DE1695850A1 - Verfahren zum Isolieren und Reinigen von loeslicher Ribonucleinsaeure - Google Patents
Verfahren zum Isolieren und Reinigen von loeslicher RibonucleinsaeureInfo
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Description
Schwarz BioReseareh, Ine», Mountain View Avenue,
Qrangeburp;, New York (V.St,A.)
Ribonucleinsäure
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Isolieren
von RibonuOleinsäure und betrifft' insbesondere eine Methode
zur Isolierung und Reinigung von löslicher Ribonucleinsäure
(nachfolgend häufig als "sRNA" bezeichnet).
In den vergangenen Jahren hat man immer starker die
Punktion von sRNA bei der Protein-Synthese untersucht,
und dadurch ist eine erhöhte Nachfrage nach sRKA hoher
Reinheit aufgetreten.
Lösliche Ribanucleinsäure hat man aus Mikroorganismen,
insbesondere Hefezellen und Escherichia coil (nachfolgend
häufig als "E.coil" bezeichnet) isoliert* und dabei konnten
beachtliche Mengen an sRNA aus großen Mengen Hefe gewonnen
werden, wie dies besehrieben ist von Holly (Bioohem.
- 1 - ■
108820/221*
Biophys. Res. Comm. 10, 186 (I96j5)).
Bei der Gewinnung der sRNA von E. coil ergeben sich jedoch
verschiedene Probleme, und zwar:
(a) Man muß mit hoher Geschwindigkeit zentrifugieren, wenn man die wäßrige Phase von dem festen Zellenmaterial und
der phenolischen Phase trennen will, während im Vergleich dazu bei der Gewinnung von sRNA aus Hefezellen
die wäßrige Phase abgehebert werden kann, wenn man das anfangs anfallende Gemisch einige Tage stehengelassen
hat. " . .
(b) Durch die Verwendung von Phenol zur Zerstörung der
Zellen von E.coil werden in der wäßrigen Phase hochmolekulare
RNA, Desoxyribonueleinsäure und beträchtliche Mengen von ultraviolettes Licht nicht absorbierenden
Materialien, wie beispielsweise Proteine und Polysaccharide zusätzlich zu den gewünschten löslichen
Nucleinsäuren gelöst. Im Gegensatz dazu wirkt das Phenol auf Hefezellen wie ein "Sieb"»für die niedriges
Molekulargewicht aufweisenden Teilchen, einsehliesslich sRNA, und es geht nur eine geringe Menge an hochmolekularen
Nucleinsäuren in Lösung.
(c) Für die Isolierung von sRNA hoher Reinheit aus roher
sRNA benötigt man im allgemeinen zusätzlich zu der Anwendung von Alkohol viele Verfahrensschritte, wie
Ausfällung, Fraktionierung von Ribonucleinsäuren, Dialyse und Säulenchromatographie.
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Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
zum Isolieren von sRNA aus Mikroorganismen zu schaffen,
bei dem die sRNA mit hoher Reinheit und hoher biologischer
Aktivität durch vergleichsweise einfache Verfahrensführung
mit hohen Ausbeuten gewonnen werden kann.
Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren in der Weise gelöst, daß man die sRNA enthaltenden Zellen
eines Mikroorganismus zerstört, daraus rohe sBNA erhält,
und diese rohe sBNA mit einem löslichen Chlorid und einem relativ stark polaren Lösungsmittel reinigt.
Man arbeitet beim erfindungsgemäßen Verfahren in der Weise, daß man Phenol und Wasser zu einem sRNA enthaltenden Mikroorganismus
in einer so ausreichenden Menge zugibt, daß die Zellen des Mikroorganismus wirksam zerstört werden, und
dann trennt man die organische Phase von der die rohe sBNA enthaltenden wäßrigen Phase ab. Wenn man E.coli mit
Phenol und Wasser behandelt, so kann man eine klare wäßrige, rohe sBNA enthaltende Phase auch ohne Zentrifugieren erhalten,
wenn man wenigstens etwa 405 Milliliter Phenol und
wenigstens etwa 935 Milliliter Wasser je 100 g des Ausgangsmaterials
zugibt. Das Phenol und das Wasser werden im allgemeinen in den genauen zuvor angegebenen Mengen
eingesetzt, da bei größeren Volumina die sRliA unnötig verdünnt
wird und größere Volumina an Alkohol erförderlich werden, wenn in der nachfolgenden Gewinnungsstufe rohe
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sBNA'ausgefällt wird. Verwendet man geringere Volumina,
so wird hochtouriges Zentrifugieren zur Abtrennung der
Schichten erforderlich.
