PT94674B

PT94674B - Processo para a purificacao de anexinas

Info

Publication number: PT94674B
Application number: PT94674A
Authority: PT
Inventors: Gerhard Bodo; Christian Reutelingsperger
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 1989-07-15
Filing date: 1990-07-12
Publication date: 1997-03-31
Also published as: JPH03175992A; KR910002893A; IE902563A1; AU628604B2; EP0409053B1; NO177787B; FI903508A0; DE59002895D1; PT94674A; NZ234492A; NO903149D0; DD297977A5; ZA905490B; FI95136C; AU5901590A; IL95082A; IE65195B1; FI95136B; KR0159275B1; EP0409053A1

Description

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 94 674

REQUERENTE: BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH, alemã, com sede em D-6507 Ingelheim am Rhein, República Federal Alemã.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DE ANEXINAS

INVENTORES: Dr. Christian Reutelingsperger e Prof. Dr. Gerhard Bodo.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

República Federal Alemã, em 15 de Julho de 1989, sob o N9 39 23 501.7.

INPI MOD 113 BF 16732

INTERNATIONAL GMBH, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6507 Ingelheim am Rhein, República Federal Alemã, (inventores: Dr.j Christian Reutelingsperger, residente na Holanda e Prof. Dr. Gerhard Bodo, residente na Áustria), para PROCESSO PARA A PURIFIXAÇÂO DE ANEXINAS

DESCRIÇÃO

--— j

I

Na maior parte dos animais mamíferos, existem proteínas que possuem propriedades de inibição de coagulação do sangue. Estas proteínas podem subdividir-se em três grupos, sendo a subdivisão baseada em diferentes mecanismos de actuação:

1. Proteínas que formam com o factor de coagulação um complexo e, desta forma, tornam o factor de coagulação inactivo. A esta classe pertencem as proteínas:

a) antitrombina-III (Thromb. Res. .5, 439 - 452 (1974));

b) inibidor de alfa-protease (Ann. Rev. Biochem. 52, 655 -709 (1983));

c) alfa2-macroglobulina (Ann. Rev. Biochem. 52, 655-709 (1983));

d) inibidor C^ (Biochemistry 20, 2738 - 2743 (1981);

e) protease nexina (J. Biol. Chem. 258, 10439 - 10444 (1983 )).

2. Proteínas que cortam um factor proteolitico e dessa forma desactivam o factor de coagulação.

Como proteína única deste tipo descreveu-se até hoje a proteína C (J. Biol. Chem. 251, 355 - 363 (1976)).

3. Proteínas que protegem e/ou hidrolisam os fosfolípidos carregados negativamente, de modo que as reacções que dependem dos fosfolípidos do mecanismo de coagulação do sangue são ' evitadas. Até agora, foram descritas apenas as fosfolipases que foram isoladas de diversas espécies de venenos de ser- ; pentes (Eur. J. Biochem. 112, 25 - 32 (1980)). }

I sistema de coagulação que se realiza normalmente em fases sucessivas foi ensaiado intensivamente nos últi- í mos anos. Ê considerado um sistema de várias operações que se intensificam, descobriram-se reacções proteolíticas em que uma enzima origina um zimogénio sob a forma activa (veja-se Cm M. Jackson, Y. Nemerson, Ann. Rev. Biochem. 49, 765 - 811 (1980)).

A velocidade destas reacções é aumentada de ma;

neira correspondente pela presença de fosfolípidos e de outros !

cofactores como o factor V ou o factor VIII . In vivo, as reac-J a a ções de pro-coagulação são controladas por diferentes mecanismos^!de inibição, que evitam um trauma trombótico explosivo depois de uma pequena activação da série de reacções de coagulação.

Os mecanismos de coagulação podem subdividir-se nas seguintes categorias (R. D. Rosenberg, J. S. Rosenberg,

J. Clin. Invest. 74, 1-6 (1984)):

I

1. 0 serina-protease-factor e a trobina são inactivados em consequência da sua ligação a antitrombina III ou ao comple xo antitrombina/heparina. Tanto a activação prõ-trombina co! mo também a formação de fibrina podem ser inibidas da mesma) maneira. Além da antitrombina III, hã ainda outros inibidores de plasma-protease diferentes, como, por exemplo, alfa₂-macroglobulina e anti-tripsina cuja actividade depende do tempo.

2. A descoberta da proteína C originou a descoberta de outro mecanismo de anticoagulação. Uma vez que a proteína C tenha sido activada, actua por proteõlise selectiva dos cofactores proteinicos factor V _e por intermédio do que é

inactivada a prõ-trombinase e a enzima que reage com o fac j tor X como anticoagulantes.

