DE2447050A1 - Verfahren zur gewinnung von proteasenhemmstoff - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von proteasenhemmstoff

Info

Publication number
DE2447050A1
DE2447050A1 DE19742447050 DE2447050A DE2447050A1 DE 2447050 A1 DE2447050 A1 DE 2447050A1 DE 19742447050 DE19742447050 DE 19742447050 DE 2447050 A DE2447050 A DE 2447050A DE 2447050 A1 DE2447050 A1 DE 2447050A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
inhibitor
lysis
heparin
interrupted
aqueous solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19742447050
Other languages
English (en)
Other versions
DE2447050C2 (de
Inventor
Auf Nichtnennung Antrag
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Laboratori Derivati Organici SpA
Original Assignee
Laboratori Derivati Organici SpA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laboratori Derivati Organici SpA filed Critical Laboratori Derivati Organici SpA
Publication of DE2447050A1 publication Critical patent/DE2447050A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2447050C2 publication Critical patent/DE2447050C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0066—Isolation or extraction of proteoglycans from organs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
    • C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Description

PATENTANWALT*·
DIpL-lng. P. WlRTH · Dr. V. SCHMIED-KOWARZIK Dlpl.-lng. G. DANNENBERG · Dr. P. WEINHOLD · Dr. D. GUDEL
281131 β FRANKFURT AM MAIN
TELEFON (061l) 287014 GR. ESCHENHEIMER STRASSE 38
Caseι bd/36 889
wd/uxn
LABORATORI DERIVATI ORGANICI S.p.A.
Mailand
Italien
"Verfahren zur Gewinnung von Proteasenhemmstoff"
Die Erfindung betrifft die Gewinnung von Hemmstoff der Proteasen, insbesondere des Kallikreins und Trypsins, deren therapeutische Anwendung sich zunehmend verbreitet und in bestimmten Fällen unersetzlich ist.
Bekanntlich wurde der Proteasenhemmstoff in mehreren tierischen Organen bzw. Geweben festgestellt, wie Bauchspeicheldrüse, Leber, Lunge, Lymphknoten, Ohrspeicheldrüsen, Milz,
509815/1277
2A47050
Blut, Samendrüse u.a.m. (Kraut, H. und KoIl. Z. physiol. ehem. 192,1 - M. Kunita und J.H. Northrop, J. Gen. physiol. 19,991 - Werle, Ξ. und KoIl.., Z. Naturforsch. 14b, 385 - Astruiip, T. Acta physiol. scan«, 26.243); es wurden auch zahlreiche Techniken ausgedacht, um ihn aus diesen Geweben herauszuziehen; diese beruhen moistens auf der selektiv herausziehenden Wirkung wässriger, saurer oder alkalischer Gemische, salziger und/oder hydroalkobolischer Fraktionierungen und auf chromatographischen Verfahren (vgl. deutsche latente Nr. 1.084.4-33, 1.148.352, Ί.011.576, 956.90?, 950.959, 954.284, britisches Patent Nr. 965.352, französisches Patent Nr. 1.566.777, japanische Patente Nr. 43-7328 und Nr. 44-8563).
Alle erwähnten Verfahren weisen - neben einer großen Kompliziertheit und der hohen Anzahl der erforderlichen Verwandlungen - den vom Standpunkt der Industrie aus stark ins Gewicht fallenden Nachteil auf, daß die Ausbeute bei unverhältnismäßig hohem Aufwand ziemlich klein ist.
Bekanntlich enthalten einige der vorgenannten, tierischen Organe auch größere Mengen Heparin, welcher Stoff ebenfalls in starkem Ausmaß hergestellt und in Krankenhäusern verwendet wird. Heparin wurde eben aus diesen Organen unter Zuhilfenahme der lösbarmachenden Wirkung einiger proteolytischer Enzyme und nachträglicher Fällung des Heparins gewonnen. Das Verfahren wurde jedoch in den meisten Fällen durch andere Herstellungsmethoden nach und nach verdrängt, die auf anderen Quellen beruhten und industriemäßig lchnander waren. Erwähnenswert ist auch die 1'atsache, daß die Abfallrückstände aus der Hoparinherstellung als Flüssigkeit, die aus der Fällung übr:.^.
