DE2000494B2 - Verfahren zur Herstellung eines Elastase-Präparates mikrobieller Herkunft - Google Patents

Description

2 OGO 494

enthält, unter Belüftung, durch anschließende Abtrennung der Zellen des Produzenten von der Kulturflüssigkeit und durch Isolierung der Elastase aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man als Produzenten der Elastase einen Stamm von Actinomyces rimosus verwendet, daß aus der nach der Abtrennung der Zellen des Produzenten erhaltenen Kulturflüssigkeit die Elastase auf einem Kunstharz-Ionenaustauscher auf der Basis von Salizylsäure und Phenol bei einer Temperatur von nicht über 10⁰C sorbiert wird, daß Elastase mit einer Salzlösung mit einer nicht weniger als lmolaren Konzentration und mit einem pH-Wert von 9,0 bis 9,4 eluiert, aus dem Eluat mit einem organischen Lösungsmittel ausgefällt, abgetrennt und schließlich getrocknet wird.

Man führt die Sorption zweckmäßig auf einem Kunstharz-Ionenaustauscher auf der Basis von Salizylsäure und Phenol, die in einem Molverhältnis von 1: 0,2 genommen wurden, mit einem relativen Quellvermögen von 9 bis 11 in der Na+-Form durch.

Vorzugsweise führt man die Sorption und die Abtrennung der Elastase bei einer Temperatur von + 2 bis +4⁰C durch.

Als Salzlösung verwendet man zweckmäßig eine Lösung der folgenden Zusammensetzung: 1 MoI NaCl, 0,3MoI NH₄Cl und NH₄OH bis zu einem pH-Wert von 9,0 bis 9,4.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird wie folgt ausgeführt:

Die Kultur eines Stammes von Actinomyces rimosus züchtet man auf einem Nährmedium, das Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.

Die Fermentation wird bei einer Temperatur von + 26 bis +28⁰C während 24 Stunden, dann bei + 30 bis +32⁰C durchgeführt; der pH des Mediums wird nicht geregelt. Er steigt während der Fermentation zunächst von 6,8 auf 7,3 und sinkt anschließend auf 6,0 bis 6,5 ab. Die Fermentation dauert 5 bis 8 Tage. Die Kultivierung wird unter Belüften unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

Nach beendeter Fermentation wird das Myzel durch Schleudern oder Filtrieren abgetrennt. Zusammen mit dem Myzel wird die Hauptmenge des Antibiotikums entfernt, das in dem Myzel gespeichert wird.

Es hinterbleibt aber in der nach der Abtrennung des Myzels erhaltenen Kulturflüssigkeit ein Teil des Antibiotikums Oxytetracyclin, das während der Fermentation in Lösung geht. Die erhaltene Kulturflüssigkeit leitet man durch eine Kolonne mit dem einen stark quellbaren Kationenaustauscher auf der Basis von Salizylsäure und Phenol darstellenden Kunstharz-Ionenaustauscher, den man vorher mit l/15molarer Pufferlösung mit einem pH von 6,2 bis 6,4 ausgleicht. Die Sorption und die anschließende Abtrennung des Fermentes wird bei einer Temperatur von nicht über 10° C durchgeführt. Die optimale Temperatur der genannten Prozesse ist die Temperatur +2 bis + 4⁰C.

Beim Durchleiten der Kulturflüssigkeit durch die Kolonne kommt es gleichzeitig zur Sorption der Elastase und des Antibiotikums. Ein Teil der inaktiven Eiweißstoffe tritt hindurch, ohne auf dem Harz sorbiert zu werden. Die Kolonne wird nach beendeter Sorption mit einem schwachen Ammoniakpuffer mit einem pH-Wert von 9,2 zum Entfernen der Pigmentstoffe gewaschen. Nach dem Waschen der Kolonne wird die Elastase mit einer Salzlösung mit mindestens 1 molarer Konzentration und einem pH-Wert von 9,0 bis 9,4 eluiert. Man verwendet zweckmäßig als Salzlösung die Lösung der folgenden Zusammensetzung:

1 Mol NaCl; 0,3 Mol NH₄Cl und NH₄OH bis zu einem pH-Wert von 9,0 bis 9,4.
Beim Eluieren geht die Elastase in die Salzlösung,

ίο während die Ballasteiweiße und Antibiotika auf dem Harz zurückbleiben. Nach einer solchen Behandlung wächst der Reinheitsgrad der Elastase auf das 10- bis 25fache.

