HU225240B1 - Process for the production of heparin - Google Patents
Process for the production of heparin Download PDFInfo
- Publication number
- HU225240B1 HU225240B1 HU0003064A HUP0003064A HU225240B1 HU 225240 B1 HU225240 B1 HU 225240B1 HU 0003064 A HU0003064 A HU 0003064A HU P0003064 A HUP0003064 A HU P0003064A HU 225240 B1 HU225240 B1 HU 225240B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- heparin
- temperature
- hours
- mixture
- added
- Prior art date
Links
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 title claims description 48
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 title claims description 48
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 27
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 14
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 13
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 25
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 8
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 5
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 5
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000004296 sodium metabisulphite Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- BCZXFFBUYPCTSJ-UHFFFAOYSA-L Calcium propionate Chemical compound [Ca+2].CCC([O-])=O.CCC([O-])=O BCZXFFBUYPCTSJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 238000010793 Steam injection (oil industry) Methods 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UKFBFLRUSA-N alpha-D-glucosamine Chemical group N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-UKFBFLRUSA-N 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940127090 anticoagulant agent Drugs 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 235000010331 calcium propionate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004330 calcium propionate Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000003635 deoxygenating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A találmány heparin előállítására vonatkozik. Közelebbről, a találmány heparinforrásként szolgáló állati szövetekben jelen lévő fehérjék kivonására szolgáló egyszerűsített eljárásra vonatkozik.
A heparin egy nagyon bonyolult glükózaminoglikán-származék, amely különbözőképpen szulfatált uronsav és a és β (1-4) kötésekkel összekötött α-D-glükózamin-csoportok alternáló szekvenciáiból épül fel. Primer szerkezetének bonyolultsága miatt a heparin egy polidiszperz heteropoliszacharid, amely molekulatömeg, fizikokémiai tulajdonságok és biológiai aktivitás szempontjából rendkívül heterogén.
A heparint már hosszú ideje használják antikoagulánsként és antitrombotikus anyagként vénás trombózis kezelésére és megelőzésére. Számos állati szövetben jelen van, és ezekből izolálással állítható elő. Az ilyen célokra alkalmazott heparin nagy részét jelenleg sertés-bélnyálkahártyából izolálják. Az izolálási eljárás során a nyálkahártyát hidrolizálják, majd a heparint extrahálják.
Az 5 607 840 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amelyet itt referenciaként adunk meg, a nyálkahártyaszövet hidrolízisére vonatkozó eljárást ismertettek. Az eljárás során emlősből származó nyálkahártyát tartalmazó vizes keveréket proteolitikus enzimmel hidrolizáltak körülbelül 55 °C-on, majd a polianionokat egy anioncserélő gyantán adszorbeáltatták, ezután a gyantáról az anionokat és a kezelt vizes oldatból a fehérjehidrolizátumot kinyerték. A nyers nyálkahártya stabilizálására és a baktériumok szaporodásának megelőzésére az oldathoz egy só formájú oxigénmentesítő szert vagy bakteriocidet adagoltak.
A nyálkahártya-tartalmú vizes közeg heparintartalma nagyon kicsi, ennek következtében nagy mennyiségű nyálkahártyaszövetet kell feldolgozni. Ezért gazdasági okokból a hidrolíziseljárást 50 m3-nél nagyobb reakcióedényben végzik. A reakció folyamán a hőmérsékletet több mint 24 órán át állandó értéken tartják, és a keveréket egy korszerű berendezéssel erősen keverik.
A heparinextraháló üzemek a vágóhidaktól nem kis távolságra vannak, ezért a nyálkahártyát nagy távolságról kell begyűjteni és szállítani. Ez különösen a távoli területek esetében azzal jár, hogy az előállító üzembe gyenge minőségű anyag kerül, ami növeli a költségeket.
A 4 216 293 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban állati szövetekből származó proteázinhibitorok enzimes bontási eljárással végzett extrakcióját ismertették. Az eljárás során először a szövettek) vizes keverékét legalább egy proteolitikus enzimmel körülbelül 40 °C-ra, ezután adott esetben 60 °C-ra, végül 90 °C-ra melegítették. Habár az eljárás a proteázinhibitorok előállítására vonatkozott, az ilyen eljárás a heparinnak egy közbenső frakcióból történő extrakciójára is alkalmas.