3. A plasmina liberta fibrina 1 monomérica, um produto da re~ !

acção da trombina com fibrinogênio, por meio do que se evita a formação de uma fribrina insolúvel (H. L. Nossel, Na- j ture 291, 165 -167 (1981)).

Das proteínas existentes no organismo que intervêm no sistema de coagulação acima mencionadas, é empregada clinicamente apenas a antitrobina III actualmente. Como inconveniente importante, no entanto, a utilização desta proteína origina o aumento da tendência para a hemorragia..

Todos os agentes empregados atê agora como anti-coagulantes, quer de origem natural quer de origem sintética, tornam inactivos de qualquer maneira que seja os factores de coa gulação e originam, por consequência, acções secundárias que podem actuar inconvenientemente sobre o processo de coagulação.

Surpreendentemente, foi possível isolar juntamente com estas proteínas outras substâncias existentes no orga-i nismo que, na realidade, possuem as propriedades pretendidas de inibição da coagulação do sangue em condições especiais, mas que não aumentam o perigo de hemorragias. Em caso de grandes hemorra gias, estas proteínas perdem as suas propriedades de inibição dei coagulação do sangue e, por consequência, quando são utilizadas,' não prejudicam os processos de coagulação necessários à sobrevi-! vência nesses casos. Como foram isolados pela primeira vez em tej eidos fortemente vascularizados, são designados como proteínas j anticoagulantes vasculares, VAC.

As proteínas' isoladas de tecidos fortemente vascularizados, como as proteínas isoladas de vasos do cordão umbilical e da placenta, possuem pesos moleculares iguais a cer3 3 3 ca de 70 x 10 , cerca de 60 x 10 , cerca.de 34 x 10 e cerca de x 10 , das quais as substancias com os pesos moleculares com3 3 preendidos entre 34 x 10 e 32 x 10 consistem numa cadeia de polipêptido única. A caracterização bioquímica exacta destas pro teínas, assim como o seu isolamento e purificação encontram-se referidos na Patente de Invenção Europeia Número EP-A-0 181 465.

As proteínas com actividade VAC são naturalmente substâncias inibidoras da coagulação do sangue que, na cadeia em série de fenómenos de coagulação do sangue, actuam por duas vezes.

De acordo com a primeira vez, elas inibem a activação do factor X com obtenção do factor Xa catalisada pelos â cl factores IX e VIII e, de acordo com a segunda vez, impedem a separação de pró-trombina com obtenção de trombina, que ê dividida pelos factores X e V . Em ambas as fases de activaçao, é comum que necessitem de iões cálcio e de fosfolípidos. Evidentemente, as proteínas VAC igualmente podem actuar com os fosfolípidos em acção inversa e, por meio desta ligação, bloquear a activação dos factores de coagulação.

Como entretanto se disse, hã uma família comI pleta que se ligam com as VAC com os fosfolípidos, de uma maneira que depende do cálcio e interferem com processos que dependem) idas superfícies dos fosfolípidos. !

A esta família, que também se designa anexinas í pertencem, juntamente com a lipocortina I, calpactina I, proteína II, lipocortina III, p67-calelectrina, também IBC, PAP, PAP I

PP4, endonexina II e lipocortina V.

As características estruturais comuns das anexinas são, na realidade, as bases para as suas propriedades de ligaçao a C e fosfolípidos. Não obstante esta propriedade geral que se encontra em todas as anexinas, verifica-se uma ciara individualidade relativamente a sua afinidade para com a C e aos diferentes tipos de fosfolípidos. ‘

As funções fisiológicas das anexinas constituem processos associados às membranas. 0 mecanismo de base da actividade de inibição da coagulação da VAC foi reconhecido como a inibição da capacidade catalítica dos fosfolípidos por ligação da VAC às suas superfícies, de modo que a formação do complexo j que provoca a coagulação na sua superfície é evitada.

Outras anexinas também podem inibir a coagulação do sangue, muito embora VAC pareça ser o inibidor efectivo.

Estudos de ligação mostraram que VAC se associa reversivelmente com fosfolípidos prõ-coagulantes, dependendo do cálcio. '

-2+2+

Outros catioes bivalentes da serie Cd , Zn ,

2+ 2+ Mn e Co também influenciam a associaçao de maneira positiva 2+ muito embora nao na proporção do Ca

I

As suas propriedades tornam as proteínas substâncias activas extraordinariamente interessantes e farmacologicamente extremamente valiosas. 0 método de tecnologia genética 1 com o qual foi possível preparar proteínas VAC foi descrito na ! Patente de Invenção Europeia EP-A-293 567, cujas indicações são expressamente referidas na presente memória descritiva.

objectivo da presente invenção foi melhorar j o processo descrito na Patente de Invenção Europeia EP-A-293 567 para isolar e purificar proteínas VAC.

