DE2357113C2

DE2357113C2 - Herstellung eines Cellulose-Enzym-Komplexes

Info

Publication number: DE2357113C2
Application number: DE2357113A
Authority: DE
Inventors: Jean Paul Bourdeau; Pierre 5935O Saint-Andre-Lez-Lille Fossati; Rene 6437O Arthez de Bearn Pornin; Jean Louis 64OOO Pau Seris
Original assignee: NATIONALE ELF AQUITAINE 92400 COURBEVOIE FR Ste
Current assignee: NATIONALE ELF AQUITAINE 92400 COURBEVOIE FR Ste
Priority date: 1972-11-15
Filing date: 1973-11-15
Publication date: 1982-12-09
Also published as: NL181212B; DK134183C; IL43573A0; CH587285A5; SE396391B; IT1001748B; NL181212C; JPS5046889A; IL43573A; NL7315494A; JPS5719955B2; LU68762A1; GB1449891A; DE2357113A1; AU6234073A; DK134183B; CA996047A

Description

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 ·»< > angegebene Verfahren. Die Patentansprüche 2 bis 5 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Das Aufbringen von Enzymen auf feste Träger war in den letzten zehn Jahren der Gegenstand von Forschungsarbeiten, die dazu dienten, enzymatische Reak- -^ tionen in einem heterogenen Medium verwirklichen zu können. Es wäre tatsächlich wertvoll, wenn man das Enzym wiedergewinnen könnte, sobald seine Einwirkung auf eine Reaktion beendet ist. Einerseits könnte das Endprodukt in größerer Reinheit erhalten werden, wenn das Enzym nicht in dem Reaktionsmedium verbliebe, wie es im allgemeinen der Fall ist, andererseits wäre das Verfahren wirtschaftlicher, vor allem bei ziemlich teuren Enzymen. Dieses Problem ist besonders wichtig bei Labferment, das gegenwärtig immer schwieriger zugänglich wird, während der Bedarf an dieser Substanz bei der Käseherstellung von Tag zu Tag ansteigt. Es wurde auch bereits versucht, Enzyme an festen Trägern, insbesondere Agarose und Cellulose, zu binden, um sie in kontinuierlichen Systemen zu ^6U verwenden. Diese Versuche haben jedoch nicht zu den angestrebten Ergebnissen geführt; selbst nach der Aktivierung des Trägers durch Mittel, wie Halogencyan, Glutaraldehyd und dergleichen, zeigten die Komplexe mit den Enzymen nicht die erforderliche Stabilität. So ^b"> sind Green und Crutchfield (Biochem. Journ. 1969, S. 183—190), die sich mit diesem Problem beschäftigt haben und die Koagulation von Milch in Gegenwart von Labferment, das an reine Cellulose gebunden und mit Glutarnldehyd aktiviert war, untersucht haben, zu dem Schluß gekommen, da3 diese Versuche in technischer Hinsicht aussichtslos sind. Andererseits haben R. Axen und S. Ernback (Eur. J. Biochem. 18 (1071) 351-360) Cellulose mit Hilfe von Cyanurhalogeniden aktiviert, um daran Proteasen zu binden und dabei festgestellt daß die erhaltenen Komplexe keinerlei proteolytische Aktivität zeigen.

Im Gegensatz zu diesen enttäuschenden Ergebnissen des Standes der Technik wird es durch die Erfindung ermöglicht verschiedene Enzyme, insbesondere Proteasen, unter anderem auch Labferment, an Cellulose zu binden und auf diese Weise feste in Wasser unlösliche, stabile Komplexe mit guter enzymatischer Aktivität zu erhalten. Durch die Erfindung wird die industrielle und technische Anwendung, insbesondere in Vorrichtungen mit einem Festbett oder bewegten Bett, des Enzyms ermöglicht. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung zeigen die neuen auf Träger aufgebrachten Enzymkomplexe den Vorteil, daß sie in Form weit größerer Körner angewendet werden können, als es bisher möglich war. Dies erleichtert ihre Anwendung in den vorstehend beschriebenen Vorrichtungen. Bei der speziellen sehr wichtigen Verwendung zur Koagulation von Milch ermöglichen die erfindungsgemäßen Komplexe, daß beträchtliche Einsparungen an Labferment erzielt werden und daß Käse erhalten wird, der frei von diesem Ferment ist.

