DE2921085A1

DE2921085A1 - Antibiotisch wirksame substanz

Info

Publication number: DE2921085A1
Application number: DE19792921085
Authority: DE
Inventors: Mamoru Arai; Ryuzou Enokita; Tatsuo Haneishi; Mutsuo Nakajima; Akio Torikata
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1978-05-24
Filing date: 1979-05-23
Publication date: 1979-11-29
Also published as: JPS54160302A; AT364082B; DE2921085C2; GB2021558B; NL7904094A; FR2426697B1; IT7968118A0; JPS6024717B2; US4332902A; ES480904A1; FR2426697A1; GB2021558A; CH641492A5; IT1120973B; US4336249A

Description

DEA-13 264

292108S

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft eine neue antibiotisch v/irksame Substanz, die als Mycoplanecin bezeichnet ist, einen neuen Mikroorganismus, Actinomycetes nov. sp. Stamm Nr. 41042, der zur Bildung von Mycoplanecin befähigt ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Mycoplanecin durch Züchtung eines Mycoplanecin bildenden MicroOrganismus des Genus Actinoplanes.

Die erzindungsgemäße neue antibiotische Substanz, Mycoplanecin, wird durch folgende physikalische und chemische Eigenschaften charakterisiert:

1.) Farbe und Zustandsform: Weißes Pulver.

2.) Schmelzpunkt: 161 - 167°C.

3.) Spezifische Drehung: _ß - 66 (c = 0,4, Chloroform).

4.) Elementaranalys e:

C: 61,78 %] H: 8,48 %; N: 11,75 ⁰A (nach der Trocknung zur Gewichtskonstanz).

5.) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

Nur Endabsorption, wie in Figur 1 der beigefügten Zeichnungen gezeigt ist, bei der Messung in einer Konzentration von 20 ug/ml in einer 50~prozentigen (V/V) v/ässrig-methanolischen Lösung.

6.) Infrarot-Absorptionsspektrum:

Das im KBr-Pressling gemessene Spektrum ist in Figur 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt.

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7.) Kernresonanzspektrum:

Das in Deuterochloroform als Lösungsmittel gegen Tetramethylsilan (TMS) als inneren Standard gemessene Spektrum ist in Figur 3 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.

8.) Löslichkeit:

Löslich in Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Aceton und Chloroform.

Wenig löslich in Benzol.
Unlöslich in Wasser.

9.) Farbreaktionen:

Braunfärbung mit 50-prozentiger (V/V) wässriger Schwefelsäure .

Positiv gegen Jod und Kaliumpermanganat im Silicagel-Dünnschichtchromatogramm.

Negativ gagen Ninhydrin und 2,4-Dinitrophenylhydrazin.

10.) Aufbau aus Aminosäuren:

Durch 20-stündige Hydrolyse mit 6 η-Chlorwasserstoffsäure bei 1O5°C wurden jeweils 1 Mol Glycin, Prolin, Leucin, 2-Amino-5-methylhexansäure, N-Methylthreonin, N-Methylleucin, Methylprolin und Äthylprolin und 2 KoI N-Methylvalin aufgefundsn.

11.) Antibakterielle Aktivität:

Starke antibakterielle Aktivität gegen verschiedene Bakterien des Genus Mycobacterium.

Darüber hinaus zeigt Kycoplanecin R:C~-,verte (bei der Dünnschichtchromatographie an Silicagel, F 254, π,25 mm, Nr. 5715» der Merck und Co. Inc.) von 0,15 nach Entwicklung mit Äthylacetat und von 0,64 nach der Entwicklung mi\. einem Gemisch aus

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Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 95 : 5·

Der erfindungsgemäße neue Microorganismus ist Actinomycetes nov. sp. Stamm Nr. 41042. Dieser Stamm wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die in Sumoto City, Hyogo Prefecture, Japan, gewonnen wurde. Der Stamm wurde bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer FERM-4504 erhalten. Der Stamm wurde außerdem unter der Hinterlegungsnummer NRRL-11462 bei dem US-Department of Agriculture hinterlegt.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung der neuen anibiotischen Substanz Mycoplanecin, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mycoplanecin bildenden Microorganismus des Genus Actinoplanes züchtet und danach Mycoplanecin aus der Kultur isoliert.

