PL195526B1

PL195526B1 - Sposób wytwarzania heparyny

Info

Publication number: PL195526B1
Application number: PL98338007A
Authority: PL
Inventors: Houdenhoven Francois Egbert Abraham Van; Adriamus Lambertus Maria Sanders; Zutphen Petrus Johannes Josephus Van
Original assignee: Organon Nv
Priority date: 1997-07-16
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2007-09-28
Also published as: DE69833205D1; NO320786B1; ZA986289B; AU739225B2; KR20010014387A; BR9810881A; HUP0003064A2; UY25097A1; CN1109048C; KR100515706B1; US6232093B1; CZ2000138A3; NO20000189D0; TW581814B; NO20000189L; ES2256954T3; IL133363A; CN1264391A; IL133363A0; TR200000086T2

Abstract

1. Sposób wytwarzania heparyny przez enzymatyczna hydrolize bialka z tkanki blony sluzowej ssaków w mieszaninie wodnej, znamienny tym, ze obejmuje nastepujace etapy: – dodanie enzymu proteolitycznego do tkanki blony sluzowej; – inkubowanie i mieszanie enzymu i blony sluzowej w temperaturze otoczenia w czasie od 2 do 8 godzin; – podniesienie temperatury mieszaniny do 50 - 75°C; oraz – inkubowanie tej mieszaniny w tym zakresie temperatury w czasie od 1 do 6 godzin. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania heparyny, który obejmuje uproszczony sposób usuwania białek występujących w tkance zwierzęcej będącej źródłem heparyny.

Heparyna jest bardzo skomplikowanym glikozaminoglikanem składającym się z naprzemiennych sekwencji różnie siarczanowanych reszt kwasu uronowego i α-D-glukozaminy powiązanych wiązaniami α i β (1-4). Wskutek złożoności tej pierwszorzędowej struktury heparyna jest polidyspersyjnym heteropolisacharydem, który jest silnie heterogenny pod względem ciężaru cząsteczkowego, właściwości fizyko-chemicznych i aktywności biologicznej.

Heparynę stosowano już od dłuższego czasu jako środek przeciwkrzepliwy i przeciwzakrzepowy w leczeniu i zapobieganiu zakrzepicy żylnej. Występuje ona w różnych tkankach zwierzęcych imożna ją otrzymywać przez wyodrębnianie z nich. Obecnie większą część heparyny stosowanej do powyższych celów wyodrębnia się z błony śluzowej jelit wieprzowych. Proces wyodrębniania obejmuje hydrolizę błony śluzowej, a następnie ekstrakcję heparyny.

W opisie patentowym USA nr 5607840 opisano sposób hydrolizy tkanki błony śluzowej. Sposób ten obejmuje hydrolizę wodnej mieszaniny zawierającej błonę śluzową ssaków za pomocą enzymu proteolitycznego w temperaturze około 55°C, adsorpcję polianionów do żywicy anionowymiennej i następnie odzyskiwanie anionów z żywicy i hydrolizatu białka z przetrawionego wodnego roztworu. Dla stabilizacji surowego materiału błony śluzowej i do zapobiegania wzrostowi bakterii do roztworu wprowadza się sole w postaci zmiatacza tlenu albo substancje bakteriobójcze.

Zawartość heparyny w wodnym środowisku zawierającym błony śluzowe jest bardzo niska i wzwiązku z tym należy przerabiać duże ilości tkanek błony śluzowej. Zatem ze względów ekono₃ micznych proces hydrolizy prowadzi się w reaktorach o objętości większej niż 50 m³. W czasie reakcji temperaturę utrzymuje się na stałym poziomie w ciągu ponad 24 godzin i mieszaninę miesza się energicznie, stosując skomplikowane wyposażenie.

Zazwyczaj instalacje do ekstrakcji heparyny nie są zlokalizowane w bliskiej odległości od rzeźni, gdzie gromadzi się błony śluzowe i konieczny jest transport na długich odległościach. Zwłaszcza wprzypadku większych odległości jest to przyczyną dostarczania do urządzeń produkcyjnych surowca o niskiej jakości i powoduje wzrost kosztów.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowej i prostej drogi wyodrębniania heparyny z tkanki błony śluzowej.