Man fällt die rohe sENA aus der wäßrigen Phase beispielsweise
dadurch aus, daß man einen Alkohol, wiebeispielsweise Äthanol zugibt, und die gewonnene sRNA wird einem
üblichen Bebrütungsverfahren unterworfen. Durch das Bebrüten werden an die sRNA gebundene Aminosäuren "abgestreift"
. Das Bebrüten wird gewöhnlich in der Weise durchgeführt, daß man eine Grundlösung von sRNA eine Stunde lang
einer Temperatur von etwa 370C unterwirft.
Man kann für das erfindungsgemäße Verfahren irgendeine
beliebige einer Vielzahl von Substanzen einsetzen, die eine sRNA-Fraktion enthalten, und representative Beispiele
dafür sind: Escherichia coli -(E. coli ), wie beispielsweise
die Stämme B,W, Ki2,K12-W 6; nicht-pathogene Bakterien,
wie beispielsweise Lactobacilli,. Bacilli, Micrococcus
lysodeikticus; Hefe; Schimmel ("molds"), wie Neurospora
crassa; Samen; keimende Samen; Teile von keimendem Samen,
wie Stengel, Blätter, Wurzeln; Gewebe von Säugetieren, wie beispielsweise Hattenleber; und dergleichen. Die Ausgangsmaterialien,
mit denen man die besten Ergebnisse erreicht,
sind die verschiedenen Stämme von E.coli» jedoch
ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf die Verwendimg dieser Materialien beschränkt.
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Hohe sRNA kann erfindungsgemäß dadurch gereinigt werden, """
daß man zum Ausfällen von Verunreinigungen ein hochpolares Lösungsmittel und ein wasserlösliches Chlorid zu einer
wäßrigen Lösung von sRNA zugibt. Der Niederschlag wird von
der die gereinigte sRNA enthaltenden klaren Phase abgetrennt, und die sRNA wird danach ausgefällt, beispielsweise durch Zugabe eines Alkohols, wie Äthanol. Die dabei
gewonnene sRNA kann erneut nach dem zuvor beschriebenen Verfahren gereinigt werden, wobei man ein Produkt mit höherer
Reinheit und verbesserter biologischer Aktivität erhält.
Als hochpolares Lösungsmittel kann man beispielsweise Dimethylformamid,
Dimethylsulfoxyd oder Dimethylacetamid einsetzen, wobei Dimethylsulfoxyd bevorzugt ist, und als
lösliches Chlorid kann man beispielsweise Kalium-, Natrium-, Ammonium- oder Magnesiumchlorid verwenden, wobei Natriumchlorid
bevorzugt eingesetzt wird. Die Zugabe erfolgt zweckmäßig bei einer Temperatur zwischen etwa 15 und 350C,
da bei niedrigeren Temperaturen sRNA mitausgefällt werden kann, und bei höheren Temperaturen sRNA möglicherweise
Zerstörung erleidet. Das Gesamtgemisch sollte, damit man eine klare Lösung von sRNA erhält, vorteilhaft zwischen
etwa 33 und 45 Volum-$ des hochpolaren Lösungsmittels enthalten.
Die Konzentration an Chloridionen hält man im allgemeinen
bei wenigstens 0,27 m, und wenn Natriumchlorid
als lösliches Chlorid eingesetzt wird, sollte die endgültige Mischung im allgemeinen etwa 9 Volum-$ 3 m Natriumchlorid
enthalten.
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Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren in einer
bevorzugten Ausführungsform, der Herstellung- gereinigter
sRNA aus E.coil, beschrieben; das erfindungsgemäße Verfahren
ist jedoch nicht auf diese bevorzugte Ausführungsform beschränkt.
Die Erzeugung von sRNA läßt sich durch Ultraviolettmessungen an wäßrigen Lösungen bei 260 hui verfolgen, und
die Messwerte sind angegeben in Einheiten der optischen Dichte A260(OD).