Nachstehend werden morphologische Charakteristika und physiologische Eigenschaften von Actinomycetes nov. sp. Stamm Nr. 41042 beschrieben:

1.) Morphologische Eigenschaften:

Bei der Züchtung auf dem Medium ISP4 gemäß der Vorschrift des International Streptomyces Project (ISP) bei 28°C während 14 Tagen zeigte Stamm Nr. 41042 bei der Beobachtung unter dem Mikroskop folgende morphologische Eigenschaften:

Sphärische bis subsphärische Sporangien mit einem gewöhnlichen Durchmesser von 7-15

Sporen einer Größe von 0,8 pm χ 1^3 pm. Diese Sporen haben Geißeln und besitzen in einem 1/15 i^m Phosphatpuffer vom pH 7<,0 eine Motilität von etwa 40 Minuten.

Die Ergebnisse beim Wachstum auf verschiedenen Medien bei 28°C während 14 Tagen sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.

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Tabelle 1

; Stärke und Salze
enthaltender Agar
'(ISP 4) SM

AM SP

j mäßig,dunkel gelblichorange

! (8-7-3)

\ kein Wachstum

! nicht gebildet

; reichlich

Medium	Merkmal	Eigenschaft von Stamm Nr. 41042
Hefe-Malz- Agar (ISP 2) ; I Ϊ j i	SM AM SP SG	reichlich,dunkel gelblich-orange (8-7-8) kein Wachstum nicht gebildet t I nicht ausgebildet j
'Hafermehl- •'Agar (ISP 3)	SM AM SP SG	reichlich, gelblichbraun (10-6-8) 1 Spuren an Luftmycel ! blaß gelblichbraun ! (4-8-9) j nicht ausgebildet
		j

Glyzerin-Asparagin-Agar
(ISP 5)

SM

SP SG

■ reichlich ,blaß .aerolichbrauii \ (4-8-3)

kein Wachstum * nicht gebildet

■ nicht ausgebildet

0 9 3 h 8 / 0 9 0 E

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Medium

Merkmal Eigenschaft von Stamm Nr. 41042

Tyro sin-Agar
(ISP 7)

SM

AM SP SG reichlich, hellbraun (8-6-7)

j kein Wachstum

ι blaß gelblich-braun

j nicht ausgebildet

Nähraga?

SM

AM

SP

SG nicht sehr gut,"blaß orange (4-8-7)

kein Wachstum nicht gebildet nicht ausgebildet

Agar nach
Emerson

SM

AM SP

SG mäßig,blaß gelblich-braun (6-8-8)

kein Wachstum gelblich-braun (10-6-8)

nicht ausgebildet

syovx.s.

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- χ-

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Medium	Merkmal	Eigenschaft von Stamm Nr. 41042
V/asser-Agar	SM	schlecht, gelblich-grau (1-9-10)
	AM	kein Wachstum
	SP	nicht gebildet
	SG	mäßig ausgebildet
Calciummaleat- Agar	Oi^-I	mäßig, blaßorange (4-8-7)
	AI-I	kein Wachstum
	SP	nicht gebildet
	SG	geringfügig ausgebildet I
Agar nach Hickejr-Tresner	SM	reichlich, gelblich-braun \

AM

SP SG

(8-6-8)

j Wachstum von geringfügigen j Spuren an Luftmycel nicht gebildet
nicht ausgebildet

.Agar nach
Bennett

SM

Ml

reichlich,dunkel gelblich-orange (8-7-3)

kein wachstum
nicht gebildet
geringfügig ausgebildet

Ports

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Tabelle 1 (Fortsetzung)

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Medium	i	Merkmal	Eigenschaft von Stamm Nr. 41042
Saccharose- Nit rat -Agar	SM !	weniger gut, blaß-orange (4-8-7)
	AM	kein viachstum
	SP	nicht gebildet
	SG	reichlich '
Glue ο s e-Aspara- gin-Agar	SM	mäßig, bräunlich-xfeiß (2-9-8)
	AM	kein Wachstum
	SP	nicht gebildet
	SG	geringfügig ausgebildet !
Tomatenmark- Hafermehl -Agar	SM	mäßig,blaß gelblich-braun 5 (6-3-9) ■ j
	AM	kein Wachstum j
	SP	nicht gebildet
	SG	nicht ausgebildet j
Glyzerin-Glycin- Agar	! „., OL-I	reichlich,blaß gelblich-braun j (5-8-8) j
' AM SP	1 i kein Wachstum '; nicht gebildet ^;

