CN106800592B - 一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用，所述细胞穿膜肽具有如下的序列：CHm‑X‑HnC；其中，所述C选自半胱氨酸残基，所述H选自组氨酸残基；所述X选自a个赖氨酸(K)残基、b个精氨酸(R)残基或者c个赖氨酸(K)残基和d个精氨酸(R)残基；且3≤m≤5，3≤n≤5，6≤a≤9，6≤b≤9，6≤c+d≤9。所述细胞穿膜肽的穿膜效果显著，效率高，且低毒安全。

Description

一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用。
背景技术
细胞膜由脂质双分子层组成，其内部由疏水性的非极性分子构成。细胞膜是物质进出细胞的屏障，其仅仅允许分子量小于600Da的非脂溶性分子进入活细胞。这一屏障虽然对机体有保护作用，但也使一些有价值的亲水性大分子药物难以穿透细胞膜进入细胞内部达到有效治疗浓度，使得这类有治疗价值但无细胞穿透性且易降解的亲水性分子在细胞生物学、药学等研究领域中的应用大大受到限制。虽然多年来，研究人员致力于将这些效应分子导入活细胞的有效方法，虽各有优势，但都不可避免的存在一些问题。
近年来，多肽作为药物辅助功能的应用逐渐成为了药物研制的热点之一。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)，也称蛋白转导域(protein transductiondomains，PTDs)，是一类具有细胞穿透功能的多肽的总称，它具有很强的跨膜转运能力，能够携带比其相对分子量大1000倍的外源性大分子进入细胞。CPPs可以有效地将蛋白、多肽、核酸片段通过无受体介导、无耗能的方式，导入多种哺乳动物细胞，且在一定范围浓度内不会造成细胞损伤。这一重要发现为具有治疗效应的生物大分子提供了一个有效的载体，在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、临床药效评价及细胞免疫学等研究领域均具有良好的应用前景。
现阶段，研究及应用最多的CPPs是来源于人免疫缺陷病毒(HIV-1)的转录活性因子(Trans-activating transcriptional activator Tat)。目前虽已证实Tat可穿透细胞膜进入细胞内，但其穿膜效率并不理想，不能有效的携带物质转运入细胞内部。
发明内容
针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用，所述细胞穿膜肽的穿膜效果显著，效率高。
为了解决上述缺陷，本发明采用如下技术方案：一种细胞穿膜肽，所述细胞穿膜肽具有如下的序列：CHm-X-HnC；
其中，所述C选自半胱氨酸残基，所述H选自组氨酸残基；所述X选自a个赖氨酸(K)残基、b个精氨酸(R)残基或者c个赖氨酸(K)残基和d个精氨酸(R)残基；且3≤m≤5，3≤n≤5，6≤a≤9，6≤b≤9，6≤c+d≤9。
作为进一步的优选，所述细胞穿膜肽序列两端的组氨酸残基的数目相同。
一种细胞穿膜肽的制备方法，所述方法包括：
1)提供一树脂，将所述树脂在第一溶剂中浸泡至树脂溶胀；
2)将氨基酸、缩合剂溶于第二溶剂，形成混合物；
3)将所述混合物加入所述溶胀的树脂中形成反应体系，反应1-4h；
4)去除反应后反应体系中的溶液，洗涤，气体鼓动，抽干；
5)在经由步骤4)后的反应体系中加入脱帽液，气体鼓动，抽干；
6)去除经由步骤5)后的反应体系中的溶液，洗涤，气体鼓动，抽干；获得合成的多肽链；
7)在所述多肽链中加入切割液，在4-30℃下搅拌1-4h，过滤得滤液，洗涤所述滤液；
8)将所述滤液萃取，离心得到多肽粗品。
所述树脂选自Fmoc-Wang树脂和H-Cys(Trt)-2cl树脂。
所述缩合剂选自碳二亚型缩合剂和苯并三唑鎓盐型缩合剂。
所述碳二亚型缩合剂选自二环己基碳二亚胺(DCC)、所述苯并三唑鎓盐型缩合剂选自O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和O-苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)。
所述第一溶剂包括二氯甲烷，所述第二溶剂选自二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷DCM及四氢呋喃(THF)。
所述氨基酸与树脂的投料摩尔量比例为1-10；所述缩合剂与树脂的投料摩尔量比例为1-10。
所述氨基酸选自半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸以及精氨酸。
作为进一步的优选，所述步骤4)循环洗涤1-5次；所述步骤6)循环洗涤1-10次。
作为进一步的优选，所述脱帽液包括：DMF溶液以及其中溶解的6％W/V的哌嗪、0.1M的HOBT。