Somit findet auf dem Harz in nur einer einzigen

xg technologischen Stufe das Konzentrieren der Elastase und deren Reinigung von dem Antibiotikum, den Pigmenten und dem Ballasteiweiß der Kulturflüssigkeit statt.

Aus dem Eluat, das eine konzentrierte Lösung von Salzen und Elastase darstellt, trennt man die Elastase durch Ausfällen mit drei Volumen von Isopropyl- oder Äthylalkohol bei einer Temperatui von nicht oberhalb +10° C ab.

Das zurr. Niederschlag ausgefallene Ferment wird durch Schleudern abgetrennt, in etwas Wasser oder in der 0,002molaren Calciumazetatlösung gelöst und lyophil getrocknet.

Nach der Beendigung des Verfahrens wird die Kolonne mit dem Harz mit 0,5 n-NaOH regeneriert, mit Wasser gewaschen und wieder mit l/15m-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,2 bis 6,4 ausgeglichen.

Die Ausbeute an Endprodukt nach der Aktivität beträgt 30 bis 45%. Das erhaltene Elastase-Präparat stellt das hellcremefarbene Pulver dar. 1 mg Elastase löst (sichtbare Auflösung) vollständig 125 bis 200 mg Elastin während 5 Stunden bei einer Temperatur von 25° C auf. Bei einer Temperatur von 40° C löst 1 mg Elastase 150 bis 300 mg Elastin während 1 Stunde auf. Die maximale Wirkung der erhaltenen Elastase tritt bei einem pH von 8,8 sowie bei pH = 6,4 in 0,05- bis 0,lmolarem Tris oder Glyzinpuffer in Erscheinung. Das erhaltene Präparat ist beständig in einem pH-Bereich von 5,5 bis 8,5 unter Erwärmen bei einer Temperatur von 40° C während 1 Stunde in einer Pufferlösung entsprechenden pH-Wertes.

Die Elastase besitzt eine merkliche Fähigkeit, andere Eiweiße, z. B. das Kasein, zu hydrolysieren. Ihre proteolytische Aktivität nach Kasein entspricht 25 bis 30 ■ 10~³ Milliäquivalent Tyrosin, das während 1 Minute Hydrolyse von Kasein bei einer Temperatur von 40° C, bezogen auf 1 mg Ferment, freigemacht wird. Die maximale Einwirkung auf das Kasein wird bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,2 beobbachtet.

Die erhaltene Elastase löst sich völlig in Wasser und Salzlösungen auf.

Das erfindungsgemäße Verfahren macht es möglich, eine hohe Ausbeute an Endprodukt nach der Aktivität zu erzielen, die Technologie der Gewinnung zu vereinfachen, sowie ein Präparat von hohem Reinheitsgrad und hoher Aktivität zu erhalten.

Außerdem macht es die Verwendung eines Stammes von Actinomyces rimosus, der auch ein Produzent des Antibiotikums Oxytetracyclin ist, möglich, den Prozeß gleichzeitig in zwei Richtungen durchzuführen, nämlich die Herstellung des Antibiotikums Oxytetracyclin aus dem Myzel und die Herstellung

des Fermentes Elastase aus der Kulturflüssigkeit nach 1/15 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,3

der Abtrennung des Myzels vorzunehmen. ausgeglichen. Beim Durchlciten der Lösung durch die

