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Verfahren zur Enzymreinigung.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von sehr reiner
und hochaktiver Glucoronoglykosaminoglykan-hyaluronatlyase unter Anwendung eines
speziellen chromatographischen Verfahrens.
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In der US-PS 3 708 575 ist ein Verfahren zur Behandlung von Herzarrhythmien,Thromben,
Artheriosklerose, Zerebralinfarkten, Zerebralthrombosen, Koronarthrombosen und Herzinfarkten
beim Menschen beschrieben, das darin besteht, daß man eine wirksame Menge einer
isotonischen, sterilen Lösung von Glucoronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase auf
intravenösem, intraarteriellem
oder intrathekalem Wege an Menschen
injiziert, die einer solchen Behandlung bedürfen.
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Viele der bislang zur Verfügung stehenden Hyaluronidase-Präparate
enthalten sehr große Mengen anderer enzymatisch wirksamer Materialien neben dem
Enzym, das tatsächlich für die Katalyse der Hydrolyse der Hyaluronsäure verantwortlich
ist. Das heterogene Verhalten der Hyaluronidase wird in einer Veröffentlichung von
Greiling et al (Z.physiol.Chem.
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340 (1965) 243) diskutiert.
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Die bislang zur Verfügung stehenden Hyaluronidase-Präparate sind häufig
mit großen und variablen Mengen anderer Enzyme verunreinigt, wie ß-Glucoronidase,
N-Acetyl-ß-hexosaminidase, Arylsulphatase A und Arylsulphatase B.
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Verfahren zur Herstellung von sehr reiner und hochaktiver Glucuronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase
sind beispielsweise in der GB-PS 1 060 513 und auch von Borders und Raftery (J.Biol.Chem.
243 (1968) 3756 bis 3762) beschrieben.
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Diese bekannten Verfahren sind jedoch für eine wirtschaftlich vertretbare
Herstellung von Glucuronoglykosaminoglykanhyaluronat-lyase in großem Maßstab zu
langwierig und zu kompliziert, so daß demzufolge ein Bedürfnis dafür besteht, ein
wirtschaftlicheres Verfahren für die Herstellung von sehr reiner und hochaktiver
Glucuronoglykosaminoglykan-hyaluronatlyase anzugeben.
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Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von sehr
reiner und hochaktiver Glucuronoglykosaminoglykanhyaluronat-lyase, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man eine Lösung des rohen Enzyms zunächst mit einem Carboxylgruppen als
aktive Gruppen aufweisenden, vernetzten Polyacryldivinylbenzol-Harz (beispielsweise
dem unter dem Warenzeichen Amberlite CG-50" erhältlichen Harz) in kontakt bringt,
das
adsorbierte Enzym dann von dem Harz eluiert, die an dem gewünschten
Enzym reichen Eluatfraktionen gegen eine gesättigte wässrige Ammoniumsulfatlösung
dialysiert und das erhaltene Enzymkonzentrat dann mit einem aktive Carboxymethylgruppen
aufweisenden vernetzten Dextrangel (beispielsweise dem unter dem Warenzeichen "CM-Sephadex"
bekannten Material) in Kontakt bringt und anschließend das Gel unter Bildung einer
Lösung der sehr reinen und hochaktiven Glucuronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase
eluiert.
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Alternativ kann man das nach der Dialyse gegen die Ammoniumsulfatlösung
anfallende Enzymkonzentrat mit einem vernetzten Dextrangel in Kontakt bringen, das
keine aktiven Carboxymethylgruppen aufweist (beispielsweise mit dem Material, das
unter den Warenzeichen "Sephadex G-75" und "Sephadex G-100" erhältlich ist), wonach
man das Gel eluiert. Die in dieser Weise erhaltene Lösung der hochaktiven Glucuronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase
kann gewünschtenfalls weiter dadurch gereinigt werden, daß man sie mit einem aktive
Carboxymethylgruppen aufweisenden, vernetzten Dextrangel (beispielsweise CM-Sephadex)
in Kontakt bringt und das Gel anschließend eluiert.
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Die als Ausgangsmaterial eingesetzte Lösung des rohen Enzyms kann
in an sich bekannter Weise ausgehend von irgendeinem Material hergestellt werden,
das reich an dem gewünschten Enzym ist. Wegen der guten Zugänglichkeit ist es bevorzugt,
für die Herstellung der Lösung des rohen Enzyms tierische Hoden, beispielsweise
Rinderhoden, zu verwenden, obwohl man auch andere Materialien, wie Leber-Lysosomen,
einsetzen kann.
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Das in der ersten Stufe der Reinigung eingesetzte carboxylgruppenhaltige
Harz wird vorzugsweise bei Raumtemperatur mit einem 0,1m-Phosphatpuffer (pH-Wert
= 6,0) äquilibriert
bzw. ins Gleichgewicht gebracht, wobei man das
rohe Enzym vorzugsweise auch in dem gleichen Puffer löst. Man kann das Harz in einer
Säule einsetzen oder man kann diese Stufe absatzweise durchführen, indem man das
Harz in einem mit einem Rührer ausgerüsteten Gefäß mit der Enzymlösung in Kontakt
bringt. Nach dem Waschen des Harzes mit dem 0,1m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 6,0)
wird es mit einem 0,3m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,7) eluiert, wobei die enzymreichen
Fraktionen aufgefangen und vereinigt werden. Diese Stufe des Verfahrens kann geeigneterweise
bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
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Die in dieser Weise erhaltene, mit Enzym angereicherte Lösung wird
dann durch Dialyse gegen eine konzentrierte wässrige Ammoniumsulfatlösung konzentriert,
bis das Volumen der Enzymlösung um beispielsweise etwa zwei Drittel abgenommen hat.
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Diese Dialyse wird vorzugsweise bei einer Temperatur unterhalb Raumtemperatur,
beispielsweise bei etwa 40C, durchgeführt.
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Den in dem Dialysebeutel erhaltenen, enzymaktiven Niederschlag kann
man dann beispielsweise durch Zentrifugieren bei Raumtemperatur gewinnen.
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Diesen Niederschlag löst man dann in einer wässrigen 0,1m-Natriumchloridlösung
und trägt ihn bei etwa 40C auf eine Säule auf, die mit einem keine aktiven Carboxymethylgruppen
aufweisenden, vernetzten Dextrangel gefüllt ist, das mit einer wässrigen 0,1m-Natriumchloridlösung
äquilibriert worden ist.
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Das Gel wird dann mit einer wässrigen 0,1m-Natriumchloridlösung eluiert,
wobei die enzymreichen Fraktionen aufgefangen und vereinigt werden.
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Der bei der Dialysestufe anfallende Niederschlag oder die bei der
Behandlung mit dem keine aktiven Carboxymethylgruppen aufweisenden, vernetzten Dextrangel
anfallenden enzymreichen Fraktionen können in einem 0,1m-Acetatpuffer (pH-Wert =
5,0) gelöst und bei einer Temperatur von etwa 40C auf eine Säule
aufgetragen
werden, die mit einem aktive Carboxymethylgruppen aufweisenden, vernetzten Dextrangel
gefüllt ist, das zuvor mit einem 0,1m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) äquilibriert
worden ist. Das Gel wird dann mit einem 1,0m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) eluiert,
wobei die enzymreichen Fraktionen aufgefangen und vereinigt werden.
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In ähnlicher Weise kann man das Dialysekonzentrat in 0,1m-Acetatpuffer
(pH-Wert = 5,0) auflösen und bei etwa 40C auf ein aktive Carboxymethylgruppen aufweisendes,
vernetztes Dextrangel, das mit einem 0,1m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) äquilibriert
worden ist, auftragen, wonach man das Gel mit einem 1,Om-Acetatpuffer (pH-Wert =
5,0) eluiert.
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Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, eine mehr
als 90fache Reinigung der Enzymaktivität zu erzielen, wobei die Gesamtrückgewinnung
des Enzyms mehr als 40% betragen kann.
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Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
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Beispiel 1 Stufe I: Ionenaustauschchromatographie a) Man äquilibriert
eine mit einem Carboxylgruppen als aktive Gruppen aufweisenden, vernetzten Polyacryl-divinylbenzol-Harz
(Amberlite CG-50)lbeschickte Säule (2,2 x 13 cm) bei Raumtemperatur mit einem 0,1m-Phosphatpuffer
(pH-Wert = 6,0).
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Dann belädt man die Säule mit 421 ml einer Lösung des rohen Enzyms
in dem gleichen Puffer (die 7,46 g Protein und 255 I.E.
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Enzym/mg Protein, das heißt 1. 902 300 I.E. Enzym enthält), wonach
man die Säule mit 1 1 eines 0,1m-Phosphatpuffers (pH-Wert = 6,0) wäscht. Die Säule
wird anschließend bei Raumtemperatur mit einem 0,3m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,7)
unter
Anwendung einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 180 ml/Std
eluiert, wobei man das Eluat in Form von Fraktionen auffängt.
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Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt:
Tabelle I
| Fraktion Volumen Protein- Protein- spezi- Gesamt- Enzym- |
| (ml) konzen- rück- fische aktivi- ausbeute |
| tration gewinnung Aktivi- tät (I.E.) (%) |
| (mg/ml) (%) tät |
| (I.E/mg |
| Protein) |
| A 38 1,12 4,2 580 24685 8,23 |
| B 36 2,0 7,2 2250 162000 54 |
| C 13 1,01 1,3 356 4674 1,56 |
b) Man wiederholt das unter a beschriebene Verfahren, wozu man jedoch eine größere
Säule (4,2 x 30 cm) anwendet, die mit dem gleichen Harz gefüllt ist (Amberlite CG-50).
Es zeigt sich, daß die erzielte Enzymausbeute bei Anwendung der kleineren Säule
größer ist. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt:
Tabelle
II
| Fraktion Volumen Protein- Protein- spezi- Gesamt- Enzym- |
| (ml) konzen- rück- sche Akti- aktivität ausbeute |
| tration gewinnungvität (I.E.) (%) |
| (mg/ml) (%) (I.E./mg |
| Protein) |
| A 132 1,48 2,62 797 155733 8,2 |
| B 206 2,57 7,09 2529 1338903 70,4 |
| C 194 1,02 2,65 343 67873 3,6 |
Stufe II: Dialyse Man konzentriert die aktive Fraktion B der Stufe I durch Dialyse
der Lösung gegen eine gesättigte wässrige Ammoniumsulfatlösung bei 40C auf, bis
das Volumen der aktiven Fraktion um zwei Drittel abgenommen hat (was etwa 60% bis
70% der gesättigten Ammoniumsulfatlösung in dem Dialysesack äquivalent ist). Der
aus dem Dialysesack erhaltene enzymaktive Niederschlag wird dann isoliert, indem
man das Material bei Raumtemperatur während 3 Minuten bei 4000 U/Min zentrifugiert.
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Stufe III: Gelfiltration Man äquilibriert eine mit einem vernetzten
Dextrangel ohne aktive Carboxymethylgruppen (Sephadex G-75) beschickte Säule-(4,2
x 75 cm) bei 40C mit einer wässrigen 0,1m-Natriumchloridlösung. Man löst das nach
der Stufe II isolierte Enzymmaterial in 15 ml einer wässrigen 0,1m-Natriumchloridlösung
und trägt die Lösung direkt auf die mit dem Gel beschickte Säule auf.
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Dann eluiert man die Säule mit einer wässrigen 0,1m-Natriumchloridlösung
mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 50 ml pro Stunde, wobei man das Eluat in Form
von Fraktionen auffängt und die enzymreichen Fraktionen vereinigt. Die vereinigten
enzymreichen
Fraktionen enthalten 40,3% der ursprünglichen Enzymaktivität, wobei die Enzymaktivität
einen 92,5-fachen Reinigungseffekt aufweist.
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Die Gesamtergebnisse der dreistufigen Reinigung sind in der folgenden
Tabelle III zusammengestellt:
Tabelle III
| Stufe Volumen Protein- Gesamt- Protein- Spezi- Gesamt- Relative
Ausbeute |
| (ml) konzen- Protein rückge- fische aktivi- Aktivi- der |
| tration (mg) winnung Aktivi- tät tät Enzym- |
| (mg/ml) (%) tät (I.E.) aktivi- |
| (I.E./mg tät (%) |
| Protein) |
| rohes Enzym 421 17,72 7460 255 1 902 300 1,0 100 |
| Behandlung 206 2,57 529,4 7,09 2529 1 338 903 9,9 70,4 |
| mit dem |
| Carboxylgrup- |
| pen aufweisen- |
| den, vernetz- |
| ten Polyacryl- |
| divinylbenzol- |
| Harz |
| Konzentration 19,3 19,0 366,7 4,92 4000 1 466 800 15,7 77,1 |
| mit Ammonium- |
| sulfat |
| Behandlung mit 36,5 0,89 32,5 0,44 23596 766 516 92,5 40,3 |
| dem vernetzten |
| Dextrangel |
| ohne aktive |
| Carboxymethyl- |
| gruppen |
Beispiel 2 Stufe I: Ionenaustauschchromatographie Man äquilibriert
eine Säule (4,4 x 60 cm), die mit einem Carboxylgruppen als aktive Gruppen aufweisenden,
vernetzten Polyacryl-divinylbenzol-Harz (Amberlite CG-50) gefüllt ist, bei Raumtemperatur
mit einem 0,1m-Phosphatpuffer (pH- Wert = 6,0). Dann beschickt man die Säule mit
550 ml einer Lösung des rohen Enzyms in dem gleichen Puffer (die 5,98 g Protein
und 340 I.E. Enzym/mg Protein, das heißt 2,03 x 106 I.E.
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Enzym enthält), wonach man die Säule mit 2,5 1 eines 0,1m-Phosphatpuffers
(pH-Wert = 6,0) wäscht. Anschließend eluiert man die Säule bei Raumtemperatur mit
einem 0,3m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,7) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von
30 ml/Std, wobei man das Eluat in Form von Fraktionen auffängt. Man vereinigt die
enzymreichen Fraktionen.
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Stufe II: Dialyse Man engt die in der Stufe I erhaltene aktive Fraktion
durch Dialyse der Lösung gegen eine gesättigte wässrige Ammoniumsulfatlösung bei
40C in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise ein.
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Stufe III: Gelfiltration Man äquilibriert eine Säule (4,4 x 72 cm),
die mit einem vernetzten Dextrangel ohne aktive Carboxymethylgruppen (Sephadex G-75)
beschickt ist, bei 4"C mit einer wässrigen 0,1m-Natriunchloridlösung. Man löst das
in der Stufe II erhaltene isolierte Enzymmaterial in 18,5 ml einer wässrigen 0,1m-Natriumchloridlosung
und trägt die Lösung direkt auf die mit dem Gel beschickte Säule auf. Man eluiert
die Säule dann mit einer wässrigen 0,lm-Natriumchloridlösung mit einer Elutionsgeschwindigkeit
von 20 ml/Std, wobei man das Eluat in Form von Fraktionen auffängt und die enzymreichen
Fraktionen
vereinigt.
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Stufe IV: Ionenaustauschchromatographie Man äquilibriert eine Säule
(13 x 1,5 cm), die mit einem aktive Carboxymethylgruppen aufweisenden, vernetzten
Dextrangel (CM-Sephadex) gefüllt ist, bei 40C mit einem 0,14m-Acetatpuffer(pH-Wert
= 5,0). Man belädt die Säule mit den in der Stufe III erhaltenen enzymreichen Fraktionen
und wäscht dann mit einem 0,42m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0). Anschließend eluiert
man die Säule bei 4°C mit einem 0,85m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5), wobei man das
Eluat in Form von Fraktionen auffängt. Die vereinigten enzymreichen Fraktionen enthalten
23% der ursprünglichen Enzymaktivität, wobei die Enzymaktivität einen 88,3-fachen
Reinigungseffekt aufweist.
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Die Gesamtergebnisse der vierstufigen Reinigung sind in der folgenden
Tabelle IV zusammengestellt: Tabelle IV
| Behandlungsstufe Gesamt- spezifi- Gesamt- relative Ausbeute
der |
| protein'sche aktivi- Aktivi- Enzymaktivi- |
| (nq) Aktivi- tät tät tät (%) |
| tät (I.E.) |
| (I.E./irg 1 |
| Protein) |
| rohes Enzym ! 5 980 ' 340 2,03x106 1 100 |
| Behandlung mit |
| dem vernetzten I l |
| Dextragel ohne 57 :15000 8,55x105 44 42 |
| aktive Carboxy- 1 |
| methylgruppen 1 1 |
| Behandlung mit |
| dem aktive |
| Carboxymethyl- 16 30000 4,8x105 88,3 23 |
| gruppen auf- |
| weisenden, ver- |
| netzten Dextran- |
| gel |
Beispiel 3 Stufe I: Ionenaustauschchromatographie Man äquilibriert
eine Säule (3,5 x 32 cm), die mit einem Carboxylgruppen als aktive Gruppen aufweisenden,
vernetzten Polyacryl-divinylbenzol-Harz (Amberlite CG-50) beschickt ist, bei Raumtemperatur
mit einem 0,1m-Phosphatpuffer (pH-Wert = 6,0). Dann belädt man die Säule mit 110
ml einer Lösung des rohen Enzyms in dem gleichen Puffer (die 585 mg Protein und
3000 I.E. Enzym/mg Protein, das heißt 175 500 I.E. Enzym enthält), wonach man die
Säule mit 700 ml eines 0,1m-Phosphatpuffers (pH-Wert = 6,0) wäscht. Anschließend
eluiert man die Säule bei Raumtemperatur mit einem 0,3m-Phosphatpuffer (pH-Wert
= 7,7) unter Anwendung einer Elutionsgeschwindigkeit von 28 ml/Std, wobei man das
Eluat in Form von Fraktionen auffängt. Man vereinigt dann die enzymreichen Fraktionen.
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Stufe II: Dialyse Man engt die aktive Fraktion der Stufe I durch Dialyse
der Lösung gegen eine gesättig4e wässrige Ammoniumsulfatlösung bei 40C ein, wie
es in Beispiel 1 beschrieben ist.
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Stufe III: Gelfiltration Man äquilibriert eine Säule (3,2 x 55 cm),
die mit einem vernetzten Dextrangel ohne aktive Carboxymethylgruppen (Sephadex G-100)
beschickt ist, bei 40C mit einer wässrigen 0,1m-Natriumchloridlösung. Man löst das
in der Stufe II erhaltene isolierte Enzymmaterial in 10 ml einer wässrigen 0,1m-Natriumchloridlösung
und trägt die Lösung direkt auf die mit dem Gel beschickte Säule auf. Dann eluiert
man die Säule mit einer wässrigen 0,1m-Natriumchloridlösung unter Anwendung einer
Elutionsgeschwindigkeit von 25 ml/Std, wobei man das Eluat in Form von Fraktionen
auffängt. Man vereinigt die enzymreichen Fraktionen.
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Stufe IV: Ionenaustauschchromatographie Man äquilibriert eine Säule
(1,6 x 11 cm), die mit einem aktive Carboxymethylgruppen aufweisenden, vernetzten
Dextrangel (CM-Sephadex) beschickt ist, bei 40C mit einem 0,14m-Acetatpuffer (ph-Wert
= 5,0). Dann trägt man die enzymreichen Fraktionen der Stufe III auf die Säule auf,
die man dann mit einem 0,42m-Acetatpuffer (pH-Wert = 5,0) wäscht.
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Anschließend eluiert man die Säule mit einem 0,85m-Acetatpuffer (pH-Wert
= 5,0), wobei man das Eluat in Form von Fraktionen auffängt. Die vereinigten enzymreichen
Fraktionen enthalten 32,8% der ursprünglichen Enzymaktivität, wobei die Enzymaktivität
einen 38,3-fachen Reinigungseffekt zeigt.
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Die Gesamtergebnisse der 4-stufigen Reinigung sind in der folgenden
Tabelle V zusammengestellt: Tabelle V
| Behandlungsstufe Gesamt- spezifische Gesamt- relative Ausbeute
der |
| protein Aktivität aktivität Aktivität Enzymakti- |
| (mg) (I.E./mg (I.E.) vität (%) |
| Protein) |
| rohes Enzym 585 300 1,75x105 1 100 |
| Behandlung mit |
| dem Carboxylgrup- |
| pen als aktive 70 2020 1,42x105 6,74 80,5 |
| Gruppen aufwei- |
| senden, ver- |
| netzten Poly- |
| acryldivinyl- |
| bonzol-Harz |
| Behandlung mit |
| dem vernetzten 19 5000 ,5x104 16,7 54 |
| Dextrangel ohne |
| aktive Carboxy- |
| methylgruppeWn |
| Behandlung mit |
| dem vernetzten |
| Dextrangel mit 5 11500 5,75x104 38,3 32,8 |
| aktiven Carboxy- |
| methylgruppen |
Die Menge der Glucuronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase in IE
(internationalen Einheiten)ermittelt man unter Anwendung der von der World Health
Organisation anerkannten (vgl.
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J.H.Humphrey, Bull. W.H.O. 16 (1957) 291) internationalen Standard-Analysenmethode
zur Bestimmung von Hyaluronidase (vgl. auch U.S. Pharmacopeia, 15th revision (1955)
Seite 329), wobei man jedoch den 0,1m-Phosphat-0,15m-NaCl-Puffer (pH-Wert = 7,0)
durch einen 0,1m-Natriumacetat-0,15m-NaCl-Puffer (pH-Wert = 6,0) ersetzt und anstelle
des Humanserums Rinderserum anwendet, wobei man im übrigen die gleichen Bedingungen
einhält.
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Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnene Glucuronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase
ist immunochemisch rein und steril und im wesentlichen frei von Rinderprotein, pyrogenen
Materialien und Antigenbestandteilen.
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Die mit Hilfe des beanspruchten Verfahrens erhaltene Glucuronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase
kann zur Behandlung von Kreislauferkrankungen beim Menschen, beispielsweise zur
Behandlung von Herzarrhythmien, Thromben, Koronarthrombosen, Herzinfarkten, Herz
stillstand, Herzschlägen, Herzblockierungen, Arteriosklerose und Zerebralthrombosen,
als auch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen des Menschen eingesetzt werden,
bei der es erwünscht ist, Antigene zur Bildung von Antikörpern in das Lymphsystem
einzuführen, beispielsweise zur Behandlung von geschwürbildender Kolitis und der
Crohn'schen Erkrankung (regionäre Ileitis).
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Die Glucuronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase wird auf systemischem
Wege, beispielsweise intravenös, intraarteriell, intrathekal, subkutan oder intramuskulös
in Form einer isotonischen, sterilen Lösung verabreicht. Die verabreichte Menge
der Glucuronoglykosaminoglykan-hyaluronat-lyase hängt von der Schwere der zu behandelnden
Erkrankung ab und kann
sich von 5000 bis 106 IE, vorzugsweise von
20 000 bis 106 IE erstrecken.