DE2607713C2

DE2607713C2 - Verfahren zur Enzymreinigung

Info

Publication number: DE2607713C2
Application number: DE19762607713
Authority: DE
Inventors: Steven Dudley 6500 Mainz Gorham; Derek John Wembley Middlesex Pope; Christopher Gawsworth Macclesfield Cheshire Rhodes
Original assignee: Biorex Laboratories Ltd
Current assignee: Biorex Laboratories Ltd
Priority date: 1976-02-25
Filing date: 1976-02-25
Publication date: 1984-04-12
Also published as: DE2607713A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von sehr reiner und hochaktiver Glucoronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase gemäß den Maßnahmen des Patentanspruchs 1. Die Patentansprüche 2 bis 9 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

In der US-PS 37 08 575 Ist ein Verfahren zur Behandlung von Herzarrhythmien, Thromben, Artheriosklerose, Zerebralinfarkten, Zerebralthrombosen, Koronarthrombosen und Herzinfarkten beim Menschen beschrieben, das darin besteht, daß man eine wirksame Menge einer isotonischen, sterilen Lösung von Glucoronoglykosaml-] noglykan-hyaluronat-lyase auf Intravenösem, intraarteriellem oder Intrathekalem Wege an Menschen injiziert, die einer solchen Behandlung bedürfen.

Viele der bislang zur Verfügung stehenden Hyaluronidase-Präparate enthalten sehr große Mengen anderer enzymatisch wirksamer Materialien neben dem Enzym, das tatsächlich für die Katalyse der Hydrolyse der Hyaluronsäure verantwortlich ist. Das heterogene Verhalten der Hyaluronldase wird In einer Veröffentlichung von Greillng et al [Z. physlol. Chem. 340 (1965) 243] diskutiert.

Die bislang zur Verfügung stehenden Hyaluronldase-Präparate sind häufig mit großen und variablen Mengen anderer Enzyme verunreinigt, wie /i-Glucoronldase, N-Acetyl-/i-hexosam!nldase, Arylsulphatase A und Arylsulphatase B.

Verfahren zur Herstellung von sehr reiner und hochaktiver Glucoronoglykosamlnoglykan-hyaluronat-lyase sind beispielsweise In der GB-PS 10 60 513 und auch von Borders und Raftery [J. BIoI. Chem. 243 (1968) 3756 bis 3762] beschrieben. Diese bekannten Verfahren sind jedoch für eine wirtschaftlich vertretbare Herstellung von Glueoronoglykosamlnoglykan-hyaluronat-lyase In großem Maßstab zu langwierig und zu kompliziert, so daß demzufolge ein Bedürfnis dafür besteht, ein wirtschaftlicheres Verfahren für die Herstellung von sehr reiner und hochaktiver Glucoronoglykosamlnoglykan-hyaluronatlyase anzugeben.

Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von sehr reiner und hochaktiver Glucoronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase, das dadurch gekennzeichnet 1st, daß man eine Lösung des rohen Enzyms zunächst mit einem Carboxylgruppen als aktive Gruppen aufweisenden, vernetzten Polyacryl-divinylbcnzol-Harz (beispielsweise dem unter dem Warenzeichen »Amberlite CG-50« erhältlichen Harz) in Kontakt bringt, das adsorblerte Enzym dann von dem Harz eluiert, die an dem gewünschten Enzym reichen Eluatfraktlonen gegen eine gesättigte wäßrige Ammoniumsulfatlösung dialysiert und das erhaltene Enzymkonzentrat dann mit einem aktive Carboxymethylgruppen aufweisenden vernetzten Dextrangel (beispielsweise dem unter dem Warenzeichen »CM-Sephadex« bekannten Material) In Kontakt bringt und anschließend das Gel unter Bildung einer Lösung der sehr reinen und hochaktiven Glucorosioglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase eluiert.

Alternativ kann man das nach der Dialyse gegen die Ammoniumsuli at lösung anfüllende Enzym konzentrat mit einem vernetzten Dextrangel in Kontakt bringen, das keine iiktiven Carboxymethylgruppen aufweist (beispiels-

weise mit dem Material, das unter den Warenzeichen »Sephadex 0-75« und »Sephadex G-100« erhältlich ist), wonach man das Gel eluieri. Die in dieser Weise erhaltene Lösung der hochaktiven Glucoronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase kann gewünschtenfalls weiter dadurch gereinigt werden, daß man sie mit einem aktive Carboxymethylgruppe aufweisenden, vernetzten Dextrangel (beispielsweise CM-Sephadex) In Kontakt bringt und das Gel anschließend eluiert.

