DE1932527A1

DE1932527A1 - Blutstillendes Praeparat und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE1932527A1
Application number: DE19691932527
Authority: DE
Inventors: Kenjiro Koyama; Yoshito Matsumoto; Yasuko Takeda
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1968-06-26
Filing date: 1969-06-26
Publication date: 1970-02-19
Also published as: DE1932527B2; DE1932527C3; US3761586A; FR2011689A1

Description

DR. ELISABETH JUNG, DR. VOLKER VOSSIUS, DIPL.-ING. GERHARD COLDEWEY

8 MÖNCHEN 23 · SIEGESSTRASSE26 . TELEFON 34 6067 ■ TELEGRAMM-ADRESSE: INVENT/MONCHEN

TELEX 5 29 686

26. Junii969

u.Z.: E 367 (Vo/Mü/Κ)

CHUGAI SEIYAKU XABUSHIKI EAISHA
Tokyo/Japan

"Blutstillendes Präparat und Verfahren zu geiner Herstellung"

Priorität: 26, Juni 1968, Japan,Nr* 43936/68 6 ο August 1968, Japan., Nr₀ 55284/68

Die Erfindung betrifft ein blutstillendes Präparat und das Verfahren zu seiner Herstellung aus dem Gift einer Giftschlange der Gattung Trimeresurus₀

Die sogenannte "Habu"-Sehlange ist eine Giftsehlange, die zu der Gattung Trimeresurus der Familie Crotalidae gehört „ Als Beispiele für diese Gattung seien genannt: Trimeresurus flavoviridis, Trimeresurus okinavensis, Trimeresurus elegans, Trimeresurus tokarensis, Trimeresurus tinkami, Trimeresurus mucrosquamatus und Trimeresurua stejnegeri. Wenn nicht besonders angegeben, so sind unter dem Ausdruck "Habu" diese Schlangen gemeinte

00 98 08/1640

Die Schlange "Habu" ist für ihre große Giftigkeit bekannt tand ist auf den Tokarainseln und südlich davon beheimatet, Ihr Gift ist gefurcht et, da es bei Menschen und Tieren durch seine hämorrhagische und gewebenekrotische Wirkung tödlich wirkt_o

Bei der Untersuchung der Giftwirkung des Gifts der "Habu¹¹-Schlange wurde überraschenderweise festgestellt, daß eine durch eine bestimmte Behandlung des Giftes erhaltene Substanz eine stark blutstillende Wirkung aufweist, die klinisch mit zufriedenstellen- ^ dem Erfolg verwendet "werden kann ο

Das Präparat der Erf inciting wird hergestellt, indem man eine wäßrige Lösung des Giftes der Schlange "Habu" zur Entfernung der Lipide mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, die wäßrige Phase dialysiert, die aktive Substanz der dialysierten Lösung an Sephadex¹*' adsorb:' rb, mit Phosphat»

piiffer eluiert, die aktive Substanz in einer Fraktion mit stark blutkoagulierender Wirkung auffängt und säulenchromatographisch an einem basischen Ionenaustauacherharz die Fraktion mit der stärksten blutkoagulierenden Wirkung gewinnt ο

' Das Verfahren der Järfindung ' ist in folgender l'abelle schematisch dargelegt·

0^164 0

BAD

Tabelle I

P-I-A

Wäßrige Lösung des rohen Giftes

Entfernung der Lipide

Zentrifugieren

wäßrige Phase organische Phase und Niederschlag

Dialyse

SVI-B dialysierte Lösung

Sephadex-Säulenchroaatographie Waschen mit Wa.sser
Zentrifugieren

q| wäßrige Ph~aae| Hiederschl'ag organische Phase

f-II F-III

P-Ti P-II P-III P-IV

-f + blufckoagulierende Wirkung + + hämorrhagische Wirkung

DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie

D-II

D-IV

D-V

•H-

D-VI "blutkoagulierende Wirkung
hämorrhagiöohe Wirkung

Das rohe Gift wird zuerst in destilliertem Wasser gelöst, dessen pH-Wert vorher auf "7,0 mit Alkali eingestellt wurde, land die Lösung viird meliJMS! Male mit dem gleichen Volumen, eines organischen Lösungsmittels. z.B-, Chloroform, Äther oder Äthylacetat, extrahiert und dann zentrifugiert ο

Da bei dieser Extraktion Lipide des Giftes in die organische Phase gehen, wird nur die wäßrige Phase (P-I-A) verwendet und gegen destilliertes Wasser öialysiert, wodurch man die dialysierte Lösung P (F-I-B) erhalte Bei dieser Stufe kann ein Verlust an aktiver Substanz wirkungsvoll verhindert werden, wenn man die wäßrige Phase F-I-A mit der wäßrigen Phase di&lyslert, die man beim Waschen 4er

organischen Phase F-IIX und des Niederschlages F-II mit wenig ■ Wasser erhält.