Sposób według wynalazku obejmuje następujące etapy:

- dodanie enzymu proteolitycznego do tkanki błony śluzowej;

- inkubowanie i mieszanie enzymu i błony śluzowej w temperaturze otoczenia w czasie od 2 do 8 godzin;

- podniesienie temperatury mieszaniny do 50-75°C; oraz

- inkubowanie tej mieszaniny w tym zakresie temperatury w czasie od 1do 6 godzin.

Etap „wstępnej hydrolizy” w temperaturze pokojowej polepsza znacznie wydajność proteolizy. Po podwyższeniu temperatury hydrolizę można kontynuować korzystnie w obecności substancji adsorbującej polianion w temperaturze poniżej 50°C. Trawienie można prowadzić w pojemnikach o średniej pojemności.

Proces ten ma tę zaletę, że można go prowadzić na względnie małą skalę. Proces ten nadajesię do prowadzenia w miejscach, gdzie produkowana jest surowa błona śluzowa i w związku z tym transport surowego materiału jest zbędny. Ponadto, nie są tu potrzebne żadne specjalne kwalifikacje.

Czas trwania inkubacji w temperaturze 50 - 75°C wynosi korzystnie mniej niż 4 godziny. Korzystnie czas inkubacji wynosi więcej niż 1godzinę. Temperaturę zwiększa się korzystnie do60-70°C.

Temperaturę można łatwo podwyższać drogą bezpośredniego dostarczania ciepła np. przez ogrzewanie pojemnika zawierającego wodny roztwór błony śluzowej. Na przykład temperaturę 60 - 70°C można szybko uzyskać za pomocą zwykłego płomienia gazowego, a także np. przez dodawanie pary. Tak uzyskaną temperaturę można utrzymywać drogą umiarkowanego ogrzewania w ciągu kilku godzin. Można też zewnętrzne doprowadzanie ciepła zatrzymać po osiągnięciu żądanej temperatury, pozostawiając mieszaninę w pojemniku do stopniowego ochładzania do temperatury otoczenia. Ze względu na stopniowe obniżanie temperatury mieszanina utrzymuje temperaturę około 50°C w cią-gu kilku godzin. I tak początkowo hydroliza białka zachodzi w temperaturze powyżej 50°C. Po usunięciu zewnętrznego źródła ciepła temperatura obniża się i hydroliza przebiega dalej w niższej temperaturze. Nie ma ograniczeń dla czasu inkubacji w obniżonej temperaturze, jednak korzystnie stosuje sięczas

PL 195 526 B1 inkubacji poniżej 24 godzin, a zwłaszcza inkubację prowadzi się w ciągu nocy. Kontynuowanie przedłużonej inkubacji w temperaturze pokojowej nie jest warunkiem zasadniczym, lecz okazuje się, że ma korzystny wpływ na wydajność heparyny. Podobnie stwierdzono, że etap „wstępnej inkubacji” w temperaturze pokojowej polepsza wydajność heparyny.

Jako reaktor można stosować np. pojemnik stalowy, lecz nie ma tu specjalnych wymagań.

Alternatywnie temperaturę można podwyższać przez dodawanie 1 - 3 objętości wodnego rozpuszczalnika o temperaturze 80- 100°C. Korzystnie stosuje się wodę, lecz można też stosować rozcieńczone roztwory soli. Korzystnie temperatura wody jest temperaturą wrzenia. W zależności od powiększania objętości wzrasta pojemność cieplna. W związku z tym temperaturę można utrzymywać na żądanym poziomie przez dostateczny czas, przy czym równocześnie następuje powoli proces ochładzania. Dodatkową zaletą dodawania wody jest zmniejszenie lepkości roztworu, co prowadzi do lepszej przesiewalności kompleksu adsorbent-heparyna, ważnej w procesie ekstrakcji heparyny. Ponieważ nie jest wymagane bezpośrednie ogrzewanie, można stosować pojemniki z różnych materiałów, np. z tworzyw sztucznych.

Dogodną drogą prowadzenia sposobu według wynalazku jest gromadzenie błon śluzowych w czasie dnia pracy i rozpoczynanie hydrolizy przez dodawanie enzymu proteolitycznego w czasie składowania surowego materiału w pojemniku. Pod koniec dnia temperaturę można podwyższać do 50-75°C i ewentualnie utrzymuje się ją na stałym poziomie w ciągu kilku godzin, a następnie prowadzi się inkubację przez noc, przy czym temperatura obniża się stopniowo do temperatury pokojowej.

