DE2340407B2

DE2340407B2 - Verfahren zur reinigung des coenzyms a

Info

Publication number: DE2340407B2
Application number: DE19732340407
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita; Tosa Tetsuya Kyoto; Matuo Yuhsi Suita; Chibata (Japan)
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co, Ltd., Osaka (Japan)
Priority date: 1972-08-10
Filing date: 1973-08-09
Publication date: 1977-08-18
Also published as: GB1440369A; US3935072A; FR2195639A1; DE2340407C3; FR2195639B1; DE2340407A1

Description

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn- ι ο zeichnet, daß der immobilisierte Coenzym A in der Weise hergestellt wird, daß 2 bis 10 mg des reduzierten Coenzyms A pro Gramm des Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharids vermischt werden. ι s

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenstärke des zellfreien Extrakts des Coenzym A erzeugenden Mikroorganismus oder der tierischen Gewebe auf 0,05 bis 0,1 eingestellt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierte Coenzym-A-Affinitätssubstanz in der Weise hergestellt wird, daß 10 bis 30 mg, vorzugsweise 15 bis 20 mg, (bezogen auf die Proteinmenge) der Coenzym-A-Affinitätssubstanz pro Gramm des Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharids vermischt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Temperatur von 15 bis 25⁰C gearbeitet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Halogencyan-aktiviertes wasserunlösliches Polysaccharid Bromeyan-aktivierte Agarose, Chlorcyan-aktivierte Agarose, Jodcyanaktivierte Agarose, Bromcyan-aktiviertes Dextran, Chlorcyan-aktiviertes Dextran, Jodcyan-aktiviertes Dextran, Bromcyan-aktivierie Zellulose, Chlorcyanaktivierte Zellulose oder Jodcyan-aktivierte Zellulose verwendet wird.

Die Erfindung betrifft die Reinigung des Coenzyms A.

Es ist bekannt, daß das Coenzym A (nachfolgend als »CoA« bezeichnet) eine wichtige Verbindung bei Stoffwechselprozessen von lebenden Zellen ist. Beispielsweise ist diese Verbindung für den Stoffwechsel von Kohlehydraten, Fetten und Aminosäuren sowie bei der Biosynthese von Protohäm IX von Bedeutung.

Einige Methoden zur Reinigung von CoA sind bekannt. Bei der Durchführung einer bekannten Methode wird CoA in der Weise gereinigt, daß eine rohe CoA-Lösung mit einem Schwermetallsalz (beispielsweise einem Quecksilbersalz, Bleisalz, Silbersalz oder Bariumsalz), Phosphowolframsäure oder einem organischen Lösungsmittel (beispielsweise Azeton) behandelt wird (vgl. Journal of Biological Chemistry 186, 235-243, ibid. 193, 307-316). Bei einer anderen Methode wird CoA durclbi eine Aktivkohle-Adsorptionsmethode oder durch Chromatographie an einer Säule aus einem Ionenaustauscher gereinigt (vgl. Journal of American Chemical Society 72, 4838, US-PS 28 28 302, Biochemistry 5, 3883-3*186, JA-PS 10188/1965). Diese Methoden eignen sich jedoch nicht für eine Durchführung in technischem Maßstäbe infolge einer unzureichenden Reinigung von CoA sowie eines großen Verlustes an CoA während der einzelnen Maßnahmen.

Es wurde nunmehr gefunden, daß eine biologische spezifische Wechselwirkung zwischen CoA und seinen zugeordneten Enzymen in vorteilhafter Weise zur Reinigung von CoA verwendet werden kann. Enzyme oder Proteine, die ein« spezifische und einzigartige Affinität für CoA besetzen, sind in unvermeidbarer Weise in lebenden Zellen von CoA erzeugenden Mikroorganismen enthalten. Derartige Enzyme oder Proteine (d. h. CoA-Affinitätssubstanzen) lassen sich in vorteilhafter Weise als ein Ligand verwenden, der mit einem festen Träger für eine Affinitätschromatographie verbunden wird. Es wurde ferner gefunden, daß sich das Ankuppeln des Liganden in einfacher Weise derart bewirken läßt, daß der zellfreie Extrakt des CoA erzeugenden Mikroorganismus mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid immobilisiert wird. Ferner wurde gefunden, daß die vorstehend erwähnte Kupplung in der Weise erzielt werden kann, daß eine CoA-Affinitätssubstanz aus dem zellfreien Extrakt eines CoA erzeugenden Mikroorganismus in der Weise abgetrennt wird, daß ein !immobilisiertes CoA verwendet wird, worauf die isolierte CoA-Affinitätssubstanz mit dem Halogencyanaktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid immobilisiert wird. Der erhaltene immobilisierte: zellfreie Extrakt, in dem die CoA-Affinitätssubstanz enthalten ist, oder die erhaltene immobilisierte CoA-Afi'initätssubstanz werden als Adsorbens für die Affinitätschromatogjaphie einer rohen CoA-Lösung verwendet.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung einer neuen und praktischen Methode zur Behandlung einer rohen CoA-Lösung zur Gewinnung einer gereinigten CoA-Lösung. Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung von CoA durch Affinitätschromatographie zur Verfügung gestellt Bei diesem Verfuhren kann CoA in einer rohen CoA-Lösung in der Weise gereinigt werden, daß eine biologisch spezifische Wechselwirkung zwischen CoA und einer CoA-Affinitiitssubstanz

Go ausgenützt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Reinigung von CoA ohne einen erheblichen Verlusi: an dieser Substanz während der einzelnen Maßnahmen.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Diese

(15 betrifft somit die in den Ansprüchen definierten Gegenstände.

Der Grundgedanke der Erfindung läßt sich somit durch das folgende !Schema wiedergeben:

Stufe A): Immobilisierung des zellfreien Extraktes eines CoA erzeugenden Mikro-Mikroorganismus mit einem Halogencyan - aktivierten wasserunlöslichen Polysacchario, wobei ein immobilisierter zellfreier Extrakt erhalten wird, der eine CoA-Affinitätssubstanz enthält.

Stufe B): Waschen des immobilisierten zellfreien Extraktes.

Stufe C): Immobilisierung des CoA mit einem Halogencyan-akttvierten wasserunlöslichen Polysaccharid.