A partir do processo conhecido que se descreve na Patente de Invenção Europeia EP-A-293 567, para se isolarem í

e purificarem as proteínas expressas, suspende-se a biomassa numj tampão de lise apropriado. As células foram em seguida destruidas mecanicamente, por exemplo, com uma prensa de Manton-Gaulin. Depois de se adicionar um agente precipitante para precipitar os componentes não proteínicos, como polietilenimina, separaram-se os componentes sólidos, por exemplo, por centrifugação. Depois ! de se precipitarem as proteínas, de preferência, por fraccionamento com sulfato de amónio, dissolução do precipitado, eliminação do agente de precipitação e clarificação da solução, o extracto assim obtido foi submetido a vários ensaios de purificação por cromatografia. Em vez da precipitação das proteínas, purifica-se o extracto de VAC bruto também por uma pré-purificação por cromatografia de tal forma que em seguida ele possa ser submetido a um ciclo de purificação. Como material apropriado para enchimento das colunas para a pré-purificação, verificou-se ser apropriado, por exemplo, SiO₂, muito embora sejam também apropri ados outros materiais com propriedades semelhantes. De acordo com a presente invenção, utilizou-se como suporte catalisador de sílica do grau 953 W da firma Grace.

Um ciclo de purificação por cromatografia apropriado para a purificação das proteínas de acordo com a presente invenção consistiu, por exemplo, numa cromatografia em DEAE-Sepharose de caudal rápido, em Sephacryl S-200 de elevada resolução e numa cromatografia com caudal rápido em Q-Sepharose. A pureza das proteínas de acordo com a presente invenção que assim se obtém foi determinada por meio de um ensio de SDS-PAGE de mancha de Western, de HPCL de permeametria de gel, de HPLC inversa e de focagem isoeléctrica.

Na lise realizada de acordo com este processo e por extracção, obteve-se o material purificado com um rendimento igual a cerca de 50%.

Para melhorar esta fase do processo de acordo com a presente invenção, é surpreendentemente possível aumentar o rendimento desta operação para um valor superior a 80%.

Atingiu-se surpreendentemente este melhoramento regulando o valor do pH da suspensão de lise homogeneizada para um valor compreendido entre 9,0 e 10, de preferência, para um valor de pH igual a 9,0.

Actua de maneira especialmente vantajosa a a~ ~ a⁺⁺ r dição de catiões bivalentes, especialmente de C e de fosfolipidos, como cefalina e lecitina, especialmente de lecitina. Por meio destas adições, são absorvidas as proteínas VAC para o homogeneizado que se encontram nas membranas das células do organismo hospedeiro, de preferência E. coli. Esta fase de absorção in situ permite surpreendentemente que se eliminem proporções solúveis perturbadoras do homogeneizado por simples lavagem. A dessorção das proteínas de VAC ligadas ao suporte sólido realiza-se com o auxílio de agentes quelantes, de preferência, com tampão que contém EDTA.

Um aspecto da presente invenção consiste em proporcionar um processo para a purificação de anexj.nas, caracterizado pelo facto de

a) se regular o valor do pH do homogeneizado de células para um valor de 8, 0 a 10,0,

b) se adicionar pelo menos um catião bivalente do grupo constituido por C , Cd , Zn , MN e Co ,

c) se adicionar um fosfolípido,

d) se eliminarem os componentes solúveis por lavagem do resíduo das células e

e) se extraírem as proteínas do resíduo das células com ageni tes quelantes.

A adição dos fosfolípido (operação c) pode rea lizar-se de uma única vez ou por adições sucessivas.

De preferência, pode utilizar-se uma mistura ) de catiões bivalentes, por exemplo, de C^a em ligação com Zn^⁺ em que as proporções molares de cada catião são reguladas de tal maneira que a absorção da anexina, por exemplo VAC, à superfície das células seja máxima.

Surpreendentemente, verificou-se que, na purificação das anexinas que foram preparadas por expressão em E.

coli, a proporção das proteínas de E. coli (ECP) é nitidamente ~ A reduzida por adiçao de BPA (Bioprocessing ids, fimr TOSOHAAS). Neste caso, ao extracto bruto de BPA obtido depois de extracção com EDTA, adicionou-se BPA, por exemplo, BPA-1000, BPA-1050 ou BPA-2100, de preferência, BPA-1000 e agitou-se. A quantidade adicionada pode estar compreendida entre 1 e 20% em volume, de j preferência, entre 5 e 10% em volume, de maneira especialmente j

I preferida igual a 10% em volume. ;

Separa-se o precipitado por centrifugação. Segue-se a precipitação das proteínas, assim como as operações de cromatografia. Por adição de BPA, já se consegue diminuir o teor de ECP nesta fase para até 2% do valor de partida. O teor em VAC, pelo contrário, foi apenas diminuído de cerca de 6%. j

Conseguiu-se realizar uma outra melhoria de rendimento de maneira surpreendente, inactivando as células da mistura de fermentação antes da afloração das células. Como agentes inactivantes, podem utilizar-se compostos aromáticos sim• pies, por exemplo, benzeno, tolueno, fenol, xileno ou cresol.

