DE2127315A1 - Verfahren zur Extraktion von Proteasen - Google Patents

Description

DIpl.-Jng. ~;\ t; t-.V TL sen,
Dlpl-lng. K. LArvir; ..ΐΞΗΤ

Dr.-lng. R.BEUTZ jr.
8 Manchen 22, Steinsdorfstr. 10

501-17.117P 2.6.1971

ROUSSEL-UCLAP, Paris (Frankreich)

Verfahren zur Extraktion von Proteasen

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Extraktion von in alkalischem Milieu aktiven Proteasen ausgehend von der vollständigen Fermentationsbrühe, in der die Proteasen durch Mikroorganismen gebildet wurden.

Es ist bekannt, daß einige Mikroorganismen, wie beispielsweise der Bacillus Subtilis, durch Fermentation in alkalischem Milieu aktive Proteasen bilden können. Es wurden bereits mehrere Verfahren zur Extraktion dieser Proteasen beschrieben, wie beispielsweise ein Verfahren, bei dem die unlöslichen Anteile nach Beendigung der Fermentation aus dem Milieu durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt werden,

501-'S l401 D) NoMy ('6)

109850/1715

worauf die Proteasen aus der klaren Brühe mit Hilfe von Mineralsalzen abgeschieden oder mit einem organischen Lösungsmittel ausgefällt werden.

Ziel der Erfindung ist eine Verbesserung dieser Extraktionsverfahren., insbesondere zum Zwecke der Erzeugung von Proteasen größerer Reinheit durch selektive Isolierung derselben.

Dieses Ziel kann durch das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren erreicht werden, mit dem reinere Produkte mit verbesserten organoleptisehen Eigenschaften, wie Geruch oder Farbe erhalten werden. Im übrigen entfallen gemäß der Erfindung die durch den hohen Mineralsalzgehalt in den Abscheidungseffluenten bedingten Probleme, was die Reinigung vereinfacht .

Das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren, bei dem ein in alkalischem Milieu aktive Proteasen produzierender Mikroorganismus in einem geeigneten Milieu gezüchtet wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß man - nach Beendigung der Fermentation - zu der vollständigen Fermentationsbrühe ein nichtionisches adsorbierendes Harz mit großer spezifischer Oberfläche hinzugibt und mit der Brühe 2 bis 20 Stunden lang in Kontakt läßt, daß man dann dieses Harz von der Gärbrühe trennt und mit einer auf einen pH-Wert zwischen 9 und 11 gepufferten hydroalkoholischen Lösung, die 5 bis 20 % eines Alkanols mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen enthält, eluiert und die Proteasen aus dem Eluat durch an sich bekannte Mittel gewinnt.

Unter einem nichtionischen Harz wird dabei ein Harz

109850/1715

verstanden, das ausschließlich durch ein dreidimensionales Polymernetzwerk gebildet wird, das keinerlei funktioneile Grupnen, d. h. ionische Gruppen, enthält.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Extraktionsverfahren arbeitet man vorzugsvreise wie folgt: Fan verwendet ein poröses nichtionisches Harz mit einem f-'iakronetzwerk, dessen ⁿoren einen Durchmesser von 50 bis 250 8 haben und dessen adsorbierende Oberfläche bei 250 bis 1.000 π /g liegt. Ein solches Harz kann ein acrylisches Harz sein, wie beispielsweise das im Handel unter der Bezeichnung' "Amberlite XAD?" von Röhm & Haas erhältliche Harz 'mit einem ^orendurchmesser von etwa 87 S und spezifischer Oberfläche

2
von hk^:j m ^/g).

Man bringt im allgemeinen, auf einmal oder in mehreren Malen, 100 bis 500 ml Harz pro Liter Gärbrühe zusammen. Meistens läßt man das Harz mit der vollständigen Brühe 2 bis 15 Stunden lang in Kontakt, um eine gute Adsorption von Proteasen am Harz zu ermöglichen. Man trennt dann das Harz von dieser Brühe durch einfaches Absieben ab.

