DE2340407A1 - Verfahren zur reinigung des coenzyms - Google Patents
Verfahren zur reinigung des coenzymsInfo
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Description
DR. MÜLLER-BORE DIPL. 13HYS. DR. MAN l"i Z MPL.-OriEM. DR. DEUFEL
D1PL.-ING. FINSTERWALD DIPL.-ING. GRÄMKOW
PATENTANWÄLTE
-9. Mit 1973
D/S/Gl - T 1255
Tanahe Seiyaku Co., Ltd., Osaka / Japan
Verfahren zur Reinigung des Coenzyme A
Die Erfindung betrifft die Reinigung des Coenzyms A.
Es ist bekannt, dass das Coenzym A (nachfolgend als "CoA" bezeichnet)
eine wichtige Verbindung bei StoffwechGelprozessen von lebenden Zellen ist. Beispielsweise ist diese Verbindung
für den Stoffwechsel von Kohlehydraten, Fetten und Aminosäuren sowie bei der Biosynthese von Protohäm IX von Bedeutung.
Einige Methoden zur Reinigung von CoA sind bekannt. Bei der Durchführung einer bekannten Methode wird CoA in der Weise
gereinigt, dass eine rohe CoA-Lösung mit einem Schwermetallsalz
(beispielsweise einem Quecksilbersalz, Bleisalz, Silbersalz oder Bariumsalz), PhosphowoIframsäure oder einem organischen
Lösungsmittel (beispielsweise Azeton) behandelt wird (vgl. Journal of Biological Chemistry 186, 235-243, ibid. 193,
307-316). Bei einer anderen Methode wird CoA durch eine Aktiv-
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kohle-Adsorptionsmethode oder durch Chromatographie an einer
Säule aus einem Ionenaustauscher gereinigt (vgl. Journal of American Chemical Society 72, 4858, US-PS 2 828 302, Biochemistry
5, 3883-3886, JA-PS 10 188/1965). Diese Methoden eignen sich jedoch, nicht für eine Durchführung in technischem
Maßstabe infolge einer unzureichenden Reinigung von CoA sowie eines grossen Verlustes an CoA während der einzelnen Maßnahmen
.
Es wurde nunmehr gefunden, dass eine biologisch spezifische Y/eehselwirkung zwischen CoA und seinen zugeordneten Enzymen
in vorteilhafter Weise zur Reinigung von CoA verwendet werden
kann. Enzyme oder Proteine, die eine spezifische und einzigartige Affinität für CoA besitzen, sind in unvermeidbarer Weise
in lebenden Zellen von CoA-erzeugenden Mikroorganismen enthalten. Derartige Enzyme oder Proteine (d.h. CoA-Affinitätssubstanzen)
lassen sich in vorteilhafter Weise als ein Ligand verwenden, der mit einem festen Träger für eine Affinitätschromatographie verbunden wird. Es wurde ferner gefunden, dass
sich das Ankuppeln des Liganden in einfacher V/eise derart bewirken lässt, dass der zellfreie Extrakt des CoA-erzeugenden
Mikroorganismus mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid immobilisiert wird. Ferner wurde gefunden,
dass die vorstehend erwähnte Kupplung in der Weise erzielt werden kann, dass eine CoA-Affinitätssubstanz aus dem zellfreien
Extrakt eines CoA-erzeugenden Mikroorganismus in der Weise abgetrennt wird, dass ein immobilisiertes CoA verwendet wird,
worauf die isolierte CoA-Affinitätssubstanz mit dem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid immobilisiert
wird. Der erhaltene immobilisierte zellfreie Extrakt, in dem
die CoA-Affinitätssubstanz enthalten ist, oder die erhaltene immobilisierte CoA-Affinitätssubstanz werden als Adsorbens
für die Affinitätschromatographie einer rohen CoA-Lösung verwendet.
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Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung einer neuen und praktischen
Methode zur Behandlung einer rohen CoA-Lösung zur Gewinnung einer gereinigten CoA-Lösung. Durch die Erfindung
wird ein Verfahren zur Reinigung von· CoA durch Äffinitätschroraatographie
zur Verfugung gestellt. Bei diesem Verfahren kann GoA in einer rohen CoA-Lösung in der Weise gereinigt werden,
dass eine biologisch spezifische Wechselwirkung zwischen CoA und einer CoA-Affinitätssubstanz ausgenützt wird, Das erfindungsgemüsse
Verfahren ermöglicht die Reinigung von CoA ohne einen erheblichen Verlust an dieser Substanz während
der einzelnen Maßnahmen.
Erfindungsgemäss wird eine gereinigte CoA-Lösung in der Weise
erhalten,dass der zellfreie Extrakt eines CoA-erzeu-^enden
MiIa? ο Organismus mit einem Halogencyan-aktivierten v/asserunlöslichen
Polysaccharid zur Gewinnung eines immobilisierten zellfreien Extraktes, der eine CoA-Aff initätssubs tan-z enthält,
immobilisiert wird, der immobilisierte zellfreie Extrakt gewaschen
wird, eine rohe CoA-Lösung mit dem immobilisierten zellfreien Extrakt zur Adsorption von CoA kontaktiert wird,
der immobilisierte zellfreie Extrakt gewaschen wird und dann das CoA von dem immobilisierten zellfreien Extrakt eluiert
wird. Wahlweise kann die CoA-Affinitätssubstanz von dem zellfreien
Extrakt eines CoA-erzeugenden Mikroorganismus vor der
vorstehend erwähnten Immobilisierungsstufe abgetrennt werden. Bei dieser Alternative wird die Abtrennung der CoA-Affinitätssubs
tanz in der Weise durchgeführt, dass CoA mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid immobilisiert
wird, das erhaltene immobilisierte CoA mit dem zellfreien Extrakt
eines CoA-erzeugenden Mikroorganismus kontaktiert wird, damit die CoA-Affinitätssubstanζ an dem immobilisierten
CoA adsorbiert wird, und die CoA-Affinitätssubstanz von dem
immobilisierten CoA eluiert wird. Die auf diese Weise erhaltene
Affinitätssubstanz wird dann mit einem Halogencyan-aktivierten
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1NSPEOTD
wasserunlöslichen Polysaccharid immobilisiert. Eine gereinigte CoA-Lösung wird in der Weise erhalten, dass eine rohe CoA-Lösung
mit der erhaltenen immobilisierten CoA-Affinitätssubstanz
kontaktiert wird, damit GoA daran adsorbiert wird, worauf die immobilisierte CoA-Affinitätssubstanz gewaschen wird und
anschliessend das CoAvon der immobilisierten CoA-Affinitäts- substanz
eluiert wird.
Die vorstehend geschilderten Stufen gemäss vorliegender Erfindung
lassen sich durch das folgende Schema wiedergeben:
Stufe A): Immobilisierung des zellfreien Extraktes eines CoA-erzeugenden
Mikroorganismus mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid,
wobei ein immobilisierter zellfreier Extrakt erhalten wird, der eine CoA-Affinitätssubstanz
enthält ι
Stufe B): Waschen des immobilisierten zellfreien Extraktes
Stufe C); Immobilisierung des CoA mit einem Halogencyan-aktivierten
wasserunlöslichen Polysaccharid I
Stufe D): Kontaktierung des zellfreien Extraktes eines CoA-erzeugenden
Mikroorganismus mit dem immobilisierten CoA, wodurch die CoA-Affinitätssubstanz daran
adsorbiert wirdl
Stufe E): Waschen des immobilisierten CoA ι
Stufe P); Eluierung der CoA-Affinitätssubstanz
von dem immobilisierten CoA.
