DE3511331C2

DE3511331C2 -

Info

Publication number: DE3511331C2
Application number: DE3511331A
Authority: DE
Inventors: Richard A. Clinton Ia. Us Johnson; Norman E. Ridgefield Conn. Us Lloyd
Original assignee: Stabra AG
Current assignee: Stabra AG
Priority date: 1984-03-28
Filing date: 1985-03-28
Publication date: 1993-05-13
Also published as: BE902048A; JPS60224491A; FR2562087B1; IT1208519B; JPH07114699B2; DE3511331A1; CA1237084A; DK168960B1; GB8508085D0; DK138485A; GB2156355A; HU199558B; DK138485D0; US4634673A; HUT37457A; IT8520090A0; GB2156355B; FR2562087A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen von Glucoseisomerase von wäßrigen Lösungen.

Glucoseisomerase ist ein Enzym, welches Glucose in Fructose umwandelt. Eine Reihe von Mikroorganismen ist bekannt, welche Glucoseisomerase bilden. Beispielsweise wird Glucoseisomerase von Mikroorganismen der Genera Actinoplanes, Aerobacter, Ampullariella, Arthrobacter, Bacillus, Lactobacillus und Streptomyces erzeugt. Im allgemeinen wird Glucoseisomerase zunächst intrazellular gebildet und daher findet man den größeren Anteil der Glucoseisomerase innerhalb und/oder auf den Zellwandungen der Mikroorganismen. Es ist deshalb erforderlich, das Enzym von den Mikrobenzellen zu extrahieren, um das lösliche Enzym zu gewinnen. Bei dem Extraktionsverfahren findet zumindest eine teilweise Zerstörung der Zellhüllen statt und dadurch können das Enzym und andere Zellmaterialien in den mikrobiellen Enzymextrakt diffundieren. Der Enzymextrakt enthält daher sowohl lösliche als auch unlösliche Verunreinigungen. Die unlöslichen Verunreinigungen kann man einfach in bekannter Weise, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, abtrennen. Die löslichen Verunreinigungen, von denen man annimmt, daß sie biologische Oligomere oder Polymere sind, z. B. Nucleinsäuren, nicht-enzymatische Proteine oder Zellwandkomponenten, wie Polyharnsäuren und dergleichen, sind schwierig und aufwendig zu entfernen, weil sie häufig chemische und physikalische Eigenschaften, die dem gewünschten Produkt ähnlich sind, aufweisen.

Verfahren zum Entfernen oder Abtrennen von unerwünschten löslichen Materialien aus mikrobiellen Enzymextrakten sind bekannt. Eine Zusammenfassung solcher Methoden findet man beispielsweise in Band XXII von "Methods of Enzymology", Seiten 273 bis 287 und 476 bis 656 (herausgegeben von W. E. Jakoby, Academic Press, N.Y., N.Y.). Es werden dort zahlreiche Methoden für die Enzymreinigung, z. B. Trennverfahren, die auf der Löslichkeit beruhen, Trennverfahren, die auf der spezifischen Affinität beruhen, sowie chromatografische Trennverfahren beschrieben.

Auch in zahlreichen Patentschriften werden Reinigungsverfahren für Enzyme beschrieben. In US-PS 37 69 168 wird die Reinigung vom β-Amylase durch Adsorption, Waschen und Eluieren des Enzyms mit einer ionischen Lösung beschrieben. In US-PS 39 12 595 wird die Reinigung einer hydrolytischen Enzymlösung durch reversible Komplexbildung des Enzyms auf einem körnigen Trägermaterial in einer Säule beschrieben und anschließend wird das Enzym durch Eluieren mit einem Puffer gewonnen. In US-PS 39 72 777 wird ein Verfahren zum Raffinieren von β-Galactosidase durch selektive Adsorption auf einem sauren Kationenaustauschharz und anschließendes Eluieren der β-Galactosidase von dem Harz mit einem Puffer beschrieben. Bei allen diesen Methoden wird eine unreine Enzymlösung mit einer Matrix beschrieben, welche das Enzym adsorbiert oder bindet und dann wird das gereinigte Enzym von der Matrix durch Zugabe einer Ionenlösung eluiert.

Gemäß US-PS 3 47 322 wird die Enzymreinigung durch ein chromatografisches Verfahren vorgenommen, wobei die löslichen Verunreinigungen bevorzugt an einem Ionenaustauschmaterial adsorbiert werden. Gemäß US-PS 41 06 992 wird rohe Urokinase einer Exklusionschromatografie unter Verwendung von DEAE-Celluloseharz unterworfen. Das dort beschriebene Verfahren ist hauptsächlich auf die Entfernung von pyrogenen Substanzen aus Urokinase gerichtet.

In einer Reihe von Patentschriften wird die Reinigung von mikrobiellen Enzymextrakten durch Ausfällung beschrieben. So wird in US-PS 37 28 244 die Ausfällung von Verunreinigungen mit quaternärem Ammoniumverbindung gelehrt. Aus US-PS 37 94 562 ist das Ausfällen von Verunreinigungen unter Verwendung von Polyethylenimin bekannt. Gemäß US-PS 40 55 469 erfolgt die Ausfällung von Verunreinigungen unter Verwendung von synthetischen Polyelektrolyten. GB-PS 14 11 503 lehrt die Ausfällung von Verunreinigungen mit einem kationischen oberflächenaktien Mittel. Bei allen diesen Patentschriften erfolgt die Ausfällung und Entfernung der Verunreinigungen während das aktive Enzym in Lösung verbleibt.

