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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuem Dihydrocyclosporin G der Formel (I).
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Erfindungsgemäss gelangt man zu Dihydrocyclosporin G, indem man Cyclosporin G der Formel (II)
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katalytisch hydriert.
Als Lösungsmittel kommen vorzugsweise Äthylacetat oder niedere aliphatische Alkohole, wie
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tem Druck. Als Katalysator kommt vorzugsweise Palladium, z. B. Palladium auf Kohle, oder Platin in Frage.
Das als Ausgangsprodukt verwendete Cyclosporin G kann z. B. erhalten werden, indem man einen Cyclosporin G produzierenden Stamm, beispielsweise von Tolypocladium, z. B. von Tolypocladium inflatum Gams, in Gegenwart eines Nährmediums züchtet und Cyclosporin G isoliert.
Ein bevorzugter Cyclosporin G produzierender Stamm ist der Stamm NRRL 8044 der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams. Eine Kultur davon wurde beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, Ill., USA unter der Kulturnummer NRRL 8044 deponiert und steht der Öffentlichkeit zur Verfügung. Eine andere Kultur davon wurde beim Fermentation Research Institute, Inage, Chiba City, Japan, unter der Kulturnummer FRI FERM-P Nr. 2796 deponiert. Dieser Stamm wurde vormals der Pilzspecies Trichoderma polysporum (Link ex. Pers. ) zugeordnet und ist z. B. in der GB-PS Nr. l, 491, 509 beschrieben.
Für die Herstellung von Cyclosporin G lassen sich auch Stämme der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams verwenden, wie sie z. B. durch Selektion oder Mutation des Pilzstammes NRRL 8044 unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder durch Anwendung anderer Massnahmen, z. B. durch Behandlung von Laboratoriumskulturen mit geeigneten Chemikalien, gewonnen werden können.
Cyclosporin G kann auf an sich bekannte Weise isoliert werden, z. B. wie im Beispiel beschrieben. Hiebei kann Cyclosporin G abgetrennt werden von gleichzeitig vorhandenen Naturprodukten, z. B. das weniger polarere Cyclosporin D, das etwas polarere Cyclosporin A (auch bekannt als S 7581/F-l), das polarere Cyclosporin B (auch bekannt als S 7481/F-2) und das noch polarere Cyclosporin C.
Dihydrocyclosporin G zeichnet sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittelwirkstoff verwendet werden.
Insbesondere zeichnet sich Dihydrocyclosporin G durch eine immunosuppressive und entzündungshemmende Wirkung aus.
Als Heilmittel kann Dihydrocyclosporin G allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.
In dem nachfolgenden Beispiel erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel : Dihydrocyclosporin G
700 mg Palladium-Kohle (10% Palladium) werden in 20 ml Äthanol während 30 min vorhydriert. Zu dieser Suspension des Palladiumkatalysators wird die Lösung von 4, 55 g Cyclosporin G in 60 ml Äthanol zugegeben und darauf bei 21 und einem Druck von 742 mm Quecksilbersäule bis zur beendeten Wasserstoffaufnahme hydriert. Anschliessend filtriert man vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum bei 20 bis 400 zur Trockne ein. Der Rückstand besteht aus dünnschichtchromatrographisch einheitlichem Dihydrocyclosporin G in Form eines weissen amorphen Pulvers vom Schmp. 150 bis 153 (nach Trocknen im Hochvakuum während 4 h bei 80 ).
Bruttoformel : C63 HU5 Nu 012
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= -2320UV-Spektrum in Methanol : Endabsorption IR-Spektrum in Methylenchlorid : s. Fig. 3 1 H-NMR-Spektrum in CDC13, 90 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard : s. Fig. 4.
Das als Ausgangsprodukt verwendete Cyclosporin G kann wie folgt erhalten werden : 500 1 einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 2, 0 g Natriumcaseinat, 2, 5 g Ammonium-
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tes Wasser enthält, werden mit 50 1 einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 Umdr/min) und Belüftung (1 1 Luft/min/l Nährlösung) 13 Tage bei 270 inkubiert (s. DE-OS 2455859).
Die Kulturbrühe wird mit der gleichen Menge n-Butylacetat ausgeführt, nach Abtrennung der
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organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3stufige Verteilung zwischen Methanol-Wasser (9 : 1) und Petroläther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Das nach der Filtration gewonnene Material wird an der 5-bis 7fachen Menge Sephadex LH-20 (ein Anionenaustauscherharz mit quarternären Ammoniumgruppen) mit Methanol als Elutionsmittel chromatographiert.
Die Spitzenfraktionen werden anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm (Merck) mit Hexan-Aceton (2 : 1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin A und Cyclosporin D enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C. Zur weiteren Reinigung werden die Cyclosporin A- und D-haltigen Fraktionen aus der 2- bis 2, 5fachen Menge Aceton bei-150 kristallisiert und anschliessend durch zweimalige Chromatographie an Kieselgel 60, Korngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm (Merck) weiter aufgetrennt, wobei die mit Hexan-Aceton (2 : 1) zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D in stark angereicherter Form enthalten. Diese werden in der doppelten Menge Aceton gelöst und bei -150 kristallisieren lassen.
Das dabei erhaltene Rohkristallisat besteht aus sehr stark angereichertem Cyclosporin D, die Mutterlauge enthält neben Cyclosporin D noch weitere Komponenten, so Cyclosporin G. Zur Gewinnung von Cyclosporin G wird die zur Trockne verdampfte Mutterlauge an Kieselgel 60, Korngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm (Merck) mit wassergesättigtem Essigester chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D enthalten, und die später eluierten Fraktionen Cyclosporin G im Gemisch neben weiteren Komponenten. Zur weiteren Anreicherung wird das Gemisch zuerst an Kieselgel 60, Korngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm (Merck) mit Chloroform-Methanol (98 : 2) und anschliessend zur Auftrennung mit Hexan-Aceton (2 : 1) chromatographiert ; dabei enthalten die späteren eluierten Fraktionen Cyclosporin G in sehr stark angereicherter Form.
Zur Reingewinnung werden die Cyclosporin G-Anteile zweimal aus Äther-Petroläther (1 : 1) bei Raumtemperatur kristallisiert ; sie liefern dünnschichtchromatographisch- - einheitliches, reines (Reinheitsgrad > 95%) Cyclosporin G als farblose Polyeder vom Schmp. 193 bis 194 (nach Trocknen der Kristalle im Hochvakuum bei 80 während 2 h).
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