KR830002697B1 - 고정화 효소의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

고정화 효소의 제조방법

본 발명은 고정화 효소의 제조방법에 관한 것이다.

유기 혹은 무기담체에 효소를 결합시켜서 효소를 고정화하여 재사용과 연속처리를 하는 효소고정화는 잘 알려져 있다.

유기물(예 셀룰로스, 나일론, 폴리아크릴아미드)은 담체로서 불리한데, 왜냐하면 기계적 안정성이 좋지 않으며, 용매에 의한 부식, pH와 이온 강도에 따르는 변화와 미생물에 의한 침해로 인하여 효소와의 결합이 파괴될 수 있기 때문이다.

따라서 효소가 흡착 혹은 공유적으로 흡착하는 무기물 담체가 제안되었는데, 걸함형태는 효소의 사용조건과 형태 및 기질의 특성에 따른다. 즉, 기질이 강한 염농도이면, 흡착된 효소의 불착이 일어나기 때문에 흡착법은 적용될 수 없다. 따라서 효소의 공유결합이 우선한다. 담체의 표면은 효소의 결합을 유도하는 특이한 기능기를 포괄하여야 한다. 대부분 담체는 기능기를 포괄할 수 없기 때문에, 표면의 전처리가 필요하다. 즉, 유기물을 실란으로 처리할 수 있는데, 이결과 표면은 유기기능기(예, 알킬아민)를 수용하게되며, 이것은 유기물과 공유결합을 할수 있게된다. 무기물을 설푸릴염화물, 티오닐염화물 혹은 시아누릭염화물로 처리하는 것이 제안되었다. 더나아가서 담체의 표면을 세기능기를 지니는 불용성 폴리머로 피복하는 것이 제안되었다(예, 단량체마다 10-70%의 유리알데히드기를 지니는 것).

알루미늄 산화물, 닉켈산화물, 철산화물, 티타늄산화물, 지르코늄산화물, 히드록실아파티트, 실리케이트 및 기공유리가 알맞는 유기물로 제안되었는데, 왜냐하면 그의 기공구조가 효소의 흡착과 기질이 내벽에 흡착하는 것을 유도하기 때문이다. 그러나, 원하는 특성, 에, 최적의 기공분포와 표면크기 같은 것에 따라서 광범위한 데이타를 사용한다.

사용된 결합의 형태마다, 독자적으로, 효소특이성이 유리상태와 유사한 정도로 효소를 고정하는 것은 불가능하다. 디. 엘. 라티구(공업적반응 기용 고정화효소 런던 1975. p. 127)은 최적의 고정화 조건에서도 최대로 80%의 효소가 활성형태로 담체에 고정화됨을 보였다.

본 발명에서 다음의 공정으로 고정화 효소를 제조하였다.

기능기를 공유걸합으로 무기담체에 부착시키고 이에 연속걸합된 효소의 양에 관계없이 최대활성을 지닌 것을 제조할 수 있는 최다수의 기공직경을 지닌 무기담체를 특이성이 유리상태의 효소 특이성과 근사하는 정도의 양을 지닌 효소용액과 접촉시키는 것으로 이루어짐.

본 공정의 수행시에, 각기다른 직경을 지닌 담체는 공유걸합등에 의하여 담체에 걸합하거나 효소와 공유걸합을 하는 카플링 메디아에 의한 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 무기담체에 사용되는 가장 일반적인 방법은 실란화에 의한 것이지만, 이미 언급하였듯이, 다른 형태의 카플링제가 사용될 수 있다. 담체상의 카플링수는 충분히 커야하는데 담체의 표면에 따라서 그 양이 변화한다.

본 방법에서 전처리된 담체는 서로 다른 농도의 효소용액과 이들을 접촉시키고, 카플링 요소에 효소가 공유걸합하도록 하여서 다양한 양의 효소를 제공한다. 산출된 생산물의 활성을 결정한후, 결합된 효소의 양에 관계없이 생성된 것의 활성이 최다수의 기공직경에 따르면 최대치에 이를때 임을 발견하였다. 또한 담체의 입경은 최대치의 경우에도 별로 영향을 못미치며 그 절대치가 가장 영향이 있음을 발견하였다. 담체의 입경은 최대치의 경우에도 별로 영향을 못미치며 그 절대치가 가장 영향이 있음을 발견하였다. 담체의 입경은 본 발명에서 이차적으로 중요하며 대부분이 적용목적, 예, 담체의 점성도,공정처리법 및 그외에 따름을 보인다. 최다수의 기공직경에 따라서 걸정된 최적담체의 경우에, 또한 다른양의 효소를 제공하였다. 이 경우에 몇몇 효소농도에서 생성물은 유리상태에 근사하는 즉, 상대적활성이 100%에 가까운 특이성을 제공하였다.

