DE2447050A1 - Verfahren zur gewinnung von proteasenhemmstoff - Google Patents
Verfahren zur gewinnung von proteasenhemmstoffInfo
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Description
PATENTANWALT*·
DIpL-lng. P. WlRTH · Dr. V. SCHMIED-KOWARZIK
Dlpl.-lng. G. DANNENBERG · Dr. P. WEINHOLD · Dr. D. GUDEL
281131 β FRANKFURT AM MAIN
Caseι bd/36 889
wd/uxn
wd/uxn
LABORATORI DERIVATI ORGANICI S.p.A.
Mailand
Italien
"Verfahren zur Gewinnung von Proteasenhemmstoff"
Die Erfindung betrifft die Gewinnung von Hemmstoff der Proteasen, insbesondere des Kallikreins und Trypsins, deren
therapeutische Anwendung sich zunehmend verbreitet und in bestimmten Fällen unersetzlich ist.
Bekanntlich wurde der Proteasenhemmstoff in mehreren tierischen Organen bzw. Geweben festgestellt, wie Bauchspeicheldrüse,
Leber, Lunge, Lymphknoten, Ohrspeicheldrüsen, Milz,
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2A47050
Blut, Samendrüse u.a.m. (Kraut, H. und KoIl. Z. physiol.
ehem. 192,1 - M. Kunita und J.H. Northrop, J. Gen. physiol.
19,991 - Werle, Ξ. und KoIl.., Z. Naturforsch. 14b, 385 -
Astruiip, T. Acta physiol. scan«, 26.243); es wurden auch
zahlreiche Techniken ausgedacht, um ihn aus diesen Geweben herauszuziehen; diese beruhen moistens auf der selektiv herausziehenden
Wirkung wässriger, saurer oder alkalischer Gemische, salziger und/oder hydroalkobolischer Fraktionierungen
und auf chromatographischen Verfahren (vgl. deutsche latente Nr. 1.084.4-33, 1.148.352, Ί.011.576, 956.90?, 950.959, 954.284,
britisches Patent Nr. 965.352, französisches Patent Nr. 1.566.777, japanische Patente Nr. 43-7328 und Nr. 44-8563).
Alle erwähnten Verfahren weisen - neben einer großen Kompliziertheit
und der hohen Anzahl der erforderlichen Verwandlungen - den vom Standpunkt der Industrie aus stark ins Gewicht
fallenden Nachteil auf, daß die Ausbeute bei unverhältnismäßig hohem Aufwand ziemlich klein ist.
Bekanntlich enthalten einige der vorgenannten, tierischen Organe auch größere Mengen Heparin, welcher Stoff ebenfalls
in starkem Ausmaß hergestellt und in Krankenhäusern verwendet wird. Heparin wurde eben aus diesen Organen unter Zuhilfenahme
der lösbarmachenden Wirkung einiger proteolytischer Enzyme und nachträglicher Fällung des Heparins gewonnen. Das
Verfahren wurde jedoch in den meisten Fällen durch andere Herstellungsmethoden nach und nach verdrängt, die auf anderen
Quellen beruhten und industriemäßig lchnander waren. Erwähnenswert
ist auch die 1'atsache, daß die Abfallrückstände aus der
Hoparinherstellung als Flüssigkeit, die aus der Fällung übr:.^.
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bleibt, in die Abwasserleitung entleert wurden, was zugleich einen nicht zu übersehenden Faktor der Umweltverunreinigung
bildete.
Hauptsweck der Erfindung ist die Schaffung eines neuen Verfahrens
zur Herstellung eines Proteasenhemrastoffes evtl. mit
gleichzeitiger Heparinherst ellung', welches vom Gesichtspunkt der Industrieherstellung aus gesehen in bezug auf Ausbeute
und Kalkulation gegenüber den herkömmlichen Methoden günstig liegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist durch folgende Reihe Vorgänge
gekennzeichnet:
a) Tierische Organe, die den Hemmstoff enthalten,.werden sowohl
ganz oder in Form von Pulver oder Extrakt mittels eines proteolytischen Enzyms, das unter solchen zu wählen ist, die
den Hemmstoff nicht angreifen, in wässriger Lösung so behände
lift, daß eine Lysis entsteht, wobei die wässrige Lösung auf die Eigenschaften und Eigenart des jeweiligen proteolytischen
Enzyms abgestimmt ist;
b) die Lysis wird durch Proteinentziehung unterbrochen;
c) der Hemmstoff wird mittels eines kationischen Detergens getrennt, und
d) der Hemmstoff wird auf den gewünschten Reinheitsgrad gebracht,
der dem vorgesehenen Verwendungszweck entspricht.