Stufe D): Kontaktierung des zellfreien Extraktes eines CoA erzeugenden Mikroorganismus mit dem immobilisierten CoA, wodurch die CoA-Affinitätssubstanz daran adsorbiert wird.

Stufe E): Waschen des immobilisierten CoA.

Stufe F): Eluierung der CoA-Affinitätssubstanz von dem immobilisierten CoA.

Stufe G): Immobilisierung der CoA-Affinitätssubstanz mit einem Halogencyari-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid.

Stufe H): Kontaktieren einer rohen CoA-Lösung mit dem immobilisierten zellfreien Extrakt oder der immobilisierten CoA-Affinitätssubstanz zur Adsorption von CoA an der immobilisierten Zubereitung.

Stufe I): Waschen der immobilisierten Zubereitung.

Stufe J): Eluierung von CoA von der immobilisierten Zubereitung.

Mikroorganismen, die CoA erzeugen, können für die erfindungsgemäßen Zwecke eingesetzt werden. Beispiele für CoA erzeugende Mikroorganismen sind Sarcina lutea IAM (Institute of Applied Microbiology, Tokyo University, Japan) 1099, Sarcina auranfiaca IAM 1059, Sarcina aurantiaca IFO (Institute for Fermentation, Osaka, Japan) 3064, Mikrococcus rubens IFO 3768, Microbacterium flavum IAM 1642, Brevibacterium ammoniagenes IAM 1641, Cornyebacterium alkanophilum nov. sp. ATCC 21071 und Pseudomonas alkanolytica nov. sp. ATCC 21034. Alle diese Mikroorganismen sind von den vorstehend angegebenen Deponien erhältlich. In diesem Zusammenhang ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die Erfindung nicht auf die Verwendung dieser spezifischen Mikroorganismen beschränkt ist, sondern vielmehr die Verwendung aller CoA

Wasserunlösliches
Polysaccharid

ΟΗΊ
OH J_n

erzeugenden Mikroorganismen umfaßt Der zellfreie Extrakt eines jeden der vorstehend erwähnten Mikroorganismen wird nach an sich bekannten Methoden hergestellt, beispielsweise durch eine Homogenisierungs-, Ultraschallzerstörungs- oder Lysozymbehandlung (vgl. beispielsweise Methods in Enzymology, Academic press Ina, New York, Band 1, Seite 51 [1955]). Darüber hinaus wird das erfindungsgemäße Halogency an-aktivierte wasserunlösliche Polysaccharid nach einer bekannten Methode hergestellt, die in »Nature« 214, 1302 -1304 (1967), beschrieben wird Die Aktivierungsreaktion eines wasserunlöslichen Polysaccharids (beispielsweise Agarose, Dextran oder Zellulose) mit einem Halogencyan wird durch das folgende Schema wiedergegeben:

Wasserunlösliches FOCNi

—Lc -

Polysaccharid

oh J_n

Wasserunlösliches Polysaccharid O\

C = NH

(= Halogcncyan-akti viertes

wasserunlösliches Polysaccharid)

Geeignete Beispiele für die aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharide sind mit Bromcyan aktivierte Agarose, mit Chlorcyan aktivierte Agarose, mit Jodcyan aktivierte Agarose, mit Bromcyan aktiviertes Dextran, mit Chlorcyan aktiviertes Dextran, mit Jodcyan aktiviertes Dextran,, mit Bromcyan aktivierte Zellulose, mit Chlorcyan aktivierte Zellulose sowie mit Jodcyan aktivierte Zellulose. Zur Herstellung des aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharids, das sich für die erfindungsgemäße Verwendung eignet, ist es vorzuziehen, 0,01 bis 0,05 Mol, insbesondere 0,01 bis 0,03 Mol, eines Halogencyans pro Gramm des wasserunlöslichen Polysaccharids einzusetzen. Beispielsweise werden vorzugsweise 1 bis 2 g Bromcyan pro Gramm des wasserunlöslichen Polysaccharids zur Durchführung der Aktivierungsreaktion verwendet.

Die Immobilisierung des zellfreien Extraktes (d.h. Stufe A) bei der Durchführung der Erfindung läßt sich in einfacher Weise derart bewerkstelligen, daß der zellfreie Extrakt eines CoA erzeugenden Mikroorganismus mit dem Halogencyan-aküvierten wasserunlöslichen Poiysaccharid bei einem pH von 6 bis 9 vermischt wird. Die Reaktion kann bei 0 bis 30⁰C, insbesondere 15 bis 25° C, unter Rühren durchgeführt werden. Die bevorzugte Menge des eingesetzten zellfreien Extrakts zur Durchführung der Immobilisierungsreaktion liegt zwischen 10 und 30 mg und insbesondere zwischen 15 und 20 mg (bezogen auf die Proteinmenge) pro Gramm des Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharids. Die !mmobilisierungsreaktion kann innerhalb von 10 bis 30 Stunden beendet sein. Der erhaltene immobilisierte zellfreie Extrakt, der eine CoA-Affinitätssubstanz enthält, wird dann mit einem Lösungsmittel so lange gewaschen, bis alle Materialien entfernt sind, die nicht kovalent an dem aktivierten wasserunlöslichen Poiysaccharid gebunden sind. Wasser sowie eine wäßrige Natriumchloridlösung (pH 6 bis 8) können als

ι ο Waschlösungsmittel verwendet werden.

