DE1442143A1 - Herstellung von Aminopeptidase - Google Patents

Description

Herstellung von Aminopeptidase

Unter den in neuerer Zeit näher untersuchten Peptidasen kommt der Leucinaminopeptidase eine steigende praktische Bedeutung zu. Dieses Ferment ist ein wertvolles Hilfsmittel

sowohl bei der strukturellen Aufklärung von Proteinen als auch bei der Analytik auf dem Gebiet der synthetischen Peptide ("The Enzymes" von Boyer,. Lardy und Myrbäck, 2. Ausgabe, i960, "4. Band, S. yj ff., insbesondere S. βθ). Leucinaminopeptidase spaltet Peptidbindungen von der N-terminalen Aminosäure her, wobei eine strenge Spezifität für die Spaltung von ausschließlich linksdrehenden Aminosäuren besteht. Die fermentative Hydrolyse von Eiweißen mit Hilfe des genannten Enzyms kann sowohl als technischer Prozeß durchgeführt als auch pharmakologisch ausgenutzt werden.

Obwohl bekannt ist, daß Leucinaminopeptidase in Pflanzen, Mikroorganismen und im tierischen Organismus vorkommt, ist sie lediglich in tierischen Organen in einer solchen Menge vorhanden, daß sich eine Isolierung aus der Niere, z. B. der Schweineniere, der Milz, dem Herzmuskel oder anderen Organen lohnt. Eines der bekanntesten Verfahren, mit dessen Hilfe Leucinaminopeptidase von hoher Reinheit gewonnen werden · kann, haben Davis und Smith im J,- physiol. Chem., 224 (1957), S. 2β1 bis 275, beschrieben. Dieser über sechs Stufen führende Prozeß hat sich für die technische Herstellung des genannten Ferments nicht als geeignet erwiesen, da mit seiner Hilfe nur ein geringer Teil der in den verarbeiteten Schweinenieren enthaltenen Leucinaminopeptidase gewonnen werden konnte.

Es wurde nun gefunden, daß sich Aminopeptidase bzw. ein Gemisch von in ihrem Aufbau sehr ähnlichen Aminopeptidasen in

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einfacher Weise und mit ausgezeichneten Ausbeuten aus tierischen Organen auf folgendem Wege gewinnen läßt:

Tierische Organe, wie Niere, Leber, Hirn oder Herz,* werden mechanisch zerkleinert und mit Wasser bzw. einer is'otohischen Salz- oder Zuckerlösung aufgeschlämmt. Aus dieser Aufschlämmung wird die feindisperse Zellfraktion isoliert, erneut in eine wäßrige Phase gebrächt und mit Toluol oder einem gleichwertigen, Lipoid lösenden organischen Lösungsmittel versetzt. Die an der Phasengrenzfläche sich abscheidende Fraktion wird gesammelt und der Einwirkung eines proteolytischen Enzyms unterworfen. Dabei wird die Aminopeptidase von der Trägersubstariz befreit und .in an sich bekannter Weise gewonnen.

Zur Durchführung des Verfahrens kann man z. B. so vorgehen, daß man zunächst das mit Wasser oder einer Salz- bzw. Zuckerlösung aufgeschlämmte Mahlgut, gegebenenfalls nach einer weiteren Homogenisierung, in üblicher Weise in einer Zentrifuge in grobdisperse Anteile und in die gelöste, kolloidal verteilte und feindisperse Stoffe (Mikrosomen und andere Zellfraktionen) enthaltende wäßrige Phase trennt. Die Zentrifugalbeschleunigung beträgt dabei, wie dies von der Durchführung ähnlicher Trennprozesse her bekannt ist,.das 10 000-bis 4o. 000-fache der Erdbeschleunigung. " ' "

Der Hauptteil der zu isolierenden Aminopeptidase befindet sich in dem trüben wäßrigen Medium und ist an eine Träger-' substanz gebunden, deren chemischer Aufbau bisher nicht si- ■ eher aufgeklärt werden konnte. Es steht jedoch fest, daß es sich dabei um Substanzen mit Eiweißcharakter, vermutlich um Lipoproteine, handelt, die unter der Einwirkung proteolytische;r-"-Enzyme hydrolytisch aufgespalten werden können. Als Voraussetzung "für einen·weitgehend glatten Ablauf der Hydrölyse^Sbr-.Trägersubstanz, die für die Isolierung der "Ämino- " peptidase'unerläßlich ist, hat sich eine in ihrem Ablauf bis-

