NO320786B1 - Fremgangsmate for fremstilling av heparin - Google Patents
Fremgangsmate for fremstilling av heparin Download PDFInfo
- Publication number
- NO320786B1 NO320786B1 NO20000189A NO20000189A NO320786B1 NO 320786 B1 NO320786 B1 NO 320786B1 NO 20000189 A NO20000189 A NO 20000189A NO 20000189 A NO20000189 A NO 20000189A NO 320786 B1 NO320786 B1 NO 320786B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- temperature
- heparin
- mixture
- hours
- added
- Prior art date
Links
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 title claims description 48
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 title claims description 48
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 31
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 4
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 16
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 13
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 9
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 8
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 8
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 7
- 239000004296 sodium metabisulphite Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BCZXFFBUYPCTSJ-UHFFFAOYSA-L Calcium propionate Chemical compound [Ca+2].CCC([O-])=O.CCC([O-])=O BCZXFFBUYPCTSJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 229940123973 Oxygen scavenger Drugs 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 alkali metal salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UKFBFLRUSA-N alpha-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-UKFBFLRUSA-N 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940127090 anticoagulant agent Drugs 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 235000010331 calcium propionate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004330 calcium propionate Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av heparin. Den vedrører spesielt en forenklet fremgangsmåte for fjerning av proteinene som er tilstede i en vevskilde for heparin i dyr.
Heparin er et meget komplisert glykosaminoglykan bestående av alternerende sekvenser av forskjellig sulfaterte residier av uronsyre og a-D-glukosamin koblet med a og p (1-4) bindinger. På grunn av kompleksiteten til primærstrukturen er heparin et polydispers heterosakkarid som er sterkt hetereogent med hensyn på molekylvekt, fysiokjemiske egenskaper og biologiske aktiviteter.
Heparin har allerede blitt anvendt i lang tid som et antikoaguleringsmiddel og antitrombotisk middel for behandling og forhindring av venetrombose. Det er tilstede i forskjellige dyrevev og kan bli oppnådd ved isolering derifra. For tiden blir en stor del av heparin anvendt for disse formålene isolert fra tarmslimhinnen til gris. Isolerings-prosessen innbefatter hydrolyse av slimhinnen etterfulgt av ekstrahering av heparin.
US patent 4,216,293 beskriver en enzymolytisk fremgangsmåte for ekstrahering av protease inhibitorer fra dyrevev. Denne fremgangsmåten omfatter først oppvarming av den vandige blandingen av vevet(ene) og minst et protolytisk enzym til omtrent 40°C, eventuelt deretter til 60°C og deretter til 90°C. Til tross for at fremgangsmåten er rettet mot produksjon av protease inhibitorer muliggjør denne fremgangsmåten også ekstrahering av heparin fra en intermediær fraksjon.
US patent 5,607,840 beskriver en fremgangsmåte for hydrolyse av slimhinnevev. Fremgangsmåten innbefatter hydrolyse av en vandig blanding inneholdende slimhinne fra pattedyr med et protolytisk enzym ved en temperatur på omtrent 55°C, adsorbsjon av polyanioner til en anionbytteharpiks og påfølgende isolering av anionene fra harpiksen og protein-hydrolysatet fra den spaltede vandige løsningen. For å stabilisere det rå slimhinne-materialet og å forhindre bakteriell vekst, blir salter i form av en oksygenoppfanger eller bakteriocider ført inn i løsningen.
Heparininnholdet i det slimhinne-inneholdende vandige mediet er meget lavt, og følgelig må store mengder av slimhinnevev bli bearbeidet. Av økonomiske grunner blir hydrolyseprosessen følgelig utført i reaksjonsbeholdere som rommer mer enn 50 m3.1 løpet av reaksjonstiden blir temperaturen holdt på et konstant nivå i mer enn 24 timer og blandingen blir omfattende omrørt ved anvendelse av avansert utstyr.