Der Gegenstand der Erfindung ist aus den vorstehenden Ansprüchen ersichtlich.

Die Erfindung beruht auf der unerwarteten Erkenntnis, nicht mehr die reinen Cellulosen, die mit Hilfe bekannter Mittel aktiviert sind, sondern weitgehender modifizierte Cellulosen, nämlich chlorierte, sulfurylierte und/oder thionylierte Cellulosen zu verwenden. Die verschiedenen Verfahren zur Herstellung von Cellulosederivaten, wie Estern, Äthern, Halogeniden, Sulfonaten und dergleichen sind bekannt. Unter diesen zahlreichen Methoden haben überraschenderweise die Chlorierung und die Sulfochlorierung zu Cellulosen geführt, die befähigt sind, Enzyme fest zu binden und sehr aktive und stabile Cellulose-Enzym-Komplexe zu bilden, unter der Bedingung, daß diese Chlorierung oder Sulfochlorierung in einer Flüssigkeit durchgeführt wird, die ein gutes Dispergieren der Cellulose ermöglicht (vgl. Patentanspruch 1).

Der Chlorgehalt beträgt zweckmäßig 1 bis 1,6Gew.-%, wenn die Cellulose praktisch keinen Schwefel enthält. Bei Cellulosen, die Schwel el enthalten, im allgemeinen in Form von S-Oxiden, die besonders gut für die Zwecke der Erfindung geeignet sind, kann der Schwefelgehalt beispielsweise 1 bis 7 Gew.-% betragen. Wenn beide Elemente S und Cl vorliegen, muß der Chlorgehalt stets geringer als der Schwefelgehalt sein und vorzugsweise bei einem niedrigeren Wert als 1 %, d. h. zwischen 0 und 1 % liegen. Die bevorzugten Mengen an Schwefel betragen etwa 3 bis 4%.

Die zur Durchführung der Erfindung geeigneten Sulfo- und/oder Chlorcellulosen können durch Einwirkung beliebiger bekannter Chlorierungsmittel, beispielsweise PCI3, PCI5, Oxalylchlorid, Succinylchlorid oder des Chlorids einer anderen organischen Säure, vor allem mit Hilfe von Sulfochlorierungsmitteln, d. h. Thionylchlorid SOCb oder Sulfurylchlorid SO2CI2, hergestellt werden. Die Cellulose wird vorher mit einer alkalischen Lösung behandelt, danach gewaschen und in einer organischen Flüssigkeit dispergiert, die durch das verwendete

Chlorierungsmittel nicht zerstört wird. Die verwendete Flüssigkeit ist neutral, wie beispielsweise Dioxan, oder schwach-basisch, wie Pyridin. Das Chlorierungsmittel wird in die Cellulosedispersion eingeführt und dann während einer Dauer von nicht mehr als einigen Stunden bei mäßiger Temperatur von höchstens 60⁰C umgesetzt. In Abhängigkeit von der Art der verwendeten Cellulose liegt die Temperatur im allgemeinen bei 10 bis 55°C. Nach der Abtrennung der so behandelten Cellulose aus dem Reaktionsmedium wird sie gewä- ,₀ sehen und gegebenenfalls zur Aufbewahrung getrocknet, bevor die Bindung eines Enzyms erfolgt Am besten wird die Zugabe des Chlorierungsmittels zu der Cellulusedispersion nach und nach vorgenommen.

Die Herstellung von sulfochlorierten Cellulosen kann , beispielsweise in der Art und Weise erfolgen, die von Carre und Mauclere (Comptes Rendus de l'Academie des Sciences, 1931 — 192 — 1567) und danach von R. L. Boehm (I.Org.Chem. 1958 - 23 — i716) beschrieben wurde, d. h. mit Hilfe von Thionylchlorid in Pyridin. Dieses Verfahren führt jedoch zu Cellulosen, die zu stark chlorhaltig und im allgemeinen relativ schwefelarm sind und nicht den vorstehend angegebenen Bedingungen für die Erfindung entsprechen. Diese Bedingungen müssen daher überwacht werden, um geeignete Chlor- und/oder Sulfochlorcellulosen zu erhalten. Die Zusammensetzung des behandelten Produkts hängt auch von der Art der verwendeten Ausgangscellulose ab.

