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Verfahren zur Gewinnung von biologisch wirksamen Produkten Gegenstand
der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Spaltprodukten
des adrenocorticotropen Hormons. Solche Präparate sind wertvoller Heilmittel, so
z. B. bei rheuma,to,ide!r Arthritis. Für ihre therapeutische Anwendung ist es jedoch
von größter Bedeutung, daß sie möglichst rein von anderen Bestandteilen, vor allem
von hochmolekularen: Abhauprodukten., sind.
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L i, E v a. n s und S i m p s o n haben erstmals im Journal of Biologica,l
Chemistry, Bd.. 149 (1g43), S. 413, die Möglichkeit aufgezeigt, durch vorsichtige,
proteolytische Hydrolyse biologisch aktive Abbauprodukte des adrenocorticotropen
Hormons zu gewinnen. Sie .gingen, dabei so, vor, da,ß sie auf ein physikalisch einheitliches,
reines Präparat des adrenocorticotropen Hormons aus Schafshypophysen kurze Zeit
Pepsin- oder Trypsinpräpara,to einwirken ließen. Im geeigneten Moment wurdet die
Ferme@ntwirkung durch Erhitzen der Reaktionslösung unterbrochen. Bei dieser Arbeitsweise
zeigten die erhaltenen Präparate die gleiche biologische Wirksamkeit wie das Ausgangsmaterial,
wenn durch die Proteolyse mit Pepsin nicht mehr als 36 bis 37°/0 und mit Trypsin
nicht mehr als 16 bis 180/a des eiweißartigen Hormons abgebaut wurden. Eine länger-
dauernde Einwirkung der proteolytischen Fermente dagegen führte zu
einer
vollständigen Irnaktivierüng des Hormonpräparateis. So war ein solches bereits wirkungslos,
wenn 2611h, des: Proteins durch dies Trypsineinwirkung abgebaut worden waren. Gemäß
einer späteren Publikation hat Li Präparate aus. Schafshypophysen analog der obigen
Methode, partiell hydrolysieirt (Josiah Macy, Jr. Foun dation, Transactions of the,
Soventoemth Meeting, Con,forencej of Metabolic Aspects of Convalescence, New York,
N7. Y., 194$) S. I14). Aus der erhaltenem Lösung wurden dann die hochmolekularen
Bestandteile und zugesetzten Fermente durch Fällung mit Trichloressigsäure entfernt.
Ähnliche Spaltprodukte haben nach einer Mitteilung im Journal 0f the American Chemical
Society, $d.72 (195o), S. 1040, Brink, Meisinger und Folkers durch Pepsin-Hydrolyse
eines Präparates dös adren:acorticotropen Hormons aus Schweinehypophysen erhalten.
Dabei wurde die Fermentwirkung durch Verdünnung unterbrochen und die, Reaktionslösung
anschließend gegen destilliertes Wasser dialysiert.
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Es wurde nun, ,gefunden, daß. bei der hydrolytischen, Spaltung des
adrenocorticotropen. Hormons in .einfacher Weise direkt weitgehend gereinigte, biologisch
aktive Spaltprodukte er-halten werden:, wenn man, gleichzeitg mit der Hydrolyse
die Reaktionslösung dialysiert und aus denn Dialys.at die Spaltprod'ukto isoliert.
-Für die hydrolytische Spaltung können beliebige, das adrenocorticotrope Hormon,
z. B,. des Hypophysenvorderlappens, enthaltende Materialien verwendet worden; vorzugsweise
geht man jedoch- von möglichst einheitlichen, reinen Präparaten. aus. Die hydrolytische
Spaltung wird insbeson.dero mit proteolytisch.enl Fermenten:, wie Pepsin oder Trypsin,
vorgenommen. Sie kann jedoch auch mit anderen hydrolytischen, Mitteln, wie z. B.