Die wäßrige Lösung des rohen Giftes und die wäßrige Phase nach Entfernen der Lipide. F-I-A und F-I-B absorbieren bei 280 mfv fast gleich stark, was zeigt, daß der Großteil des Proteins in die wäßrige Phase gegangen ist. Die Tatsache, daß die dialysierte Lösung eine etwas geringere Abi3orption aufweist, läßt sich dadurch erklären! daß durch die Dialyse niedermolekulare Substanzen entfernt worden sind,

Bei der Untersuchung der Blutgerinnungszeit des rohen Schlangengiftes in F-I-A, F-I-B, F-II und F-III nach der Recalcifizierungszeitraethode an Kaninchenpiasina zeigt sich, daß die koagulierende Wirkung des rohen Giftes, F-I-A und F-I-B fast gleich stark ist und in F-II und F-III kaum Aktivität beobachtet wird * Diese Ergebnisse zeigen, daß der Großteil der aktiven Substanz in der

009808/1640

BAD ORIGINAL

dialysierten Lösung enthalten ist«

Die so erhaltene Lösung enthält noch verschiedene schädliche Bestandteile, einschließlich des hämorrhagischen Paktors· Sie Lösung wird deshalb über eine Sephadexsäule gegeben. Bei Blut ion mit Phosphatpuffer erhält man die Fraktionen P-I bis P-IV. Die Fraktion P-I mit den hochmolekularen Bestandteilen enthält viel blutgerinnende Substanz, aber sie enthält ebenso noch viel hämorrhagischen Faktor₀ Deshalb wird der hämorrhagische Faktor säulenchromatographlsc'h an einem basischen Ionenaustauscherharz, z.B. Diäthylaminoäthyleellulose (DEAE-Cellulose), Triäthylaminoäthylcellulose (TEAE-Cellulose) und Diäthylaminoäthylcellulose-Sephadex (DEAB-Sephadex) entfernt, wobei man die Fraktionen D-I bis D-YI erhält, von denen die Fraktion D-III eine stark blutgerinnende Wirkung aufweist, aber wenig hämorrhagischen Faktor enthalte

Die so erhaltene aktive Substanz ist ein ausgezeichnetes Hämostat ikum mit thrombinähnlicher Wirkung» Seine blutgerinnende Wirkung 1st ungefähr mehrere Male bis 10 Mal so hoch wie die von bekannten, handelsüblichen blutstillenden Agentien_o Das Beispiel erläutert die Erfindung_o

500 mg des lyophilisierten rohen Giftes von i'rimeresurus okinavensis wurden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst, dessen pH» λ er t vorhirr mit Alkali auf 7,0 eingestellt wurde, Die Lösung vraräe mit 10 j al Chloroform ausgeschüttelt und anschließend zentrifugiert, Diese Maßnahme wurde 5 Mal wiederholt und dip «tiörige-Phase elt, Die Chloroformphasen und die HiedarsciüLäge wurden

noch zweimal mit destilliertem Wasser ausgeschüttelt und zentrifu-

00 9808/1640

BAD

1932523.

giert, wobei die wäßrigen Phasen gesammelt wurden, Diese wäßrigen. Phasen wurden mit der obengenannten wäßrigen Phase vereinigt» und das G-emisch wurde über Nacht gegen destilliertes v/asser dialysierto Die dialysierte Lösung wurde lyophilisiert ·

170 mg des Produkts wurden in 1 ml eines 1/70 m Phosphatpuffers vom pH-V/ert 7,4 gelöst, und die Lösung wurde über eine Sephadex-G-75 Säule (2 χ 46 cm) zur Adsorption der blutstillenden Substanz gegeben, Die Säule wurde bei 21⁰G mit t/70 m Phosphatpuffer mit einer Tropfgeschwindigkeit von 6 ml/Stunde eliiiert. Eine Fraktion mit stark blutkoagulierender Wirkung - getestet an Kaninchenplasma - wurde gesammelt und lyophilisiertο

