JPH07241200A - ヒアルロン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目 的】鶏冠からヒアルロン酸を採取するのに、蛋白
を効率よく消化して、ヒアルロン酸を高純度且つ高収率
で得る。 【構 成】リパーゼ及びプロテアーゼを用いて鶏冠を生
のまゝ消化し、次に常法により分離・精製してヒアルロ
ン酸を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は鶏冠より高分子量ヒアル
ロン酸を高純度で、かつ収率よく分離する方法に関す
る。詳しくは、鶏冠よりヒアルロン酸を分離する際に、
鶏冠を生のまゝ細断し、リパーゼとプロテアーゼを用い
て５８〜６８℃で処理し、鶏冠に含有される脂肪を分解
することにより蛋白を効率よく消化することを特徴とす
る製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒアルロン酸はヒトや動物の結合組織、
臓器と体液中に広く分布し、細胞の増殖や組織の形成に
重要な役割をもち、生命の維持に不可欠の成分として存
在している。ヒアルロン酸はグルコサミンとグルクロン
酸より成る直鎖状の多糖体で、分子間の相互作用により
堅粘性を示すユニークな多糖体であり、保湿成分として
化粧品や外用剤に用いられ、眼疾患手術の補助剤や治療
剤として膝関節および肩関節注射剤に使用され、基材と
して種々の生体への適用が予想されるほか、他の工業分
野においても粘性基剤として応用が期待されている有用
な物質である。

【０００３】動物臓器からヒアルロン酸を製造する場合
は、特にヒアルロン酸含量の高い鶏冠を原料として用い
るのが一般的である。鶏冠には主成分の繊維性蛋白並び
にヒアルロン酸、およびコンドロイチン硫酸とデルマタ
ン硫酸とコア蛋白から成るプロテオグリカンが存在する
他に脂肪が多量に含有されている。そしてヒアルロン酸
とプロテオグリカンとは鶏冠の結合組織成分としてコラ
ーゲン繊維の間に絡み合って存在している。動物組織の
グリコサミノグリカンの抽出・分離・精製には、組織の
細切、アセトン脱脂、プロテアーゼ消化、消化液に塩化
セチルビリジニウムを添加して沈殿させ、沈殿物を溶解
してヒアルロン酸以外のグリコサミノグリカンを分別除
去し、エタノールで沈殿させる方法が一般的である。ヒ
アルロン酸を工業的に製造するには、原料鶏冠の殺菌処
理、脱脂操作や蛋白の変性処理などの前処理が必要条件
となることから、種々の方法が考案されている。鶏冠中
の全グリコサミノグリカンを抽出後、ヒアルロン酸を分
画・精製する方法として、その形状のまゝ７０〜１００
℃加熱処理し、プロテアーゼ分解後、公知の方法で分離
・精製する方法（特公昭６０−９０４２号）、３５〜６
５℃で加熱処理し、プロテアーゼ分解後、公知の方法で
分離・精製する方法（特公昭６１−８０８３号）、凍結
鶏冠をペースト化し、高温加熱殺菌後、プロテアーゼ処
理する方法（特開平１−１１５９０２号）がある。鶏冠
よりヒアルロン酸を選択的に抽出精製する方法として
は、原料の鶏冠を第四級アンモニウム塩中で加熱処理
し、プロテアーゼ処理してヒアルロン酸を分取する方法
（特公昭６１−２１２４１号）、鶏冠を生のまゝプロテ
アーゼ処理してヒアルロン酸を選択的に抽出する方法
（特公昭６１−６００８１号）などがある。工業的に大
量の高分子量ヒアルロン酸を製造するには、分離したヒ
アルロン酸画分中に蛋白が混入して蛋白の除去が困難な
操作となるため、鶏冠の加熱処理後に常法による蛋白の
プロテアーゼ処理を充分に行うことが必要である。蛋白
含量の極めて低い高純度のヒアルロン酸を精製するに
は、プロテアーゼによる鶏冠の消化液が粘稠なために短
時間の酵素消化では蛋白の分解が充分に行われず、ヒア
ルロン酸画分から混入蛋白の除去が困難になる。そのた
めプロテアーゼ消化の方法が工夫され、粗製ヒアルロン
酸を再加熱処理後、再度プロテアーゼ処理する方法（特
開昭６０−４９７９７号）、消化工程において複数の酵
素（プロテアーゼ）を用いてプロテアーゼ処理を行う方
法（特開平１−１１５９０３号）などが考案されてい
る。これらの問題点を解決するさらに効率の良いヒアル
ロン酸の製造法が期待されている。