Stufe Gr): Immobilisierung der CoA-Affinitätssubstanz mit einem
Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid
Stufe H): Kontaktieren einer rohen CoA-iiösung
mit dem immobilisierten zellfreien Extrakt oder der immobilisierten CoA-Affi nitätssubstanz zur Adsorption von CoA an
der immobilisierten Zubereitung
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Stufe I): Waschen der immobilisierten Zubereitung
Stufe J): Eluierung von CoA von der
immobilisierten Zubereitung
Mikroorganismen, die CoA erzeugen, können für die erfindungsgemässen
Zwecke eingesetzt werden. Beispiele "für CoA-erzeugende Mikroorganismen sind Sarcina lutea IAM (Institute of Applied
Microbiology, Tokyo University, Japan) 1099, Sarcina aurantiaca
IAM 1059, Sarcina aurantiaca H1O (Institu-fe for Fermentation,
Osaka, Japan) 3064, Micrococcus rubens Ii1O 3768, Microbacterium
flavum IAM 1642, Brevibacterium ammoniagenes IAM 1641, Cornyebacterium
alkanophilum nov. sp. ATCC 21071 und Pseudomonas alkanolytica nov. sp. ATCC 21034. Alle diese Mikroorganismen sind
von den vorstehend angegebenen Deponien erhältlich. In diesem Zusammenhang ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die Erfindung
nicht auf die Verwendung dieser spezifischen Mikroorganismen beschränkt ist, sondern vielmehr die Verwendung aller CoA-erzeugenden
Mikroorganismen umfasst. Der zellfreie Extrakt eines jeden der vorstehend erwähnten Mikroorganismen wird nach an sich bekannten
Methoden hergestellt, beispielsweise durch eine Homogenisierungs-,
Ultraschallzerstörungs- oder Lysozymbehandlung (vgl. beispielsweise
Methods in Enzymology, Academic press Inc., New York, Band 1, Seite 51 (1955)). Darüber hinaus wird das erfindungsgemässe
Halogencyan-aktivierte wasserunlösliche Polysaccharid nach einer bekannten Methode hergestellt, die in "Nature" 214,
1302-1304 (1967) beschrieben wird. Die Aktivierungsreaktion eines
wasserunlöslichen Polysaccharids (beispielsweise Agarose, Dextran oder Zellulose) mit einem Halogencyan wird durch das folgende
Schema wiedergegeben:
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WasserunlöslichesY-OH ^ WasserunlöslichesV· OClI
Polysaccharid /--OH J 7 Polysaccharid )-■ OH
Wasserunlösliches5*—r 0 ^ n_H„
Polysaccharid /~~f 0^ Jn
(= Halogencyan-aktiviertes
wasserunlösliches Polysaccharid)
Geeignete Beispiele für die aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharide
sind mit Bromcyan aktivierte Agarose, mit Chlorcyan aktivierte Agarose, mit Jodcyan aktivierte Agarose, mit Bromcyan
aktiviertes Dextran, mit Chlorcyan aktiviertes Dextran, mit Jodcyan aktiviertes Dextran, mit Bromcyan aktivierte Zellulose,
mit Chlorcyan aktivierte Zellulose sowie mit Jodcyan aktivierte Zellulose. Zur Herstellung des aktivierten wasserunlöslichen
Polysaccharids, das 3ich für die erfindungsgenasse
Verwendung eignet, ist es vorzuziehen, 0,01 bis 0,05 Mol, insbesondere 0,01 bis 0,03 Mol, eines Halogencyans pro Gramm des
wasserunlöslichen Polysaccharids einzusetzen. Beispielsweise werden vorzugsweise 1 bis 2 g Bromcyan pro Gramm des wasserunlöslichen
Polysaccharids zur Durchführung der Aktivierungsreaktion verwendet.
Die Immobilisierung des zellfreien Extraktes (d.h. Stufe A)
bei der Durchführung der Erfindung lässt sich in einfacher Weise derart bewerkstelligen, dass der zellfreie Extrakt eines CoA-erzeugenden
Mikroorganismus mit dem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid bei einem pH von 6 bis 9 vermischt
wird. Vorzugsweise wird die Reaktion bei O bis 3O°C,
insbesondere 15 bis 250C, unter Rühren durchgeführt. Die bevorzugte
Menge des eingesetzten zellfreien Extrakts zur Durchführung der Immobilisierungsreaktion liegt zwischen 10 und 30 mg
und insbesondere zwischen 15 und 20 mg (bezogen auf die Protein-
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menge) pro Gramm des Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Poiysaccharids. Die Immobilisierungsreaktion kann innerhalb
von 10 bis 30 Stunden beendet sein. Der erhaltene immobilisierte zellfreie Extrakt, der eine CoA-Affinitätssubstanz
enthält, wird dann mit einem Lösungsmittel solange gewaschen, bis alle Materialien entfernt sind, die nicht kovaient an dem
aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid gebunden sind. Wasser sowie eine wässrige Natriumchloridlösung (pH 6 bis 8)
werden als Waschlösungsmittel verwendet.
Die Immobilisierung des CoA (d.h. die Stufe C) wird in der Weise durchgeführt, dass CoA mit dem Halogencyan-aktivierten
wasserunlöslichen Polysaccharid bei einem pH von 6 bis 8 vermischt wird. Die Immobilisationsreaktion wird bei O bis 300C
und insbesondere bei 15 bis 25°C unter Rühren durchgeführt. Bei dieser Immobilisierungsreaktion ist es darüber hinaus vorzuziehen,
ein hochgereinigtes CoA zu verwenden, insbesondere eine authentische Probe des reduzierten CoA. Die Immobilisierungsreaktion
des CoA kann innerhalb von 6 bis 10 Stunden beendet sein. Die bevorzugte Menge des reduzierten CoA, das
an dem aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid gebunden ist, beträgt 2 bis 5 mg, insbesondere 3 bis 4 mg, pro Gramm
des aktivierten.wasserunlöslichen Poiysaccharids. Zur Durchführung
der Immobilisationsreaktion ist es daher vorzuziehen, 2 bis 10 mg des reduzierten CoA pro Gramm des aktivierten wasserunlöslichen
Poiysaccharids zu verwenden. Das auf diese Weise erhaltene immobilisierte CoA wird durch die folgende Formel
wi edergegeben:
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WasserunlösA-liches PoIy-J
saccharid T
saccharid T
OH
OCONH
OCONH
CONHCH2CH2CONHCH2CH2Sh
CHOH
t -J
CH2O-P-O-P-OCH2
HO Q-PO3H2
Zur Durchführung der Adsorptionsmethode (d.h. der Stufe D) ist es vorzuziehen, den zellfreien Extrakt mit einer Ionenstärke
von weniger als 0,1 und insbesondere 0,05 bis 0,1 zu verwenden. Besitzt der zellfreie Extrakt, der aus dem CoA-erzeugenden Mikroorganismus
erzeugt wird, eine Ionenstärke von mehr als 0,1, dann ist es zu empfehlen, diesen Extrakt vor der Adsorptionsmethode der Stufe D gegen Wasser zu dialysieren. Besitzt andererseits
der zellfreie Extrakt eine Ionenstärke von weniger als 0,05, dann kann ein inerter Elektrolyt, wie Natriumchlorid,
in einer solchen Menge zugesetzt werden, dass die Ionenstärke auf 0,05 bis 0,1 eingestellt wird. Der derart eingestellte
zellfreie Extrakt wird dann mit dem immobilisierten CoA vermischt, worauf die Mischung bei 0 bis 300C und insbesondere
bei 15 bis 250C gerührt wird. Dann wird die Mischung filtriert,
worauf daß auf diese Weise immobilisierte CoA mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer lonenstärke von 0,05 bis
0,1 gewaschen wird. Beispiele für Waschlösungsmittel, die zur Durchführung der Stufe E verwendet werden können, sind eine
wässrigen O,O1m-Natriurnacetat-Pufferlösung (pH 6,5), die 0,05m
Natriumchlorid enthält, sowie eine wässrige O,01m-Phosphat-Pufferlösung
(pH 7,0), die 0,05m Natriumchlorid enthält. Durch diese Maßnahmen wird das immobilisierte CoA, an dem eine CoA-Affinitätssubstanz
adsorbiert ist, erhalten. Wahlweise können die Adsorption sowie die sich daran anschli ess enden Max3nahmen
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L O ■■■·, J 'τ U /.