Die Menge des zu verwendenden Chlorierungsmittels kann in Abhängigkeit von den vorstehend angegebenen Faktoren und von der Art des flüssigen organischen Mediums, das als Dispergiermittel für die Cellulose verwendet wird, abhängen.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Komplexe erfolgt durch Umsetzen der behandelten Cellulose mit einer gepufferten Enzymlösung. Der pH-Wert der gepufferten Enzymlösung liegt zwischen 5 und 10 und die besten Ergebnisse werden bei pH-Werten zwischen 6 und 9 erzielt. Die Temperatur des Reaktionsmediums liegt am besten unter 45° C und in jedem Fall unterhalb der Grenztemperatur der Stabilität des verwendeten Enzyms. Diese Temperatur liegt häufig bei 0 bis 40⁰C. Die Bindung des Enzyms an der aktivierten Cellulose erfordert eine Kontaktdauer in der Größenordnung von 24 bis 48 Stunden.

Die Menge des Enzyms, die mit dem aktivierten Celluloseträger umgesetzt wird, kann innerhalb weiter Grenzen schwanken. Sie beträgt meist 0,1 bis 100 Gew.-%, zweckmäßig 1 bis 60 Gew.-% der verwendeten Cellulose.

Zu den Enzymen, die zur Komplexbildung mit der aktivierten Cellulose befähigt sind, gehören insbesondere die Hydrolysen des Zuckerstoffwechsels bzw. Zuckerabbaus, wie Invertase, Amylase, Maltase, die Pectinasen, die Hydrolasen des Proteinabbaus, wie die Proteasen, Peptidasen, Trypsin, Chymotrypsin, Lysozym, sowie andere Hydrolasen, wie Phosphatasen und Ribonucleasen. Die Erfindung ist besonders günstig bei ihrer Anwendung auf Komplexe von Cellulose mit &o Labferment,/J-Galactosidase und Chymotrypsin.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung beruht auf der unerwarteten Feststellung, daß Cellulose^ die einen gewissen Anteil an Lignin enthalten, nach der Chlorierung oder Sulfochlorierung weit bessere b^r> Träger für Enzyme darstellen, als die entsprechenden Derivate der reinen Cellulose. Gemäß dem bisherigen Stand der Technik war man stets bestrebt, eine möglichst reine Cellulose herzustellen, um sie als Träger für Enzyme zu verwenden, weil man von dem Prinzip ausging, daß die Gegenwart von Lignin und anderen pflanzlichen Materialien, welche die Cellulose begleiten können, die Bindung von Enzymen verhindert Dies ist übrigens richtig, und ein zu hoher Anteil an Lignin verhindert eine solche Bindung. Das nicht vorhersehbare Merkmal der Erfindung liegt darade in der Tatsache, daß zwar ein zu hoher Anteil an Lignin störend ist daß jedoch ein Anteil, der zwischen gewissen Grenzwerten liegt im Gegenteil sehr günstig wirkt, wenn die Voraussetzung erfüllt wird, daß in der Struktur der gewählten Cellulose das Lignin in der Celiulosemasse dispergiert ist und nicht an der Oberfläche der Cellulose angereichert ist, so daß der Zusammenhalt der Körner oder Fasern gewährleistet ist

Der neue Komplex von Enzym, das an Cellulose gebunden ist ist gemäß einer Ausführungsform der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß der Celluloseträger etwa 5 bis 25 Gew.-% Lignin, vorzugsweise 10 bis 20Gew.-% Lignin, bezogen auf das Gewicht des trockenen Materials, enthält Die für die Zwecke der Erfindung geeignete Cellulose mit gemäßigtem Ligningehalt kann aus irgendeinem der gut bekannten natürlichen Ausgangsmaterialien erhalten werden, wie beispielsweise Holz, das in Form von Abfällen verwendet werden kann, insbesondere in Form von Spänen oder Sägemehl, Strohstoppeln oder Strohhalmen und dergleichen. Auch Papierbrei kann sogar verwende': werden, vorausgesetzt, daß er einen Ligningehalt innerhalb der vorstehend angegebenen Grenzen aufweist. Ein spezielles Ausgangsmaterial, das im Hinblick auf die Qualität der Cellulose, was das Bindungsvermögen für Enzyme betrifft, sehr empfehlenswert ist, sind Stiele bzw. Ährenstiele von Getreidearten, insbesondere von Mais.