Quaternäre Ammoniumverbindungen, die wenigstens einen langkettigen Kohlenwasserstoff-N-Substituenten enthalten, sind oberflächenaktive Elektrolyte, die in Lösung Aggregate oder Mycele zu bilden vermögen. Diese Verbindungen haben eine hydrophile quaternäre Aminogruppe und eine hydrophobe Kohlenwasserstoffkette. Zahlreiche quaternäre Ammoniumverbindungen haben breite Anwendung als antimikrobielle Mittel gefunden und zwar aufgrund ihrer Fähigkeit, Mikroorganismen zu inaktivieren oder zu inhibieren. Diese Eigenschaft ergibt sich wahrscheinlich durch die Bildung eines Anionen-Kationen-Komplexes zwischen dem positiv geladenen quaternären Amin und der negativ geladenen Mikrobenoberfläche.

Quaternäre Ammoniumverbindungen bilden auch unlösliche Anionen-Kationen-Komplexe mit einer Reihe von negativ geladenen Makromolekülen, wie Proteinen. Eine Ausfällung, Inaktivierung, Denaturisierung, Redispergierung und Komplexbildung sind Phänomene, die aus der Reaktion von Proteinen mit quaternären Ammoniumverbindungen auftreten.

Die vorliegende Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren.

Bei der vorliegenden Erfindung wird Glucoseisomerase mit einem tertiären oder quaternären Amin unter solchen Bedingungen in Berührung gebracht, daß das Amin mit der Isomerase unter Bildung eines löslichen Enzym- Amin-Komplexes reagiert. Der Isomerase-Amin-Komplex kann zu einer stark ionischen Lösung gegeben werden, in welcher der Komplex dissoziiert und dabei eine lösliche gereinigte und konzentrierte Isomerasezubereitung ergibt.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß gewisse Aminverbindungen bei dem Verfahren zum Reinigen von Glucoseisomerase-Zubereitungen verwendet werden können.

Die tertiären und quaternären Aminverbindungen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, haben die allgemeine Formel

und darin bedeuteten R₁ einen Kohlenwasserstoffrest, enthaltend wenigstens 6 Kohlenstoffatome, R₂ einen Kohlenwasserstoffrest, enthaltend 8 bis 20 Kohlenstoffatome, R₃ einen Niedrigalkylrest und R₄ Wasserstoff oder einen Niedrigalkylrest.

Die Kohlenwasserstoffreste sind vorzugsweise Alkyl, Cycloalkyl, Alken, Aryl und Aralkyl und können durch Gruppen, wie Halogengruppen, z, B. Chlor und Brom, oder durch Hydroxy- oder Alkoxygruppen substituiert sein. Die Kohlenwasserstoffreste schließen auch Kohlenwasserstoffketten, die durch Sauerstoff- oder Schwefelatome unterbrochen sind, also beispielsweise Ether- oder Thioetherverbindungen ein, z. B. Diisobutylphenoxyethoxyreste und Diisobutylkresoxyethoxyethylreste.

X ist irgendein geeignetes anorganisches oder organisches Anion, z. B. ein Halogenid, Nitrat, Sulfat, Benzolsulfonat, Acetat, wobei das Anion gegenüber dem Enzym inert ist.

Beispiele für Amingrupen der obigen Formen, die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind Dimethylbenzyldodecylammonium-, Dimethyldilaurylammonium-, Stearyldimethylbenzylammonium-, Distearyldimethylammonium-, Diethyldioctadecylammonium-, Dimethyldidodecylammonium-, Dimethyldodecylnaphthylmethylammonium-, Dimethylhexadecyldichlorbenzylammonium- und Dimethyldiisobutylphenoxyethylbenzylammoniumsalze.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird wenigstens eine der vorerwähnten Aminverbindungen zu dem zu reinigenden wäßrigen Glucoseisomeraseextrakt unter solchen Bedingungen gegeben, daß das Amin mit der Glucoseisomerase unter Ausbildung eines unlöslichen Isomerase- Amin-Komplexes, der ausfällt, reagiert. Der unlösliche Isomerase-Amin-Komplex wird dann durch übliche Verfahren, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Zum Entfernen des Enzyms aus dem Niederschlag gibt man den Isomerase-Amin-Komplex zu einer ionisierten Salzlösung, in welcher der Komplex dissoziiert und die Isomease und das Amin wieder in Lösung gehen. Die Aminverbindung kann dann aus der Enzymlösung durch Ultrafiltration gewonnen werden oder durch Abtrennen mit einem Kationenaustauschharz und man erhält eine gereinigte konzentrierte Glucoseisomerase-Zubereitung mit einer hohen spezifischen Aktivität (beispielsweisse einer Aktivität pro mg Protein.).

