DE2014277B2 - Verfahren zur Herstellung von Acylderivaten des Antibiotikums T-2636 C - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Acylderivaten des Antibiotikums T-2636 C

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DE2014277B2
DE2014277B2 DE2014277A DE2014277A DE2014277B2 DE 2014277 B2 DE2014277 B2 DE 2014277B2 DE 2014277 A DE2014277 A DE 2014277A DE 2014277 A DE2014277 A DE 2014277A DE 2014277 B2 DE2014277 B2 DE 2014277B2
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Description

OH
HO
(Π)
NHCOCOCH3
mit Estern organischer Säuren, die einen Acylrest der Formel R.CO— enthalten, in der R die obengenannte Bedeutung hat, in Gegenwart einer gegebenenfalls gereinigten Kultur der Mikroorganismen Streptomyces rochei var. volubilis (IFO 12 507), Streptomyces tolypophorus (IFO 12 554). Streptomyces hygroscopicus (IFO 12 703), Aspergillus sojae (IFO 4200) und Tramctes sanguinea (IFO 7045) bei Temperaturen von 20 bis 40" C und pH-Werten von 4 bis 9 umsetzt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung in pharmazeutisch wertvollen Acylderivatcn von itibiotikumT-2636C.
Es ist bekannt, daß ein neues, als »Antibiotikum 2636C« bezeichnetes Antibiotikum in einer Kulturühe eines neuen Stammes ck:r Gattung Strcptovces. nämlich Streptomyces rochei var. volubilis gebildet wird und in guter Ausbeute aus der Kulturbri'ihe isoliert werden kann Is. belgisches Patent 715 356).
Antibiotikum T-2636C (nachstehend häuiig kurz als »C« bezeichnet) ist eine farblose, kristalline, fcttlösliche Substanz, die gegen grampositive Bakterien wirksam ist und zwei Hydroxylgruppen in den Stellungen 8 und 14 enthält, wie die folgende Formel zeigt:
OH
worin R ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrcst mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum T-2636 C der allgemeinen Formel
R-CO
CH3
VNHCOCOCH3
CH3
In dem Bemühen, neue wertvolle Derivate von C nach einem technisch durchführbaren Verfahren herzustellen, wurde gefunden:
1. C kann in Gegenwart einer Kultur gewisser Mikroorganismen oder eines verarbeiteten Bestandteils der Kultur acyliert werden.
2. Die Acylierung findet spezifisch in der 14-Slellung statt, so daß die Ausbeute der Reaktion sehr hoch ist.
3. Das gebildete T-2636 C-14-Monoacyldcrival kann durch Chromatographie oder nach anderen üblichen Verfahren in gewünschter Reinheit isoliert werden.
Der Erfindung liegen diese Feststellungen zugrunde. Die Erfindung betrifft demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von 14-Monoacylderivaten des Antibiotikums T-2636 C der allgemeinen Formel I, worin R ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Antibiotikum T-2636C der allgemeinen Formel
35
40
55
f.o H1C
(H)
NHCOCOCH3
mil listern organischer Säuren, die einen Acylrest der
Formel R.C'O enthalten, in der R die obeng-jrumnte Jedeutung hat. in Gegenwart einer gegebenenfalls gereinigten Kultur der Mikroorganismen Sircpiomyccs rochei var. voliibilis (iFO 12 507), Sireptomyces lolypophorus (IFO !2 554), Sireptomycc-s hy- ; groscopicus (I FO 12 703), Aspergillus sojae (1FO 4200) und Trameres sanguinea (IFO 7045) bei Temperaturen von 20 bis 40 C und pH-Werten von 4 bis 9 umsetzt. Die iFO-Nummcrn in Klammern sind die Hinterlegungsnummerr. beim Institute for Fermentation, Osaka. Von diesen Stämmen ist Streptomyces rochei var. volubilis am vorteilhaftesten für die gemäß der Erfindung zu lösende Aufgabe, da der Stamm selbst eine große Menge C anreichert und es somit ermöglicht, das gewünschte C-14-Monoacylderivat lediglich durch Behandlung der Kultur mit einem geeigneten Ester einer organischen Säure zu erhalten.
