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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Heparin. Insbesondere
betrifft sie ein vereinfachtes Verfahren zur Entfernung von Proteinen,
die in einem Tiergewebe vorhanden sind, welches Quelle von Heparin
ist.
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Heparin
ist ein sehr kompliziertes Glycosaminoglycan, welches aus alternierenden
Abfolgen von verschiedenen sulfatierten Residuen von Uronsäure und α-D-Glucosamin
besteht, welche durch α und β (1-4) Bindungen
verbunden sind. Aufgrund der Komplexität seiner primären Struktur
ist Heparin ein polydisperses Heteropolysaccharid, welches in den Begriffen
von Molekulargewicht, physico-chemischen Eigenschaften und biologischen
Aktivitäten sehr
heterogen. ist.
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Heparin
ist für
eine lange Zeit als ein Antikoagulanz und antithrombotisches Mittel
in der Behandlung und der Vermeidung von Venenthrombosen eingesetzt
worden. Es liegt in einer Vielzahl von Tiergeweben vor und kann
durch Isolation aus diesen erhalten werden. Derzeit wird ein grosser
Teil des Heparins, welches für
diese Zwecke eingesetzt wird, aus Schweinedarmschleimhäuten isoliert.
Das Isolationsverfahren umfasst Hydrolyse der Mukosa, gefolgt: von
der Extraktion des Heparins.
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Das
US Patent 4,216,293 beschreibt einen enzymolytischen Prozess für die Extraktion
der Protease-Inhibitoren aus dem Tiergewebe. Dieses Verfahren umfasst
zuerst das Aufheizen der wässrigen Mischung
des Gewebes oder der Gewerbe und mindestens eines proteolytischen
Enzyms bis ungefähr 40°C, optional
dann bis 60°C
und anschliessend bis 90°C.
Obwohl das Verfahren auf die Herstellung von Protease-Inhibitoren
ausgerichtet ist, gestattet solch ein Verfahren auch die Extraktion
von Heparin aus einer Zwischenfraktion.
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Das
US Patent 5,607,840, welches hier als Referenz eingeschlosen wird,
beschreibt ein Verfahren der Hydrolyse von Mukosa-Gewebe. Das Verfahren
umfasst die Hydrolyse einer wässrigen
Mischung, enthaltend die Säugetier-Mukosa,
mit einem proteolytischen Enzym bei einer Temperatur von ungefähr 55°C, die Adsorption
von Polyanionen an ein Anionenaustauschharz und nachfolgende Wiedergewinnung
der Anionen aus dem Harz und des Protein-Hydrolysats aus der aufgeschlossenen
wässrigen Lösung. Um
das rohe Mukosa-Material zu stabilisieren und bakterielles Wachstum
zu vermeiden, werden Salze in Gestalt eines Sauerstoffradikalfänger oder
Bakteriozids in die Lösung
eingeführt.
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Der
Heparingehalt in dem wässrigen
Medium, welches die Mukosa enthält,
ist sehr gering und daher sind grosse Mengen an Mukosa-Gewebe zu verarbeiten.
Daher wird aus wirtschaftlichen Gründen das Hydrolyse-Verfahren
in Reaktionsbehältern
von mehr als 50 m3 ausgeführt. Während der
Reaktionszeit wird die Temperatur bei einem konstanten Niveau für mehr als
24 Stunden aufrecht erhalten und die Mischung wird kräftig durchgerührt unter
Einsatz von fortgeschrittener Ausrüstung.
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Üblicherweise
sind Heparin-Extraktions-Fabriken nicht in einem kurzen Abstand
von Schlachthäusern
angeordnet, wo die Mukosa gesammelt wird und somit ist ein Transport über lange
Entfernung erforderlich. Insbesondere in weitentfernten Gebieten führt dies
zur Ablieferung von qualitativ minderwertigem Material am Produktionsort
und zu einer Erhöhung
der Kosten.