Die Menge des für die Wiederauflösung des ausgefällten Enzym-Amin-Komplexes benötigten ionisierten Salzes kann in einfacher Weise durch einen einfachen Versuch, bei dem man Lösungen verschiedener Konzentrationen, d. h. Ionenstärken, von geeigneten Elektrolyten verwendet, wobei Natriumchlorid aus Gründen der Wirtschaftlichkeit und der Verfügbarkeit bevorzugt wird. Jeder Elektrolyt kann verwendet werden, sofern er die Glucoseisomerase nicht negativ beeinflußt. Die jeweils benötigte Menge des Salzes stellt man fest als die minimale Konzentration, die erforderlich ist, um den Niederschlag aufzulösen. Da Natriumchlorid keinerlei merkliche Wirkung auf das Enzym hat, kann man es in konzentrierter Lösung verwenden, um ein vollständiges Auflösen des Niederschlags sicherzustellen.

In einigen Fällen kann die wäßrige Enzymlösung, aus welcher das Enzym gewonnen werden soll, Verunreinigungen enthalten, die mit der zugegebenen Aminverbindung vor dem Ausfällen des gewünschten Enzyms Niederschläge ergeben. In solchen Fällen sollte die Zugabe des Amins stufenweise erfolgen und zwar im allgemeinen in zwei Stufen, wobei in der ersten Stufe die Verunreinigungen ausfallen und in der zweiten Stufe dann das Enzym. Die Menge des für die erste Stufe verwendeten Amins läßt sich leicht dadurch bestimmen, daß man aliquote Teile der ursprünglichen Enzymlösung verwendet und dazu graduierte Mengen der Aminverbindung zugibt. Der bei jeder Zugabe gebildete Niederschlag wird auf die Enzymaktivität überprüft und wenn diese einmal festgestellt ist, ist dies ein Anzeichen für die Menge des erforderlichen Ausfällungsmittels für die Ausfällung in der ersten Stufe.

Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet man vorzugsweise quaternäre Amine der vorgenannten allgemeinen Formeln, worin R₂ einen Alkylrest mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, R₁ einen Rest mit etwa 6 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen, R₃ und R₄ Niedrigalkylreste und X ein Halogenanion bedeuten. Noch bevorzugtere Verbindungen sind solche, bei denen R₂ einen Alkylrest mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, R₁ einen Aralkylrest mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen, R₃ und R₄ Niedrigalkylreste und X einen Halogenrest bedeuten.

Ganz besonders bevorzugte Verbindungen haben die allgemeine Formel

worin n eine ganze Zahl, die 12, 14 oder 16 entspricht, ist und X ein Anion ist. Ein solche Verbindungen enthaltendes Produkt wird unter dem Handelsnamen BTC-835 vertrieben. BTC-835 ist eine Mischung aus 50% einer Verbindung, in welcher n in der obigen Formel 14 ist, 40% einer Verbindung, in welcher n in der obigen Formel 12 ist und 10% einer Verbindung, in welcher n in der obigen Formel 16 ist.

Die Bedingungen, unter denen man die vorliegende Erfindung durchführen kann, hängen von der Reinheit und der Konzentration des Isomeraseextraktes und der jeweils verwendeten Aminverbindung ab. Die Menge des verwendeten Amins soll ausreichen, um im wesentlichen das gesamte aktive Enzym ausfällen und beträgt wenigstens 100 ppm, bezogen auf die wäßrige Lösung auf einer Gewichts-pro- Volumen-Basis. Die bevorzugte Menge beträgt wenigstens 500 ppm und im allgemeinen 500 bis 5.000 ppm. Ganz besonders bevorzugt wird eine Menge von 1000 bis 3000 ppm.

Der pH-Wert soll in einem Bereich liegen, der eine pH-Wert-Einheit oberhalb des isoelektrischen Punktes (pI) des Enzyms und eine pH-Wert- Einheit unterhalb des pKa der verwendeten Aminverbindung liegt. Der pH-Wert beträgt daher 5,5 bis 8,5, noch bevorzugter daher 5,5 bis 8,5, noch bevorzugter 6,0 bis 8,0 und ganz besonders bevorzugt 7,0 bis 7,4.

Die Temperatur kann in einem weiten Bereich variieren und zwar von 0°C bis zu der Temperatur, bei welcher eine Wärmedenaturisierung oder Inaktivierung des Enzyms eintritt. Der Einfachheit halber wird das Verfahren im allgemeinen bei Umgebungstemperatur durchgeführt.