Als Ester von organischen Säuren eignen sich beispielsweise die Ester von Fettsäuren, die gegebenenfalls relativ niedere Substituenien enthalten, z. B. Ameisensäure. Essigsäure, Propionsäure usw.. mit niederen Alkoholen wie Methanol, Äthanol. Propanol. Athylenglykol und Glycerin. Insbesondere sind Mcthylformiat. Äthylacetat. Äthylpropionat. Monoacetin und Triacetin zu erwähnen. In jedem Fall wird das dem verwendeten Ester der organischen Säure entsprechende C-14-Monoacylderivat erhalten.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird eine Kultur der vorstehend genannten Mikroorganismen oder ein verarbeiteter Bestandteil dieser Kultur vcrwendet. Der hier gebrauchte Ausdruck »verarbeiteter Bestandteil« bezeichnet jede Fraktion, die in höhcrem Maße als die Kultur selbst die 1 ähigkeit hat, C in der 14-Stellung zu acylieren, und die durch Reinigung der Kultur beispielsweise durch Lösungsmittelextraktion oder mit Hilfe eines Adsorptionsmittels oder eines Ionenaustauscherharze erhalten werden kann.
Als verarbeitete Bestandteile kommen beispielsweise die rohen Enzyme, die aus der Kultur von Streptomyces rochei var. volubilis, Streptomyces tolypophorus. Streptomyces hygroscopicus erhalten v/erden, das aus einer Kultur von Aspergillus sojae erhaltene rohe Estcrasesystcm (Journal of Fermentation Technology, Vol. 40, P 610, 1962) und das aus einer Kultur von Trametes sanguinea erhaltene rohe Ccllulasesystem (japanische Patentveröffentlichung 217 45 66) in Frage. Die jeweiligen rohen Enzyme werden in Abhängigkeit von ihren Eigenschaften Ri 1 verschiedene Zwecke verwendet. Neu ist die Feststellung, daß diese Systeme für die Zwecke der Erfin■· dung geeignet sind.
Mit steigender Menge des Fisters und mit langer werdender Reaktionszeit steigt der Umsatz zum gewünschten Produkt. Die Reaktionszeit variiert mit den Reaktionsbedingungen. Im allgemeinen sind mehr als 30 Minuten für die Reaktion erforderlich. Bei Verwendung eines Esters einer organischen Säure, der mit Wasser nicht mischbar ist, ist es zweckmäßig, das Reaktionssystem zu rühren, bis sich eine Emulsion gebildet hat. Die Reaktionstemperatur und der pH-Wert sind bei verschiedenen Arten von Kulturen oder Enzymen verschieden.
Als Lösungsmittel für die Extraktion des gebildeten C-14-Monoacylderivats wird der iii der Kulturbrühc verbliebene Ester der organischen Säure sowie ein fts zusätzlich zu diesem Ester zugegebenes organisches Lösungsmittel, z. B. Mcthylisobutylketon. Benzol und Chloroform, verwendet. Die Lösungsmittclphasc wird mit einer wiiürigen Lösung eines schwach alkalischen Sal/es wie Ni'iriumhydrogencarbonal und dann mit Wasser gewaschen, worauf über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt wird. Das erhaltene Kon/enuat enthält ein C-14-Monoacylderivat und den nicht umgesetzten Teil von C. Zur Isolierung des gewünschten Produkts vom Konzentral kann eine Chiornatopraphiesäule. die mit einem Adsorptionsmittel wie Kicselgel (für Chromatographie geeigneter Typ, Nr. 0,05 bis 0 2. Merck) gefüllt ist, verwendet werden. Das Konzentrat wird zunächst mit einer geeigneten Menge eines Lösungsmittels von niedriger Polarität, z. B. Benzol oder Chloroform, verdünnt und Chromatographien. Das an der Säule adsorbierte Produkt wird dann mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z. B. einem Gemisch von Benzol und Äthylacetat, eluiert. Die Fraktion, die die gewünschte Verbindung enthält, wird unter vermindertem Druck eingeengt. Das Derivat scheidet sich ohne weitere Behandlung oder beim Stehenlassen des Konzentrats nach Zusatz einer geeigneten Menge beispielsweise von Äther oder Petroläther in Form von Kristallen ab.