Die Immobilisierung des CoA (d. h. die Stufe C im vorstehenden Schema) wird in der Weise durchgeführt, daß CoA mit dem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Poiysaccharid bei einem pH von 6 bis 8 vermischt wird. Die Immobilisierungsreaktion kann bei 0 bis 30⁰C und insbesondere bei 15 bis 25⁰C unter Rühren durchgeführt werden. Bei dieser Immobilisierungsreaktion sollte ein hochgereinigtes CoA, insbesondere eine authentische Probe des reduzierten CoA, verwendet werden. Die Immobilisierungsreaktion des CoA kann innerhalb von 6 bis 10 Stunden beendet sein. Die vorteilhafte Menge reduziertes CoA, das an dem aktivierten wasserunlöslichen Poiysaccharid gebunden ist, beträgt 2 bis 10 mg, insbesondere 2 bis 5 mg bzw. 3 bis 4 mg, jeweils pro Gramm des aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharids. Das auf diese Weise erhaltene immobilisierte CoA kann durch die folgende Formel wiedergegeben werden:

Wasserunlösliches
Poiysaccharid

-OH
-OCONH

CONHCH₂CH₂CONHCH₂CH₂Sh

CHOH

O O C(CH₃)₂

CH₂O-P-O-P-OCH₂ O O

0-PO₃H₂

Zur Durchführung der Adsorptionsmethode (d. h. der Stufe D im vorstehenden Schema) ist es vorzuziehen, den zellfreien Extrakt mit einer Ionenstärke von weniger als 0,1 und insbesondere 0,05 bis 0,1 zu verwenden. Besitzt der zellfreie Extrakt, der aus dem CoA erzeugenden Mikroorganismus erzeugt wird, eine tonenstärke von mehr als O₁I, dann ist es zu empfehlen, diesen Extrakt vor der Adsorptionsmethode der Stufe D gegen Wasser zu dialysleren. Besitzt andererseits der zellfreie Extrakt eine Ionenstärke von weniger als 0,05, dann kann ein Inerter Elektrolyt, wie Natriumchlorid, in einer solchen Menge zugesetzt werden, daß die Ionenstärke auf 0,05 bis 0,1 eingestellt wird. Der derart eingestellte zellfreie Extrakt wird dann mit dem Immobilisierten CoA vermischt, worauf die Mischung bei 0 bis 30° C und Insbesondere bei 15 bis 25⁰C gerührt wird. Dann wird die Mischung filtriert, worauf das auf diese Weise immobilisierte CoA mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer lonenstärke von 0,05 bis 0,1 gewaschen wird. Beispiele für Waschlösungsmittel, die zur Durchführung der Stufe E im vorstehenden Schema verwendet werden können, sind eine wäßrige 0,01-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5), die 0,05-m Natriumchlorid enthält, sowie eine wäßrige 0,01-m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,05-m

Natriumchlorid enthält. Durch diese Maßnahmen wird das immobilisierte CoA, an dem eine CoA-Affinitätssub- Stanz adsorbiert 1st, erhalten. Wahlweise können die Adsorption sowie die sich daran anschließenden Maßnahmen (d. h. die Stufen D bis P im vorstehenden

ss Schema) gernäß vorliegender Erfindung unter Verwendung einer Säule durchgeführt werden. Beispielswelse wird das bei der Durchführung der Stufe C erhaltene immobilisierte CoA in eine Säule gegeben, worauf der zellfreie Extrakt (pH 6 bis 8), der in der vorstehend

beschriebenen Weise eingestellt worden ist, durch die Säule bei 0 bis 3O⁰C und insbesondere bei 15 bis 25⁰C geschickt wird. Durch Waschen der Säule mit einer wäßrigen Lösung, wie sie vorstehend geschildert worden ist, wird das immobilisierte CoA, an dem die

6s CoA-Affinitätssubstanz adsorbiert ist, erhalten.

Ein Eluieren der CoA-Afflnitätssubstanz von dem Immobilisierten CoA, d.h. die Stufe P, läßt sich in einfacher Weise durchführen. Als Eluierlösungsmlttei

7OB 633/441

wird eine wäßrige Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von mehr als 0,5 und insbesondere 0,5 bis 1 verwendet. Beispielsweise können in geeigneter Weise eine wäßrige 0,01-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5), die 0,5-m Natriumchlorid enthält, sowie eine wäßrige 0,1-m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,2-m Natriumchlorid enthält, als Eluierlösungsmittel verwendet werden. Die Eluierung kann bei 0 bis 3O⁰C und insbesondere 15 bis 25⁰C durchgeführt werden. Die Immobilisierung der CoA-Affinitätssubstanz, die auf diese Weise eluiert worden ist, d.h. die Stufe G im vorstehenden Schema, kann in der gleichen Weise wie die Stufe A durchgeführt werden. Die bevorzugte Menge der CoA-Affinitätssubstanz, die bei der Immobilisationsreaktion der Stufe G eingesetzt wird, beträgt 10 bis 30 mg, insbesondere 15 bis 20 mg (bezogen auf die Menge des Proteins) pro Gramm des Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharide.

Der bei der Durchführung der Stufen B oder G erhaltene zellfreie Extrakt oder die CoA-Affinitätssubstanz wird dann mit einer rohen CoA-Lösung zur CoA-Adsorption an der immobilisierten Zubereitung kontaktiert Dies bedeutet, daß der immobilisierte zellfreie Extrakt oder die CoA-Affinitätssubstanz mit der rohen CoA-Lösung vermischt wird, worauf die Mischung gerührt wird. Nach einem Filtrieren der Mischung wird die gewonnene immobilisierte Zubereitung mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen. Durch diese Maßnahmen wird der immobilisierte zellfreie Extrakt oder die CoA-Affinitätssubstanz mit adsorbiertem CoA erhalten. Wahlweise können die Adsorption sowie die sich ihr anschließenden Maßnahmen (d. h. die Stufen H bis I im vorstehenden Schema) unter Verwendung einer Säule durchgeführt werden. Beispielsweise kann die immobilisierte Zubereitung, die bei der Durchführung der Stufen B oder G erhalten worden ist, in eine Säule gegeben werden, worauf eine rohe CoA-Lösung durch die Säule mit einer gegebenen Fließgeschwindigkeit geschickt wird. Durch Waschen der Säule mit einem geeigneten Lösungsmittel wird der immobilisierte zellfreie Extrakt oder die CoA-Affinitätssubstanz mit absorbiertem CoA erhalten. Die Adsorptionsmethode (d. h. die Stufe H) wird vorzugsweise bei einem pH von 6 bis 8 und bei 0 bis 30°C und insbesondere 15 bis 25° C durchgeführt. Als Waschlösungsmittel zur Durchführung der Stufe I kann eine wäßrige Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von weniger als 0,04 und insbesondere mit einer ionenstärke von 0,02 bis 0,04 verwendet werden. Beispiele für geeignete Waschlösungsmittel, die zur Durchführung der Stufe 1 verwendet werden können, sind eine wäßrige 0,01 -m NatriumaceUi-Pufferlösung (pH 6,5), Hie 0,03-m Natriumchlorid enthält, sowie eine wäßrige 0,005-m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,02-m Natriumchlorid enthält,