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her nicht vollständig aufgeklärte strukturelle Veränderung des das Enzym bindenden Trägers als notwendig erwiesen. Diese strukturelle Veränderung wird durch die genannte Einwirkung von Toluol oder einem gleichwertigen Lösungsmittel erreicht. Dabei können verschiedene Methoden zur Anwendung kommen:

Die nach Abtrennung der grobdispersen Faserteile erhaltene wäßrige Phase kann erneut zentrifugiert werden, und zwar bei einer Zentrifugalbeschleunigung von 50 000 bis 100 000 g. Das dabei erhaltene Sediment enthält Zellfraktionen, darunter die enzymtragenden Mikrosomen. Es wird in einer.Pufferlösung aufgeschlämmt und gegebenenfalls nach vorherigem Waschen mit Toluol versetzt. Die eine Weiterverarbeitung beschleu- ■ nigende Phasentrennung zwischen wäßriger und organischer Phase kann durch kurzes Zentrifugieren bewirkt werden. Zwischen der oberen Toluol- und der unteren wäßrigen Phase bildet sich eine lipoproteinhaltige Zwischenschicht aus, in der sich der Hauptanteil an enzymatischer Aktivität befindet. Diese Zwischenschicht wird in üblicher Weise isoliert, wiederum mit einer wäßrigen Pufferlösung verdünnt und mit einem proteolytischen Enzym, z. B-.. mi.t wäßriger Trypsinlösung, versetzt. Während die Trägersubstanz offensichtlich bei dem bisherigen Prozeß so weit verändert worden ist, daß sie rasch abgebaut wird, widersteht das native Ferment bei geeigneter Wahl von Proteasekonzentration, Arbeitstemperatur und Hydrolysedauer einer schädigenden Einwirkung des eiweißspaltenden Enzyms.

Eine weitere Möglichkeit, den aminopeptidasehaltigen Träger zu isolieren und diesen enzymatisch abzubauen, besteht in folgendem Vorgehen: Der nach Abtrennung der grobdispersen Organteile anfallende wäßrige Überstand wird über eine Anschwemm-Filterschioht aus z. B. Kieselgur oder aus einem unter dem

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Handelsnamen Sephadex bekannten, chemisch modifizierten Dextran-Gel gegeben. Die feindispersen Anteile, darunter die zu isolierende, Peptidäse enthaltende Trägersubstanz, werden von einem solchen Filter zurückgehalten* Nach Aufschlämmen des beladenen Filters mit Pufferlösung wird Toluol zugesetzt. Dabei tritt die bereits beschriebene Drei-Schichten-Bildung ein» Die "mittlere Schicht wird in der angegebenen Art weiterverarbeitet. ' - ■■--.

Mit besonderem Vorteil ist es möglich, die nach Abtrennung der grobdispersen Teile anfallende wäßrige Lösung unmittelbar mit Toluplauszuschütteln, wobei die für die erfindungsgemäße Aminopeptidasegewinnung notwendige strukturelle Veränderung · der enzymhaltigen Trägersubstanz ebenfalls erreicht wird und die Drei-Schiehten-Bildung eintritt.

Als Mittel, die Fette zu lösen vermögen, mit Wasser nicht mischbar sind und nicht enzymschädigend.wirken, können außer Toluol beispielsweise Xylol, Petroläther oder Benzol verwen-. det werden. Die den Proteaseangriff ermöglichende Veränderung der Trägersubstanz kann durch den Zusatz fettspalfcender Enzyme' unterstützt werden. Wenn es auch grundsätzlich möglich ist, die erforderliche und als Gefügeaufidekerung vorstelle ' bare strukturelle Veränderung ausschließlichfermentativ _:' durchzuführen, hat sich die Verwendung eines organisenen'. Lösungsmittels der gekennzeiehneteh Art. wegen der Ausbildung feiner Zwischenschicht^ in der sich das an ei^ne Tfägörsub-^ ,- * stanz gebundene Enzym befindet, als zweckvoll erwiesen* Mit "/' t der" Äbtreiinuhg dieser Zwischenschicht fiiidefe eine die Wirt- .,'■■ sehäftiiehkeils des Verfahrens erst iimöglieilendeι Konzentrier · ·' ' ■ rung der zu gewinhönden^ Wirksubätänz^ stati;* '