' nicht ausgebildet

Glucüse-Nitrat-Agar

AM SP SG

. mäßig, dunkel '-eiblich-ο range

^: (8-7-8)

■ kein V/achstum

\ dunkelgelb (10-7-9)

, nicht ausgebildet

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Abkürzungen:

SM : Substratmycel;

AM : Luftmycel;

SP : Lösliches Pigment;

SG : Sporangium

2.) Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften von Stamm Nr. 41042 sind in Tabelle 2 aufgeführt.

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Tabelle 2

Tyrosinasereaktion Ni "tr atr edukti on Hydrolyse von Stärke

Verflüssigung von Gelatine

Peptonisierung von Milch, 26°C Coagulation von Milch

Melaninbildung Medium A

Medium B

Temperaturbereich für das Wachstum

(auf ISP 2-Medium) stark positiv stark positiv negativ

stark positiv

positiv (pH 6,0)

posi/civ

positiv positiv

9,0 - 32,5°C

(Optimaltenro eratur für das Wachstum 18,5 - 29 C)

INSPECTED

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- -HT-

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Es wurden folgende Medien verwendet:

Medium A : Trypton-Hefeextrakt-Brühe

(ISP 1)

Medium B : Pepton-Hefeextrakt-Sisen-Agar

(ISP 6)

In der nachstehenden Tabelle 3 wird das Kohlenstoffquellenausnutzungsmuster für Stamm Nr. 41042 auf Pridham-Gottlieb's-Agar-Medium bei 28⁰C nach 14 Tagen gezeigt.

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J*

Tabelle 3

Medium	C D	Medium C	D	I	-	-
D-Glucose		Raffinose	■η· !
L-Arabinose	4-4- ++	Inulin	\
D-XyIose	₊₊ 4-4-	Dextrin 4-4-	-
D-Fructose	+	Stärke +	- :
L-Rhamnose	4- 4-4-	i-Inosit	-
D-Galactose	4-4- 4-4-	D-Mannit
D-Mannose	4-4- 4-4-	DuIcit
Saccharose	4-	Salicin
D-Cellobiose	4- ₊₊	Natriumacetat
Melibiose	_ _	Natriumsucci- nat

iß-Lactose

!Maltose Trehalose

Glycerin

Cellulose

Kontrolle

++ I

++ ; wird gut verwertet + t wird verwertet

- : wird nicht verwertet

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Es wurden folgende Medien verwendet: Medium C : Pridham-Gottlieb-Agar

Medium D : Pridham-Gottlieb-Agar plus

0,5 % Hefeextrakt.

3.) Mycel-Komponenten

Ein Säurehydrolysat der Mycelien wurde durch Papierchromatographie nach den Verfahren analysiert, die von B. Becker et al in Applied -Microgiology, 1_2, 421 (1964) und 1_3, 236 - 243 (19'^:5) und von M.P. Lechevalier et al in ^!!The Actinomycetales" von H. Prauser, 311 (1970) beschrieben \\rurden. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 gezeigt.

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Tabelle 4

Zellwand - Typ

(Typ der Diaminopimelinsä.ure

Mesο LL Hydroxy

Glycin AraMnose Galactose

+ Spuren

Durch diese Ergebnisse wird bestätigt, daß es sich um den Zellwand-Typ II handelt.

Tabelle 5

Saccharidkomponenten der gesamten Zelle

Glucose

Galactose . Mannose Arabinose Xylose

Spuren Spuren Spuren

Wie aus den vorstehend "beschriebenen Eigenschaften klar ersichtlich ist, gehört Stamm Nr. 41042 dem Genus Actinoplanes der Familie Actinoplanaceae innerhalb der Spezies Actinomycetes an. Dieser Schluß gründet sich auf die Bildung von sphärischen bis subsphärischen Sporangien, beweglichen Sporen und Zellwänden des Typs II. Der neue Stamm wird daher als Actinoplanes nov. sp. Stamm Nr. 41042 bezeichnet.