실리카겔에서 생성된 담체의 경우에, Na₂O로 계산하고 무게비로 0.1-0.5%인 건조물로 계산한 알카리 농도로 적정후, 겔을 400℃-850℃, 특히 570℃-750℃의 스팀으로 5-10시간 소성화하면 최적의 담체가 산출될 수 있다.

특히, 건조를 180℃-200℃의 스팀으로 포화된 스팀으로 행하는 것이 유리하다. 40-80%의 상대습도의 스팀함유 공기가 소성화에 유리하다.

이 방법으로 산출된 담체는 175-3000Å, 특히 250-600Å으로서 약 340Å이 최적의 기공직경이다.

본 고정화 공정은 모든 효소에 사용될 수 있다 : 예, 가수분해효소(예, 아밀라제, 글리코시시제, 프로테아제), 산화환원효소 (글루코스옥시다제, 카탈라제), 이성화효소(글루코스이소머라제) 및 전이효소(덱스트란수크라제).

유리상태에서 10-15단위/mg의 특이성을 지니는 아밀로글루 코시다제의 경우에, 최적담체를 담체 그람당 25-75mg, 특히 50mg의 아밀로글루코시다제와 접촉하면 최적의 생산이다.

유리상태에서 50-70단위/mg의 특이성을 지닌 글루코스이소 머라제를 사용하면, 최적담체를 담체그람당 20-50mg, 특히 25mg의 글루코스이소머라제를 지닌용액과 접촉시키면 최적의 생산이 이루어진다.

본 발명은 하기의 실시예로 설명된다.

[실시예 1]

담체 1을 제조하기 위하여, 무게비로 0.3의 산화나트륨을 지닌 실푸릭산을 지닌 소디움 실리캐이트용액에서추출된 실리카겔을 스팀으로 포화된 공기에서 180℃로 3시간 동안 건조하였다.

이것을 1kg 730℃로 6시간 80%의 상대습도를 지니는 분당 2리터의 스팀공기에서 소성시켰다. 이러한 처리후, 실리카는 1400˚직경의 기공이 가장 많았다. 담체 1을 스크리닝으로 구분시키고 이것을 0.25-0.5mm크기인 것으로 더 구분하였다. 150g의 이담체를 8시간동안 10%의 γ-아미노프로필트리 에톡시실란 4리터를 벤젠에서 환류가열하고 냉각후, 1000ml의 벤젠으로 3회 1000ml의 아세톤으로회 3세 척하였다. 진공상태에서 용매를 증류시킨후, 담체를 0.05ml의 인산염완충액 (pH7)으로 2회, 증류수로 3회 세척하

이 담체 10g을 0.05m의 인산염완충액내 (pH7)1g의 아밀로글루코시다제 20ml(메르크 1330)을 부유시켰다. 아밀로글루코시다제의 활성은 11.75단위/mg으로서, 사용된 활성측정 U가 25℃에서 분당 1μ물의 글루코스 생성이 되었다. 현탁액을 20분간 진공상태에 방치하고, 공기유통후 2시간후, 20분간 진공으로 하였다. 4시간후 담체를 필터로 용액에서 분리하고, 이후 이것을 0.01m 인산염완충액 (pH5)로 3회세척하였다. 최종의 담체 1.1.을 인산염완충액 (pH5)에 4℃로 저장하였다.

C-N분석에 의하면 16.5mg/g의 단백질농도를 나타냈다. 담체 1.2.의 제조의 경우 10g의 실란화된 담체 1을 0.5m 인산염완충액(pH7)내 0.5g의 아밀로글루코시다제 20ml(메르크 1330)에 현탁시키고, 담체 1.1.의 제조공정을 행하였다. 최종의 담체 1.2.의 C-N분석은 9.0mg/g의 단백질농도를 보였다.