4-5Λ kg an gefrorenem E.coil wurden mit 86 Litern 88 $igem
Phenol (der Qualität U.S.P. oder einer besseren Qualität)
vermischt, und die Mischung wurde (etwa 1,0 bis 1,5 Stunden lang) stark gerührt, so daß sich daraus ein gleichförmiger,
gut dispergierter Slurry bildete» Dem Slurry wurden 200 Liter entionisiertes Wasser zugemischt, und
die Mischung wurde etwa 1 Stunde gerührt und dann über Nacht stehengelassen. Am folgenden Tag wurden weitere
96 Liter Phenol zugegeben, das Gemisch wurde 0,5 Stunden
gerührt, es wurden weitere 220 Liter entionisiertes Wasser zugesetzt, und etwa 1 Stunde weitergerührt. Alsdann ließ
man das Gemisch wiederum über Nacht stehen.
Am folgenden Tag wurde die obere wäßrige Schicht (etwa
400 Liter), die sRNA enthielt, von de® Gemisch abgehebert
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und durch Zugabe von 20 #igem Kaliumacetat auf pH 5,2
abgepuffert, im allgemeinen mit einer Menge von etwa
1 Volum-^ der wäßrigen Lösung. Dann wurde die sRNA mit
2 Volumen absolutem Alkohol, (3 A) ,ausgefällt, und die
ausgefällten Feststoffe ließ man über Nacht absitzen.
Am nächsten Tag wurde die klare alkoholische Lösung von
der alkoholischen Suspension abgegossen, und die rohe sRNA wurde durch Filtration gewonnen. Danach wurde die
sRNA mit kaltem 75 $igem Äthanol und kaltem Isopropanol
gewaschen, wobei die Isopropanolwäsche durchgeführt wurde,
um ein Dunkelwerden des Produktes beim Trocknen zu verhindern* Dann wurde das Produkt durch Trocknen im Vakuum
bei 25 bis 3O°C von Alkohol befreit, und es resultierte
eine Ausbeute von 500 bis 800 g je 45,4 kg E.coil. Der
A2g0-Gehait sollte in einem Bereich von 6 bis 9 x 10
liegen.
Die getrockneten Feststoffe wurden in eine Glasflasche von 40 Liter Inhalt eingebracht* und es wurde dazu eine 0,05 η
Kaliumacetat-Lösung gegeben. Die Suspension wurde bei etwa
15 bis 200C gehalten, und es wurde weitere Kaliumacetat-Lösung
zugegeben, bis eine Uitraviolett-Ablesung zwischen 550 und J6O χ l(P AggQ/Liter erhalten wurde. Alsdann wurde
der pH-Werfc mit 5 η Ämmoniumhydroxyd auf 8,8 bis 8,9
(pH-Meter Ablesung} eingestellt, und, sofern erforderlich, wurde sofort Essigsäure zugegeben, um überschüssiges
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Ammoniumhydroxyd zu neutralisieren. Die resultierende
Lösung wurde unter einstündigem Rühren bei 35 bis 37°C
bebrütet, auf 15 bis 200C abgekühlt und dann durch Zugabe
von Eisessig auf einen pH-Wert von etwa 7*0 bis 7*2 eingestellt.
Die neutralisierte Lösung wurde bei einer Temperatur von etwa 10 bis 15°C gehalten, und' es wurden unter
Rühren dazu etwa 0,70 Volumen an Dimethylsulfoxyd gegeben. Die Temperatur der Lösung wurde auf 30 bis 32°C eingestellt,
und dann wurden unter Rühren 0,25 Volumen (berechnet auf die Menge an wäßriger sRNA-Lösung) an
3 m Natriumchlorid (175*5 g Natriumchlorid, in Reagenz-Qualität,
je Liter) zugefügt. Das Gemisch wurde eine halbe Stunde lang bei etwa 30 bis 32°C gehalten. Dann wurde die
Lösung unter Verwendung eines Trichters mit einem Durchmesser von 57*2 cm auf einem 950 Papier filtriert, und der
Niederschlag wurde mit einer kalten Mischung aus Wasser, Dimethylsulfoxyd und 3 m Natriumchlorid (1:1:0,25) gewaschen.
Die sRNA in dem Piltrat und dem Waschwasser wurde durch Zugabe von 0,5 Volumen Äthylalkohol ausgefällt, und
das ausgefällte Produkt wurde mit kaltem 75 #igem Äthylalkohol und Isopropylalkohol gewaschen. Das ausgefällte
Produkt wurde im Vakuum bei 25 bis 300C getrocknet, bis
jeglicher Alkohol entfernt war, und dann wurde an dem gewonnenen
Peststoff eine AggQMessung vorgenommen. Der Wert
lae im Berelch von 1^ bis 1^.