. De maneira especialmente vantajosa, utiliza-se m-cresol.

Adicionando esta operação de inactivação, foi possível, em associação com as fases de processo jã acima descritas, aumentar os rendimentos de extracção para um valor supe rior a 98%.

Ã operação de adsorção/desorção/ seguem-se as operações de purificação conhecidas descritas na Patente de Invenção Europeia EP-A-293 567. Os parâmetros necessários a essa operação, tais como temperatura, proporções entre as quantidades, sequência das operações individuais, valores de pH, reagen tes especiais, etc., são melhor conhecidas pelos peritos no assunto. Os Exemplos descritos mais adiante, caso assim se preten da, podem ser alterados de maneira apropriada conhecida pelos peritos no assunto. Especialmente, não constituem quaisquer limitações relativamente âs proteínas a purificar.

Com base nas caracteristicas estruturais totais, assim como relativamente âs propriedades gerais das anexi nas, o processo de acordo com a presente invenção pode também ser utilizado para purificação das outras anexinas, mas é especialmente apropriado para purificação das anexinas IBC, PAP,

PAP I, PP4, endonexina, lipocortina V e VAC.

Em geral, o processo de acordo com a presente invenção também pode ser utilizado para isolamento e purificação de anexinas provenientes de tecido fortemente vascularizado

As indicações relativamente aos reagentes uti lizados são apenas indicações comerciais apresentadas a título de exemplo e não constituem qualquer limitação.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1 : perfil de eluição da cromatografia em caudal rápido de fenil-Sepharose (*—»= conjunto de VAC).

Figura 2 : perfil de eluição na cromatografia em caudal rápido de Q-Sepharose (<--»· = conjunto de VAC).

Γ«>·

EXEMPLOS

Exemplo 1

1. Afloração das Células

Adição de Ca⁺⁺ e de lecitina, lavagem e extracção

Suspenderam-se 122 gramas de massa de células ί não inactivadas congeladas do clone E. coli HBl01/-pRH291 prove ί niente da fermentação N9 524 depois de descongelar com 500 ml de tampão de lise por agitação (cerca de uma hora, arrefecimento com gelo) e, em seguida, homogeneizou-se com um homogeneizador Ultra-Turrax T 45/6 (cerca de um minuto, arrefecimento com gelo).

Tampão de Lise
100	mM	de	Tris	12,14	g/1000	ml	Merck	8382
1	mM	de	EDTA	0,37	g/1000	ml	Titriplex III,
							Merck	8418
200	mM	de	N^aCl	11,69	g/1000	ml	Merck	6404
				0 valor de	pH foi	regulado	a 9,0	+ 0,1 com

HC1 a 32%.

Homogeneizou-se a suspensão tres vezes a cer2 ca de 420 kg/cm por meio de uma prensa de Manton-Gaulin do tipo 15 Μ 8TA, em gue se arrefece o reservatório de recolha em gelo. O aparelho é em seguida lavado duas vezes com 150 - 200 ml i

de tampão de lise respectivamente (volume total do extracto :

1000 ml).

2. Adição de Ca⁺⁺ e de lecitina para a absorção de VAC ao residuo de células insolúveis

Ao homogeneizado adiciona-se 0,55 grama de cio! reto de cãlcio (Merck 2083) recentemente dissolvido - concentração final 5 mM - e 6,1 ml de solução de lecitina (200 mg/ml de clorofórmio). Concentração final 1 grama de lecitina/100 gramas • de biomassa.

Homogeneíza-se a mistura durante um minuto com o Ultra-Turrax e agita-se em banho de gelo durante sessenta minutos .

í

Lecitina : Lecitina de soja, pract., Serva 57556

Em seguida, adicionam-se 110 ml de solução de polimina (preparada a partir de 50% de polimina p, Serva 33141, diluida a 5% e neutralizada a pH 8 com HC1 5 normal) e agita-se mais uma vez durante 30 minutos. A concentração final ê igual a 0,5%. Em seguida, centrifuga-se a suspensão até ficar límpida, (centrífuga Beckman de elevada velocidade J2-21, rotor JA 10, 8000 rotações por minuto, trinta minutos, regulação 2°C).

RESÍDUO I : 1020 ml (4,25 mg de proteína/ml; 0,05 mg de VAC/ml).

i i

3. Lavagem do resíduo de células para eliminação dos componentes solúveis

Suspende-se o resíduo das células com 600 ml de tampão de lavagem com auxílio do homogeneizador Ultra-Turrax e, em seguida, agita-se durante trinta minutos.