Die verschiedenen C-14-Acylderivate haben die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften :
Physikalische und chemische Eigenschaften
a) C-14-Monoformiat
Farblose Plättchen nach Umkristallisation aus Äthylacetat-Diäthyläther, Schmelzpunkt 175 bis 177 C; [>J? = 276.00C (C = 1,0 in Äthanol).
Elementaranalyse für C26H33NO8:
Berechnet ... C 64,04, H 6,82„ N 2.87%:
gefunden .... C 63,90, H 6,72, N 3.06%.
Ultra violctt-Absorptionsspektrum:
/.!„'"" 227 (E\ym = 1010).
b) C-14-Monoacetat (T-2636A)
Farblose Plättchen nach Umkristallisation aus Äthylacetat; Schmelzpunkt 200 bis 202 C; [-0? = -2351C(C= 1,0 in Äthanol).
Elcmcntaranalyse für C27H35NO8:
Berechnet ... C 64,67, H 6,99, N 2,79%:
gefunden .... C 64,59, H 7,05, N 2.99%.
c) C-14-Monopropionat
Farblose Plättchen nach Umkristallisation aus Äthylacetat-Diäthyläther; Schmelzpunkt 188 bis 199°C:[«]?,' = 254,3°C(C = 1,0 in Chloroform).
Elementaranalysc für C2SH
Berechnet ... C 65,23, H 7,23, N 2,72%;
gefunden .... C 65,17, H 7,24, N 2.94%.
Die C-14-Monoacylderivate haben eine geringere Toxizität und eine höhere Wirksamkeit als das als Ausgangsprodukt verwendete Antibiotikum T-2636C.
wie beispielsweise die folgenden Versuchsergebnisse /eigen:
C
C'-!4-Monoformiat ..
C-14-Monoacetat... .
C-! 4-Monoprupiorial
Aktile l-.(Tekuve
T.!M/iiäi*| j Dosis·* ι S
|L|),,,i.iiii! ki! I [Ι-Π,,,ι mu ki! Kiirpergewiclii Kttriicr.ücwicht
4100
5000-10000
8000 !0000
> 10000
50
40
32,5
3X.5
*i Eine Emulsion der Testverbindung in 5%igem Gummiarabikum wimlc ('.nippen vnn 4 Wochen alten männlichen Mäu.;en !Stumm t^ ICk JCLT) inirapcritoneal verabfolgt. Nach 7 Tagen wurde die mittlere Letaldosis |LD5U) berechnet.
**) 4 Wochen alte männliche Mäuse wurden mtraperitoneal mit Staphylococcus aureus 3O8A-1 infiziert. Unmittelbar anschließend wurde ihnen eine Emulsion der Testverbiiidung in U.2r"oiger Carboxymethylcellulose oral verabreicht, wor uf die miniere , efTektive Dosis ED5n ermittelt wurde.
Die Herstellung der Ausgangsverbindung C wird im folgenden Versuch beschrieben. Anschließend wird die Herstellung von C-14-Monoacylderivaten in Ausführungsbeispielen beschrieben. In diesen Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilcn wie Ciramm zu Kubikzentimeter.
Versuch
1,5 Raumteile eines Mediums, das 1% lösliche Stärke, 2% Maisquellwasser, 0,3% Pepton und Γ« gefälltes Calciumcarbonat enthält, wird in einen Fermenter gegeben, der ein Fassungsvermögen von 3 Raumteilen hat und 15 Minuten unter einem Druck von 1.5kg/cm2 sterilisiert wird. In den Fermenter wird e: ic Kultur von Streptomyccs rochei vat. volubilis T-2636 (IFO 12 507) aus Schrägagarkulturen geimpft, worauf 42 Stunden bei 28° C bebrütet wird. Die Kulturbrühe wird in einen sterilisierten Fermenter überführt, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hat und 100 Raumteile des Mediums der obengenannten Zusammensetzung enthält.
Die Kultivierung wird als Submerskultur bei einer Temperatur von 28 C und 50% Belüftung pro Minute pro Raumteil des Mediums unter Rühren mit 200 UpM durchgeführt. 60 Raumteile der erhaltenen Impfkultur werden in einen Hauptfermenter überführt. In einen Fermentcr.dcrein Fassungsvermögen von 6000 Raumteilen hat, werden 4000 Raumteile eines Mediums gegeben, das 3% Glycerin, 2% Maisquellwasser. 1% Baumwollsaatmehl, 0,2% Pepton und 0.5% Natriumchlorid enthält (pH 6,8). worauf das Medium sterilisiert wird. In den Fermenter wird die obengenannte Impfkultur gegeben, worauf 44 Stunden bei 28°C und 50% Belüftung pro Minute pro Raumteil des Mediums unter Rühren mit 15OUpM bebrütet wird. Nach der Bebrütungszeit haben sich 200 -//ml C in der Kulturbrühe angereichert.