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Die
vorliegende Erfindung liefert ein neues und einfaches Verfahren
zur Isolation von Heparin aus dem Mukosa-Gewebe. Es ist aufgefunden
worden, dass Protein in einer wässrigen
Mischung, welche Säugetier-Mukosa-Gewebe
enthält,
auch mit einem proteolytischen Enzym bei einer Temperatur zwischen
50-75°C
für ungefähr 6 Stunden
aufgeschlossen werden kann. Ein einfacher "Prä-Hydrolyse"-Schritt bei Umgebungstemperatur
ist umfasst. Es hat sich gezeigt, dass die Effizienz der Proteolyse
signifikant ansteigt. Nach der Erhöhung der Temperatur kann die
Hydrolyse vorzugsweise in Gegenwart eines Polyanion adsorbierenden
Materials bei einer Temperatur von unter 50°C fortgeführt werden. Das Aufschliessen
kann in Behältern
mit mittlerer Kapazität
durchgeführt
werden.
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Daher
umfasst das Verfahren gemäss
der Erfindung den Schritt des Anhebens der Temperatur der Mukosa
bis ungefähr
50-75°C
und des Inkubierens der Mukosa bei diesem Temperaturbereich für ungefähr 6 Stunden
in der Gegenwart eines proteolytischen Enzyms.
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Das
Verfahren hat den Vorteil, dass es in relativ kleinen Skalierungen
durchgeführt
werden kann. Das Verfahren ist sehr gut geeignet, an Orten durchgeführt zu werden,
wo das Roh-Mukosa-Material
erzeugt wird und somit wird kein Transport von Rohmaterial benötigt. Weiterhin
werden keine speziellen Fähigkeiten
erforderlich sein.
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Gemäss der vorliegenden
Erfindung sind auch die folgenden Inkubationsschritte in dem Verfahren
eingeschlossen:
- – Inkubieren der Mischung in
einem Behälter
für bis
ungefähr
8 Stunden bei Umgebungstemperatur vor dem Temperaturanstieg,
- – weiteres
Inkubieren nach dem Anstieg der Temperatur, während es der Lösung gestattet
wird, auf Umgebungstemperatur abzukühlen.
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Die
Inkubationszeit bei ungefähr
50-75°C
beträgt
vorzugsweise weniger als 4 Stunden. Vorzugsweise beträgt die Inkubationszeit
mehr als 1 Stunde. Die Temperatur wird vorzugsweise zu ungefähr 60-70°C angehoben.
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Die
Temperatur kann in einfacher Weise durch direktes Heizen des Behälters angehoben
werden, welcher die wässrige
Mukosa-Lösung
enthält. Beispielsweise
kann eine Temperatur von ungefähr 60-70°C schnell
mit einem gewöhnlichen
Gasflammenbrenner erreicht werden, aber auch beispielsweise durch
Zusatz von Dampf. Die so erhaltene Temperatur kann durch moderates
Heizen für
mehrere Stunden aufrecht erhalten werden. Alternativ können kleine
Zuführungen
von Hitze gestoppt werden, sobald die gewünschte Temperatur erreicht
wird, was es der Mischung in dem Behälter gestattet, graduell abzukühlen. Aufgrund
des graduellen Temperaturabstiegs, wird die Mischung ihre Temperatur
oberhalb von 50°C
für mehrere
Stunden aufrecht erhalten. Damit wird die ursprüngliche Protein-Hydrolyse bei
einer Temperatur von über
50°C stattfinden.
Nach der Entfernung der externen Wärmequelle, wird die Temperatur
absinken und die Hydrolyse fährt
an einer geringeren Temperatur fort. Es besteht keine Begrenzung in
Bezug auf die Inkubationszeit bei verminderter Temperatur, es werden
jedoch Inkubationszeiten von weniger als 24 Stunden bevorzugt, insbesondere kann
die Inkubation über
Nacht ausgeführt
werden. Die Weiterführung
einer verlängerten
Inkubation bei Umgebungstemperatur ist kein notwendiges Erfordernis,
aber hat einen Einfluss auf die Heparin-Ausbeute. In gleicher Weise
zeigte der "Prä-Inkubations"-Schritt bei Umgebungstemperatur
eine Verbesserung der Heparin-Ausbeuten.
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Das
Reaktionsgefäss
kann beispielsweise ein Stahlbehälter
sein, aber es bestehen keine spezifischen Anforderungen für diesen.
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Alternativ
kann die Temperatur durch Zuführung
von 1-3 Volumen einer wässrigen
Lösung
mit einer Temperatur zwischen 80 und 100°C angehoben werden. Vorzugsweise
wird Wasser benutzt, aber es können
auch verdünnte
Salzlösungen
eingesetzt werden. Vorzugsweise ist die Temperatur des Wassers am
Siedepunkt. Aufgrund der Volumenvergrösserung erhöht sich die Wärmekapazität. Daher
kann die Temperatur bei der gewünschten
Temperatur für eine
genügend
lange Zeit beibehalten werden, wohingegen gleichzeitig der Abkühlprozess
langsam fortschreitet. Ein zusätzlicher
Vorteil des Zufügens von
Wasser ist derjenige, dass die Viskosität der Lösung vermindert wird, was in
einer leichteren Siebbarkeit des Adsorbens-Heparin-Komplexes resultiert, welcher
für die
Extraktion des Heparins wesentlich ist. Da kein direktes Aufheizen
erforderlich ist, können
Behälter
aus verschiedenen Materialien eingesetzt werden, beispielsweise
kann Kunststoff eingesetzt werden.
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Ein
angenehmer Weg, das Verfahren gemäss der Erfindung auszuführen, liegt
darin, die Mukosa an einem Werktag zu sammeln und mit der Hydrolyse
durch Zufügen
des proteolytischen Enzyms während
der Lagerung des Rohmaterials in einem Behälter zu beginnen. Am Ende des
Tages kann die Temperatur auf 50-75°C angehoben werden und dann
optional bei einem konstanten Niveau für eine gewisse Anzahl von wenigen
Stunden beibehalten werden, wobei dann über Nacht weiter inkubiert
wird, während
die Temperatur graduell zur Umgebungstemperatur absinkt.
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Es
ist bevorzugt, dass während
des Hydrolyse-Verfahrens die Mischung umgerührt wird, um eine homogene
Lösung
zu erhalten und um einen guten Kontakt zwischen dem Adsorbens (Adsorptionsmittel)
und der Heparin enthaltenden Lösung
herzustellen.
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Die
Mukosa enthaltene Lösung
kann erhalten werden durch Verteilung von tierischem Gewebe in Wasser.
Gewebe können
beispielsweise vom Rind, Hund, Schwein und Schaf erhalten werden.
Die Gewebe haben endotheliale oder mucosale Bestandteile. Heparin
ist beispielsweise in der Lunge, in den Eingeweiden, in der Haut,
und in der Leber von einer Vielzahl von Tieren präsent. Vorzugsweise
werden Darmschleimhaut von schweinischer Herkunft eingesetzt.
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Eine
grosse Vielzahl von Enzymen können
in dem Verfahren eingesetzt werden, sofern sie eine proteolytische
Aktivität
aufweisen. Geeignete Enzyme sind im Stand der Technik wohl bekannt,
beispielsweise microbielle Proteasen, Trypsin, Chymotrypsin. Ein
geeignetes Enzym zum Einsatz in alkaliner Hydrolyse ist in kommerzieller
Weise unter dem Markennamen Maxatase® erhältlich.
Das Enzym-zu-Substrat-Verhältnis
liegt ungefähr
bei 0.02 bis 0.2%. Das Konservierungsmittel, welches üblicherweise
in der Mukosa-Gewebe-Lösung
vorhanden ist, kann bei der vorliegenden Erfindung auch im Verfahren
selber hinzugefügt
werden. Vorzugsweise wird als Konservierungsmittel Natrium-Metabisulfit eingesetzt,
aber es sind auch andere Konservierungsstoffe wie beispielsweise
Calcium-Propionat oder Phenol den Anforderungen genügend. Die
Menge an Bisulfit, welche hinzuzufügen ist, liegt bei ungefähr 0.5 bis
5 kg/100 Liter Mukosa. Das Konservierungsmittel wird am besten während der
Sammlung der Mukosa-Gewebe hinzugefügt.
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Der
pH-Wert kann auf einen pH-Wert zwischen 7 und 9 mit einem alkalinen
Reagenz eingestellt werden. Üblicherweise
wird Natrium-Hydroxid in einer Menge zwischen ungefähr 0.8 und
1.2 kg/100 Liter von Mukosa hinzugefügt. Die am meisten benutzten
proteolytischen Enzyme üben
ihre optimale Aktivität
bei diesem pH-Wert aus. Eine Einstellung kann sowohl in dem "Prä-Hydrolyse"-Schritt eingeführt werden,
als auch während
des Inkubationsschrittes bei höherer
Temperatur.
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Es
ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Isolierung
von Heparin anzugeben. Das Hydrolyse-Verfahren der vorliegenden Erfindung
ist wesentlich bei der Isolation von Heparin. Heparin kann aus dem
Hydrolysat extrahiert werden, falls ein Adsorbens zu der Mischung
während
einer oder mehrerer der Inkubationsschritte hinzugefügt wird,
um das in der hydrolysierenden Lösung vorhandene
Heparin zu binden.
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Vorzugsweise
wird das Adsorbens zu Beginn der Inkubation an der höheren Temperatur
hinzugefügt.
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Das
Adsorbens ist vorzugsweise ein Anionen-Austauscher-Harz, welches
in ausreichender Menge hinzugefügt
wird, um die in der Mukosa-Lösung
vorhandenen Polyanione zu binden. Solche Anionen-Austauscher-Harze sind kommerziell erhältlich. Üblicherweise
wird eine Menge von 2 Liter je 100 Liter Mukosa hinzugefügt. Auch
kann ein Affinitäts-Adsorbens,
welches speziell für
Heparin geeignet ist, hinzugefügt
werden, um Heparin aus der aufgeschlossenen Lösung zu extrahieren.
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Die
gesamte Salzkonzentration des Hydrolysats sollte innerhalb eines
Bereichs ausgewählt
werden, um die wesentliche quantitative Aufnahme durch das Harz
zu gewährleisten,
was für
die Effizienz des Bindens der Polyanionen an das Ionen-Austauscher-Harz
wesentlich ist, und üblicherweise
zwischen 0.1 und 0.5 Molaren liegt. Zusätzlich zu den in der Mukosa
vorhandenen Salzen werden auch Konservierungsstoffe und Alkali-Metall-Salze oder
Ammonium-Salze während
des Hydrolyse-Verfahrens hinzugefügt.
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Nach
dem Hydrolyse-Verfahren wird das Adsorbens abgesiebt. Das adsorbierte
Heparin wird dann durch eine hohe Salzlösung eluiert und das Heparin
wird weiterverarbeitet. Somit ist es auch ein Ziel der vorliegenden
Erfindung, ein Verfahren zur Isolierung von Heparin anzugeben, welches
die weiteren Schritte des Siebens des Adsorbens mit dem Heparin und
die Elution des Heparins aus dem Adsorbens umfasst.
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Um
eine optimale Wiedergewinnung des Heparins zu gewährleisten,
ist es wünschenswert,
dass die für
die Elution eingesetzte Salzlösung
von einer genügend
hohen ionischen Stärke
ist, um eine im wesentlichen vollständige Freigabe des Heparins
aus dem Adsorbens zu gewährleisten.
Eine Art der Wiedergewinnung des Heparins aus dem Heparin-Anionen-Austauscher-Komplex
ist die Elution mit NaCl mit einer Konzentration von 2-4 Molaren.
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Es
ist klar, dass es das Verfahren gemäss der Erfindung möglich macht,
das nicht adsorbierte Material, das heisst die Mukosa, an dem Ort
zu verarbeiten, an dem sie hergestellt worden ist, da das Verfahren
einfach durchzuführen
ist und nur eine minimale Ausrüstung
erforderlich ist, um die Hydrolyse durchzuführen. Daher kann das Verfahren
gemäss der
vorliegenden Erfindung ausgeführt
werden, selbst wenn es sich um einen technologisch einfaches Umgebungsprofil
mit einfacher Infrastruktur handelt.
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Die
folgenden Beispiele erläutern
die Erfindung und sollten in keiner Weise als den Rahmen der Erfindung
beschränkend
verstanden werden.
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Beispiel 1
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Zu
250 kg von Schweine-Mukosa, die mit 0.5% Natriummetabisulfit stabilisiert
worden ist, sind 200 Gramm Maxatase® hinzugefügt worden
und die Mischung ist bei Umgebungstemperatur gerührt worden. Nach 4 Stunden
ist die Mukosa auf 69°C
mit einem Gasflammenbrenner in ungefähr 70 Minuten aufgeheizt worden.
NaOH ist hinzugefügt
worden (1'500 Gramm),
was in einem pH-Wert von 7.3 resultierte und 3.5 Liter Anion-Austauscher
sind hinzugefügt
worden. Die Mischung ist dann über
Nacht zum Auskühlen
abgestellt worden, während
umgerührt wurde.
Um die Separierung des Ionen-Austauschers zu vereinfachen, ist die
Mischung am nächsten
Tag vor dem Absieben des Ionen-Austauschers aufgeheizt worden. Der
Ionen-Austauscher ist dann mit 3.5% Salzlösung gewaschen und mit einer
14% Salzlösung
eluiert worden. Das eluierte Heparin ist mit Methanol ausgefällt worden.
Die Heparin-Ausbeute war 36'100
U/kg Mukosa im Eluat und 34'300
U/kg im Ausfall. Die Aktivität
und die Qualität
waren mit Roh-Heparin vergleichbar, welches aus einem Standardverfahren
gewonnen worden ist.
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Beispiel 2
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Zu
100 kg von Schweine-Mukosa, die mit 1% Natriummetabisulfit stabilisiert
worden ist, sind 80 Gramm Maxatase® hinzugefügt worden
und die Mischung ist bei Umgebungstemperatur gerührt worden. Nach 2 Stunden
ist die Mukosa auf 65°C
durch Hinzufügen
von 120 Liter kochendem Wassers in ungefähr 10 Minuten aufgeheizt worden.
Der pH-Wert ist verändert
worden, indem 630 Milliliter einer 33% NaOH-Lösung hinzugefügt worden
sind (gemessener pH-Wert von 7.3), und es sind 3.5 Liter Anion-Austauscher hinzugefügt worden.
Die Anfangstemperatur war 65°C,
nach einer Stunde war sie 61°C,
nach zwei Stunden 56°C
und nach drei Stunden 52°C.
Die Mischung ist dann über
Nacht zum Auskühlen
abgestellt worden. Der Ionen-Austauscher ist bei einer Temperatur
von 28°C
abgesiebt worden und der gewaschene Ionen-Austauscher ist eluiert worden. Die
Heparin-Ausbeute war 30'500 U/kg
Mukosa im Eluat und 26'400
U/kg im Ausfall. Die Aktivität
und die Qualität
waren mit Roh-Heparin vergleichbar, welches aus einem Standardverfahren gewonnen
worden ist.
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Beispiel 3
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Zu
47,5 kg von Schweine-Mukosa, die mit 0.5% Natriummetabisulfit stabilisiert
worden ist, sind 80 Gramm Maxatase® bei
30°C unter
Rühren
hinzugefügt
worden. Nach 4 Stunden sind weitere 55.5 kg Mukosa hinzugefügt worden
und die Mischung ist für weitere
2 Stunden bei Umgebungstemperatur (26°C) gerührt worden. Dann ist die Mischung
in 40 Minuten auf 65°C
durch Einleiten von heissem Dampf in die Mischung aufgeheizt worden.