509815/1277
bleibt, in die Abwasserleitung entleert wurden, was zugleich einen nicht zu übersehenden Faktor der Umweltverunreinigung bildete.
Hauptsweck der Erfindung ist die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Herstellung eines Proteasenhemrastoffes evtl. mit gleichzeitiger Heparinherst ellung', welches vom Gesichtspunkt der Industrieherstellung aus gesehen in bezug auf Ausbeute und Kalkulation gegenüber den herkömmlichen Methoden günstig liegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist durch folgende Reihe Vorgänge gekennzeichnet:
a) Tierische Organe, die den Hemmstoff enthalten,.werden sowohl ganz oder in Form von Pulver oder Extrakt mittels eines proteolytischen Enzyms, das unter solchen zu wählen ist, die den Hemmstoff nicht angreifen, in wässriger Lösung so behände lift, daß eine Lysis entsteht, wobei die wässrige Lösung auf die Eigenschaften und Eigenart des jeweiligen proteolytischen Enzyms abgestimmt ist;
b) die Lysis wird durch Proteinentziehung unterbrochen;
c) der Hemmstoff wird mittels eines kationischen Detergens getrennt, und
d) der Hemmstoff wird auf den gewünschten Reinheitsgrad gebracht, der dem vorgesehenen Verwendungszweck entspricht.
In der Tat beruht das eben erwähnte Verfahren auf verschiedenen Prinzipien, von denen einige zwar an sich bekannt sind, aber noch nie zur Gewinnung dieses Hemmstoffes angewandt wurden*
50981 5/1 277
244705Q
Zuerst muß hervorgehoben werden, daß der Proteasenhemmstoff von zahlreichen proteolytischen Enzymen nicht angegriffen wird, wie etwa Pepsin, Trypsin, Chimotrypsin, Kallikrein, Plasmin, Elastase, Kollagenase, Carboxy-Peptidasen A und B, Ficin, Papain und Brpmelin (B.Eassell und KoIl. J. Biol.Chem. 219,203 - H. Kraut und KoIl. Z. physiol. ehem. 334,236 und 348,1498). Außerdem wurde von den angeführten Verfassern sowie von der Änmelderin festgestellt, daß insbesondere Pepsin, Papain und Ficin durch den Proteasenhemmstoff nicht inhibiert werden. Es ist nun bekannt, daß einige dieser proteolytischen Enzyme in den Vorgängen zur Gewinnung des Heparins aus Geweben und Organen, wo es enthalten ist, Verwendung finden.
An zweiter Stelle wird beobachtet, daß die Löslichkeit des Hemmstoffes in den verschiedenen, proteinentziehenden Gemischen zwar gegeben ist, aber in veränderlichem Haß durch dieselben Proteine beeinflußt wird, die in den normalen Rohextrakten vorhanden sind und bei der Reinigung entfernt werden müssen, um mögliche anaphylaktogene Folgen auf ein Mindestmaß herabzusetzen. Bei der Extraktion des Peptids aus den dieses enthaltenden Organen bestand daher das Problem, die Beeinflussung der Löslichkeit des in Rede stehenden Hemmstoffes durch Proteine zu beseitigen und gleichzeitig die Gefahr von Anaphylaxis einzuschränken.
Schließlich konnte die Anmelderin feststellen, daß die Anwendung kationischer Detergentien, wie die quaternären Ammoniumbasen, unter bestimmten Bedingungen die Befreiung des Hemmstoffes von polyanionischen Verunreinigungen wie Kukopoly-
509815/1277
saccharide, Nukleinsäuren und zahlreichen Stoffen pyrogenetischer Art erlaubt; demnach kann sich die Anwendung derartiger Deta?3entien als nützlich erweisen, nicht nur zur Reinigung sondern auch zur Einschränkung der Fyrogenizität des Produktes. Es ist nämlich bekannt, daß auch bei der Fabrikation des Heparins kationische Detergentien verwendet werden um den Stoff aus den betreffenden Brühen zu gewinnen.