Találmányunk tárgyát a heparin nyálkahártyaszövetből történő izolálására vonatkozó új, egyszerű eljárás kidolgozása képezi. Felismertük, hogy emlősből származó nyálkahártyaszövetet tartalmazó vizes keverékben a fehérje proteolitikus enzimmel körülbelül °C és 75 °C közötti hőmérsékleten 6 órán belül lebontható. A kezelés előtt egy szobahőmérsékleten végzett egyszerű „előhidrolizálási” lépés beiktatásával láthatóan jelentősen javul a proteolízis hatékonysága. Az emelt hőmérsékleten végzett kezelés után a hidrolízis tovább folytatható, előnyösen egy polianion adszorbens anyag jelenlétében, 50 °C alatti hőmérsékleten. A kezelés közepes kapacitású tartályokban végezhető.
A találmányunk szerinti eljárás a következő lépéseket foglalja magában:
a nyálkahártyaszövethez proteolitikus enzimet adunk;
az enzimet és a szövetet szobahőmérsékleten 2 óra és 8 óra közötti időtartamig inkubáljuk és keverjük;
a keverék hőmérsékletét 50 °C és 75 °C közé emeljük; és a keveréket ilyen hőmérséklet-tartományban inkubáljuk 1 óra és 6 óra közötti időtartamig.
Az eljárás előnye, hogy viszonylag kis mennyiségben végezhető. Az eljárás nagyon jól kivitelezhető a nyers nyálkahártya előállítási helyén, így a nyersanyag szállítására nincs szükség. Ezen túlmenően nem igényel speciális szakértelmet.
A találmányunk szerinti eljárás során az alábbi inkubálási lépést is végrehajthatjuk:
az emelt hőmérsékleten végzett kezelés után tovább inkubáljuk, miközben az oldatot szobahőmérsékletre hagyjuk hűlni.
Az inkubálási idő 50 °C és 75 °C közötti hőmérsékleten előnyösen 4 óránál rövidebb. Az inkubálási idő 1 óránál hosszabb. A hőmérsékletet előnyösen körülbelül 60 °C és 70 °C közötti értékre emeljük.
A hőmérséklet könnyen emelhető a vizes nyálkahártyaoldatot tartalmazó tartály hevítésével. Például a 60 °C és 70 °C közötti hőmérséklet gyorsan elérhető szokásos módon gázlánggal vagy például gőz bevezetésével. Az elért hőmérsékletet mérsékelt keverés mellett néhány órán át fenntarthatjuk. Egy másik megoldás szerint a külső hőátadást megszüntetjük, amint elérjük a kívánt hőmérsékletet, és a keveréket a tartályban folyamatosan hagyjuk lehűlni. A fokozatos hőmérséklet-csökkenés következtében a keverék hőmérséklete néhány órán át 50 °C fölött marad. így a fehérje hidrolízise 50 °C felett végbemegy. A külső hőforrás eltávolítása után a hőmérséklet csökken, és a hidrolízis alacsonyabb hőmérsékleten folytatódik. A csökkenő hőmérsékleten végzett inkubálás időtartama nincs korlátozva, azonban előnyösen az inkubációs idő 24 óránál rövidebb, előnyösebben az inkubálási egy éjszakán át végezzük. A szobahőmérsékleten végzett nyújtott időtartamú inkubálás nem feltétel, azonban kimutatható, hogy befolyásolja a heparin kitermelését. Kimutattuk azt is, hogy a szobahőmérsékleten végzett „előinkubálási” lépés is javítja a heparin kitermelését.
A reakcióedény lehet például egy acéltartály, azonban ezzel kapcsolatban nincsenek speciális követelmények.
Egy másik megoldás szerint a hőmérsékletet 1-3 térfogat 80 °C és 100 °C közötti hőmérsékletű vi2
HU 225 240 Β1 zes oldat hozzáadásával emelhetjük. Előnyösen vizet használunk, azonban híg sóoldat is használható. A víz előnyösen forrásban van. A térfogat növekedésével a hőkapacitás nő. Ezért a hőmérsékletet elegendően hosszú ideig a kívánt értéken tarthatjuk, ezzel egyidejűleg a lehűtést lassítjuk. A víz hozzáadásának további előnye, hogy az oldat viszkozitása csökken, ezáltal az adszorbens-heparin komplex jobban szűrhető, ami a heparin extrakciója szempontjából fontos. Mivel a tartályt nem szükséges közvetlenül hevíteni, különböző anyagokból, például műanyagból is készülhet.