Der Mechanismus, nach dem das Verfahren abläuft, ist derzeit noch nicht genau bekannt. Man nimmt an, daß das Amin mit der Glucoseisomerase unter Ausbildung eines unlöslichen Isomerase-Amin-Komplexes reagiert. Gibt man den unlöslichen Isomerase-Amin-Komplex zu einer starken ionischen Lösung, dann dissoziiert der Isomerase-Amin-Komplex und Isomerase und Amin gehen wieder in Lösung.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielbaren Ergebnisse sind außerordentlich überraschend. So war es sehr überraschend, daß man die vorliegenden Aminverbindungen zum Reinigen von Glucoseisomerase-Extrakten anwenden kann, weil man annahm, daß es sich hier um starke Enzyminaktivatoren und Denaturisierungsmittel handelt. Überraschenderweise sind nicht alle quaternären Ammoniumsalze und auch nicht alle tertiären Amine in der Lage, solche Ergebnisse zu erzielen, wie sie mit den speziellen tertiären Aminen und quaternären Ammoniumsalzen gemäß der vorliegenden Erfindung erzielt werden. Bekannte quaternäre Aminsalze, wie Hexadexyltrimethylammoniumchlorid, bildet keinen Niederschlag unter den Bedingungen der vorliegenden Erfindung, während andere Aminverbindungen, z. B. Octadecyltrimethylammoniumchlorid eine geringe Menge eines Niederschlags ergibt, der jedoch keine nachweisbare Enzymaktivität aufweist. Andere Amine verursachen einen erheblichen Verlust an Enzymaktivität und zwar unabhängig davon, ob sie einen Niederschlag bilden oder nicht. Die besonders wirksamen Aminverbindungen sind solche, bei denen R₁ eine Aralkylgruppe mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, z. B. Benzyl und Naphthylmethyl, R₂ Alkyl mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen bedeutet und R₃ und R₄ jeweils Niedrigalkyl, insbesondere Methyl, bedeuten. Es ist auch überraschend, daß man den Isomerase-Amin-Komplex so einfach wiederauflösen kann unter Ausbildung eines gereinigten aktiven Enzyms.

Verfahren zum Herstellen von Glucoseisomerase-Extrakten, die als Ausgangsmaterialien beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielsweise kann man einen Enzymextrakt, welchen Glucoseisomerase enthält, dadurch erhalten, daß man Mikroorganismen einer Spezies, von der man weiß, daß sie Glucoseisomerase bilden, fermentiert, das Enzym aus den Mycelen extrahiert und unlösliches Material in bekannter Weise entfernt.

Bevorzugte Glucoseisomerase-Extrakte, die man von Mikroorganismen erhalten kann, sind solche der Genera Actinoplanes, Ampullariella, Aerobacter, Arthrobacter, Bacillus, Micromonospora, Microellobospora, Norcardia oder Streptomyces. Typischerweise können Glucoseisomerase- Extrakte von Mikroorganismen der Spezies Streptomyces rubigenosus, Streptomyces olivochromogenes, Bacillus coagulans oder Bacillus stearothermophilus erhalten werden.

Analysemethoden Gesamtprotein

Das Gesamtprotein wurde bestimmt unter Verwendung eines Spektrofotometes bei einer Wellenlänge von 280 mµ.

Isomeraseaktivität-IGIU

IGIU ist die Abkürzung für Internationale Glucose Isomerase Unit und ist die Menge des Enzyms, die 1 Mikromol Glukose pro Minute in Glucose umwandelt und zwar in einer Lösung, die anfangs 2 Mol Glukose pro Liter, 0,02 Mol MgSO₄ und 0,001 Mol CoCl₂ pro Liter bei einem pH-Wert von 6,84 bis 6,85 (0,2 M Natriummaleat), gemessen bei Umgebungstemperatur und bei einer Temperatur von 60°C, enthielt. Die Glucoseisomerase- Bestimmung wurde nach der Methode, die von N.E. Lloyd et al, Cereal Chem., 49, Nr. 5, Seiten 544 bis 553 (1972) beschrieben wird, durchgeführt.

Immobilisierte Isomeraseaktivität-FAU

Die immobilisierte Isomeraseaktivität wurde nach folgendem Verfahren bestimmt:

Eine immobilisierte Isomeraseprobe, enthaltend 1.400 bis 2.200 IGIU, wurde abgewogen. Die Probe wurde in einen 250 ml-Kolben mit 125 ml Dextrose-Assay-Lösung (vorher auf 65°C erwärmt) und 10 ml 0,1 Tris-hydroxy- methylaminomethan (THAM)-Lösung (pH 7,8) gespült. Die Dextrose-Assay-Lösung enthielt 3,33 M Dextrose, 20 mM Magnesiumsulfat, 10 mM Natriumsulfit, 100 mm THAM und 1 mM Cobaltchlorid (pH-Wert 7,8). Bei 65°C hatte die Dextroselösung einen pH-Wert von 7,0. Der Kolben wurde in ein Wasserbad von 65°C eingetaucht und 1 Stunde geschüttelt. Die Mischung wurde durch einen 45 mm- Trichter mit einer groben Glasfritte mit einem Glasfaserfilter, das zuvor mit 1 g Filterhilfe beschichtet worden war, im Vakuum filtriert. Der Kolben und der Enzymkuchen wurden mit kleinen aliquoten Anteilen von 100 mM THAM-Pufferlösung (pH 7,8) bis zu einer Gesamtmenge von 100 ml gelöst.