Aus obigen Überlegungen geht deutlich hervor, daß eine gewisse Parallelität zwischen Heparinherstellung nach der bisherigen Technik und der Herstellung des Proteasenhemmstoffes nach dem von der Anmelderin erfundenen und vorgeschlagenen Verfahren besteht.
Ein weiterer Zweck der Erfindung ist schließlich die Vereinigung der Gewinnung des Heparins sowie des Proteasenhemmstoffes. irr einem Verfahren, welches Verfahren in beziig auf die bereits bekannten Vorgänge zur Herstellung des Heparins durch die Anwendung proteolytischer Enzyme gekennzeichnet ist, die den Proteasenhemmstof nicht angreifen und in Bezug auf die Herstellung des Hemmstoffes an sich dadurch gekennzeichnet ist, daß die bisherige Ausschußfraktion aus der Ausfällung von Heparin, Mukopolysacchariden und/oder pyretogenen Stoffen, dazu verarbeitet wird, um den Hemmstoff zu konzentrieren und zu reinigen.
Wie die Anmelderin außerdem feststellen konnte und nächste- ■ hende Beispiele bestätigen es, ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur desv/egen vorteilhaft," weil es ermöglicht, bisher unausgenutzt ausscheidende Ausschußrückstände unter
509815/1277
bestimmten Bedingungen zu verwerten, und ein fast aufgegebenes Verfahren zur Herstellung des Heparins und der Mukopolysaccharide vom Standpunkt der Industrie aus wieder brauchbar zu machen, sondern auch weil die Ausbeute an Hemmstoff wesentlich höher ist als bei den bekannten Verfahren, und schließlich weil sich dadurch zugleich Verbesserungen an der Reinigung und an der Ausscheidung .verunreinigender Stoffe erzielen lassen.
Es wird hier noch darauf hingewiesen, daß ein reichlicheres Verzeichnis der für die Anwendung im erfindungsgemaßen Vorfahren infrage kommenden proteolytischen Enzyme aus 3. Kassell, "Methods Enzymology" Vol. 19» S. 848-850 entnommen werden kann ·
Bei einer näheren Erörterung des erfindungsgemaßen Verfahrens ist tiun folgendes zu bemerken:
1. Vorzugsweise soll das in der Extraktions- und Lösbarmachungsstufe verwendete proteolytische Enzym ein solches sein, das durch den betreffenden Hemmstoff nicht unaktiv gemacht wird; insbesondere wird dieses Enzym in der Gruppe ausgewählt, die Papain, IFicin und Bromelin enthält, und zwar sowohl in isolierter Form als auch in Stoffen oder Gev/eben, die es enthalten.
2. .Bei der Unterbrechung der Lysis greift man auf die normalen proteinentziehenden Agenzien und/oder auf V/ärmezufuhr zurück, so daß die Temperatur der wässrigen Lösung in der dem Fachmann wohlbekannten Art und Weise erhöht wird.
J. V/as die quaternären Ammoniumbasen anbelangt, so hat sich
509815/1277
die Verwendung von Cetylpyridinium und Brom-Oetyl-Triinethyl- -ammonium als besonders vorteilhaft erwiesen.
4-. Eür die Isolierung und Reinigung des Hemmstoffes nach der Trennung des Heparins und der MukopοIysaccharide wird vorzugsweise eine Säuerung mit Trichloressigsäure 2-5$ vorgenommen, worauf eine Fraktionierung mittel»0- Zusatz von Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration, die zwischen 0,45 und 0,9 von der Sättigungskonsentration liegt, erfolgt.
Die weitere Reinigung des Hemmstoffes kann durch Alkohol- und/oder Acetonfraktionierung und Gelfilterung oder Gelchromatographie erfolgen.
Kachstehend angeführte Beispiele wollen das erfindungsgemäße Verfahren näher erklären, stellen aber auf keinen FaIL eine unzulässige Einschränkung desselben dar.
BEISPIEL 1