【０００４】

【発明の概要】本発明者は、高分子量ヒアルロン酸を製
造する方法を研究し、工業的に蛋白含量の極めて低い高
純度のヒアルロン酸を大量に製造する方法を見出した。

【０００５】すなわち、本発明は新鮮鶏冠を生のまゝ細
切し、リパーゼとプロテアーゼを用いて処理する方法に
関し、これにより前処理加熱することなく酵素消化で
き、精製純化が容易になることを発見した。鶏冠に含有
される脂肪をリパーゼで分解すると混在する脂肪による
プロテアーゼ作用が阻害されず、容易に蛋白が分解され
て精製純化が容易になり、蛋白含量の極めて低いヒアル
ロン酸を得ることができる。

【０００６】一般に鶏冠は採取後、直ちに急速冷凍され
た新鮮な鶏冠が用いられ、凍結状態を維持したまゝ運
搬、保管し、製造に供されている。冷凍後は解凍される
条件下に保存すると細菌の増殖を招来し、また凍結状態
で長期にわたって保存すると品質の劣化を生じるので、
可能な限り鮮度の高い原料を用いるようにすることが必
要である。新鮮凍結鶏冠は解凍し、細切するが最大細断
面が１ｃｍ×１ｃｍ程度の切片でよく、リパーゼとプロ
テアーゼを用いて消化できる。酵素処理に用いるリパー
ゼは、例えばリパーゼＰ、リパーゼＳ（アマノ）、タリ
パーゼなどであり、プロテアーゼはパパインＷ、プロテ
アーゼＳ（アマノ）、サモアーゼなど高温で長時間作用
する酵素を用いる。これらのリパーゼとプロテアーゼは
それぞれ一種のみを単独で用いて充分に酵素消化が可能
である。

【０００７】本発明では、リパーゼとプロテアーゼを用
いて鶏冠を処理し、細切した生の鶏冠を予めリパーゼ処
理し、次ぎにプロテアーゼ処理してもよいが、リパーゼ
とプロテアーゼを同時に使用してもよい。また、酵素の
処理温度（消化温度）は５８〜６８℃を用いる。鶏冠を
生のまゝプロテアーゼ消化した場合には、５８℃以上の
消化温度で消化され、５５〜５６℃以下の消化温度では
長時間の酵素処理でも繊維性蛋白は消化されない。ま
た、短時間のプロテアーゼ処理ではコドロイチン硫酸と
デルマタン硫酸より成るプロテオグリカンが酵素分解さ
れにくゝ、ヒアルロン酸のみ溶出される傾向がある。そ
して、このような消化条件では蛋白の分解が十分に行わ
れないので蛋白分解物の大きなフラグメントがヒアルロ
ン酸画分に混入し、その分離が困難である。一般的に用
いられている４０〜５０℃のプロテアーゼ消化温度で
は、鶏冠は生のまゝでは酵素消化されず抽出されるヒア
ルロン酸の収率も低い。このような消化温度では細菌の
増殖に起因してヒアルロン酸の粘度が低下する度合いが
大きい。プロテアーゼ消化温度は混入細菌の増殖を抑え
るためには高温を維持するのがよく、５８℃〜６８℃が
適している。この温度付近での長時間のプロテアーゼ処
理ではヒアルロン酸の粘度の低下はみられない。また、
７０℃を超える消化温度での長時間の酵素処理ではヒア
ルロン酸の粘度が低下する傾向がみられる。

【０００８】鶏冠をプロテアーゼ処理すると酵素消化が
進行するにつれて消化液の粘稠性が次第に高くなり、プ
ロテアーゼによる蛋白分解が十分に行われにくゝなる傾
向がある。リパーゼ処理によって脂肪が分解されて消化
液の粘稠性が低下し、蛋白の分解が進み易くなる。蛋白
含量の極めて低いヒアルロン酸を製造するには、プロテ
アーゼ処理を長時間行うことが必要で、少なくとも１０
時間から１５時間程度まで作用させて蛋白を十分に分解
することが必要である。

【０００９】本発明では酵素消化後は常法により塩化セ
チルピリジニウムと塩化ナトリウムを用いてヒアルロン
酸画分を分離し、エタノールで沈殿させ、沈殿物を分離
し、乾燥して高分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得る。

【００１０】

【発明の効果】本発明によると、鶏冠を前処理加熱する
ことなく細断し、リパーゼとプロテアーゼ処理すること
を特徴とするので、含有脂肪が分解されプロテアーゼに
より蛋白が効率よく分解される。さらに、比較的高温で
プロテアーゼ処理するために混入細菌のヒアルロニダー
ゼによるヒアルロン酸の粘度低下もなく、長時間にわた
ってプロテアーゼ消化するので蛋白が十分に分解され
る。そのため精製が容易になり蛋白含量の極めて低い、
高純度の高分子量ヒアルロン酸を好収量で製造できる。