B e i s ρ i e 1 1
2000 Raumteile der beim vorstehend beschriebenen Versuch erhaltenen Kulturbrühc werden mit 60 Gewichtstcilcn eines Filterhilfsmittels filtriert. Die Zellen werden anschließend mit 400 Raumtcilen Wasser gewaschen. Das Fittrat wird mit dem Waschwasser (15 vereinigt, worauf 1000 RaumteileÄthylacetat zugesetzt werden. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt und flnnn etwa 2 Stunden stehengelassen. Die organische Phase wird mit ?,00 Raumteilcn Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck auf 20 Raumteile eingeengt Das Konzentrat wird zweimal mil je
5 Raumteilcn einer 2%igen wäßrigen Natriumhicarbonatiösung und dann mit 5 R:iumteilen Wasser gewaschen, worauf eine weitere Einengung auf 2 Ri.umleile vorgenommen wird. Das Konzentrat wird mit
6 Raumteilen Benzol verdünnt und an einer Säule, die 2 Gewichtsteile Kieselgel enthält, das in Benzol suspendiert worden ist. adsorbiert. Dann wird ein Gemisch von Benzol und Äthylacelat (1:1) durch die Säule geleitet, wobei das C-14-Monoacetat zuerst aus der Säule austritt, worauf C erscheint. Die Monoacciatfraktion wird unter vermindertem Druck eingcenet. wobei C-14-Monoacetat in Form von Stäbchen erhalten wird. Nach Umkristallisation aus Äthylacetat v/erden 0.15 Gewichtsteile reine Kristalle erhalten.
Schmelzpunkt 2ÜÜ bis 2-t2' C; [./]!,' = -235 C (C = 1,0 in Äthanol).
Elemcntaranalyse (C27H35NO8):
Berechnet ... C 64,67, H 6,99. N 2.79%:
gefunden ... C 64,59, H 7,05. N 2.99%.
Beispiel 2
Zu 3000 Raumteilen des im oben beschriebenen Versuch erhaltenen Filtrats werden 600 Raumteile Methylacetat gegeben. Das Gemisch wird 4 Stunden bebrütet. Es wird dann stehengelassen, worauf die wäßrige Phase mit 1000 Raumteilen Methylisobutylketon extrahiert wird. Die organischen Phasen werden vereinigt und zweimal mit je 400 Raumteilen einer 2%igen wäßrigen Natriumbicarbnnatlösung und dann mit Wasser gewaschen, worauf unter vermindertem Druck eingeengt wird.
Zu 5 Raumteilcn des Konzentrats werden 20 Raumteile Chloroform gegeben. Das Gemisch wird mit 20 Gewichtstcilen Kieselgel auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt. Die effektive Fraktion wird eingeengt, wobei 0,05 Gewichtsteile C-14-Monoacctat erhallen werden.
Schmelzpunkt 201 bis 2040C.
Elemcntaranalyse (C27H35NO8):
Berechnet ... C 64.67, H 6,99. N 2.79%:
gefunden .... C 63.95, H 6,76, N 3.00%.
Beispiel 3
Zu 3000 Raumteilen des im oben beschriebenen Versuch erhaltenen Filtrats werden 600 Raumteile Propylacctat zugesetzt. Das Gemisch wird 4 Stunden bebrütet. Es wird dann stehengelassen, worauf die wäßrige Phase mit 1000 Raumteilen Methylisobuty'iketon extrahiert wird. Die organischen Phasen werden vereinigt, 2mal mit 400 Raumteilen 2%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen, worauf unter vermindertem Druck eingeengt wird.
Zu 5 Raumteilen des Konzentrats werden 20 Raumteile Chloroform gegeben, worauf das Gemisch mit 20 Gcwichtsteilcn Silicagel auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt wird. Die effektive Fraktion wird eingeengt, wobei 0.15 Gewichtsteile C-14-Monoacetat erhalten werden.