55 mg des Produktes wurden in 1 ml 0,005 m Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 7» 1 gelöst, und die Lösung wurde über eine DEAE-Gellulose-Säule (0,9 χ 35 cm) zur Adsorption der blutstillenden Substanz gegebene Die Säule wurde mit einem Natriumacetatpuffergradienten von 0,005 m - 0,5 m eluiert*

Die Fraktion mit der am stärksten blutkoagulierenden Wirkung wurde gesammelt und lyophilisiert_o

Das Bndprodukt enthält keinen hämorrhagischen Faktor und keine anderen schädlichen Bestandteile und ist ein praktisch verwendbares blutstillendes Agens*

0098087 1640

8AD ORIGINAL

Claims

Patentansprüche

Ι» Blutstillendes Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es hergestellt worden ist, indem man eine wäßrige Lösung des Giftes der Schlange "Habu" mit einem organischen Lösungsmittel zur Entfernung der Lipide extrahiert, die" wäßrige Phase dialysiert, die aktive Substanz des Dialysats an Sephadex adsorbiert, die aktive Substanz nfit Phoephatpuffer eluiert» eine Fraktion mit stark blutkoagulierender Wirkung sammelt und säulenchromatographisch an einem basischen Ionenaustaucherharz eine Fraktion mit der am stärksten blutstillenden Wirkung gewinnt.

2„ Blutstillendes Präparat nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η -' zeichnet, daß das Gift von Trimereaurus flavoviridis, TrimeresuruB okinavensis, TrimereeuruB elegans, Trimeresurus tokarensis, Trimeresurus tinkami, Trimeresurus raucrosquamatus und Trimeresurus stejnegeri verwendet wird«

3. Blutstillendes Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß .zur Entfernung der Lipide aus der wäßrigen Lösung des Giftes der Schlange "Habu" Chloroform verxfendet wird»

4 ο Blutstillendes Präparat nach Anspruch 1, dadurch g e k ö η η zeichnet, daß die Dialyse gegen destilliertes Wasser durchgefUhrt -wird ο

5 ο Blutstillendes Präparat, dadurch ge kennzeichnet , daß es hergestellt worden ist, indem man eine wäßrige Lösung

OO980#/164 0 ~ „

BAD ORIGINAL

Schlange ^MHabu" mit einem organischen Lösungsmittel zur Entfernung der Lipide extrahiert und die wäßrige Phase dialysiert, wobei diese wäßrige Phase mit der Waschlösung, mit der die organische Phase und der Niederschlag der obigen Extraktion gewaschen wurden, vereinigt wird«, ...;..

6 ο Blutstillendes Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat die Form eines lyophilisierten Pulvers hat»

7° Verfahren zur Herstellung eines blutstillenden Präparats, dadurch gekennze i c h net , daß man eine wäßrige Lösung des Giftes der Schlange "Habu" mit einem organischen Lösungsmittel zur Entfernung der Lipide extrahiert, die wäßrige Phase dialysiert, die aktive Substanz an Sephadez adsorbiert, die aktive Substanz mit Phosphatpuffer eluiert, eine fraktion mit stark blutgerinnender Wirkung gewinnt und bei.der säulenchromatographischen Behandlung dieser Fraktion an einem basischen lonenaustauscherharz eine Fraktion mit der stärksten blutstillenden Wirkung erhält»

8o Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennze lohnet , daß das Gift von Trimeresurus flavoviridis, Trimeresurue okinaronsis, Trimeresurus elegans, Trimeresurus tokarensis, Triaeresuruß tinkami, Trimeresurus mucrosquaaatus und Trimeresurua etejnegeri verwendet wird.

9o Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, ' daß zur Entfernung der Lipide aus einer wäßrigen Lösung des Giftes der Schlange "Habu" Chloroform verwendet wirde

0 9 8 0 8/1640

BAD

■ ~. 9 -

1Oo Verfahren nach insprach 7* dadurch gekennzeichnet , daß gegen destilliertes Wasser dialysiert wird*

11, Verfahren nach Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, «daß man eine wäßrige Itäsung des Giftes der Schlange "Habu" mit einem organischen Lösungsmittel zur Entfernung der Lipide extrahiert mod die wäßrige Phase dialysiert ₉ wobei diese wäßrige Phase mit dem Waschwasser, mit dem die organische Phase und der Niederschlag der obigen Extraktion gewaschen wurde, vereinigt wird·'

009808/1640 BADORIGINAL