Der pH-Wert ist mit Hinzufügen
von 550 Gramm NaOH auf einen pH-Wert von 7.2 verändert worden und Umrühren für eine Stunde
ist ein Liter Ionen-Austauscher hinzugefügt worden. Die Anfangstemperatur
war 65°C,
nach einer Stunde war sie 62°C,
und nach zwei Stunden 53°C.
Die Mischung ist dann über
Nacht zum Auskühlen
abgestellt worden, die Temperatur hat bei 27°C gelegen. Die Heparin-Ausbeute war 40'000 U/kg Mukosa im
Eluat und 38'700
U/kg im Ausfall.
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Beispiel 4
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Zu
3 kg von Schweine-Mukosa in einem isolierten Behälter, die mit 0.5% Natriummetabisulfit
stabilisiert worden ist, sind 2.3 Gramm Maxatase® hinzugefügt worden
und die Mischung ist bei Umgebungstemperatur gerührt worden. Nach 5.5 Stunden
bei 30°C
ist die Mukosa auf 64°C
durch Hinzufügen
von 5.4 Liter kochendem Wassers aufgeheizt worden. 35 Milliliter
einer 33% NaOH-Lösung
sind hinzugefügt worden,
was in einem pH-Wert von 7.6 resultierte, und es sind 110 Milliliter
Anion-Austauscher hinzugefügt
worden. Die Mischung ist dann zum Auskühlen abgestellt worden. Nach
ungefähr
16 Stunden lag die Temperatur bei 41°C und der Ionen-Austauscher
ist abgesiebt worden. Die Heparin-Ausbeute war 32'200 U/kg Mukosa im
Eluat. Die Aktivität
und die Qualität waren
mit Roh-Heparin vergleichbar, welches aus einem Standardverfahren
gewonnen worden ist.
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Beispiel 5
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Zu
115 kg von Schweine-Mukosa, die mit 1% Natriummetabisulfit stabilisiert
worden ist, sind 88 Gramm Maxatase® hinzugefügt worden
und die Mischung ist bei Umgebungstemperatur gerührt worden. Nach 2 Stunden
ist die Mukosa auf 65°C
durch Hinzufügen
von 133 Liter kochendem Wassers in ungefähr 10 Minuten aufgeheizt worden.
Der pH-Wert ist verändert
worden, indem 880 Gramm NaOH (pH-Wert 7.75) hinzugefügt worden
sind, und 4 Liter Anion-Austauscher sind hinzugefügt worden.
Nachfolgend sind 108 Gramm Maxatase® hinzugefügt worden.
Die Anfangstemperatur war 65°C,
nach einer Stunde war sie 60°C,
nach zwei Stunden 57°C und
nach drei Stunden 54°C.
Nach drei Stunden ist der Ionen-Austauscher
abgesiebt worden. Der gewaschene Ionen-Austauscher ist eluiert worden
und das Heparin ist ausgefällt
worden. Die Heparin-Ausbeute war 20'500 U/kg Mukosa im Eluat und 17'565 U/kg im Ausfall.
Die Aktivität
und die Qualität
waren mit Roh-Heparin vergleichbar, welches aus einem Standardverfahren
gewonnen worden ist.
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Beispiel 6
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Zu
10 kg von Schweine-Mukosa, die mit 1% Natriummetabisulfit stabilisiert
worden ist, ist Maxatase® hinzugefügt worden
und die Mischung ist bei Umgebungstemperatur gerührt worden. Dann ist die Mukosa
auf 68°C
mit einem Gasflammenbrenner in 60 Minuten aufgeheizt worden. NaOH
ist hinzugefügt worden
sind, was in einem pH-Wert von 7.2 resultierte. Danach sind 2.1
Liter Anion-Austauscher hinzugefügt
worden. Die Mischung ist dann abgekühlt worden, bis die Temperatur
unter 60°C
gefallen ist, dann ist ein zusätzliches
Heizen angewandt worden, um die Temperatur über 60°C zu halten. Nach drei Stunden
ist der Ionen-Austauscher
abgesiebt worden. Der Ionen-Austauscher ist gewaschen und bei 5°C für den Transport
zur verarbeitenden Fabrik gelagert worden.