Es muß auch hervorgehoben werden, daß erfin- Kolonne werden auf demKunstharz-Ionenaustauscher

dungsgemäß eine Methode zur Herstellung von EIa- 98% der Elastase-Aktivität sowie 42 g Eiweiß und stase vorgeschlagen wird, die zur technischen Nutzung 5 78 g Oxytetracyclin sorbiert Das Harz wird mit 121

auf der Basis der gerade produzierenden Oxytetra- Ammoniumpuffer der folgenden Zusammensetzung:

cyclinanlagen geeignet sind. 0,005 m NH₄Cl und NH₄OII bis zu einem pH von

In diesem Falle bilden die elastolytischen Fermente 9,2 gewaschen. Mit dem Waschwasser treten ein Teil den Abfall der Basisproduktion, was sich zweifellos der Farbe, 9% Eiweiß und 6% Oxytetracyclin aus. auf die Selbstkosten des Antibiotikums und des EIa- io Die Elastase wird mit 101 Puffer der folgenden Zustase-Präparates auswirkt Das Verfahren ist in seiner sammensetzung: 1 m NaCl; 0,3 m NH₄Q und technologischen Ausführung einfach und günstig. NH₄OH bis zu einem pH-Wert von 9,2 mit einer Die Ausbeute des gereinigten Elastase-Präparates ist Geschwindigkeit von 750 ml/h eluiert. Das Eluat enthöher als die der anderen Quellen. hält 70 · 10⁵ Einheiten der Elastase-Aktivität, 30,6 g

15 (5,1%) Eiweiß nach Lowry und 1,5 g (1,7%) Oxy-

rseispiei tetracyclin. Das Eluat neutralisiert man mit verdünn-

Man verwendet die Kultur A;tinomyces rimosus ter Essigsäure und gibt unter Rühren 27 1 auf

LCT-Hybrid. Zur Inokulation verwendet man das -15⁰C abgekühltes Isopropanol zu, hält das Ge-

Inoculum der ersten Generation. Die Züchtung des misch während 1 Stunde, trennt den Niederschlag

Inoculums dauert 48 Stunden. 20 durch Separieren ab und löst in 11 Lösung von

Zur Fermentation verwendet man ein Nährmedium 0,002 m Calciumazetat auf. AiIe Operationen werden

der folgenden Zusammensetzung: (in Masse-%) bei einer Temperatur von nicht über +4° C durch-

Stärke 6; Sojamehl 2; Ammoniumsulfat 0,45; Mais- geführt. Die Elastase-Lösung wird lyophil getrocknet,

extrakt 1,5; Calciumkarbonat 0,8·, Wasser bis 100. Die Ausbeute an trockenem Präparat beträgt 26 g,

Die Fermentation wird bei 26 bis 28° C während 25 die Ausbeute an Endprodukt nach der Aktivität

der ersten 24 Stunden, dann bei 30 bis 32° C durch- 34%, die Elastase-Aktivität des Endproduktes

geführt. Der pH-Wert beträgt am Anfang der Fer- 260 Einheiten/mg, der Gehalt des Endprouktes an

mentation 6,8 bis 7,3, zum Schluß der Fermentation Oxytetracyclin Spuren.

6,0 bis 6,5. Die Fermentation wird unter sterilen Als ungeeignet für die Eluienmg erweisen sich die

Bedingungen unter aktivem Belüften durchgeführt. 30 Salzsysteme, die Ionen von Schwermetallen enthalten,

Die Fermentation dauert 7 Tage. Dann wird das z. B. Salze von Hg, Ag, Cd, Pb, Sn und einige andere,

Myzel durch Filtrieren abgetrennt. die für den absolut größten Teil der Fermente Gift

1001 der erhaltenen Lösung, die 200 · 10* Einhei- sind und daher nicht zum Eluieren verwendet werten der Elastase-Aktivität, 600 g Eiweiß nach Lowry den. Zur Eluierung werden auch die Salze der Metalle und 90 g Oxytetracyclin enthält, leitet man durch eine 35 nicht verwendet, die bei einem alkalischen pH-Wert Kolonne mit einem Kunstharz-Ionenaustauscher auf Gallerten biiden, z. B. Salze von Fe⁺⁺⁺. Das ist den der Basis von Salizylsäure und Phenol (Molverhältnis Spezialisten auf dem Gebiet der Ionenaustausch-1: 0,2) mit einem relativen Quellvermögen von 9 Chromatographie und der Enzymologie bekannt und bis 11. Die Kolonne (10 · 50 mm) wird vorher mit bedarf Veiner weiteren Erläuterungen.