作为进一步的优选，所述切割液包括：以重量百分数计，95％的TFA、2％的TIS以及3％的H2O。
作为进一步的优选，所述步骤7)中，洗涤滤液所用的为TFA。
作为进一步的优选，所述步骤8)中，所述萃取包括：在所述滤液中，加入无水乙醚，放置1-4h；所述无水乙醚与滤液的体积比为5-60。
一种细胞穿膜肽的应用，所述细胞穿膜肽在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。
作为进一步的优选，所述标记物选自荧光素、生物素以及亲和基团；所述载物分子选自糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子及纳米微球。
作为进一步的优选，将所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA。
作为进一步的优选，所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合，包括如下步骤：
(1)将质粒DNA与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液(PBS)中；
(2)调整所述质粒DNA与穿膜肽含量间的N/P比(NH+3/PO-4)为0-80；
(3)培养过夜的细胞，用无血清的培养基洗涤，将含有所述质粒DNA和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中；
(4)4-6h后去掉培养基，添加含有10-15％FCS(胎牛血清)的培养基，静置1-4h。
作为进一步的优选，所述质粒DNA选自pEGFP和PdsRED。
作为进一步的优选，调整所述质粒DNA与穿膜肽含量间的N/P比分别为0、10、20、40、80。
本发明的有益效果是：
(1)本发明细胞穿膜肽分子量小，氨基酸残基个数少，穿膜效果显著，效率明显高于穿膜肽Tat及
Figure BDA0001214855980000031
2000转染试剂。
(2)本发明细胞穿膜肽免疫原性低，安全低毒，毒性远远低于穿膜肽Tat及
Figure BDA0001214855980000032
2000。
(3)本发明细胞穿膜肽由固相合成方法而得，所述合成方法既可以在实验室水平也可在工业水平进行，操作简单且便于质量管控。
附图说明
图1为本发明实施例细胞穿膜肽制备方法的流程示意图。
图2a-2f为本发明实施例1-6细胞穿膜肽与质粒DNA结合后最优n/p比的实验结果图。
图3a-3g为本发明实施例1-6细胞穿膜肽用于BHK21细胞转染结果示意图。
图4a-4g为本发明实施例1-6细胞穿膜肽用于B16细胞转染结果示意图。
图5为本发明实施例用于BHK21转染得到的荧光值。
图6为本发明实施例用于B16转染得到的荧光值。
图7a-7f为本发明实施例1-6细胞穿膜肽用于BHK21MTT结果示意图。
图8a-8f为本发明实施例1-6细胞穿膜肽用于B16MTT结果示意图。
具体实施方式
本发明实施例通过提供一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用，克服了现有穿模肽的穿膜效率不理想，不能有效的携带物质转运入细胞内部的缺陷。
为了解决上述缺陷，本发明实施例的主要思路是：
本发明实施例细胞穿膜肽，具有如下的序列：CHm-X-HnC；
其中，所述C选自半胱氨酸残基，所述H选自组氨酸残基；所述X选自a个赖氨酸(K)残基、b个精氨酸(R)残基或者c个赖氨酸(K)残基和d个精氨酸(R)残基；且3≤m≤5，3≤n≤5，6≤a≤9，6≤b≤9，6≤c+d≤9。
本发明实施例细胞穿膜肽的制备方法，所述方法包括：
1)提供一树脂，将所述树脂在第一溶剂中浸泡至树脂溶胀；
2)将氨基酸、缩合剂溶于第二溶剂，形成混合物；
3)将所述混合物加入所述溶胀的树脂中形成反应体系，反应1-4h；
4)去除反应后反应体系中的溶液，洗涤，气体鼓动，抽干；
5)在经由步骤4)后的反应体系中加入脱帽液，气体鼓动，抽干；
6)去除经由步骤5)后的反应体系中的溶液，洗涤，气体鼓动，抽干；获得合成的多肽链；
7)在所述多肽链中加入切割液，在4-30℃下搅拌1-4h，过滤得滤液，洗涤所述滤液；
8)将所述滤液萃取，离心得到多肽粗品。
本发明实施例细胞穿膜肽的应用，所述细胞穿膜肽可在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。
所述标记物选自荧光素、生物素以及亲和基团；所述载物分子选自糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子及纳米微球。