Wie gut bekannt ist, sind die Eigenschaften von Actinornyceten, einschließlich Stämmen von Actinoplanes nicht fixiert und unterliegen leicht der Mutation sowohl durch natürliche Einflüsse,als auch als Ergebnis von künstlichen Mutationsmethoden. Die Erfindung bezieht sich zwar auf die Herstellung des neuen Antibiotikums Mycoplanecin, insbesondere durch Züchtung des vorstehend definierten Microorganisimis' Actinoplanes nov. sp. Stamm Nr. 41042, schließt sber auch die Verwendung von Mutanten dieses MicroOrganismus und allgemein eines jeden Stammes von Actinoplanes ein, der zur Bildung von Ilycoplanecin befähigt 1st, um auf diese Weise diese antiblotisch wirksame Substanz herzustellen.

Die Züchtung der Mycoplanecin bildenden Microorganisrnen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann unter den Bedingungen erfolgen, die üblicherweise zur Züchtung der Spezies Actinoplanes angewendet werden. Bevorzugt werden die Schüttelkultur oder Submerskultur unter Belüftung und Rühren in einem flüssigen Medium. Das zur Züchtung verwendete Nährraediuin kann eine Zusammensetzung haben, wie sie üblicherweise zur Züchtung von Actinomycetes angewendet wird. Dieses ϊ-Iedium enthalt somit eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, z.B. Glucose, Arabinose, Galactose, Mannose, Saccharose, Maltose, Dextrin, St'irke, Glycerin, ein pflanzliches Fett oder Cl, wie Sojabohnenöl, Maisöl odex" Leinsamenöl, ein tierisches Fett oder öl, wie Geflügelül oder Spocköl oder Fischöl, eine assimilierbare Stickstofiquelle, 2.B. Sojabohnen:nehl, Zrdmu..n;;lil_? Bc-urawoll» samenmehip Fischnshl, Maisquellflüssigkeit, Hafermehl, entrahmte Milchs Pepton, Fleischextrakt, lebend- Hefe, HefeextraV't,

BAD OFUStNAt*

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Casaminosäure.- (Aminosäuren aus Casein), Natriumnitrat, Aminoniumnitrat oder Ammoniumsulfat, sowie anorganische Salze, z.B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate, Magnesiumcarbonat, Calciumcarbonat oder Calciumchlorid. Es kann außerdem kleine Mengen verschiedener anderer Metallsalze enthalten, z.B. Ferrosulfat, Kupfersulfat, Magnesiumsulfat, Zinksulfat oder Kobaltsulfat.

Die Züchtung in einem flüssigen Medium erfolgt vorzugsweise aerob unter Lüftung und Rühren. In diesem Fall kann dem Medium ein Antischaummittel zugesetzt v/erden. Zu geeigneten Antischaummitteln gehören Siliconöle, pflanzliche öle oder oberflächenaktive Mittel.

Die Züchtung wird in geeigneter Weise bei einem im wesentlichen neutralen pH-Wert und bei einer Temperatur von 18 bis 50⁰C, vorzugsweise bei etwa 28°C durchgeführt.

Der Titer des in der Kulturbrühe gebildeten Mycoplanecins kann im Verlauf der Züchtung quantitativ mit Hilfe der Cup-assay-Methode unter Verwendung von Mycobacterium smegmatis ATCC 6 als Test-Micrcorganismus bestimmt werden. Die maximale Produktion von Mycoplanecin wird im allgemeinen nach 3 - 5-tägiger Züchtung erreicht.

Mycoplanecin ist sowohl im flüssigen Anteil, als auch in dem Mycel-Anteil der Kulturbrühe vorhanden, die mit Hilfe des erfindungsgemaßen Verfahrens erhalten wird. Um das Antibiotikum nach Vervollständigung der Züchtung aus der Kulturbrühe zu gewinnen, werden das Mycel und andere Feststoffe zuerst durch Filtration, beispielsweise unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrationshilfsmittel, oder durch Zentrifugieren, von der flüssigen Phase entfernt. Das Mycoplanecin, welches in dem Mycel-Anteil, dem Filtrat oder in der überstehenden Flüssigkeit vorliegt, kann dann nit Hilfe ".bücher Hethodan, die an seine physikalisch-chemischen Eigenschaften angeglichen sindj isoliert und gereinigt werden.

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BAD ORIGINAL

So kann beispielsweise das in dem Mycel-Anteil vorliegende Mycoplanecin durch Zugabe eines wassermischbaren Lösungsmittels, wie Methanol, iithanol, Isopropanol oder Aceton, extrahiert werden. Das Lösungsmittel wird dann von dem Extrakt entfernt und der Rückstand wird mit einem wasserunmischbaren Lösungsmittel, wie Chloroform, Äthylacetat, Methylisobutylketon oder Methylenchlorid, rückextrahiert. Das in dem flüssigen Anteil der Kulturbrühe vorliegende Mycoplanecin kann ebenfalls mit einem solchen wasserunmischbaren Lösungsmittel extrahiert werden, wonach es normalerweise mit dem Extrakt aus dem Mycel-Anteil kombiniert wird und konzentriert wird, so daß ein roher Mycoplanecinextrakt erhalten wird.

Gemäß einer anderen Ausführungsform kann Mycoplanecin durch Zugabe eines wassermischbaren Lösungsmittels, wie eines der vorstehend beispielhaft genannten Lösungsmittel, direkt zu der Kulturbrühe extrahiert werden, ohne daß das Mycel aus dem flüssigen Anteil abgetrennt wird. Der gebildete Extrakt wird filtriert und konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen, wonach der Rückstand wie in der vorstehend beschriebenen Ausführungsform mit einem wasserunmischbaren Lösungsmittel extrahiert wird.

Das auf diese Weise erhaltene Mycoplanecin kann mit Hilfe irgend einer der Methoden, die zur Reinigung von Verbindungen mit ähnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften gut bekannt sind, weiter gereinigt werden; vorzugsweise werden jedoch Reinigungsmethoden unter Verwendung eines Adsorptionsmittels oder mit Hilfe der Gegenstrom-Verteilungsmethode, bevorzugt. Zu geeigneten Adsorptionsmitteln gehören Aluminiumoxid, Silicagel, Sephadex (eine Reihe von organischen Polysaccharidderivaten) oder Cellulose. Erfindungsgemäß wird insbesondere die Tremimethode durch Süulenchromatographie unter Verwendung von Si-. licagel als Trüger und Methanol, ivthylacetat, Chloroform oder von Gemischen dieser Lösungsmittel als Elutionsmittel, bevorzugt. Die präparative Dünnschichtchromatogracliie unter Verwendung von uilxcagel ist ebenfalls gut wirksam zur Herstellung

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von hoher gerexnigtem Mycoplanecm.

Das auf diese Weise erhaltene, gereinigte Mycoplanecin zeigt bei Farbreaktionen mit Schwefelsäure, Kaliumpermanganat oder Jod im Silicagel-Dünnschichtchromatogramm einzelne Flecken und hat außerdem die vorstehend beschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften.

Die inhibierenden Mindestkonzentrationen (MIC) of Mycoplanecin gegen verschiedene Microorganismen sind in der nachstehenden Tabelle 6 gezeigt. Die Werte xmrden in folgender Weise bestimmt:

Für Mycobakterien nach der Inkubation während 5 Wochen bei 37°C mit Hilfe der Verdünnungsmethode unter Verwendung von flüssigem Dubos-Medium mit einem Gehalt an 1 % Rinderserum. Allgemein bei Bakterien nach der Inkubation während 24 Stunden bei 37°C mit Hilfe der Agar-Verdünnungsmethode, wobei Herzinfusionsagarmedium verwendet wurde. Bei Fungi und Hefen nach der Inkubation während 48 Stunden bei 26°C mit Hilfe der Agarverdünnungsmethode unter Verwendung von Agarmedium nach Sabouraud.