In der Tat beruht das eben erwähnte Verfahren auf verschiedenen
Prinzipien, von denen einige zwar an sich bekannt sind,
aber noch nie zur Gewinnung dieses Hemmstoffes angewandt wurden*
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Zuerst muß hervorgehoben werden, daß der Proteasenhemmstoff von zahlreichen proteolytischen Enzymen nicht angegriffen
wird, wie etwa Pepsin, Trypsin, Chimotrypsin, Kallikrein, Plasmin, Elastase, Kollagenase, Carboxy-Peptidasen A und B,
Ficin, Papain und Brpmelin (B.Eassell und KoIl. J. Biol.Chem.
219,203 - H. Kraut und KoIl. Z. physiol. ehem. 334,236 und
348,1498). Außerdem wurde von den angeführten Verfassern sowie von der Änmelderin festgestellt, daß insbesondere Pepsin,
Papain und Ficin durch den Proteasenhemmstoff nicht inhibiert werden. Es ist nun bekannt, daß einige dieser proteolytischen
Enzyme in den Vorgängen zur Gewinnung des Heparins aus Geweben und Organen, wo es enthalten ist, Verwendung
finden.
An zweiter Stelle wird beobachtet, daß die Löslichkeit des Hemmstoffes in den verschiedenen, proteinentziehenden Gemischen
zwar gegeben ist, aber in veränderlichem Haß durch dieselben Proteine beeinflußt wird, die in den normalen Rohextrakten
vorhanden sind und bei der Reinigung entfernt werden müssen, um mögliche anaphylaktogene Folgen auf ein Mindestmaß
herabzusetzen. Bei der Extraktion des Peptids aus den dieses enthaltenden Organen bestand daher das Problem,
die Beeinflussung der Löslichkeit des in Rede stehenden Hemmstoffes
durch Proteine zu beseitigen und gleichzeitig die Gefahr von Anaphylaxis einzuschränken.
Schließlich konnte die Anmelderin feststellen, daß die Anwendung kationischer Detergentien, wie die quaternären Ammoniumbasen,
unter bestimmten Bedingungen die Befreiung des Hemmstoffes von polyanionischen Verunreinigungen wie Kukopoly-
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saccharide, Nukleinsäuren und zahlreichen Stoffen pyrogenetischer
Art erlaubt; demnach kann sich die Anwendung derartiger Deta?3entien als nützlich erweisen, nicht nur zur Reinigung
sondern auch zur Einschränkung der Fyrogenizität des
Produktes. Es ist nämlich bekannt, daß auch bei der Fabrikation des Heparins kationische Detergentien verwendet werden
um den Stoff aus den betreffenden Brühen zu gewinnen.
Aus obigen Überlegungen geht deutlich hervor, daß eine gewisse Parallelität zwischen Heparinherstellung nach der bisherigen
Technik und der Herstellung des Proteasenhemmstoffes nach dem von der Anmelderin erfundenen und vorgeschlagenen
Verfahren besteht.
Ein weiterer Zweck der Erfindung ist schließlich die Vereinigung der Gewinnung des Heparins sowie des Proteasenhemmstoffes.
irr einem Verfahren, welches Verfahren in beziig auf die bereits bekannten Vorgänge zur Herstellung des Heparins durch
die Anwendung proteolytischer Enzyme gekennzeichnet ist, die den Proteasenhemmstof nicht angreifen und in Bezug auf die
Herstellung des Hemmstoffes an sich dadurch gekennzeichnet ist, daß die bisherige Ausschußfraktion aus der Ausfällung
von Heparin, Mukopolysacchariden und/oder pyretogenen Stoffen, dazu verarbeitet wird, um den Hemmstoff zu konzentrieren und
zu reinigen.