Die wie zuvor beschrieben gewonnene sRNA wurde in Wasser zu
640 χ M? A2g0 /Liter gelöst, es wurde ein gleicher
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Volumenanteil an Dimethylsulfoxyd unter Rühren bei 10 bis' 150C zugegeben, und die Temperatur wurde unterhalb 30
bis j52°C gehalten. Dann wurden 0,20 Volumanteile an 3 m
Natriumchloridlösung zugefügt, das Gemisch wurde auf 20 bis 230C gekühlt, abfiltriert, und die Feststoffe wurden mit
einer kalten Mischung aus Wasser, Dimethylsulfoxyd und 3 m Natriumchlorid gewaschen. Das sRNA enthaltende Piltrat
und die Waschwässer wurden mit 0,33 Volumanteilen an Äthylalkohol zusammengebracht, so daß sRNA ausfiel, und
die Ausfällung wurde filtriert und mit kaltem 75 #igem
Äthylalkohol und Isopropanol gewaschen. Die sRNA wurde dann bei 25 bis 3O0C im Vakuum getrocknet, und man erhielt
eine Ausbeute von mehr als 100 g. Der AggQ/mg Wert sollte
im Anschluß an zusätzliches Trocknen im Vakuum über PgOp. mehr als 21 betragen.
Es versteht sich, daß man bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von sRNA alle diejenigen Vorsichtsmaßnahmen berücksichtigt, die bekannt
sind, um das Endprodukt vor Verunreinigung zu bewahren. So sollte beispielsweise keines der Präparate berührt
werden, und es sollen möglichst nur mit Säure ausgewaschene Glasgefäße verwendet werden.
Obgleich die Reinigung von roher sRNA speziell mit Bezug auf die Reinigung von roher sRNA beschrieben worden ist»
die durch Zerstörung von sRNA-Fraktionen enthaltender
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Mikroorganismen gewonnen wurde, versteht es sich, daß man
das erfindungsgemäße Verfahren ebensogut auf die Reinigung von auf andere Weise gewonnener roher sRNA anwenden kann.
297 S an gefrorenem E.coil B (22,6 % trockener Feststoffe)
wurden durch Mischen mit 282 Millilitern 88 tigern Phenol
aufgetaut. Dann wurden 660 Milliliter Wasser zugegeben, und anschliessend wurde weiteres Phenol und Wasser zugefügt,
um den Phenolgehalt auf 1200 Milliliter und den Wassergehalt
auf 2800 Milliliter aufzufüllen. Nach einer kurzen Zeit konnte man ein Absetzen bemerken, und nach 24 Stunden konnte
eine aus 24-50 Millilitern bestehende wäßrige Schicht
abgehoben werden. Die Lösung wurde mit lj50 Millilitern 88 $igem Phenol extrahiert, und die gewonnene wäßrige
Lösung, 2340 Milliliter, wurde mit 25 Millilitern 20 #igem
Kaliumacetat (pH 5*2) und 2 Volumen absolutem Alkohol behandelt.
Die gewonnene rohe sRNA hatte ein Gewicht von 7,085 g und enthielt 68,1 χ ΙΟ5 A360 Einheiten.
Die rohe sRNA wurde in 200 Millilitern 0,05 m Kaliumacetat gelöst, und die Lösung wurde mit 5 m Ammoniumhydroxyd
auf einen pH-Wert von 8,8 eingestellt. Die die suspendierten Feststoffe enthaltende Lösung wurde 1 Stunde lang
bei 37°C bebrütet, und dann wurde die Suspension durch Zugabe
von Essigsäure bei einer Temperatur von 200C auf einen
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pH-Wert von 7,0 gebracht. Die rohe sRNA (70,5 xKr A
270 Milliliter) wurde mit 2 Volumen absolutem Alkohol ausgefällt und gewonnen.
Das getrocknete rohe Produkt, 6,3 Z» wurde in 100 Millilitern
Wasser gelöst, und dann wurden dazu 100 Milliliter an 3 m Natriumchlorid zugegeben. Es wurde solange
Dimethylsulfoxyd zugefügt, bis an einer Probemenge beim Zentrifugieren eine klare überstehende Flüssigkeit auftrat.
