TW581814B - Process for the production of heparin - Google Patents

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經漓部中央標率局貝工消費合作社印繁 581814 A7 五、發明説明（1 ) 本發明係關於肝素之製法，更確定地說，其係關於將 肝素動物組織來源中存在的蛋白質去除之簡單方法。 肝素爲一種非常複雜之聚葡萄糖胺，由經α及/3 (1 - 4)鍵連接之糖醛酸及α - D -葡萄糖胺之不同硫酸化 殘基之交替順序組成，尤其其主要結構之複雜性，肝素爲 一種多分散性的雜多糖類，其有非常複雜的分子量、物理 -化學性質及生物活性。 很久以來就已經使用肝素作爲抗凝聚劑及抗血栓劑， 供治療及預防靜脈血栓，其存在於多種動物組織中且可得 自從其中分離，目前大部分供這些目的使用之肝素是從豬 腸黏膜分離，分離步驟包括水解黏膜後萃取肝素。 倂於本文供參考之美國專利5，6 0 7，8 4 0揭示 水解黏膜組織之方法，此方法包括用蛋白分解酵素在約5 5 °C之溫度下，水解含哺乳動物黏膜之水性混合物，將多 元陰離子吸附在陰離子交換樹脂，隨後從樹脂及消化水溶 液之蛋白質水解物回收陰離子，爲了安定原始的黏膜物質 及預防細菌腸長，在溶液中加入氧去除劑或殺菌劑形式之 鹽類。 在含黏膜的水性介質中，肝素含量非常低，因此必須 處理大量的黏膜組織，所乙基於經濟因素，水解法是在大 於50立方米之反應容器中進行，在反應期間，溫度保持 在定値超過2 4小時且用先進的設備激烈攪拌混合物。 通常肝素萃取廠與收集黏膜之屠宰場的距離不會太短 且需要長距離之運送，尤其是在偏遠的地方，此導致製造 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格(210X 297公龄）一4麵 … (讀先閱讀背面之注意事項界填寫本頁)

經漓部中央標隼局貝工消費合作社印聚 581814 A7 B7 五、發明説明（2 ) 工廠運送少量的物質且增加成本。 本發明提供一種新穎且容易的方法從黏膜組織分離肝 素，頃經發現在含哺乳動物黏膜組織水性混合物中的蛋白 質，也可用蛋白分解酵素在5 0 - 7 5°C下約6小時將其 消化，可視需要包括在環境溫度下的簡單 ''預水解〃步驟 ，此顯示可明顯地改進水解效應，提高溫度後，較宜在多 元陰離子吸附物質存在下，在低於5 0 °C之溫度持續水解 ,可在中等含量之容器中進行消化。 因此，根據本發明之方法包括提昇黏膜之溫度至約 5 0 - 7 5°C及使黏膜在該溫度範圍內及在蛋白分解酵素 存在下大約培養6小時之步驟。 本方法之優點是可在相當小的規模下進行，本方法非 常適合在生產原始的黏膜物質且因此不需要運送原料之地 方進行，而且不需要特殊之技術。 根據本發明，可在方法中包括一或同時兩個下列的培 養步驟： a) 提昇溫度前，在環境溫度下於容器中培養混合 物至多約8小時， b) 提昇溫度後進一步培養，同時使溶液冷卻至環 境溫度。 在5 0 - 7 5 t之培養時間較宜少於4小時，培養時 間較宜大於1小時，溫度較宜提昇至約6 0 — 7 0 °C。 經由直接加熱含黏膜水溶液之容器而輕易地提昇溫度 ，例如，用一般的天然氣火燄以及例如加入蒸氣，可使溫 本紙張尺度適用中國國家標準（0奶丁八4规格(210X 297^'^ ) (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經满部中央標準局員工消費合作社印製 581814 A7 ____ 五、發明説明（3 ) 度快速到達約6 0 - 7 0 °C ,如此所得的溫度可經由適度 加熱而維持數小時，或者是，當到達所需的溫度後，可停 止外來熱的加入，使容器中的混合物逐漸冷卻，因爲溫度 緩慢下降，混合物將維持在高於5 0 °C之溫度數小時，因 此，初始蛋白質水解發生在高於5 0 °C之溫度，將外來熱 源移除後，溫度下降且持續在較低的溫度下水解，在下降 溫度之培養時間沒有限制，但是培養時間較宜少於2 4小 時，更宜過夜進行培養，在環境溫度下持續長時間的培養 並非先決必要，但顯示對肝素之產量有影響，同樣地，在 環境溫度下之 > 預培養〃顯示可改進肝素之產量。 