Wie die Anmelderin außerdem feststellen konnte und nächste- ■
hende Beispiele bestätigen es, ist das erfindungsgemäße Verfahren
nicht nur desv/egen vorteilhaft," weil es ermöglicht,
bisher unausgenutzt ausscheidende Ausschußrückstände unter
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bestimmten Bedingungen zu verwerten, und ein fast aufgegebenes
Verfahren zur Herstellung des Heparins und der Mukopolysaccharide
vom Standpunkt der Industrie aus wieder brauchbar zu machen, sondern auch weil die Ausbeute an Hemmstoff
wesentlich höher ist als bei den bekannten Verfahren, und schließlich weil sich dadurch zugleich Verbesserungen
an der Reinigung und an der Ausscheidung .verunreinigender Stoffe erzielen lassen.
Es wird hier noch darauf hingewiesen, daß ein reichlicheres
Verzeichnis der für die Anwendung im erfindungsgemaßen Vorfahren
infrage kommenden proteolytischen Enzyme aus 3. Kassell,
"Methods Enzymology" Vol. 19» S. 848-850 entnommen werden
kann ·
Bei einer näheren Erörterung des erfindungsgemaßen Verfahrens ist tiun folgendes zu bemerken:
1. Vorzugsweise soll das in der Extraktions- und Lösbarmachungsstufe
verwendete proteolytische Enzym ein solches sein, das durch den betreffenden Hemmstoff nicht unaktiv gemacht wird;
insbesondere wird dieses Enzym in der Gruppe ausgewählt, die Papain, IFicin und Bromelin enthält, und zwar sowohl in isolierter
Form als auch in Stoffen oder Gev/eben, die es enthalten.
2. .Bei der Unterbrechung der Lysis greift man auf die normalen
proteinentziehenden Agenzien und/oder auf V/ärmezufuhr zurück,
so daß die Temperatur der wässrigen Lösung in der dem Fachmann wohlbekannten Art und Weise erhöht wird.
J. V/as die quaternären Ammoniumbasen anbelangt, so hat sich
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die Verwendung von Cetylpyridinium und Brom-Oetyl-Triinethyl-
-ammonium als besonders vorteilhaft erwiesen.
4-. Eür die Isolierung und Reinigung des Hemmstoffes nach der
Trennung des Heparins und der MukopοIysaccharide wird vorzugsweise
eine Säuerung mit Trichloressigsäure 2-5$ vorgenommen, worauf eine Fraktionierung mittel»0- Zusatz von Ammoniumsulfat
bis zu einer Konzentration, die zwischen 0,45 und 0,9 von der Sättigungskonsentration liegt, erfolgt.
Die weitere Reinigung des Hemmstoffes kann durch Alkohol- und/oder Acetonfraktionierung und Gelfilterung oder Gelchromatographie
erfolgen.
Kachstehend angeführte Beispiele wollen das erfindungsgemäße Verfahren näher erklären, stellen aber auf keinen FaIL eine
unzulässige Einschränkung desselben dar.
