DE2048548C3 - Verfahren zur Abtrennung von Bacitracin aus Fermentationsflüssigkeiten - Google Patents

Verfahren zur Abtrennung von Bacitracin aus Fermentationsflüssigkeiten

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DE2048548C3
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
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    • C07K7/58—Bacitracins; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Bacitracin aus Fermentationsflüssigkeiten, in denen das Antibiotikum durch Mikroorganismen gebildet wurde.
Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Abtrennung von Bacitracin aus Bacitracin enthaltenden Gäroder Fermentationsflüssigkeiten bekannt. Diese Verfahren gehen generell von der klaren Flüssigkeit aus, erfordern also jeweils die vorangehende Entfernung der Feststoffe aus der anfallenden gesamten Fermentationsflüssigkeit, und das Bacitracin wird erst aus der von Feststoffanteilen befreiten Flüssigkeit extrahiert bzw. abgetrennt. Derartige einleitende Prozesse zur Erzielung einer klaren Flüssigkeit sind bei industrieller Herstellung meist recht kostspielig; zudem werden zumeist nur Ausbeuten um 45% erzielt.
Es wurde nun gefunden, daß die vorangehende Klirung durch Behandlung der gesamten Fermentationsflüssigkeit mit einem vernetzten, nichttonischen, porösen und in Wasser unlöslichen Harz vermieden werden kann, wobei zugleich hohe Ausbeuten an Bacitracin erzielbar sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Abtrennung von Bacitracin geht von der gesamten Fermentationsflüssigkeit aus, in der das Bacitracin durch Mikroorganismen gebildet wurde und ist gekennzeichnet durch Adsorption des Bacitracins aus der Fermentationsflüssigkeit an einem vernetzten, nichtionischen, porösen und in Wasser unlöslichen partikelförmigen Harz, der Abtrennung des beladenen Harzes von der Fermentationsflüssigkeit, Elution des adsorbierten Bacitracins mit einem niederen Alkanol und anschließende Isolierung des Bacitracins aus dem Eluat in an sich bekannter Weise.
Das erfindungsgemäß eingesetzte Harz weist ein dreidimensional vernetztes Polymergerüst auf, das keinerlei funktioneile Gruppen enthält, wobei die spezifische Oberfläche mindestens 50 m3/g beträgt.
Als niederes Alkanol wird ein Alkanol mit i bis 6 C-Atomen eingesetzt.
Die das Bacitracin enthaltende gesamte Fermenta-
lu tionsflüssigkeit kann nach in der Literatur zur Erzeugung dieses Antibiotikums beschriebenen Verfahren erhalten weden, beispielsweise gemäß der US-PS 27 89 941.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise wie folgt durchgeführt:
Es wird ein Acryl- oder Polystyrolharz mit einer Porengröße von 50 bis 250 A verwendet, dessen adsorbierende Oberflächen im Bereich *όπ 250 bis 1000 nvVg liegt.
Erfindungsgemäß geeignete derartige Harze sind etwa das Polystyrolharz Amberlite XAD-2® (Porengröße 85 bis 95 A, spezifische Oberfläche 290 bis 330 nvVg) sowie das Acrylharz Amberlite XAD-7® (Porengröße etwa 87 Ä, spezifische Oberfläche etwa 445 m2/g), die beide handelsüblich sind (Herstellen Röhm & Haas).
Man verwendet im allgemeinen einmal oder mehrmals 100 bis 350 ml Harz pro Liter zu behandelnde Fermentationsflüssigkeit; so wurde beispielsweise festgestellt, daß mit 125 ml Harz pro Liter Fermentationsflüssigkeit eine Abtrennung des Antibiotikums unter sehr befriedigenden Bedingungen erreicht werden kann. Im allgemeinen läßt man das Harz mit der gesamten Fermentationsflüssigkeit 1 bis 12 Stunden lang und vorzugsweise etwa 5 Stunden lang in Kontakt und
J5 trennt dann das Harz von der Flüssigkeit durch einfaches Absieben.
Anschließend wird das Harz vorzugsweise mit Methanol eluiert, dessen Volumen das 2- bis 5fache des eingesetzten Harzvolumens ausmacht. Das Eluat wird gesammelt und durch Einengen im Vakuum von Methanol befreit. Man erhält so eine wäßrige Bacitracinlösung, aus der das Bacitracin in an sich bekannter Weise gewonnen bzw. isoliert werden kann.
Aus der erfindungsgemäß erhaltenen konzentrierten Bacitracinlösung kann das Antibiotikum beispielsweise durch Ausfallen in Form von Bacitracinzink isoliert oder als Rohprodukt durch direkte Zerstäubung der Lösung erhalten werden; es kann ferner auch durch Reinigung der Bacitracinlösung nach dafür an sich bekannten Verfahren ein Bacitracin von pharmazeutischer Qualität erzielt werden. Verfahren zur Isolierung von Bacitracin ausgehend von einer konzentrierten, wäßrigen Bacitracinlösung sind beispielsweise aus der GB-PS 8 92 083 und der US-PS 28 34 711 bekannt.