Dieses gewaschene Enzym wurde zu einem 250-ml-Kolben, enthaltend 125 ml Dextrose-Assay-Lösung (zuvor bei 65°C ins Gleichgewicht gebracht), gegeben. Das gewaschene Enzym wurde quantitativ in dem Kolben zusammen mit 10 ml eines 10 mM THAM-Puffers 8 pH 7,8) gespült und der Kolben wurde genau 60 Minuten geschüttelt. Dann wurden 12,0 ml Eisessig zugegeben und die angesäuerte Mischung wurde weitere 15 Minuten geschüttelt. Die Mischung wurde durch einen 45 mm-Glastrichter mit grober Fritte, der mit einem Glasfaserfilter ausgerüstet war und zuvor mit 1 g Filterhilfe beschichtet worden war, im Vakuum filtriert. Der Kolben und der Trichterinhalt wurden mit entmineralisiertem Wasser gewaschen, bis annähernd 400 ml Filtrat gesammelt worden waren. Das Filtrat wurde auf 25°C gekühlt und auf 500 ml verdünnt. Die Drehung der Lösung wurde mit einer 2-dm-Zelle bei 25°C als R₂ bestimmt.

Eine Blindprobe wurde in gleicher Weise wie oben beschrieben, jedoch ohne Zugabe des Enzyms, durchgeführt. Die optische Drehung der Blindprobe wurde ebenfalls bei 25°C als R₁ bestimmt. Der Isomerisierungsgrad wird nach folgender Gleichung berechnet:

worin a die spezifische Drehungsveränderung bedeutet, wenn Fructose vollständig in Dextrose umgewandelt ist, C_p die Konzentration des Zuckers in der Lösung (0,15 g/ml) und L die Länge des Polarimeterrohres (2 dm) ist.

Die fixierte Aktivitätseinheit (FAU) der Isomeraseaktivität wird wie folgt berechnet:

FAU/g = JC/K_ftw

worin K_f eine Ratenkonstante (1,21 I h^-1FAu^-1 mg Glucose), t die Reaktionszeit in Stunden (1 h), w das Gewicht in Gramm der Probe, C die Anfangskonzentration in mg pro 125 ml Reaktionsmischung (75,000 mg Glucose) bedeutet und J wie folgt definiert wird:

worin bedeuten:
I_e = Isomerisierungsgrad beim Gleichgewicht als Molfraktion von Fructose (0,513),
I = Isomerisierungsgraad als Molfraktion von Fructose.
C_m = Anfangsmolkonzentration von Glucose (3,33 M),
K_s = Michaelis-Konstante für Glucose (0,7 M),
K_p = Michaelis-Konstante für Fructose (1,43 M)

Ein IGIU entspricht 15,8 FAU′s.

Die folgenden Beispiele beschrieben die Erfindung.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Bildung eines unlöslichen Glucoseisomerase-Amin-Komplexes und die Dissoziation des Komplexes in einer ionischen Lösung unter Ausbildung einer gereinigten aktiven Glucoseisomerase- Zubereitung.

Ein Glucoseisomerase-Extrakt wurde aus Mikroorganismen eines ausgewählten Stammes von Streptomyces genes erhalten und auf den pH-Wert 7,2 eingestellt. Die Isomeraseaktivität des Extraktes betrug 40 IGIU/ml. Zu jedem von 9 Behältern wurden 25 ml des Enzymextraktes (1000 IGIU-Gesamt) gegeben. Eine ausreichende Menge an BTC-835, N-Alkyl(C₁₂, C₁₄, C₁₆)-dimethyl-benzylammoniumchlorid wurde in jeden Behälter bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Rühren während 15 Minuten gegeben. Die Zugabe von BTC ergab die Bildung eines weißen flockigen Niederschlags und zwar schon bei dem untersten Niveau von 100 ppm.

Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und Anteile der überstehenden Lösung wurden auf die Isomeraseaktivität untersucht. Die Ergebnisse werden in Tabelle I gezeigt.

Tabelle I

Die Daten zeigen, daß keine lösliche Isomeraseaktivität bei einer BTC-Konzentration von 1000 ppm oder mehr verblieb. Bei einer BTC-Konzentration von 500 ppm betrug die restliche Löslichkeitsaktivität 50%.

Der Niederschlag von Versuch 5 wurde in 5 ml 0,5 N NaCl bei Raumtemperatur resuspendiert und gerührt. In wenigen Minuten löste sich der Niederschlag wieder auf. Ein 0,5 ml-Anteil der erhaltenen Lösung wurde mit 19,5 ml NaCl verdünnt und eine Untersuchung zeigte eine Isomeraseaktivität.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bildung einer gereinigten und konzentrierten Glucoseisomerase.

Eine 300-ml-Probe des Isomeraseextraktes von Beispiel 1 mit einer Gesamtaktivität von 12 000 IGIU und einer spezifischen Aktivität von 2,7 IGIU/mg Protein wurde mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. BTC-835 wurde bis zu einer Endkonzentration von 1000 ppm zugegeben und dann wurde 15 Minuten gerührt. Der so gebildete Niederschlag wurde auf einer Vorbeschichtung von Filterhilfen durch Filtrieren gesammelt. Der gesammelte Kuchen wurde auf dem Filter mit Wasser gewaschen und Proben des Filtrats und des Waschwassers wurden auf Isomeraseaktivität untersucht. Es wurde keine Aktivität bei den Lösungen festgestellt.