ΊΟ kg gemahlene Ochsenlunge werden in 16 1 destilliertem
Wasser suspendiert. Nach vorsichtiger Erwärmung der Suspension bis 40 C wurde derselben eine Suspension von 20 g Papain
in U Ziträtpufferlösung O,25 M mit-pH 5,5 zugesetzt, wobei letztere
200 g Magnesiumsulfat enthielt. Die Temperatur wurde auf 55°O eingestellt und die Masse 4 Std. lang bei diesen Bedingungen
gelassen. Darauf wurde der pH-Wert auf 6,2 durch Z-usatz konzentrierten Ammoniaks abgestimmt und die Hasse auf
900C gebracht. Das Ganze wurde dann unter Druck filtriert
und der Rückstand ausgeschieden. Die klare Flüssigkext wurde bis zur restlosen Fiockrnig der Polyanionen mit Oetypyridinium
behandelt. Dann wurde die Filterung vorgenommen um das Heparin -
509815/127 7
enthaltende Präzipitat zu sammeln, während der Flüssigkeit Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 3$
zugesetzt wurde. Nach 30 min. wird wieder unter Druck filtriert mit Spülung über dem Filter mit 4 1' Trichloressigsäure
3$. Somit erhielt man 32 1 einer klaren Flüssigkeit
mit 610 wirksamen Hemmstoffeinheiten je cc (für Hemmstoffeinheit
vgl. Z. Physiol Chem. 182,1 - 1930), was einer Ausbeute von 1,95 x 10 Wirkstoffeinheiten je kg des Ausgangsorgans
entspricht. Diese Lösung wurde dann einer Fraktionierung mit Ammoniumsulfat von 0,5 bis 0,9 der Sättigung unter
zogen und das Präzipitat wurde durch Zentrifugation aufge-
7 nommen. Dabei wurden 85 g Präzipitat erhalten mit 1,9 x 10
Hemmstoffeinheiten (ca.98% der gesamten durch Lysis erhaltenen
Aktivität),während der Inhalt an Proteinmaterial 36,5%
erreichte,was einem Reinheitsgrad von 1,56 meg je Hemmstoffeinheit
gleichkommt.Die weiteren,für dieses Präzipitat nach den bekannten Methoden der einschlägigen Technik durchgeführten
Reinigungen ermöglichten ein Ergebnis von 465 cc einer apyrogenen
Lösung mit einer Aktivität von 32000 Hemmstoffeinheiten
je cc zu erreichen, d.h. insgesamt 1,49 x 10' Hemmstoffeinheiten,
was einer Ausbeute von 76$ gegenüber der Anfangsaktivität
gleichkommt. Der bei der Analyse des Proteinmaterials festgestellte Reinheitsgrad betrug 0,143 meg je Hemmstoffeinheit.
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III ,
-9-
Sin.Vergleichsversuch mit einer entsprechenden Menge desselben
gemahlenen Organs mit Extraktion mit Äthylalkohol 70$
in Gegenwart vonKalziumchlorid (vgl. deutsche Patentschrift Nr. 1.084-,4-33) ergab eine Ausbeute von 0,875 x 10 Hemmstoffeinheiten
je kg des Organs im Rohzustand und 0,322 χ 10 Hemmstoffeinheiten je kg des Organs in gereinigtem Zustand
mit Reinheitsgrad 0,14 meg je Hemmstoff einheit'. Diese Daten
mit den Ergebnissen der Papainlysis verglichen entsprechen einer Ausbeute von 21,7$ des gereinigten Produktes bzw. 46#
des Rohproduktes. Ein weiterer Versuch, der mit einer entsprechenden
Menge desselben gemahlenen Organs unter Anwendung des Verfahrens nach B. Kassell "Methods Enzymology" Vol. 19,
S. 845* vorgenommen wurde, ergab eine Ausbeute an Rohprodukt
von 1,02o χ 10 Hemmstoffeinheiten je kg des Organs, bzw·
0,418 χ 10 Hemmstoffeinheiten je kg des Organs an gereinigtem
Produkt. Beim Vergleich mit den Ergebnissen der Papainlysis entsprechen diese Daten einer Ausbeute von 53 »6# an
Rohprodukt bzw. 28$ an gereinigtem Produkt.
Es wurde wie bei Beispiel 1 verfahren, wobei Ficin anstatt
Papain verwendet wurde. Die Ausbeute betrug 2,03 x 10 Hemmstof
feinheiten je kg Lunge an Rohprodukt bzw. 1,64 χ 10 je kg Lunge an gereinigtem Produkt.