Tampão de lavagem

100	mM	de	Tris
200	mM	de	N^aCl
5	mM	de	c^aci

Regula-se o valor de pH de maneira a ser igual a 9,0 + 0,1 com HC1 a 32%.

Recupera-se o resíduo de células como se descreveu anteriormente, por centrifugação.

SOBRENADANTE II : 580 ml (1,35 mg de proteína/ml;

0,04 mg de VAC/ml).

Homogeneízam-se os peletes com 900 ml de tampão de extracção num homogeneizador Ultra-Turrax e, em seguida, agita-se durante a noite em sala arrefecida. Centrifuga-se o extrac to como se descreveu e obtém-se a solução límpida: EXTRACTO BRUTO.

EXTRACTO BRUTO : 915 ml (1,98 mg de proteína/ml; 0,65 mg de

VAC/ml).

Tampão de Extracção mM de Tris mM de EDTA

Regula-se o valor do pH de maneira a ser igual a 7,5 + 0,1 com N^aOH 5 N.

Resumo do Processo de Lavagem e Extracção

Sobrenadante	I	1020	ml	4335	mg	de	proteína,	49	mg	de	VAC
Sobrenadante	II	580	ml	783	mg	de	proteína,	22	mg	de	VAC
Sobrenadante	III	340	ml	316	mg	de	proteína,	5	mg	de	VAC
				5434	mg	de	proteína,	76	mg	de	VAC

(11%)

EXTRACTO BRUTO VAC

915 ml 1816 mg de proteína, 594 mg de VAC em 122 gramas de massa de células de VAC total 670 mg (89%).

iExemplo 2

I

Resumo :

i-1. Inactivação !2. Afloração das células ¹ — a. ++ ~

3. Adição de C e de lecitina para a absorçao de VAC ao resíduo das células insolúvel

4. Lavagem do resíduo das células e eliminação dos componentes solúveis

5. Extracção de VAC com tampão que contém EDTA

6. Adição de sulfato de amónio saturado a 35% e eliminação do precipitado

7. Cromatográfia em fenil-Sepharose de caudal rápido

8. Diãlise do conjunto de VAC e cromatográfia em Q-Sepharose de caudal rápido

9. Concentração do conjunto de VAC e cromatográfia em Sephacry

S-200 HR.

1. Inactivação

Atinge-se o fim da fermentação aproximadamente depois de desassete horas a partir do consumo de fosfato no meio. Neste momento, adiciona-se C^aCl₂ 10 mM e regula-se a temperatura de modo a obter-se o arrefecimento o mais rapidamente possível de 5 a 8° Celsius.

Todos os restantes parâmetros são regulados de maneira a ficarem constantes (como arejamento, agitação, valor de pH, pressão, etc.). Depois de cerca de sete minutos, adicionam-se 7 ml/litro de m-cresol; em seguida, regula-se a pressão, arejamento e valor de pH e reduz-se a agitação de maneira que, na realidade, se garante uma boa mistura do caldo de fermentação com o cresol, mas se reduza a formação de espuma. Nestas condições, inactiva-se durante pelo menos três e, no máximo quinze ho ras (temperatura ainda entre 5 e 8° Celsius).

2. Afloração das Células

Adição de Ca e de lecitina, lavagem e extracçao

Suspendem-se 286 gramas de massa de células inactivadas com m-cresol do clone HB 101/pGN25 depois de desongelar com 750 ml de tampão de lise por agitação (cerca de uma hora, arrefecimento com gelo) e, em seguida, homogeneíza-se com um homogeneizador Ultra-Turrax T 45/6 (cerca de um minuto, arrefecimento com gelo).

Tampão de Lise

100	mM	de	Tris
1	mM	de	EDTA
200	mM	de	N^aCl

Regula-se o valor de pH de maneira a ser igual a 9,0 + 0,1 com HCl a 32%.

Homogeneíza-se a suspensão três vezes a cerca de 420 kg/cm (6000 psi) com uma prensa de Manton-Gaulin tipo 15 Μ 8TA, arrefecendo-se o vaso de recolha com gelo. Em seguida, la va-se o aparelho duas vezes com 150-200 ml de tampão de lise de cada vez. Volume do homogeneizado : 1400 ml.

2. Adição de Ca⁺⁺ e de lecitina para a adsorção de VAC ao resí duo de células insolúvel

Ao homogeneizado adiciona-se 0,55 grama de Ca Cl₂ (Merck 2083)/1000 ml (concentração final 5 mM) (dissolvidos em cerca de 10 ml de H₂O) e 1 grama de lecitina/100 gramas de biomassa, dissolvido em clorofórmio (cerca de 0,2 g/ml).