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enthaltende wäßrige Lösung, die gegebenenfalls vor einer Weiterverarbeitung von Trübstoffen in an sich bekannter Weise befreit werden kann. Die Isolierung des Enzyms aus der klaren Lösung wird, wie dies auch von der Gewinnung anderer Enzyme her bekannt ist, auf chromatographischem Wege durchgeführt. Mit besonderem Vorteil verwendet man dabei das bereits genannte chemisch modifizierte Dextran-GeI, das bekanntlich gleichzeitig als Molekularsieb und als Ionenaustauscher wirkt und die in der wäßrigen Lösung enthaltene Aminopeptidase zusammen mit zugesetzter Protease zurückhält. Durch übliches Auswaschen mit Pufferlösung kann die Aminopeptidase eluiert und in an sich bekannter Weise, Z^ B. durch Konzentrieren im Vakuum, durch Gefriertrocknung oder Fällung", gegebenenfalls nach vorherigem Dialysieren der wäßrigen Lösung, in reiner Form gewonnen werden. Es verdient hervorgehoben zu werden, daß die erfindungsgemäß hergestellte Aminopeptidase stabiler als die nach bisher bekannten Verfahren hergestellten Aminopeptidasen, z. B. als Leucinaminopeptidase, ist. Die erfindungsgemäß isolierten Peptidasen zeichnen sich gegenüber der Leucinaminopeptidase, die z. B. nach dem eingangs beschriebenen Verfahren von Davis und Smith hergestellt worden ist, vor allem hinsichtlich der Spaltungsgeschwindigkeit von Peptidbindungen verschiedenartiger Aminosäuren aus. - Das erfindungsgemäß· hergestellte Produkt kann sowohl für die Durchführung technischeir Prozesse als auch als pharmakologische Wirksubstanz verwendet werden* .

ORIGINAL INSPECTED -6 -

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Claims (6)

' Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer Aminopeptidase aus tierischen Organen durch Isolierung der das Enzym.enthaltenden Zellteile und Freisetzung des Enzyms daraus,

dadurch gekennzeichnet,

daß aus der Aufschlämmung der zerkleinerten Organe die feindisperse Zellfraktion isoliert wird, in eine wäßrige Phase gebracht und mit Toluol oder einem gleichwertigen, Lipoid lösenden, organischen Lösungsmittel versetzt, die, an der Phasengrenzfläche sieh sammelnde Fraktion gesammelt und der Einwirkung einer Lösung eines proteolytischen Enzyms unterworfen wird, worauf die auf diese Weise von der Trägersub-. stanz befreite Aminopeptidase in wäßriger Lösung in an sich bekannter Weise gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die die Aminopeptidase enthaltende feindisperse Zellfraktion durch Zentrifugieren bei einer das 50 000- bis 100 000-fache: der Erdbeschleunigung ausmachenden Zentrifugalbeschleunigung, mit Vorteil bei 80 000 bis 100 000 g, isoliert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die feindisperse Zellfraktion durch Filtration über Anschwemmschichten isoliert wird.

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4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die nach Abtrennung der grobdispersen Teile anfallende
wäßrige Phase unmittelbar mit Toluol ausgeschüttelt und die sich zwischen organischer- und wäßriger Phase sammelnde Fraktion weiterverarbeitet wird» ·

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß.die unter der Einwirkung des organischen Lösungsmittels eintretende strukturelle Veränderung durch die Mitverwendung von Lipasen unterstützt wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die durch proteolytischen Abbau der .Trägersubstanz in Freiheit gesetzten Aminopeptidasen aus der'wäßrigen Lö-· sung chromatographisch isoliert werden.