JPH01115903A - ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は高分子のヒアルロン酸を高純度、かつ高収率で
製造する方法に関する。

（従来の技術とその問題点） ヒアルロン酸は、アミノ糖とウロン酸から成る複雑な多
Ｉｌ！類の一種である。動物諸組織、特に開光組織に広
く分布し、硝子体、水様液、ヘソの緒、関節液、肋膜液
、皮膚、ニワトリの鶏冠（いわゆるトサカ）等に多く含
まれ、動物組織にあっては、遊離酸および塩としてゲル
状をなして細胞間、および繊維間を埋める結合物質であ
る。粘稠性、保水性、潤滑性等の性質を有するヒアルロ
ン酸は、医薬や化粧品基材として需要が多く、高粘度、
高純度のものが要求される。

従来、ヒアルロン酸を得るには、原料を水で抽出して得
た水溶液から塩化セチルピリジニウムで沈澱させ、塩化
ナトリウム溶液に溶解して、さらにエタノールで再沈澱
する方法が基本的方法として知られている。

収率良く品質の良いヒアルロン酸を大量に製造するため
には、原料を前処理する必要があることから、多くの方
法が提案されている。例えば、結合組織をその形状のま
ま約７０〜１３０℃に加熱処理した後に蛋白質分解酵素
処理し、常法により処理する方法（特公昭６０−９０４
２号公報）、鶏冠をその形状のまま、または裁断して３
５〜６５℃で加温後帯白質分解酵素処理を行い、以下常
法により処理する方法（特公昭６１−８０８３号公報）
、予め加熱処理したヒアルロン酸含有原料をペースト化
した後、プロテアーゼ処理する方法（特開昭６０−２４
１９４号公報）等がある。

これらのうち、特に原料の水分散液にプロテアーゼ（蛋
白質分解酵素）を作用させて抽出を行う工程は、ヒアル
ロン酸の抽出率を高め、しかも同伴する蛋白質を減少さ
せることから、高純度のヒアルロン酸を収率よく製造す
るうえで有効な手段と考えられる。しかしながら、従来
法の如き単独の酵素剤による処理では、ヒアルロン酸の
抽出に長時間を要したり、また蛋白質の分解の程度が不
十分であったりして、実際の効果は必ずしも満足できる
ものではなかった。

本発明は、このような従来のプロテアーゼによる処理方
法を改良し、高純度のヒアルロン酸を収率よく取得する
方法を提供せんとするものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明のヒアルロン酸の製造方法は、原料の水分散液に
プロテアーゼを作用させてヒアルロン酸を抽出し、続い
て常法により処理するヒアルロン酸の製造方法において
、複数の酵素剤を併用してプロテアーゼ処理を行うこと
を特徴とする。

原料としては、ヒアルロン酸を多量に含む結合組織を用
いる。このような原料としては、鶏冠、皮膚、項靭帯、
関節液、調帯、血管壁、軟骨、硝子体等があげられ、特
に多量に入手が容易な鶏冠が好ましい。原料は、採取し
て日数を経るにしたがって、原料中に混入するヒアルロ
ニダーゼ（ヒアルロン酸の分解酵素）が作用してヒアル
ロン酸を低分子化する、等の品質低下が生ずるので、採
取後、速やかに使用するか、あるいは急速冷凍して保存
することが好ましい。。

これらの原料は、例えばその形状のまま約７０〜１３０
℃で加熱処理した後にミンチする（前記特公昭６０−９
０４２号公報の方法）等、公知の方法により水分散液を
調製する。なお、原料の水分散液として、前記の急速凍
結した原料を解凍することなく、そのままミートチョッ
パー等を用いて細断し、更にホモゲナイザー、超微粒粉
砕機（スーパーマスコロイダー等）を用いてペースト化
し、これを７０〜１４０℃で１〜６０秒間殺菌処理した
ものを使用するならば、抽出工程におけるヒアルロニダ
ーゼの作用が防止され、しかも完全な失活が達せられる
ため、従来法にない高分子量のヒアルロン酸を取得でき
るので特に有利である。

プロテアーゼ処理に用いる酵素剤としては、例えばパパ
イン、フィシン、ブロメライン等の植物起源の酵素剤、
トリプシン、キモトリプシン等の動物起源の酵素剤、プ
ロリシン、アクチナーゼ、アルカラーゼ、ニュートラー
ゼ等の微生物起源の酵素剤等を挙げることができる。

本発明では、これら酵素剤を複数併用してプロテアーゼ
処理を行うものであり、その例としては、例えば、エン
ド型プロテアーゼであるアルカラーゼとニュートラーゼ
の併用、エキソ型とエンド型が共存する酵素剤、例えば
、アクチナーゼＥ、プロチンＦＮ（大和化成■製）　、
ＦＰＣ−３０（協和マイルス■製）等のうちの２種以上
の併用、あるいはエキソ型を含む酵素剤とエンド型酵素
剤の併用、例えばアクチナーゼＥとニュートラーゼの併
用等を挙げることができる。