Vanligvis ligger ikke fabrikker for proteinekstrahering i nærheten av slakterier hvor slimhinnen blir samlet og transportering over lange avstander er følgelig nødvendig. For spesielt avsidesliggende strøk resulterer dette i levering av materiale med lav kvalitet fra produksjonsfabrikken og en økning av kostnadene.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny og lettere fremgangsmåte for å isolere heparin fra slimhinnevev. Det er blitt oppdaget at proteinet i en vandig blanding omfattende slimhinnevev fra pattedyr også kan bli spaltet med et protolytisk enzym ved en temperatur på mellom 50-75°C i opptil omtrent seks timer. Et enkelt "for-hydrolyse" trinn ved romtemperatur kan eventuelt bli innbefattet. Dette forbedret effektiviteten til protolysen i betydelig grad. Etter økning i temperatur kan hydrolysen bli fortsatt, fortrinnsvis i nærvær av polyanionadsorberingsmateriale ved en temperatur under 50°C. Spaltningen kan bli utført i beholdere med middels kapasitet.
Fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen omfatter følgelig trinnene omfattende økning av temperaturen til slimhinnen til omtrent 50-75°C og inkubering av slimhinnen innenfor det temperaturområdet i opptil omtrent seks timer i nærvær av et protolytisk enzym.
Fremgangsmåten har den fordelen at den kan bli utført i relativt liten skala. Fremgangsmåten er godt egnet for å bli utført på steder hvor rått slimhinnemateriale blir produsert og det er følgelig ikke nødvendig med transportering av råmateriale. Det er heller ikke nødvendig med spesielle kunnskaper.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av heparin ved anvendelse av en metode for enzymatisk hydrolyse av protein fra slimhinnevev fra pattedyr, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: (a) tilsetning av et protolytisk enzym til slimhinnevevet; (b) inkubering av blandingen oppnådd i trinn (a) i en beholder ved
omgivelsestemperatur i opptil 8 timer;
(c) økning av temperaturen til 50-75°C og inkubering av blandingen ved den
forhøyede temperaturen i 1 til 6 timer;
idet et adsorberingsmiddel blir tilsatt til blandingen i løpet av minst et av trinnene (a), (b) eller (c) i en mengde som er tilstrekkelig for å binde heparinet som er tilstede i blandingen.
Inkubasjonstiden ved 50-75°C er fortrinnsvis i mindre enn fire timer. Det er foretrukket at inkubasjonstiden er på mer enn en time. Temperaturen blir fortrinnsvis øket til omtrent 60-70°C.
Temperaturen kan lett bli øket ved direkte oppvarming av beholderen inneholdende den vandige slimhinneløsningen. For eksempel kan en temperatur på omtrent 60-70°C hurtig bli oppnådd med en vanlig gassflamme, men også for eksempel ved tilsetning av damp. Temperaturen oppnådd på denne måten kan følgelig bli opprettholdt ved moderat oppvarming i flere timer. Alternativt kan ytre tilsetning av varme bli stoppet når ønsket temperatur blir oppnådd og dermed muliggjøre at blandingen i beholderen gradvis blir avkjølt. På grunn av den gradvise temperaturøkningen, vil blandingen beholde dets temperatur over 50°C i flere timer, i begynnelsen oppstår proteinhydrolyse følgelig ved en temperatur over 50°C. Etter fjerning av den ytre varmekilden reduseres temperaturen og hydrolysen fortsetter ved en lavere temperatur. Det er ingen begrensning på grad av inkubasjonstid ved den reduserte temperaturen, men inkubasjonstider som er mindre enn 24 timer er foretrukket, mer foretrukket blir inkubasjon utført over natt. Fortsettelse av en forlenget inkubasjon ved romtemperatur er ikke en absolutt nødvendighet, men det er blitt vist å ha innvirkning på utbyttet av heparin. Likeledes viste "pæ-inkubasjons" trinnet ved romtemperatur å forbedre utbyttet av heparin.
Reaksjonsbeholderen kan for eksempel være en stålbeholder men ikke spesielle krav er nødvendige.
Alternativt kan temperaturen bli øket ved tilsetning av 1-3 volum av en vandig løsning med en temperatur mellom 80 og 100°C. Det er foretrukket at vann blir anvendt, men også fortynnede saltløsninger kan bli anvendt. Det er foretrukket at temperaturen på vannet er koketemperatur. På grunn av volumøkningen øker varmekapasiteten. Temperaturen kan følgelig bli opprettholdt ved ønsket temperatur i en tilstrekkelig lang tidsperiode, mens avkjølingsprosessen forløper sakte fremover. En ytterligere fordel av tilsetting av vann er at viskositeten til løsningen blir redusert og resulterer i en bedre siktbarhet av adsorberingsmidlet-heparinkpmplekset som er viktig ved ekstrahering av heparin. Idet det ikke er behov for direkte oppvarming, kan beholdere av forskjellige materialer for eksempel plast bli anvendt.
