SU749847A1 - Способ получени носител дл иммобилизации биологически активных веществ - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к химическо и микробиологической промышленности и может быть использовано дл  получе ни  активированных носителей дл  иммобилизации биологически активных веществ, в частности ферментов. Полу ченные на их основе иммобилизованные биологически активные вещества могут быть применены как лекарственные препараты, биохимические реактивь и как новый тип промышленных катализаторов - биокатализаторы. Иммобилизаци  ферментов путем их присоединени  к нерастворимым носител м  вл етс  хорошо известным спо ,собом улучшени  технологических пока зателей этих биокатализаторов. Из большого числа материалов самыми распространенными носител ми  вл ютс  неорганические кремнесодер жащиё пористые вещества: преимущест венно пористое стекло, силохром, силикагель и керамические материалы Указанные носители часто покрывают полимерной пленкой, содержащей реак ционноспособные группы, с последующей активацией носител  бифункциональным реагентом, ковалентно св зывающйм иммобилизуемый фермент с носителем. Носители такого типа характеризуютс  хорошими гидродинамическими свойствами и стабильностью вследствие упрочени  структуры носител . Известен способ получени  носител  дл  иммобилизации биологически активных веществ путем обработки кремнеземного носител  раствором полимера (поликарбамида, полиметакрилата , найлона). Активацию покрытого полимерной пленкой носителей проводили кип чением с гидразингиДратом с последующим переводом в диизоцнанаты через амиды кислот ll. Однако полученные таким образом носители не обеспечивают стабильности, достаточной дл  применени  полученных на их основе илв билизованных ферментов в промышленн12Х процессах. Наиболее близким по технической сущности  вл етс  способ получени  носител  дл  иммобилизации белков путем обработки Пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом с последующей активацией носител  глутаровым диальдегидом , дииэоцианатом или п-бен зохиноном 2J. По данному способу неорганический пористый материал (с лохром, силикагель) обрабатывают см сью адипиновой кислоты и 1,6-гексаметилеидиамина в соотношении эквивалентов соответственно 1:1,5 и осу ществл ют поликонденсацию полимера при 180-200°С в атмосфере инертного газа. , Затем носитель промывают водой и ацетоном и сушат при . Получаю носитель с содержанием активных ами ногрупп в Количестве 50 мкв/г носител . .-- - --..;.--:-.-- - .: Недостатками указанного способа  вл етс  сравнительно невысока  реакцирнноспрсобность и недостаточна  высока  стабильность в процессе использовани  получаемого носител , обусловлейна  природой полимера. Целью изобретени   вл етс  улучшение качества носител , т.е. повышение реакционноспрсобности носител и стабильности в процессе использова:ни . Указанна  цель достигаетс  тем, что в качестве пленкообразующего ве щества примен ют Диизоцианат адипиновой кислоты, аобработку неоргани ческого материала осуществл ют после довательно диизоцианатом адипиновой кислоты при 105-115°С и 1,6-гексаметиландиамином/при температуре кипе ни  резекционной смеси при мол рном соотношении эквивалентов диизоцианат 1,б-гексаметилендиамин 1: (1,5-2) с высушиванием после каждой обработки при lOO-iao C в течение 1,5-2 ч. Согла9но„изобретению описываетс  способ получени  носител  дл  иммоби лизации биологически активных вещест в частности, ферментов, путем обработки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом, представл ющим собой 6-членное циклическое насыщенное соединение, и 1,6-гексаметилендиамином с последугачей.активацией носител  реагентом, выбранным из группы, включающей глутаровый диальдегид, диизоцианат адипийоэойили винной кислоты, с высокой реакционноспособностью и стабильностью в процессе использовани , заключающийс  в том, что неорганический материал обрабаты вают последовательно диизоцианатом .адициновой кислоты при 105-115 с и 1,б-гексаметилендиамином при температуре кипени  реакц;ионной смеси при мол рном соотношений эк вивалентов диизоцианат: 1,б-Гексйметйлёндиамин 1:(1,5-2), с высушиванием после каждой обработки при 100-120 С в течение 1,5-2 ч. Предпочтительно процесс провод т следующим образом. С целью увеличени  количества 1 ейкционнопособных гидроксильных групп 474 на поверхности неорганичес| их пористых материалов (кремнеземов) последние обрабатывают растворами NaOH и НС1 и высушивают до посто нного веса. Затем носитель обрабатывают раствором диизоцианата адипиновой кислоты в толуоле при нагревании до 11012 С в течение 1,5-2 ч с последующим высушиванием при 100-120 С и водным раствором 1,6-гексаметилендиамина при кип чении в течение 15 мин с последующим высушиванием при 120С. В результате обработки получают носитель- с содержанием активных аминогрупп в количестве 100 мк экв/г носител , который далее активируют глутаровым диальдегидом или диизоцианатом адиппиновой или винной кислоты . Полученный носитель пригоден дл  иммобилизации биологических активных веществ, например/ ферментов. Синтезированна  на поверхности неорганического пористого материала поликарбамидна  пленка по своей природе обладает улучшенными свойствами - повышенной стойкостью к дейстВИЮ воды и минеральных кислот, к действию различных атмосферных воздействий . При нагревании между молекулами поликарбамида образуютс  дополнительные поперечные св зи, что способствует образованию равномерной полимерной пленки, а также укреплению св зи полимера с поверхностью носител , Это обусловливает повышенную стабильность получаемого носител  в процессе его использовани . Пример 1. К5г силохрома или силикагел  добавл ют 10 мл 0,1 н раствора едкого натриЯ. Пропитанный щелочью силохром высушивают при . После этого материал промывают 10 мл 0,15 н сол ной кислоты и высушивают при . Обработанный таким путем носитель пропитывают 7 мл 0,25 н раствора диизоциа 1ата адипиновой кислоты в толуоле. Смесь выдерживают при в течение 1,5 ч. После этого материал высушивают при . Затем носитель кип т т в 0,4 н водном растворе 1, б-гексаметилендиаг-шна в течение 1 ч. Затем носитель фильтруют, промывают водой и ацетоном и высушивают при 12 . В результате такой обработки получают носитель, содержшдий на поверхности активные аминогруппы в количестве 100 мк экв на 1 г носител . Пример 2. 5 г обработанного растворами едкого натри  и сол ной кислоты (пример 1) носител  пропитывают 7 мл 0, 3 н раствора диизоцианата адипиновой кислоты в толуоле. Смесь выдерживают при 110°С в течение 45 мин. После этого материал высушивают при . Затем носитель кип т т в 0,6 н .водном растворе 1,6-гек саметиленлиамина в 15 мин. Затем носитель фильтруют, промывают водой и ацетоном и высушивают при 120°С. В результате такой обработки получают носитель, содержащий на поверхности активные аминогруппы в количестве ЮОмк, экв на 1 г носител . Носитель, полученный по примерам 1 и 2, используют дл  иммобилизации ферментов с помощью бифункциональны реагентов, таких как глутаровый диальдегид , диизоцианат адипиновой ил винной кислоты. Пример 3. Получение нераст римого ферментного препарата с использованием носител , модифицированного полйка рбамидом, активированием глутаровым диальдегидом. К 5 г модифицированного поликарбамидом носител  (пример 1) добавл  ют 15 мл 2 -ного водного раствора глутарового диальдегида. Смесь перемешивают и выдерживают при комнат ной температуре в течение 2 часов. После этого материал отмйваетс  Дис тиллированной водой от непрореагировавшего глутарового диальдегида на воронке Бюхнера до исчезновени  глутарового диальдегида в проглывной воде и к влажному носителю добавл ю 5 мл раствора хиМотрипсина с Концентрацией 50 мг/мл в боратном буфе ре рН 8,0. Смесь перемешивают, ва-. куумируют дл  удалени  йоздуха из пор и выдерживают при в течени . -4 ч. После инкубации препарат промывают в воронке Бюхнера боратным буфером рН 8,0, 1 М раствором хлори того натри  и затем еще боратным буфером, добавл   эти растворы порци ми . Объем промывных вод составл  ет 100 мл. Полученный иммобилизован ный препарат хран т во влажном виде в боратном буфере в холодильнике. Ферментативную активность препарата определ ют на синтетическом субстрате - этиловом эфире ацетилти розина (АТЭЭ) . Активность равн етс  1550 Е/г (сохран етс  50% от исходной активности) содержание белка 17,4 мг/г. Стабильность препарата оценивают по остаточной активности после проведени  промьгвки препарата 100 мл 2%-ным раствором казеина рН 8,0 в колонке с диаметром 6 гдм и высотой столба препарата 70 мм в те чение 24 ч. После промывки сохран етс  70% от исходной активности. Пример 4. Получение нераст воримого ферментного препарата с использованием носител , модифицированного поликарбамидом, активированием диизоцианатом адипиновой кис лоты. К 5 г модифицированного поликарбамидом носител  (пример 1) добавл ют 20 мл 0,25 н раствора дииэоцианата адипиновой кислоты в толуоле и смесь кип т т при в течение 1ч. После этого носитель фильтруют, промывают ацетоном и высушивают при . Вследствие такой обработки получают носитель с активными изоцианатными группами (80 мк,экв/г). Такой носитель смачивают 8 мл бо- . ратного буфера. Иммобилизацию фермента провод т Как описано в примере 2. При иммобилизации панкреатина получают препарат с активностью 1100 Е/г (на АТЭЭ) (сохран етс  42% от исходной активности) с содержанием белка 17,8 мг/г. Дл  определени  стабильности препарата провод т гидролиз 2% раствора казеина в реакторе перемешивани  при в течение 17 ч. После такого гидролиза остаточна  активность составл ет 44% от исходной. Пример 5. Получение нерастворийого ферментного препарата с исползованием носител , модифицированного поликарбамидом, активированием диизоцианатом адипиновой кислоты. 5 г модифицированного поликарбамидом носител  (пример 1) обрабатывают раствором диизоцианата адипиновбй кислоты, как в примере 3. Активированный носитель содержит 100,0 мк экв активных изоцианатных Групп на г) смачивают 8 мл боратного буфера. Иммобилизацию химотрипсина провод т, как описано в примере 2. .Получают препарат с активностью АТЭЭ 1840 Е/г (сохран етс  49% от исходной активности ) с содержанием белка 18,2 мг/г. После промывки препарата 2%-ным раствором казеина остаточна  активность составл ет 57% от исходной. Пример 6. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носител , модифициро- . ванного поликарбамидом, активированием диизоцианатом винной кислоты. К 5 г модифицированного поликарбамидоМ носител  (пример 1) добавл 1Ьт 20 мл 0,01 н водного раствора диизоцианат винной кислоты, рН которого непосредственно перед использованием вакуумируют и контактиРУ1ЭТ в течение 1 часа. После этого носитель фильтру1от и прО1иивают боратным буфером. Иммобилизацию химитрипсина на влажном носителе провод т, как опйсайо в примере 2. Получают препарат с активностью 1670 Е/г (на ТАЭЭ) и содержанием белка 24,7 мг/г. Выход иммобилизации по активности составл ет 44% После промывки препарата 2% раствором казеина остаточна  активность составл ет 58% от исходной. Пример 7, Получение нерастворимого ферментного препарата с

использованием носител , модифицированного поликарбамидом, активированием рлутаровым диальдегидом.

10 МП раствора |&-галактозидазы в 0,2 М ацетатйом буфере с рН 4,2 контактируют с О,24 МП 25%-ого раствора глутарового диапьдегйда при комнатной Т5 мпературе в течение 16 минут. После этого полученный раствор пропускают при помрвда перистальтического насоса через 1 г модифицирован: .юго поликарбамидом носител  (пример 1), загруженного в термостатируемую KojioHKy. Иммобилизацию провод т при в течение 2,5 ч. После этого остаточный раствор отдел ют от носител  и препарат проивлвают 100 мп ацетатного буфера с рН 4,2, 50 мл 0,5 М раствора хлористого натри  и затем 100 мл ацетатного буфера.

Полученный иммобилизованный препарат |Ь -галактозидазы количественно вымывают из колонки, отжимают и определ ют его активность по начальной скорости расщеплени  о-нитрофенил-й- Р-галактопиранозида . Активность препарата составл ет 187 Е/г, содержание белкз в препарате 40 мг/г и йыход им Ioбилизaции по актийности 40%. Врем  полураспада активности препарата при гидролизе 5% раствора лактозы в термостатируемой колонке при 60°С равн етс  30 дн м.

Claims (2)

1.Киппер Р.Х., Эрин А.Э., Егоров Х.Я., Кивисилла К.А., Кестнер А. Получение активированных носителей дл  иммобилизации ферментов. Труды Таллинского политехнического института , 1976, №402, с. 21-28.

2.Авторское свидетельство СССР по за вке 2506847/04,

кл. С 07G 7/02, С.07 F 7/02, . 18.07.77 (прототип).