Korzystnie mieszaninę miesza się w czasie procesu hydrolizy w celu uzyskania jednorodnego roztworu i w celu wytworzenia dobrego kontaktu pomiędzy adsorbentem i roztworem zawierającym heparynę.

Roztwór zawierający błonę śluzową można otrzymywać drogą dyspergowania tkanek zwierzęcych w wodzie. Tkanki można uzyskiwać np. od bydła, psów, świń i owiec. Tkanki mają składniki śródbłonowe lub śluzówkowe. Heparyna występuje np. w płucach, jelitach, skórze i wątrobie różnych zwierząt. Korzystnie stosuje się jelitową błonę śluzową pochodzenia wieprzowego.

Do reakcji można stosować wiele enzymów pod warunkiem, że wykazują aktywność proteolityczną. Odpowiednie enzymy są znane, np. proteazy z mikroorganizmów, trypsyna, chymotrypsyna. Odpowiednim enzymem do stosowania w procesie hydrolizy alkalicznej jest enzym dostępny w handlu pod nazwą maxatase^R. Stosunek enzymu do substratu wynosi zazwyczaj około 0,02- 0,2%. W sposobie według wynalazku można również dodawać środek konserwujący obecny zazwyczaj w roztworze tkanki błony śluzowej. Korzystnie jako środek konserwujący stosuje się pirosiarczyn sodu, lecz można też stosować inne środki konserwujące, takie jak np. propionian wapnia albo fenol. Ilość dodawanego pirosiarczynu wynosi około 0,5-5 kg na 100 litrów błony śluzowej. Środek konserwujący dodaje się korzystnie podczas gromadzenia tkanki błony śluzowej.

Wartość pH można doprowadzać do pH 7-9 za pomocą reagentu alkalicznego. Zazwyczaj dodaje się wodorotlenku sodu w ilości około 0,8-1,2 kg/100 litrów błony śluzowej. Najczęściej stosowane enzymy proteolityczne wykazują optymalną aktywność przy tej wartości pH. Doprowadzanie do tej wartości może następować podczas etapu „wstępnej hydrolizy”, jak również w czasie etapu inkubacji w wyższej temperaturze.

Korzystnie w sposobie według wynalazku można ekstrahować heparynę z hydrolizatu, dodając w czasie hydrolizy adsorbent w ilości wystarczającej do związania heparyny występującej w roztworze hydroliżującym. Korzystnie adsorbent dodaje się na początku procesu inkubacji w podwyższonej temperaturze.

Adsorbentem jest korzystnie żywica anionowymienna, którą dodaje się w ilości wystarczającej do związania polianionów występujących w roztworze błony śluzowej. Takie żywice anionowymienne są dostępne w handlu. Zazwyczaj dodaje się je w ilości 2 litrów na 100 litrów błony śluzowej. Do ekstrakcji heparyny z trawionego roztworu można również stosować adsorbenty powinowactwa specyficzne dla heparyny.

Całkowite stężenie soli w hydrolizacie powinno być dobrane w zakresie zapewniającym prawie ilościowy wychwyt przez żywicę, co jest ważne dla efektywności wiązania polianionów z żywicą jonowymienną i jest to na ogół stężenie 0,1- 0,5 molowe. Dodatkowo w czasie procesu hydrolizy do soli obecnych w błonie śluzowej zazwyczaj dodaje się również środki konserwujące i sole metali alkalicznych albo sole amonowe.

Po zakończeniu procesu hydrolizy adsorbent odsiewa się. Następnie zaadsorbowaną heparynę eluuje się za pomocą roztworu o wysokim stężeniu soli i heparynę poddaje się dalszej obróbce. Tak

PL 195 526 B1 więc sposób według wynalazku obejmuje sposób wyodrębniania heparyny przez dalsze etapy odsiewania adsorbentu z heparyną i eluowania heparyny z adsorbentu.

W celu zapewnienia optymalnego uzyskiwania heparyny pożądane jest, aby roztwór soli stosowany do eluowania wykazywał wystarczająco wysoką siłę jonową dla zapewnienia zasadniczo całkowitego uwolnienia heparyny z adsorbentu. Jedną z dróg odzyskiwania heparyny z kompleksu heparyny z substancją anionowymienną jest eluowanie za pomocą NaClw stężeniu 2-4 molowym.

Sposób według wynalazku umożliwia obróbkę niezaadsorbowanego materiału, to jest błony śluzowej, na miejscu wytwarzania, ponieważ sposób ten jest łatwy do przeprowadzenia i wymaga tylko minimalnego wyposażenia do prowadzenia hydrolizy. Tak więc sposób według wynalazku można prowadzić nawet w środowisku o niskim wyposażeniu technicznym z ubogą infrastrukturą.

Następujące przykłady bliżej wyjaśniają wynalazek i nie stanowią ograniczenia zakresu wynalazku.

Przykład 1

Do 250 kg wieprzowych błon śluzowych, stabilizowanych za pomocą 0,5% pirosiarczynu sodu, dodaje się 200 g maxatase^R i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej. Po upływie 4 godzin błony śluzowe ogrzewa się do temperatury 69°C za pomocą podgrzewacza na płomień gazowy w ciągu około 70 minut. Dodaje się NaOH (1500 g), uzyskując wartość pH 7,3 i dodaje się 3,5 litra wymieniacza anionowego. Następnie mieszaninę pozostawia się do ochłodzenia przez noc, mieszając. Wcelu ułatwienia oddzielania wymieniacza jonowego mieszaninę ogrzewa się następnego dnia przed odsiewaniem wymieniacza jonowego. Wymieniacz jonowy przemywa się 3,5% roztworem soli i eluuje za pomocą 14% roztworu soli. Eluowaną heparynę wytrąca się metanolem. Wydajność heparyny wynosi 36100 U/kg błon śluzowych w eluacie i 34300 U/kg w osadzie. Aktywność i jakość jest porównywalna z surową heparyną pochodzącą z procesu standardowego.

Przykład 2

Do 100 kg wieprzowych błon śluzowych, stabilizowanych za pomocą 1% pirosiarczynu sodu, dodaje się 80 g maxatase^R i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej. Po upływie 2 godzin błony śluzowe ogrzewa się do temperatury 65°C przez dodawanie 120 litrów wrzącej wody w ciągu około 10 minut. Wartość pH zmienia się przez dodanie 630 ml 33% roztworu NaOH (wartość zmierzona 7,3) i dodaje się 3,5 litra wymieniacza anionowego. Temperatura wyjściowa wynosi 65°C, po upływie 1 godziny temperatura wynosi 61°C, po upływie 2 godzin 56°C, a po upływie 3 godzin 52°C. Mieszaninę pozostawia się do ochłodzenia w ciągu nocy. Wymieniacz jonowy odsiewa się w temperaturze 28°C i przemyty wymieniacz jonowy eluuje się. Wydajność heparyny wynosi 30500 U/kg błon śluzowych w eluacie i 26400 U/kg w osadzie. Aktywność i jakość jest porównywalna z surową heparyną pochodzącą z procesu standardowego.

Przykład 3

Do 47,5 kg błon śluzowych, stabilizowanych za pomocą 0,5% pirosiarczynu sodu, dodaje się 80 g maxatase^R w temperaturze 30°C, mieszając. Po upływie 4 godzin dodaje się dodatkowo 55,5 kg błon śluzowych i mieszaninę miesza się w ciągu dalszych 2 godzin w temperaturze pokojowej (26°C). Następnie mieszaninę ogrzewa się w ciągu 40 minut do temperatury 65°C przez wprowadzanie gorącej pary do mieszaniny. Wartość pH doprowadza się do 7,2 za pomocą 550 g NaOH, po czym miesza się w ciągu 1 godziny i następnie dodaje się 1 litr wymieniacza jonowego. Wyjściowa temperatura wynosi 65°C, po upływie jednej godziny wynosi 62°C, a po upływie 2 godzin 53°C. Mieszaninę pozostawia się do ochłodzenia przez noc, przy czym temperatura wynosi wtedy 27°C. Wydajność heparyny wynosi 40000 U/kg w eluacie i 38700 U/kg w osadzie.