En hensiktsmessig måte for å utføre prosedyren ifølge oppfinnelsen er å samle slimhinnen i løpet av en arbeidsdag og å begynne med hydrolysen ved tilsetning av
protolytisk enzym i løpet av lagring av råmaterialet i en beholder. På slutten av dagen kan temperaturen bli forøket til 50-75°C, eventuelt holdt på et konstant nivå i noen få timer og deretter ytterligere inkubert over natt mens temperaturen reduseres gradvis til romtemperatur.
Det er foretrukket at blandingen i løpet av hydrolyseprosessen blir omrørt for å oppnå en homogen løsning og oppnå en god kontakt mellom adsorberingsmidlet og den heparin-inneholdende løsningen.
Den slimhinne-inneholdende løsningen kan bli oppnådd ved dispergering av dyrevev i vann. Vevene kan bli oppnådd fra for eksempel okse, hund, gris og sau. Vevene har endotele eller slimhinnekomponenter. Heparin er for eksempel tilstede i lunge, tarm, hud og lever fra forskjellige dyr. Det er foretrukket at tarmslimhinne fra gris blir anvendt.
Forskjellige enzymer kan bli anvendt i fremgangsmåten forutsatt at de innehar en protolytisk aktivitet. Egende enzymer er velkjente innenfor fagområdet, for eksempel mikrobielle proteaser, trypsin og kymotrypsin. Et egnet enzym for anvendelse ved alkalisk hydrolyse er kommersielt tilgjengelig under varemerket maxatase®. Forholdet mellom enzym og substrat er vanligvis omtrent 0,02-0,2%. Konserveringsmidlet som normalt er tilstede i løsningen av slimhinnevev kan også bli tilsatt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Det er foretrukket at natriummetabisulfit blir anvendt som konserveringsmiddel, men også andre konserveringsmidler så som for eksempel kalsiumpropionat eller fenol vil være tilstrekkelig. Mengde bisulfit som blir tilsatt er omtrent 0,5-5 kg /100 liter slimhinne. Konserveringsmidlet blir best tilsatt i løpet av samling av slimhinnevevet.
pH kan bli justert til pH 7-9 med et alkalisk reagens. Vanligvis blir natrium-hydroksid tilsatt i en mengde på omtrent 0,8-1,2 kg /100 liter slimhinne, De mest anvendte protolytiske enzymene utøver optimal aktivitet ved denne pH. Justering kan oppstå i løpet av "prehydrolysering" trinnet og også i løpet av inkubasjonstrinnet ved høyere temperatur.
Heparin blir som angitt ovenfor isolert og hydrolyseprosessen ifølge oppfinnelsen er følgelig viktig for isolering av heparin. Heparin kan bli ekstrahert fra hydrolysatet dersom adsorberingsmidlet blir tilsatt til blandingen i løpet av en eller flere inkubasjonstrinn for å binde heparin som er tilstede i hydrolyseringsløsningen. Det er foretrukket at adsorberingsmidlet blir tilsatt ved inkubasjonens begynnelse ved høyere temperatur.
Adsorberingsmidlet er fortrinnsvis et anionbytteharpiks som blir tilsatt i en mengde som er tilstrekkelig for å binde polyanionene tilstede i slimhinneløsningen.
Slike anionbytteharpikser er kommersielt tilgjengelige. Vanligvis blir en mengde på 2 liter pr. 100 liter slimhinne tilsatt. I tillegg kan et affinitets-absorberingsmiddel spesifikt for heparin bli anvendt for å ekstrahere heparin fra den spaltede løsningen.
Total saltkonsentrasjon til hydrolysatet bør bli valgt innenfor et område for å forsikre nesten kvantitativt opptak av harpiksen som er viktig for bindingseffektiviteten til polyanionene til ionebytterharpiksen og varierer vanligvis mellom 0,1 og 0,5 molar. I tillegg til saltene tilstede i slimhinnen blir også vanligvis konserveringsmidler og alkalimetallsalter eller ammoniumsalter tilsatt i løpet av hydrolyseprosessen.