mit Mineiralsäuren, wie verdünnte Salzsäure, durchgeführt werden. Bei der Dialyse
arbeitet .man mit Vorteil so, daß, diel Außeufüssiigkeit annähernd den gleichen
p11-Wert wies die Innenflüssigkeit aufweist. Wird z. B. das, adrenocorticotrope
Hormon mit einem Ferment, wie Pepsin in saurer Lösung, gespalten, so dialysiert
man: gegen eine, Lösung mit einer gleichen Konzentration an Säure-. Als sennipormeablo
Trennungsflächen; der beiden Lösungen verwendet man vorzugsweti#so solche, die nur
für niedermolekulare Peptido durchlässig sind. Die Form und Größe der samipermoablon,
Membran wird so gewählt, daß eine möglichst wirksame Dialyse und damit eines rasche
Entfernung der gebildeten aktiven Spaltprodukte des adren0cozticotropenl Hormons
aus, dem Reaktionsmedium gewährleistet ist. Zweckmäßig wird die Außenflüssigkeit
ständig emenort. Eine: ,besondere Ausführungsform besteht darin:, daß man als Hydrolysie;rgeifäß.
einen, langen, schmalen Schlauch aus halb-durchlässigeim Material verwendet. Dieser
wird, gegebenenfalls in bewegtem Zustand, von der Außenflüssigkeit in Form einer'
- fließenden, dünnen, Schicht, z. B,. in einem passenden Rohr, umspült. Die Gewinnung
der wirksamen Spaltprodukte aus dem Dialysat erfolgt in üblicher -Weise. Vorzugsweise
wird die Lösung lyaphi.lisiert, d. h. eingefroren und das Lösungsmittel im Vakuum
verdampft.
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Das, neues Verfahren -vermeidet den, weitergehenden, Abbau der entstandenen
aktiven Spaltprodukte 'des a@dren:oco-rticotropem, Hormons, indem es diese sofort
nach ihrer Bildung aus dem Reaktionsmedium entfernt. Dadurch ist es möglich, in
einfacher Weiiso praktisch die Gesamtmenge! des adronoco,rticotropen Hormons zu
spalten. und eine entsprechend hohe Ausbeute an Spaltprodukten zu erzi eilen.
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Die Erfindung wird in; den: nachstehenden Beispielen näher beschrieben.
Zwischen Gewichtsteil und Volumteil besteht die gleiche: Beziehung wie zwischen
Gramm und Kubikzentimeter. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. Beispiel
i 5 Gewichtsteile eines nach der Methode von F i s h m an (Journal of Biological
Cheimistry, Bd. 167 [1g47], S. 42,5) hergestellten, Präparats des adremocorticotropen
Hormons aus Schwoineihypo,-physein worden in; iooo Volumteiil.en einer Lösung von
o,5 Gewichtsteilen Pepsin in. o,o5 n, HCl gelöst und: die, Lösung in; einen dünnwandigen
Dialysier-Schlauch, dessen; Oberfläche im Verhältnis zum In; halt möglichst -groß
ist, gefüllt. Der -Dialysieirschlauch. wird hierauf in ein mit io ooo Volumteilen
o,o5 n-H Cl beschicktes, bei 37''° gehaltenes Dialysiergefäß! eingesetzt und die
gut gerührte Außenflüssigkeit alle 30 Minuten abgehebert und, durch die -gleiche
Menge auf 37° vorgewärmte o,o5 n-H Cl ersetzt. Die abgeheberten, die niedermolekularen,
aktiven Spaltprodukte des Hormons enthaltenden Fraktionen der Außenflüssigkeit werden
sofort lyophilisiort, die Trockenrückstände gewogen und im Ascorbinsäurovorminderungstest
nach Sayors, S ay e.rs und' W o,o,.db,u ry auf adrenoco@rticotropo Hormonwirkung
.geprüft. Es ergibt sich, daß die zuerst dia,lysiie@rten farblosen Produkte nur
eine, geringe biologische Aktivität zeigen; die, hernach gewonnenen Außendialysate-
ergeben gelbgefärbte Trockenrückstände, die die gleiche Aktivität wie das zur Hydrolyse
eingesetzte Präparat aufweisen. Die, aus den letztem Dialysaten isolierten fa.rblosett
Trockenprodukte zeigen nur geringe Aktivität. -B@eis.piel2 Eine konzentrierte Lösung
des Rohextrakts des adremocorticotropen Hormons, enthaltend 2o Gewichts.teilo eines
saureal, So°/aigen Acetom:eixtralrts der isolierten Hypophyenvord'eirlappen des
Wales wird in, 40o Volumteilen einer auf d° abgekühlten Lösung vom. i Gewichtsteil
Pepsin in mit Toluol gesättigter 0,05, n, -H Cl gelöst. Diese Lösung wird.