(d.h. die Stufen D bis F) gemäss vorliegender Erfindung unter
Verwendung einer Säule durchgeführt werden. Beispielsweise wird das bei der Durchführung der Stufe C erhaltene immobilisierte
CoA auf eine Säule eingegeben, worauf der zellfreie Extrakt (pH 6 bis 8), der in der vorstehend beschriebenen Weise eingestellt
worden ist, durch die Säule bei O bis 3O0C und inibesondere
bei 15 bis 25°C geschickt wird. Durch Waschen der Säule mit einer wässrigen Lösung, wie sie vorstehend geschildert worden
ist, wird das immobilisierte CoA, an dem die CoA-Affinitätssubstanz adsorbiert ist, erhalten.
Ein Kiuieren der CoA-Affinitätssubstanz von dem immobilisierten
CoA, d.h. die Stufe F, lässt sich in einfacher V/eise durchführen,
Ais Eluierlösungsmittei wird eine wässrige Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von mehr als 0,5 und insbesondere 0,5 bis
1 verwendet. Beispielsweise können in geeigneter Weise eine wässrige O,O1m-Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5), die 0,5m
Natriumchlorid enthält, sowie eine wässrige O,Im-Phosphat-Pufferlösung
(pH 7,0), die 0,2m Natriumchlorid enthält, als Eluierlösungsmittel verwendet werden. Vorzugsweise wird die
Eluierung bei O bis 300C und insbesondere 15 bis 250C durchgeführt.
Die Immobilisierung der CoA-Affinitätssubstanz, die auf diese Weise eluiert worden ist, d.h. die Stufe G, kann in
der gleichen Weise wie die Stufe A durchgeführt werden. Die bevorzugte Menge der CoA-Affinitätssubstanz, die bei der Immobilisationsreaktion
der Stufe G eingesetzt wird, beträgt 10 bis 30 mg, insbesondere 15 bis 20 mg (bezogen auf die Menge
des Proteins) pro Gramm des Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen
Polysaccharids.
Der bei der Durchführung der Stufen B oder G erhaltene zellfreie
Extrakt oder die CoA-Affinitätssubstanz wird dann mit einer rohen CoA-Lösung zur CoA-Adsorption an der immobilisierten
Zubereitung kontaktiert. Dies bedeutet, dass der immobilisierte zellfreie Extrakt oder die CoA-Affinitätssubstanz mit
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der rohen CoA-Lösung vermischt wird, worauf die Mischung gerührt
wird. Nach einem Filtrieren der Mischung wird die gewonnene immobilisierte Zubereitung mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen.
Durch diese Maßnahmen wird der immobilisierte zelxfreie Extrakt oder die CoA-Affinitatssubstanz mit aioorbiertem CoA
erhalten. V/ahlweise können die Adsorption sowie die sich ihr
anschliessenden Maßnahmen (d.h. die Stufen H bis I) unter Verwendung einer Säule durchgeführt werden. Beispielsweise kann die
immobilisierte Zubereitung, die bei der Durchführung der Stufen B oder G erhalten worden ist, auf eine Säule aufgegeben werden,
worauf eine rohe CoA-Lösung durch die Säule mit einer geeigneten Fliessgeschwindigkeit geschickt wird. Durch Waschen der Säule
mit einem geeigneten Lösungsmittel wird der immobilisierte zeilfreie
Extrakt oder die CoA-Affinitätssubstanz mit adsorbiertem CoA erhalten. Die Adsorptionsmethode (d.h. die Stufe H) wird
vorzugsweise bei einem pH von 6 bis 8 und bei 0 bis 300C und
insbesondere 15 bis 250C durchgeführt. Als Waschlösungsmittei
zur Durchführung der Stufe I wird eine wässrige Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von weniger als 0,04 und insbesondere
mit einer Ionenstärke von 0,02 bis 0,04 verwendet. Beispiele für geeignete Waschlösungsmittel, die zur Durchführung der Stufe
I verwendet werden können, sind eine wässrige 0,01m-Natriumace^at-Pufferlösung
(pH 6,5), die 0,03m Natriumchlorid enthält, sowie eine wässrige O,005m-Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,02m
Natriumchlorid enthält.
Die Eluierung des CoA von dem erhaltenen immobilisierten zellfreien
Extrakt oder der CoA-Affinitätssubstanz, d.h. die Stufe J, wird vorzugsweise bei 0 bis 300C und insbesondere bei 15 bis 25°C
durchgeführt. Eine wässrige saure Lösung mit einem pH von 2 bis 5 wird als Eluierlösungsmittel zur Durchführung dieser Stufe eingesetzt.
Darüber hinaus wird eine wässrige Lösung mit einem pH von 6 bis 8 sowie mit einer Ionenstärke von mehr als 0,06, insbesondere
mit einer Ionenstärke von 0,01 bis 0,5, als Eluier-
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BAD ORIGINAL
lösungsmittel für diesen Zweck eingesetzt. Bevorzugte Beispiele für Eluierlösungsmittel, die zur Durchführung der Stufe J eingesetzt
werden können, sind eine wässrige 0,01m-Natriumacetat-Pufferlösung
(pH 6,5), die 0,1m Natriumchlorid enthält, sowie eine wässrige O,01m-Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,06m
Natriumchlorid enthält. Ist das Eluieren beendet, dann wird der immobilisierte zellfreie Extrakt oder die CoA-Affinitätssubstanz in Form eines festen Materials gewonnen. Die auf diese
'./eise erhaltene immobilisierte Zubereitung kann wiederholt
für die erfindungsgemässen Zwecke eingesetzt werden.
Nach dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemässen Verfahren lässt sich ein CoA-Extrakt, der aus tierischen Geweben (beispielsweise
Hundelebern) oder der Gärungsbrühe eines CoA-erzeugenden Mikroorganismus erhalten wird, in einfacher Weise reinigen.