Claims (4)

Patentansprüche- Dei Fermentation, wird während 2 bis 5 Tagen raieniansprucne. durchgeführt. Dabei kommt es zu maximaler Speiche-

1. Verfahren zur Herstellung eines Elastase- rung des Fermentes in der Kulturflüssigkeit. Dann Präparates mikrobieller Herkunft durch Kultivie- trennt man die Zellen des Produzenten (Myzel) durch rung eines Mikroorganismus als Produzenten auf 5 Schleudern ab und fügt in die erhaltene Kulturlösung einem Nährmedium, das Quellen von Kohlenstoff, Ammoniumsulfat hinzu. Dabei scheidet sich unge-Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter reinigtes Ferment ab, dessen Reinigung durch Elek-Belüftung, durch anschließende Abtrennung der trophorese auf Polyvinylchloridgel in O.Olmolarer Zellen des Produzenten von der KulturSüssigkeit Lösung von Na₂B₄O₇ (pH = 9,2) durchgeführt wird. und durch Isolierung der Elastase aus der erhal- io Das begünstigt die Entfernung des Pigmentes und tenen Kulturflüssigkeit, dadurch ge kenn- einiger nichtelastolytischer Proteinasen. Nach einer zeichnet, daß man als Produzenten der EIa- solchen Behandlung aber bleibt die Elastase-Fraktion stase einen Stamm von Actinomyces rimosus durch andere Fermente verunreinigt Zu deren Entverwendet, daß aus der nach der Abtrennung der fernung wird die weitere Behandlung in Gegenwart Zellen des Produzenten erhaltenen Kulturflüssig- 15 von Aluminiumoxidgel durchgeführt. Zu diesem keit die Elastase auf einem Kunstharz-Ionenaus- Zweck unterwirft man das ungereinigte Ferment, das tauscher auf der Basis von Salizylsäure und durch das Ausfällen mit Ammoniumsulfat erhalten Phenol bei einer Temperatur von nicht über wird, einer Dialyse und trocknet lyophil, gibt dann 10° C sorbiert wird, daß die Elastase mit einer Aluminiumoxidgel, destilliertes Wasser und Ammo-Salzlösung mit einer nicht weniger als 1 molaren ao niaklösung (pH 7,6 bis 8,0) zu. Das erhaltene GeKonzentration und mit einem pH-Wert von 9,0 misch wird während 15 Minuten geschüttelt, dann im bis 9,4 eluiert, aus dem Eluat mit einem orga- Kühler während einer Nacht stehengelassen. Den nischen Lösungsmittel ausgefällt, abgetrennt und Niederschlag trennt man durch Schleudern ab. Der schließlich getrocknet wird. Überstand enthält gereinigte Elastase.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- 25 Die Ausbeute an gereinigter Elastase beträgt wenikennzeichnet, daß man die Sorption auf einem ger als 10% nach der Aktivität.
Kunstharz-Ionenaustauscher auf der Basis von 1 mg Elastase löst bei einer Temperatur von Salizylsäure und Phenol, die in einem Molver- +25⁰C 10 mg Elastin (sichtbare Auflösung) während hältnis von 1:0,2 genommen wurden, mit einem 5 Stunden auf (Ma η die and Cohen, American relativen Quellvermögen von 9 bis 11 in der 30 Chemical Sociaty Meeting, Sept. 1959; J. Mandle Na+-Form durchführt. and B. Cohen, Archiv of Biochemistry and Bio-