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TABELLE 6

. Testorganismus	IFM	IFM	2062	ledium*	MIC (jlg/ml)
Mycobactcrium kansasii	IFM	IFM	207S	DM	0,025
Mycobacterium fortuitum	Mycobacterium intracellulare IFf-	IFM	I 2073	DM	1, 56
	Mycobacterium intracellulare IFF	IFM	. 2083	DM	0,39
Mycobacterium tuberculosis	IFM	2026	DM	0,39
Matsudo nycobacterium tuberculosis	IFM	2027	DM	0,195
Maru Mycobacterium tuberculosis	IFM	2028	DM	0,39
^H37 Mvcobacterium tuberculosis		2029	DM	0,78
M₃₇Rv Mycobacterium tuberculosis	IFM ATCC	2030	DM	0,39
H₂ f'lycobaGterium bovis BCG		2031	DM	0,78
Mycobacterium bovis ushi-10		2032	DM	0,78
Mycobacteriurn tuberculosis		DM	0,1
CStreptomycin-resistent) Mycobacterium smagmatis	2033 607
Mycobacterium phlei 'licrococcus Iutbus PCI 1001		DM DM	0»1 0,08
	DM H	0,01 0,0125

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IS

TABELLE 6 (Fortsetzung)

ι TestOrganismus	2Q9P JC-1	Medium *	ME (u.g/ml)
Staphylococcus aureus	PCI 219	H	>400
Bacillus ,subtilis	NIH3 OC-2	H	^>4ü0
Escherichia coli	PCI 602	H	>4Ü0
Klebsiella pneumoniae	OX 19	H	>40Ü
Proteus vulgaris	1331	H	>400
Proteus mirabilis	SANK	H	>4D0
Pseudomonas aerüginosa	73BB0 Yu 12DÜ
Candida albicans	SANK	H S	>400 --4ÜU
Aspergillus oryzae	11262 SANK
Penicillium chrysogenum	12768 SANK	S	>400
Trichophytop. mentagrophytes	22374 SANK	S	>4ÜO
Pyricularia oryzae	16975	S	?400 > /■ ^^
	S	400

Medium DM

Dubos-Medium, aas für die beiden Stämme Mycobacterium smegmatis ATCC 607 ur.d Kycobacterium phlei durch Zugabe von 10 % Rinderserum abgeändert war.

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Medium H : Herzinfusions-Agarmedium Medium S : Sabouraud-Agarmedium

Die Toxizität der antibiotisehen Substanz Mycoplanecin wurde durch intraperitoneale Verabreichung an Mäuse in einer Dosis von 100 mg/kg Körpergewicht geprüft. Dabei ging keine Maus ein.

Die Herstellung von Mycoplanecin wird in den nachstehenden Beispielen verdeutlicht.

Beispiel 1

In einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben wurden 100 ml eines Impfkulturmediuras gegeben, welches vor der Sterilisierung einen pH-Wert von 7,0 hatte. Dieses Medium hatte folgende Zusammensetzung (die Proζentangaben sind Gewicht/Volumen) :

Glucose 1 %

Glyc erin 1 %

Hafermehl 0,5 %

Saccharose 1 %

Sojabohnenmehl 2 %

Casaminosäure 0,5 °6

lebende Hefe 1 %

Calciumcarbonat 0,1 % Wasser q.s.

Dieses Medium wurde mit einer Kultur von Actinoplanes nov. sp. Stamm Kr. 41042 beimpft und wurde in pendelnder Schüttelkultur 96 Stunden bei 2d°C bebrütet. Die so erhaltene Kulturbrühe wurde in 5 ml-AnteilG unterteilt und .jeder Anteil wurde in einen Sakaguchi-Kolben eingeimpft, der jeweils 100 ml eines Produktionsmediums mit einem pH-¥ert von 7^0 "/or der Sterilisierung

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mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung enthielt (die Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht/Volumen) :

Glycerin	O,	5 %
Saccharose	2	%
Sojabohnenmehl	1	%
lebende Hefe	1	%
Maisquell
flüssigkeit	o,	5 %
COCl₂.6H₂O	o,	001 %
Wasser q.s.

Dann wurde eine Schüttelkultur mit Pendelbewegung während Stunden bei 23⁰C durchgeführt. Die gebildeten Kulturbrühen wurden kombiniert.