Darüber hinaus kann eine überstehende Lösung oder ein FiItrat, das durch Zentrifugieren oder Filtrieren der erhitzten· Gärbrühe
eines CoA-erzeugenden Mikroorganismus erhalten wird, als rohe CoA-Lösung gemäss vorliegender Erfindung eingesetzt werden. Eine
CoA-Lösung, die durch Reinigen einer derartigen überstehenden Flüssigkeit-oder eines derartigen Filtrats mit Aktivkohle erhalten
wird, kann ebenfalls als rohe CoA-Lösung gemäss vorliegender Erfindung verwendet werden. Wahlweise kann die CoA-Lösung,
die in der vorstehend beschriebenen Weise mit Aktivkohle gereinigt worden ist, weiter durch Chromatographie an einer Säule aus
einem Ionenaustauscherharz, wie beispielsweise DEAE-Zellulose,
vor der erfindungsgemässen Reinigung gereinigt werden.
Die folgenden Beispiele zeigen praktische und bevorzugte Ausführungsformen
des erfindungsgemässen Verfahrens. Erfindungsgemäss wird die Menge an CoA (d.h. die Gesamtmenge an reduziertem
und oxydiertem CoA) in Gegenwart von Zystein nach der Phosphotransacetylase-Methode
ermittelt, die in "The Journal of Biological Chemistry" 191, 365 (1951) beschrieben wird. Die Menge des redu-
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zierten CoA wird ebenfalls spektrophotometrisch nach der Phosphotransacetylase-Methode ermittelt, die in "Methods of
Enzymatic Analysis", Seite 512 (1963) (Academic Press Incorp.) beschrieben wird. Die Reinheit (%) des CoA sowie des reduzierten
CoA wird gemäss folgender Gleichung bestimmt:
Reinheit (%) des CoA =
Menge des CoA (d.h. Gesamtmenge des reduzierten und oxydierten CoA), die nach der
vorstehend geschilderten Methode ermittelt wird
Menge an CoA (dTh.Gesamtmenge an reduziertem
und oxydiertem CoA), die aus der Extinktion bei 257 nm ermittelt wird
x100
Reinheit des reduzierten CoA =
Menge des reduzierten CoA, die nach der vorstehend geschilderten Methode ermittelt
wird
Menge des reduzierten CoA,die aus der Extinktion bei 257 nm ermittelt wird
χ 100
Darüber hinaus wird die Menge der CoA-Affinitätssubstanz nach der Methode ermittelt, die in "The Journal of Biological
Chemistry", 198, 265 (1951) beschrieben wird. Unter dem Begriff "CoA (oder Coenzym A)-Affinitätssubstanz" soll eine Gruppe von
Enzymen oder Proteinen verstanden werden, die in unvermeidbarer Weise in lebenden Zellen eines CoA (oder Coenzym A)-erzeugenden
Mikroorganismus enthalten und gleichzeitig an CoA (oder Coenzym A) in einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer
Ionenstärke von weniger als 0,1 adsorbiert ist. Ferner soll der Begriff "CoA (oder Coenzym A)-Affinitätssubstanz" zum Ausdruck
bringen, dass es sich um eine Mischung aus Enzymen oder Proteinen handelt, die ausDephospho-CoA (oder Coenzym A)-Kinase,
Acyltransferase, Acyl-CoA (oder Coenzym A)-Reduktase, Palmitoyl-CoA
(oder Coenzym A)-Hydrolase, Succinyl-CoA (oder Coenzym A)-Hydrolase, Citratsynthase oder anderen analogen Proteinen
mit einer Affinität zu CoA ausgewählt sind.
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1) Herstellung des zellfreien Extrakts eines CoA-erzeugenden
Mikroorganismus
10 1 eines wässrigen Nährmediums, das 10 % (Gewicht/Volumen)
Glukose, 2,2 % (Gewicht/Volumen) Maiswasser, 1,35 % (Gewicht/
Volumen) Pepton, 0,5 % (Gewicht-Volumen) Monokaliumphosphat, 0,5 % (Gewicht/Volumen)Dikaliumphosphat, 0,1 % (Gewicht/Volumen)
Mangesiumsulfat.7Hp0, 1,0 % (Gewicht/Volumen) Ammoniumacetat und
0,05 ug/ml Biotin enthält, werden in· eine Gärungseinrichtung
eingefüllt..Das Mährmedium wird auf einen pH von 7,0 eingestellt rnd anschliessend sterilisiert. Sarcina lutea IAM 1099 wird auf
das Nährmedium aufgeimpft. Dann wird das Medium bei 30°C während
einer Zeitspanne von 72 Stunden unter Belüftung (3 l/Minute) und Rühren (350 Upm) kultiviert. Die auf diese tfeise erhaltene
Gärbrühe wird zentrifugiert. Die dabei gesammelten Mikrobenzellen werden lyophilisiert, wobei 500 g der lyophilisierten
Zellen von Sarcina lutea IAM 1099 erhalten werden. 100 g der lyophilisierten Zellen werden in 3,5 1 einer O,05m-Phosphat-Pufferiösung
(pH 7,0) suspendiert. Die Suspension wird einer Ultraschallbehandlung (20 Kilohertz/Stunde) unter Eiskühlen
unterzogen und anschliessend zentrifugiert. 3 1 des zellfreien Extrakts von Sarcina lutea IAM 1099 werden erhalten.
2) Herstellung eines Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen
Polysaccharids "
700 g Agarose (feucht) (hergestellt von der Pharmacia Fine Chemical Co. unter dem Warenzeichen "Sepharose") werden in 28
einer wässrigen Bromcyanlösung (Bromcyangehalt: 25 mg/ml) suspendiert,
worauf die Suspension bei ungefähr 25°C während einer
Zeitspanne von 8 Minuten gerührt wird. Die Suspension wird bei einem pH von 11 unter Verwendung einer wässrigen 5n-Natriumhydroxydlösung
während der Reaktion gehalten. Nach der Reaktion
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wird der erhaltene Niederschlag durch Filtration gebammelt.
Der auf diese Weise gesammelte Niederschlag wird mit V/asser und einer wässrigen Ojim-Natriumbicarbonatlösung gewaschen.
650 g der Bromcyan-aktivierten Agarose werden in feuchter
Form erhalten.
3) Herstellung eines immobilisierten zellfreien Extrakti
320 g der Bromcyan-aktivierten Agarose (feucht) werden zu 3 des zellfreien Extrakts gegeben, der gemäss 1) hergeste-it
worden ist. Nachdem die Mischung während einer Zeitspanne von 17 Stunden bei 1O0C gerührt worden ist, werden 320 g
der Bromcyan-aktivierten Agarose (feucht) zugegeben. Dann wird die Mischung auf einen pH von 6 eingestellt und während
einer Zeitspanne von 6 Stunden bei 1O°C gerührt. Der erhaltene
Niederschlag wird durch Filtration gesammelt. Der auf diese Weise gesammelte Niederschlag wird mit Wasser und einer
wässrigen 0,01m-Natriumacetatlösung (pH 7,0) gewaschen. 640 g
eines immobilisierten zellfreien Extrakts (feucht) werden erhalten.