ΊΟ kg gemahlene Ochsenlunge werden in 16 1 destilliertem Wasser suspendiert. Nach vorsichtiger Erwärmung der Suspension bis 40 C wurde derselben eine Suspension von 20 g Papain in U Ziträtpufferlösung O,25 M mit-pH 5,5 zugesetzt, wobei letztere 200 g Magnesiumsulfat enthielt. Die Temperatur wurde auf 55°O eingestellt und die Masse 4 Std. lang bei diesen Bedingungen gelassen. Darauf wurde der pH-Wert auf 6,2 durch Z-usatz konzentrierten Ammoniaks abgestimmt und die Hasse auf 900C gebracht. Das Ganze wurde dann unter Druck filtriert und der Rückstand ausgeschieden. Die klare Flüssigkext wurde bis zur restlosen Fiockrnig der Polyanionen mit Oetypyridinium behandelt. Dann wurde die Filterung vorgenommen um das Heparin -
509815/127 7
enthaltende Präzipitat zu sammeln, während der Flüssigkeit Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 3$ zugesetzt wurde. Nach 30 min. wird wieder unter Druck filtriert mit Spülung über dem Filter mit 4 1' Trichloressigsäure 3$. Somit erhielt man 32 1 einer klaren Flüssigkeit mit 610 wirksamen Hemmstoffeinheiten je cc (für Hemmstoffeinheit vgl. Z. Physiol Chem. 182,1 - 1930), was einer Ausbeute von 1,95 x 10 Wirkstoffeinheiten je kg des Ausgangsorgans entspricht. Diese Lösung wurde dann einer Fraktionierung mit Ammoniumsulfat von 0,5 bis 0,9 der Sättigung unter zogen und das Präzipitat wurde durch Zentrifugation aufge-
7 nommen. Dabei wurden 85 g Präzipitat erhalten mit 1,9 x 10 Hemmstoffeinheiten (ca.98% der gesamten durch Lysis erhaltenen Aktivität),während der Inhalt an Proteinmaterial 36,5% erreichte,was einem Reinheitsgrad von 1,56 meg je Hemmstoffeinheit gleichkommt.Die weiteren,für dieses Präzipitat nach den bekannten Methoden der einschlägigen Technik durchgeführten Reinigungen ermöglichten ein Ergebnis von 465 cc einer apyrogenen Lösung mit einer Aktivität von 32000 Hemmstoffeinheiten
je cc zu erreichen, d.h. insgesamt 1,49 x 10' Hemmstoffeinheiten, was einer Ausbeute von 76$ gegenüber der Anfangsaktivität gleichkommt. Der bei der Analyse des Proteinmaterials festgestellte Reinheitsgrad betrug 0,143 meg je Hemmstoffeinheit.
50 9815/127
III ,
-9-
Sin.Vergleichsversuch mit einer entsprechenden Menge desselben gemahlenen Organs mit Extraktion mit Äthylalkohol 70$ in Gegenwart vonKalziumchlorid (vgl. deutsche Patentschrift Nr. 1.084-,4-33) ergab eine Ausbeute von 0,875 x 10 Hemmstoffeinheiten je kg des Organs im Rohzustand und 0,322 χ 10 Hemmstoffeinheiten je kg des Organs in gereinigtem Zustand mit Reinheitsgrad 0,14 meg je Hemmstoff einheit'. Diese Daten mit den Ergebnissen der Papainlysis verglichen entsprechen einer Ausbeute von 21,7$ des gereinigten Produktes bzw. 46# des Rohproduktes. Ein weiterer Versuch, der mit einer entsprechenden Menge desselben gemahlenen Organs unter Anwendung des Verfahrens nach B. Kassell "Methods Enzymology" Vol. 19, S. 845* vorgenommen wurde, ergab eine Ausbeute an Rohprodukt von 1,02o χ 10 Hemmstoffeinheiten je kg des Organs, bzw· 0,418 χ 10 Hemmstoffeinheiten je kg des Organs an gereinigtem Produkt. Beim Vergleich mit den Ergebnissen der Papainlysis entsprechen diese Daten einer Ausbeute von 53 »6# an Rohprodukt bzw. 28$ an gereinigtem Produkt.
BEISPIEL 2:
Es wurde wie bei Beispiel 1 verfahren, wobei Ficin anstatt Papain verwendet wurde. Die Ausbeute betrug 2,03 x 10 Hemmstof feinheiten je kg Lunge an Rohprodukt bzw. 1,64 χ 10 je kg Lunge an gereinigtem Produkt.
BEISPIEL 3:
5 kg Ochsenlunge wurden in 5 1 Wasser suspendiert und 2 1 einer Suspension mit 10 g Bromelin in einer Phosphatpufferlösung 0,1 M mit pES zugesetzt, die 1# Äthylendiamin-Tetra-
509815/1277
- ίο -