Schmelzpunkt 201 bis 204" C.
Elcmcntaranalyse (C27H15NO8):
Berechnet ... C 64,67. 116,99. N 2.79%:
gefunden .... C 63,98. H 6,70, N 3,02%.
B e i s ρ i e I 4
Zu 3000 Raumteilen des im oben beschriebenen Versuch erhaltenen Filtrats werden 600 Raumteile Älhylformiat zugesetzt, worauf das Gemisch 4 Stunden bebrütet wird. Danach wird stehengelassen. Die wäßrigen Phasen werden dann mit 1000 Raumteilen Mcthylisobutylketon extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, 2mal mit 400 Raumtcilcn 2%iger wäßriger Nalriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen,und schließlich wird unter vermindertem Druck eingeengt.
Zu 5 Raumteilcn des Konzentrats werden 20 Raumteile Chloroform zugegeben, worauf das Gemisch mit 20 Gewichtsteilcn Silicagel auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 beschrieben behandelt wird. Die Monoformiatfraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt, worauf säulenförmige Kristalle von C-14-Monoformiat erhalten werden, die nach Umkristallisation aus Diäthyläther 0,23 Gewichtsteile reine Kristalle ergeben.
Schmelzpunkt 175 bis 177'C; [-<]? = -276.0'C (C = 1,0 in Äthanol).
Elementaranalyse (C26H,,NO8):
Berechnet ... C 64.04, H 6,82. N 2,87%;
gefunden .... C 63,90, H 6,72, N 3,06%.
UV-Absorptionsspektrum:
/.,',,'.,',"'227!T^(EiI = 1010).
30
Beispiel 5
35
Zu 3000 Raumteilen des im oben beschriebenen Versuch erhaltenen Filtrats werden 600 Raumteile Athylpropionat zugesetzt, worauf das Gemisch 4 Stunden bebrütet wird. Nach Stehenlassen wird die wäßrige Phase mit 1000 Raumteilen Mcthylisobutylketon extrahiert. Die organischen Phasen weiden vereinigt. 2mal mit 400 Raumteilen 2%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen, worauf unter vermindertem Druck eingeengt wird.
Zu 5 Raumteilen des Konzentrats werden 20 Raumteile Chloroform zugesetzt, worauf die Mischung mit 20 Gewichtsteilen Silicagel auf die im Beispiel I beschriebene Weise behandelt wird. Die Monopropionalfraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt. wobei Säulen von C-14-Monopropionat erhalten werden. Nach Umkristallisation aus Diäthyläther beträgt die Ausbeute an reinen Kristallen 0.23 Gewichtsteile.
Schmelzpunkt 198 bis 199°C; [«]" = -254.3°C (C = 1,0 in Chloroform).
Elementaranalyse (C28H37NO8):
Berechnet ... C 65.23. H 7.23, N 2.72%:
gefunden .... C 65,17, H 7,24. N 2,94%.
Beispiel 6
Streptomyces tolypophorus (IFO 12 544) wird verwendet, um ein Medium (pH 7,0) zu impfen, das 2.0% Glucose, 3,0% lösliche Stärke, 1,0% Maisquell wasser. 1,0% rohes Sojabohnenmehl, 0,5% Pepton. 0.3% Natriumchlorid und 0,5% gefälltes Calciumcarbonat enthält. Die Bebrütung wird 42 Stunden bei 28 C vorgenommen. Die erhaltene Kulturbrühc wird zusammen mit 3% Filterhilfsmittel filtriert. Zu 1000 Raumteilcn des Filtrats wird nach Entfernung von ToIypomyein (ein von St. tolypophorus gebildetes Antibiotikum) durch Extraktion eine Lösung von 2 Gewichtsteilcn C in 10 Raumtcilcn Methanol und 100 Raumtcilcn Monoacctin zugesetzt. Das Gemisch wird 3 Stunden der Reaktion bei 37 C überlassen. Nachdem die Reaktion beendet ist. wird das Gemisch mit 500 Raumteilcn Äthylacetat extrahiert und der Extrakt mit 200 Raumteilcn Wasser gewaschen und auf 20 Raumteile eingeengt. Das Konzentrat wird 2mal mit 5 Raumteilcn 2%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und danach mit 5 Raumtcilcn Wasser gewaschen und bis auf 5 Raumteile weiter eingeengt. Das Konzentrat wird mit 15 Raumteilcn Benzol verdünnt und an einer Säule adsorbiert, die mit 5 Gewichtsteilcn von in Benzol suspendiertem Silicagel beschickt ist. Auf die Säule wird ein Gemisch aus Bcnzol/Äthylacctat (1:1) gegeben, worauf das C-14-Monoacetat zuerst die Säule verläßt, gefolgt von nichtacylicrtcm Produkt. Die Monoucctatfraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei Säulen von C-14-Monoacetat erhalten werden. Die Ausbeute an reinen Kristallen beträgt nach Umkrisiallisation aus Äthylacetat 0,10 Gewichtsteile.