5 kg Ochsenlunge wurden in 5 1 Wasser suspendiert und 2 1
einer Suspension mit 10 g Bromelin in einer Phosphatpufferlösung
0,1 M mit pES zugesetzt, die 1# Äthylendiamin-Tetra-
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- ίο -
-essigsäure enthielt. Die Masse wurde bis 37°C vorsichtig erwärmt
und 4 Std. lang auf dieser Temperatur gehalten. Nach dieser Zeit wurde die Temperatur 10 min. lang bis auf 90° ■
erhöht. Anschließend wurde unter Druck filtriert und über dem Filter miU 2 1 destilliertem Wasser gespült. Nach der
Abkühlung wurde das Filtrat mit Getyltrinothylammonbromid
bis zur restlosen blockung der Polyanionen behandelt, die zur Trennung des Heparins auf Filter gesammelt wurden. Die
klar gefilterte Flüssigkeit ergab 16 1 mit einer Aktivität · von 540 Hemmstoffeinheiten je cc, was einer Ausbeute von
1,735 x 10 Hemmstoffeinheiten je kg vom Ausgangsorgan
entspricht. Daraufhin wurde die Reinigung wie unter Beispiel 1 vorgenommen. Die Endausbeute an gereinigtem Produkt
betrug 1,18 χ 10 Hemmstoffeinheiten je kg der Lunge. Ein
Vergleichsversuch unter Extraktion und Fraktionierung mit Ammonsulfat, wie in der französischen Patentschrift Nr.
1.566.777 beschrieben, ergab eine Endausbeute an gereinigtem Produkt νοηΟρδ χ 10 Hemmstoff einheiten je kg vom Ausgangsorgan,
was den 57»7% der mit dem in diesem Beispiel beschriebenen
Verfahren erzielten Ausbeute entspricht.
2»5 kg trockenes Ochsenlungenpulver wurden nach dem unter
Beispiel 1 beschriebenen Schema extrahiert. Die Endausbeute betrug 3»2 χ 10 Hemmstoffeinheiten je kg Pulver.
BEISPIEL 5:
2,5 kg Ochsenlungenpulver wurden in 23,5 1 destilliertem
Wasser suspendiert. Nach vorsichtigem Erwärmen bis 40 C
wurde.unter Rühren eine Suspension von 40 g Pankreatin in
4 1 Triäthanolamin-Puff er lösung 0,2 M, pH8 mit 30 g Kalzium-
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- - 11 -
-Chlorid augesetzt. Die lemperatur wurde 24 Std. lang auf
40°C gehalten und dann auf 900C erhöht, worauf die Masse
unter Druck gefiltert wurde. Dann wurde das Filtrat wie unter Beispiel 1 beschrieben, behandelt«, Die Endausbeute betrug
4,2 χ 106 Hemmstoffeinheiten je kg vom Lungenpulver an
Rohprodukt und 2,8 χ 10 Hemmstoffeinheiten Je kg Lunge an
Reinprodukt.
BEISPIEL 6: ·
10 kg Ochsenlunge wurden in 16 1 zweifach destilliertem Wasser suspendiert. Nach vorsichtigem Erwärmen auf 4O0G wurden
500 g frische Ochsenbauchspeicheldrüse zermahlen und in 4 1
Triäthanolamin-Pufferlösung 0,2 M, pH8 mit 30 g Kalziumchlo-
-rid zugesetzt. Dann wurde wie unter Beispiel 5 beschrieben,
verfahren. Die Endausbeute betrug 1,25 x 10 Hemmstoff einer
hexten je kg vom Organ an Rohprodukt bzw. 0,780 χ 10 je kg
vom Organ an Reinprodukt.
20 1 flüssiger .Lungenextrakt als Rückstand aus der Trennung
von Heparin mittels quatemären Ammoniumbasen"werden mit Tri-■
-chloressigsäure bis zu einer Endkonzentration 3$ gesäuert.
Nach 60 min. wird unter Druck gefiltert und über Filter mit
5 1 Trichloressigsäure 3$ gespült. Somit wurden 23,2 1 einer
klaren Flüssigkeit gewonnen, die 352 Hemmstoffeinheiten je
cc enthielt. Die Flüssigkeit wurde dann durch Salzen mit Ammoniumsulfat von 0,4-5 bis 0,9 der Sättigung fraktioniert
und das Präzipitat mittels Schleudern gesammelt. Es wurden somit 41 g Iräzipicat mit· Gesamtaktivität 7,9 x 1Ö6 Hemm-
5ÖT8T5/T2 7
stoffeinheiten und einem Inhalt an Proteinstoffen von 31,5$
gewonnen, was einer spezifischen Tätigkeit von ca. 1,63 meg
je Hemmstoffeinheit entspricht. V/eitere, an diesem Präzipitat
vorgenommene Reinigungen ermöglichten die Gewinnung einer apyrogenen Lösung, die 36 OOO Hemmstoffeinheiten ,je cc
enthielt, sowie einer Endausbeute von 5»7 x 10 Hemmstoff-
einheiten, d.h. 70$ der im Ausgangsstoff insgesamt enthaltenen
Tätigkait. Als spezifische Tätigkeit ergab sich 0,141 meg
je Hemmstoffeinheit.