Zu 4 1 der kombinierten Kulturbrühen (pH 7,2) wurden 5 % (Gewicht/Volumen) eines Filterhilfsmittels (Celite 545, Warenzeichen der Johns Manville Product Corporation, USA) zugefügt und die Brühe wurde filtriert, um die Flüssigkeit von dem das Mycel enthaltenden Filterkuchen abzutrennen. Das Filtrat wurde mit 2 1 Äthylacetat extrahiert, um das darin enthaltene Mycoplanecin zu gewinnen, während der Mycelkuchen mit 2 1 Aceton, das 20 % (Volumen/Volumen) Wasser enthielt, extrahiert wurde. Das Aceton wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit 2 1 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetat-Extrakte aus dem Filtrat und dem Mycelkuchen wurder, kombiniert, wobei 4 1 eines kombinierten Extrakts erhalten wurden.

Dieser kombinierte Extrakt wurde zweimal mit jeweils 1 1 einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen,, Der gewaschene Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann durch Eindampfen unter vernirio.ertem Druck konzentriert, wobei 1,07 g einer öligen Substanz erhalten wurden.

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Diese ölige Substanz wurde in einem kleinen Volumen Chloroform gelöst und an einer 20 g Silicagel enthaltenden Säule adsorbiert, die vorher mit Chloroform behandelt worden war. Die Säule wurde dann mit Chloroform gewaschen und Verunreinigungen wurden mit Hilfe eines Gemisches aus Chloroform und Äthylacetat im Volumenverhältnis 1:1 und danach nur mit Äthylacetat eluiert. Das gewünschte Mycoplanecin wurde danach mit einem Mischlösungsmittel eluiert, das aus 95 Volum-% Äthylacetat und 5 Volum-% Methanol bestand. 1 1 einer aktiven Fraktion wurde aus den Eluatfraktionen abgetrennt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 130 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden.

110 mg dieses weißen Pulvers wurden in einem kleinen Volumen Chloroform gelöst und die erhaltene Lösung wurde in eine 200 ml-Säule, die Sephadex LH-20 (Produkt der Pharmacia Co. Limited, Schweden) enthielt, welche mit Chloroform gefüllt war, gegossen. Die Slution wurde dann mit Chloroform durchgeführt. Die dabei gewonnenen aktiven Fraktionen wurden durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 90 mg Mycoplanecin in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden. Dieses gereinigte Produkt zeigte im Silicagel-Dünnschichtchromatogramm einzelne Flecken mit Jod, Schwefelsäure und Kalimmpermanganat.

Beispiel 2

Zehn 500 ml-Sakaguchi-Korben, die jeweils 100 ml eines Impfkulturmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthielten, wurden mit einer Kultur von Actinoplanes nov. sp_o Stamm Nr. 41042 angeimpft und eine Schüttelkultur unter Pendelbewegung wurde 96 Stunden bei 2ü°C durchgeführt.

Ein 30 1-Krugfermeriter, der 15 1 eines Produk ;\onsmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel " enthielt, wurde mit 750 ml der wie oben beschrieben gebildeten Kulturbrühe

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beimpft und das beimpfte Medium wurde dann einer Schüttelkultur unter Rühren mit 250 Upm und Belüftung bei einer Temperatur von 28⁰C und einer Luftzuführung von 15 l/min während 80 Stunden unterworfen.

Zu der gebildeten Kulturbrühe wurden 15 1 Aceton gegeben, das Gemisch wurde gerührt und das Produkt wurde mit Hilfe von 500 g Celite filtriert. 25 1 des Filtrats wurden durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert, wobei das Aceton abdestilliert wurde. Zu der verbleibenden Flüssigkeit (15 1) wurden 7 1 Methylenchlorid zugesetzt und die Extraktion erfolgte unter Schütteln und Rühren. Der Rückstand wurde weiterhin mit zusätzlichen 7 1 Methylenchlorid extrahiert und die Extrakte wurden kombiniert, wonach das Lösungsmittel verdampft wurde und 1,8 g einer öligen Substanz verblieben.

Eine Lösung dieser öligen Substanz in einem kleinen Volumen Chloroform wurde an einer 50 g Silicagel enthaltenden und mit Chloroform gefüllten Säule adsorbiert und von dieser Säule wurde Mycoplanecin mit Hilfe eines aus 99 Volum-% Chloroform und 1 Volum-?£ Methanol bestehenden Lösungsmittelsystems eluiert.