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch physics, 91, 47 [I960]).

gekennzeichnet, daß man die Sorption und die Nachteile des genannten Verfahren sind niedrige

Abtrennung der Elastase bei einer Temperatur Ausbeute an Endprodukt nach der Aktivität, Vervon +2 bis +4⁰C durchführt. 35 wendung eines schwierig herstellbaren Mediums so-

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch wie die Kompliziertheit des technologischen Progekennzeichnet, daß man als Salzlösung die zesses, der eine Reihe aufwendiger Stufen wie Salz-Lösung folgender Zusammensetzung verwendet: fällung, Dialyse, Schleudern, Elektrophorese und 1 Mol NaCl, 0,3 Mol NH₄Cl und NH₄OH bis zu andere enthält.

einem pH-Wert von 9,0 bis 9,4. 40 In Chemical Abstracts, Vol.69, 1968, Referat

Nr. 9050y, fehlen die Angaben über die Ausbeute und elastolytische Aktivität der Endpräparate, was

eine vergleichbare Analyse der Vorzüge dieses oder

jenes Verfahrens nicht zuläßt. Vor allem ist bekannt, 45 daß in der Regel die Fermentpräparate, die durch

Das Fermentpräparat Elastase findet breite Ver- Ausfällen mit organischen Lösungsmitteln aus der wendung in der Nahrungsmittelindustrie, Leicht- Kulturflüssigkeit erhalten werden, schlecht gereinigt Industrie, in der Medizin sowie in der Forschung. sind und viele Ballasteiweißstoffe enthalten und folgin der Nahrungsmittelindustrie verwendet man Hch von einer geringen Aktivität sind. In Archives Elastase-Präparate zum Weichmachen von Fleisch, 50 of Biochem. Biophys., Vol. 120, 1967, S. 69, sind d. h. zur Verbesserung seiner Qualität bei der fer- Angaben über die laboratoriumsmäßige Reinigung mentativen Behandlung. In der Leichtindustrie ver- des Elastase-Präparates von Streptomyces fradiae auf wendet man die Elastase zum Beizen der Rohhäute. KM-Zellulose mit dem Ergebnis der Aktivität von In der Medizin verwendet man die Präparate Elastase 720 Einheiten/mg angeführt. Es muß hervorgehoben zum Entfernen nekrotischer Hautflächen bei Ver- 55 werden, daß das erfindungsgemäß hergestellte EIabrennungsverletzungen, bei Narbenbildung auf der stase-Präparat mit einer Aktivitätsausbeute von bis Lunge, zur Entfernung skierotischer Plättchen bei 45^fl/o eine Aktivität von 150 bis 250 Einheiten/mg einigen Arten von Arteriosklerose, zur Reinigung besitzt, was die Aktivität der Elastase der Bauchvon Eiterherden usw. Speicheldrüse der Tiere und die Elastase von Flaco-

Bekannt ist ein Verfahren zur Herstellung von 60 bacterium elastolyticum um das Mehrfache übertrifft. Elastase mikrobieller Herkunft durch Kultivierung Bei einer weiteren Reinigung des Präparates, z. B. von Flavobacterium elastolyticum, das aus der ge- auf KM-Zellulose, erhöht sich die spezifische elastomischten periodontalen Kultur von an Periodontitis Iytische Aktivität bis 1000 bis 1200 Einheiten/mg.
Erkrankten nach der allgemein bekannten Methode Die Erfindung besteht nun in einem Verfahren zur

isoliert wurde. Die Kultivierung von Flavobacterium 65 Herstellung eines Elastase-Präparates mikrobieller elastolyticum wird auf verschiedene Medien, dar- Herkunft durch Kultivierung eines Mikroorganismus unter auf einem 3^fl/oigen Trypsinhydrolysat von Soja als Produzent auf einem Nährmedium, das Quellen oder auf einem Leberhydrolysat durchgeführt. von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze