CZ299281B6

CZ299281B6 - Zpusob prípravy heparinu

Info

Publication number: CZ299281B6
Application number: CZ20000138A
Authority: CZ
Inventors: Houdenhoven@Francois Egbert Abraham Van; Lambertus Maria Sanders@Adriamus; Zutphen@Petrus Johannes Josephus Van
Original assignee: N.V. Organon
Priority date: 1997-07-16
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2008-06-04
Also published as: EP0996642A1; HUP0003064A2; PL338007A1; DK0996642T3; HRP980399B1; AU739225B2; CA2294780C; EP0996642B1; KR100515706B1; JP2002508805A; IL133363A; UY25097A1; NO20000189D0; CA2294780A1; PL195526B1; KR20010014387A; HRP980399A2; AU9071598A; NO320786B1; BR9810881A

Abstract

Podstatu rešení tvorí zpusob výroby heparinu enzymatickou hydrolýzou bílkovin ze sliznicní tkáne savcu, pricemž postup spocívá v tom, že se a) ke sliznicní tkáni pridá proteolytický enzym, b) smes, získaná v predchozím stupni se inkubuje v nádrži pri teplote místnosti po dobu až 8 hodin a c) pak seteplota zvýší na 50 až 75 .degree.C a pri této teplote se smes inkubuje 1 až 6 hodin, pricemž v prubehu alespon jednoho ze stupnu b) nebo c) se ke smesi pridá adsorpcní cinidlo v množství, dostatecném pro vazbu heparinu, prítomného ve smesi.

Description

Předmětný vynález se týká způsobu přípravy heparinu. Zvláště pak se týká zjednodušeného způsobu odstraňování bílkovin přítomných v živočišné tkáni, která slouží jako zdroj heparinu.

Dosavadní stav techniky

Heparin je velmi komplikovaný glykosaminoglykan složený ze střídajících se sekvencí různě sulfatovaných zbytků uronové kyseliny a α-D-glukosaminu spojených 1 až 4 a a β vazbami. Díky složitosti své primární struktury je heparin polydisperzní heteropolysacharid, který je velmi heterogenní ve smyslu relativní molekulové hmotnosti, fyzikálně-chemických vlastností a biologické aktivity.

Heparin je již dlouho používán jako látka bránící srážení krve a jako antitrombotická látka při léčbě a prevenci žilní trombózy. Heparin je obsažen v různých živočišných tkáních a lze ho získat izolací z těchto tkání. V současné době se velká část heparinu používaného pro zmíněné účely získává z prasečí střevní sliznice. Způsob izolace zahrnuje hydrolýzu sliznice a následnou extrakci heparinu.

Americký patent číslo US 5 607 840, který je zde obsažen jako odkaz, popisuje způsob hydroiýzy sliznice, který zahrnuje hydrolýzu vodné směsi obsahující savčí sliznici a proteolytický enzym při teplotě přibližně 55 °C, adsorpci polyaniontů na měnič aniontů a následnou zpětnou izolaci aniontů z pryskyřice a proteinového hydrolyzátu z vyluhovaného vodného roztoku. Pro stabilizaci surové sliznice a zabránění růstu bakterií jsou do roztoku přidávány soli ve formě zachycovače kyslíku nebo baktericidy.

Obsah heparinu ve vodném médiu obsahujícím sliznici je velmi malý, díky čemuž musí být zpracováno velké množství slizniční tkáně. Z ekonomických důvodů se proto hydrolýza provádí v reakčních nádržích jejichž objem je větší než 50 m³. Během reakce je po dobu delší než 24 hodin udržována konstantní teplota a směs je míchána pomocí technicky vyspělého zařízení.

Obvykle nejsou provozy pro extrakci heparinu umístěné v blízkosti jatek, kde se shromažduje sliznice a je proto zapotřebí přepravovat surovinu na dlouhé vzdálenosti. Zvláště v případě vzdálených oblastí má tato skutečnost za následek nízkou kvalitu materiálu, který je dodáván výrobnímu provozu a zvýšené výrobní náklady.

Dokument WO 94/12 524 popisuje jednostupňový způsob hydroiýzy savčí tkáně. Postupuje se tak, že se hydrolyzuje vodná směs s obsahem slizniční tkáně savců působením proteolytického enzymu při teplotě přibližně 55 °C, polyanionty se adsorbují na aniontoměničovou pryskyřici a pak se anionty izolují z pryskyřice a bílkovinný hydrolyzát se izoluje z vodného roztoku. Ke stabilizaci surového slizničního materiálu a k zábraně růstu bakterií se do roztoku přidávají soli, schopné vázat kyslík nebo antibakteriální látky.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob výroby heparinu enzymatickou hydrolýzou bílkovin ze slizniční tkáně savců, jenž spočívá v tom, že se

a) ke slizniční tkáni přidá proteolytický enzym,

- 1 CZ 299281 B6

b) směs, získaná v předchozím stupni se inkubuje v nádrži při teplotě místnosti po dobu až 8 hodin a

c) pak se teplota zvýší na 50 až 75 °C a při této teplotě se směs inkubuje 1 až 6 hodin, přičemž v průběhu alespoň jednoho ze stupňů b) nebo c) se ke směsi přidá adsorpční činidlo v množství, dostatečném pro vazbu heparinu, přítomného ve směsi.

Od postupu, uvedeného v dokumentu WO 94/12 524 se způsob podle předmětného vynálezu liší zejména zařazením dalšího stupně, kterým je předběžná inkubace, při níž se směs siizniční tkáně a enzymu udržuje na teplotě místnosti po dobu až 8 hodin. Toto opatření podstatně zvyšuje ío výtěžek celého postupu ve srovnání se známým postupem podle namítaného dokumentu.

Způsob podle předmětného vynálezu tak zahrnuje stupeň zvyšování teploty sliznice na teplotu přibližně 50 až 75 °C a inkubaci sliznice v tomto rozsahu teplot v přítomnosti proteolytického enzymu po dobu přibližně až 6 hodin.

Výhodou způsobu podle tohoto vynalezu je, že může být prováděn v relativně malém měřítku. Způsob je velmi vhodný pro provádění přímo na místech, která jsou zdrojem surového slizničního materiálu a odpadá tak potřeba přepravy suroviny. Dále nejsou potřeba žádné speciální dovednosti.

Způsob podle předmětného vynálezu může rovněž zahrnovat jeden nebo oba z následujících inkubačních stupňů:

a) inkubace směsi v nádrži při teplotě okolí před zvýšením teploty po dobu až přibližně 8 hodin

b) další inkubace po zvýšení teploty během doby, kdy je roztok ponecháván zchladnout na teplotu okolí.

Doba inkubace při teplotě 50 až 75 °C je nejlépe kratší než 4 hodiny, nejlépe pak delší než 1 hodinu. Teplota je zvýšena nejlépe na přibližně 60 až 70 °C.

Teplotu lze snadno zvyšovat přímým ohřevem nádrže obsahující vodný siizniční roztok. Například teploty 60 až 70 °C lze rychle dosáhnout ohřevem pomocí běžného plynového hořáku, ale také například přidáním páry. Takto dosažená teplota může být několik hodin udržována mírným zahříváním, případně může být po dosažení požadované teploty zastaven externí přívod tepla a směs v nádrži může být ponechána pozvolna chladnout. Díky tomuto pozvolnému poklesu teploty bude teplota směsi po dobu několika hodin vyšší než 50 °C. Podle tohoto způsobu tedy při teplotě vyšší než 50 °C nastane počáteční hydrolýza bílkovin a po odstranění vnějšího tepelného zdroje teplota směsi klesá a hydrolýza pokračuje při nižší teplotě. Doba inkubace při nižší teplotě není nijak omezena, avšak měla by být upřednostňována doba kratší než 24 hodin, v nej lepším případě je potom inkubace prováděna přes noc. Další pokračování inkubace při teplotě okolí není nezbytným předpokladem, ale bylo prokázáno, že tímto stupněm je ovlivněn výtěžek heparinu. Podobně jako bylo pozorováno, že „předinkubační“ stupeň při teplotě okolí kladné ovlivňuje výtěžky heparinu.

Reakční nádobou může být např. ocelová nádrž, bez jakýchkoli specifických požadavků.

Podle jiné alternativy může být teplota zvyšována přidáním 1 až 3 objemů vodného roztoku o teplotě 80 až 100 °C. Nejlépe je používána samotná voda, ale lze použít rovněž zředěný solný roztok. Voda se přidává ohřátá nejlépe na teplotu varu. Díky zvětšení objemu dojde i ke zvýšení tepelné kapacity a proto lze udržovat teplotu na požadované výši po dostatečně dlouhou dobu, kdežto simultánně probíhající proces chladnutí postupuje pomalu. Další výhodou přidávání vody je to, že je snížena viskozita roztoku, výsledkem čehož je lepší filtrovatelnost komplexu adsobent-heparin, což je důležité pro extrakci heparinu. Protože při této alternativě není využíváno přímého ohřevu, mohou být používány nádrže vyrobené z různých materiálů jako je např. plastická hmota.

Vhodným způsobem provedení způsobu podle předmětného vynálezu je shromáždění sliznic během pracovního dne a započetí hydrolýzy přídavkem proteolytického enzymu do nádrže během skladování suroviny v této nádrži. Na konci dne může být teplota směsi v nádrži zvýšena na 50 až 75 °C, případně několik hodin udržována na konstantní hodnotě a dále může být směs inkubována přes noc, zatímco její teplota pozvolna klesá na teplotu okolí.

Pro získání homogenního roztoku a lepšího kontaktu adsorbentu s roztokem obsahujícím heparin je třeba upřednostňovat míchání směsi během hydrolýzy.

Slizniční roztok může být připraven dispergací živočišných tkání ve vodě. Tyto tkáně, které mají endoteliální nebo slizniční složky, mohou pocházet například z hovězího dobytka, psů, vepřů nebo ovcí. Heparin je obsažen např. v plicích, střevech, kůži a játrech různých živočichů. Pokud možno je používána sliznice pocházející z prasečích střev.

Při provedení způsobu podle předmětného vynálezu může být využito velké množství enzymů splňujících předpoklad, že jsou proteolyticky aktivní. Vhodné enzymy jsou dobře známé a jedná se např. o mikrobiální proteázy, trypsin a chymotrypsin. Enzym vhodný pro alkalickou hydrolýzu je komerčně dostupný pod obchodním názvem maxatase®. Poměr enzymu k substrátu se obvykle pohybuje v rozmezí přibližně 0,02 až 0,2 %. Způsob podle tohoto vynálezu může zahrnovat přidávání konzervačních látek, které jsou normálně přítomné v roztoku slizniční tkáně, do směsi. Nejlépe je používán disiřiěitan sodný, ale lze použít i jiné konzervační látky jako například propionan vápenatý nebo fenol. Množství přidávaného disiřitanu sodného je přibližně 0,5 až 5 kilogramů/100 litru slizničního roztoku. Nejlépe je konzervační činidlo přidáváno během shromaž25 ďování slizniční tkáně.

Přidáním alkalického činidla, obvykle hydroxidu sodného v množství přibližně 0,8 až 1,2 kilogramů/100 litrů slizničního roztoku, lze upravit pH na hodnotu 7 až 9. Většina běžně používaných proteolytických enzymů vykazuje nej lepší aktivitu právě při takovýchto hodnotách pH.

Úprava pH může být provedena během „předhydrolýzového“ stupně i během inkubace při zvýšené teplotě.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž způsob izolace heparinu. Způsob hydrolýzy podle předmětného vynálezu je důležitý při izolaci heparinu. Pokud je ke směsi během jednoho nebo několika inkubačních stupňů přidán adsorbent pro vázání heparinu přítomného v hydrolyzovaném roztoku, je možné heparin z hydrolyzátu extrahovat.

Adsorbent je přidáván nejlépe před začátkem inkubace při zvýšené teplotě.

Adsorbentem je nejlépe měnič aniontů, který je přidáván v množství dostatečném pro vázání polyaniontů přítomných ve slizničním roztoku. Takové měniče aniontů jsou běžně komerčně dostupné a obvykle se přidávají v množství 2 litry na 100 litrů slizničního roztoku. Heparin lze z vyluhovaného roztoku extrahovat rovněž pomocí přídavku afinitního adsorbentu se specifitou na heparin.

Celková koncentrace soli v hydrolyzátu musí být zvolena v takovém rozmezí, aby bylo zajištěno téměř kvantitativní odstranění pryskyřicí důležitou pro účinnost vázání polyaniontů k iontoměni45 čové pryskyřici a obvykle se pohybuje v rozmezí od 0,1 do 0,5 mol/litr. Kromě solí přítomných ve sliznici se obvykle během hydrolýzy k roztoku ještě přidávají konzervační činidla a soli alkalických kovů nebo amonné soli.

Po skončení hydrolýzy je z roztoku adsorbent odfiltrován, naadsorbovaný heparin je eluován vysoce koncentrovaným solným roztokem a heparin je dále zpracováván. Předmětem tohoto vynálezu je tedy také způsob izolace heparinu zahrnující další stupně odfiltrování adsorbentu s naadsorbovaným heparinem a eluci heparinu z adsorbentu.

-3 CZ 299281 B6

Pro zajištění optimálního zpětného uvolnění heparinu je žádoucí, aby solný roztok používaný pro eluci měl dostatečně vysokou iontovou sílu, která zajistí skutečně úplné uvolnění heparinu z adsorbentu. Jednou z možností zpětného uvolnění heparinu z komplexu heparin-anex je eluce 2 až 4 molárním roztokem chloridu sodného.

Je zřejmé, že způsob podle předmětného vynálezu umožňuje zpracovávat nenaadsorbovaný materiál, tj. sliznici, v místě, kde je tento materiál produkován, protože provedení způsobu podle tohoto vynálezu je snadné a pro provedení hydrolýzy je zapotřebí pouze minimální výbava. Proto může být způsob podle tohoto vynálezu prováděn i v místech s nízkou technickou vybaveností a špatnou infrastrukturou.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou pouze ilustrativní a nikterak neomezují rozsah tohoto vynálezu.

Příklad 1

Ke 250 kilogramům prasečí sliznice stabilizované 0,5 % disiřičitanu sodného bylo přidáno 200 gramů maxatasy® a směs byla míchána při teplotě okolí. Po 4 hodinách byla sliznice ohřátá plynovým hořákem během přibližně 70 minut na teplotu 69 °C. Přidáním 1500 gramů hydroxidu sodného bylo upraveno pH na hodnotu 7,3 a k této směsi bylo přidáno 3,5 litru měniče aniontů. Poté byla směs ponechána chladnout přes noc za nepřetržitého míchání. Pro usnadnění oddělení měniče iontů byla druhý den směs před odfiltrováním měniče iontů ohřátá. Měnič iontů byl nejprve promyt 3,5% roztokem soli a následně eluován 14% roztokem soli. Eluovaný heparin byl vysrážen methanolem. Výtěžek heparinu činil v eluátu 36 100 U/kilogram sliznice a 34 300 U/kilogram sliznice ve sraženině. Aktivita a kvalita byly srovnatelné se surovým heparinem získaným standardním způsobem.

Příklad 2

Ke 100 kilogramům prasečí sliznice stabilizované 1 % disiřičitanu sodného bylo přidáno 80 gramů maxatasy® a směs byla míchána při teplotě okolí. Po 2 hodinách byla sliznice přidáním 120 litrů vroucí vody během přibližně 10 minut ohřátá na teplotu 65 °C. Po přidání 630 mililitrů 33% roztoku hydroxidu sodného bylo upraveno pH na hodnotu 7,3 (naměřená hodnota) a k této směsi bylo přidáno 3,5 litru měniče aniontů. Počáteční teplota směsi byla 65 °C, po jedné hodině byla teplota směsi 61 °C, po dvou hodinách 56 °C a po třech hodinách byla teplota směsi 52 °C. Směs byla ponechána chladnout přes noc. Měnič iontů byl odfiltrován při teplotě 28 °C a po promytí eluován. Výtěžek heparinu činil v eluátu 30 500 U/kilogram sliznice a 26 400 U/kilogram sliznice ve sraženině. Aktivita a kvalita byly srovnatelné se surovým heparinem získaným standardním způsobem.

Příklad 3

K míchané směsi 47,5 kilogramů sliznice stabilizované 0,5 % disiřičitanu sodného bylo při teplotě 30 °C přidáno 80 gramů maxatasy®. Po 4 hodinách bylo přidáno dalších 55,5 kilogramů sliznice a směs byla míchána další 2 hodiny při teplotě okolí (26 °C). Poté byla do směsi zavedena horká pára a směs byla během 40 minut ohřátá na teplotu 65 °C. Přidáním 550 gramů hydroxidu sodného bylo upraveno pH na hodnotu 7,2 a k této směsi byl po jedné hodině míchání přidán jeden litr měniče iontů. Počáteční teplota směsi byla 65 °C. O hodinu později 62 °C a po dvou hodinách klesla na hodnotu 53 °C. Směs byla ponechána chladnout přes noc a její teplota

-4CZ 299281 B6 klesla na 27 °C. Výtěžek heparinu byl 40 000 U/kilogram v eluátu a 38 700 U/kilogram ve sraženině.

Příklad 4

Ke 3 kilogramům prasečí sliznice v izolované nádrži stabilizované 0,5 % disiřičitanu sodného bylo přidáno 2,3 gramů maxatasy® a výsledná směs byla míchána při teplotě okolí. Po 5,5 hodinách míchání při teplotě 30 °C byla sliznice ohřátá přidáním 5,4 litru vroucí vody na teplotu 64 °C. Ke směsi bylo dále přidáno 35 ml 33% roztoku hydroxidu sodného, čímž bylo upraveno pH na hodnotu 7,6 a následně bylo ke směsi přidáno 110 ml měniče aniontů. Směs byla ponechána chladnout a po přibližně 16 hodinách klesla její teplota na 41 °C a byl odfiltrován měnič iontů. Výtěžek heparinu v eluátu byl 32 200 U/kilogram sliznice. Aktivita a kvalita byly srovnatelné se surovým heparinem získaným standardním způsobem.

Příklad 5

Ke 115 kilogramům prasečí sliznice stabilizované 1 % disiřičitanu sodného bylo přidáno 88 gramů maxatasy® a směs byla míchána při teplotě okolí. Po 2 hodinách byla sliznice přidáním 133 litrů vroucí vody během přibližně 10 minut ohřátá na teplotu 65 °C. Hodnota pH byla upravena přidáním 880 gramů hydroxidu sodného na hodnotu 7,3 a k této směsi byly postupně přidány 4 litry měniče aniontů a dalších 108 gramů maxatasy®. Počáteční teplota směsi byla 65 °C, po jedné hodině byla teplota směsi 60 °C, po dvou hodinách 57 °C a po třech hodinách byla teplota směsi 54 °C. Po uplynutí tří hodin byl ze směsi odfiltrován měnič iontů, který byl dále promyt a eluován. Eluovaný heparin byl vysrážen. Eluát heparinu obsahoval 20 500 U/kilogram sliznice a sraženina obsahovala 17 565 U/kilogram sliznice. Aktivita a kvalita byly srovnatelné se surovým heparinem získaným standardním způsobem.

Příklad 6

Ke 100 kilogramům prasečí sliznice stabilizované 1 % disiřičitanu sodného byla přidána maxatasa® a směs byla míchána při teplotě okolí. Poté byla sliznice plynovým hořákem ohřátá během přibližně 60 minut na teplotu 68 °C. Hodnota pH byla pomocí hydroxidu sodného upravena na hodnotu 7,2 a k této směsi bylo přidáno 2,1 litru měniče aniontů. Poté byla směs ponechána chladnout dokud její teplota neklesla pod 60 °C a následně byla směs zahřívána tak, aby teplota směsi byla udržována nad 60 °C. Po třech hodinách byl měnič iontů odfiltrován, promyt, a uložen při teplotě 5 °C pro přepravu do zpracovatelského provozu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby heparinu enzymatickou hydrolýzou bílkovin ze slizniční tkáně savců, vyznačující se t í m , že se

a) ke slizniční tkáni přidá proteolytický enzym,

b) směs, získaná v předchozím stupni se inkubuje v nádrži při teplotě místnosti po dobu až 8 hodin a

c) pak se teplota zvýší na 50 až 75 °C a při této teplotě se směs inkubuje 1 až 6 hodin, přičemž v průběhu alespoň jednoho ze stupňů b) nebo c) se ke směsi přidá adsorpční činidlo v množstvím dostatečném pro vazbu heparinu přítomného ve směsi.

- 5 CZ 299281 B6
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že ve stupni c) se směs inkubuje 1 až 4 hodiny.
3. Způsob podle nároku 1 nebo2, vyznačující se tím, že se stupeň c) provádí při teplotě 60 až 70 °C.
4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až3, vyznačující se tím, že se po ukončení stupně c) směs dále inkubuje tak dlouho, až roztok zchladne na teplotu místnosti.
5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až4, vyznačující se tím, že se teplota zvýší přímým přenosem tepla.
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se teplota ve stupni c) zvýší tak, že se ke směsi přidají 1 až 3 objemy vodného rozpouštědla s teplotou v rozmezí 80 až 100 °C.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se jako vodné rozpouštědlo užije vroucí voda.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že adsorpční prostředek s heparinem se oddělí filtrací a heparin se z adsorpčního prostředku uvolní.