Die Eluierung des CoA von dem erhaltenen

immobilisierten zellfreien Extrakt oder der CoA-Affinitätssubstanz, d. h. die Stufe J im vorstehenden Schema, kann bei 0 bis 3O⁰C und insbesondere bei 15 bis 25⁰C durchgeführt werden. Eine wäßrige saure Lösung mit

einem pH von 2 bis 5 wird als Eluierlösungsmittel zur Durchführung dieser Stufe eingesetzt. Dartiber hinaus wird eine wäßrige Lösung mit einem pH von 6 bis 8 sowie mit einer Ionenstärke von mehr als 0,06, insbesondere mit einer Ionenstärke von 0,01 bis 0,5, als

ίο Eluierlösungsmittel für diesen Zweck eingesetzt Bevorzugte Beispiele für Eluierlösungsmittel, die zur Durchführung der Stufe ] eingesetzt werden können, sind eine wäßrige 0,01-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5), die 0,1-m Natriumchlorid enthält, sowie eine wäßrige

0,01-m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,06-m Natriumchlorid enthält. Ist das Eluieren beendet, dann wird der immobilisierte zellfreie Extrakt oder die CoA-Affinitätssubstanz in Form eines festen Materials gewonnen. Die auf diese Weise erhaltene immobilisierte

Zubereitung kann wiederholt für die erfindungsgemäßen Zwecke eingesetzt werden.

Nach dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich ein CoA-Extrakt, der aus tierischen Geweben (beispielsweise Hundelebern) oder

der Gärungsbrühe eines CoA erzeugenden Mikroorganismus erhalten wird, in einfacher Weise reinigen. Darüber hinaus kann eine überstehende Lösung oder ein Filtrat, das durch Zentrifugieren oder Filtrieren der erhitzten Gärbrühe eines CoA erzeugenden Mikroorga-

nismus erhalten wird, als rohe CoA-Lösung gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt werden. Eine CoA-Lösung, die durch Reinigen einer derartigen überstehenden Flüssigkeit oder eines derartigen Filtrats mit Aktivkohle erhalten wird, kann ebenfalls als rohe

CoA-Lösung gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden. Wahlweise kann die CoA-Lösung, die in der vorstehend beschriebenen Weise mit Aktivkohle gereinigt worden ist, weiter durch Chromatographie an einer Säule aus einem lonenaustauscherharz, wie beispiels-

weise DEAE-Zellulose, vor der erfindungsgemäßen Reinigung gereinigt werden.

Die folgenden Beispiele zeigen praktische und bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Erfindungsgemäß wird die Menge an

4s CoA (d.h. die Gesamtmenge an reduziertem oder oxydiertem CoA) in Gegenwart von Zystein nach der Phosphotransacetylase-Methode ermittelt, die in »The Journal of Biological Chemistry« 191, 365 (1951), beschrieben wird. Die Menge des reduzierten CoA wird

so ebenfalls spektrophotometrisch nach der Phosphotransacetylase-Methode ermittelt, die in »Methods of Enzymatic Analysis«, Seite 512 (1963) (Academic Press Incorp.), beschrieben wird. Die Reinheit (%) des CqA sowie des reduzierten CoA wird gemäß folgender

is Gleichung bestimmt:

Reinheit (%) des CoA

Menge des CoA (d. h. Gesamtmenge des reduzierten und oxydierten CoA), j! 1. _dcr vorstehend Beschilderten Methode ermittelt wird.

Menge an CoA fd. h. Gesamtmenge an reduziertem und oxydiertem CoA), die aus der Extinktion bei 257 nm ermittelt wird.

Reinheit des reduzierten CoA » - -r

Menge des reduzierten CoA, die nach der vorstehend geschilderten Methode ermittelt wird.

Menge des reduzierten CoA, die aus der Extinktion bei 2S7 nm ermittelt wird.

Darüber hinaus wird die Menge der CoA-Affinitätssubstanz nach der Methode ermittelt, die in »The Journal of Biological Chemistry«, 198, 265 (1951), beschrieben wird. Unter dem Begriff »CoA-(oder Coenzym A-)Affinitätssubstanz« soll eine Gruppe von Enzymen oder Proteinen verstanden werden, die in unvermeidbarer Weise in lebenden Zellen eines CoA (oder Coenzym Λ) erzeugenden Mikroorganismus enthalten und gleichzeitig an CoA (oder Coenzym A) in einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von weniger als 0,1 adsorbiert ist. Ferner soll der Begriff »CoA-(oder Coenzym A-)Affinitätasubstanz« zum Ausdruck bringen, daß es sich um eine Mischung ius Enzymen oder Proteinen handelt, die aus Dephospho-CoA (ader Coenzym A)-Kinase, Acyltransferase, Acyl-CoA-(oder Coenzym A-)Reduktase, Palmitoyl-CoA-(oder Coenzym A-)Hydrolase, Succinyl-CoA-(oder Coenzym A-)Hydrolase, Citratsynthase oder anderen analogen Proteinen mit einer Affinität zu CoA ausgewählt sind.

Beispiel 1

1) Herstellung des zellfreien Extrakts eines CoA erzeugenden Mikroorganismus

101 eines wäßrigen Nährmediums, das 10% (Gewicht/Volumen) Glukose, 2,2% (Gewicht/Volumen) Maisquellwasser, 1,35% (Gewicht/Volumen) Pepton, 0,5% (Gewicht/Volumen) Monokaliumphosphat, 0,5% (Gewicht/Volumen) Dikaliumphosphat, 0,1% (Gewicht/ Volumen)Magnesiumsulfat · 7H₂O, l,0%(Gewichl/Volumen) Ammoniumacetat und 0,05 μ§/ιη1 Biotin enthält, werden in eine Gärungseinrichtung eingefüllt. Das Nährmedium wird auf einen pH von 7,0 eingestellt und anschließend sterilisiert. Sarcina lutea !AM 1099 wird auf das Nährmedium aufgeimpft. Dann wird das Medium bei 3O⁰C während einer Zeitspanne von 72 Stunden unter Belüftung (3 l/Minute) und Rühren (350 Upm) kultiviert. Die auf diese Weise erhaltene Gärbrühe wird zentrifugiert. Die dabei gesammelten Mikrobenzellen werden lyophilisiert, wobei 500(5 der lyophilisierten Zellen von Sarcina lutea IAM 1099 erhalten werden. 100 g der lyophilisierten Zieüen werden in 3,51 einer 0,05-m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert Die Suspension wird einer Ultraschallbehandlung (20 Kilohertz/Stunde) unter Eiskühlen unterzogen und anschließend zentrifugiert. 31 des zellfreien Extrakts von Sarcina lutea IAM 1099 werden erhalten.