Der Filterkuchen wurde mit 0,5 N NaCl eluiert. Das Natriumchlorideluat wurde unter Verwendung einer XM100 (100 000 Mol Gewicht cut-off (MWCO))- Membran ultrafiltriert. Das Ultrafilterretentat wurde mit 3 Volumenanteilen von 0,5 N NaCl zum Entfernen von restlichem ungebundenen BTC diafiltriert. Schließlich wurde das Retentat durch wiederholte Diafiltration mit Wasser entsalzen. Das fertige Retentat enthielt insgesamt 8860 IGIU mit einer spezifischen Aktivität von 43,32 IGIU/mg Protein. Insgesamt 73,8% der Ausgangs-Isomeraseaktivität wurden gewonnen und die spezifische Aktivität von 43,32 IGIU/mg Protein zeigte an, daß die Zubereitung wenigstens 90% Isomerase auf einer Proteinbasis enthielt. Es wurde somit eine Reinigung um etwa das 20fache bei einer guten Aktivität erzielt.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt unter Verwendung eines Isomeraseextraktes, der aus einer zweiten Fermentation des gleichen Streptomyces, der in Beispiel 1 verwendet wurde, erhalten wurde.

Ein 500-ml-Anteil des Isomeraseextraktes (14 000 IGIU gesamt) wurde auf den pH-Wert 7,2 eingestellt und dazu wurde bis zu einer Endkonzentration von 1000 ppm tropfenweise BTC-835 gegeben. Die erhaltene Suspension wurde nach Zugabe von 2 g einer Filterhilfe filtriert und der Filterkuchen wurde mit etwa 100 ml Wasser gewaschen. Das Filtrat plus die Waschwässer enthielten keine Isomeraseaktivität. Der gewaschene Filterkuchen wurde dann langsam in situ mit 300 ml 0,5 N NaCl während einer Dauer von 3 Stunden eluiert.

Das Salzeluat wurde mit einer Amicon-Membran XM-50 (50 000 MWCO) ultrafiltriert. Das Ultrafilterretentat wurde gründlich mit 0,5 N NaCl und dann mit Wasser zur Entfernung von restlichem BTC und von Salz diafiltriert. Das letzte Retentat enthielt insgesamt 13 550 IGIU mit einer spezifischen Aktivität von 43,4 IGIU/mg. Die Reinigung war also ebenso erfolgreich wie in Beispiel 2 und die Aktivität (94%) wurde erheblich erhöht.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wurde das erfindungsgemäße Verfahren zum Reinigen eines Isomeraseextraktes, der aus Bacillus-Mikroorganismen erhalten worden war, angewendet.

(A) Die Ausgangs-Enzymquelle war ein Trockenpulver, bestehend aus Bacillus-Gesamtzellen, vermischt mit einem Filterhilfenträger. Die Enzymsolubilisierung erfolgte, indem man das Pulver in einem verdünnten Tris-Puffer, pH- Wert 7,0, suspendierte und 2 Stunden bei Raumtemperatur rührte, nachdem man Lysozym zugegeben hatte (200 mg/100 g trockenes Enzym). Das unlösliche Material wurde durch ein Filter, das mit einer Filterhilfe vorbeschichtet war, abfiltriert und das Filtrat wurde auf 60°C erwärmt und 20 Minuten dabei gehalten, um Verunreinigungen auszufällen und den Extrakt zu pasteurisieren. Nach der Entfernung der unlöslichen Bestandteile über ein vorbeschichtetes Filter wurde ein 10-ml-Anteil des Extraktes (262 IGIU) auf den pH-Wert 7,2 eingestellt und dazu wurde BTC-835 bis zu einer Endkonzentration von 1500 ppm gegeben. Der sich dabei unmittelbar bildende schwere weiße Niederschlag wurde abzentrifugiert und ein aliquoter Teil der überstehenden Flüssigkeit wurde auf Isomeraseaktivität untersucht. Praktisch die gesamte Ausgangsaktivität (259 IGIU) befand sich in der löslichen Fraktion.

(B) Ein Teil des ursprünglichen Extraktes von Teil (A) wurde mit 1500 ppm BTC-835 behandelt und das dabei gebildete unlösliche Material wurde abfiltriert und verworfen. 25 ml (555 IGIU jeweils) des behandelten Extraktes wurden dann für die Zugabe von unterschiedlichen Mengen an BTC-835 verwendet, um festzustellen, welche Konzentration zur Ausfällung der Isosmerase erforderlich ist. Nach Zugabe von BTC wurden die Niederschläge abzentrifugiert und aliquote Teile der löslichen Phase wurden auf Isomeraseaktivität untersucht und die Ergebnisse werden in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Die Zugabe von BTC ergab, nach einer Vorbehandlung mit 1500 ppm zur Entfernung der nicht-enzymatischen Verunreinigungen, nahezu den gesamten Verlust der Aktivität an löslicher Isomerase bei Konzentrationen von 2000 ppm BTC oder höher. Die Zugabe von 1000 ppm ergab einen Niederschlag von etwa der Hälfte der löslichen Aktivität.