[실시예 2]

담체 2의 제조의 경우에, 무게비로 0.3%의 산화나트륨을 지니고 설푸릭산을 지닌 나트륨실리케이트에서 침전된 실리카겔, 실시예 1에 서술된 것을 건조하였다. 이 재료 1kg을 6시간 680℃로 분당 2리터의 상대습도 80%스팀공기로 소성화하였다. 이후, 실리카는 기공직경이 대부분 340Å이었다. 담체 2를 스크리닝으로 구분 시키고 0.25-0.5mm크기로 구분하였다.

150g의 이 담체구분물을 실시예 1의 방법으로 벤젠내 10%의 γ-아미노프로필트리에톡시실란용액 4리터로 8시간 처리하였다. C와 N의 평균치에 준하여, 담체 2는 g당 0.19m당량의 실란을 함유하였다.

10g의 이 담체를 0.05m의 인산염완충액 (pH7)내 1g의 아밀로글루코시다제(메르크 1330)용액 20ml에 현탁시키고, 실시예 1과 동일한 방법으로 처리하였다. 담체 2.1은 C-N분석으로 30.8mg/g의 단백질 농도를 지녔다.

실란화된 담체 2 ; 10g을 0.05m인산염 완충액(pH7)내 0.5g의 아밀로글루코시다제(메르크 1330) 20ml에 현탁시키고, 실시예 1과 같이 처하였다.

C-N분석에 의하면 담체 2.2는 17.4mg/g의 단백질농도를 지녔다.

[실시예 3]

담체 3의 제조의 경우에, 실시예 1에 따르는 무게비로 0.3%의 산화나트륨 농도를 지니고 설푸릭산을 지닌 소디움실리케이트 용액에서 침전된 실리카겔을 건조하였다. 이것 1kg을 분당 2리터의 상대습도 60%인 공기스팀에서 640℃로 6시간 소성하였다.

이 처리후, 실리카는 180℃의 직경의 기공이 최다수가 되었다. 담체 3을 스크리닝으로 구분하고, 0.25-0.50mm의 크기를 지니는 구분을 행하였다.

150g의 이담체를 8시간 실시예 1에 서술된 방법으로 벤젠에서 10%의 γ-아미노프로필트리에톡시실란 4리터로 처리하였다. 담체 3은 C와 N결정의 평균치에 준하여 g당 0.51몰당량의 실란을 함유하였다.

10g의 이담체를 0.05m인산염완충액 (pH7)내 1g의 아밀로글루코시다제 20ml에 현탁하고, 실시예 1과 같이 처리하였다. 최종의 담체 3.1은 C-N분석에 따르면 26.2mg/g의 단백질 농도를 지녔다.

실란화된 담체 3의 10g을 0.05m인산염완충액 (pH7)내 0.5g의 아밀로글루코시다제 20ml에 현탁하고, 실시예 1과 동일하게 처리하였다(담체 1.2). 최종담체 3.2의 C-N분석은 12.7mg/g의 단백질 농도를 지녔다.

[실시예 4]

카플링미디엄이 제조물의 활성에 영향이 없음을 증명하기 위하여, 0.25-0.5mm크기의 일부를 담체 2에서 분리하고 (340Å의 기공이 최다수인 것)이것 50g을 실온에서 5분간 500ml의 12.5% 글루타르알데히드 수용액에서 교반하고, 이후 500ml의 포화염화암모늄용액을 가하였다. 4시간 실온에서 교반후, 염화물이 없어질때까지 세척하고, 포스포러스 펜톡사이드에서 진공건조하였다.

10g의 이 담체를 0.05m인산염 완충액 (pH7)내 1g의 아밀로글루코시다제의 20ml용액에 현탁시키고, 실시예 1과 같이 처리하였다. 최종의 담체 4.1은 C-N분석에 따라서 29.8mg/g의 단백질 농도를 지녔다.

10g의 담체 2를 0.05m인산염완충액 (pH7)내 0.5g의 아밀로글루코시다제의 20ml용액에 현탁시키고, 실시예 1(담체 1.2)에서 술된대로 처리하였다. 최종의 담체 4.2의 C-N분석에 따르면 17.0mg의 단백질 농도를 나타냈다.