このように、原料の水分散液中に作用機作の異なる複数
の酵素を共存させることによって蛋白質の分解が加速さ
れ、ヒアルロン酸の抽出率の向上と抽出時間の短縮が達
せられるとともに、蛋白質の同伴が減少し純度の向上が
もたらされる。

プロテアーゼ処理後は、常法により処理する。

例えば、遠心分離または濾過により、精製した後、上澄
み液または濾液に第４級アンモニウム塩（例えば塩化セ
チルピリジニウム）を添加する。得られた沈澱物を食塩
水等に再溶解し、エタノールを添加後、沈澱物を採取し
、乾燥する。

（発明の効果） 本発明は、原料の水分散液に複数の酵素剤を作用させて
プロテアーゼ処理を行うことを特徴としており、これに
より処理時間を大幅に短縮できるとともに、高純度のヒ
アルロン酸を収率よく得ることができる。

（実施例） 実施例１ 屠殺直後に採取した鶏冠を噴霧式冷凍装置を用い、液体
窒素で急速冷凍した。該冷凍鶏冠１　ｋｇをミートチョ
ッパーにより細断した。これにフレーク状の氷２　ｋｇ
を添加し、スーパーマスコロイダ−（増幸産業■製）で
ペースト化した。得られたペーストを１００℃にて３０
秒秒間間殺菌し、直ちに急速冷却した。水を２１加え、
ｐＨを７．０に調整し、プロテアーゼとして、アクチナ
ーゼＥ（科研製薬■製）１５増およびニュートラーゼ０
．５Ｌ　（ノボインダストリー・ジャパン■製）　０　
、５　ｍｌを添加し、５５℃で２時間インキュベートし
た。次いで、得られた溶液を濾過し、濾液を３．２１得
た。この濾液に５　（ｗ／ｖ）％塩化セチルピリジニウ
ム液６００−を加えた。生成した沈澱物を濾取し、０．
５Ｍの塩化ナトリウム溶液に再溶解した。この溶液にエ
タノールを６０（ｖ／ｖ）％になるように添加し、生成
した沈澱物を濾取し乾燥した。

実施例２ 実施例１と同様に処理して得られたペーストを用い、プ
ロテアーゼとして、アルカラーゼ０，６Ｌおよびニュー
トラーゼ０．５Ｌ　（いずれもノボインダストリー・ジ
ャパン■製）を各０．５ｍｌ添加した以外は、実施例１
と同様に処理してヒアルロン酸を取得した。

比較例１ 実施例１と同様に処理して得られたペーストを用い、プ
ロテアーゼとして、アクチナーゼＥを３０■添加した以
外は、実施例１と同様に処理してヒアルロン酸を取得し
た。

比較例２ 実施例１と同様に処理して得られたペーストを用い、プ
ロテアーゼとして、ニュートラーゼを１ｍｌ添加した以
外は、実施例１と同様に処理してヒアルロン酸を取得し
た。

実施例および比較例で得られたヒアルロン酸の収量、純
度、分子量を第１表に示す。

第１表 注１）カルバゾール硫酸法で測定したウロン酸量に２．
０６を乗じて算出。（以下も同様）実施例３ 原料として急速冷凍した豚皮（１ｋｇ）を用い、加熱処
理条件を１００℃で３０秒、プロテアーゼ処理を水３１
添加後アルカラーゼ０．６　Ｌ　、ニュートラーゼ０．
５Ｌ各１　ｍｌを加え、５０℃で７時間インキュベート
、とそれぞれ変更した以外は、実施例１に準拠した一連
の操作を行って豚皮起源のヒアルロン酸を取得した。収
量３．１ｇ、純度は８９．６％であった。

実施例４ 屠殺直後に採取した鶏冠１　ｋｇを沸騰水３１中に投入
し、９５℃で４５分間加熱した。固形物を取り出し、ミ
ートチョッパーにより細断した。次いで水を４１加え、
ｐＨを７．０に調整し、プロテアーゼとして、アクチナ
ーゼＥ　１５ｍｇおよびニュートラーゼ０．５Ｌ　０．
５ｄを添加し、５０℃で３時間インキュベートした。次
いで、得られた溶液を濾過し、濾液を常法により処理し
乾燥してヒアルロン酸を取得した。収量は４．８ｇ、純
度は９１．９％であった。

比較例３ 実施例４において、プロテアーゼとして、アクチナーゼ
Ｅ３０ｍｇを使用した以外は、同様に処理してヒアルロ
ン酸を取得した。収量は４．２ｇ、純度は８４．２％で
あった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 原料の水分散液にプロテアーゼを作用させてヒアルロン
   酸を抽出し、続いて常法により処理してヒアルロン酸を
   製造する方法において、複数の酵素剤を併用してプロテ
   アーゼ処理を行うことを特徴とするヒアルロン酸の製造
   方法。