P r z y k ł a d 4

Do 3 kg wieprzowej błony śluzowej w izolowanej kolbie, stabilizowanej za pomocą 0,5% pirosiarczynu sodu, dodaje się 2,3 g maxatase^R i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej. Po upływie 5,5 godzin utrzymywania w temperaturze 30°C błony śluzowe ogrzewa się do temperatury 64°C przez dodawanie 5,4 litra wrzącej wody. Dodaje się 35 ml 33% roztworu NaOH, uzyskując wartość pH 7,6, po czym do daje się 110 ml wymieniacza anionowego. Następnie mieszaninę pozostawia się do ochłodzenia. Po upływie około 16 godzin temperatura wynosi 41°C i wymieniacz jonowy odsiewa się. Wydajność heparyny w eluacie wynosi 32200 U/kg błon śluzowych. Aktywność i jakość są porównywalne z surową heparyną pochodzącą z procesu standardowego.

Przykład 5

Do 115 kg wieprzowych błon śluzowych, stabilizowanych za pomocą 1% pirosiarczynu sodu, dodaje się 88 g maxatase^R i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej. Po upływie 2 godzin błony śluzowe ogrzewa się do temperatury 65°C przez dodawanie 133 litrów wrzącej wody w ciągu

PL 195 526 B1 około 10 minut. Wartość pH zmienia się przez dodawanie 880 g NaOH (pH 7,75) i dodaje się 4 litry wymieniacza anionowego. Następnie dodaje się 108 g maxatase^R. Wyjściowa temperatura wynosi 65°C, po upływie 1 godziny temperatura wynosi 60°C, po 2 godzinach temperatura wynosi 57°C, a po 3 godzinach 54°C. Po upływie 3 godzin wymieniacz jonowy odsiewa się. Wymieniacz jonowy przemywa się, następnie eluuje się i wytrąca się heparynę. Eluat heparyny zawiera 20500 U/kg błon śluzowych, a osad zawiera 17565 U/kg. Aktywność i jakość jest porównywalna z surową heparyną pochodzącą z procesu standardowego .

Przykład 6

Do 100 kg wieprzowych błon śluzowych, stabilizowanych za pomocą 1% pirosiarczynu sodu, dodaje się maxatase^R i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej. Następnie błony śluzowe ogrzewa się do temperatury 68°C za pomocą podgrzewacza na płomień gazowy w ciągu 60 minut. Dodaje się NaOH, uzyskując wartość pH 7,2. Następnie dodaje się 2,1 litra wymieniacza anionowego. Następnie mieszaninę chłodzi się do chwili, gdy temperatura opadnie poniżej 60°C, po czym stosuje się dodatkowe ogrzewanie, utrzymując temperaturę powyżej 60°C. Po upływie 3 godzin wymieniacz jonowy odsiewa się. Wymieniacz jonowy przemywa się i przechowuje w temperaturze 5°C w celu przetransportowania do zakładu przetwórczego.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania heparyny przez enzymatyczną hydrolizę białka z tkanki błony śluzowej ssaków w mieszaninie wodnej, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

- dodanie enzymu proteolitycznego do tkanki błony śluzowej;

- inkubowanie i mieszanie enzymu i błony śluzowej w temperaturze otoczenia w czasie od 2 do 8 godzin;

- podniesienie temperatury mieszaniny do 50 - 75°C; oraz

- inkubowanie tej mieszaniny w tym zakresie temperatury w czasie od 1 do 6 godzin.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inkubację w temperaturze 50 - 75°C prowadzi się w czasie od 1-4 godzin.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperaturę podwyższa się do 60 - 70°C.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że po podniesieniu temperatury obejmuje dalsze inkubowanie, podczas którego roztwór oziębia się do temperatury otoczenia.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że temperaturę podwyższa się przez bezpośrednie dostarczanie ciepła.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że temperaturę podwyższa się przez dodawanie 1 - 3 objętości wodnego rozpuszczalnika o temperaturze w zakresie 80 - 100°C do wodnej mieszaniny zawierającej tkankę błony śluzowej.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako wodny rozpuszczalnik stosuje się wrzącą wodę.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do mieszaniny w czasie hydrolizy dodaje się adsorbent w ilości wystarczającej do związania heparyny występującej w roztworze hydrolizującym.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że obejmuje dalsze etapy odsiewania adsorbenta wraz z heparyną i odzyskiwania heparyny z adsorbenta.