Die als Ausgangsmaterial eingesetzte Lösung des κι rohen Enzyms kann in an sich bekannter Weise ausgehend von Irgendeinem Material hergestellt werden, das reich an dem gewünschten Enzym Ist. Wegen der guten Zugänglichkeit Ist es bevorzugt, für die Herstellung der Lösung des rohen Enzyms tierische Hoden, beispiels- π weise Rinderhoden, zu verwenden, obwohl man auch andere Materialien, wie Leber-Lysosomen, einsetzen kann.

Das in der ersten Stufe der Reinigung eingesetzte carboxylgruppenhaltige Harz wird vorzugsweise bei 2" Raumtemperatur mit einem 0,1 m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 6,0) äqulllbrlert bzw. Ins Gleichgewicht gebracht, wobei man das rohe Enzym vorzugsweise auch in dem gleichen Puffer löst. Man kann das Harz in einer Säule einsetzen oder man kann diese Stufe absatzweise 2> durchführen, Indem man das Harz In einem mit einem Rührer ausgerüsteten Gefäß mit der Enzymlösung In Kontakt bringt. Nach dem Waschen des Harzes mit dem 0,1 m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 6,0) wird es mit einem 0,3 m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,7) eluiert, wobei die so enzymreichen Fraktionen aufgefangen und vereinigt werden. Diese Stufe des Verfahrens kann geeigneterweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden.

Die in dieser Welse erhaltene, mit Enzym angereicherte Lösung wird dann durch Dialyse gegen eine kon- r> zentrierte wäßrige Ammoniumsulfatlösung konzentriert, bis das Volumen der Enzymlösung um beispielsweise etwa zwei Drittel abgenommen hat. Diese Dialyse wird vorzugsweise bei einer Temperatur un;erhalb Raumtemperatur, beispielsweise bei 4° C, durchgeführt. Den in w dem Dialysebeutel erhaltenen, enzymaktiven Niederschlag kann man dann beispielsweise durch Zentrifugieren bei Raumtemperatur gewinnen.

Diesen Niederschlag löst man dann in einer wäßrigen 0,1 m-Natrlumchloridlösung und trägt Ihn bei 4° C auf ■*"' eine Säule auf, die mit einem keine aktiven Carboxymethylgruppen aufweisenden, vernetzten Dextrangel gefüllt 1st, das mit einer wäßrigen 0,1 m-Natrlumchlorldlösung äqull.lbriert worden ist. Das Gel wird dann mit einer wäßrigen 0,1 m-Natriumchloridlösung eluiert, wobei die enzymreichen Fraktionen aufgefangen und vereinigt werden.

Der bei der Dialysestufe anfallende Niederschlag oder die bei der Behandlung mit dem keine aktiven Carboxymethylgrjppen aufweisenden, vernetzten Dextrangel anfallenden enzymreichen Fraktionen können in einem 0,1 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) gelöst und bei einer Temperatur von 4° C auf eine Säule aufgetragen werden, die mit einem aktive Carboxymethylgruppen aufweisenden, vernetzten Dextrangel gefüllt Ist, das zuvor mit einem 0,1 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) äquillbriert worden ist. Das Gel wird dann mit einem 1,0 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) eluiert, wobei die enzymreichen Fraktionen aufgefangen und vereinigt werden.

In ähnlicher Weise kann man das Dialysekonzentrat in 0,1 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) auslösen und bei 4° C auf ein aktive Carboxymethylgruppen aufweisendes, vernetztes Dextrangel, das mit einem 0,1 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) äquillbriert worden ist, auftragen, wonach man das Gel mit einem 1,0 m-Acetatpuffer (pH-Wert =5,0) eluiert.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, eine mehr als 90fache Reinigung der Enzymaktivität zu erzielen, wobei die Gesamtrückgewinnung des Enzyms mehr als 40% betragen kann.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1
Stufe I: lonenaustauschchromatographie