2) Herstellung eines Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharide

700 g Agarose (feuoht) werden in 281 einer wäßrigen Bromcyanlösung (Bromcyangehalt: 25 mg/ml) suspendiert, worauf die Suspension bei ungefähr 25⁰C während einer Zeitspanne von 8 Minuten gerührt wird. Die Suspension wird bei einem pH von 11 unter Verwendung einer wäßrigen Sn-Natriumhydroxydlösung während der Reaktion gehalten. Nach der Reaktion wird der erhaltene Niederschlag durch Filtration gesammelt Der auf diese Welse gesammelte Niederschlag wird mit Wasser und einer wäßrigen 0,1 -m Natrlumbicarbonatlösung gewaschen. 650 g der Bromcyan-aktivlerten Agarose werden in feuchter Form erhalten.

3) Herstellung eines immobilisierten zellfreien Extrakts

320 g der Bromcyan-aktivierten Agarose (feucht) werden zu 31 des zellfreien Extrakts gegeben, der Gemäß 1) hergestellt worden ist. Nachdem die Mischung während einer Zeitspanne von 17 Stunden bei 10⁰C gerührt worden ist, werden 320 g der Bromcyanaktivierten Agarose (feucht) zugegeben. Dann wird die

ίο Mischung auf einen pH von 6 eingestellt und während einer Zeitspanne von 6 Stunden bei 10⁰C gerührt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt Der auf diese Weise gesammtelte Niederschlag wird mit Wasser und einer wäßrigen 0,01 -m Natrium acetatiösung (pH 7,0) gewaschen. 640 g eines immobili sierten zellfreien Extrakts (feucht) werden erhalten.

4) Reinigung des CoA

Eine Impfkultur wird in der Weise hergestellt, daß

Sarcina lutea IAM 1099 während einer Zeitspanne von 20 Stunden in einem wäßrigen Medium gezüchtet wird, welches die gleichen Bestandteile enthält, wie sie im Zusammenhang mit den Ausführungen unter Ziffer 1) beschrieben worden sind. 20 ml eines wäßrigen Nähr mediums, welches die gleichen Bestandteile wie unter Ziffer 1) beschrieben enthält, werden in einen 500-ml-SchüUelkolben gegeben, worauf 0,5 ml der Impfkultur zugesetzt werden. Das Nährmedium wird bei 30⁰C während einer Zeitspanne von 48 Stunden unter Schütteln (140 UpM) kultiviert. 20 mg Kalium panthotenat, 20 ml Adenin und 20 mg Zysteinhydro· chlorid werden in dem Nährmedium aufgelöst, worauf es mit Wasser verdünnt wird, um es auf ein Volumen von 25 ml zu bringen. Dann wird das Medium weiter bei 3O⁰C während einer Zeitspanne von 16 Stunden unter Schütteln (140 UpM) kultiviert. Die auf diese Weise erhaltene Gärbrühe wird bei 10O⁰C während einer Zeitspanne von 10 Minuten erhitzt und anschließend zentrifugiert. 340 ml Wasser werden der überstehenden Lösung zugesetzt. Auf diese Weise erhält man 510 ml einer rohen CoA-Lösung (pH 6,5, Ionenfestigkeit -0,04). Die Lösung enthält 94 mg CoA (Reinheit: 0,7%).

640 g des immobilisierten zellfreien Extrakts, der gemäß Ziffer 2) erhalten worden ist, werden in eine 5x50cm-Säule gegeben, worauf die Säule mit einer wäßrigen 0,01 -m Natriumacetatlösung (pH 6,5) gewaschen wird. 510 ml der auf diese Weise erhaltenen rohen CoA-Lösung werden durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 18 ml/Stunde geschickt. Die

so Säule wird mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetat· Pufferlösung (pH 6,5), die 0,03-m Natriumchlorid enthält, so lange gewaschen, bis alle Verunreinigungen aus der Säule entfernt sind. Dann wird eine wäßrige O₁Ol-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5), die 0,5-m Natrl*

umchlorid enthält, durch die Säule zum Eluieren des CoA geschickt Das Eluat, das auf diese Weise erhalten wird, enthält 59 mg CoA (Reinheit: 71%).

Beispiel 2

Sarcina lutea IAM 1099 wird nach der In Beispiel I, Ziffer 4) beschriebenen Methode gezüchtet. Die erhaltene Gärbrühe wird auf 100" C während einer Zeltspanne von 10 Minuten erhitzt und durch Zentrifugleren abfiltriert. 11 der auf diese Welse erhaltenen

(ij Überstehenden Lösung wird In eine Säule, die mit 10 g Aktivkohle gefüllt ist, eingeführt, um das CoA an der Säule zu adsorbieren. Nach einem Wasohen der Säule mit Wasser wird eine Mischung aus wäßrigem Azeton

und wäßrigem Ammoniak (wäßrige 40%ige Azetonlösung: wäßrige 28%ige Ammoniaklösung = 100 :1) durch die Säule geschickt Die CoA enthaltenden Eluate werden gesammelt, vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert, um ein Volumen von 100 ml einzustellen. 15 ml 2-Merkaptoäthanol werden zu 100 ml des konzentrierten Eluats zugesetzt Dann wird die Mischung auf einen pH von ungefähr 8 eingestellt. Nachdem die Mischung während einer Zeitspanne von ungefähr 2 Stunden gerührt worden ist, werden 1,2 I Äthanol zugesetzt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt und anschließend in Wasser aufgelöst. 35 ml einer rohen CoA-Lösung werden erhalten. Die Lösung enthält 316 mg CoA (Reinheit: 13%).