Die erfindungsgemäß verwendete ligninhaltige Cellulose kann in Form von Stücken oder Teilchen sehr unterschiedlicher Abmessungen, beispielsweise im Bereich von 0,2 mm bis mehrere cm vorliegen, in Abhängigkeit von ihrer Herkunft und in Abhängigkeit von der Form der Vorrichtung, in der sie eingesetzt wird. Im allgemeinen liegen die geeignetsten Abmessungen bei etwa 0,3 bis 10 mm oder zweckmäßig 0,5 bis 5 mm. Mit diesen Abmessungen werden ausreichende Kontaktoberflächen geschaffen, um zu einer sehr wirksamen Aktivität des Cellulose-Enzym-Komplexes zu gelangen, während nach dem Stand der Technik, d. h., bei Verwendung von reiner Cellulose, es kaum möglich war, Fasern mit einem Durchmesser von mehr als 0,05 mm zu verwenden, wodurch natürlich die Anwendung eines Festbettes nicht ermöglicht wurde, das eine hohe Kapazität besitzt, ohne daß störendes Verstopfen und ein Verlust der Beschickung eintreten.

Eine Cellulose, die zu besonders guten Ergebnissen führt, ist die Cellulose aus Maisstielen in Stücken von 0,5 bis 10 mm, die vorher durch Einwirkung von Thionylchlorid in Gegenwart von überschüssigem Pyridin in der Weise aktiviert bzw. umgesetzt wurde, daß das Endprodukt etwa 2 bis 6% Schwefel, vorzugsweise 3 bis 4% Schwefel enthält, während der Gehalt an gebundenem Chlor stets unterhalb des Schwefelgehalts liegt, wobei vorzugsweise der prozentuale Chlorgehalt weniger als 1 % beträgt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der neuen Komplexe von Enzym und ligninhaltiger Cellulose besteht darin, daß eine Cellulose, die einen geeigneten Anteil an Lignin enthält, zu Stücken oder

Teilchen der vorstehend angegebenen Große zerkleinert wird und diese Stücke oder Teilchen zunächst mit einer etwa 3 bis 6 normalen Alkalilösung, zweckmäßig einer etwa 4,5 normalen Alkalilösung so behandelt wird, daß das Lignin, welches sich an der Kornoberfläche befindet, gelöst wird. Diese Behandlung erfolgt am günstigsten bei Raumtemperatur während 10 bis 30 Minuten. Die Cellulosekörnet werden dann aus der Flüssigkeit abgetrennt und erschöpfend mit kaltem Wasser gewaschen, bis das Filtrat nicht mehr gefärbt ist Sie werden dann mit Hilfe eines Alkohols entwässert und djnach mit Pyridin gewaschen. In eine Suspension dieser Körner in Pyridin wird nach und nach SOCb oder gegebenenfalls ein anderes Chlorierungsmittel eingeführt, wobei die Temperatur auf weniger als 60^aC, zweckmäßig auf 55° C oder einen in der Nähe liegenden Wert eingestellt wird. Das Erzielen eines Trägers, der einen optimalen Gehalt an S und Cl aufweist, wie er vorstehend angegeben wurde, wird von der Temperaturregelung beeinflußt. Im Verlauf dieser Zeit steigt das Verhältnis S/Cl an.

Nach dem Stehenlassen während etwa einer Stunde wird die Reaktion durch Kühlung abgebrochen, beispielsweise durch Eingießen des Reaktionsgemisches in ein Wasser-Eis-Bad. Die Körner werden abgetrennt und sorgfältig mit Wasser und danach mit einer Säurelösung mit einem pH-Wert von ungefähr 2 gewaschen, bis das Pyridin vollständig entfernt ist. Schließlich werden die Körner mit einem Alkohol gewaschen und bei mäßiger Temperatur, am besten unterhalb 50° C, getrocknet.

Die gewünschte Vereinigung des Enzyms mir den so hergestellten Körnern erfolgt in einer wässerigen Pufferlösung mit einem pH-Wert, der auf das spezielle Enzym eingestellt ist. So wird beispielsweise bei Labferment vorteilhaft eine Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 5,9 bis 6,4 eingesetzt. Das Medium wird bei mäßiger Temperatur, im allgemeinen zwischen Raumtemperatur und 5O⁰C während einer Dauer gerührt, die r-.ur Bindung des Enzyms erforderlich ist und im allgemeinen in der Größenordnung von 24 Stunden liegt.