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Claims (12)
1. Verfahren zur Herstellung von Froteasenhemmstoff, durch
folgende Vorgänge gekennzeichnet:
a) tierische Organe, die den Hemmstoff enthalten, werden sowohl
ganz oder in Form von Pulver oder Extrakt mittels eines proteolytischen Enzyrcs, das unter solchen zu wählen ist, die
den Hemmstoff nicht angreifen, in wässriger Lösung so behandelt, daß eine Lysis des tierischen Organs entsteht,
b) die Lysis wird durch Proteinentziehung unterbrochen;
c) der Hemmstoff wird mittels eines kationischen Detergens getrennt, und
d) der Hemmstoff wird auf den gewünschten Reinheitsgrad gebracht,
der dem vorgesehenen Verwendungszweck entspricht.
2. Kombiniertes Verfahren für die Herstellung eines proteasen
Hemmstoffes und Heparin sowie anderer Mukopolysaccharide
durch Extraktion aus tierischen Organen, sei es ganz, sei es als Pulver oder Extrakt, dadurch gekennzeichnet
, daß die betreffenden tierischen Organe einer Lysis mit einem oder mehreren proteolytischen Enzymen
unterzogen werden, die den Hemmstoff nicht angröifen,' des
weiteren, daß die Lysis durch Proteinentziehung unterbrochen
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wird und daß der wässrigen Lösung des Lysisproduktes ein
kationischer Detergent zugesetzt wird, unter Trennung eines unlösbaren Heparins und Mucopolysaccharide enthaltenden Teiles
und mit einem Rückstand, der aus einer wässrigen flüssigkeit
besteht, in der der Hemmstoff der Proteasen enthalten ist, wobei Heparin und Wirkstoff nachträglich getrennt gereinigt
xirerden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet , daß als tierische Organe Lunge, Ohrspeicheldrüse,
Bauchspeicheldrüse und Leber verwendet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 und 3, dadurch gekennzeichnet , daß der proteolytische Angriff
mit einem Enzym durchgeführt wird, das durch den Wirkstoff nicht unaktiv gemacht v/ird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet
, daß das proteolytische Enzym unter lapain, Picin und Bromelin gewählt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das proteolytische Enzym das iankreatin ist.
7· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Unterbrechung der Lysis mit einem an sich bekannten proteinentziehenden Agent vorgenommen wird.
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8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterbrechung der Lysis durch Wärmeeinwirkung erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung des Wirkstoffes von der wässrigen Lösung
nach der Lysisuiiterbrechung durch Zusatz eines kationischen
Detergenten erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 95 dadurch gekennzeichnet, daß der .
kationische Detergent eine quaternäre Ammoniumbasis ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die
quaternäre Ainmoniumbasis unter Cetylpyridinium und Brom-Cetyltrimethylamon
gewählt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet
, daß die Reinigung des Hemmstoffes in der wässrigen Lösung, die als Rückstand der Trennung übrig
bleibt, durch Zusetzen des kationischen Detergenten vorgenommen wird, wobei die Reinigung durch Säuerung mittels Tri-
-chloressigsäure 2-5#, Salzung mit Ammonsulfat bis zu einer
Konzentration gleich 0,45 bis 0,9 von der Sättigung und Alkohol-
und/oder Acetonfraktionierung und schließlich Gelfilterung oder Gelchromatographie erfolgt.
13· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
als Quelle des proteolytischen Enzyms Organe bzw. Gewebe herangezogen
weri°n, in denen dieses enthalten ist.
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