640 g eines immobilisierten zellfreien Extrakts, der gemäß Beispiel 1, Ziffer 3) hergestellt worden ist, werden auf eine 5 χ 50 cm-Säule aufgegeben. Die Säule wird mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetatlösung (pH 6,5) gewaschen. 8 ml der in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen CoA-Lösung werden mit 72 ml Wasser verdünnt und durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 18 ml/Stunde geschickt. Dann wird die Säule nach der in Beispiel 1, Ziffer 4) beschriebenen Weise behandelt Das auf diese Weise erhaltene Eluat enthält 60 mg CoA (Reinheit: 100%).

Beispiel J

!) Herstellung des zollfreien Extrakts eines CoA erzeugenden Mikroorganismus

101 eines wäßrigen Nährmediums, das 5% (jeweils Gewicht/Volumen) Glukose, 2,2% Maisquellwasser, 1,4% Pepton, 0,5% Monokaliumphosphat, 0,5% Dikaliumphosphai und 0,1 % Magnesiumsulfat · 7 H₂O enthält, werden in eine Gärungseinrichtung eingefüllt Das Nährmedium wird auf einen pH von 7,0 eingestellt und anschließend sterilisiert. Nachdem Microbacterium flavum IAM 1642 auf das Nährmedium aufgeimpft worden ist, wird dieses in der in Beispiel 1, Ziffer 1) beschriebenen Weise behandelt. Auf diese Weise erhält man 2,61 des zellfreien Extraktes von Microbacterium flavum IAM 1642.

2) Herstellung eines immobilisierten zellfreien Extrakts

1,5 kg der gemäß Beispiel 1, Ziffer 2) hergestellten Bromcyan-aktivierten Agarose werden zu 2,61 des vorstehend erhaltenen zellfreien Extrakts von Microbacterium flavum IAM 1642 gegeben. Dann wird die Mischung nach der in Beispiel 1, Ziffer 3) beschriebenen Weise behandelt. I₁S kg eines immobilisierten zellfreien Extrakts werden erhalten.

3) Reinigung des CoA

13 kg des vorstehend erhaltenen immobilisierten zellfreien Extrakts werden auf eine 10x30-cin-Säule aufgegeben. Die Säule wird mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetatlösung (pH 6,5) gewaschen. 11 ml einer rohen CoA-Löiumj, die nach der In Beispiel 2 beschriebenen Welse hergestellt worden Ist, worden mit Wasser auf ein Volumen von UOmI verdünnt, worauf die verdünnte CoA-Lösung (CoA-Gehalti 99 mg, Reinheit! 13<H>) durch die SHuIe mit einer Flleßgesohwlndlgkelt von 18 ml/Stunde geschickt wird. Dann wird die Säule nach der In Beispiel 1, Ziffer 4) beschriebenen Waise behandelt Dai auf diese Welse erhaltene Bluat enthält 94 mg CoA (Reinheit: 73%).

Beispiel 4

101 eines wäßrigen NShrmediums, das 5% (jeweils Gewicht/Volumen) Glukose, 1% Fleischextrakt, 0,45% Hefeextrakt, 0,55% Proteinhydrolysat, 135% Pepton, 0,5% Monokaliumphosphat, 0,5% Dikaliumphosphat und 0,1% Magnesiumsulfat · 7 HzO enthält, werden in

ίο eine Gärungseinrichtung eingefallt Das Nährmedium wird auf einen pH von 7,0 eingestellt und anschließend sterilisiert. Nachdem Micrococcus rubens IFO 3768 auf das Nährmedium aufgeimpft worden ist, wird dieses in der in Beispiel 1, Ziffer 1) beschriebenen Weise behandelt. Auf diese Weise erhält man 3,31 des zellfreien Extrakts von Micrococcus rubens IFO 3768.

2) Herstellung eines immobilisierten

zellfreien Extrakts

3,65 kg der gemäß Beispiel I, Ziffer 2) hergestellten Bromcyan-aktivierten Agarose (feucht) werden zu 3,31 des vorstehend erwähnten zellfreien Extrakts von Micrococcus rubens IFO 3768 gegeben. Dann wird die Mischung nach der in Beispiel 1, Ziffer 3) beschriebenen

Methode behandelt. Man erhält 3,65 kg eines immobilisierten zellfreien Extrakts.

3) Reinigung des CoA

3,65 kg des vorstehend erwähnten immobilisierten zellfreien Extrakts werden auf eine 10x75-cm-Säule aufgegeben. Die Säule wird mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetatlösung 15 ml einer rohen CoA-Lösung, die nach der in Beispiel 2 beschriebenen Weise hergestellt worden ist, werden mit 135 ml Wasser verdünnt, worauf die verdünnte rohe CoA-Lösung (CoA-Gehalt: 135 mg, Reinheit: 13%) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 18 ml/Stunde geschickt wird. Die Säule wird mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5), die 0,04-m

Natriumchlorid enthält so lange gewaschen, bis alle Verunreinigungen aus der Säule entfernt sind. Dann wird die Säule in der in Beispiel 1, Ziffer 4) beschriebenen Weise behandelt Das auf diese Weise erhaltene Eluat enthält 126 mg CoA (Reinheit: 76%).

Beispiel 5

101 eines wäßrigen Nährmediums, das 1% (jeweils Gewicht/Volumen) Glukose, 1,5% Pepton, 0,1% Hefeextrakt, 03% Dikaliumphosphat, 0,2% Natriumchlorid und 0,02 Magnesiumsulfat · 7 HjO enthält, werden in eine Oärungselnriohtung eingefüllt Das Nährmedium

wird auf einen pH von 7,0 eingestellt und anschließend sterilisiert Nachdem Brevlbicterlum ammoniagenes IAM 1641 auf das Nährmedium aufgeimpft worden Ist. wird dieses naoh der in Beispiel 1, Ziffer 1) beschriebenen Welse behandelt Auf diese Welse erhält

no man UI des zellfreien Extraktes von Brevlbacterlum ammoniagenes IAM1641.

2) Herstellung eines immobilisierten

zellfreien Extrakts

as U kg der gemäß Beispiel 1, Ziffer 2) hergestellten Bromcyan-aktivierten Agarose (feucht) werden zu 131 des vorstehend beschriebenen zellfreien Extraktes von Brevlbacterlupi am,nonlagene» IAM 1641 gegeben.