A találmányunk szerinti eljárás során a nyálkahártyát rendszerint a munkanap folyamán összegyűjtjük, és a tartályban tárolt nyersanyaghoz proteolitikus enzimet adunk, ezzel kezdjük meg a hidrolízist. A nap végén a hőmérsékletet 50 °C és 75 °C közötti értékre emeljük, és adott esetben néhány órán át ezen az állandó értéken tartjuk, majd egy éjszakán át tovább inkubáljuk, miközben a hőmérséklet fokozatosan szobahőmérsékletre csökken.
Előnyös, ha a hidrolízis folyamán a keveréket keverjük, ezáltal homogén oldatot állítunk elő, amelyben az adszorbens és a heparintartalmú oldat jobban érintkezik.
A nyálkahártya-tartalmú oldatot az állati szövetek vízben való diszpergálásával állíthatjuk elő. A szöveteket nyerhetjük például marhából, kutyából, sertésből vagy birkából. A szövetek endotélium- és nyálkahártya-komponensekből állnak. A heparin jelen van például a különböző állatok tüdejében, belében, bőrében és májában. Előnyösen sertéseredetű bélnyálkahártyát használunk.
Nagyon sokféle enzimet alkalmazhatunk az eljárásban, feltéve, hogy azok proteolitikus aktivitást mutatnak. A megfelelő enzimek jól ismertek a szakirodalomban, ilyenek például a mikrobaproteáz, a tripszin vagy a kimotripszin. Alkalikus hidrolízissel jól alkalmazható a kereskedelemben maxatase® márkanéven beszerezhető enzim. Az enzim-szubsztrát arány általában körülbelül 0,02% és 0,2% közötti. A nyálkahártyaszövet-oldatban rendszerint jelen levő tartósítószer adagolható a találmányunk szerinti eljárás során. Előnyösen nátrium-metabiszulfit tartósítószert alkalmazunk, azonban más tartósítószerek, például kalcium-propionát vagy fenol is megfelelő. A biszulfitot 100 I nyálkahártyára számítva körülbelül 0,5 kg és 5 kg közötti mennyiségben adagoljuk. A tartósítószert leginkább a nyálkahártyaszövet begyűjtése során adagoljuk.
A kémhatást egy lúgos reagenssel pH 7 és 9 közötti értékre állíthatjuk be. Általában nátrium-hidroxidot adagolunk 100 I nyálkahártyára számítva körülbelül 0,8 kg és 1,2 kg közötti mennyiségben. A szokásosan alkalmazott proteolitikus enzimek optimális aktivitásukat ilyen pH-η fejtik ki. A pH-beállítást végezhetjük az „előhidrolizálási” lépésben vagy a magasabb hőmérsékleten végzett inkubálási lépésben.
Találmányunk kiterjed a heparin izolálási eljárására is. A találmányunk szerinti hidrolizálási eljárásban nagyon fontos a heparin izolálása. A heparint extrahálhatjuk a hidrolizátumból, ha a keverékhez adszorbenst adagolunk a hidrolizálóoldatban jelen lévő heparin megkötésére az egy vagy több inkubálási lépés folyamán. Előnyösen az adszorbenst a magasabb hőmérsékleten végzett inkubálás elején adagoljuk.
Adszorbensként előnyösen egy anioncserélő gyantát használunk, amelyet a nyálkahártyaoldatban jelen lévő polianionok megkötéséhez szükséges mennyiségben adagolunk. Az anioncserélő gyanták a kereskedelemben beszerezhetők. 100 I nyálkahártyára számítva általában 2 I mennyiséget adagolunk. Egy heparinspecifikus affinitás adszorbenst is használhatunk a heparinnak az oldatból történő extrahálására.
A hidrolizátum teljes sókoncentrációját olyan tartományba állítjuk be, amivel a majdnem kvantitatív gyantafelvétel biztosítható, ami a polianionok ioncserélő gyantához való kötődésének hatékonysága szempontjából fontos, és általában 0,1 mól és 0,5 mól közötti érték. A nyálkahártyában jelen lévő sók mellett általában tartósítószereket és alkálifémsókat vagy ammóniumsókat is adagolunk a hidrolízis során.