Nach der Abtrennung der so mit dem Enzym vereinigten Körner erfolgt zweckmäßig die Entfernung des Teils des Enzyms, das nicht durch kovalenie Bindungen gebunden wurde. Dies kann durch Waschen mit Pufferlösungen mit einem geeigneten pH-Wert und mit Wasser erfolgen. Es ist empfehlenswert, die so erhaltenen Körner bei einer relativ niedrigen Temperatur in einem Puffer aufzubewahren, bei dessen pH-Wert das Enzym besonders stabil ist.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Chlorierung von Cellulose in Gegenwart von Pyridin

a) 32,4 g Cellulose für die Chromatographie werden mit einer 18°/oigen wässerigen Lösung von NaOH ι während zwei Stunden behandelt. Die erhaltene Alkalicellulose wird auf einer Glasfritte mit absolutem Methanol gewaschen, bis die ablaufenden Filtrate nicht mehr basisch sind und wird danach mehrere Male mit Pyridin gewaschen. Danach wird sie in 800 ml Pyridin r suspendiert. Dieser Suspension werden 146 ml Thionylchlorid SOO2 einer Reinheit von 99% zugesetzt und die Umsetzung wird während 4 Stunden bei 28°C vorgenommen Am Ende dieser Zeitspanne wird das Reaktionsgemisch in ein Eiswasser-Bad gegossen und während einer Stunde gerührt. Die Cellulose wird dann durch Filtration abgetrennt und über Nacht in einer halbgesättigte.η Natriumbicarbonatlösung in Suspension gehalten- Am nächsten Tag wird sie mit Wisser gewaschen, bis: die Filtrate klar ablaufen. Schließlich wird das so behandelte Cellulosepulver 24 Stunden im Trockenschrank bei 50°C getrocknet. Es enthält 3,57% Chlor und 4,4% Schwefel.

b, c, d) Die vorstehenden Verfahrensschritte werden noch dreimal wiederholt, wobei zweimal eine andere Dauer der Reaktion mit SOCI2 und einmal eine andere Temperatur gewählt wird. In jedem Fall wird der Chlorgehalt und der Schwefelgehalt der erzielten Cellulose bestimmt. Dabei werden die nachstehenden Ergebnisse erhalten:

	Temperatur	Dauer	%S	%C1
a)	28°C	4h	4,40	3,57
b)	4°C	4h	6,48	3,85
c)	28°C	2h	6,35	2,30
d)	28°C	lh	6,50	1,59

Diese Ergebnisse zeigen, daß in Pyridin als Medium der Schwefel während der ersten Stunde der Reaktions-

jo dauer an die Cellulose gebunden wird und daß der Schwefelgehalt sich erniedrigt, wenn der Prozeß bei 28°C durchgeführt wird, wohingegen die Bindung des Chlors nach der ersten Stunde erhöht wird. Es ist daher durch geeignete Regelung der Temperatur und der Reaktionsdauer möglich, zu dem erfindungsgemäß gewünschten G ehalt an Cl und S zu gelangen.

Beispiel 2

Chlorierung von Cellulose in Gegenwart von Dioxan

Es wird wie in Beispiel 1 gearbeitet, wobei als Ausgangsmaterial eine Suspension von 60 g Cellulose in 450 ml Dioxan verwendet wird. Es werden 30 ml SOO2 zugesetzt, entsprechend der Maximalmenge an Chlor, welche die Cellulose in Dioxan binden kann. Nach einstündiger Umsetzung wird das Reaktionsgemisch filtriert, mit Wasser gewaschen und im Trockenschrank getrocknet. Der Chlorgehalt der Cellulose beträgt nur 1,51% und wird auch nicht erhöht, wenn man die Menge des Chlorierungsmittels oder die Reaktionsdauer erhöht, im Gegensatz zu den Vorgängen in Pyridin, in welchem sich dir Anteil des gebundenen Chlors mit der Zeit erhöht.

Beispiel 3

Behandlung mit Sulfurylchlorid

Man arbeitet wie in Beispiel 1, wobei jedoch die Konzentration des chlorierten Reaktanten vermindert wird, um ein im starkes Erhitzen des Reaktionsgemisches zu verhindern, was zu einem Abbau der Cellulose führen würde. l=s werden daher nur 44 ml Sulfurylchlorid, d. i. 0,55 Mol, zugesetzt.