Dann wird die Mischung nach der in Beispiel 1, Ziffer 3) beschriebenen Weise behandelt Man ernält 13 kg eines immobilisierten zellfreien Extrakte*.

3) Reinigung des CoA

\ß kg des vorstehend erwähnten immobilisierten zellfreien Extraktes werden in 11 einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetatlösung (pH 7,0) suspendiert 4 ml einer rohen CoA-Lösung (CoA-Gehalt; 36 mg, Reinheit: 13%), hergestellt nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode, werden der Suspension zugesetzt Die Mischung wild bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 5 Stunden gerührt, wobei das CoA an dem immobilisierten zellfreien Extrakt adsorbiert wird. Der immobilisierte zellfreie Extrakt wird durch Filtration gesammelt und mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetatlösung (pH 7,0), die 0,01-m Natriumchlorid enthält so lange gewaschen, bis alle Verunreinigungen aus der immobilisierten Zubereitung entfernt sind. Dann wird der immobilisierte zellfreie Extrakt in 1,71 einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetatlösung (pH 7,0), die 0,5-m Natriumchlorid enthält suspendiert Die Suspension wird bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 2 Stunden gerührt Dann wird die Suspension zur Entfernung von unlöslichen Materialien filtriert Das auf diese Weise erhaltene Filtrat enthält 23 mg CoA (Reinheit: 70%).

Beispiel 6
1) Herstellung eines immobilisierten CoA

510 g der vorstehend erwähnten Bromcyan-aktivierten Agarose v/erden in 11 einer wäßrigen 0,1-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,0) suspendiert worauf 0,6 g des reduzierten CcA (Reinheit: 92%) zugesetzt werden. Die Suspension wird bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 3 Stunden gerührt Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt Der Niederschlag, der auf diese Weise gesammelt worden ist wird mit Wasser und einer wäßrigen 0,5-m Natriumchloridlösung gewaschen. 500 g eines immobilisierten CoA werden erhalten. Es enthält 3 mg des reduzierten CoA pro Gramm. Darüber hinaus ist es gegenüber einer Nitroprussid-Reaktion positiv und zeigt eine Infrarotabsorptionsbande bei 1720 cm-' (R-OCON-).

2) Herstellung einer CoA-Affinitätssubstanz

500 g des immobilisierten CoA, das gemäß Ziffer 1) erhalten worden ist werden auf eine 5x40-cm-Säule aufgegeben. Die Säule wird mit einer wäßrigen 0,1-m Natriumchloridlösung gewaschen. Der zellfreie Extrakt von Sarcina lutea IAM 1099, der nach der Methode gemäß Beispiel 1, Ziffer 1) hergestellt worden ist wird bei TC über Nacht durch Zellophan gegen Wasser dialysiert 850 ml der dialysierten Lösung werden durch die Säule geschickt Die Säule wird mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5), die 0,1-m Natriumchlorid enthält so lange gewaschen, bis die Verunreinigungen aus der Säule entfernt sind. Dann wird die Säule mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5), die 0,5-m Natriumchlorid enthält eluiert 31 des auf diese Weise erhaltenen Eluats enthalten 3,5 g der CoA-Af Pnitätssubstanz.

3) Herstellung einer immobilisierten
CoA-Affinitätssubstanz

270 g der in Beispiel 1, Ziffer 2) beschriebenen Bromcyan-aktivierten Agarose (feucht) werden zu 31 des gemäß Ziffer 2) erhaltenen Eluats gegeben. Nach einem Rahren der Mischung bei 10° C während einer

ίο Zeitspanne von 17 Stunden werden erneut 270 g der gemäß Ziffer 1) erhaltenen Bromcyan-aktivierten Agarose (feucht) zugesetzt Dann wird die Mischung auf einen pH von 6,0 eingestellt und weiter bei 10⁰C während einer Zeitspanne von 6 Stunden gerührt Der

erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt Der auf diese Weise gesammtelte Niederschlag wird mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 7,0), die 1-m Natriumchlorid enthält gewaschen. 530 g einer CoA-Affinitätssubstanz (feucht) werden erhalten.

4) Reinigung des CoA

530 g der gemäß Zi'fer 3) erhaltenen immobilisierten CoA-Affinitätssubstanz (feuch*) werden auf eine 5x43-cm-Säule gegeben. Die Säule wird mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5) die 0,01-m 2-Merkaptoäthanol enthält gewaschen. 6 ml einer rohen CoA-Lösung, hergestellt gemäß Beispiel 2, werden mit 72 ml Wasser verdünnt und durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 18 ml/Stunde geschickt Die Säule wird mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5), die 0,03-m Natriumchlorid enthält so lange gewaschen, bis die Verunreinigungen aus der Säule entfernt sind. Dann wird die Säule mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 6,5), die 0,5-m Natriumchlorid enthält eluiert Das auf diese Weise erhaltene Eluat enthält 50 mg des reduzierten CoA (Reinheit: 98%).

Beispiel 7

Eine immobilisierte CoA-Affinitätssubstanz wird nach der in Beispiel 6, Ziffer 3) beschriebenen Weise hergestellt 1 kg der immobilisierten CoA-Affinitätssubstanz wird mit Wasser gewaschen und dann in 21 einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetatlösung suspendiert 12 ml einer rohen CoA-Lösung, hergestellt nach Beispiel 2, werden der Suspension zugesetzt Die Suspension wird bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 5 Stunden gerührt Der erhaltene

so Niederschlag wird durch Filtration gesammelt Der auf diese Weise gesammtelte Niederschlag wird mit einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetat-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,03-m Natriumchlorid enthält, so lange gewaschen, bis die Verunreinigungen aus dem Niederschlag entfernt

ss sind. Dann wird der Niederschlag in 131 einer wäßrigen 0,01-m Natriumacetatlösung (pH 7,0), die 0,5-m Natriumchlorid enthält suspendiert Nachdem die Suspension bei Zimmertemperatur während, einer Zeitspanne von 2 Stunden gerührt worden ist wird der erhaltene Niederschlag durch Filtration entfernt Das auf diese Weise erhaltene Filtrat enthält 81 mg des reduzierten CoA (Reinheit: 98%).