Dabei wurden 400 ml aktiver Fraktionen gewonnen und durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 390 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden. Eine Lösung dieses weißen Pulvers in einem kleinen Volumen Chloroform wurde dann der präparativen Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Silicagelplatte (5717 der Merck & Co» Inc») unterworfen und mit einem Chloroform/Methanol-Gemisch im Volumverhältnis 95 ί 5 entwickelt. Die aktiven Banden wurden mit Äthylacetat extrahiert j, wobei 250 mg Mycoplanecin als weif3es Pulver in einer Reinheit von etwa 90 % (bestimmt durch biologischen Test) erhalten wurden.

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Claims

PA rFNTANWÄLTfc.

SCHIFF ν. FÜNER STREHL SCHÜBEL-HOPF EBBINGHAUS FINCK

MARIAHILFPLATZ Ώ. & 3, MÖNCHEN 9O 292108B

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KARL LUDWIG SCHIFF (1964.-1978)

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23. Mai 1979
SANKYO COMPANY LIMITED DEA-13 264

AntiMotisch wirksame Substanz

PATMTMiSPRUCHE

1. Antibiotisch wirksame Substanz_: Mycoplanecin, g e k e η η zeichnet durch folgende Eigenschaften :

(1) Farbe und Zustand : weißes Pulver;

(2) Schmelzpunkt : 161 bis 167°C;

(3) spezifische Drehung ;

[a]ß¹ - 66° (c = 0,4, Chloroform);

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(4) Elementaranalyse :

C 61,78 JSj H 8,48 %; N 11,75 % (nach Trocknung zur Gewichtskonstanz);

(5) Ultraviolett-Absorptionsspektrum : Nur Endabsorption gemäß beigefügter Fig. 1, bei Messung von 20 ug/ml in 50 % (V/V) wässrig-methanolischer Lösung;

(6) Infrarot-Absorptionsspektrum :

Gemäß beigefügter Fig. 2,bei Messung in KBr-Preßscheibe;

(7) Kernresonanzspektrum (NMR) :

Gemäß beigefügter Fig. 3, bei Messung in Deuterochloroform als Lösungsmittel und mit Tetramethylsilan (TMS) als innerem Standard;

(8) Löslichkeit :

Löslich in Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Aceton und Chloroform;
wenig löslich in Benzol;
unlöslich in Wasser·;

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(9) Farbreaktionen :

Braunfärbung mit 50 %iger (V/V) wässriger Schwefelsäure;

positiv gegenüber Jod und Kaliumpermanganat am Silicagel-Dünnschichtchromatogramm; negativ gegenüber Ninhydrin und 2,4-Dinitrophenylhydrazin;

(10) Aufbau aus Aminosäuren :

Je 1 Mol Glycin, Prolin, Leucin, 2-Amino-5-methylhexansäure, N-Methylthreonin, N-Methylleucin, Methylprolin und Äthylprolin, sowie 2 Mol N-Methylvalin (gemäß der Bestimmung nach Hydrolyse mit 6n Chlorwasserstoffsäure bei 105°C während 20 Stunden);

(11) Antibakterielle Aktivität :

Starke antibakterielle Aktivität gegen verschiedene Bakterien des Genus Mycobacterium»

ο Verfahren zur Herstellung der antibiotisehen Substanz Mycoplanecin gemäß Anspruch 1_s dadurch gekennzeichne t 5 daß man einen Mycoplanecin bildenden Mikroorganismus des Genus Actinoplanes auf einem Kulturmedium züchtet und Mycoplanecin aus der gebildeten Kulturbrühe isolierte

Verfahren nach Anspruch 2₂ dadurch gekennzeich

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net, daß man als Mycoplanecin bildenden Mikroorganismus Actinoplanes nov. sp. Stamm Nr. 41042, NRRL-11462 verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von 18 bis 30⁰C durchführt.

5« Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Züchtung eine Temperatur von etwa 28°C einhält.

6. Arzneimittel, enthaltend einen Wirkstoff und gegebenenfalls übliche Träger- und Zusatzstoffe, dadurch gekennzeich net, daß es als Wirkstoff eine antibiotische Substanz nach Anspruch 1 enthält.

7. Mikroorganismus Actinoplanes nov. sp. Stamm Nr. 41042, NRRL-11462.

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