Schmelzpunkt 202 bis 204" C.
Elementaranalysc (C27Hj5NO8):
Berechnet ... C 64,67. H 6,99. N 2.79%:
gefunden .... C 64,68. H 6,97, N 2.89%.
B e i s ρ i e 1 7
45 Raumteile des nach Beispiel 1 mit Äthylacetat extrahierten Filtrats der Kulturbrühe wird bei 40 C unter vermindertem Druck auf 7.5 Teile eingeengt. Hierauf werden 45 Raumteile Äthanol bei 0 bis 5 C diesem Konzentrat zugesetzt, worauf 30 Minuten stehengelassen wird. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und gibt 1 Gewichtsteil rohes Enzym.
! Gewichtsteil des rohen Enzyms wird in 1000 Raumteilen Phosphatpuffer (pH 7,0. 0.1 M) gelöst. Dk Lösung wird mit 2 Gewichtsteilen von C. gelöst ir 1000 Raumteilen Äthylacetat, vereinigt, und das Gemisch wird 3 Stunden bei 37" C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wird das Reaktionsgemisch ge trennt. Die organische Phase wird mit 200 Raumteifer Wasser gewaschen und unter vermindertem Drucl· auf 20 Teile eingeengt. Das Konzentrat wird 2ma mit 5 Raumteilen 2%iger wäßriger Bicarhonatlösum und danach mit 5 Raumteilen Wasser gewaschen worauf weiter bis zu einer Menge von 5 Raumteiler eingeengt wird. Das erhaltene Konzentrat wird mi 15 Raumteilen Benzol verdünnt und auf einer Säuli an 5 Gewichtsteilen Silicagel adsorbiert, das vorher ii Benzol suspendiert worden war. Auf die Säule wird eii Gemisch aus Benzol/Äthylacetat (1:1) aufgegeben unc durchlaufen gelassen, wobei C-14-Monoacetat dii Säule erst verläßt, gefolgt von C. Die Monoacetat fraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt wobei das C-14-Monoacetat in Form von Säulei erhalten wird. Die Umkristallisation aus Äthylaceta ergibt 1,8 Gewichtsteile reiner Kristalle.
Schmelzpunkt 200 bis 2020C.
309 586/39
Elcmentaranalysc (C27H35NO8):
Berechnet ... C 64,67, M 6.99. N 2.79%;
gefunden .... C 64,63, M 7,01. N 2.95%.
Beispiel 8
''.0O Ocwichtstcilc Wcizcnkleic werden mil 1000 Raumtcilcn Leitungswasser befeuchtet und bei 115 C 15 Minuten sterilisiert. Die sterilisierte Kleie wird mit Aspergillus sojac (IF-O 4200) bebrütet und anschließend I Woche bei 28"C die Züchtung fortgesetzt. Die als Kultur verwendete Kleie wird mit 4000 Volumtcilcn destilliertem Wasser extrahiert und filtriert. 3000 Raumteile des Filtrats werden mil 7000 Raumtcilcn Aceton versetzt. Nach 24stündigcm Stehen wird das ausgefallene Produkt durch Zentrifugieren gesammelt, wobei 10 Gcwichtstcilc rohe F-stcrase erhalten werden.
In 1000 Raumlcilcn Tris-PulTcr (pH 7,0, 0,1 M) werden 10 Gewichtsteile des rohen Estcrascpräparats gelöst. Zu dieser Lösung werden 2 Gcwichtstcilc von C in IO Raumtcilen Methanol und 130 Raumteile Monoacctin zugegeben. Das Gemisch wird bei 37"C für 3 Stunden reagieren gelassen, worauf mit Äthylacetat extrahiert wird.