709 533/440

Claims

Patentansprüche:

1, Verfahren zur Reinigung von Cocnzynj A, dadurch gekennzeichnet,

(A) daß der zellfreie Extrakt eines Coenzym A erzeugenden Mikroorganismus oder von tierischen Geweben mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid bei ι ο einem pH von 6 bis 9 zur Gewinnung eines immobilisierten zellfreien Extrakts vermischt wird, der immobilisierte zellfreie Extrakt so lange gewaschen wird, bis die Materialien, welche nicht kovalent daran gebunden sind, is entfernt worden sind, eine Coenzym-A-Lösung mit dem immobilisierten zellfreien Extrakt bei einem pH von 6 bis 8 zur Adsorption des Coenzyms A an der immobilisierten Zubereitung kontaktiert wird, der immobilisierte zellfreie Extrakt mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von weniger als 0,04 gewaschen wird und anschließend der immobilisierte zellfreie Extrakt mit einer wäßrigen sauren Lösung (pH 2 bis 5) oder mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von mehr als 0,06 zur Eluierung des Coenzyms A aus dem Immobilisierten zellfreien Extrakt kontaktiert wird, oder

(B) daß der zellfreie Extrakt «ines Coenzym A erzeugenden Mikroorganismus oder von tierischen Geweben mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid bei einem pH von 6 bis 9 bei 0 bis 30⁰C zur Gewinnung eines immobilisierten zellfreien Extrakts vermischt wird, der immobilisierte zellfreie Extrakt mit Wasser und/oder einer wäßrigen Natriumchloridlösung (pH 6 bis 8) so lange gewaschen wird, bis die Materialien, die nicht kovalent gebunden sind, entfernt worden sind, die Coenzym-A-Lösung mit dem immobilisierten zellfreien Extrakt bei einem pH von 6 bis 8 bei 0 bis 3O⁰C zur Adsorption des Coenzyms A an der immobilisierten Zubereitung kontaktiert wird, der immobilisierte zellfreie Extrakt mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von 0,02 bis 0,04 gewaschen wird und anschließend der immobilisierte zellfreie Extrakt mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) und einer Ionenstärke von 0,1 bis 0,5 bei 0 bis so 3O⁰C ?.ur Eluierung des Coenzyms A aus dem immobilisierten zellfreien Extrakt kontaktiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der immobilisierte zellfreie Extrakt in der Weise hergestellt wird, daß 10 bis 30 mg, vorzugsweise 15 bis 20 mg, (bezogen auf die Proteinmenge) des zellfreien Extrakts des Coenzym A erzeugenden Mikroorganismus oder der tierisehen Gewebe pro Gramm des Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharids vermischt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Temperatur von 15 bis 25° C igearbeitet wird.
4. Verfahren zur Reinigung von Coenzym A, dadurch gekennzeichnet,

(A) daß das Coenzym A mit einem Halogencyanaktivierton, wasserunlöslichen Polysaccharid bei einem pH von 6 bis 8 zur Gewinnung eines immobilisierten Coenzyms A vermischt wird, das immobilisierte Coenzym A mit dem zellfreien Extrakt eines Coenzym A erzeugenden Mikroorganismus oder der tierischen Gewebe bei einem pH von 6 bis 8 zur Adsorption einer Coenzym-A-Affinitätssubstanz an dem immobilisierten Coenzym A kontaktiert wird, das immobilisierte Coenzym A mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis ö) mit einer Ionenstärke von 0,05-0,1 gewaschen wird, das immobilisierte Coenzym A mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer lonemstärke von mehr als 0,5 zur Eluierung der Coenzym-A-Affinitätssubstanz von dem immobilisierten Coenzym kontaktiert wird, die erhaltene Coenzym-A-Affinitätssubstanz mit einem Halogencyanaktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid bei einem pH von 6 bis 9 zur Gewinnung einer immobilisierten Coenzym-A-Affinitätssubstanz vermischt wird, eine Coenzym-A-Lösung mit der immobilisierten Coenzym-A-Affinitätssubstanz bei einem pH von 6 bis 8 zur Adsorption des Coenzyms A an der immobilisierten Zubereitung kontaktiert wird, die immobilisierte Coenzym-A-Affinitätssubstanz mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer lonenstärke von weniger als 0,04 gewaschen wird und anschließend die immobilisierte Coenzym-A-Affinitätssubstanz mit einer wäßrigen sauren Lösung (pH 2 bis 5) oder mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer lonenstärke von mehr als 0,06 zur Eluierung des Coenzyms A aus der immobilisierten Coenzym-A-Affinitätssubstanz kontaktiert wird, oder

(B) daß Coenzym A mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid bei einem pH von 6 bis 8 sowie bei 0 bis 30⁰C zur Gewinnung eines immobilisierten Coenzyms A vermischt wird, das immobilisierte Coenzym A mit dem zellfreien Extrakt eines Coenzym A erzeugenden Mikroorganismus oder der tierischen Gewebe bei einem pH von 6 bis 8 sowie bei 0 bis 3O⁰C zur Adsorption einer Coenzym-A-Affinitätssubstanz an dem immobilisierten Coenzym A kontaktiert wird, das immobilisierte Coenzym A mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer lonenstärke von 0,05 bis 0,1 gewaschen wird, das immobilisierte Coenzym A mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer lonenstärke von 0,5 bis 1 bei 0 bis 3O⁰C zur Eluierung der Coenzym-A-Affinitätssubstanz von dem immobilisierten Coenzym A kontaktiert wird, die erhaltene Coenzym-A-Affinitätssubstanz mit einem Halogencyan-aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharid bei einem pH von 6 bis 9 sowie bei 0 bis 30⁰C vermischt wird, eine Coenzym-A-Lösung mit der immobilisierten Coenzym-A-Affinitätssubstanz bei einem pH von 6 bis 8 sowie bei 0 bis 30° C zur Adsorption des Coenzym A an der immobilisierten Zubereitung kontaktiert wird, die immobilisierte Coenzym-A-Affinitätssubstanz

mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von 0,02 bis 0,04 gewaschen wird und anschließend die immobilisierte Coenzym· A-Affinitätssubstanz mit einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 8) mit einer Ionenstärke von 0,1 s bis 03 bei 0 bis 3O⁰C zur Eluierung des Coenzyme A von der immobilisierten Coenzym-A-Affinitätssubstanz kontaktiert wird.