4) Reinigung des CoA
Eine Impfkultür wird in der Weise hergestellt, dass Sarcina
lutea IAM 1099 während einer Zeitspanne von 20 Stunden in einem wässrigen Medium gezüchtet wird, welches die gleichen
Bestandteile enthält, wie sie im Zusammenhang mit den Ausführungen unter Ziffer 1) beschrieben worden sind. 20 ml
eines wässrigen Nährmediums, welches die gleichen Bestandteile wie unter Ziffer 1) beschrieben enthält, werden in
einen 500 ml-Schüttelkolben gegeben, worauf 0,5 ml der Impfkultur
zugesetzt werden. Das Nährmedium wird bei 3O°C während
einer Zeitspanne von 48 Stundin unter Schütteln (140 Upm)
kultiviert. 20 ag Kaliumpanthotenat, 20 al Adenin und 20 mg
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Zystelnhydrochlorid werden in dem Nährmedium aufgelöst, worauf
es mit Wasser verdünnt wird, um es auf ein Volumen von 25 ml zu bringen. Dann wird das Medium weiter bei 3O°C während einer
Zeitspanne von 16 Stunden unter Schütteln (14O Upm) kultiviert.
Die auf diese Weise erhaltene Gärbrühe wird bei 1000C während
einer Zeitspanne von 10 Minuten erhitzt und anschliessend zentrifugiert. 340 ml Wasser werden der überstehenden Lösung
zugesetzt. Auf diese Weise erhält man 510 ml einer rohen CoA-Lösung (pH 6,5, Ionenfestigkeit = 0,04). Die Lösung enthält
94 mg CoA (Reinheit: 0,7 #).
640 g des immobilisierten zellfreien Extrakts, der gemäss Ziffer 2) erhalten worden ist, werden in eine 5 x 50 cm-Säule
gegeben, worauf die Säule mit einer wässrigen 0,01m-Natriumacetatlösung
(pH 6,5) gewaschen wird. 510 ml der auf diese Weise erhaltenen rohen CoA-LiSsung werden durch die Säule mit
einer Fliessgeschwindigkeit von 18 ml/Stunde geschickt. Die Säule wird mit einer wässrigen O,O1m-Natriumacetat-Pufferlösung
(pH 6,5), die 0,03m Natriumchlorid enthält, solange gewaschen, bis alle Verunreinigungen aus der Säule entfernt sind. Dann
wird eine wässrige O^im-Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5)ι
die 0,5m Natriumchlorid enthält, durch die Säule zum Eluieren des CoA geschickt. Das Eluat, das auf diese Weise erhalten wird,
enthält 59 mg CoA (Reinheit: 71 %).
Sarcina lutea (IAM 1099 wird nach der in Beispiel 1, Ziffer 4)
beschriebenen Methode gezüchtet. Die erhaltene Gärbrühe wird auf 10Ö°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten erhitzt und
durch Zentrifugieren abfiltriert. 1 1 der auf diese Weise erhaltenen überstehenden Lösung wird in eine Säule, die mit 10 g
Aktivkohle gefüllt ist, eingeführt, um das CoA an der Säule . zu adsorbieren. Nach einem Waschen der Säule mit Wasser wird
eine Mischung aus wässrigem Azeton und wä.ssrigem Ammoniak
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(wässrige 40 %ige Azetonlösung: wässrige 28 ^ige Ammoniaklösung
= 100:1) durch die Säule geschickt. Die CoA-enthaltenden Eluate werden gesammelt, vereinigt und unter vermindertem Druck
konzentriert, um ein Volumen von 100 ml einzustellen. 15 ml
2-Merkaptoäthanol werden zu 100 ml des konzentrierten Eluats zugesetzt. Dann wird die Mischung auf einen pH von ungefähr
eingestellt. Nachdem die Mischung während einer Zeitspanne von ungefähr 2 Stunden gerührt worden ist, werden 1,2 1 Äthanol
zugesetzt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt und anschliessend in Wasser aufgelöst. 35 ml einer
rohen CoA-Lösung werden erhalten. Die Lösung enthä±t 316 mg
CoA (Reinheit: 13 %).
640 g eines immobilisierten zellfreien Extrakts, der gemäss
Beispiel 1, Ziffer 3) hergestellt worden ist, werden auf eine 5 χ 50 cm-Säule aufgegeben. Die Säule wird mit einer wässrigen
0,01m-Natriumacetatlösung (pH 6,5) gewaschen. 8 ml der in
der vorstehend beschriebenen V/eise erhaltenen CoA-Lösung werden mit 72 ml Wasser verdünnt und durch die Säule mit einer
Fliessgeschwindigkeit von 18 ml/Stunde geschickt. Dann wird die Säule nach der in Beispiel 1, Ziffer 4) beschriebenen
Weise behandelt. Das auf diese Weise erhaltene Eluat enthält
60 mg CoA (Reinheit: 100 0A).
1) Herstellung des zellfreien Extrakts eines CoA-erzeugenden
Mikroorganismus
10 1 eines wässrigen Nährmediums, das 5 %_ (jeweils Gewicht/
Volumen) Glukose, 2,2 % Maiswasser, 1,4 % Pepton, 0,5 % Monokaliumphosphat,
0,5 % Dikaliumphosphat und 0,1 % Magnesiumsulfat. 7H2O enthält, werden in eine Gärungseinrichtung eingefüllt.
Das Nährmedium wird auf einen pH von 7,0 eingestellt und anschliessend sterilisiert. Nachdem Microbacterium flavum
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IAM 1642 auf das Nährmedium aufgeimpft worden ist, wird dieses
in der in Beispiel 1, Ziffer 1) beschriebenen Weise behandelt. Auf diese Weise erhält man 2,6 1 des zellfreien Extraktes von
Microbacterium flavum IAM 1642.
2) Herstellung eines immobiliserten zellfreien Extrakts
1,5 kg der gemäss Beispiel 1, Ziffer 2) hergestellten Bromcyan-aktivierten
Agarose werden zu 2,6 1 des vorstehend erhaltenen zellfreien Extrakts von Microbacterium flavum IAM 1642
gegeben. Dann wird die Misciiung nach der in Beispiel 1, Ziffer 3)
beschriebenen V/eise behandelt. 1,5 kg eines immobilisierten zellfreien Extrakts werden erhalten.
3) Reinigung des CoA
1,5 kg des vorstehend erhaltenen immobilisierten zellfreien
Extrakts werden auf eine 10 cm χ 30 cm-Säule aufgegeben. Die Säule wird mit einer wässrigen. 0,01m-Natriumacetatlösung
(pH 6,5) gewaschen. 11 ml einer rohen CoA-Lösung, die nach der in Beispiel 2 beschriebenen ,/eise hergestellt worden ist,
werden mit Wasser auf ein Volumen von 110 ml verdünnt, worauf
die verdünnte CoA-Lösung (CoA-Gehalt: 99 mg, Reinheit: 13 %)
durch die Säule mit einer Fliessgeschwindigkeit von 18 ml/Stunde geschickt wird. Dann wird die Säule nach der in Beispiel 1,
Ziffer 4) beschriebenen Weise behandelt. Das auf diese Weise erhaltene Eluat enthält 94 mg CoA (Reinheit: 73 %)>
1) Herstellung des zellfreien Extrakts eines CoA-erzeugenden
Mikroorganismus
10 1 eines wässrigen Nährmediums, das 5 % (jeweils Gewicht/
Volumen) Glukose, 1 % Fleischextrakt, 0,45 % Hefeextrakt, 0,55 %
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Proteinhydrolysat, 1,35 % Pepton, 0,5 % Monokaliumphosphat,
0,5 /ο Dikaliumphosphat und 0,1 % Magnesiumsulfat.7^0 enthält,
werden in eine Gärungseinrichtung eingefüllt. Das Nährmedium wird auf einen pH von 7,0 eingestellt und anschliessend sterilisiert.