Der Extrakt wird mit 200 Raumtcilen Wasser gewaschen und auf 20 Raumteile unter verminderen! Druck eingeengt. Das Konzentrat wird 2mai mit 5 kaumteilen 2%igcr Nalriumbiairbonatlösung und danach mit 5 Raumtcilcn Wasser gewaschen, worauf weiter bis auf 5 Rauintcilc eingeengt wird. Das Konzentrat wird mit 15 Raumtcilcn Benzol verdünnt und auf einer Siiule an 5 Gcwichtsleilcn Silicagcl, das in Benzol suspendiert worden war. adsorbiert. Dann wird ein Gemisch aus Bcnzol/Äthylacetat (1:1) durch die Säule gegeben, wobei C-14-Monoacelat zuerst aus der Säule austritt, gefolgt von C. Die Monoacctatfraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei säulenförmiges C-14-Monoacctat erhalten wird. Die Ausbeute an Umkristallisation aus Äthylacetat beträgt 0.055 Gewichtsteile an reinen Kristallen.
Schmelzpunkt 201 bis 202°C.
Elcmcntaranalysc (C27H35NO8):
Berechnet ... C 64,67, H 6,99. N 2,79%;
gefunden .... C 64,69, H 6,98, N 3,03%.
Beispiel 9
I-Ίιι .sterilisiertes wäßriges Medium mit einem pl I-Wert von 6.0. das 6", 1O Saccharose. 3% Sojabohnenprel.ikuchen. 3% Maisqucllwasser. 1% gemahlenen HolzzcllslofT (powdered pulp). 0.2% monobasisches Kaliumphospliat und 0.1% Magnesiumsulfat (als Hcptahydral) enthält, wird mit Tramctcs sanguinca (IFO 7045) beimpft. Das Medium wird mit 160 Um-
to drehungen/Minute bei 100 '/« Belüftung gerührt. Die Züchtungsdauer beträgt bei 28C 138 Stunden. Nach Einstellung des pH-Werts auf 4.0 mit Schwefelsäure wird die Kulturbrühe filtriert. Dann werden 500 Gewichtsteile Ammoniumsulfat zu 1000 Raumteilen des Filtrats zugegeben, wobei ein Niederschlag entsteht. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, bei 35°C getrocknet und ergibt 10 Gewichtsteile rohes Cellulasepräparat.
In 1000 Raumtcilcn Tris-PufTer (pH 7.0.0,1 M) werden 10 Gewichtsteile der rohen Ccllulase gelöst, worauf zu dieser Lösung 2 Gewichtsteile C in 10 Gcwichtsteilen Methanol und 130 Raumteile Monoacetin zugesetzt werden. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 37" C reagieren gelassen, danach wird mit 500 Raumteilen Äthylacetat extrahiert, der Extrakt mit 200 Raumtcilcn Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck auf 20 Raumteile eingeengt. Das Konzentral wird 2mal mit 5 Raumtcilcn 2%igcr wäßriger Natriumbicarbonatlösung und darauf mit 5 Raumteiler! Wasser gewaschen, wonach weifer bis auf 5 Raumteile eingeengt wird. Das Konzentrat wird mit 15 Raumteilen Benzol verdünnt und auf einer Säule an 5 Gcwichtsteilen Silicagcl, das in Benzol suspendiert worden war. adsorbiert. Dann wird ein Gemisch aus Benzol/Äthylacetat (1:1) durch die Säule gegeben, wobei C-14-Monoacetat zuerst austritt, gefolgt von C. Die Monoacetatfraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei säulenförmiges C-14-Monoacetat erhalten wird. Nach Umkristallisation aus Äthylacetat beträgt die Ausbeute an reinem Kristall 0,075 Gewichtsteile.
Schmelzpunkt 202 bis 2040C.
Elementaranalyse (C27H35NO8):
Berechnet ... C 64,67, H 6,99, N 2,79%;
gefunden .... C 64,59. H 7,03, N 3,00%.

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  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von 14-Monoacylierivaten des Antibiotikums T-2636C der allicmeinen Formel
    OH
    NHCOCOCH3
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