反應容器可爲例如不銹鋼容器，但是沒有特定的需求 或者是，可經由加入1 - 3倍體積溫度爲8 0至 1 0 0 °C之間的水溶液而提昇溫度，較宜使用水但是也可 使用稀釋的鹽溶液，水的溫度較宜爲沸點溫度，由於體積 增加而使熱容增加，因此溫度可維持在所需的溫度足夠長 的時間同時使冷卻緩慢進行，添加水之另一個優點是溶液 之黏性降低，導致吸附劑-肝素複合體有較佳的篩選性， 此在萃取肝素時很重要，因爲不需要直接加熱，容器可用 不同的材料例如塑膠。 進行本發明步驟之方便方式是在工作日收集黏膜，在 容器中儲存原料時，經由加入蛋白分解酵素而開始水解， 在每天結束時，將溫度增加至5 0 - 7 5 °C ,視需要保持 在定値數小時，然後進一步培養過夜同時使溫度緩慢下降 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規枱（210X297公餘） ^ (謂先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經滴部中央標準局員工消費合作社印聚 581814 Α7 Β7 五、發明説明（4 ) 至環境溫度。 在水解過程中，較宜攪拌混合物以便得到均勻的溶液 倂使吸附劑與含肝素之溶液有良好的接觸。 含黏膜之溶液可得自將動物組織分散在水中，組織可 得自例如牛、狗、豬及羊，此組織含內皮或黏膜成份，肝 素存在於例如多種動物之肺、腸、皮膚及肝，較宜使用來 自豬的腸黏膜。 本方法可使用多種酵素，只要其具有蛋白分解活性， 合適的酵素熟知於此項技藝中，例如微生物蛋白酶、胰蛋 白酶、胰凝乳蛋白酶，適合在鹼性水解中使用的酵素爲以 maxatase®爲商標商業化供應者，酵素與基質之比例通常約 0 . 0 2 - 0 . 2 % ,通常存在於黏膜組織溶液中的防腐 劑也可在本發明方法中加入，較宜使用焦亞硫酸鈉，但是 也可使用其他防腐劑例如丙酸鈣或酚，焦亞硫酸鈉之添加 量爲約0·5-5公斤/100升黏膜，最宜在黏膜組織 之收集過程中加入防腐劑。 pH可用鹼性試劑調整至pH 7 — 9,通常加入約 0·8—1·2公斤/100升黏膜之氫氧化鈉，最常使 用的蛋白分解酵素在此p Η下可顯現最佳的活性，在〜預 水解〃及叫高溫度下的培養時可進行調整。 本發明之另一目的是提供分離肝素之方法，本發明之 水解步驟在肝素之分離中很重要，在一或多次的培養過程 中，如果將吸附劑加入混合物中以連結存在於水解溶液中 的肝素，可從水解物中萃取出肝素，較宜在叫跟溫度之培 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規枱（210X2W公犛）_ η _ (鄣先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經漪部中央標準局貝工消費合作社印製 581814 A7 Η 7 五、發明説明（5 ) 養開始時加入吸附劑。 吸附劑較宜爲陰離子交換樹脂，其添加量足以連結存 在於黏膜溶液中的多元陰離子，此種陰離子交換樹脂有商 業化供應，通常每10 0毫升的黏膜加入2升，而且也可 使用特別對肝素有親和性之吸附劑從消化溶液中萃取肝素 0 水解物中的總離子濃度必須在範圍內選擇，使幾乎定 量地被樹脂消耗，此對多元陰離子結合至離子交換樹脂之 效應很重要，通常爲0.1至0·5克分子，除了存在於 黏膜中的鹽以外，通常在水解過程中加入防腐劑及鹼金屬 鹽類或銨鹽。 經過水解步驟後，將吸附劑過篩，然後用高鹽溶液溶 離吸附的肝素且進一步處理肝素，因此，本發明之另一目 的是提供分離肝素之方法，其中包括過篩含肝素之吸附劑 ，且從吸附劑中溶離肝素之額外步驟。 爲了使肝素之回收最佳化，供溶離使用之鹽溶液必須 有足夠高的離子強度，使實質上完全從吸附劑釋出肝素， 從肝素-陰離子交換劑複合物回收肝素之一種方法是用濃 度爲2 - 4克分子之Na C 1溶離。 很淸楚地，根據本發明之步驟可在產生之場所處理沒 有吸附之物質，也就是黏膜，因爲步驟很容易進行，且只 需要最少的設備進行水解，因此根據本發明之方法可在設 備不良之低技術環境下進行。 下列實例供說明本發明，且不能以任何方式作爲本發 本紙張尺度適用中國國家彳'ί準（CNsT^4悅将(210χ2^7-λ>^ )睡8 (部先閱讀背而之注意事項再頊寫本頁)