a) Man äquillbriert eine mit einem Carboxylgruppen als aktive Gruppen aufweisenden, vernetzten Polyacryldivinylbenzol-Harz (Amberlite CG-50) beschickte Säule (2,2 χ 13 cm) bei Raumtemperatur mit einem 0,1 m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 6,0). Dann belädi man die Säule mit 421 ml einer Lösung des rohen Enzyms in dem gleichen Puffer (die 7,46 g Protein und 255 I.E. Enzym/mg Protein, das heißt 1 902 300 I.E. Enzym enthält), wonach man die Säule mit 1 1 eines 0,1 ni-Phosphatpuffers (pH-Wert = 6.0) wäscht. Die Säule wird anschließend b'J Raumtemperatur mit einem 0.3 m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,7) unter Anwendung einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 180ml/Std. eluiert. wobei man das Eluat in Form von Fraktionen auffängt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt:

Tabelle I	Volumen	Protein konzentration	Protein rückgewinnung	spezifische Aktivität	Gesamt aktivität	Enzym ausbeute
Fraktion	(ml)	(mg/ml)	(%)	(I.E./mg Protein)	(I.E.)	(%)
	38	1,12	4,2	580	24 685	8,23
A ·	36	2,0	7,2	2 250	162 000	54
B	13	1,01	1,3	356	4 674	1,56
C

b) Man wiederholt das unter a) beschriebene Verfahren, wozu man jedoch eine größere Säule (4,2 χ 30 cm) anwendet, die mit dem gleichen Harz gefüllt ist (Ambeilite CG-50). Es zeigt sich, daß die erzielte Enzymausbeute bei Anwendung der kleineren Säule größer ist. Die erhaltenen Ergebnisse sind In der folgenden Tabelle II zusammengestellt:

	5	Protein- konzenlration	26 07 713	spezifische Aktivität	6	Enzym ausbeute
Tabelle II		(mg/ml)		(I.E./mg Protein)		(%)
F^raktion	Volumen	1,43	Protein rückgewinnung	797	Gesamt aktivität	8,2
	(ml)	2,57	(%)	2 529	(I.E.)	70,4
A	132	1,02	2,62	343	155 733	3,6
B	206	7,09	1 338 903
C	194	2,65	67 873

Stufe II: Dialyse

Man konzentriert die aktive Fraktion B der Stufe I durch Dialyse der Lösung gegen eine gesättigte wäßrige Ammoniumsulfatlösung bei 4° C auf, bis das Volumen der aktiven Fraktion um zwei Drittel abgenommen hat (was etwa 60% bis 70% der gesättigten Ammoniumsulfatlösung in dem Dialysesack äquivalent ist). Der aus dem Dialysesack erhaltene enzymaktive Niederschlag wird dann isoliert, Indem man das Material bei Raumtemperatur während 3 Minuten bei 4000 U/Min, zentrifugiert.

Stufe III: Gelfiltration

Man äqulllbrlert eine mit einem vernetzten Dextrmgel ohne aktive Carboxymethylgruppen (Sephadex O-75) beschickte Säule (4,2 χ 75 cm) bei 4⁰C mit einer wäßrigen 0,1 m-Natriumchlorldlösung. Man löst das nach der Stufe II isolierte Enzymmaterial in 15 ml einer wäßrigen 0,1 m-Natrlumchlorldlösung und trägt die Lösung direkt auf die mit dem Gel beschickte Säule auf. Dann eluiert man die Säule mit einer wäßrigen 0,1 m-Natriumchloridlösung mit einer Elur msgeschwindigkeit von 50 ml pro Stunde, wobei man das Eluat In Form von Fraktionen auffängt und die enzymreichen Fraktionen vereinigt. Die vereinigten enzymreichen Fraktionen enthalten 40,3% der ursprünglichen Enzymaktivität, wobei die Enzymaktivität einen 92,5fachen Reinigungseffekt aufweist.

Die Gesamtergebnisse der dreistufigen Reinigung sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt:

Tabelle III

Volumen

(ml)

Proteinkonzentration

Gesamt-Protein

Proteinrückge
winnung

(mg/ml) (mg) Spezifische
Aktivität

(I.E./mg
Protein)

Gesamtaktivität

(I.E.)