Es wurde festgestellt, daß die so erhaltene Bacitracinlösung im Mittel 70% der in der gesamten Ausgangsfermentationsflüssigkeit vorhandenen Bacitracinaktivität enthält; die erfindungsgemäße Verfahrensweise liefert entsprechend gegenüber dem Stand der Technik erheblich höhere Ausbeuten an Bacitracin, wie aus den nachfolgenden Beispielen im einzelnen hervorgeht.
Beispiel I
In einem als wesentliche Bestandteile Sojamehl. ftl> Maisstärke und Natriumsulfat enthaltenden wäßrigen Fermentationsmilieu wurde unter Rühren bzw. Bewegung ein Stamm des Bacitracin erzeugenden Bacillus subtilis 23 h in Aerobiose bei 38"C gezüchtet.
Dabei wurden 4,5 1 der gesamten Fermentationsbrühe mit einem Bacitracingehalt von 510 Einheiten pro ml erhalten, zu der 1,5 I eines nichtionischen Polystyrolharzes (Amberlite® XAD-2, Hersteller Rohm & Haas) hinzugegeben wurden; die Mischung wurde 6 h gerührt.
Danach wurde das Harz abgesiebt, in Säulen gegeben und mit 3,91 Methanol eluiert. Bacitracingehalt des Eluats: 466 E/ml.
Zu diesem Eluat wurden dann 0,551 Wasser hinzugegeben und das Methanol aus der Mischung durch Abdampfen im Vakuum bei 200C entfernt Es wurden so 1,151 einer wäßrigen Bacitracinlösung mit einem Bacitracingehalt von 1740 E/ml erhalten, deren Temperatur auf 15°C gesenkt wurde. Ausbeute der Abtrennung (Aktivität der erhaltenen wäßrigen Lösung: Aktivität in der gesamten Ausgangsfermentationsflüssigkeit): 86%.
Zu dieser Lösung wurde Schwefelsäure bis zu pH 3,5 hinzugegeben; nach 10 min Rühren wurden 325 ml einer Zinkchloridlösung der Dichte 1,25 g/ml hinzugefügt Die Mischung wurde 30 min in Bewegung gehalten und dann immer noch unter Rühren mit JO n-Natronlauge (544 ml) auf pH 7,0 gebracht. Sie wurde 2 h lang bei 15°C belassen, worauf der gebildete Niederschlag abfiltriert und getrocknet wurde.
Es wurden so 38,2 g Bacitracinzink mit einer Bacitracinaktivität von 463 E/mg erhalten (Ausbeute der Abtrennung: 77,5%).
Beispiel 2
Zu 8,4 I einer wie in Beispiel 1 erhaltenen Fermentationsflüssigkeit ~nit einer Bacitracinaktivität von 495 E/ml wurden in zwei Zugaben 1,2 I eines nichtioni-
sehen Polystyrolharzers hinzugefügt (Amberlite® XAD-2, Hersteller Röhm & Haas). Die Mischung wurde nach jeder Zugabe 5 h gerührt.
Anschließend wurde das Harz abgesiebt, in Säulen gebracht und mit 4,2 I Methanol eluiert Die methanolische Lösung wurde im Vakuum eingeengt und dann bis zur Erzielung einer Lösung mit einem Bacitracingehalt von 1950 E/ml mit Wasser versetzt (Ausbeute der Abtrennung: 75%).
Diese Lösung wurde dann zur Isolierung des Bacitracins nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren behandelt. Dabei wurden 104 g Bacitracinzink mit einem Gehalt von 28 E/mg gesammelt; auf diese Weise wurden 70,5% der in der Ausgangs-FermentDtionsflüssigkeit enthaltenen Bacitracinaktivität gewonnen.
Beispiel 3
Zu 1 I einer wie in Beispiel 1 erhaltenen F'%.rmentationsflüssigkeit mit einer Bacitracinaktivität von 490 E/ml wurden, in zwei Zugaben 110 ml Acrylharz (Arnberlite® XaD-7, Hersteller Röhm & Haas) hinzugegeben; die Mischung wurde nach jeder Zugabe 6 h gerührt. Das Harz wurde durch Sieben abgetrennt und mit 330 ml Methanoi eluiert (Gehalt des Eluats/965 E/ml Bacitracin entsprechend 86,4% der Ausgangsaktivität).
Das Eluat wurde dann zur Entfernung des Methanols im Vakuum eingeengt und mit 100 ml Wasser versetzt; danach wurde das Bacitracin in Form von Bacitracinzink wie im Vergieichsbeispiei 1 ausgefällt. Es wurden so 9,21 g Produkt mit einem Gehalt von 33 E/mg Bacitracin erhalten (Gesamtausbeute der Abtrennung: 64%).

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Abtrennung von Bacitracin, ausgehend von der gesamten Fermentationsflüssigkeit, in der es durch Mikroorganismen gebildet wurde,
gekennzeichnet durch
— Adsorption des Bacitracins aus der Fermentationsflüssigkeit an einem vernetzten, nichtionischen, porösen und in Wasser unlöslichen partikelfömiigen Harz,
— Abtrennung des beladenen Harzes von der Fermentationsflüssigkeit,
— Elution des adsorbierten Bacitracins mit einem niederen Alkanol und
— anschließende Isolierung des Bacitracins aus dem Eluat in an sich bekannter Weise.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses mit einem Polystyrol- oder Acrylharz durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses mit einem Polystyrol- oder Acrylharz mit einer Porengröße von 50 bis 250 Ä und einer spezifischen Oberfläche von 50 bis 1000 mVg durchführt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses mit einem Acrylharz mit einer Porengröße von etwa 87 Ä und einer spezifischen Oberfläche von etwa 445 m2/g durchführt.
DE2048548A 1969-10-10 1970-10-02 Verfahren zur Abtrennung von Bacitracin aus Fermentationsflüssigkeiten Expired DE2048548C3 (de)

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