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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuem Isocyclosporin G der Formel
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Erfindungsgemäss gelangt man zu Isocyclosporin G, indem man Cyclosporin der Formel
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einer Säurebehandlung unterwirft.
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Die Säurebehandlung lässt sich nach an sich bekannten Methoden ausführen, beispielsweise mit starken organischen Säuren, z. B. mit Trifluoressigsäure, vorzugsweise Methansulfonsäure oder p-Toluolsulfonsäure.
Die Menge der starken Säure, die zur Isomerisierung angewendet wird, liegt vorzugsweise zwischen 1 und 4 Mol pro Mol Cyclosporin G.
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B.Tolypocladium inflatum Gams, in Gegenwart eines Nährmediums züchtet und Cyclosporin G isoliert.
Ein bevorzugter Cyclosporin G produzierender Stamm ist der Stamm NRRL 8044 der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams. Eine Kultur davon wurde beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, 111., USA unter der Kulturnummer NRRL 8044 deponiert und steht der Öffentlichkeit zur Verfügung. Eine andere Kultur davon wurde beim Fermentation Research Institute, Inage, Chiba City, Japan, unter der Kulturnummer FRI FERM-P Nr. 2796 deponiert. Dieser Stamm wurde vormals der Pilzspecies Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.) zugeordnet und ist z. B. in der GB-PS Nr. l, 491, 509 beschrieben.
Für die Herstellung von Cyclosporin G lassen sich auch Stämme der Pilzspecies Tolypocladium
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nen werden können.
Cyclosporin G kann auf an sich bekannte Weise isoliert werden, z. B. wie im Beispiel beschrieben. Hiebei kann Cyclosporin G abgetrennt werden von gleichzeitig vorhandenen Naturprodukten, z. B. das weniger polarere Cyclosporin D, das etwas polarere Cyclosporin A (auch bekannt als S 7481/F-l), das polarere Cyclosporin B (auch bekannt als S 7481/F-2) und das noch polarere Cyclosporin C.
Isocyclosporin G zeichnet sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittelwirkstoff verwendet werden.
Insbesondere zeichnet sich Isocyclosporin G durch eine immunosuppressive und entzündungshemmende Wirkung aus.
Als Heilmittel kann Isocyclosporin G allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.
In dem nachfolgenden Beispiel erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel : Isocyclosporin G
Zur Lösung von 6, 08 g Cyclosporin G in 40 ml absolutem Dioxan gibt man die Lösung von 1, 20 g Methansulfonsäure in 20 ml Dioxan und hält das Gemisch bei 50 unter Feuchtigkeitsausschluss. Der Fortgang der Reaktion wird im Dünnschichtchromatogramm verfolgt [Polygram SIL G-Folien, Chloroform-Methanol-Eisessig (90 : 6 : 4), Joddampf zur Sichtbarmachung]. Nach 16 h wird auf Raumtemperatur gekühlt. Durch Zufügen von 1, 13 g wasserfreiem Natriumacetat wird die Säure abgestumpft, nach Rühren während 45 min das ausgeschiedene Salz abgenutscht und das Filtrat im Vakuum bei 450 eingedampft. Die 8, 1 g Rückstand werden an 500 g Kieselgel, Merck, Korngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm, chromatographiert, wobei zur Elution Chloroform-Methanol (98 : 2) dient.
Die praktisch aus reinem Isocyclosporin G bestehenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum bei 500 eingedampft und der Rückstand aus Äther bei +70 kristallisiert, wobei Isocyclosporin G vom Smp. 143 bis 1460 anfällt.
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[a] = -1960 (c = 0, 72 in Chloroform) - 1280 (c = 0, 73 in Methanol) UV-Spektrum in Methanol : Endabsorption IR-Spektrum in Methylenchlorid : s. Fig. 3 1 H-NMR-Spektrum in eDel, 90 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard : s. Fig. 4.
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Das als Ausgangsprodukt verwendete Cyclosporin G kann wie folgt hergestellt werden :
500 1 einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 2, 0 g Natriumcaseinat, 2, 5 g Ammoniumphosphat, 5 g MgS04. 7H20, 2 g KH2P04'3 g NaN03, 0, 5 g KCl, 0, 01 g FeS04 und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 l einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 Umdr/min) und Belüftung (1 l Luft/min/l Nährlösung) 13 Tage bei 270 inkubiert (s. DE-OS 2455859).
Die Kulturbrühe wird mit der gleichen Menge n-Butylacetat ausgerührt, nach Abtrennung der organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3-stufige Verteilung zwischen Methanol-Wasser (9 : 1) und Petroläther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefällt.
Das nach der Filtration gewonnene Material wird an der 5- bis 7fachen Menge Sephadex LH-20 (ein Anionenaustauscherharz mit quarternären Ammoniumgruppen) mit Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Die Spitzenfraktionen werden anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm (Merck) mit Hexan-Aceton (2: 1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin A und Cyclosporin D enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C.
Zur weiteren Reinigung werden die Cyclosporin A- und D-haltigen Fraktionen aus der 2- bis 2,5fachen Menge Aceton bei -150 kristallisiert und anschliessend durch zweimalige Chromatographie an Kieselgel 60, Korngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm (Merck) weiter aufgetrennt, wobei die mit Hexan-Aceton (2 : 1) zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D in stark angereicherter Form enthalten. Diese werden in der doppelten Menge Aceton gelöst und bei-15 kristallisieren gelassen. Das dabei erhaltene Rohkristallisat besteht aus sehr stark angereichertem Cyclosporin D, die Mutterlauge enthält neben Cyclosporin D noch weitere Komponenten, so Cyclosporin G.
Zur Gewinnung von Cyclosporin G wird die zur Trockne verdampfte Mutterlauge an Kieselgel 60, Körngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm' (Merck) mit wassergesättigtem Essigester chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D enthalten, und die später eluierten Fraktionen Cyclosporin G im Gemisch neben weiteren Komponenten. Zur weiteren Anreicherung wird das Gemisch zuerst an Kieselgel 60, Korngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm (Merck) mit Chloroform- - Methanol (98 : 2) und anschliessend zur Auftrennung mit Hexan-Aceton (2 : 1) chromatographiert ; dabei enthalten die späteren eluierten Fraktionen Cyclosporin G in sehr stark angereicherter Form.
Zur Reingewinnung werden die Cyclosporin G-Anteile zweimal aus Äther-Petroläther (1 : 1) bei Raumtemperatur kristallisiert ; sie liefern dünnschichtchromatographisch-einheitliches, reines
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2 h).- 1910 (c = 1, 04 in Methanol) UV-Spektrum in Methanol : Endabsorption IR-Spektrum in Methylenchlorid : s. Fig. l
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