Etter hydrolyseprosessen blir adsorberingsmidlet siktet ut. Adsorbert heparin blir deretter eluert med en høy saltløsning og heparin blir ytterligere bearbeidet. Det er følgelig også en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for isolering av heparin omfattende de ytterligere trinnene av å sikte adsorberingsmidlet med heparin og eluering av heparinet fra adsorberingsmidlet.
For å forsikre optimal isolering av heparin er det ønskelig at saltløsningen anvendt for eluering har tilstrekkelig høy ionestyrke for å forsikre vesentlig fullstendig frigjøring av heparin fra adsorberingsmidlet. En måte å isolere heparin på fra heparin-anionbyttekomplekset er eluering med NaCI i en konsentrasjon på 2-4 molar.
Det er klart at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å bearbeide ikke-adsorbert materiale, på grunn av at fremgangsmåten er lett å utføre og minimalt utstyr er nødvendig for å utføre hydrolysen. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan følgelig bli utført selv i omgivelser med lav teknologi og dårlig infrastruktur.
Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.
EKSEMPLER
Eksempel 1
Til 250 kg slimhinne fra gris, stabilisert med 0,5% natriummetabisulfit ble det tilsatt 200 g maxatase® og blandingen ble omrørt ved romtemperatur. Etter fire timer ble slimhinnen oppvarmet til 69°C med en gassflamme oppvarmingsinnretning i omtrent 70 minutter. NaOH ble tilsatt (1500 g) og resulterte i en pH på 7,38 og 3,5 liter anionebytter ble tilsatt. Blandingen ble deretter avkjølt over natt ved røring. For å lette separering av ionebytteren ble blandingen oppvarmet neste dag før utsikting av ionebytteren. Ionebytteren ble vasket med en 3,5% saltløsning og eluert med en 14% salteluering. Eluert heparin ble presipitert med metanol. Heparinutbytte var 36100 U/kg slimhinne i eluatet og 34300 U/kg i presipitatet. Aktiviteten og mengden var sammenlignbar med rå heparin avledet ifølge en standard fremgangsmåte.
Eksempel 2
Til 100 kg slimhinne fra gris, stabilisert med 1 % natriummetabisulfit ble det tilsatt 80 g maxatase® og blandingen ble omrørt ved romtemperatur. Etter to fimer ble slimhinnen oppvarmet til 65°C ved tilsetning av 120 liter kokende varmt vann i løpet av omtrent 10 minutter. pH ble endret ved tilsetning av 630 ml av en 3% NaOH løsning (målt verdi 7,3) og 3,5 liter anionebytter ble tilsatt. Utgangstemperaturen var 65°C og etter en time var denne 61 °C, etter to timer 56°C og etter tre timer 52°C. Blandingen ble avkjølt over natt. Ionebytteren ble siktet ut ved en temperatur på 28°C og vasket ionebytter ble eluert. Heparinutbytte var 30500 U/kg slimhinne i eluatet og 26400 U/kg i presipitatet. Aktiviteten og mengden var sammenlignbar med rå heparin avledet ifølge en standard fremgangsmåte.
Eksempel 3
Til 47,5 kg slimhinne stabilisert med 0,5% natriummetabisulfit ble det tilsatt 80 g maxatase® i en temperatur på 30°C med røring. Etter fire timer ble ytterligere 55,5 kg slimhinne tilsatt, og blandingen ble omrørt i ytterligere to timer ved romtemperatur (26°C). Deretter ble blandingen oppvarmet i 40 minutter til 65°C ved innføring av vanndamp i blandingen. pH ble endret til 7,2 med 550 g NaOH og etter omrøring i en time ble en liter ionebytter ble tilsatt. Utgangstemperaturen var 65°C og etter en time var denne 62°C, etter to timer 53°C. Blandingen ble avkjølt over natt, og temperaturen var 27°C. Heparinutbytte var 40000 U/kg slimhinne i eluatet og 38700 U/kg i presipitatet.