Der Niederschlag aus jedem der obigen Versuche wurde in 10 ml einer 0,5N NaCl-Lösung suspendiert. Die Niederschläge lösten sich schnell wieder auf. Die die aufgelösten Niederschläge enthaltenden Lösungen wurden zusammengegeben und mit einer XM-50-Membran ultrafiltriert. Nach der Diafiltration mit 0,5 N NaCl und mit Wasser wurde das Retentat auf Isomeraseaktivität und Proteinkonzentration analysiert. Die gesamte gewonnene Aktivität betrug 1103 IGIU. Die spezifische Aktivität betrug 4,16 IGIU/mg, bezogen auf Protein, das durch UV-Absorption gemessen wurde.

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt die Behandlung von Glucoseisomerase- Extrakt mit unterschiedlichen quaternären Ammoniumverbindungen.

Gleiche Anteile des in Beispiel 3 beschriebenen Isomeraseextraktes wurden auf den pH-Wert 7 eingestellt und verschiedene quaternäre Ammoniumverbindungen wurden bis zu einer Endkonzentration von 2000 ppm zugegeben. Die Bildung eines Niederschlags wurde als Beweis für eine Umsetzung zwischen dem Enzym und der quaternären Ammoniumverbindung angesehen.

Es wurden die folgenden quaternären Verbindungen geprüft:

(1)
BTC-835
	Alkyl(C₁₂, C₁₄, C₁₆)dimethylbenzylammoniumchlorid,
(2)	ARQUAD 18-50
	Octadecyltrimethylammoniumchlorid,
(3)	CERTRIMIDE (CTAB)
	Cetyltrimethylammoniumbromid,
(4)	BTC-2125M (DUAL QUAT)
	Alkyl(C₁₄, C₁₆, C₁₂, C₁₈)dimethylbenzylammoniumchlorid,
	Alkyl(C₁₂, C₁₄)dimethylethylbenzylammoniumchlorid,
(5)	HYAMINE 1622
	Diisobutylphenoxyethoxyethyldimethylbenzylammoniumchlorid,
(6)	HYAMINE 2389
	(Methyldodecylbenzyl)trimethylammoniumchlorid,
	Methyldodecylxylenbis(tetramethyl)ammoniumchlorid,
(7)	MAQUAT DLC 1214
	Alkyl(C₁₂, C₁₄, C₁₆, C₁₈)dimethyl(dichlorobenzyl)ammoniumchlorid,
(8)	BTC-812
	Octyldodecyldimethylammoniumchlorid,
(9)	Hexadecyltrimethylammoniumchlorid.

Die Verbindungen (1), (4), (5) und (7) bildeten große Mengen eines weißen Niederschlags. Eine geringere Ausfällung erfolgte mit den Verbindungen (8), (3) und (2), während mit den Verbindungen (9) und (6) kein Niederschlag gebildet wurde. Die Suspensionen wurden zum Abtrennen der Niederschläge zentrifugiert und aliquote Teile der klaren, überstehenden Lösungen wurden auf Isomeraseaktivität untersucht. Die Ausfällungen wurden in 0,5 N NaCl resuspendiert, um den Enzym-quaternären Ammonium-Verbindungskomplex zu dissoziieren und das Enzym wieder in Lösung zu bringen. Aliquote Teile des resolubilisierten Niederschlags wurden auf Isomeraseaktivität untersucht, nachdem man eine Verdünnung mit 0,5 N NaCl und -0,2 M Co⁺⁺ vorgenommen hatte.

Die Ergebnisse werden in Tabelle III gezeigt.

Tabelle III

Die vier Verbindungen, die den am stärksten sichtbaren Niederschlag in der größten Menge ergaben, waren Verbindungen (1), (4), (5) und (7), die alle den N-Benzylsubstituenten enthielten.

BTC-812 (8), welches zwei langkettige Alkylgruppen enthielt, ergab einen Niederschlag, der sich physikalisch von dem Niederschlag unterschied, den man mit BTC-835 und den anderen Ausfällungsmitteln erhielt. Die Gewinnung der Aktivität war in diesem Fall ausgezeichnet. Die Verbindungen (6) und (9) ergaben offensichtlich keine Ausfällung und nur eine sehr geringe Enzyminaktivierung. Die Verbindungen (3), (4) und (7) ergaben einen merklichen Verlust an Aktivität.

Beispiel 6

In diesem Beispiel wird gezeigt, daß der unlösliche Komplex aus einem Enzym und einer quaternären Ammoniumverbindung enzymatisch aktiv ist.

Eine Probe des Isomeraseectraktes von Beispiel 4 wurde auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und dann mit 1500 ppm BTC-835 behandelt. Dazu wurde eine Filterhilfe gegeben und das unlösliche Material wurde abfiltriert. Der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und vermischt. Eine Probe wurde auf die Aktivität des immobilisierten Enzyms mittels des FAU-Verfahrens analysiert.

Das Ergebnis zeigte eine Aktivität, die 29% der Ausgangsaktivität der Lösung entsprach.

Beispiel 7

In diesem Beispiel wird ein alternatives Verfahren verwendet, bei dem man ein stark saures kationisches Austauschharz zur Entfernung von BTC aus den wiederaufgelösten Isomerase-BTC-Ausfällungen verwendet.