【００１１】

【実施例】次ぎに実施例を示す。

【００１２】実施例１ 新鮮な鶏冠１Ｋｇを細切して水２ｌを加えて、６０℃で
リパーゼＰ（アマノ）３ｇとパパイン３ｇを添加して攪
拌下に１２時間消化した。酵素消化液は水を加えて５ｌ
に希釈し、▲ろ▼過助剤と活性炭を添加して攪拌し、▲
ろ▼過した。清澄▲ろ▼過液に５％塩化セチルピリジニ
ウム３００ｍｌを加えて沈殿した。生成した沈殿物を分
離し、０．０２％塩化セチルピリジニウム／０．０４Ｍ
塩化ナトリウム溶液で洗い、０．４Ｍ塩化ナトリウム／
３０％エタノール溶液で溶解し、溶解液を分離してエタ
ノールを添加して沈殿した。沈殿物を０．５Ｍ塩化ナト
リウム溶液に溶解し、活性炭処理した後、▲ろ▼過し、
▲ろ▼過液にエタノールを加えて沈澱した。沈殿物を分
離し、乾燥してヒアルロン酸ナトリウムを得た。

【００１３】実施例２ 凍結鶏冠２Ｋｇを流水中で解凍し、ミンチし、水４ｌに
懸濁して、リパーゼＰ２ｇを添加して６０℃で５時間処
理し、つづいてプロテアーゼＳ３ｇを添加して６８℃で
１０時間消化した。消化液を希釈し、塩化ナトリウム２
０％溶液と塩化セチルピリジニウム４％溶液の等量混合
溶解液１．２ｌを加えて攪拌し、▲ろ▼過助剤と活性炭
を添加して▲ろ▼過し、▲ろ▼過液にエタノールを加え
て沈殿した。沈殿物を分離し、０．５Ｍ塩化ナトリウム
溶液に溶解し、活性炭処理して▲ろ▼過し、▲ろ▼液に
エタノールを添加して沈殿した。沈殿物を分離して乾燥
した。

【００１４】実施例３ 新鮮凍結鶏冠１０Ｋｇをアジ化ソーダを添加した５０ｌ
の水に浸漬して解凍後、水洗し、ミンチし、 水２０ｌ
に懸濁した。リパーゼＰ２０ｇとプロテアーゼＳ３０ｇ
を同時に添加して６２℃で１５時間攪拌下に消化した。
消化液に塩化ナトリウム２０％溶液と塩化セチルピリジ
ニウム４％溶液の等量混合溶解液６ｌを添加し、▲ろ▼
過助剤と活性炭を加えて▲ろ▼過した。▲ろ▼過液は実
施例２と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得
た。

【００１５】上記の実施例１〜３で得られたヒアルロン
酸ナトリウムの収量および分析値を表１に示した。

【００１６】

【表１】

【００１７】・ ：カルバゾール硫酸法， ・・：フォリン法 ・・・ウベローデ型粘度計により測定

【００１８】比較例で、プロテオグリカンの酵素消化速
度をプロテアーゼのみの単独処理、リパーゼ処理後のプ
ロテアーゼ処理、リパーゼとプロテアーゼで同時に処理
した場合の消化液中へのコンドロイチン硫酸およびデル
マタン硫酸の溶出速度を検討した。

【００１９】比較例１ 解凍鶏冠ミンチを５５℃で攪拌下にプロリシンで消化
し、３，６，および９時間目に消化液を分取して、▲ろ
▼過後、▲ろ▼過液に塩化セチルピリジニウムを添加し
て沈殿させ、沈殿物を０．５Ｍ塩化ナトリウム／４０％
エタノール混合溶液に溶解し、溶解液にエタノールを加
えて沈殿した。沈殿物を０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液に
溶解しエタノール沈殿し沈殿物を分離・乾燥した。

【００２０】比較例２．６３℃でプロテアーゼＳで消化
した以外は比較例１と同様に処理した。

【００２１】比較例３．６０℃で４時間リパーゼＰ処理
後６６℃でプロテアーゼＳ処理した以外は比較例１と同
様に処理した。

【００２２】比較例４．５９℃でリパーゼＰとプロテア
ーゼＳを同時に用いて処理した以外は比較例１と同様に
処理した。

【００２３】比較例１〜４で得られたグリコサミノグリ
カン混合物をセルロースアセテート膜電気泳動し、トル
イジンブルー染色してヒアルロン酸の他に検出されるコ
ンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸のバンドの濃淡の度
合いを表２に示した。リパーゼとプロテアーゼを用いる
と蛋白とプロテオグリカンが速く消化された。

【００２４】

【表２】

【００２５】−：バンド検出なし、±：僅かに検出され
る、＋：明瞭に検出、＋＋：極めて明瞭に検出

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】リパーゼとプロテアーゼを用いて鶏冠を生
   のまゝ５８〜６８℃で消化し、つづいて常法により分離
   ・精製するヒアルロン酸の製造法