Homogeneiza-se a mistura durante um minuto num homogeneizador Ultra-Turrax e agita-se em banho de gelo durante 60 minutos.

Lecitina : Lecitina de soja, pract., Serva 57556.

Em seguida, adiciona-se 0,11 volumes de solu!ção a 5% de polimina (preparada a partir de 50% de polimina p, Serva 33141, diluida até 5% e neutralizada a pH 8 com HC1 5 N) e agita-se durante mais trinta minutos. A concentração final é iJgual a 0,5%. Em seguida, centrifuga-se a suspensão até ficar límpida (centrífuga de alta velocidade Beckman J2-21, rotor JA

10, 8.000 rotações por minuto, trinta minutos, regulação 2°C).

i

SOBRENADANTE I : 1200 ml (5,8 mg de proteína/ml; 0,01 mg de VAC /ml) .

3. Lavagem do resíduo de células para a eliminação dos componentes solúveis

Suspende-se o resíduo de células com cerca de 1000 ml de tampão de lavagem com o auxílio de um homogeneizador Ultra-Turrax e, em seguida, agita-se durante 30 minutos.

Tampão de lavagem

100	mM	de	Tris
200	mM	de	N^aCl
i ⁵	mM	de	c^aci

Regula-se o valor de pH de maneira a ser igual a 9,0 + 0,1 com HCl a 32%.

! Recupera-se o resíduo de células como se indijcou anteriormente, por centrifugação.

i

SOBRENADANTE II : 1000 ml (1,94 mg de proteína/ml; 0,01 mg de VAC/ml).

Repete-se a suspensão em 1000 ml de tampão de lavagem com subsequente homogeneização e agitação e, em seguida, • centrifuga-se.

iSOBRENADANTE III : 1000 ml (0,79 mg de proteína/ml;

ι 0,01 mg de VAC/ml).

i4. Extracção de VAC com tampão que contém EDTA j Homogeneízam-se os peletes com 1350 ml de tampão de extracção num homogeneizador Ultra-Turrax e, em seguida, agita-se durante a noite em sala arrefecida. Centrifuga-se o extracto como se indicou anteriormente e obtém-se a solução límpida = EXTRACTO BRUTO.

EXTRACTO BRUTO : 1350 ml (3,35 mg de proteína/ml; 1,46 mg de VAC/ml).

Tampão de Extracção mM de Tris mM de EDTA

Regula-se o valor de pH de maneira a ser igual a 7,5 + 0,1 com N^aOH 5 N.

Resumo do processo de lavagem e extracção

Sobrenadante	I	1200	ml	6960	mg	de	: proteína,	12	mg	de	VAC
Sobrenadante	II	1000	ml	1940	mg	de	proteína,	10	mg	de	VAC
Sobrenadante	III	1000	ml	790	mg	de	proteína,	10	mg	de	VAC
				9690	mg	de	proteína	32	mg	de	VAC

(2%)

Extracto bruto de VAC 1350 ml 4522 mg de proteína 1971 mg VAC em 286 gramas de massa de células VAC total 2003 mg (98%).

5-6. Precipitação com sulfato de amónio saturado a 35% e cromatografia com Fenil-Sepharose de caudal rápido

Precipitação com sulfato de amónio

Ao extracto bruto adicionam-se lentamente sob agitação 209 gramas/litro de sulfato de amónio sólido (Merck 1217). Isso origina um grau de saturação de 35%. Depois de se agitar pelo menos durante uma hora em sala arrefecida, centrifuga-se a solução até ficar límpida (condições como se mencionou anteriormente) e rejeita-se o precipitado. Bombeia-se a solução com a velocidade de 8-10 ml/minuto para um aparelho de FPLC com um enchimento de fenil-Sepharose FF previamente preparada.

Processa-se o sobrenadante de sulfato de amónio a 35% de saturação centrifugado até ficar límpido em duas partes aproximadamente iguais e realiza-se sucessivamente por duas vezes as operações descritas seguidamente.

Preparação da coluna

Enche-se uma coluna pharmacia do tipo XK 26/40 (volume do leito cerca de 200 ml) com fenil-Sepharose de caudal rápido (Pharmacia, numero de código 17-0965) e equilibra-se com tampão A. Para o efeito, precipitam-se 2-3 volume de coluna (CV) de tampão. Coloca-se a coluna num aparelho de FPLC. Toda a cromatografia se realiza â temperatura ambiente.

Tampão A mM de Tris

Regula-se o tampão com HC1 concentrado de maneira a ter o pH 7,2 + 0,1.

Adicionam-se imediatamente 209 gramas/1000 ml de sulfato de amónio sólido (Merck 1217).

Tampão B

Como o tampão A, mas sem adição de sulfato de amónio.

Cromatografia

Controla-se o eluido por medição da densidade óptica a 280 nanómetros. Assim que a composição é colocada na co luna, lava-se com tampão A atê que a densidade óptica a 280 nm tenha regressado ao valor normal. Em seguida, utiliza-se um gradiente de tampão A-tampão B de 0 a 100% de B com 5 volumes da coluna (1000 ml) para realizar a eluição das VAC ligadas. A VAC corresponde ao primeiro pico saliente depois do início do gradiente (veja-se a representação do diagrama de eluição na Figura

1). Ensaiam-se partes alíquotas do líquido de eluição, do conjun to de VAC e, eventualmente ainda, de outros picos do perfil de variação da densidade óptica por ensaio de SDS-PAGE. O ensaio do conjunto de VAC : determinação da proteína, ensaio de VAC, ensai o de SDS-PAGE.

Regeneração da coluna

Regenera-se a fenil-Sepharose com 2 volumes de ureia 6 molar. Depois de se lavar o material de ureia (1 CV de ãgua destilada), guarda-se em 24% de etanol.

Para determinar ou evitar os componentes corados presentes na extremidade superior da coluna, utiliza-se um processo de lavagem e regeneração alargado:

1.	1	VC	de	ãgua destilada
2.	2	CV	de	ureia 6 M (Merck	8487)
3.	1	VC	de	ãgua destilada
4.	1	VC	de	N^aOH 0,1 M
5.	lavagem	e armazenagem em	etanol

6. antes da utilização, equilíbrio com 3 VC de tampão A.

7. Cromatografia em Q-Sepharose de Caudal Rápido

Para não se consumir demasiadamente tampão na diãlise do conjunto de VAC com o tampão de aplicação da Q-Sepharose, em primeiro lugar concentra-se o referido conjunto numa cé lula de ultrafiltração Amicon e com um filtro YM 10 até cerca de 150 ml. Em seguida, dialisa-se com tampão A.

Tampão A i;

Ί jí 20 mM de bis-Tris

Regula-se o valor de pH de maneira a ser igual a 6,3 + 0,1 com HCl 5 N.

i jTampão B ii Tampão A + 0,35 M de N^aci.

mM de bis-tris * a

350 mM de N Cl.

J i;

Regula-se o valor de pH de maneira a ser igual a 6,3 + 0,1 com HCl 5 N.

i

Preparação da coluna

Inclui-se no sistema de FPLC uma coluna do tipo HR 16/50 Pharmacia (VC 100 ml) e com um dispositivo de enchimento com Q-Sepharose de caudal rápido (Pharmacia). Equilibra-se com 2 VC de tampão A. A cromatografia realiza-se à temperatura ambiente.

Cromatografia

A introdução da amostra realiza-se com o caudal de 4 ml/minuto. Em seguida lava-se imediatamente com tampão A até a densidade óptica a 280 nm do eluido descer até o valor inicial. O programa do gradiente ê o seguinte:

0,5 VC O - 30% de B

8,0 VC 30 - 70% de B (neste valor realiza-se a separação) cerca de 1,0 VC de 100% de B.

IPrograma de lavagem ’ Depois de a 100% de B não se eluir mais materi al activado por UV, inicia-se o programa de lavagem:

2	VC	de	ãgua	destilada
2	VC	de	N^aOH	0,5 normal
2	VC	de	água	destilada

Armazenagem : etanol a 24%.

Antes da utilização, lava-se com 2 - 3 VC de tampão A; pH de con trolo = 6,3,

Eluem-se as impurezas no programa antes do VAC 0 perfil da eluição está representado no anexo (Figura 2).

8. Cromatografia em Sephacryl S-200 HR

Concentra-se o conjunto VAC com um ultrafiltro Amicon YM 10 até cerca de 10 ml. Neste caso, verifica-se que se pode concentrar a VAC atê 100 mg/ml (BioRad) sem quaisquer problemas .

Preparação da coluna

Enche-se uma coluna K 26/100 de Pharmacia com cerca de 400 ml de volume de leito procedendo de acordo com as instruções do fabricante com Sephacryl S-200 de elevada resolução (Pharmacia) e equilibra-se com tampão de eluição (2 VC).

Tampão de Eluição mM de fosfato de sódio, pH 7,2

150 mM de N^aCl; ou mM de sal de N ₂ de acido succínico (pH = 7,0)

0,01% de Tween 20

Regula-se o valor de pH de maneira a ser igual a 7,0 + 0,1 com HCl 1 N.

Cromatografia

A cromatografia realiza-se em sala arrefecida. A velocidade de passagem corresponde ao caudal de 80 ml/hora. Re unem-se as fracções com o pico da densidade õptica determinado a

280 nm. O VAC assim reunido tinha um grau de pureza >99% (análise de RP-HPLC).

Regeneração da coluna de Sephacryl

Programa de Lavagem:'

VC de ãgua destilada

VC de N^aOH 0,5 N (+ armazenagem durante alguns dias).

(no caso de armazenagens mais longas, aconselha-se 1 M de N^acl + + 0,0025% de N^aOH).

Regeneração:

VC de ãgua destilada

VC de tampão de eluição.

Resumo de toda a purificação

Produto intermediário da purificação Volume

VAC-alfa^XX

Proteína x

	(ml)	(mg)	(mg)
Sobrenadante I	1.200	6.960	12
Sobrenadante II	1.000	1.940	10
Sobrenadante III	1.000	790	10
Extracto bruto	1.350	4.522	1.971
Sobrenadante 35% sat. Am„SO. 2 4	1.500	4.500	2.098
Conjunto de fenil-Seph.FF-	975	3.050	2.041
Carga de Q-Seph.FF	355	3.062	2.277
Conjunto de Q-Seph.FF	475	2.660	2.082
Carga de Seph.S-200 HR	23,7	2.446 (1.859)^XXX	n.b.
Conjunto de Seph.S-200 HR	192	2.477 (1.883)	2.126

-'-Λ'..,

Ensaio de proteína BioRad (padrão : albumina de soro de vitela) xx - Ensaio de Vac-alfa : inibição da formação de trombina a partir de pró-trombina (Reutelinsperger, Hornstra e Hemker, Eur. J. Biochem. 151, 625 - 629, 1985). Como referência, serviu uma composição de VAC-alfa purificada.

xxx - 0 teor de proteína é determinado por medição da densidade óptica a 280 nanõmetros, com utilização do factor VAC-alfa puro : densidade óptica 280 mm x 1,277 = mg/ml de VAC-alfa.

Exemplo 3

Purificação do extracto bruto em EDTA com BPA

Realizou-se a purificação que se descreveu no

Exemplo 1 e no Exemplo 2 até à extracção com tampão que contém EDTA (Fase 4). 0 material de partida foi, de uma vez, 295 gramas e, de outra vez, 240 gramas de biomassa.

Depois da obtenção do extracto bruto, adicionaram-se 10% em volume de BPA 1000 e agitou-se durante 10 minutos. Separou-se o precipitado obtido por centrifugação (centrífuga de alta velocidade J2-21 da firma Beckman com o rótor JA 10 8000 rotações por minuto, 30 minutos a 2°C).

j A posterior purificação realizou-se como se

Ί « (descreveu: adição de sulfato de amónio sólido até 35 por cento de saturação e posterior cromatografia em fenil-Sepharose de cau dal rápido (veja-se o procedimento anterior).

Resultado para VAC alfa

O material de partida foi 295 gramas de biomas sa (carga B005001).

Produto Vol. ml Proteína VACalpha ECP ppm

Intermédio mg/ml mg/ml(Total)

Claims

Processo para a purificação de anexinas, carac terizado por

a) se regular o valor do pH do homogeneizado das células de maneira a ser igual a 8,0 a 10,0;

b) se adicionar pelo menos um catião bivalente do grupo Ca
2+

Cd

Zn

Mn e Co

c) se adicionar um fosfolípido;

d) se eliminar os compostos solúveis por lavagem do resíduo das células;

e) se extrair as proteínas do resíduo das células com agentes quelantes e,

f) se purificar as proteínas extraídas por precipitação das proteínas extraídas e subsequente purificação.

- 2^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, no fim da fase e) se adicionar BPA, de preferên cia BPA 1000 e se preparar o precipitado obtido.

-
3^a Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por, a seguir à operação e) se purificarem as proteínas extraidas por precipitação da proteína e subsequente purificação das proteínas precipitadas pelo método usualmente empregado na química das proteínas.

Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3 caracterizado por se regular o valor do pH para 9,0.

- 5^a Processo de acordo com as reivindicações 1 a 2+ 2+
4, caracterizado por se adicionar Ca e ou Zn como catião bivalente .

- 6^a Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por se adicionar lecitina como fosfolípido

Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações anteriores, caracterizado por se efectuar praticamente ao mesmo tempo as operações b) e c).

- 8^a Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações anteriores, caracterizado por se empregar EDTA como agente quelante.

- 9^a Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações anteriores caracterizado por as células serem previamen te inactivadas.

- 10^a Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por, como agente de inactivação, se utilizar um composto aromático simples, em especial, benzeno, tolueno, fenol, xileno ou cresol, de maneira especialmente preferida, cresol.

- 11^a Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por, como agente de inactivação, se empregar m-cresol.

- 12^a Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações anteriores, caracterizado por a proteína anticoagulante vascular a purificar ser a VAC ou um seu análogo.

A requerente reivindica a prioridade do pedido apresentado em 15 de Julho de 1989, sob ο N9 P 39 23 501.7.