-essigsäure enthielt. Die Masse wurde bis 37°C vorsichtig erwärmt und 4 Std. lang auf dieser Temperatur gehalten. Nach dieser Zeit wurde die Temperatur 10 min. lang bis auf 90° ■ erhöht. Anschließend wurde unter Druck filtriert und über dem Filter miU 2 1 destilliertem Wasser gespült. Nach der Abkühlung wurde das Filtrat mit Getyltrinothylammonbromid bis zur restlosen blockung der Polyanionen behandelt, die zur Trennung des Heparins auf Filter gesammelt wurden. Die klar gefilterte Flüssigkeit ergab 16 1 mit einer Aktivität · von 540 Hemmstoffeinheiten je cc, was einer Ausbeute von 1,735 x 10 Hemmstoffeinheiten je kg vom Ausgangsorgan entspricht. Daraufhin wurde die Reinigung wie unter Beispiel 1 vorgenommen. Die Endausbeute an gereinigtem Produkt betrug 1,18 χ 10 Hemmstoffeinheiten je kg der Lunge. Ein Vergleichsversuch unter Extraktion und Fraktionierung mit Ammonsulfat, wie in der französischen Patentschrift Nr. 1.566.777 beschrieben, ergab eine Endausbeute an gereinigtem Produkt νοηΟρδ χ 10 Hemmstoff einheiten je kg vom Ausgangsorgan, was den 57»7% der mit dem in diesem Beispiel beschriebenen Verfahren erzielten Ausbeute entspricht.
BEISPIEL 4:
2»5 kg trockenes Ochsenlungenpulver wurden nach dem unter Beispiel 1 beschriebenen Schema extrahiert. Die Endausbeute betrug 3»2 χ 10 Hemmstoffeinheiten je kg Pulver. BEISPIEL 5:
2,5 kg Ochsenlungenpulver wurden in 23,5 1 destilliertem Wasser suspendiert. Nach vorsichtigem Erwärmen bis 40 C wurde.unter Rühren eine Suspension von 40 g Pankreatin in 4 1 Triäthanolamin-Puff er lösung 0,2 M, pH8 mit 30 g Kalzium-
509815/1277
- - 11 -
-Chlorid augesetzt. Die lemperatur wurde 24 Std. lang auf 40°C gehalten und dann auf 900C erhöht, worauf die Masse unter Druck gefiltert wurde. Dann wurde das Filtrat wie unter Beispiel 1 beschrieben, behandelt«, Die Endausbeute betrug 4,2 χ 106 Hemmstoffeinheiten je kg vom Lungenpulver an
Rohprodukt und 2,8 χ 10 Hemmstoffeinheiten Je kg Lunge an Reinprodukt.
BEISPIEL 6: ·
10 kg Ochsenlunge wurden in 16 1 zweifach destilliertem Wasser suspendiert. Nach vorsichtigem Erwärmen auf 4O0G wurden 500 g frische Ochsenbauchspeicheldrüse zermahlen und in 4 1 Triäthanolamin-Pufferlösung 0,2 M, pH8 mit 30 g Kalziumchlo- -rid zugesetzt. Dann wurde wie unter Beispiel 5 beschrieben,
verfahren. Die Endausbeute betrug 1,25 x 10 Hemmstoff einer
hexten je kg vom Organ an Rohprodukt bzw. 0,780 χ 10 je kg vom Organ an Reinprodukt.
BEISPIEL ?:
20 1 flüssiger .Lungenextrakt als Rückstand aus der Trennung von Heparin mittels quatemären Ammoniumbasen"werden mit Tri-■ -chloressigsäure bis zu einer Endkonzentration 3$ gesäuert. Nach 60 min. wird unter Druck gefiltert und über Filter mit 5 1 Trichloressigsäure 3$ gespült. Somit wurden 23,2 1 einer klaren Flüssigkeit gewonnen, die 352 Hemmstoffeinheiten je cc enthielt. Die Flüssigkeit wurde dann durch Salzen mit Ammoniumsulfat von 0,4-5 bis 0,9 der Sättigung fraktioniert und das Präzipitat mittels Schleudern gesammelt. Es wurden somit 41 g Iräzipicat mit· Gesamtaktivität 7,9 x 1Ö6 Hemm-
5ÖT8T5/T2 7
stoffeinheiten und einem Inhalt an Proteinstoffen von 31,5$ gewonnen, was einer spezifischen Tätigkeit von ca. 1,63 meg je Hemmstoffeinheit entspricht. V/eitere, an diesem Präzipitat vorgenommene Reinigungen ermöglichten die Gewinnung einer apyrogenen Lösung, die 36 OOO Hemmstoffeinheiten ,je cc enthielt, sowie einer Endausbeute von 5»7 x 10 Hemmstoff-
einheiten, d.h. 70$ der im Ausgangsstoff insgesamt enthaltenen Tätigkait. Als spezifische Tätigkeit ergab sich 0,141 meg je Hemmstoffeinheit.
509815/1277