Relative Ausbeute

Aktivität der

Enzymaktivität

rohes Enzym 421

Behandlung mit dem Carboxyl- 206 gruppen aufweisenden, vernetzten Polyacryldivinylbenzol-Harz

Konzentration mit Ammonium- 19,3 sulfat

Behandlung mit dem vernetzten 36,5 Dextrangel ohne aktive
Carboxy mf thy !gruppen

17,72 7 460
2,57 529,4 7,09

19,0 366,7 4,92

0,89 32,5 0,44

255 1902 300 1,0 100

2 529 1338 903 9,9 70,4

4 000 1466 800 15,7 77,1

23 596 766 516 92,5 40,3

Beispiel 2 Stufe I: Ionenaustauschchromatographle

Man äqullibrlert eine Säule (4,4 χ 60 cm), die mit einem Carboxylgruppen als aktive Gruppen aufweisenden, vernetzten Polyacryl-dlvlnylbenzol-Harz (Amberlite CG-50) gefüllt Ist, bei Raumtemperatur mit einem 0.1 m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 6,0). Dann beschickt man die Säule mit 550 ml einer Lösung des rohen Enzyms In dem gleichen Puffer (die 5,98 g Protein und 340 I.E. Enzym/mg Protein, das heißt 2,03 χ 10* I.E. Enzym enthält) wonach man die Säule mit 2.5 I eines 0,1 m-Phosphatpuffers (pH-Wert = 6.0) wuscht. Anschließend eluiert man die Säule bei Raumtemperatur mit einem 0,3 m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,7) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml/Std. wobei man das F.luat In Form von Fraktionen auffangt. Man vereinigt die enzymreichen Fraktloiien.

Stufe II: Dialyse

Man engt die in der Stufe I erhaltene aktive Fraktion durch Dialyse der Lösung gegen eine gesättigte wäßrige Ammonlumsulfatlösung bei 4° C In der In Beispiel 1 beschriebenen Weise ein.

Stufe III: Gelfiltration

Man äqulllbrlert eine Säule (4,4 χ 72 cm), die mit einem vernetzten Dextrangel ohne aktive Carboxymethylgruppen (Sephadex G-75) beschickt ist, bei 4° C mit einer wäßrigen 0,1 m-Natrlumchloridlösung. Man löst das In der Stufe II erhaltene Isolierte Enzymmaterial In 18,5 ml einer wäßrigen 0,1 m-Natrlumchlorldlösung ^>Λ und trägt die Lösung direkt auf die mit dem Gel beschickte Säule auf. Man eluiert die Säule dann mit einer wäßrigen 0,1 m-Natrlumchlorldlösung mit einer Elutlonsgeschwindlgkelt von 20 ml/Std. wobei man das

Eluat In Form von Fraktionen auffängt und die enzymreichen Fraktionen vereinigt.

Stufe IV: lonenaustauschchromatographle

Man äqulllbrlert eine Säule (13 χ 1.5 cm), die mit einem aktive Carboxymethylgruppen aufweisenden, vernetzten Dextrangel (CM-Sephadex) gefüllt ist, bei 4° C mit einem 0,14 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0). Man belädt die Säule mit den in der Stufe III erhaltenen enzymreichen Fraktionen und wäscht dann mit einem

0,42 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0). Anschließend eluiert man die Säule bei 4° C mit einem 0,85 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5), wobei man das Eluat In Form von Fraktionen auffängt. Die vereinigten enzymreichen Fraktionen enthalten 23% der ursprünglichen Enzymaktivität, wobei die Enzymaktivität einen 88,3fachen Reinigungseffekt aufweist.

Die Gesamtergebnisse der vierstufigen Reinigung sind In der folgenden Tabelle IV zusammengestellt:

Tabelle IV

Behandlungsstule	Gesamt protein	spezi fische Aktivität	Gesamt aktivität	relative Aktivität	Ausbeule der Enzymaktivität
	(mg)	(I.E./mg Protein)	(I.E.)		(%)
rohes Enzym	5 980	340	2,03 X 10"	1	100
Behandlung mit dem vernetzten Dextrangel ohne aktive Carboxymethylgruppen	57	15 000	8,55 x 10⁵	44	42
Behandlung mit dem aktive Carboxymethylgruppen auf weisenden, vernetzten Dextrangel	16	30 000	4,8 X 10⁵	88,3	23