Eksempel 4
Til 3 kg slimhinner fra gris i en isolert flaske stabilisert med stabilisert med 0,5% natriummetabisulfit ble det tilsatt 2,3 g maxatase® og blandingen ble omrørt ved romtemperatur. Etter 5,5 timer ved 30°C ble slimhinnen oppvarmet til 64°C ved tilsetning av 5,4 liter kokende varmt vann. 35 ml av en 33% NaOH løsning ble tilsatt og resulterte i pH på 7,6 og 110 ml anionebytter ble tilsatt. Deretter ble blandingen avkjølt. Etter omtrent 16 timer var temperaturen 41 °C og ionebytteren ble siktet ut. Utbytte av heparin i eluatet var 32200 U/kg slimhinne. Aktiviteten og kvaliteten var sammenlignbar med rå heparin avledet fra en standardprosess.
Eksempel 5
Til 115 kg slimhinner fra gris, stabilisert med 1% natriummetabisulfit ble det tilsatt 88 g maxatase® og blandingen ble omrørt ved romtemperatur. Etter to timer ble slimhinnen varmet til 65°C ved tilsetning av 133 liter kokende varmt vann i løpet av omtrent 10 minutter. pH ble endret ved tilsetning av 880 g NaOH (pH 7,35) og 4 liter anionebytter ble tilsatt. Deretter ble 180 g maxatase® tilsatt. Utgangstemperaturen var 65°C og etter en time var denne 60°C, etter to timer 57°C og etter tre timer 54°C. Etter tre timer ble anionebytteren siktet ut. Den vaskede anionebytteren ble eluert og heparin ble presipitert. Heparineluatet inneholdt 20500 U/kg slimhinne i og 17565 U/kg i presipitatet. Aktiviteten og kvaliteten var sammenlignbar med rå heparin avledet fra en standardprosess.
Eksempel 6
Til 100 kg slimhinne fra gris, stabilisert med 1% natriummetabisulfit ble det tilsatt maxatase® og blandingen ble omrørt ved romtemperatur. Deretter ble slimhinnen varmet til 68°C med en gassflamme varmeinnretning i 60 minutter. NaOH ble tilsatt og resulterte i en pH på 7,2. Deretter ble 2,1 liter anionebytter tilsatt. Blandingen ble deretter avkjølt helt til temperaturen var under 60°C og deretter ble ytterligere varme tilført for å holde temperaturen over 60°C. Etter tre timer ble ionebytteren siktet ut. Ionebytteren ble vasket og lagret ved 5°C for transport til fabrikken for bearbeidning.
Claims (8)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av heparin ved anvendelse av en metode for enzymatisk hydrolyse av protein fra slimhinnevev fra pattedyr,
karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) tilsetning av et protolytisk enzym til slimhinnevevet; (b) inkubering av blandingen oppnådd i trinn (a) i en beholder ved omgivelsestemperatur i opptil 8 timer; (c) økning av temperaturen til 50-75°C og inkubering av blandingen ved den
forhøyede temperaturen i 1 til 6 timer;
idet et absorberingsmiddel blir tilsatt til blandingen i løpet av minst et av trinnene (a), (b) eller (c) i en mengde som er tilstrekkelig for å binde heparinet som er tilstede i blandingen.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at trinn (c) blir utført i løpet av 1 til 4 timer.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at temperaturen i trinn (c) er 60-70°C.
4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at den omfatter et forlenget inkubasjonstrinn etter trinn (c) mens løsningen blir kjølt ned til omgivelsestemperatur.
5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at økning av temperaturen blir oppnådd ved direkte varmeoverføring.
6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at økningen av temperaturen i trinn (c) blir oppnådd ved tilsetning til blandingen 1-3 volum av et vandig oppløsningsmiddel med en temperatur på mellom 80-100°C.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det vandige løsningsmiddelet er kokende vann.