Beispiel 4 Chlorierung mit Hilfe von Phosphortrichlorid

Es wird wie in Beispiel 3 gearbeitet, wobei 50 ml, d. i. 0,6 Mol PCb anstelle von SO2CI2 verwendet werden.

Beispiel 5 Chlorierung mit Hilfe von Phosphorpentachlorid

In Beispiel 4, das in Pyridin durchgeführt wurde, wird PcI₃ durch 62,5 PcI₅, d. i. 0,3 Mol, ersetzt, das vorher in Dioxan gelöst wurde. Diese Behandlung wird somit gleichzeitig in Pyridin und in Dioxan durchgeführt.

Beispiel 6

Herstellung des Cellulose-Labferment-Komplexes

16g gemäß Beispiel la sulfochlorierte Cellulose werden mit 40 ml einer technischen Lösung von Labferment, die auf das 5fache in einem Phosphatpuffer des pH-Wertes 6,2 verdünnt wurde, während 48 Stunden in Berührung gebracht. Man hält das Reaktionsgemisch unter Rühren bei einer Temperatur zwischen 4° und 6°C. Nach Beendigung der Kontaktdauer wird die Cellulose mit 250 ml Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,2,250 ml einer wässerigen Natriumchloridlösung (5 Mol/Liter) und 250 ml Wasser gewaschen. Dann wird der Komplex wieder in 250 ml Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,4, d. h. bei etwa dem pH-Wert der Milch, bei einer Temperatur von 4 bis 6⁰C unter Rühren mit Hilfe eines Magnetrührers während einer Stunde in Suspension gebracht. Diese Behandlung wird durchgeführt, um den nicht durch kovalentc Bindung fixierten Anteil des Enzyms zu desorbieren. Nach einer erneuten Filtration wird das unlöslich gemachte Enzym unter den gleichen Bedingungen während 20 Stunden in 250 ml Acetatpufferlösung gehalten. Nach einer letzten Filtration wird der erhaltene Cellulose-Labferment-Komplex erneut in 100 ml dieses Acetatpuffers vom pH-Wert 4,4 dispergiert und bei 4 bis 6°C im Kühlschrank aufbewahrt. Die Aktivität von !6 g dieses Komplexes entspricht 0,12 ml eines technischen Labferments.

Beispiel 7 Celluiose-Chymotrypsin-Komplex

In den Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff werden 500 mg gemäß Beispiel 2 behandelte Cellulose gegeben, zu der man 10 ml einer auf pH 9 gepufferten Enzymlösung gibt, die mit Hilfe eines Borsäure/KCl/ NaOH-Puffers (Titrisol) gepuffert ist. Die Röhrchen werden danach 10 Minuten bei Raumtemperatur auf eine Vibratorplatte gelegt. Danach werden sie 20 Minuten bei 2500 Umdrehungen/Minute zentrifugiert. Man entfernt den obenstehenden Anteil, während das Sediment mit 10 ml einer Lösung von Natriumchlorid (5 Mol NaCI/1) gewaschen wird, um den nicht gebundenen Anteil des Enzyms zu desorbieren. Nach dem Rühren wird erneut 20 Minuten zentrifugiert. Das Sediment wird mit 10 ml einrr Pufferlösung vom pH 8,5, bestehend aus 2-Amino-2-hydΓoxymethylpropandiol-13 (Tris) und 10 ml des Tritrisolpuffers vom pH 9 behandelt

Dann werden noch in gleicher Weise zwei weitere Waschen durchgeführt, wonach die behandelte Cellulose getrocknet wird.

Die proteolytische Aktivität des erhaltenen trockenen Komplexes wird an Casein bei einem pH-Wert von 8,5 und einer Temperatur von 37°C bestimmt. Man bringt 800 mg des Komplexes und 20 ml einer "> Caseinlösung (oder Magermilch) in einer konischen Flasche zusammen, um das Casein zu hydrolysieren. Nach lOminütigem Bebrüten werden 10 ml der Lösung entnommen und in ein Reagenzglas gegossen, das 10 ml Trichloressigsäure enthält, um die Reaktion zu unterbrechen. Das Reagenzglas wird dann eine halbe Stunde in ein bei 37°C gehaltenes Bad gestellt, um das gesamte nicht hydrolysierte Casein auszufällen. Man filtriert und bestimmt die Menge des freigesetzten Tyrosins spektrometrisch durch Messung der optischen Dichte

i'i des Filtrats bei einer Wellenlänge von 2750 Ä. Dabei wird gefunden, daß die Aktivität von 500 mg des Cellulose-Chymotrypsin-Komplexes der Aktivität von 0,8 mg freien Chymotrypsins gegenüber 10 ml Magermilch unter den gleichen Bedingungen entspricht.