A hidrolízis befejeződése után az adszorbenst kiszűrjük. Ezután az adszorbeálódott heparint nagy koncentrációjú sóoldattal eluáljuk, és a heparint feldolgozzuk. Ennek megfelelően találmányunk kiterjed a heparin izolálási eljárására is, amely a heparint tartalmazó adszorbens szűrését és a heparin adszorbensről történő eluálását foglalja magában.
A heparin optimális kinyerésének biztosításához az szükséges, hogy az elúcióhoz megfelelően nagy ionerősségű sóoldatot használjunk, amivel biztosítjuk a heparin lényegében teljes eltávolítását az adszorbensről. A heparin-anioncserélő gyanta komplexből a heparin eltávolításának egyik módja a 2 mol/l és 4 mol/l közötti koncentrációjú nátrium-klorid-oldattal végzett eluálás.
Nyilvánvaló, hogy a találmányunk szerinti eljárással a nem adszorbeált anyag, azaz a nyálkahártya feldolgozható az előállítás helyén, mivel az eljárás könnyen végrehajtható, és a hidrolízissel kapcsolatos berendezésigény minimális. Ezért a találmányunk szerinti eljárás végrehajtható gyenge infrastruktúrával rendelkező, alacsony technikai színvonalú környezetben is.
Találmányunkat az alábbi példákban kívánjuk bemutatni anélkül, hogy találmányunk oltalmi körét a bemutatott példákra korlátoznánk.
Példák
1. példa
250 kg 0,5% nátrium-metabiszulfittal stabilizált sertésnyálkahártyához 200 g maxatase®-t adunk, és a keveréket szobahőmérsékleten keverjük. 4 óra elteltével a nyálkahártyát 69 °C-ra melegítjük gázlánggal körülbelül 70 perc alatt. 1500 g nátrium-hidroxidot adunk hozzá, ezzel a pH-t 7,3 értékre állítjuk be, és 3,5 I anioncserélő gyantát adagolunk. Ezután a keveréket egy éjszakán át keverés közben hűlni hagyjuk. Az ioncserélő elválasztására a keveréket következő nap az ioncserélő szűrése előtt felmelegítjük. Az ioncserélőt 3,5%-os sóoldattal mossuk, és 14%-os sóoldattal
HU 225 240 Β1 eluáljuk. Az eluált heparint metanollal kicsapjuk. A heparin kitermelése 1 kg nyálkahártyára számítva 36 100 U/kg az eluátumban és 34 300 U/kg a csapadékban. Aktivitása és a minősége összehasonlítható a szokásos eljárásokkal előállított nyers heparinéval.
2. példa
100 kg 1%-os nátrium-metabiszulfittal stabilizált sertésnyálkahártyához 80 g maxatase®-t adunk, és a keveréket szobahőmérsékleten keverjük. 2 óra elteltével a nyálkahártyát 65 °C-ra hevítjük 120 I forró víz körülbelül 10 perc alatt történő hozzáadásával. A pH-t 630 ml 33%-os nátrium-hidroxid-oldattal pH 7,3 értékre állítjuk be, és 3,5 I anioncserélőt adunk hozzá. A kezdeti hőmérséklet 65 °C, ez 1 óra múlva 61 °C-ra, 2 óra múlva 56 °C-ra és 3 óra múlva 52 °C-ra csökken. A keveréket egy éjszakán át hagyjuk hűlni. Az ioncserélőt 28 °C-on kiszűrjük, és a mosott ioncserélőt eluáljuk. 1 kg nyálkahártyára számítva a heparin kitermelése az eluátumban 30 500 U/kg és a csapadékban 26 400 U/kg. Aktivitása és a minősége összehasonlítható a szokásos eljárásokkal előállított nyers heparinéval.
3. példa
47,5 kg 0,5% nátrium-metabiszulfittal stabilizált nyálkahártyához 80 g maxatase®-t adunk 30 °C hőmérsékleten keverés közben. 4 óra elteltével további
55,5 kg nyálkahártyát adunk hozzá, és a keveréket további 2 órán át keverjük szobahőmérsékleten (26 °C-on). Ezután a keveréket 40 perc alatt 65 °C-ra emeljük a keverékbe gőz bevezetésével. A kémhatást 550 g nátrium-hidroxid hozzáadásával pH 7,2 értékre állítjuk be, és 1 óra keverés után 1 I ioncserélőt adunk hozzá. A kiindulási hőmérséklet 65 °C, 1 óra után ez 62 °C és 2 óra után 53 °C. A keveréket egy éjszakán át hagyjuk hűlni, 27 °C hőmérsékletig. A heparin kitermelése 40 000 U/kg az eluátumban és 38 700 U/kg a csapadékban.
4. példa
Egy szigetelt lombikban 3 kg 0,5% nátrium-metabiszulfittal stabilizált sertésnyálkahártyához 2,3 g maxatase®-t adunk, és a keveréket szobahőmérsékleten keverjük. 5,5 óra elteltével a 30 °C-os nyálkahártyát 64 °C-ra hevítjük 5,4 I forrásban lévő víz hozzáadásával. 35 ml 33%-os nátrium-hidroxid-oldatot adunk hozzá, ezzel a kémhatást pH 7,6 értékre állítjuk be, és 110 ml anioncserélőt adagolunk. Ekkor a keveréket hűlni hagyjuk. Körülbelül 16 óra elteltével a hőmérséklet 41 °C, ekkor az ioncserélőt kiszűrjük. 1 kg nyálkahártyára számítva a heparin kitermelése az eluátumban 32 200 U/kg. Aktivitása és a minősége összehasonlítható a szokásos eljárásokkal előállított nyers heparinéval.
5. példa
115 kg 1%-os nátrium-metabiszulfittal stabilizált sertésnyálkahártyához 88 g maxatase®-t adunk, és a keveréket szobahőmérsékleten keverjük. 2 óra elteltével a nyálkahártyát 65 °C-ra hevítjük 10 perc alatt 133 I forrásban lévő víz hozzáadásával. A kémhatást 880 g nátrium-hidroxid hozzáadásával pH 7,75 értékre állítjuk be, és 4 I anioncserélőt adagolunk. Ezután 108 g maxatase®-t adunk hozzá. A kezdeti hőmérséklet 65 °C, egy óra után 60 °C, két óra után 57 °C és három óra után 54 °C. 3 óra elteltével az ioncserélőt kiszűrjük. A mosott ioncserélőt eluáljuk, és a heparint kicsapjuk. 1 kg nyálkahártyára számítva a heparineluátum 20 500 U/kg-ot és a csapadék 17 565 U/kg-ot tartalmaz. Aktivitása és a minősége összehasonlítható a szokásos eljárásokkal előállított nyers heparinéval.
6. példa
100 kg 1%-os nátrium-metabiszulfittal stabilizált sertésnyálkahártyához maxatase®-t adunk, és a keveréket szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a nyálkahártyát gázlánggal 60 perc alatt 68 °C-ra hevítjük. Nátrium-hidroxid hozzáadásával a pH-t 7,2 értékre állítjuk be. Ezután 2,1 I anioncserélőt adagolunk. A keveréket állni hagyjuk, amíg a hőmérséklet 60 °C alá hűl, majd további hevítést alkalmazunk, ezzel a hőmérsékletet 60 °C fölött tartjuk. 3 óra elteltével az ioncserélőt kiszűrjük. Az ioncserélőt mossuk és 5 °C-on tároljuk a feldolgozóüzembe szállításhoz.
Claims (8)
1. Eljárás heparin előállítására emlős-nyálkahártyaszövetből származó fehérjének vizes keverékben végzett enzimes hidrolízisével, azzal jellemezve, hogy a nyálkahártyaszövethez proteolitikus enzimet adunk;
az enzimet és a szövetet szobahőmérsékleten 2 óra és 8 óra közötti időtartamig inkubáljuk és keverjük;
a keverék hőmérsékletét 50 °C és 75 °C közé emeljük; és a keveréket ilyen hőmérséklet-tartományban inkubáljuk 1 óra és 6 óra közötti időtartamig; és a hidrolízis folyamán a keverékhez a hidrolizálóoldatban jelen lévő heparin megkötéséhez szükséges mennyiségű adszorbenst adagolunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 50 °C és 75 °C közötti hőmérsékleten 1 óra és 4 óra közötti inkubációs időt alkalmazunk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hőmérsékletet 60 °C és 70 °C közé emeljük.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az emelt hőmérsékleten végzett kezelés után az inkubálást tovább folytatjuk, miközben az oldatot szobahőmérsékletre hagyjuk hűlni.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hőmérséklet emelését közvetlen hőátadással végezzük.
6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hőmérsékletet úgy emeljük,
HU 225 240 Β1 hogy a nyálkahártyaszövetet tartalmazó vizes keverékhez 1-3 térfogat 80 °C és 100 °C közötti hőmérsékletű vizes oldószert adunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizes oldószerként forró vizet használunk. 5
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy további lépésben a heparint tartalmazó adszorbenst kiszűrjük, és a heparint az adszorbensről visszanyerjük.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97202213 | 1997-07-16 | ||
| PCT/EP1998/004939 WO1999003893A1 (en) | 1997-07-16 | 1998-07-09 | Process for the production of heparin |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0003064A2 HUP0003064A2 (hu) | 2000-12-28 |
| HUP0003064A3 HUP0003064A3 (en) | 2003-01-28 |
| HU225240B1 true HU225240B1 (en) | 2006-08-28 |
Family
ID=8228564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0003064A HU225240B1 (en) | 1997-07-16 | 1998-07-09 | Process for the production of heparin |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6232093B1 (hu) |
| EP (1) | EP0996642B1 (hu) |
| JP (1) | JP4455680B2 (hu) |
| KR (1) | KR100515706B1 (hu) |
| CN (1) | CN1109048C (hu) |
| AR (1) | AR013223A1 (hu) |
| AT (1) | ATE315588T1 (hu) |
| AU (1) | AU739225B2 (hu) |
| BR (1) | BR9810881B1 (hu) |
| CA (1) | CA2294780C (hu) |
| CZ (1) | CZ299281B6 (hu) |
| DE (1) | DE69833205T2 (hu) |
| DK (1) | DK0996642T3 (hu) |
| ES (1) | ES2256954T3 (hu) |
| HR (1) | HRP980399B1 (hu) |
| HU (1) | HU225240B1 (hu) |
| IL (1) | IL133363A (hu) |
| NO (1) | NO320786B1 (hu) |
| PL (1) | PL195526B1 (hu) |
| TR (1) | TR200000086T2 (hu) |
| TW (1) | TW581814B (hu) |
| UY (1) | UY25097A1 (hu) |
| WO (1) | WO1999003893A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA986289B (hu) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2284535A1 (en) * | 2002-03-11 | 2011-02-16 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Low molecular weight heparins |
| KR20050012816A (ko) | 2002-06-19 | 2005-02-02 | 캔 테크놀로지스 인코포레이티드 | 점막 부산물을 포함하는 동물 사료 조성물 |
| US6933372B2 (en) * | 2003-03-07 | 2005-08-23 | Warner-Lambert Company | Method to produce a solid form of heparin |
| CN100425624C (zh) * | 2006-05-11 | 2008-10-15 | 中国农业大学 | 一种同步提取肝素钠和猪肠粘膜抗菌肽的方法 |
| CN100439402C (zh) * | 2006-10-12 | 2008-12-03 | 孙红 | 采用卵磷脂液膜分离法提取肝素的方法 |
| US9139876B1 (en) | 2007-05-03 | 2015-09-22 | Momenta Pharmacueticals, Inc. | Method of analyzing a preparation of a low molecular weight heparin |
| WO2010110654A1 (en) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Van Hessen Bv | Method for preparation of heparin from mucosa |
| CN102791742B (zh) * | 2010-01-19 | 2014-12-24 | 动量制药公司 | 评价肝素制剂 |
| WO2012115952A1 (en) | 2011-02-21 | 2012-08-30 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Evaluating heparin preparations |
| KR101447123B1 (ko) | 2014-02-27 | 2014-10-06 | 박상협 | 헤파린의 추출 방법 |
| CN104086672A (zh) * | 2014-06-10 | 2014-10-08 | 安徽申奥生物科技有限公司 | 一种粗品肝素钠的生产方法 |
| WO2020013346A1 (en) | 2018-07-11 | 2020-01-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for enzymatic sulfurylation of alcohols and amines using bacterium of the family enterobacteriaceae |
| KR102180261B1 (ko) * | 2019-03-19 | 2020-11-18 | 중앙대학교 산학협력단 | 돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 방법 |
| KR102104367B1 (ko) | 2019-09-02 | 2020-04-24 | 팜앤바이오 주식회사 | 헤파린나트륨의 제조장치 및 제조방법 |
| CN115028757A (zh) * | 2022-06-29 | 2022-09-09 | 江苏麦德森制药有限公司 | 一种肝素钠的脱色方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH617963A5 (hu) * | 1973-10-05 | 1980-06-30 | Derivati Organici Lab | |
| HU177887B (en) * | 1979-03-21 | 1982-01-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for preparing a raw material containing heparin |
| EP0421508B1 (en) * | 1989-10-04 | 1993-12-15 | Akzo Nobel N.V. | Sulphated glycosaminoglycuronan with antithrombotic activity |