8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at den omfatter utsiktning av absorberingsmiddelet med heparin og isolering av heparinet fra absorberingsmiddelet
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97202213 | 1997-07-16 | ||
| PCT/EP1998/004939 WO1999003893A1 (en) | 1997-07-16 | 1998-07-09 | Process for the production of heparin |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20000189D0 NO20000189D0 (no) | 2000-01-14 |
| NO20000189L NO20000189L (no) | 2000-03-14 |
| NO320786B1 true NO320786B1 (no) | 2006-01-30 |
Family
ID=8228564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20000189A NO320786B1 (no) | 1997-07-16 | 2000-01-14 | Fremgangsmate for fremstilling av heparin |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6232093B1 (no) |
| EP (1) | EP0996642B1 (no) |
| JP (1) | JP4455680B2 (no) |
| KR (1) | KR100515706B1 (no) |
| CN (1) | CN1109048C (no) |
| AR (1) | AR013223A1 (no) |
| AT (1) | ATE315588T1 (no) |
| AU (1) | AU739225B2 (no) |
| BR (1) | BR9810881B1 (no) |
| CA (1) | CA2294780C (no) |
| CZ (1) | CZ299281B6 (no) |
| DE (1) | DE69833205T2 (no) |
| DK (1) | DK0996642T3 (no) |
| ES (1) | ES2256954T3 (no) |
| HR (1) | HRP980399B1 (no) |
| HU (1) | HU225240B1 (no) |
| IL (1) | IL133363A (no) |
| NO (1) | NO320786B1 (no) |
| PL (1) | PL195526B1 (no) |
| TR (1) | TR200000086T2 (no) |
| TW (1) | TW581814B (no) |
| UY (1) | UY25097A1 (no) |
| WO (1) | WO1999003893A1 (no) |
| ZA (1) | ZA986289B (no) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2284535A1 (en) * | 2002-03-11 | 2011-02-16 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Low molecular weight heparins |
| KR20050012816A (ko) | 2002-06-19 | 2005-02-02 | 캔 테크놀로지스 인코포레이티드 | 점막 부산물을 포함하는 동물 사료 조성물 |
| US6933372B2 (en) * | 2003-03-07 | 2005-08-23 | Warner-Lambert Company | Method to produce a solid form of heparin |
| CN100425624C (zh) * | 2006-05-11 | 2008-10-15 | 中国农业大学 | 一种同步提取肝素钠和猪肠粘膜抗菌肽的方法 |
| CN100439402C (zh) * | 2006-10-12 | 2008-12-03 | 孙红 | 采用卵磷脂液膜分离法提取肝素的方法 |
| US9139876B1 (en) | 2007-05-03 | 2015-09-22 | Momenta Pharmacueticals, Inc. | Method of analyzing a preparation of a low molecular weight heparin |
| WO2010110654A1 (en) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Van Hessen Bv | Method for preparation of heparin from mucosa |
| CN102791742B (zh) * | 2010-01-19 | 2014-12-24 | 动量制药公司 | 评价肝素制剂 |
| WO2012115952A1 (en) | 2011-02-21 | 2012-08-30 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Evaluating heparin preparations |
| KR101447123B1 (ko) | 2014-02-27 | 2014-10-06 | 박상협 | 헤파린의 추출 방법 |
| CN104086672A (zh) * | 2014-06-10 | 2014-10-08 | 安徽申奥生物科技有限公司 | 一种粗品肝素钠的生产方法 |
| WO2020013346A1 (en) | 2018-07-11 | 2020-01-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for enzymatic sulfurylation of alcohols and amines using bacterium of the family enterobacteriaceae |
| KR102180261B1 (ko) * | 2019-03-19 | 2020-11-18 | 중앙대학교 산학협력단 | 돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 방법 |
| KR102104367B1 (ko) | 2019-09-02 | 2020-04-24 | 팜앤바이오 주식회사 | 헤파린나트륨의 제조장치 및 제조방법 |
| CN115028757A (zh) * | 2022-06-29 | 2022-09-09 | 江苏麦德森制药有限公司 | 一种肝素钠的脱色方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH617963A5 (no) * | 1973-10-05 | 1980-06-30 | Derivati Organici Lab | |
| HU177887B (en) * | 1979-03-21 | 1982-01-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for preparing a raw material containing heparin |
| EP0421508B1 (en) * | 1989-10-04 | 1993-12-15 | Akzo Nobel N.V. | Sulphated glycosaminoglycuronan with antithrombotic activity |
| AU5681094A (en) * | 1992-11-30 | 1994-06-22 | Celsus, Inc. | Protein hydrolysate derived from mucosal tissue |
-
1998
- 1998-07-09 EP EP98942666A patent/EP0996642B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 WO PCT/EP1998/004939 patent/WO1999003893A1/en active IP Right Grant
- 1998-07-09 ES ES98942666T patent/ES2256954T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 IL IL13336398A patent/IL133363A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 AT AT98942666T patent/ATE315588T1/de active
- 1998-07-09 DK DK98942666T patent/DK0996642T3/da active
- 1998-07-09 DE DE69833205T patent/DE69833205T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 AU AU90715/98A patent/AU739225B2/en not_active Expired
- 1998-07-09 KR KR10-1999-7012554A patent/KR100515706B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 CA CA2294780A patent/CA2294780C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 CZ CZ20000138A patent/CZ299281B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 JP JP50645999A patent/JP4455680B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 HU HU0003064A patent/HU225240B1/hu unknown
- 1998-07-09 PL PL98338007A patent/PL195526B1/pl unknown
- 1998-07-09 BR BRPI9810881-6A patent/BR9810881B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 TR TR2000/00086T patent/TR200000086T2/xx unknown
- 1998-07-09 CN CN98807195A patent/CN1109048C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 US US09/462,223 patent/US6232093B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-15 ZA ZA986289A patent/ZA986289B/xx unknown
- 1998-07-16 AR ARP980103468A patent/AR013223A1/es active IP Right Grant
- 1998-07-16 UY UY25097A patent/UY25097A1/es not_active IP Right Cessation
- 1998-07-16 HR HR980399A patent/HRP980399B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-07-16 TW TW087111617A patent/TW581814B/zh not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-01-14 NO NO20000189A patent/NO320786B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO320786B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av heparin | |
| Tabuchi et al. | Matrix solubilization and cell wall weakening by β‐expansin (group‐1 allergen) from maize pollen | |
| Yang et al. | Production and purification of protease from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean wastes☆ | |
| EP0494207A4 (en) | Thermostable purified endoglucanases from thermophilic bacterium acidothermus cellulolyticus | |
| US20180298411A1 (en) | Method of Producing Heparan Sulfate Having Anticoagulant Activity | |
| Setlow et al. | Identification of several unique, low-molecular-weight basic proteins in dormant spores of Clostridium bifermentans and their degradation during spore germination | |
| JP2020532278A (ja) | ２−ｏ−硫酸化酵素変異体、および３−ｏ−硫酸化酵素変異体、ならびにそれらを用いる方法 | |
| CN116947996A (zh) | 一种生产富含多巴重组贻贝粘蛋白的方法 | |
| Van Der Meulen et al. | Characterization of the neoagarotetra-ase and neoagarobiase of Cytophaga flevensis | |
| CN1916171B (zh) | 一种生产木二糖的方法及其专用固定化酶 | |
| EP1080158B1 (en) | Adhesives | |
| CA1284464C (en) | D(-)-mandelate dehydrogenase produced microbiologically, a process for its production and application thereof | |
| Konno et al. | Studies on the pectic depolymerases I. Exopolygalacturonase from root tissues and cell suspension cultures of carrots | |
| CN103667201A (zh) | 海洋微生物菌株ys0810产的碱性过氧化氢酶及其分离纯化方法 | |
| MXPA00000579A (en) | Process for the production of heparin | |
| Konno et al. | Degradation of pectic polysaccharides extracted from suspension cultures of carrot by purified exo‐polygalacturonase | |
| CN114410665B (zh) | 高效催化没食子酸甲酯生物合成的基因及其应用 | |
| US5583027A (en) | Enzyme intended for the fragmentation of N-acetylheparosan, production of preparations containing this enzyme and fragmentation process using this enzyme | |
| WO2024160906A1 (en) | Enzymatic process for the production of aldaric acids | |
| WO2024160907A1 (en) | Enzyme for the oxidation of uronic acids | |
| JPS61285989A (ja) | フエノ−ルオキシダ−ゼおよびその製造方法 | |
| JP2004024026A (ja) | キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び該ベクターを導入した形質転換体 | |
| CN118207184A (zh) | 来自肝素黄杆菌的2-o-脱硫酸基酶及其制备和应用 | |
| Hur et al. | Purification and partial characterization of a peroxidase from Perilla callus | |
| JPH03247298A (ja) | コンドロイチン硫酸から誘導される不飽和二糖の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| CHAD | Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften) |
Owner name: MERCK SHARP & DOHME BV, NL |
|
| MK1K | Patent expired |