Nachdem Micrococcus rubens IFO 3768 auf das Nährmedium aufgeimpft worden ist, wird dieses in der in Beispiel 1, Ziffer
1) beschriebenen V/eise behandelt. Auf diese Weise erhiilt
man 3,3 1 des zellfreien Extrakts von Micrococcus rubens IFO 3768.
2) Herstellung eines immobilisierten zellfreien Extrakts
3,65 kg der gemäss Beispiel 1, Ziffer 2) hergestellten Bromcyanaktivierten
Agarose (feucht) werden zu 3>3 1 des vorstehend erwähnten zellfreien Extrakts von Micrococcus rubens IFO 3768
gegeben. Dann wird die Mischung nach der in Beispiel 1, Ziffer 3) beschriebenen Methode behandelt. Man erhält 3,65 kg
eines immobilisierten zellfreien Extrakte.
eines immobilisierten zellfreien Extrakte.
3) Reinigung des CoA
3,65 kg des vorstehend erwähnten immobilisierten zellfreien Extrakts werden auf eine 10 cm χ 75 cm-3äule aufgegeben. Die
Säule wird mit einer wässrigen 0,01m-Natriumacetatxösung gewaschen.
15 ml einer rohen CoA-Lösung, die nach der in Beispiel
2 beschriebenen Weise hergestellt worden ist, werden mit 135 ml Wasser verdünnt, worauf die verdünnte rohe CoA-Lösung
(CoA-Gehalt: 135 mg, Reinheit: 13 %) durch die Säule mit
einer Fliessgeschwindigkeit von 18 ml/Stunde ge.chickt wird. Die Säule wird mit einer wässrigen OjOim-Natriumacetat- Pufferlösung (pH 6,5), die 0,04m Natriumchlorid enthält, solange
gewaschen, bis alle Verunreinigungen aus der Säule entfernt sind. Dann wird die Säule in der in Beispiel 1, Ziffer 4)
beschriebenen Weise behandelt. Das auf diese Weise erhaltene
einer Fliessgeschwindigkeit von 18 ml/Stunde ge.chickt wird. Die Säule wird mit einer wässrigen OjOim-Natriumacetat- Pufferlösung (pH 6,5), die 0,04m Natriumchlorid enthält, solange
gewaschen, bis alle Verunreinigungen aus der Säule entfernt sind. Dann wird die Säule in der in Beispiel 1, Ziffer 4)
beschriebenen Weise behandelt. Das auf diese Weise erhaltene
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Eluat enthält 126 mg CoA (Reinheit: 76 %).
1) Herstellung des zellfreien Extrakts eines CoA-erzeugendai
Mikroorganismus
"0 1 eines wässrigen Nährmediums, das 1 % (,jeweils Gewicht/Volumen)
Glukose, 1,5 % Pepton, 0,1 % Hefeextrakt, 0,3 % Dikaliumphosphat,
0,2 % Natriumchlorid und 0,02 % Magnesiumsulfat.7H2O
enthält, werden in eine Gärungseinrichtung eingefüllt. Das Nährmedium wird auf einen pH von 7,0 eingestellt und anschliessend
sterilisiert. Nachdem Brevibacterium ammoniagenes IAM 1641
auf das Nährmedium aufgeimpft worden ist, wird dieses nach der
in Beispiel 1, Ziffer 1) beschriebenen Weise behandelt. Auf diese Weise erhält man 1,3 1 des zellfreien Extraktes von Brevibacterium
ammoniagenes IAM 1641.
2) Herstellung eines immobilisierten zellfreien Extrakts
1,3 kg der gemäss Beispiel 1, Ziffer 2)-hergestellten Bromcyanaktivierten
Agarose (feucht) werden zu 1,3 1 des vorstehend beschriebenen zellfreien Extraktes von Brevibacterium ammoniagenes
IAM 1641 gegeben. Dann wird die Mischung nach der in Beispiel 1,
Ziffer 3) beschriebenen Weise behandelt. Man erhält 1,3 kg eines immobilisierten zellfreien Extraktes.
3) Reinigung des CoA
1,3 kg des vorstehend erwähnten immobilisierten zellfreien Extraktes werden in 1 1 einer wässrigen Ο,ΟΙΐη-Natriumacetatlösung
(pH 7,0) suspendiert. 4 ml einer rohen CoA-Lösung (CoA-Gehalt: 36 mg, Reinheit: 13 76), hergestellt nach der in Beispiel
2 beschriebenen Methode, werden der Suspension zugesetzt. Die Mischung wird bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne
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von 5 Stunden gerührt, wobei das CoA an dem immobilisierten
zellfreien Extrakt adsorbiert wird. Der immobilisierte zellfreie
Extrakt wird durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,01m-Natriumacetatlösung (pH 7,0), die 0,01m
Natriumchlorid enthält, solange gewaschen, bis alle Verunrei- nigungen aus der immobilisierten Zubereitung entfernt sind.
Dann wird der immobilisierte zellfreie Extrakt in 1,7 1 einer wässrigen 0,01m-Natriumacetatlösung (pH 7,0), die 0,5m Natriumchlorid
enthält, suspendiert. Die Suspension wird bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 2 Stunden gerührt. Dann
wird die Suspension zur Entfernung von unlöslichen Materialien filtriert. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat enthält 23 mg
CoA (Reinheit: 70 %).
1) Herstellung eines immobilisierten CoA
510 g der vorstehend erwähnten Bromcyan-aktivierten Agarose
werden in 1 1 einer wässrigen O,1m-Natriumacetat-Pufferlösung
(pH 6,0) suspendiert, worauf 0,6 g des reduzierten CoA (Reinheit: 92 %) zugesetzt werden. Die Suspension wird bei Zimmertemperatur
während einer Zeitspanne von 3 Stunden gerührt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt. Der
Niederschlag, der auf diese Weise gesammelt worden ist, wird mit Wasser und einer wässrigen O,5m-Natriumchloridlösung gewaschen.
500 g eines immobilisierten CoA werden erhalten. Es enthält 3 mg des reduzierten CoA pro Gramm. Darüber hinaus
ist es gegenüber einer Nitroprussid-Reaktion positiv und zeigt eine Infrarotabsorptionsbande bei 172° cm (R-OCON=).
2) Herstellung einer CoA-Affinitätssubstanz
500 g des immobilisierten CoA, das gemäss Ziffer 1) erhalten
worden ist, werden auf eine 5 x 40 cm-Säule aufgegeben. Die
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Säule wird mit einer wässrigen Ojim-Natriumchloridlösung gewaschen.