Dazu war die Zugabe von 100 Millilitern Dimethylsulfoxyd
erforderlieh. Nach dem Abschrecken wurde das ausgefällte Produkt abzentrifugiert und mit einem Gemisch aus Wasser,
3 m Natriumchlorid und Dimethylsulf oxyd (1:1:1) gewaschen. Die klare Lösung enthielt 23,1 χ 10^26O Einheiten. Durch
die Zugabe von 2 Volumen Alkohol wurde die sBNA ausgefällt,
und die abgeschiedenen Feststoffe wurden gewaschen und getrocknet.
Der in Dimethylsulf oxyd unlösliche Rückstand hatte ein Gewicht von 4,4-6 g, während die sHNÄ-Fraktion
ein Gewicht von 1,373 g aufwies.
Ein Teil der sRNA-Fraktion wurde in Wasser gelöst (so daß
1,0 g 16,3 x 105 A260/25 Milliliter Wasser enthielt), und
es wurde eine gleiche Volumenmenge an Dimethylsulfoxyd und
0,20 Volumenanteile an 3 n* Natriumchlorid zugegeben« Der
Niederschlag wurde bei 200C abzentrifugiert und mit einem
kalten Gemisch aus Wasser, Dimethylsulf oxyd und 3 m Natriumchlorid
(1:1:0,2) gewaschen. Nach der Zugabe von
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10 Millilitern absolutem Alkohol zu'der gewonnenen Lösung
(16,3 x 105-A260/69 Millilitern) fiel die sRNA aus. Die
sRNÄ wurde mit sowohl 75 $igem Äthylalkohol als auch Isopropanol
gewaschen, und das getrocknete Produkt hatte ein
Gewicht von-0,653 g (13,5 χ 1(P A2^0). Die Ausbeute betrug,
berechnet auf 1,373 S sRNÄ, 0,900 g.
Die Ausbeute entspricht 3*02 g sRNA je kg E..coil, mit
22,6 % trockenem Feststoff, oder 4,00 g sRNA je kg E.coli,
mit 30 % trockener Peststoffe.
450 g E.coli B (30 % trockener Feststoffe) wurden mit
1800 Milliliter 88 #igem Phenol, und 4200 Millilitern
Wasser vermischt, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Am nächsten Tag wurden 4 Liter
der wäßrigen Phase abgehoben, und es wurden 40 Milliliter an 20 tigern Kaliumacetat (pH 5,2) und 8 Liter Äthylalkohol
zugegeben.
Das getrocknete Rohprodukt (4,91 g; 72,5 χ ICr A2^0)
wurde in 200 Millilitern 0,05 m Kaliumacetat gelöst, und ■
die Suspension wurde mit 5 m Ammoniumhydroxyd auf einen
pH-Wert von 8,8 gebracht. Nach einer Stunde bei 37°C wurde
der pH-Wert mit Essigsäure auf 7,2 eingestellt.
Zu I90 Millilitern der wie zuvor erhaltenen sRNA-Lösung
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wurden 133 ml Dimethylsulfoxyd (0/70 Volumenanteile) und
47,5 ml 3 in Natriumchlorid ('0,25 Volumenanteile) unter Abschrecken
zugegeben. Nach 30 Minuten wurden die "unlöslichen
Bestandteile abzentrifugiertj und es wurde mit einem Gemisch
aus Wasser j Diraethylsulfoxyd und 3 m Natriumchlorid
(1:1:0,25) gewaschen. Der getrocknete Rückstand hatte ein
Gewicht von 2,945 g (47,4 x 10"^ Αο6θ^* Die gewonnene
Mutterlauge enthielt zusammen mit den beiden Waschwässern 27,4 χ ICK A2go/52O ml. Durch Zugabe von 0,5 Volumenanteileh
an absolutem Alkohol (3 A) unter Abschrecken wurde die sRNA ausgefällt. Die Feststoffe wurden abzentrifugiert
und mit 75 $igem Äthylalkohol und Isopropanol gewaschen.
Es wurden 1,477 g an sRNA (24,5 x 10^ A2^0) gewonnen.
1,3 g der sRNA wurden in 33 Millilitern Wasser und 33 Millilitern
Dimethylsulfoxyd gelöst, und es wurden unter Abschrecken 6,6 Milliliter an 3 m Natriumchlorid zugegeben.
Die Ausfällung wurde abzentrifugiert und mit einem kalten Gemisch aus Wasser, Dimethylsulfoxyd und 3 m Natriumchlorid
(1:1:0,2) gewaschen. Durch Zugabe von 24 Millilitern absolutem
Alkohol wurde die sRNA aus der Lösung ausgefällt. Die gewonnene sRNA wurde mit 75 $igem Äthylalkohol und
mit Isopropanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, und man erhielt 0,966 g sRNA (19,7 x 105 A
Die Ausbeute entsprach 2,42 g sRNA je kg E.coli, mit
30 % trockenem Feststoff.
. lt _ 109820/2216
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden 3*46 g roher
sRNA (28,4 χ ICr A2gQ) aus 227 g E.coli W gewonnen.
Nach der Bebrütung zum "Abtrennen" von gebundenen Aminosäuren wurde die Lösung der.rohen sRNA in 75 Millilitern
mit 59,5 Millilitern Dimethylsulfoxyd und 21,2 Millilitern j5 m Natriumchlorid vermischt, während eine Temperatur
von etwa 52 C aufrechterhalten wurde. Die unlöslichen
Bestandteile wurden abzentrifugiert und mit einem Gemisch aus Wasser, Dimethylsulfoxyd und 3 m Natriumchlorid gewaschen.
Die anfallende Mutterlauge wurde zusammen mit den Waschwässern mit 0,5 Volumenanteilen an absolutem Alkohol
gewaschen und dann zur Ausfällung der sRNA abgeschreckt. Es wurden 0,966 g an sRNA (15,7 x 10 A260^ gewonnen.
Die 0,966 g an sRNA wurden in 24 Millilitern Wasser gelöst,
und es wurden 24 Milliliter Dimethylsulfoxyd und 4,8 Milliliter 3 m Natriumchlorid unter Abschrecken zugegeben.
Die ausgefällten Bestandteile wurden bei 23 bis 250C abzentrifugiert
und mit einem kälten Gemisch aus Wasser, Dimethylsulfoxyd und 3 m Natriumchlorid gewaschen. Aus der
Lösung wurde mit 0,5 Volumenanteilen an absolutem Alkohol die sRNA ausgefällt. Die gewonnene sRNA wurde mit 75 #igem
Äthylalkohol und Isopropanol gewaschen und im Vakuum getrocknet,
und es wurden 0,672 g an sRNA (12,9 χ 10-5 A
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erhalten. Die Ausbeute entsprach 2,95 g an sRNA/kg
E.coli Μ, mit 30 % Feststoffen.
Aus 454 g an E.coli K-12 wurden nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren 11,5 g.an roher sRNA (127 x 1O5 A2^0) gewonnen.
Nach der Bebrütung zum "Abtrennen" von gebundenen Aminosäuren
wurde die Lösung der rohen sRNA in 36O Millilitern
mit 252 Millilitern Dimethylsulfoxyd und 90 Millilitern
3 m Natriumchlorid bei 29 bis 3I0C vermischt. Nach etwa
einer halben Stunde wurden die unlöslichen Bestandteile abzentrifugiert und mit einem kalten Gemisch aus Wasser,
Dimethylsulfoxyd und 3 m Natriumchlorid (Ii1:0,25) gewaschen.
Die anfallende Mutterlauge wurde zusammen mit den Waschwässern mit 0,5 Volumenanteilen an absolutem Alkohol
vermischt, wobei sRNA ausfiel. Die ausgefallenen Peststoffe wurden abzentrifugiert und mit 75 $igem Äthylalkohol und
Isopropanol gewaschen, und man erhielt 3,214 g an sRNA
(57,3 x ΙΟ5).
3,19 g der zuvor beschriebenen sRNA wurden in 90 Millilitern.Wasser
gelöst, und dazu wurden unter Abschrecken 90 Milliliter Dimethylsulfoxyd und 18 Milliliter an 3 m Natriumchlorid
zugegeben. Die Ausfällung wurde bei 200C abzentrifugiert
und mit einem kalten Gemisch aus Wasser,
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Dimethylsulfoxyd und J m Natriumchlorid (1:1:0,2)
gewaschen. Mit 0,33 Volumenanteilen an absolutem Alkohol
wurde die sRNÄ ausgefällt. Die gewonnene sRNA wurde mit
75 tigern Äthylalkohol und Isopropanol gewaschen und im
Vakuum getrocknet, und dabei wurden 1,94 g an sRNA gewonnen. Die Ausbeute entspricht 4,26 g an sRNA je kg
E.coli K-12y mit 30 % Feststoff, Der A0^nZnIg Wert betrug
Es wurden 5*42 g an roher sRNA aus 227 g E. coIi B nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren erhalten.
Im Anschluß an die Bebrütung zum "Abtrennen" von gebundenen
Aminosäuren wurde die Lösung von 5,42 g roher* sRNA in 200
Millilitern mit 200 Milliliter Dimethylformamid und 200 Milliliter an 3 m Natriumchlorid bei 25°C behandelt. Die
unlöslichen Bestandteile wurden abzentrifugiert und mit einem Gemisch aus Wasser, Dimethylformamid und 3 m Natriumchlorid
gewaschen. Die anfallende Mutterlauge, wurde1 zusammen
mit den Waschwässern mit 0,5 Volumenanteilen an absolutem Alkohol vermischt, und dabei wurde sRNA ausgefällt.
Die Feststoffe wurden abzentrifugiert und mit Äthylalkohol und Isopropanol gewaschen. Es wurden 0,915 g an sRNA gewonnen.
0,895 ε der wie zuvor beschrieben gewonnenen sRNA wurden in
10982 0/2216 -tfc --
25 Millilitern Wasser gelöst, und es wurden 25 Milliliter
Diraethylforinamid und 5 Milliliter an 3 m Natriumchlorid bei
etwa 23 bis 25°C zugegeben. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert
und mit einem kalten Gemisch aus Wasser, Dimethylformamid
und 3 m Natriumchlorid gewaschen. Durch Zugabe von 0,33 Volumenanteilen an absolutem Alkohol wurde
die sRNA aus der Lösung ausgefällt. Die gewonnene sRNA
wurde mit Äthylalkohol und Isopropanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, und es wurden 0,698 g an sRNA gewonnen.
Die Ausbeute entsprach 3,14 g sRNA/kg E.coli B, mit 30 %
trockenen Feststoffen. Der ApgQ/mg Wert betrug 21,2.
Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise läßt sich auch
unter Verwendung von Dimethylacetamid anstelle von Dimethylformamid durchführen.
Aus Backhefe wurden nach der von Holly (Biochem.Biophys.
Res. Comm. 10, 186 (1963)) beschriebenen Arbeitsweise 5 g an roher sRNA isoliert.
Die 5 g an roher sRNA wurden in 200 Millilitern Wasser aufgenommen und bildeten eine kolloidale Lösung, die etwas ungelöste Peststoffe enthielt. Die Lösung enthielt 40,2 χ 10*
A260 Einnelte>n (8 Aggo/mg). Zu der zuvor beschriebenen
Lösung wurden eine gleiche Volumenmenge an Dimethylsulfoxyd
und eine Viertelvolumenmenge an 3 m Natriumchlorid unter
109820/2216 -4t-
Abschrecken zugegeben. Die unlöslichen Bestandteile wurden abzentrifugiert, und in der Lösung verblieben
61 % der ursprünglichen A2^0 Anteile. Die sRNA wurde
dann durch Zugabe einer halben Volumenmenge an Äthanol aus der Lösung ausgefällt.
Es wurden 2,0 g an getrockneter sRNA (13*2 Agg^y/mg) gewonnen.
Die sRNA kann durch Wiederholung der zuvor beschriebenen Arbeitsweise und/oder durch DEAE-Cellulose-Chromatographie
noch weiter gereinigt werden.
Nachfolgend sind Werte für die Aminosäure-Akzeptor-Aktivität von sRNA, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
aus E.coil B hergestellt, angegeben. Die Aktivitätswerte
sind in Molen/A2g0 (OD) Einheit an sRNA, bestimmt in
einem Puffer von 0,02 m Mg ++ /0,1 m Tris-(hydroxymethyl) aminomethan (Tris), pH 7*5* angegeben.
| Aminosäuren | Aktivität |
| L-Alanin | 75 |
| L-Asparaginsäure | 62 |
| L-Glutaminsäure | 52 |
| L-Isoleucin | 75 |
| L-Leucin | 153 |
| L-Methionin | 87 |
| L-Phenylalanin | 81 |
| L-Prolin | 61 |
| L-Serin | 52 |
| L-Tyrosin | 50 |
| L-Valin | 109820^216 |
tt
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders wirksam für
die Isolierung und Reinigung von sRNÄ. Beispielsweise enthält
rohe sRNA, die aus E.coIi isoliert ist, hochmolekulare
Ribonueleinsäure, Besoxyribonücleinsäure und eine
beträchtliche Menge an ultraviolettes Lieht nicht-absorbierenden
Bestandteilen, wie Protein und Polysaccharide, und ohne das erfindungsgemäße Verfahren mußte die rohe
sRNA allen oder einigen der nachfolgenden Reinigungsverfahren unterworfen werden: Ausfällen und/oder enzymatische
Hydrolyse von Desoxyribonucleinsaure, Fraktionierung der Ribonucleinsäuren, Dialysen und Säulenehromatographie.
Abgesehen davon, daß das erfindungsgemäße Verfahren infolge der einfachen Art seiner Durchführung besonders
vorteilhaft ist, besteht ein weiterer Vorzug darin, daß
die damit gewonnene lösliehe RNA eine Reinheit und biologische Aktivität aufweist, die weit höher ist als
diejenige von derzeit erhältlicher, mit bekannten Verfahren herstellbarer löslicher RNA.
109820/2218
IS-
Claims (11)
1. Verfahren zum Reinigen von roher löslicher Ribonucleinsäuren
dadurch gekennzeichnet, daß man in einer ersten Verfahrensstufe (a) die rohe lösliche Ribonucleinsäure in
wäßriger Lösung mit einem löslichen Chlorid und einem stark:
polaren Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxyd, Dimethylformamid
oder Dimethylacetamid vermischt, wobei das polare Lösungsmittel in einer Menge von ~5J>
bis 4-5 Vol.-$, bezogen auf die
Mischung, eingesetzt wird, und in einer zweiten Verfahrensstufe (b) die in der ersten Verfahrensstufe (a) gebildete
klare Phase abtrennt und daraus die gereinigte lösliche Ribonucleinsäure abscheidet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der ersten' Verfahrensstufe (a) eine rohe lösliche
Ribonucleinsäure einsetzt, die man durch Zugabe von Phenol und Wasser zu einer eine lösliche Ribonücleinsäure-Fraktion
enthaltenden Substanz und Zerstörung von deren Zellen, Aufrahmen der dabei gebildeten Mischung in eine organische Phase
und eine die rohe lösliche Ribonucleinsäure enthaltende wäßrige
Phase und Abtrennung der wäßrigen Phase sowie Abscheiden der rohen löslichen Ribonucleinsäure daraus, gewonnen hat.
109820/2216
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn- · zeichnet, daß man das lösliche Chlorid in einer Konzentration
von wenigstens etwa 0,27 m einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis ~$>
dadurch gekennzeichnet, daß man als lösliches Chlorid Kalium-, Natrium-, Ammonium- oder Magnesiumchlorid, vorzugsweise Natriumchlorid,
einsetzt.
5. . Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man in der ersten Verfahrensstufe (a) die
Temperatur zwischen etwa 15 und etwa 35°C einstellt und hält.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5* dadurch gekennzeichnet,
daß man als stark polares Lösungsmittel Dimethylsulfoxyd einsetzt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5* dadurch gekennzeichnet,
daß man als stark polares Lösungsmittel Dimethylformamid einsetzt.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5s dadurch gekennzeichnet,
daß man als stark polares Lösungsmittel Dimethylacetamid einsetzt« -r-.
9. . Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß man die in der zweiten Verfahrensstufe (b) gewonnene
gereinigte lösliche Ribonuoleinsäure wiederholt den Verfahrensstufen
(a) und (b) unterwirft und eine lösliche Ribo-
109 820/2216 maleinsäure höherer Reinheit gewinnt! υαο*υ/
- ff -
10. Verfahren nach Anspruch 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man in der ersten Verfahrensstufe (a) eine
rohe lösliche Ribonucleinsäure einsetzt, die man aus einem der zahlreichen Stämme von E.coli gewonnen hat.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß man in der ersten Verfahrensstufe (a) eine rohe lösliche Ribonucleinsäure einsetzt, die man unter Zugabe von wenigstens
etwa 405 Millilitern Phenol und wenigstens etwa 935
Millilitern Wasser je 100 g der eine lösliche Ribonucleinsäure-Praktion
enthaltenden Substanz gewonnen hat.
109820/2218
as-
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