Ein teilgereinigtes Isomerasekonzentrat wurde hergestellt, indem man einen rohen Enzymextrakt ultrafiltrierte. Das Ultrafilterretentat wurde mit 5 Volumina entionisiertem Wasser zur Entfernung von niedrigmolekulargewichtigen löslichen Stoffen diafiltriert. Das fertige Konzentrat hatte eine Stärke von 2175 IGIU/ml und eine Proteinkonzentration von 66,9 mg/ml (spezifische Aktivität 32,5 IGIU/mg).

Ein 10-ml-Anteil dieses Konzentrats wurde mit Wasser auf 300 ml verdünnt und der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden 300 mg BTC-835 gegeben und die Suspension wurde 30 Minuten gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und mit 25 ml 0,5 M NaCl wieder aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde 1 g (auf Trockenbasis) feuchtes Kationenaustauschharz (Natriumform) gegegeben. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt und die Suspension wurde schwach während 30 Minuten gerührt. Dann ließ man das Harz sich absetzen und ein aliquoter Teil der überstehenden Flüssigkeit wurde für eine UV-Analyse auf lösliches Protein (Absorption bei 280 nm) und für BTC (Absorption bei 262 nm) entnommen. Die UV-Analysen zeigten die gesamte Entfernung an löslichem BTC. Ein weiterer aliquoter Teil der überstehenden Flüssigkeit wurde genommen und 10fach mit Wasser verdünnt. Die Abwesenheit eines Niederschlags bei dieser verminderten Salzkonzentration zeigte, daß das BTC mittels des Harzes entfernt worden war. Der Rest der überstehenden Flüssigkeit wurde vom Harz durch Filtrieren abgetrennt und das Filtrat wurde mit einer Amicon 201 gerührten Zelle unter Verwendung einer YM-30- Membran zur Entfernung von restlichem NaCl ultrafiltriert. Das restliche Ultrafilterretentat wurde auf Isomeraseaktivität und Proteinkonzentration untersucht. Die Ausbeute an Isomeraseaktivität betrug 19 4000 IGIU oder mehr als 90% der Ausgangsaktivität, korrigiert um die bei der Probenahme entstandenen Verluste. Die spezifische Aktivität betrug 40,12 IGIU/mg Protein.

Beispiel 8

In diesem Beispiel wird die Verwendung von verschiedenen quaternären und tertiären Aminen beim erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt. Die Verfahrensweise war im wesentlichen die gleiche wie in Beispiel 5. Eine erfolgreiche Enzymausfällung und Gewinnung von wenigstens 80% der ausgefällten Aktivität wurde mit den folgenden Verbindungen erzielt:

MAQUAT MC 1412
Alkyl (C₁₄, C₁₂, C₁₆)dimethylbenzylammoniumchlorid,
BTC-1010
Didecyldimethylammoniumchlorid,
BTC-1100
Alkyl(C₁₂, C₁₄)dimethyl-1-naphthylmethylammoniumchlorid,
Stearyldimethylbenzylammoniumchlorid,
HYAMINE 3500
Alkyl(C₁₄, C₁₂, C₁₆)dimethylbenzylammoniumchlorid,

Bei Verwendung der nachfolgenden Verbindungen fand entweder keine Enzymausfällung statt oder es trat eine Inaktivierung ein:

VARIQUAT B-200
Benzyltrimethylammoniumchlorid,
ARQUAD 12-50
Dodecyltrimethylammoniumchlorid,
Dimethyldodecylamin,
Dimethylbenzylamin,
Triisooctylamin.

Claims

1. Verfahren zum Abtrennen von Glucoseisomerase von wäßrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Lösung mit einem Aminkomplex der allgemeinen Formel worin bedeuten:
R₁ ein Kohlenwasserstoffrest mit wenigstens 6 Kohlenstoffatomen,
R₂ einen Kohlenwasserstoffrest mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen,
R₃ Niedrigalkyl,
R₄H oder Niedrigalkyl und
X ein Anion,
wobei die Menge der Aminverbindung wenigstens 100 ppm, bezogen auf die wäßrige Lösung, und der pH der Lösung 5,5 bis 8,5 beträgt,
in Berührung bringt und den dabei erhaltenen enzymhaltigen Niederschlag gewinnt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH auf 6 bis 8 einstellt.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminverbindung einsetzt, in der R₁ ein Alkyl mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, R₂ ein Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, R₃ und R₄ jeweils Niedrigalkylgruppen und X ein Halogenanion bedeuten.

Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminverbindung der Formel einsetzt, worin R₂ C_nH_2n+1 bedeutet, worin n eine ganze Zahl entsprechend 12, 14 oder 16 bedeutet und X ein Anion bedeutet.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminverbindung einsetzt, in der R₂ eine Mischung von Resten der Formel C_nH_2n+1 ist, worin n 12, 14 oder 16 bedeutet.

6. Verfahren gemäß Ansprüchen 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der wäßrigen Lösung auf 7,0 bis 7,4 einstellt.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens 1000 ppm, bezogen auf die wäßrige Lösung, an Aminverbindung zusetzt.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminverbindung ein Alkyl(C₁₂,C₁₄,C₁₆)dimethylbenzylammoniumchlorid zusetzt.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminverbindung Octyldodecyldimethylammoniumchlorid, Stearyldimethylammoniumchlorid oder Didecyldimethylammoniumchlorid zusetzt.