Der zellfreie Extrakt von Sarcina lutea IAM 1099, der nach der Methode gemäss Beispiel 1, Ziffer 1) hergestellt worden
ist, wird bei 10C über Nacht durch Zellophan gegen V/asser
dialysiert. 850 ml der dialysierten Lösung werden durcn die
Säule geschickt. Die Säule wird mit einer wässrigen 0,01m-Natriumacetat-Pufferlösung
(pH 6,5), die O, -im Natriumchlorid enthält, solange gewaschen, bis die Verunreinigungen aus der
Säule entfernt sind. Dann wird die Säule mit einer wässrigen 0,01m-Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5), die 0,5m Natriumchlorid
enthält, eluiert. 3 1 des auf diese tfeise erhaltenen Eluats enthalten 3,5 g der CoA-Affinitätssubstanz.
3) Herstellung einer immobilisierten CoA-Affinitätssubstanz
270 g der in Beispiel 1, Ziffer 2) beschriebenen Bromcyan-aktivierten
Agarose (feucht) werden zu 3 1 des gemäss Ziffer 2) erhaltenen Eluats gegeben. Nach einem Rühren der Mischung bei
100C während einer Zeitspanne von 17 Stunden werden erneut 270 g
der gejnäss Ziffer 1) erhaltenen Bromcyan-aktivierten Agarose
(feucht) zugesetzt. Dann wird die Mischung auf einen pH von 6,0 eingestellt und weiter bei 100C während einer Zeitspanne
von 6 Stunden gerührt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt. Der auf diese Weise gesammelte Niederschlag
wird mit einer wässrigen 0,01m-Natriumacetat-Pufferlösung (pH
7,0), die 1m Natriumchlorid enthält, gewaschen. 530 g einer CoA-Äffinitätssubstanz (feucht) werden erhalten.
4) Reinigung des CoA
530 g der gemäss Ziffer 3) erhaltenen immobilisierten CoA-Affini
tätssubstanz (feucht) werden auf eine 5 x 43 cm-Säule gegeben.
Die Säule wird mit einer wässrigen Ο,ΟΙπι-Natriumacetat-Pufferlösung
(pH 6,5), die 0,01m 2-Merkaptoäthanol enthält, gewaschen. 6 ml einer rohen CoA-Lösung, hergestellt gemäss Bei-
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spiel 2, werden mit 72 ml 'rfasser verdünnt und durch die Säuxe
mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1ö ml/Stunde geschickt.
Die Säule wird mit einer wässrigen Ο,ΟΙπι-Natriumacetat-Pufferlösung
(pH 6,5), die O,O3m Natriumchlorid enthält, solange gewaschen,
bis die Verunreinigungen aus der Säuxe entfernt sind. Dann wird die Säule mit einer wässrigen 0,01m—Katriuniacetai;—
Pufferlösung (pH 6,5), die 0,5m Natriumchlorid enrhiit, eluiert.
Das auf diese V/eise erhaltene Eluat enthält 50 mg des reduzierten
CoA (Reinheit: 98 %).
Eine immobixisierte CoA-Affinitätssubstanz wi.d r.acn der ir.
Beispiel 6, Ziffer 3) beschriebenen V/eise hergestellt. Λ k~
der immobilisierten CoA-Affinitätssubstanz wird mit V/asser gewaschen
und dann in 2 1 einer wässrigen OjOim-ITatriumacetatlösung
suspendiert. 12 ml einer rohen' CoA-Lösung, hergestellt nach Beispiel 2, werden der Suspension zugesetzt. Die Suspension
wird bei Zimmertemperatur während einer Zei -spanne von 5
Stunden gerührt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt. Der auf diese "rfeise gesammelte Niederschlag wird
mi einer wässrigen 0,01m-Natriumacetat-Pufferlösung (pH 7,0),
die 0,03m Natriumchlorid enthält, solange gewaschen, bis die Verunreinigungen aus dem Niederschlag entfernt sind. Dann wird
der Niederschlag in 1,3 1 einer wässrigen 0,01m-Natriumaceta lösung
(pH 7,0), die 0,5m Natriumchlorid enthält, suspendiert. Nachdem die Suspension bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne
von 2 Stunden gerührt worden ist, wird der erhaltene Niederschlag durch Filtration entfernt. Das auf diese Weise
erhaltene Fiitrat enthält 81 mg des reduzierten CoA (Reinheit: 98 %).
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Claims (19)
- Patentanspruch«A Verfahren zur/i'einigung des Coenzyms A, dadurch gekennzeichnet, dassA) der zellfreie Extrakt eines Coenzym Α-erzeugenden Mikroorganismus mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid zur Gewinnung eines immobilisierten zellfreien Extrakts vermischt wird und der immobilisierte zellfreie Extrakt gewaschen wird, oderB) das Coenzym A mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid zur Gewinnung eines immobilisierten Coenzyms A vermischt wird, das immobilisierte Coenzym A mit dem zellfreien Extrakt eines Coenzya Α-erzeugenden Mikroorganismus zur Adsorption der Coenzym A-Affinitätssubstanz an dem immobilisierten Coenzym A kontaktiert wird, das immobilisierte Coenzym A gewaschen wird, die Coenzym A-Affinitätssubstanz von dem immobilisierten Coenzym A eluiert wird und die Coenzym A-Affinitätssubstanz mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid zur Gewinnung einer immobilisierten Coenzym A-Affinitätssubstanz vermischt wird, undC) eine Coenzym Α-Lösung mit dem immobilisierten zellfreien Extrakt oder der Coenzym A-Affinitätssubstanz zur Adsorption des Coenzmys A an der immobilisierten Zubereitung kontaktiert wird, der immobilisierte zellfreie Extrakt oder die Coenzym A-Affinitätssubstanz gewaschen wird und anschliessend das Coenzym A von dem immobilisierten zellfreien Extrakt oder der Coenzym A-Affinitätssubstanz eluiert wird.
- 2. Verfahren zur Reinigung des Coenzmys A gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der zellfreie Extrakt eines Coenzym Α-erzeugenden Mikroorganismus mit einem Halogencyanaktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid bei einem pH von 6 bis 9 zur Gewinnung eines immobilisierten zellfreien Extrakts vormischt wird, der immobilisierte zellfreie Extrakt solange409810/0852gewaschen wird, bis die Materialien, welche nicht kovalent daran gebunden sind, entfernt worden sind, eine Coenzym A-Lösung mit dem immobilisierten zellfreien Extrakt bei einem pH von β bis 8 zur Adsorption des Coenzyms A an der immobilisierten Zubereitung kontaktiert wird, der immobilisierte zeilfreie Extrakt mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von weniger als 0,04 gewaschen wird und ancchliessend der immobilisierte zellfreie Extrakt mit einer wässrigen sauren Lösung (pH 2 bis 5) oder mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von mehr als 0,6 zur Eluierung des Coenzyms A aus dem immobilisierten zellfreien Extrakt kontaktiert wird.