Beispiel 3
Stufe I: lonenaustauschchromatographle

Man äqulllbrlert eine Säule (3,5 χ 32 cm), die mit einem Carboxylgruppen als aktive Gruppen aufweisenden, vernetzten Polyacryl-divinylbenzol-Harz (Amberllte CG-50) beschickt Ist, bei Raumtemperatur mit einem 0,1 m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 6,0). Dann belädt man die Säjle mit 110 ml einer Lösung des rohen Enzyms In dem gleichen Puffer (die 585 mg Protein und 3000 I.E. Enzym/mg Protein, das heißt 175 500 I.E. Enzym enthält), wonach man die Säule mit 700 ml eines 0,1 m-Phosphatpuffers (pH-Wert = 6,0) wäscht. Anschließend eluiert man die Säule bei Raumtemperatur mit einem 0,3 m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,7) unter Anwendung einer Elutionsgeschwindigkeit von 28 ml/Std. wobei man das Eluat in Form von Fraktionen auffängt. Man vereinigt dann die enzymreichen Fraktionen.

Stufe !!: Dialyse

Man engt die aktive Fraktion der Stufe I durch Dialyse der Lösung gegen eine gesättigte wäßrige Ammoniumsulfatlösung bei 4' C ein, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.

Stufe III: Gelfiltration Man äquillbriert eine Säule (3,2 χ 55 cm), die mit

einem vernetzten Dextrangel ohne aktive Carboxymethylgruppen (Sephadex G-100) beschickt Ist, bei 4° C mit einer wäßrigen 0,1 m-Natrlumchioridlösung. Man löst das In der Stufe II erhaltene Isolierte Enzymmaterial In 10 ml einer wäßrigen 0,1 m-Natrlumchloridlösung und trägt die Lösung direkt auf die mit dem Gel beschickte Säule auf. Dann eluiert man die Säule mit einer wäßrigen 0,1 m-Natriumchloridlösung unter Anwendung einer Elutionsgeschwindigkeit von 25 ml/Std, wobei man das Eluat in Form von Fraktionen auffängt. Man vereinigt die enzymreichen Fraktionen.

Stufe IV: lonenaustauschchromatographle

Man äqullibriert eine Säule (1,6x11 cm), die mit einem aktive Carboxymethylgruppen aufweisenden, vernetzten Dextrangel (CM-Sephadex) beschickt ist, bei 4° C mit einem 0,14 m-Acetatpufftr (pH-Wert = 5,0). Dann trägt man die enzymreichen Fraktionen der Stufe III auf die Säule auf, die man dann mit einem 0,42 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) wäscht. Anschließend eluiert man die Säule mit einem 0,85 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0), wobei man das Eluat In Form von Fraktionen auffängt. Die vereinigten enzymreichen Fraktionen enthalten 32,896 der ursprünglichen Enzymaktivität, wobei die Enzymaktivität einen 38,3fachen Reinigungseffekt zeigt.

Die Gesamtergebnisse der 4stufigen Reinigung sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt:

Tabelle V

Behandlungsstufc

10

Uesaml- spe/i- GesiuiU-

protcin fische aktivität

Aktivität

relative Ausbeute der
Aktivität Hn zymakti vital

	(mg)	Protein)	(I.L.)	x K)"	1	100
rohes Enzym	585	300	1,75	X 10'	6,74	80.5
Behandlung mit dem Carboxyl	70	2 020	1,42
gruppen als aktive Gruppen
aufweisenden, vernetzten
Polyacryl-divinylbenzol-Harz				X ΙΟ'¹	16,7	54
Behandlung mit dem vernetzten	19	5 000	9,5
Dextrangei ohne aktive
Carboxymethy !gruppen				x Η)-·	38,3	32,8
Behandlung mit dem vernetzten	5	11 500	5,75
Dextrangei mit aktiven
Carboxymethy !gruppen

Die Menge der Glucoronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase In I.E. (Internationalen Einheiten) ermittelt man unter Anwendung der von der World Health Organisation anerkannten [vgl. J. H. Humphrey, Bull. W.H.O. 16 (1957) 192] internationalen Standard-Analysenmethode zur Bestimmung von Hyaluronidase [vgl. auch U.S. Pharmacopeia, 15th revision (1955) Seite 329], wobei man jedoch den 0,1 m-Phosphat-0,15 m-NaCl-Puffer (pH-Wc?rt = 7,0) durch einen 0,1 m-Natriumacetat-0,15 m-NaCl-Puffer (pH-Wert = 6,0) ersetzt und anstelle des Humanserums Rinderserum anwendet, wobei man im übrigen die gleichen Bedingungen einhält.