Beispiel 8
Trypsin-Cellulose- Komplex

4 g eines gemäß Beispiel 2 hergestellten Trägers werden in eine konische Flasche mit 80 ml Enzymlösung, mit 200 mg Trypsin und 100 ml Titrisol-Puffer vom pH 9, entsprechend dem vorhergehenden Beispiel, gegeben. Es wird in einem thermostatisierten Bad gerührt und 10 Minuten bei 37°C belassen. Dann filtriert

in man mit Hilfe einer Glasfritte und wäscht den Komplex mit 70 ml einer 5 molaren wässerigen NaCl-Lösung. Unter Verwendung von 50 ml bzw. 30 ml der gleichen NaCl-Lösung werden eine zweite und eine dritte Wäsche durchgeführt. Das unlöslich gemachte Enzym,

i~' d. h. der erhaltene Komplex, wird in einem Tris-Puffer vom pH 8,5 gemäß Beispiel 7 aufbewahrt. Die proteolytische Aktivität von 500 mg des Komplexes, die an Casein bei einem pH-Wert von 8,5 und einer Temperatur von 37°C bestimmt wurde, entspricht der

->° von 0,4 mg freiem Trypsin.

Beispiel 9
/J-Galactosidase-Cellulose- Komplex

·' Zu 13 mg modifizierter Cellulose gemäß Beispiel 1 werden 40 ml einer Enzymlösung, verdünnt mit 100 ml einer aus 10~² Mol/l Kaliumphosphat und ΙΟ-⁴ Mol/l Magnesiumchlorid bestehenden Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2, gegeben. Die Enzymlösung ist ein

~>^u Zellextrakt von Escherichia CoIi K 12, der durch Fällung mit Ammoniumsulfat gereinigt wurde und 1800 Einheiten o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid (O.N.P.G.) pro ml enthält. Das Gemisch wird 48 Stunden bei 40°C gerührt. Nach einer ersten Filtration wird der Komplex

>"' gewaschen und in den folgenden Lösungen suspendiert:

Danach wird filtriert. Das auf dem Celluloseträger fixierte Enzym wird in Phosphatpuffer von pH 6,2 ^fc5 aufbewahrt

Die Aktivität des so aus 13 g modifizierter Cellulose erhaltenen Komplexes entspricht gemäß einer Bestimmung 1000 Einheiten freier /J-Galactosidase.

Wasser	6,2	150 ml
Phosphatpuffer pH		150 ml
NaClS Mol/l		150 ml
Wasser	6,2	150 ml
Phosphatpuffer, pH	150 ml

Die Aktivität der jS-Galactosidase wird durch ihre Hydrolysewirkung gegenüber o-Nitrophenyl-ji-D-galactopyranosid (O.N.P.G.) bestimmt, bei der in der Lösung von O.N.P.G. eine Gelbfärbung durch das freigesetzte o-Nitrophenol auftritt. Die Menge des -, hydrolysierten O.N.P.G. wird durch Erhöhung der optischen Dichte bei 4200 Ä bestimmt. Bei konstantein pH-Wert verändert sich die Färbung nicht. Bei verschiedenen pH-Werten wurden Eichkurven aufgenommen und die Aktivität des Enzyms wird durch <u Messung der Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion, die durch die Neigung der Geraden gegeben wird, ermittelt.

Beispiel 10

Komplex aus Labferment und ligninhaltiger ''

Cellulose

Masstiele, die etwa 80% Cellulose und 15% Lignin enthalten, werden zu Körnern von 1,5 bis 2,5 mm zerkleinert.

50 g dieser Körner werden in eine 18%ige Natriumcarbonatlösung gegeben, die 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wird. Die Körner werden dann abgetrennt und gut mit kaltem Wasser gewaschen, bis das Filtrat nur noch geringfügig gefärbt ist. Die Wäsche ?^r> wird mit einem Liter Methanol und danach mit 400 ml Pyridin abgeschlossen.