Claims (12)

PATENTANSPRÜCHE "
1. Verfahren zur Herstellung von Froteasenhemmstoff, durch folgende Vorgänge gekennzeichnet:
a) tierische Organe, die den Hemmstoff enthalten, werden sowohl ganz oder in Form von Pulver oder Extrakt mittels eines proteolytischen Enzyrcs, das unter solchen zu wählen ist, die den Hemmstoff nicht angreifen, in wässriger Lösung so behandelt, daß eine Lysis des tierischen Organs entsteht,
b) die Lysis wird durch Proteinentziehung unterbrochen;
c) der Hemmstoff wird mittels eines kationischen Detergens getrennt, und
d) der Hemmstoff wird auf den gewünschten Reinheitsgrad gebracht, der dem vorgesehenen Verwendungszweck entspricht.
2. Kombiniertes Verfahren für die Herstellung eines proteasen Hemmstoffes und Heparin sowie anderer Mukopolysaccharide durch Extraktion aus tierischen Organen, sei es ganz, sei es als Pulver oder Extrakt, dadurch gekennzeichnet , daß die betreffenden tierischen Organe einer Lysis mit einem oder mehreren proteolytischen Enzymen unterzogen werden, die den Hemmstoff nicht angröifen,' des weiteren, daß die Lysis durch Proteinentziehung unterbrochen
509815/1277
wird und daß der wässrigen Lösung des Lysisproduktes ein kationischer Detergent zugesetzt wird, unter Trennung eines unlösbaren Heparins und Mucopolysaccharide enthaltenden Teiles und mit einem Rückstand, der aus einer wässrigen flüssigkeit besteht, in der der Hemmstoff der Proteasen enthalten ist, wobei Heparin und Wirkstoff nachträglich getrennt gereinigt xirerden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet , daß als tierische Organe Lunge, Ohrspeicheldrüse, Bauchspeicheldrüse und Leber verwendet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 und 3, dadurch gekennzeichnet , daß der proteolytische Angriff mit einem Enzym durchgeführt wird, das durch den Wirkstoff nicht unaktiv gemacht v/ird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß das proteolytische Enzym unter lapain, Picin und Bromelin gewählt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das proteolytische Enzym das iankreatin ist.
7· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterbrechung der Lysis mit einem an sich bekannten proteinentziehenden Agent vorgenommen wird.
509815/1277
8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterbrechung der Lysis durch Wärmeeinwirkung erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung des Wirkstoffes von der wässrigen Lösung nach der Lysisuiiterbrechung durch Zusatz eines kationischen Detergenten erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 95 dadurch gekennzeichnet, daß der . kationische Detergent eine quaternäre Ammoniumbasis ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die quaternäre Ainmoniumbasis unter Cetylpyridinium und Brom-Cetyltrimethylamon gewählt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Reinigung des Hemmstoffes in der wässrigen Lösung, die als Rückstand der Trennung übrig bleibt, durch Zusetzen des kationischen Detergenten vorgenommen wird, wobei die Reinigung durch Säuerung mittels Tri- -chloressigsäure 2-5#, Salzung mit Ammonsulfat bis zu einer Konzentration gleich 0,45 bis 0,9 von der Sättigung und Alkohol- und/oder Acetonfraktionierung und schließlich Gelfilterung oder Gelchromatographie erfolgt.
13· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Quelle des proteolytischen Enzyms Organe bzw. Gewebe herangezogen weri°n, in denen dieses enthalten ist.
509815/1277
DE2447050A 1973-10-05 1974-10-02 Verfahren zur Gewinnung von Proteasenhemmstoff Expired DE2447050C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH1426573A CH617963A5 (de) 1973-10-05 1973-10-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2447050A1 true DE2447050A1 (de) 1975-04-10
DE2447050C2 DE2447050C2 (de) 1983-07-28