Das Harz wird dann in eine Säule gebracht und mit einer vorzugsweise auf pH 10,5 +0,1 gepufferten hydroalkoholischen Lösung, die 5 bis 10 \? Methanol enthält, eluiert, wobei das Volumen der Lösung 5- bis 5-mal so groß ist wie das des verwendeten Harzes. Das Eluat wird gesammelt und durch Einengen im Vakuum vom Methanol befreit. Ausgehend von der verbleibenden Lösung kann man dann die Proteasen durch Zerstäubung, Gefriertrocknen, Ausfällung oder Abscheidung gewinnen.

Es wurde festgestellt, daß man so im Mittel 70 bis 90 %

109850/1715

der in der vollständigen Gärbrühe enthaltenen Proteasen gewinnen kann, was eine ausgezeichnete Extraktionsausbeute darstellt.

Es folgen zwei nicht einschränkende Beispiele für die Durchführung der Erfindung.

Beispiel 1

In einem geeigneten Nährmedium wurde ein Stamm von in alkalischem Milieu aktive Proteasen produzierendem Bacillus Subtilis 36 Stunden lang bei J53° C aerob gezüchtet. Zu 280 ml der gesamten Gärbrühe ''mit einem Gehalt von 67,2 nroteolytisehen Einheiten üro ml) wurden 90 ml nichtionisches Harz i.Amberlite XAD? von Röhm & Haas) hinzugefügt und I5 Stunden lang unter mäßigen Rühren in Kontakt gelassen.

Das Harz wurde dann abgesiebt, in eine Säule gebracht und mit 270 ml durch 0,05 M Natriumbicarbonatlösung auf pH 10,5 gepufferter hydroalkoholischer Lösung, die 10 % Methanol enthält, eluiert.

Das Eluat wurde zur Abtrennung des Methanol im Vakuum eingeengt und dann lyophilisiert. Es wurden so 1,2 g eines Produktes mit 12.000 proteolytischen Einheiten pro Gramm entsorechend einer Gesamtausbeute von 76 Ί erhalten.

Beispiel 2

Zu 500 ml vollständiger Gärbrühe, die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen "/erfahren erhalten wurde und 75 pro-

109850/1715

teolytische Einheiten pro ml enthielt, wurden l4o ml Harz XAD 7 hinzugefügt und 12 Stunden lang unter Rühren in Kon_T takt gelassen.

Das Harz wurde dann abgesiebt, in eine Säule gebracht und mit 400 ml eines dem in Beispiel 1 angegebenen entsprechenden Eluenten eluiert.

Durch Einengen des Eluats im Vakuum wurden 60 ml einer Lösung mit etwa 500 proteolytisehen Einheiten pro ml erhalten. Die Proteasen dieser Lösung wurden durch Zugabe von 2 Volumina Isopropanol '120 ml) ausgefällt. Nach dem Trocknen des Niederschlages wurden 2 g Produkt mit einem Gehalt von 15 000 proteolytischen Einheiten pro O-ramm, d. h. eine Ausbeute von 8o % erhalten.

109850/1715

Claims (3)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Extraktion von in alkalischem Milieu aktiven Proteasen ausgehend von der gesamten Fermentationsbrühe, in der die Proteasen durch Mikroorganismen gebildet wurden, dadurch gekennzeichnet, daß man zu der vollständigen Gärbrühe ein nichtionisches adsorbierendes Harz mit großer spezifischer Oberfläche hinzugibt und mit der Brühe 2 bis 20 Stunden lang in Kontakt läßtj daß man dann dieses Harz von der Gärbrühe trennt und mit einer auf einen pH-Wert zwischen 9 und 11 gepufferten hydroalkoholischen Lösung, die 5 bis 20 $ eines Alkanols mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen enthält, eluiert und die Proteasen aus dem Eluat durch an sich bekannte Mittel gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Harz ein poröses Harz mit einem makromolekularen Netzwerk und einem Porendurchmesser von 50 bis 250 Ä und einer adsorbierenden Oberfläche von 250 bis 1.000 m /g verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Harz ein acrylisches Harz verwendet wird.

109850/1715