Dann werden die Körner in 800 ml Pyridin gegossen, wonach 100 ml SOCI2 tropfenweise in das gerührte Pyridin während 45 Minuten eingeführt werden. Die m Temperatur des Reaktionsgemisches erhöht sich bis auf 55°C und das Medium verfärbt sich plötzlich intensiv. Eine Stunde nach Beendigung der Zugabe von Thionylchlorid wird das Gemisch in ein Eis-Wasser-Bad gegossen und die Körner werden dann abgetrennt und j mit mehreren Litern Wasser und danach mit einer HCI-Lösung vom pH 2 gewaschen, bis das an den Körnern adsorbierte Pyridin vollständig entfernt ist. Die Wäsche wird mit 1 I Methanol abgeschlossen. Die so erhaltenen Körner werden bei 40°C getrocknet.

Es wird festgestellt, daß die so behandelte Cellulose etwa 3,5% Schwefel und nur Spuren an Chlor enthält.

In 160 ml einer Phosphatpufferlösung mit dem pH 6,2 werden 16 g der in der vorstehenden Weise vorbereiteten Körner gegeben und 40 ml Labferment (carlin) werden zugesetzt. Der gesamte Ansatz wird unter Rühren während 24 Stunden bei 4O⁰C gehalten.

Danach werden die Körner abgetrennt und die Desorption des nicht chemisch gebundenen Labferments durch Waschen wird zunächst mit 250 ml der gleichen Pufferlösung wie vorher und anschließend mit 2 1 destilliertem Wasser und schließlich mit 250 ml einer Acelatniifferlösung vom pH 4,4 durchgeführt. Die Mutterlaugen dieser Behandlung werden wiederverwendet. Die Körner des Komplexes von Labferment und Cellulose von Maisstielen, die so erhalten werden, werden in 250 ml Acetatpuffer bei 4°C aufbewahrt. Dieser Komplex führte zu ausgezeichneten Ergebnissen bei der Koagulation von Milch. 8 g dieses Komplexes, die 0,04 g gebundenes Labferment enthalten, ermöglichten in kontinuierlicher Verfahrensweise die Koagulation von 35 1 Milch in 55,5 Stunden, während durch übliche Koagulation durch Auflösen des Labferments in Milch die gleiche Menge des Ferments von 0,04 g nur die Koagulation von 0,4 I ermöglicht und das Labferment definitiv verloren ist.

Die erfindungsgemäßen Enzym-Trägerkomplexe behalten ihre Enzymatisch^ Aktivität während sehr langer Dauer bei, wenn sie einer Lyophylisierungsbehandlung unterworfen werden und bei tiefer Temperatur aufbewahrt werden. Diese Aktivität kann auf diese Weise während mehr als 2 Jahren beibehalten werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Cellulose-Enzym-Komplexes, bei dem man eine Hydrolase mit Cellulose in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Derivat der Cellulose, das Chlor und/oder Schwefel in Oxidform im Molekül enthält, wobei der Chlorgehalt des Cellulosederivate 0 bis 4 Gew.-% und der Schwefelgehalt des Cellulosederivats 0 bis 7 Gew.-% beträgt und in jedem Fall mindestens eines der Elemente Chlor und Schwefel vorliegt, in einer wäßrigen Lösung des Enzyms in Gegenwart eines Puffers, der den pH-Wert der Lösung bei einem Wert zwischen 5 und 10 hält, dispergiert und bei einer Temperatur von 0 bis 45" C während einer zur Bindung des Enzyms an dem Cellulosederivat ausreichenden Dauer in Kontakt mit der Lösung beläßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Derivat einer Cellulose mit -O einem Ligningehalt von 5 bis 25 Gew.-% verwendet, wobei das Lignin in der Masse der Cellulose verteilt ist

J. Verfahren nach Ansprucn 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Derivat einer Cellulose mit einem Ligningehalt von 10 bis 20Gew.-% verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Cellulosederivat mit einem Schwefelgehalt von 1 bis 7 Gew.-% und einem jo Chlorgehalt von weniger als 1 Gew.-°/o verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Cellulosederivat mit einem Schwefelgehalt von 3 bis 4 Gew.-°/o und einem Chlorgehalt von weniger als 1 Gew.-% verwendet. )">