- 3. Verfahren zur Reinigung des Coenzyms A gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der zeilfreie Extrakt eines Coenzym Α-erzeugenden Mikroorganismus mit einem Halogencyanaktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid bei einem pH von 6 bis 9 bei O bis 300C zur Gewinnung eines immobilisierten zellfreien Extrakts vermischt wird, der immobilisierte zellfreie Extrakt mit Wasser und/oder einer wässrigen Natriumchloridlösung (pH 6 bis 8) solange gewaschen wird, bis die Materialien, die nicht kovalent gebunden sind, entfernt worden sind, die Coenzym Α-Lösung mit dem immobilisierten zellfreien Extrakt bei einem pH von 6 bis 8 bei 0 bis 300C zur Adsorption des Coenzyms A an der immobilisierten Zubereitung kontaktiert wird, der immobilisierte zellfreie Ex+rakt mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von 0,04 bis 0,02 gewaschen wird und anschliessend der immobilisierte zellfreie Extrakt mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) und einer Ionenstärke von 0,1 bis 0,5 bei 0 bis 300C zur Eluierung des Coenzyms A aus dem immobilisierten zellfreien Extrakt kontaktiert wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der immobilisierte zellfreie Extrakt in der Weise hergestellt wird, dass 10 bis 30 mg (bezogen auf die Proteinmenge)409810/0852ORIGINAL INSPECTEDdes zellfreien Extrakts des Coenzym Α-erzeugenden Mikroorganismus pro Gramm mit dem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid vermischt werden.
- 5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3> dadurch gekennzeichnet, dass der immobilisierte zellfreie Extrakt in der Weise hergestellt wird, dass 15 bis 20 mg (bezogen auf die Proteinmenge) des zellfreien Extrakts des Coenzym A-erzeugsnden Mikroorganismus pro Gramm mit. dem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid vermischt werden.
- 6. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperacur während der Stufen auf 15 bis 25°C eingestellt wird.
- 7. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Halogencyan-aktivierte wasserunlösliche Polysaccharid aus Bromcyan-aktivierter Agarose, Chlorcyan-aktivierter Agarose, Jodcyan-aktivierter Agarose, Bromcyan-aktiviertem Dextran, Chlorcyanaktiviertem Dextran, Jodcyan-aktiviertem Dextran, Bromcyanaktivierter Zellulose, Chlorcyan-aktivierter Zellulose und Jodcyan-aktivierter Zellulose ausgewählt wird.
- 8. Verfahren zur Reinigung des Coenzyms A gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Coenzym A mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid bei einem pH Von 6 bis 8 zur Gewinnung eines immobilisierten Coenzyms A vermischt wird, das immobilisierte Coenzym A mit dem zellfreien Extrakt eines Coenzym Α-erzeugenden Mikroorganismus bei einem pH von 6 bis 8 zur Adsorption einer Coenzym A-Affinitätssubstanz an dem immobilisierten Coenzym A kontaktiert wird, das immobilisierte Coenzym A mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von weniger als 0,1 gewaschen wird, das immobilisierte Coenzym A mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8)409810/08527340407mit einer Ionenstärke von mehr als 0,5 zur Eluierung der Coenzym A-Affiniiätssubstanz von dem immobilisierten Coenz/n '. kontaktiert wird, die erhaltene Coenzym A-Affinitätssubstanz mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen PoIysaccharid bei einem pH von 6 bis 9 zur Gewinnung einer immobilisierten Coenzym A-Affinitätssubstanz vermischt wird, eine Coenzym Α-Lösung mit der immobilisierten Coenzym A-Affinitätssubstanz bei einem pH von 6 bis 8 zur Adsorption des Coenzym A an der immobilieierten Zubereitung kontaktiert wird, die immobilisierte Coenzym A-Affinitätssubstanz mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von weniger als 0,4 gewaschen wird und anschliessend die immobilisierte Coenzym A-Affinitätssubstanz mit einer wässrigen sauren Lösung (pH 2 bis 5) oder mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von mehr als 0,6 zur Eluierung des Coenzym A aus der immobilisierten Coenzym A-Affinitätssubstanz kontaktiert wird.
- 9· Verfahren zur Reinigung des Coenzym A gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Coenzym A mit einem Haiosencyanaktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid bei einem pH von 6 bis 8 sowie- bei O bis 300C zur Gewinnung eines immobilisierten Coenzym A vermischt wird, das immobilisierte Coenzym A mit dem zellfreien Extrakt eines Coenzym Α-erzeugenden Mikroorganismus bei einem pH von 6 bis 8 sowie bei 0 bis 300C zur Adsorption einer Coenzym A-Affinitätscubstanz an dem immobilisierten Coenzym A kontaktiert wird, das immobilisierte Coenzym A mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von 0,1 bis 0,5 gewaschen wird, das immobilisierte Coenzym A mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von 0,5 bis 1 bei 0 bis 300C zur Eluierung der Coenzym A-Affinitätssubstanz von dem immobilisierten Coenzym A kontaktiert wird, die erhaltene Coenzym A-Affinitätssubstanz mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid bei einem pH von 6 bis 9 sowie bei 0 bis 300C vermischt wird,409810/0852BAD ORIGINAL. 27 . 7340407eine Coenzym Α-Lösung mit der immobilisierten Coenzym A-Affinitätssubstanz bei einem pH von 6 bis 8 sowie bei O bis 3O°C zur Adsorption des Coenzym A an der immobilisierten Zubereitung kontaktiert wird, die immobilisierte Coenzym A-Affinitätssubstanz mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von 0,02 bis 0,04 gewaschen wird und anschiiessend die immobilisierte Coenzym A-Affinitätssubstanz mit einer wässrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von 0,1 bis 0,5 bei 0 bis 300C zur Eluierung des Coenzym A von der immobilisierten Coenzym A-Affinitätssubstanz kontaktiert wird.
- 10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das immobilisierte Coenzym Λ in der Weise hergestellt wird, dass 2 bis 10 mg des reduzierten Coenzym A pro Gramm mit dem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid vermischt werden.
- 11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Ioneiifestigkeit des zellfreien Extrakts des Coenzym A-erzeugenden Mikroorganismus auf 0,1 bis 0,05 eingestellt wird.
- 12. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierte Coenzym A-Affinitätssubstanz in der Weise hergestellt werden, dass 10 bis 30 mg (bezogen auf die Proteinmenge) der Coenzym A-Affinitätssubstanz pro Gramm mit dem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid vermischt werden.
- 13. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9» dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierte Coenzym A-Affinitätssubstanz in der Weise .hergestellt-wird, dass 15 bis 20 mg (bezogen auf die Proteinmenge) der Coenzym A-Affinitätssubstanz pro Gramm mit dem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid vermischt werden.409810/0852
- 14. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur während der Stufen auf 15 bis 25°C eingestellt wird.
- 15; Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Halogencyan-äktivierte wasserunlösliche Polysaccharid aus Bromcyän-aktivierter Agarose, Chlorcyan-aktivierter Agarose, Jodcyan-aktivierter Agarose, Bromcyan-aktiviertem Dextran, Chlorcyan-aktiviertem Dextran, Jodcyan-aktiviertaaDextran, Bromcyanaktivierter Zellulose, Chlorcyan-aktivierter Zellulose und Jodcyan-aktivierter Zellulose ausgewählt wird.
- 16. Reduziertes Coenzym A, dessen Aminogruppe an die Hydroxygruppe eines wasserunlöslichen Polysaccharids über eine Carbonylgruppe verbunden ist.
- 17. Reduziertes Coenzym A gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt des reduzierten Coenzym A 2 bis 5 mg pro Gramm des wasserunlöslichen Polysaccharids beträgt.
- 18. Reduziertes Coenzym A gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt des reduzierten Coenzym A 3 bis 5 mg pro Gramm des wasserunlöslichen Polysaccharids beträgt.
- 19. Reduziertes Coenzym A gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserunlösliche Polysaccharid aus Agarose, Dextran oder Zellulose besteht.409810/0852
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