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Glucoronoglykosaminoglykan-hyaluronatlyase ist immunochemlsch rein und steril und im wesentlichen frei von Rinderprotein, pyrogenen Materlallen und Anllgenbestandteilen.

Die mit Hilfe des beanspruchten Verfahrens erhaltene Glucoronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase kann zur

Behandlung von Kreislauferkrankungen beim Menschen, beispielsweise zur Behandlung von Herzarrhythmien, Thromben, Koronarthrombosen, Herzinfarkten, Herzstillsland, Herzschlägen, Herzblockierungen, Arteriosklerose und Zerebralthrombosen, als auch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen des Menschen eingesetzt werden, bei der es erwünscht ist. Antigene zur Bildung von Antikörpern in das Lymphsystem einzuführen, beispielsweise zur Behandlung von geschwürbildender Kolitis und der Crohn'schen Erkrankung (reglonäre lleitls).

Die Glucoronoglykosamlnoglykan-hyaluronat-lyase wird auf systemischem Wege, beispielsweise Intravenös, intraarteriell, intrathekal, subkutan oder intramuskulös in Form einer isotonischen, sterilen Lösung verabreicht. Die verabreichte Menge der Glucoronoglykosamlnoglykan-hyaluronat-lyase hängt von der Schwere der zu behandelnden Erkrankung ab und kann sich von 5000 bis 16⁶ I.E. vorzugsweise von 20 000 bis 10* I.E. erstrecken.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von sehr reiner und hochaktiver Glucoronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung der rohen Lyase zunächst mit einem Carboxylgruppen als aktive Gruppen aufweisenden, vernetzten Polyacryl-divInylbenzol-Harz in Kontakt bringt, die adsorbierte Lyase dann von dem Harz eluiert, die an der gewünschten Lyase reichen Eluatfraktionen gegen eine gesättigte wäßrige Ammoniumsulfatlösung dialysiert und das in dieser Weise erhaltene Enzymkonzentrat welter dadurch reinigt, daß man das Konzentrat

entweder mit einem aktive Carboxymethylgruppen aufweisenden, vernetzten Dextrangel in Kontakt bringt und das Gel anschließend unter Bildung einer Lösung der gewünschten Lyase eluiert
oder mit einem vernetzten Dextrangel, das keine aktiven Carboxymethylgruppen aufweist, in Kontakt bringt und das Gel anschließend unter Bildung einer Lösung der gewünschten Lyase eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Eluat, das man unter Anwendung des keine aktiven Carboxymethylgruppen aufweisenden, vernetzten Dextrangel erhalten hat, zusätzlich mit einem aktive Carboxymethylgruppen aufweisenden, vernetzten Dextrangel In Kontakt bringt und anschließend das Gel unter Bildung einer Lösung der gewünschten Lyase eluiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das vernetzte Polyacryl-dlvinylbenzol-Harz bei Raumtemperatur mit einem 0,1 m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 6,0 äqulllbriert.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Harz mit einem 0,1 m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 6,0) wäscht und die Lyase dann mit einem 0,3 m-Phosphatpuffer (pH-Wp.rt = 7,7) eluiert.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dialyse bei einer Temperatur von 4" C durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das bei der Dialyse erhaltene Konzentrat In einer wäßrigen 0,1 m-Natrlumchloridlösung löst und bei 4° C auf das vernetzte Dextrangel aufbringt, das keine aktiven Carboxymethylgruppen aufweist und mit einer wäßrigen 0,1 m-Natriumchloridlösung äquilibrlert worden Ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das vernetzte Dextrangel mit einer wäßrigen 0,1 m-Natrlumchloridlösung eluiert.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die bei der Behandlung mit dem vernetzten Dextrangel, das keine aktiven Carboxymethylgruppen aufweist, erhaltenen Fraktionen In einem 0,1 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) löst, die Lösung bei 4° C auf ein vernetztes Dextrangel aufbringt, das aktive Carboxymethylgruppen aufweist und mit einem 0,1 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) äquilibrlert worden lsi, und das Gel dann mit einem 1.0 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) eluiert.

y. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das bei der Dialyse erhaltene Konzentrat in einem 0,1 m-AceüUpuffer (pH-Wert = 5,0) löst, die Lösung bei 4° C auf ein verncUtes Dextrangel auftrügt, das aktive Carboxymethylgruppen aufweist und mit einem 0,1 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) äquilibriert worden ist, und das Gel dann mit einem 1,0 m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) eluiert.