Family

ID=4399389

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2447050A Expired DE2447050C2 (de) 1973-10-05 1974-10-02 Verfahren zur Gewinnung von Proteasenhemmstoff

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4216293A (de)
JP (1) JPS619286B2 (de)
AR (1) AR200699A1 (de)
CA (1) CA1034495A (de)
CH (1) CH617963A5 (de)
DD (1) DD118654A1 (de)
DE (1) DE2447050C2 (de)
DK (1) DK139913B (de)
ES (1) ES430685A1 (de)
FR (1) FR2246567B1 (de)
NL (1) NL7413127A (de)
SU (1) SU611595A3 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4035234A (en) * 1975-03-05 1977-07-12 Bayer Aktiengesellschaft Process for the preparation of the kallikrein-trypsin inhibitor

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5334911A (en) * 1976-09-01 1978-03-31 Mochida Pharm Co Ltd Production of proteolytic enzyme inhibitor
IT1190313B (it) * 1986-04-17 1988-02-16 Crinos Industria Farmaco Procedimento per l'ottenimento di polidesossiribonucleotidi chimicamente definiti e riproducibili e prodotto farmacologicamente attivo risultante
DE69833205T2 (de) * 1997-07-16 2006-07-20 Akzo Nobel N.V. Verfahren zur herstellung von heparin
US20060263415A1 (en) 2005-05-05 2006-11-23 Sensient Flavors Inc. Production of beta-glucans and mannans

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3451996A (en) * 1968-02-12 1969-06-24 Thompson Farms Co Method for the preparation of heparin

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU377159A1 (ru) 1970-12-31 1973-04-17 Способ получения ингибитора протеаз

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3451996A (en) * 1968-02-12 1969-06-24 Thompson Farms Co Method for the preparation of heparin