[실시예 5]

10g의 담체 1(1400Å의 기공이 최다수)을 0.5g의 글루코스이소머라제를 지닌 40ml의 0.05m인 인산염완충액 (pH7)에 현탁시켰다(와이. 타카사끼, 농생화학, 33. 11번. 1527-1534(1969)).

실온에서 반응시간은 30분이었다. 이 경우에, 10분후 반응도를 진공으로하고, 반응완결후, 잔존액을 펌프로필터티리하였다. 3회 물과 0.5m인산염완충액 (pH7)로 세척하였다. 최종의 담체 5.1은 C-N분석에 따르면 4.8mg/g의 단백질 농도를 지녔다. 담체 5.2의 경우에, 10g의 담체 1을 0.25g의 글루코스 이소머라제를 지닌 40ml의 0.05m인산염완충액 (pH7)에 현탁시켰다. 다음은 담체 5.1의 제조법에 따른다. 최종 단체 5.2의 C-N분석은 2.0mg/g의 단백질농도를 나타냈다.

[실시예 6]

10g의 담체 2(340Å의 기공이 최다수)를 0.5g의 글루코스이소머라제를 지닌 40ml의 0.05m인산염완충액(pH7)에 현탁시키고, 실시예 5와 동일한 처리를 하였다. 최종의 담체 6.1은 22.0mg/g의 단백질농도를 지녔다. 담체 6.2의 제조시, 10g의 담체 2를 0.25g의 글루코스이소머라제를 지닌 40ml의 0.05m, 인산염완충액 (pH7)에 현탁시키고, 실시예 5와 같이 처리하였다. 최종담체 6.2의 단백질농도는 10.2mg/g이었다.

[실시예 7]

10g의 담체 3(180Å의 기공이 최다수)을 0.5g의 글루코스이소머라제를 지닌 40ml의 0.05m인산염완충액에 현탁시키고, 실시예 5와 같이 처리하였다. 최종담체 7.1은 11.2mg/g의 단백질농도를 지녔다.

담체 7.2의 제조시 10g의 담체 3을 0.25g의 글루코스이소 머라제를 지닌 40ml의 0.05m인산염완충액 (pH7)에 현탁 시키고, 담체 5.1의 제조에 서술된대로 처리하였다.

최종샘플 7.2의 단백질농도는 5.1mg/g이었다.

[실시예 8]

실시예 4에 서술된 10g의 담체(340Å의 기공이 최다수, 글루타르알데히드 용액으로 처리됨)를 0.5g의 글루코스이소머라제를 지닌 40ml의 0.05m인산염완충액 (pH7)에 현탁시키고, 실시예 5에 서술된대로 처리하였다. 최종담체 8.1의 단백질농도는 21.3mg/g이었다.

담체 8.2의 제조시, 10g의 동일담체를 0.25g의 글루코스 이소머라제를 지닌 40ml의 0.05m인산염 완충액 (pH7)에 현탁시키고, 담체 5.1의 제조에 서술된대로 처리하였다. 최종샘플 8.2의 단백질농도는 9.8mg/g이었다.

[실시예 9]

실시예 1-4에 서술된 담체 1.1,1.2,2.1,2.2 : 3.1,3.2 : 4.1,4.2와 고정화에 쓰인 효소의 활성은 디니트로살리시클릭법으로 결정하였다(비교, 틱, 더블류우., 스테그바우어, 에이취. 피. : 버그마이어, 에이치. 유. "효소분색법", 베르라그헤미에 1970. 848페이지). 활성 한단위(U)는 배양조건하에서 1μ당량의 환원성기를 방출하는 양의 효소에 상응한다(글루코스스로 계산).

배양조건

0.1m인산염 완충액 pH5.0에서 30분, 25℃의 2%의 기질용액(줄코스키-스타치메르크. 1257).

기질-고정된 제조물을 600rpm의 속도의 40ml교반반응기에서 상기 조건하에 현탁시켰다(생성물의 속도는 교반기 속도와 별도임).

제조물의 단백질농도는 C-N결정의 평균치에 준하여 결정되었다. 담체의 최다수의 기공직경은 기공분포에서 결정되었다(고압가공측정기로 측정).

하기표 1에서 담체 1-4의 결과가 나와있다. 사용된 기호는 다음과 같다.

최다수의 기공직경 D (Å)

효소흡착 C_E(mg. 효소/g. 담체)

활성 U (단위/g. 샘플)

특이성 U_S=U/C_E(단위/mg. 효소)

유리상태에서특이성 U_SF(단위/mg. 효소)

상대적활성 Urel=100 U_S/U_SF(%)

[표 1]

(고정된 아밀로글루코시다제)

[실시예 10]

실시예 5-8에 서술된 담체 5.1,5.2 : 6.1,6.2 : 7.1,7.2 : 8.1,8.2의 활성과 고정화에 사용된 글루코스이소머라제는 다가사끼법에 의하여 결정되었다(와이. 다가사끼 : 농생화학, 30권, 12번, 1247-1253, 1966과 제트. 디쉐와이. 보렌프로인트 : 생화학지 192,583,1951), 활성단위(U)는 배양조건하에서 1g의 프럭토스를 형성하는 양의 효소로 정의 되었다.

배양조건

온도 65℃

반응시간 1시간

기질 0.0004m황산마그네슘으로 pH8.0,0.05인산염완충액에서 0.1m글루코스_XH₂O(메르크 8342). 기질에 고정화된 제조물은 실시예 9에 서술된 표준조건의 교반 반응기에 현탁시켰다.

제조물의 단백질 농도는 C-N결정의 평균치에 준하여 경정하였다.

하기표 2에서 담체 5-8의 결과를 나열하였다.

사용된 기호는 실시예 9에 주어져 있다.

[표 2]

(고정화된 글루코스이소머라제)

결과 :

1. 조사된 샘플의 활성 U는 담체의 최다수 기공직경과 달리 최대로 진행된다.

2. 특이성 U_S는 효소흡착에 따르며 일정효소농도 C_E에서 유리상태 U_SF에서의 효소의 활성치가 Urel=100이 되도록 한다. 만일 효소의 양이 초과하면, 특이성은 U_S와 U_E의 생산이 일정할때 낮아진다.

3. 담체에 의하여 용해된 효소의 양은 최다수기공직경의 기능에 따른다. 최적담체2 (최다수의 기공직경 340Å)가 g당 10.2mg의 글루코스이소머라제 혹은 g당 17.4mg의 아밀로 글루코시다제(담체 2.2와 6.2각각)를 용해하면 효소/담체 시스템은 최소의 효소사용시 최적활성을 보인다.

4. 조사된 담체의 활성과 효소흡착은 카플링 메디아와 다르다. 효소비용이 높으며 필요순도에 따라 그 비용이 증가하고, 이들 요소가 경제적으로 중요한 역활을 함에 따라서, 본 공정은 최대활성에 필요조 양의 효소를 최적화할 수 있기 때문에 기술적으로 고가의 효소를 사용할 수 있는 가능성을 제시하였다.

Claims (1)

1. 공유 결합을 위한 기능기를 가지는 무기 담체와 효소 용액을 접촉시켜 고정화 효소를 제조하는 방법에 있어서, 담체와 결합하는 효소의 양에 관계없이 최대의 활성도를 갖는 조제물이 얻어질 수 있는 최다수 기공직경을 가지는 담체를, Na₂O의 중량%로 표시되는 알카리 함량을 0.1-0.5중량%로 조절하고 180℃-200℃로 건조한 후 수증기함유 공기류 중에서 400℃-850℃로 소성한 실리카 겔로부터 선택하고, 이와 같이 선택한 담체를, 상기 조제물의 특이성이 유리상태에서의 효소의 특이성에 도달하거나 가까워지는 정도의 수(數)의 효소, 즉 유리 상태에서 특이성이 10-15단위/mg인 아밀로글루코시다제 또는 유리상태에서 특이성이 50-70단위/mg인 글루코스이소머라제 만을 함유하는 여러가지 농도의 효소 용액과 접촉시키고, 그렇게하여 얻어진 효소 조제물들을 분리하고, 그들의 효소 특이성을 측정하여, 최대 특이성을 갖는 효소를 선택하는 것을 특징으로 하는 고정화 효소의 제조방법.