| AU5681094A (en) * | 1992-11-30 | 1994-06-22 | Celsus, Inc. | Protein hydrolysate derived from mucosal tissue |
-
1998
- 1998-07-09 EP EP98942666A patent/EP0996642B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 WO PCT/EP1998/004939 patent/WO1999003893A1/en active IP Right Grant
- 1998-07-09 ES ES98942666T patent/ES2256954T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 IL IL13336398A patent/IL133363A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 AT AT98942666T patent/ATE315588T1/de active
- 1998-07-09 DK DK98942666T patent/DK0996642T3/da active
- 1998-07-09 DE DE69833205T patent/DE69833205T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 AU AU90715/98A patent/AU739225B2/en not_active Expired
- 1998-07-09 KR KR10-1999-7012554A patent/KR100515706B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 CA CA2294780A patent/CA2294780C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 CZ CZ20000138A patent/CZ299281B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 JP JP50645999A patent/JP4455680B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 HU HU0003064A patent/HU225240B1/hu unknown
- 1998-07-09 PL PL98338007A patent/PL195526B1/pl unknown
- 1998-07-09 BR BRPI9810881-6A patent/BR9810881B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 TR TR2000/00086T patent/TR200000086T2/xx unknown
- 1998-07-09 CN CN98807195A patent/CN1109048C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 US US09/462,223 patent/US6232093B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-15 ZA ZA986289A patent/ZA986289B/xx unknown
- 1998-07-16 AR ARP980103468A patent/AR013223A1/es active IP Right Grant
- 1998-07-16 UY UY25097A patent/UY25097A1/es not_active IP Right Cessation
- 1998-07-16 HR HR980399A patent/HRP980399B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-07-16 TW TW087111617A patent/TW581814B/zh not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-01-14 NO NO20000189A patent/NO320786B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU225240B1 (en) | Process for the production of heparin | |
| US5607840A (en) | Protein hydrolysate derived from mucosa tissue | |
| JP2587268B2 (ja) | 低粘度ヒアルロン酸又はその塩の製造方法 | |
| WO2023082523A1 (zh) | 一种提高罗非鱼头骨制备硫酸软骨素提取率的方法 | |
| US4024000A (en) | Stabilization of β-amylase in aqueous medium | |
| JPS61233A (ja) | 水溶性乳漿蛋白質水解物の製造方法 | |
| US4283530A (en) | Process for the preparation of heparin | |
| JPH08140585A (ja) | 低分子馬鈴薯蛋白質の製造方法 | |
| MXPA00000579A (en) | Process for the production of heparin | |
| JP2021138660A (ja) | 鮭鼻軟骨からのプロテオグリカン抽出方法 | |
| CA1132904A (en) | Process for the recovery of heparin | |
| JPS5959189A (ja) | 新規なアルカリプロテア−ゼ | |
| RU2262859C2 (ru) | Способ получения ферментативного гидролизата на основе белков рыб | |
| CN111548433B (zh) | 一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法 | |
| EP0059182B1 (en) | A process for isolating aminoacylase enzyme from a mammal kidney extract | |
| SU975797A1 (ru) | Способ выделени лейцинаминопептидазы из aSpeRGILLUS oRYZae | |
| SU1717072A1 (ru) | Способ получени гидролизата из форменных элементов крови | |
| JPH01317391A (ja) | Ｄ―β―ヒドロキシアミノ酸を取得する方法 | |
| JPH01115903A (ja) | ヒアルロン酸の製造方法 | |
| JPH06141880A (ja) | Ｃｍｐ−ｋｄｎの合成方法 | |
| JPH05276972A (ja) | ヒアルロン酸の製造法 | |
| JPH08109364A (ja) | ゲル化剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: N.V. ORGANON, NL Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO NOBEL N.V., NL |
|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: MSD OSS B.V., NL Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO NOBEL N.V., NL; N.V. ORGANON,, NL |
|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: MERCK SHARP & DOHME B.V., NL Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO NOBEL N.V., NL; MSD OSS B.V., NL; N.V. ORGANON,, NL |