581814 A7 Η 7 五、發明説明（6 ) 明範圍之限制。 对先閱讀背而之注意事項再填艿本页 實例 實例1 在用0 · 5%焦亞硫酸鈉安定之2 5 0公斤豬黏膜中 ，加入2 0 0克maxatase® ,使混合物在環境溫度下攪拌， 經4小時後，用天然氣火燄加熱器將黏膜加熱至6 9 °C約 70分鐘，加入Na〇Η(1500克）導致pH爲7· 3且加入3.5升陰離子交換樹脂，然後使混合物放置冷 卻過夜並攪拌，爲了促進分離離子交換劑，第二天在過筛 離子交換劑前加熱混合物，用3 · 5 %鹽溶液淸洗離子交 換劑，並用14%鹽溶液溶離，用甲醇使溶離的肝素沈澱 ，溶離液中肝素產量爲36100U/公斤黏膜，且沈澱 物中爲3 4 3 0 0 U/公斤，其活性及品質與衍生自標準 方法之肝素粗產物相當。 實例2 經濟部中央標举局貝工消費合作社印則木 在用1%焦亞硫酸鈉安定之1 Ο 0公斤豬黏膜中，加 入8 0克maxatase® ,使混合物在環境溫度下攪拌，經2小 時後，經由加入1 2 0升沸騰的熱水將黏膜加熱至6 5 °C 約10分鐘，加入630毫升33%之Na OH溶液而改 變pH(測定値爲7·3)且加入3·5升陰離子交換樹 脂，起始溫度爲6 5 °C ,經1小時後爲6 1 °C ,經2小時 後爲5 6 °C且經3小時後爲5 2 °C ,使混合物放置冷卻過 本紙張尺度適用中國國家標車(CNS ) MWJtf ( 210χ297λ>^； ) q _ 經满部中央標準局員工消費合作社印製 581814 A7 __ H7 五、發明説明（7 ) 夜，在2 8 °C之溫度下過篩離子交換劑並溶離淸洗後的離 子交換劑，溶離液中肝素產量爲3 0 5 0 0 U/公斤黏 膜，且沈澱物中爲 2 6 4 0 0 U /公斤，其活性及品質與衍生自標準方法 之肝素粗產物相當。 實例3 在用0 · 5%焦亞硫酸鈉安定之4 7 . 5公斤豬黏膜 中，在30°C下加入80克maxatase®並攪拌，經4小時後 ，加入另外的5 5 · 5公斤黏膜並使混合物在環境溫度（ 2 6 °C )下再攪拌2小時，經由將熱蒸氣加入混合物中使 混合物在65 °C下加熱40分鐘，加入550克Na〇Η 使Ρ Η變爲7 · 2 ,攪拌1小時後，加入1升的離子交換 劑，起始溫度爲6 5 °C ,經1小時後爲6 2 °C且經2小時 後爲5 3 °C，使混合物放置冷卻過夜，溫度爲2 7 °C ,溶 離液中肝素產量爲40000 U/公斤黏膜，且沈澱物 中爲38700 U/公斤。 實例4 在保溫燒瓶內並用0 · 5%焦亞硫酸鈉安定之3公斤 豬黏膜中，加入2 · 3克maxatase®，使混合物在環境溫度 下攪拌，在3 0 °C下經5 · 5小時後，經由加入5 · 4升 沸騰的熱水將黏膜加熱至6 4 加入3 5毫升3 3%之 NaOH溶液而導致pH爲7·6,且加入110毫升陰 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) /\4坭枯（210 X 公玷） ’‘ (誚先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 4 經漪部中央標準局員工消费合作社印製 581814 A7 Η 7 "" _··ΙΙ 一___ 丨 j_ 麵_| I I I. 丨丨一一 ·.—«一 MI 丨 '1 丨丨丨____ 1 — 一 一 ------------------... I·. _«.一 . ..... , . ________ , _ _ 五、發明説明（8 ) 離子交換劑，然後使混合物放置冷卻，約1 6小時後溫度 爲4 It並過篩離子交換劑，溶離液中肝素產量爲3 2 2 0 0 U /公斤黏膜，其活性及品質與衍生自標準方法之 肝素粗產物相當。 實例5 在用1%焦亞硫酸鈉安定之115公斤豬黏膜中，加 入8 8克maxatase® ,使混合物在環境溫度下攪拌，經2小 時後，經由加入1 3 3升沸騰的熱水將黏膜加熱至6 5 t 約10分鐘，經由加入880毫克NaOH而改變pH( pH7 · 75)，加入4升陰離子交換劑，隨後加入10 8克maxatase®，起始溫度爲6 5 t：,經1小時後爲6 0 °C ，經2小時後爲5 7 °C且經3小時後爲5 4 t：,經3小時 後過篩離子交換劑，溶離淸洗後的離子交換劑並使肝素沈 澱，肝素溶離液含2 0 5 0 0 U/公斤黏膜且沈澱物爲 1 7 5 6 5 U /公斤，其活性及品質與衍生自標準方法 之肝素粗產物相當。 實例6 在用1%焦亞硫酸鈉安定之1 0 0公斤豬黏膜中，加 入maxatase®,使混合物在環境溫度下攪拌，然後用天然氣 火燄加熱器將黏膜加熱至6 8 °C約6 0分鐘，加入N a〇 Η導致pH爲7·2,隨後加入2.1升陰離子交換劑， 然後使混合物放置冷卻直到溫度低於6 0 °C ,然後另外供 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4^7210X2^^1 7, τί先閱讀背而之注意事項再楨寫本頁) 脅. 、11 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 581814 Λ7 Η 7 五、發明説明（9 ) 應加熱使溫度保持高於6 0 °C，經3小時後過篩離子交換 劑，淸洗離子交換劑並儲存在5 °C供輸送至加工廠。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) /\4規枱（210X297公耠） (邻先閱讀背而之注意事項再硪寫本頁)

Claims (1)

1. A8 B8 C8 D8 yf: 六、申請專利範圍 附件4A 第87111617號專利申請案 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 中文申請專利範圍替換本： 民國92年3月4日修正 1 · 一種自哺乳動物之黏膜組織製造肝素之方法，其包 含 添加蛋白質水解酶至該黏膜組織； 於周溫下混合該酶和黏膜組織達2至8小時； 提升該混合物之溫度至50-70 t，且於該溫度範圍內 培育該混合物達1-6小時；及 回收該肝素。 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中該50-70 °C下 之培育時間係1至4小時。 3 ·如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該培育之· 溫度係提升至60-70 °C。 4 ·如申請專利範圍第1或2項之方法，其中經該升溫 培育後，該混合物係冷卻至周溫。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5·如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該溫度之 提升係藉由直接之熱傳。 6. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該溫度之 提升係藉由添加1至3倍體積之溫度介於80-100 °C的水溶 性溶劑至包含該黏膜組織和蛋白質水解酶之混合物中。 7. 如申請專利範圍第6項之方法’其中該水溶性溶劑 係溫度介於80-100 °C之沸水。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 581814 Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍 8·如申請專利範圍第1或2項之方法，其中於回收步驟 中，在提升該混合物之溫度後的任何時間點，添加足以結 合存在於該混合物中之肝素的量之吸附劑至該混合物中。 9.如申請專利範圍第8項之方法，其進一步包含濾飾 含有肝素之吸附劑並自該吸附劑回收肝素。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -2 -