hierauf ins einen langen, schmalen, dünnwandigem Dialysierschlauch aus Viskosefolie
eingefüllt und der so vorbereitete Schlauch in eine geeignete, auf die .optimale
Hydro,lysiorteimpeiratür vom 37'° aufgeheizte Dialysierapparatur eingesetzt. Diese
Apparatur besteht im wesentlichem aus .einem geraden, senkrecht stehenden., der
Schlauchlänge!
angepaßten Rohr, z. B. aus Glas, dessen: Innendurchmesser
nur wenig größer ist als derjenige des gefüllten Cellophanschlauches. Der in das
Rohr eingesetzte Dia.lys.ierschla:uch wird mittels einer Ro:tiervorrichtung, an
deren senkrecht stehender Achse er aufgehängt ist, während der ganzen Dauer der
Hydrolyse in drehender Bewegung gehalten und währenddessen von der den Raum zwischen
Schlauch und Rohrinnenwandung ausfüllenden, ständig erneuerten Außenflüssigkeit
umspült. Aus der kontinuierlich abfließenden Außenlösung wird das Dialysiergut durch
Einfrieren, und Verdampfen des gefrorenen Lösungsmittels im Vakuum isoliert.
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Die Erneuerung der Außenflüssigkeit wird während des Versuchs so reguliert,
daß innerhalb 3 Stunden -2o ooo Volumteile frischer Lösung zu-bzw.ebenso viele der
das Dialysiergut enthaltenden Lösung abfließen. Das so gewonnene, die niedermolekularen
Spaltprodukte des adrenocorticotropen Hormons enthaltende Außendialvsat hinterläßt
nach dem Verdampfen des Lösungsmittels 13 Gewichtsteile eines leicht wasserlöslichen,
durch Pigmente bläulich gefärbten Produkts, dessen im Ascorbinsäureerniedrigungstest
bestimmte biologische Aktivität mit der des zur Hydrolyse eingesetzten Rohextrakts
identisch ist.
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Nach Ablauf dieser Versuchsdauer wird unterbrochen und dem Inhalt
des Dialvsierschlauches nochmals i Gewichtsteil Pepsin zugesetzt, worauf die Hydrolyse
unter Einhaltung der gleichen Versuchsbedingungen fortgeführt wird. Es können so
innerhalb 2 Stunden aus 16 ooo Volumteilen abgelaufener Außenlösung nochmals 3 Gewichtsteile
Dialysiergut mit der gleichen biologischen Wirks s ainkeit gewonnen werden. Beispiel
3 2o Gewichtsteile eines aus ganzen Schafshypophysen gewonnenen Präparats des sogenannten
Rohprolactins werden unter Einhaltung der gleichen Gewichts- und Volumverhältnisse
und unter den in Beispiel a beschriebenen Versuchsbedingungen einer gleichzeitigen
Hvdrolyse und Dialyse unterworfen. Aus den nach 3 Stunden Versuchsdauer erhaltenen
ad. ooo Volumteilen Außenflüssigkeit isoliert man 1-a Gewichtsteile niedermolekulare
Spaltprodukte des adrenocorticotropen Hormons als weißliches Pulver; seine biologische
Aktivität beträgt die Hälfte des der Hydrolyse unterworfenen Rohhormons. Durch Fortsetzung
der Hydrolv se unter den gleichen Versuchsbedingungen, jedoch nach nochmaligem Zusatz
von i Gewichtsteil Pepsin, können nach 2stündiger Versuchsdauer zusätzlich 2 Gewichtsteile
eines gleich aktiven Dialysats gewonnen werden. Eine Prüfung der Innenlösung zeigt,
daß diese immer noch etwa io°/o der ursprünglichen Gesamtaktivität aufweist und
daher noch auf zusätzliche Mengen des aktiven Dialysats ausgebeutet werden kann.