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chemical Abstracts 79, 1973, 51999w *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4035234A (en) * 1975-03-05 1977-07-12 Bayer Aktiengesellschaft Process for the preparation of the kallikrein-trypsin inhibitor

Also Published As

Publication number Publication date
DK139913B (da) 1979-05-14
DE2447050C2 (de) 1983-07-28
NL7413127A (nl) 1975-04-08
CA1034495A (en) 1978-07-11
DK522174A (de) 1975-06-09
JPS5063186A (de) 1975-05-29
CH617963A5 (de) 1980-06-30
US4216293A (en) 1980-08-05
ES430685A1 (es) 1976-11-01
AR200699A1 (es) 1974-11-29
DD118654A1 (de) 1976-03-12
DK139913C (de) 1979-10-15
JPS619286B2 (de) 1986-03-22
FR2246567B1 (de) 1978-03-24
SU611595A3 (ru) 1978-06-15
FR2246567A1 (de) 1975-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69011136T2 (de) Verfahren zur Herstellung einer Protein enthaltenden Zusammensetzung.
DE2854381A1 (de) Verfahren zur gewinnung des antihaemophilen faktors viii aus blut, blutplasma oder blutplasma-fraktionen
EP0115023A2 (de) Verfahren zur Gewinnung von Pankreatin
DE2927841A1 (de) Verfahren zur herstellung einer biologischen zusammensetzung zur verwendung als blutserum-bezugszusammensetzung fuer diagnostische analysezwecke
DE69834742T2 (de) Verfahren für extraktion und verwendung der schlüpf-flüssigkeit des atlantiklachses
DE3230151A1 (de) Neues polypeptid mit wirkung auf das immunsystem, verfahren zu seiner isolierung und reinigung, seine verwendung, dieses enthaltende mittel sowie seine spaltprodukte, deren verwendung und diese enthaltende mittel
DE2447050A1 (de) Verfahren zur gewinnung von proteasenhemmstoff
DE1102973B (de) Verfahren zur Herstellung von hoch gereinigten Kallikrein-Praeparaten
DE69315059T2 (de) Enzymatische Zubereitungen die Papain oder Chymotrypsin enthalten zur dauerhafte enzymatische Entfernung von Haaren
DE69727736T2 (de) Verfahren zur Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin
DE3034045C2 (de)
DE3101001A1 (de) Verfahren zur konzentration und reinigung des antihaemophilie-faktors oder faktor viii
DE2715748A1 (de) Zubereitungen auf der grundlage von verbindungen vom plasminogen-typ, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel
DE2555587C3 (de) Verfahren zur Extraktion und Sammlung von Kallidinogenase
DE69230887T2 (de) Escharase enthaltene proteolytische mischung und methode seiner isolierung
CH404858A (de) Verfahren zur Herstellung von wachstumfördernde Stoffe enthaltenden Präparaten
DE2654093A1 (de) Verfahren zur herstellung von gelatine
DE2635894A1 (de) Verfahren zur herstellung eines antihaemophiles globulin a enthaltenden konzentrats
DE1617566B1 (de) Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven Polypeptids
DE1767099B1 (de) Verfahren zur Gewinnung eines Glykoproteins mit einer Hemmwirkung gegenueber Magensaeureabsonderung und einer Antiaktivitaet gegenueber Ulcus-Bildung
DE69009667T2 (de) Verfahren zur Herstellung von Protease-Inhibitoren.
DE1617566C (de) Verfahren zur Herstellung eines physio logisch aktiven Polypeptide
DE881987C (de) Verfahren zur Gewinnung von biologisch wirksamen Produkten
DD220334A5 (de) Verfahren zur isolierung des carboxypeptidase b enzyms aus dem pankreas von saeugetieren
DE708075C (de) Verfahren zur Herstellung eines wirksamen Extraktes aus den Raupen der Wachsmotten

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
8126 Change of the secondary classification

Ipc: A61K 35/12

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee