DE2715748A1

DE2715748A1 - Zubereitungen auf der grundlage von verbindungen vom plasminogen-typ, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE2715748A1
Application number: DE19772715748
Authority: DE
Inventors: Jean Choay; Jean Goulay; Jean-Claude Lormeau
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1976-04-07
Filing date: 1977-04-07
Publication date: 1977-10-27
Also published as: BE853350R; FR2347048A2; GB1581472A; DE2715748C3; JPS6157289B2; JPS52151711A; DE2715748B2; NL7703738A; FR2347048B2

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN POSTFACH 860 820 HtM/cb MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 983921/22

PL/SH-O153-77-B

CHOAY S.A.

48, Avenue Theophile-Gautier 75782 Paris Cedex 16/Frankreich

Zubereitungen auf der Grundlage von Verbindungen vom Plasminogen-Typ, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel

(Zusatz zu Patent (Patentanmeldung P 24 59 915.3-41))

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CHOAY S.A.

Case: PL/SH-O153-77-B

Die vorliegende Erfindung betrifft eine weitere Ausgestaltung

der in dem Hauptpatent (Patentanmeldung P 24 59 915.3-41)

beschriebenen Erfindung. Sie betrifft insbesondere Zubereitungen oder Produkte auf der Grundlage von Verbindungen vom Typ des Plasminogens bzw. vom Plasminogen-Typ, die vorzugsweise menschlichen Ursprungs sind, diese Zubereitungen oder Produkte enthaltende Arzneimittel und ein Verfahren zur Gewinnung und zur Reinigung dieser Zubereitungen oder Produkte, das insbesondere von Zusammensetzungen ausgeht, die wasserlösliche Verbindungen des Plasminogen-Typs enthalten und aus Plazentabrei extrahiert worden sind.

Zubereitungen oder Produkte auf der Grundlage von wasserlöslichen Plasminogen-Verbindungen und insbesondere aus Plazenta gewonnene Produkte dieser Art sind bereits Gegenstand des Hauptpatentes (Patentanmeldung P 24 59 915.3.41). Das Hauptpatent (Patentanmeldung P 24 59 915.3-41) betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Gewinnung solcher Zubereitungen ausgehend von Plazentabreien, die man ihrerseits insbesondere durch mechanisches Zerkleinern gefrorener Plazentas, Auftauen der erhaltenen Breie, das praktisch beendet wird, wenn die Temperatur dieser Breie 1°C übersteigt, und Abtrennen des Plazentablutes, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 4 C, insbesondere durch Zentrifugieren, und Gewinnen des unlöslichen Breies erhält. Dieser Plazentabrei enthält insbesondere die Plazentagewebe und die Fibrinklumpen oder -klümpchen, die in der Plazenta enthalten waren.

Gemäß dem in dem Hauptpatent (Patentanmeldung

P 24 59 915.3-41) beschriebenen Verfahren bewirkt man eine Extraktion der Verbindungen vom Plasminogen-Typ, die in diesem Brei enthalten sind, indem man den Plazentabrei mit einer Lösung, die einen pH-Wert aufweist, der das Inlösunghalten des extrahierten Plasminogens ermöglicht, und insbesondere zwischen 5 und 10 und vorzugsweise im Neutralbereich liegt, in Gegenwart eines Inhibitors der Aktivierung des Plaminogens, insbesondere einer

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£ -Aminosäure, auslaugt, wobei man nach der Abtrennung des restlichen Breies eine Lösung erhält, die die fraglichen Verbindungen vom Plasminogen-Typ enthält. Der Inhibitor der Aktivierung des Plasminogens und mindestens ein großer Anteil der die Verbindungen vom Plasminogen-Typ begleitenden Proteine, die in der genannten Lösung enthalten sind, können mit Hilfe klassischer Verfahrensweisen beseitigt werden, insbesondere jener,

die in dem Hauptpatent (Patentanmeldung P 24 59 915.3-41

beschrieben sind.

Es ist hierdurch möglich, Zubereitungen oder Produkte, die wasserlösliche Verbindungen vom Plasminogen-Typ enthalten, zu gewinnen, die einen Plasminogengehalt von mehr als 4 UCA-Einheiten/mg (kaseinolytische Einheiten/mg) und einen Plasmingehalt aufweisen, der vernachlässigt werden kann, da er unterhalb 0,04 UCAr-Einheiten/mg liegt.

Insbesondere liegen die Plasminogengehalte der nach dem Verfahren des Hauptpatentes (Patentanmeldung P 24 59 915.3-41)

erhältlichen Zubereitungen, ausgedrückt in Mikrokatal, im Bereich von 2,3 bis 2,6 Mikrokatal.

In diesem Zusammenhang sei daran erinnert, daß eine Plasminogen-Aktivität von 1 Mikrokatal der Piasmindosis entspricht, die man aus der entsprechenden Plasminogendosis nach der Aktivierung des Plasminogens mit Urokinase erhält, die dazu in der Lage ist, 1 yUMol des Methylesters von N-Acetyl-glycin-L-lysin pro Sekunde bei 37°c zu hydrolysieren (wobei die Aktivität der Esterhydrolyse des Plasmins mit einem pH-Staten erfolgt).

Die Analyse der nach dem Verfahren des Hauptpatentes

(Patentanmeldung P 24 59 915.3—41) erhaltenen Zubereitungen zeigt, daß sie verschiedene Verbindungen vom Plasminogen-Typ enthalten. Insbesondere unter Zuhilfenahme von Elektrofokussierungstechniken ist festzustellen, daß sie bis zu 8 Protein-Peaks

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aufweisen können, deren isoelektrische Punkte zwischen 6,00 und 8,25 liegen. Die Bestimmung der NH„-Gruppen aufweisenden, endständigen Aminosäuren der verschiedenen Verbindungen vom Plasminogen-Typ, die in den fraglichen Zubreitungen enthalten sind (insbesondere unter Anwendung der Methode von Gros und Labouesse, Europ. J. Biochem. 7 (1969) 453) hat gezeigt, daß sie erhöhte Anteile an "voraktivierten Plasminogenen" oder "durch teilweise Proteolyse gebildete Plasminogene" enthalten, die aus dem vollständigen Plasminogen, das auch als "Glutamyl-Plasminogen" bezeichnet wird, entstanden sind, das die gleiche NH₂-Gruppen aufweisende endständige Aminosäure wie das Plasminogen des zirkulierenden Blutes aufweist, und das insbesondere dadurch gebildet ist, daß die letzteren mindestens ein Peptidfragment verloren haben, das die endständigen Aminosäuren dieser Verbindung enthält, die durch Glutaminsäure mit freier Aminogruppe gebildet sind.

Diese Verbindungen des Plasminogen-Typs scheinen von der gleichen Art zu sein wie jene, die vorübergehend im Verlauf der Proteolyse der nativen Plasminogene zu Plasmin unter dem Einfluß eines Aktivators des Plasminogens oder des Plasmins als solchem auftreten, worauf die Ausdrücke "voraktivierte Plasminogene" oder "durch teilweise Proteolyse gebildete Plasminogene" zurückgehen, die zur Bezeichnung der besonderen Verbindungen vom Plasminogen-Typ verwendet werden, von denen hierin die Rede ist.

Unter den voraktivierten Plasminogenen, die in den Zubereitungen

des Hauptpatentes (Patentanmeldung P 24 59 915.3-41)

enthalten sind, findet man in den fraglichen Zubereitungen oder Produkten häufig die überwiegende Anwesenheit von Peptidketten, die als endständige Aminosäuregruppe mit freier Aminogruppe Methionin enthalten und die im folgenden als "Methionyl-Plasminogene" bezeichnet werden. So können diese Zubereitungen beispielsweise 40 bis 60 % Methionyl-Plasminogen enthalten.

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Wie in dem Hauptpatent (Patentanmeldung P 24 59 915.3-4

angegeben ist, sind die fraglichen Zubereitungen oder Zusammensetzungen in Wasser löslich. Sie sind weiterhin stabil, insbesondere weil sie kein Plasmin oder Plasmin nur in vernachlässigbaren Mengen enthalten.

Es hat sich gezeigt, daß die nach dem Verfahren des Hauptpatentes (Patentanmeldung P 24 59 915.3-41) erhaltenen Zubereitungen, insbesondere wenn dieses Verfahren in technischem Maßstab durchgeführt wird, auch erhebliche Menge anderer voraktivierter Plasminogene enthalten können, insbesondere Verbindungen vom Plasminogen-Typ, die als endständige Aminosäure mit freier Aminogruppe Lysin enthalten (Lysyl-Plasminogen).

Die vorliegende Erfindung betrifft nun noch weiter an "voraktivierten Plasminogenen" angereicherte Zubereitungen und insbesondere wasserlösliche Zubereitungen, deren Bestandteile vom Plasminogen-Typ im wesentlichen vollständig voraktiviert sind, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Sie betrifft insbesondere Zubereitungen, deren Bestandteile, insbesondere unter den weiter unten beschriebenen experimentellen Bedingungen, praktisch vollständig und in stabiler Weise an Fibrinklumpen oder -klümpchen gebunden werden, was im Gegensatz steht zu dem Verhalten des "Glutamyl-Plasminogens" oder des zirkulierenden Plasminogens, die unter den gleichen Bedingungen nur in geringer Menge an Fibrin gebunden werden und daran nicht gebunden bleiben.

Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Herstellung solcher Zubereitungen ausgehend von Ausgangslösungen von Verbindungen des Plasminogen-Typs, deren Bestandteile vom Plasminogen-Typ zum Teil in voraktiviertem Zustand vorliegen oder in diesen Zustand überführt werden können.

Gegenstand der Erfindung ist daher eine wasserlösliche Zubereitunq oder Zusammensetzung, die im wesentlichen aus Verbindungen vom

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Plasminogen-Typ, die zu Plasmin aktiviert werden können, besteht, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie im wesentlichen von Glutamyl-Plasminogen und Plasmin frei ist; daß die genannten Verbindungen im wesentlichen voraktivierte Zymogene umfassen, die insbesondere von Glutamyl-Plasminogen abgeleitet sind, indem die letztere Verbindung ein Peptidfragment verloren hat, das die durch Glutaminsäure mit freier Aminogruppe gebildeten endständigen Aminosäuregruppen dieser Verbindung aufweist; daß im wesentlichen die Gesamtheit dieser Verbindungen an einen Fibrinklumpen gebunden wird und selbst nach dem Waschen dieses Klumpens unter Bedingungen, die weiter unten angegeben sind, gebunden bleibt; und

daß ihr isoelektrischer Punkt oberhalb 6,7 und insbesondere zwischen 7 und 9, liegt.

Die Technik, die dazu angewandt wird, den Bindungsgrad der Verbindungen des Plaminogen-Typs an Fibrin zu ermitteln, ist eine Methode, die an die Methode angepaßt ist, die von E.G. Vairel (Prod. Pharm. 5, 25 (1970) 347-353) für die Untersuchung der geringen Piasminaktivitäten angegeben wurde. Das Prinzip ist das folgende: Man bildet den Klumpen in dem Ende eines Glasröhrchens, indem man 0,4 ml Humanplasma erneut mit Calcium behandelt. Man wäscht den Klumpen, indem man eine isotonische Chloridlösung hindurchführt, bis sie sich in Gegenwart eines Plasminogen-Aktivators nicht mehr löst. Der Klumpen wird anschließend während einer vorbestimmten Zeit mit einer Lösung der zu untersuchenden Plasminogene in Kontakt gebracht. Dann wäscht man ihn erneut mit der isotonischen Chloridlösung, um das nichtgebundene Plasminogen zu extrahieren. Die Anwesenheit von an das Fibrin gebundenem Plasminogen wird durch eine Lyse des Klumpens nach dem Inkontaktbringen mit einem Plasminogen-Aktivator (20 ,u CTA/ml Urokinase oder 150 ,u SK/ml Streptokinase pro 2 ml des Klumpens) nachgewiesen.

Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Zubereitung aus Plazenta gewonnen.

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Die Erfindung betrifft ferner und vorzugsweise Zubereitungen, die im wesentlichen aus ausschließlich voraktivierten Plasminogenen bestehen, in denen Methionyl-Plasminogen überwiegt, oder Zusammensetzungen, die als Hauptbestandteil Lysyl-Plasminogen enthalten.

Sie betrifft gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform Zubereitungen, die im wesentlichen aus Methionyl-Plasminogen, Lysyl-Plasminogen und gegebenenfalls auch Valyl-Plasminogen bestehen.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der genannten Zubereitungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine vorzugsweise aus Plazenta gewonnene Ausgangslösung, die im wesentlichen von Inhibitoren der Aktivierung des Plasminogens frei ist und Verbindungen vom Plasminogen-Typ, von denen ein Teil aktiviert ist, enthält, bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9, vorzugsweise bei neutralem pH-Wert, und bei einer Temperatur zwischen 0 und 40 C, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa +4c, während eines Zeitraumes mit Fibrin in Kontakt bringt, der dazu ausreicht, eine wirksame Bindung des wesentlichen Anteils der in dieser Lösung enthaltenen voraktivierten Plasminogene an das Fibrin zu bewirken;

daß man das Fibrin wäscht, vorzugsweise mit einem Medium der Art, wie dem, in dem zuvor die genannten Verbindungen des Plasminogen-Typs in der Ausgangslösung gelöst waren, um die nichtgebundenen Proteine zu entfernen; und

daß man anschließend die an das Fibrin gebundenen voraktivierten Plasminogene eluiert, indem man sie mit einer Lösung eines Inhibitors der Aktivierung des Plasminogens in Kontakt bringt, worauf man diese voraktivierten Plasminogene durch Entfernen der genannten Inhibitoren in gereinigtem Zustand gewinnen kann oder gewinnt.

Die bevorzugt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten

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Ausgangslösungen sind Lösungen von Verbindungen vom Plasminogen-Typ, wie man sie bei dem Verfahren des Hauptpatentes (Patentanmeldung P 24 59 915.3-41), insbesondere ausgehend von Plazentabrei, erhält. Diese Zubereitungen enthalten, wie oben bereits angegeben wurde, in der Tat bereits erhebliche Mengen voraktivierter Plasminogene und sind darüber hinaus praktisch frei von Plasmin. Es versteht sich jedoch, daß die eingesetzten Ausgangslösungen auch auf andere Plasminogen-Quellen zurückgehen können, insbesondere auf Plasmen, wobei es sich versteht, daß die in ihnen enthaltenen Verbindungen vom Plasminogen-Typ, insbesondere die "Glutamyl-Plasminogene" zuvor teilweise durch Anwendung an sich bekannter Verfahrensweisen voraktiviert worden sind.Es sind insbesondere Methoden zur Reinigung von Plasminogenen, ausgehend von solchen Ausgangsmaterialien beschrieben.worden, die zu einer teilweisen Proteolyse der anfänglich vorhandenen Plasminogene führen.

Bei dem verwendeten Fibrin handelt es sich vorzugsweise um ein Fibrin, das zuvor von sämtlichen Plasmaverunreinigungen, insbesondere restlichen Plasminogenen befreit worden ist, wobei ein solches Fibrin gegen die Einwirkung von Plasminogen-Aktivatoren unempfindlich ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bewirkt man eine Chromatographie unter Verwendung einer mit Fibrin beschickten Säule, die mit einer gepufferten Lösung äquilibriert worden ist, die vorzugsweise von der gleichen Art und der gleichen Zusammensetzung ist, wie das Medium der Ausgangslösung, die die zu reinigenden Plasminogene enthält, wobei das Verfahren darin besteht, daß man die Ausgangslösung der zu reinigenden Plasminogene über die Fibrinsäule führt, man die Fibrinsäule anschließend mit dem genannten Medium und in Abwesenheit von Plasminogen wäscht, bis die Abströme keine Proteine mehr enthalten, worauf man die an das Fibrin der Säule gebundenen Plasminogene eluiert, indem man eine Lösung durch die

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Säule führt, die einen Inhibitor der Aktivierung des Plasminogens enthält.

Das verwendete Fibrin kann man in irgendeiner an sich bekannten Weise gewinnen, insbesondere durch Zugabe von Thrombin zu Fibrinogen, das insbesondere menschlichen Ursprungs ist, oder durch Auflösen dieses Fibrinogens in einem Plasma und erneute Zugabe von oder Behandlung mit Calcium (bzw. Calciumionen) unter Rühren.

Das erhaltene Fibrin wird vermählen, so daß man ein vorzugsweise feinteiliges Pulver erhält.

Dieses Vermählen kann man durch Homogenisieren einer Suspension des Fibrins in einer isotonischen Natriumchloridlösung (isotonische Chloridlösung) bewirken.

Vorteilhafterweise wird das erhaltene feinvermahlene Fibrin von Plasmaverunreinigungen oder anderen Verunreinigungen, insbesondere dem gegebenenfalls noch darin vorhandenen Plasminogen befreit, was man durch mehrfaches Waschen erreicht, wobei man mindestens einmal mit einer Lösung wäscht, die einen Inhibitor der Aktivierung des Plasminogens enthält. Beispielsweise wäscht man das Fibrin jedesmal mit der 4- bis 10-fachen Menge ihres Volumens einer wäßrigen Lösung, wobei man mindestens einen Waschvorgang mit einer 0,5 m £ -Aminocapronsäurelösung bewirkt, so daß man ein Fibrin erhält, das gegenüber der Einwirkung von Aktivatoren unempfindlich ist, selbst nach dem Inkubieren während 24 Stunden in einer Urokinase-Lösung (bei der man insbesondere 500 mg Fibrin pro ml einer Lösung einsetzt, die 20 ,u CTA Urokinase enthält).

Dieses Fibrin wird anschließend zur Beschickung einer Säule verwendet, die mit einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert zwischen 6 und 9, vorzugsweise mit einem pH-Wert von etwa 7,

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deren Ionenstärke mindestens gleich 2 ist, äquilibriertbzw. ins Gleichgewicht gebracht wird. Vorteilhafterweise verwendet man eine 0,9 %-xge Natriumchloridlösung.

Man erzielt gute Ausbeuten der Extraktion der in einer Lösung der oben definierten Art enthaltenen voraktivierten Plasminogene, wenn man für die Reinigung einer Lösung, die 1 mg der Verbindungen vom Plasminogen-Typ enthält, ein Säulenvolumen der Fibrinsäule von 2 bis 6 ml, insbesondere etwa 4ml, anwendet und den stündlichen Durchsatz der Lösung des zu reinigenden Plasminogens durch die Säule auf etwa 1 bis etwa 100 Volumen-Prozent, vorzugsweise etwa 25 bis 50 Volumen-Prozent und insbesondere etwa 25 Volumen-Prozent, bezogen auf das Volumen der Säule, einstellt.

Die auf die Kolonne aufgetragene Plasminogenlösung enthält vorteilhafterweise 1 bis 10 Mikrokatal Plasminogen pro ml. Nach dem Überführen dieser Lösung durch die Säule wäscht man die Säule mit einem Volumen der Pufferlösung, das mindestens gleich ist dem Volumen der Säule, wobei man das Ende des Auftretens von nichtgebundenen Proteinen im Eluat mit Hilfe an sich bekannter Verfahrensweisen ermitteln kann, beispielsweise durch Bestimmen der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 28O nm.

Es ist bemerkenswert, daß die Bindung der voraktivierten Plasminogene und insbesondere der Methionyl- und Lysyl-Plasminogene an Fibrin unter den angebebenen Bedingungen ausreichend selektiv und stabil ist, so daß die Bindung das Waschen mit der Pufferlösung übersteht.

Die Elution der an Fibrin gebundenen Verbindungen vom Plasminogen-Typ kann dann mit einer Lösung irgendeines bekannten Inhibitors der Aktivierung von Plasminogen erreicht werden. Man bewirkt diese Elution vorteilhafterweise mit einer Lösung, die mehr als

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0,005 Mol pro Liter, beispielsweise 0,05 Mol pro Liter^-Aminocapronsäure in einer isotonischen Chloridlösung enthält.

Man kann jedoch auch auf andere Inhibitoren der Aktivierung des Plasminogens zurückgreifen. Beispielsweise kann man trans-4-Amino-methyl-cyclohexancarbonsäure oder p-Aminomethylbenzoesäure verwenden.

Die Verbindungen vom Plasminogen-Typ können dann in an sich bekannter Weise aus dem Eluat gewonnen werden, beispielsweise mit Hilfe der Methoden, die als beispielhafte Methoden in dem Hauptpatent (Patentanmeldung P 24 59 915.3-41) angegeben

sind. Beispielsweise kann man die^-Aminocapronsäure durch Dialyse gegen destilliertes Wasser, durch Überführen der Lösung über ein geeignetes Molekularsieb oder durch Ausfällen der Proteine, beispielsweise mit einem Alkohol oder mit einem Salz, wie Ammoniumsulfat, abtrennen. Gemäß der bevorzugten Verfahrensweise fällt man die eluierten Proteine mit Alkohol selektiv aus einer Wasser-Alkohol-Mischung (35° GL) aus.

Das schließlich erhaltene Produkt kann gefriergetrocknet werden .

Ausgehend von einer aus Plazenta gewonnenen Lösung von Plasminogenen, wie man sie nach dem Hauptpatent (Patentanmeldung P 24 59 915.3-41) erhält, gewinnt man in dieser Weise Zubereitungen, die vollständig frei sind von "Glutamyl-Plasminogenen" und die als endständige Aminosäuren mit NH₂-Gruppe Methionin oder Lysin enthalten. Die isoelektrischen Punkte dieser Plasminogen-Bestandteile der erhaltenen Zubereitung liegen oberhalb 6,7. Sie liegen insbesondere zwischen 7 und 9. Die Plasminogene werden in selektiver und stabiler Weise an einen Fibrinklumpen gebunden und bleiben dort gebunden, wenn man den Klumpen mit einer gepufferten Lösung mit neutralem pH-Wert eluiert, die frei ist von Inhibitoren der Aktivierung des Plasminogens.

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Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann man die Verbindungen vom Plasminogen-Typ an Fibrin binden, dann kann man dieses waschen, worauf man die zurückgehaltenen Plasminogene eluiert, indem man andere Methoden als chromatographische Verfahrensweisen anwendet. Insbesondere kann man diskontinuierlich arbeiten, beispielsweise in der Weise, daß man eine Suspension von Fibrin in der die zu reinigenden Plasminogene enthaltenden Lösung bereitet, nach Beendigung der Bindung das das Plasminogen aufweisende Fibrin abtrennt, gewinnt, wäscht und anschließend in einer Lösung suspendiert, die den Inhibitor der Aktivierung des Plasminogens enthält, und schließlich nach der Abtrennung des Fibrins die Lösung gewinnt, in der die gewünschten voraktivierten Plasminogene enthalten sind, wobei es sich versteht, daß die Bedingungen hinsichtlich der Behandlungszeit, des pH-Wertes und der Temperatur ebenfalls in jenen Bereichen liegen können, die bereits weiter oben angegeben sind.

Es ist darauf hinzuweisen, daß Methionyl-Plasminogen und Lysyl-Plasminogen sich nur durch eine verminderte Anzahl von Aminosäuren, die 5 nicht übersteigen, unterscheiden. Es scheint so zu sein, daß Lysyl-Plasminogen von Methionyl-Plasminogen dadurch abgeleitet ist, daß diese letztere Verbindung ein kleines Peptidfragment, das aus den genannten Aminosäuren besteht, verloren hat, insbesondere während längerer Lagerung von rohen Extrakten, die man bei einer Zwischenstufe des Verfahrens zur Extraktion und zur Reinigung von aus Plazenta gewonnenen Verbindungen vom Plasminogen-Typ erhält, insbesondere zwischen der eigentlichen Maßnahme der Extraktion aus den Plazentas, die

in dem Hauptpatent (Patentanmeldung P 24 59 915.3-41)

beschrieben ist, und der letzten Stufe der Reinigung durchlaufen wird. Das gleiche Ergebnis kann man auch bei einer technischen Herstellung beobachten, bei der die verschiedenen Behandlungen der rohen Extrakte mit den verwendeten Reagentien im allgemeinen während längerer Zeitdauern als bei jenen Verfahrensweisen erfolgen, die mit geringeren Mengen im Laboratorium durchgeführt

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werden.

Demzufolge betrifft die Erfindung auch ganz allgemein eine stabile Zubereitung, die im wesentlichen frei von Plasmin ist und die gleichzeitig eine Verbindung vorn Plasminogen-Typ, deren endständige Aminosäure, die eine freie Aminogruppe aufweist, durch Glutaminsäure gestellt wird (natives Plasminogen) und ein weiteres Plasminogen (voraktiviertes Plasminogen) mit geringerem Molekulargewicht enthält, das insbesondere dadurch gebildet ist, daß das native Plasminogen ein die genannte endständige Aminosäure aufweisendes Peptid verloren hat, und das ein Molekulargewicht von etwa 7 000 bis 8 000 aufweist, wobei dieses voraktivierte Plasminogen in der Zubereitung in einer Menge von ^- 40 Gewichtsprozent, bezogen auf die Gesamtmenge der Verbindungen vom Plasminogen-Typ, die in dieser Zusammensetzung enthalten sind, die dadurch gekennzeichnet ist, daß das voraktivierte Plasminogen mindestens zum Teil aus Lysyl-Plasminogen besteht. Diese Verbindung kann die Verbindung vom Plasminogen-Typ sein, die unter den in der Zubereitung enthaltenen voraktivierten Plasminogene in überwiegendem Ausmaß vorhanden ist.

Die Erfindung betrifft ferner stabile, wasserlösliche, pharmazeutische Zubereitungen, die im wesentlichen von Plasmin frei sind, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die genannten Verbindungen vom Plasminogen-Typ zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Bindemittel, Trägermaterial und/oder Hilfsstoff enthalten. Die Erfindung betrifft insbesondere pharmazeutische Zubereitungen dieser Art, die injizierbar sind.

Weitere Ausführungsformen, Gegenstände und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem folgenden Beispiel.

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Beispiel

1. Extraktion von Verbindungen vom Plasminogen-Typ aus Plazentas und ihre Reinigung.

Die eigentliche Plazenta, die Membranen und die Plazentaschnur werden nach der Lieferung gefroren und bei - 20 C gelagert. Die Plazentas werden in gefrorenem Zustand mechanisch in Stücke mit einer Seitenlänge von 1 bis 5 mm zerkleinert und dann unter Rühren in 2 Volumen einer isotonischen Chloridlösung aufgetaut. Nachdem die Temperatur der Suspension + 6 C erreicht hat, wird die Suspension zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit (Plazentablut), die Hämoglobin und Plasmaproteine enthält, jedoch praktisch frei ist von Plasminogenen, wird verworfen. Das Sediment oder der Plazentabrei, der aus Plazentagewebe und zum geringeren Anteil aus Fibrinklumpen besteht, wird während 2 Stunden bei + 4 C mit 2 Volumina einer isotonischen Chloridlösung, die 0,05 Mol pro Liter £-Aminocapronsäure enthält, ausgelaugt und dann erneut zentrifugiert. Die extrahierten Verbindungen vom Plasminogen-Typ finden sich in der überstehenden Flüssigkeit. Sie werden bei einem pH-Wert von 7,0 durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Menge, die dazu ausreicht, eine Endsättigungskonzentration von 40 % zu erreichen, ausgefällt. Das in dem Miederschlag enthaltene Proenzym wird anschließend durch Affinitätschrcmatographie gereinigt (nach der Methode von D. Deutsch und E.T. Merz, Science, 170 (1970) 1O95-1O96). Bei jeder Stufe der Reinigung gibt man Aprotinin (den aus dem Pankreas extrahierten Kunitz-Inhibitor, der im Handel unter der Bezeichnung Iniprol erhältlich ist) zu, um einen Abbau der Verbindungen vom Plasminogen-Typ durch Proteolyse des als Verunreinigung vorhandenen Plasmins zu verhindern.

Unabhängig von der Menge der als Ausgangsmaterial behandelten Plazenta (5, 50, 200 oder 1 OOO kg) erhält man in allen Fällen Präparate von Verbindungen vom Plasminogen-Typ, die, in trocke-

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nem Zustand, eine spezifische Aktivität von 2,4 bis 2,6 Mikrokatal pro mg aufweisen.

Die Analyse der endständigen Aminosäuren mit NH„-Gruppe nach der bereits erwähnten Technik von Gros und Labouesse weist auf die Anwesenheit erhöhter Mengen von Lysyl-Plasminogen und Methionyl-Plasminogen hin, während als restliche Verbindungen vom Plasminogen-Typ Glutamyl-Plasminogen vorhanden ist.

Sie besitzen insbesondere die in der folgenden Tabelle I angegebene Zusammensetzung:

TABELLE I

Endständige Aminosäuren mit NH₂-Gruppe	Menge in %
Methionin Glutaminsäure Lysin Valin	55 25 20 Spuren

2. Herstellung einer Fibrinsäule

Man löst 9 g menschliches Fibrinogen unter Rühren während 3 Stunden in 200 ml Humanplasma. Das Plasma wird dann durch Zugabe von 30 ml einer 2 %-igen Calciumchloridlösung mit Calcium behandelt. Nach der Koagulation läßt man den gebildeten Klumpen während 36 Stunden bei Raumtemperatur stehen, damit die Wirkung des durch das Plasma zugeführten Faktors XIII vollständig ist und eine gute "Festigkeit" des Fibrins sicherstellt. Der Klumpen wird dann in Stücke zerschnitten und anschließend in 800 ml isotonischer Chloridlösung homogenisiert (wozu man einen Homogenisator des Typs Ultraturax verwendet, der während 5 Minuten mit maximaler Geschwindigkeit betrieben wird). Die Fibrinteilchen werden anschließend auf einem Büchner-

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Filter mit 3 1 isotonischer Chloridlösung, 1 1 isotonischer Chloridlösung, die 0,5 Mol pro 1 ^-Aminocapronsäure enthält, 1 1 isotonischer Chloridlösung, 112m NaCl-Lösung mit einem pH-Wert von 7,2, und schließlich mit 2 1 isotonischer Chloridlösung gewaschen. Das in dieser Weise erhaltene Fibrin ist von sämtlichen Plasmaverunreinigungen befreit und in 5 m Harnstofflösungen unlöslich. Insbesondere unterliegt es keiner Lyse, wenn man es mit einem Aktivator des Plasminogens in Kontakt bringt (indem man 2 ml des Fibrins während 24 Stunden mit 20,u CTA/ml Urokinase oder 150 ,u SK/ml Streptokinase behandelt) .

Das in dieser Weise erhaltene Fibrin wird dann in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Höhe von 45 cm eingefüllt und unter einem Durchsatz von 48 ml pro Stunde während 48 Stunden mit einer isotonischen Chloridlösung mit einem pH-Wert von 7,2 äquilibriert.

3. Extraktion der voraktivierten Plasminogen-Beständteile, ausgehend von Präparaten von Verbindungen des Plasminogen-Typs, die nach der Behandlunqsweise gemäß Ziffer 1. erhalten wurden

Man löst 60 mg des Präparates der Verbindungen vom Plasminogen-Typ in 30 ml isotonischer Chloridlösung und trägt die Lösung oben auf die Säule auf. Man wäscht die Säule dann, um die nichtgebundenen Proteine zu entfernen, mit der gleichen isotonischen Chloridlösung, bis der Abstrom keine Proteine mehr enthält, was man durch Bestimmung der optischen Dichte der aufeinanderfolgenden Waschfraktionen bei 280 nm feststellt.

Das gebundene Plasminogen wird mit einer isotonischen Chloridlösung eluiert, die zusätzlich £ -Aminocapronsäure in einer Konzentration von 0,05 Mol pro Liter enthält.

Die eluierte Fraktion, die etwa 75 % der im Ausgangspräparat enthaltenen Proteine umfaßt, besteht aus einer Plasminogen-Mischung,

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die als endständige Aminosäuren mit freier NH„-Gruppe Methionin und Lysin enthält, und die keine Glutamyl-Plasminogene aufweist.

Durch Elektrofokussierung läßt sich ermitteln, daß die Fraktionen Proteine mit isoelektrischen Punkten von 7,07, 7,65, 8,00, 8,12 bzw. 8,75 enthalten.

Die eluierten Proteine werden anschließend selektiv ausgefällt, indem man Alkohol in einer Menge zu der erhaltenen wäßrigen Lösung zusetzt, daß man eine Wasser-Alkohol-Mischung mit einer Alkoholkonzentration entsprechend 35° GL (Gay Lussac-Einheiten) erhält. Das erhaltene Produkt wird dann gefriergetrocknet .

Sämtliche obigen Maßnahmen werden, wenn nichts anderes angegeben ist, bei einer Temperatur von etwa 4°C durchgeführt.

Die erhaltenen Produkte können an Fibrinklumpen gebunden werden, insbesondere an Klumpen, die zuvor von sämtlichen Plasminogenen befreit worden sind.

Es sei darauf hingewiesen, daß die vollständig von Plasminogen befreiten Fibrinklumpen in Gegenwart eines Plasminogen-Aktivators unter den oben beschriebenen Bedingungen keiner Lyse unterliegen. Es hat sich jedoch gezeigt, daß die gleichen Klumpen, wenn man sie mit den genannten Produkten in Berührung gebracht hat, dieser Lyse unter Einwirkung eines Plasminogen-Aktivators unterliegen. Im Gegensatz dazu lassen sich die gleichen, anfänglich von Plasminogen befreiten Klumpen unter den oben angegebenen Bedingungen nicht lysieren, wenn man sie zuvormit einem natives Plasminogen enthaltenden Plasma in Kontakt gebracht hat, zumindest unter den gleichen Bedingungen, wie die erfindungsgemäßen Verbindungen.

Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle II aufge-

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führt, in der auch die Versuchsbedingungen in der Spalte "Art des Versuches" aufgeführt sind.

TABELLE II
Untersuchung der Bindung der Plasminogene an Fibrin

Nr.des
Versuchs

Art des Versuchs

Aktivator

Ergebnis nach Stunden

Klumpen gewaschen und mit 2 ml Plasma in Kontakt gebracht

Klumpen gewaschen, mit 2 ml eines Puffers, der 0,5 mg/ml des erfindungsgemäßen Plasminogens und 10 ug/ml Aprotinin enthält, behandelt und gewaschen

Kontaktdauer: 45 Minuten

Der Versuch erfolgt identisch mit dem Versuch Nr. 2, wobei jedoch in Gegenwart von 0,1 mg/ml des erfindungsgemäßen Plasminogens gearbeitet wird

Versuch identisch mit dem Versuch Nr. 2, wobei jedoch in Gegenwart von 0,25 mg/ml des erfindungsgemäßen Plasminogens gearbeitet wird

Urokinase Streptokinase

keine Lyse keine Lyse

100 %-ige Lyse 100 %-ige Lyse

20 %-ige Lyse 20 %-ige Lyse

50 %-ige Lyse 50 %-ige Lyse

Man gibt das Aprotinin zu, wenn man das Plasminogen in dem Puffer löst, um eine Zersetzung oder einen Abbau des Plasminogens durch das verunreinigende Plasmin sowie das Auflösen des Fibrins durch dieses gleiche Plasmin zu verhindern.

Der Versuch Nr. 1 zeigt, daß das native Plasminogen des Plasmas nicht an das bei der Ausfällung gebildeten Fibrin adsorbiert wird. Im Gegensatz dazu bleibt das aus der Plazenta extrahierte Plasminogen an dem Fibrin adsorbiert (Versuch Nr. 2), wobei die adsorbierte

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Menge von der Menge abhängt, die mit dem Klumpen in Kontakt gebracht wird (Versuche Nr. 2, 3 und 4).

Die erhaltenen Präparate, die nur die voraktivierten Plasminogene enthalten, stellen besonders wertvolle Arzneimittelwirkstoffe dar, da sie sich vollständig an Fibrinklumpen binden können, was im Gegensatz zu dem Verhalten der Glutamyl-Plasminogene steht, die eher im Plasma gelöst bleiben und in allen Fällen nicht in dem Klumpen verbleiben. Die selektive Bindung der Plasminogen-Präparate an Fibrinklumpen begünstigt die Lösung dieser Klumpen nach der vollständigen Aktivierung der Plasminogene und ermöglicht bessere thrombolytische Behandlungen.

Ganz allgemein können die Zubereitungen auf der Grundlage der erfindungsgemäßen Plasminogene zur Behandlung von Thrombosen und pathologischen Fibrinabscheidungen behandelt werden, insbesondere im Fall der folgenden klinischen Indikationen:

a) Akute Atembeschwerden bei Neugeborenen und Frühgeborenen, die einen vollständigen oder teilweisen Plasminogenmangel aufweisen, ein Syndrom, das im allgemeinen mit einer Fibrin-Abscheidung im Bereich der Lungenbläschen verbunden ist;

b) Venen-Embolien und -Thrombosen;

c) Mikroembolien von im wesentlichen cerebraler Art; und

d) akute, subakute und chronische Zwischengefaßkoagulationen lokaler und verbreiteter Art mit extensiver Tendenz.

Die Verabreichung des Planzenta-Plasminogens kann durch kontinuierliche venöse Perfusionen in Mengen von 1 000 bis 1 200 UCA-Einheiten, die über eine Dauer von 24 Stunden bis 36 Stunden verteilt werden, oder durch langsame intravenöse Injektion erfolgen (wobei sich die angegebenen Werte auf einen Menschen mit

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einem mittleren Gewicht von 60 kg beziehen).

Bei Säuglingen wendet man Dosierungen von 200 UCA alle 6 Stunden an, die durch langsame Perfusion in einer 0,9 %-igen isotonischen Chloridlösung, die auf einen pH-Wert von 7,4 gepuffert ist, im Verlaufe von 24 Stunden verabreicht werden.

Bei Bildung der bevorzugten erfindungsgemäßen Präparate verwendet man Lösungen des Plasminogens in einem pharmazeutisch verträglichen Trägermaterial, insbesondere einem physiologischen Serum, vorzugsweise einem Glucoseserum.

Claims

Patentansprüche

j Ii Wasserlösliche Zubereitung, bestehend im wesentlichen aus Verbindungen vom Plasminogen-Typ, die zu Plasmin aktiviert werden können, dadurch gekennzeichnet,

daß sie im wesentlichen von Glutamyl-Plasminogen und Plasmin frei ist;

daß die genannten Verbindungen im wesentlichen voraktivierte Zymogene umfassen, die von Glutamyl-Plasminogen abgeleitet sind, indem die letztere Verbindung ein Peptidfragment verloren hat, das die durch Glutaminsäure mit freier NH₂-Gruppe gebildeten endständigen Aminosäuregruppen dieser Verbindung aufweist; daß im wesentlichen die Gesamtheit dieser Verbindungen an einem Fibrinklumpen gebunden wird und selbst nach dem Waschen mit einer Pufferlösung mit neutralem pH-Wert gebunden bleibt; und daß ihr isoelektrischer Punkt oberhalb 6,7 und insbesondere zwischen 7 und 9 liegt.
2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Plazenta gewonnen wurde.
3. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen vom Plasminogen-Typ Methionyl-Plasminogen enthalten.
4. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen vom Plasminogen-Typ Lysyl-Plasminogen enthalten.
5. Zubereitung nach einem der Ansprüche 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Valyl-Plasminogen enthält.
6. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen vom Plasminogen-Typ im wesent-

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ORIGINAL INSPECTED

lichen Methionyl-Plasminogen und Lysyl-Plasminogen umfassen.
7. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine vorzugsweise aus Plazenta gewonnene Ausgangslösung, die im wesentlichen von Inhibitoren der Aktivierung des Plasminogens frei ist und Verbindungen vom Plasminogen-Typ, von denen ein Teil voraktiviert ist, enthält, bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9, vorzugsweise bei neutralem pH-Wert, und bei einer Temperatur zwischen O und 40°C, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa + 4°C, während eines Zeitraumes mit Fibrin in Kontakt bringt, der dazu ausreicht, eine wirksame Bindung des wesentlichen Anteils der in dieser Lösung enthaltenen voraktivierten Plasminogene an das Fibrin zu bewirken; daß man das Fibrin wäscht, vorzugsweise mit einem Medium der Art wie dem, in dem zuvor die genannten Verbindungen des Plasminogen-Typs in der Ausgangslösung gelöst waren, um die nichtgebundenen Proteine zu entfernen; und

daß man anschließend die an das Fibrin gebundenen voraktivierten Plasminogene eluiert, indem man sie mit einer Lösung eines Inhibitors der Aktivierung des Plasminogens in Kontakt bringt, worauf man diese voraktivierten Plasminogene durch Entfernen der genannten Inhibitoren in gereinigtem Zustand gewinnen kann oder gewinnt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fibrin ein Fibrin einsetzt, das zuvor von sämtlichen Plasmaverunreinigungen, insbesondere restlichen Plasminogenen, befreit wurde, und das gegen die Einwirkung von Plasminogen-Aktivatoren unempfindlich ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Chromatographie über eine Fibrin-Säule durchführt, die vorzugsweise mit einer Lösung der gleichen Art und der gleichen Zusammensetzung wie jener,,die die zu reinigenden

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Plasminogene enthält, äquilibriert worden ist, indem man diese letztere Lösung über die Fibrin-Säule führt und diese Säule mit der gleichen gepufferten Lösung wäscht, und schließlich eine Elution der gebundenen Verbindungen vom Plasminogen-Typ bewirkt, indem man eine Lösung eines Inhibitors der Aktivierung des Plasminogens durch die Fibrin-Säule führt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete gepufferte Lösung eine Ionenstärke zwischen 0 und 2 aufweist,

daß die verwendete Fibrinmenge etwa 1 bis etwa 5 ml, vorzugsweise etwa 3 ml Fibrin pro mg der zu reinigenden Plasminogene beträgt, daß die das zu reinigende Plasminogen enthaltende gepufferte Lösung in einer Menge zwischen etwa 1 und 100 Volumen-Prozent, vorzugsweise zwischen 25 und 50 Volumen-Prozent der Lösung pro Volumen des Fibrins in der Säule durch die Säule geführt wird und daß man nach der Bindung der Verbindungen des Plasminogen-Typs an das Fibrin diese letzteren Verbindungen mit einer Lösung eines Inhibitors der Aktivierung des Plasminogens eluiert, die diesen letzteren Bestandteil in einer Konzentration von 0,005 Mol/Liter oder mehr enthält.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Fibrinogen in der die zu reinigenden Plasminogene enthaltenden Lösung suspendiert, daß man anschließend das das Plasminogen zurückhaltende Fibrin

abtrennt und gewinnt und

daß man nach erfolgter Bindung das Fibrin wäscht und erneut in

einer Lösung suspendiert, die den Inhibitor der Aktivierung des

Plasminogens enthält, und schließlich nach der Abtrennung des

Fibrins eine Lösung gewinnt, die die gewünschten voraktivierten

Plasminogene enthält.

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12. Stabile Zubereitung, die im wesentlichen frei ist von Plasmin und gleichzeitig eine Verbindung vom Plasminogen-Typ, die als endständige Aminosäuregruppe mit freier Aminogruppe Glutaminsäure aufweist (natives Plasminogen) und ein weiteres Plasminogen (voraktiviertes Plasminogen) mit geringerem Molekulargewicht enthält, das insbesondere dadurch gebildet ist, daß das native Plasminogen ein die genannte endständige Aminosäure aufweisendes Peptid verloren hat, und das ein Molekulargewicht von etwa 7 0OO bis 8 OOO aufweist, wobei dieses voraktivierte Plasminogen in der genannten Zubereitung in einer Menge von mindestens 40 Gewichtsprozent, bezogen auf die Gesamtmenge der in dieser Zubereitung enthaltenen Verbindungen vom Plasminogen-Typ vorhanden ist, dadurch gekennzeichnet, daß das voraktivierte Plasminogen mindestens zum Teil aus Lysyl-Plasminogen besteht.
13. Zubereitung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,

daß das überwiegend in dieser Zubereitung enthaltene voraktivierte Plasminogen Lysyl-Plasminogen ist.
14. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff eine Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 12 und 13 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Bindemittel, Trägermaterial und/oder Hilfsstoff enthält.
15. Zubereitung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer injizierbaren wäßrigen Lösung vorliegt.

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