鉴于现有穿膜肽穿膜研究及Tat的弊端，申请人设计并合成了一系列新的本发明实施例穿膜肽CHR，观察其穿膜效率及其毒性，并评估了其递送绿色荧光蛋白(GFP)和质粒DNA的效果，为其作为一种高效、安全的效应分子递送载体的开发提供了科学依据。另外，本发明细胞穿膜肽可用于生产药物、保健品、美容或护肤品、转染试剂或诊断试剂等实际应用中。
为了让本发明之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举数实施例，来说明本发明所述之细胞穿膜肽及其制备方法、应用。
实施例1
本发明实施例1细胞穿膜肽CHR1，具有如下的序列：CHHHRRRRRRHHHC；如序列表SEQIDNO：1所示。
本发明实施例1细胞穿膜肽CHR1采用化学合成法制备，所述制备方法包括如下步骤：
(1)称取Fmoc-Wang树脂倒入玻璃反应器中，加入二氯甲烷(DCM)浸泡直至树脂溶胀；
(2)称取相当于树脂1倍摩尔量的每步投料的氨基酸(半胱氨酸、组氨酸及精氨酸)，1倍摩尔量的碳二亚型缩合剂(如二环己基碳二亚胺(DCC)溶于二甲基甲酰胺(DMF)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；
(3)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；
(4)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；
(5)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；
(6)反复上述操作直至多肽链合成完成；
(7)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用TFA洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；
运用HPLC/MS或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽。
将上述方法合成的本发明实施例1细胞穿膜肽CHR1介导的质粒DNA转染方法，包括如下步骤：
(1)将质粒pEGFP与上述穿膜肽CHR1分别混合于磷酸盐缓冲液(PBS)中；
(2)计算质粒与穿膜肽含量间的N/P比(NH+3/PO-4)，调整两者间N/P比分别为0、1、5、10、20、40、80；将上述调整好N/P比的混合液进行琼脂糖电泳实验，确定最优N/P比；如图2a所示，N/P在20左右时，质粒与穿膜肽已结合的较好。
实施例2
本发明实施例2细胞穿膜肽CHR2，具有如下的序列：CHHHKKKKKKHHHC；如序列表SEQIDNO：2所示。
本发明实施例2细胞穿膜肽CHR2采用化学合成法制备，所述制备方法包括如下步骤：
(1)称取H-Cys(Trt)-2cl树脂倒入玻璃反应器中，加入二氯甲烷(DCM)浸泡直至树脂溶胀；
(2)称取相当于树脂10倍摩尔量的每步投料的氨基酸(半胱氨酸、组氨酸及赖氨酸)，10倍摩尔量的苯并三唑鎓盐型缩合剂(如O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU))溶于二甲基甲酰胺(DMF)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；
(3)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；
(4)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；
(5)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；
(6)反复上述操作直至多肽链合成完成；
(7)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30℃恒温机械搅拌1-4h，过滤后用TFA洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；
(8)运用HPLC/MS或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽。
将上述方法合成的本发明实施例2细胞穿膜肽CHR1介导的质粒DNA转染方法，包括如下步骤：
(3)将质粒PdsRED与上述穿膜肽CHR2分别混合于磷酸盐缓冲液(PBS)中；
(4)计算质粒与穿膜肽含量间的N/P比(NH+3/PO-4)，调整两者间N/P比分别为0、1、5、10、20、40、80；将上述调整好N/P比的混合液进行琼脂糖电泳实验，确定最优N/P比。如图2b所示，N/P在20左右时，质粒与穿膜肽已结合的较好。
实施例3
本发明实施例3细胞穿膜肽CHR3，具有如下的序列：CHHHKRKRKRHHHC；如序列表SEQIDNO：3所示。
本发明实施例3细胞穿膜肽CHR3采用化学合成法制备，所述制备方法包括如下步骤：
(1)称取Fmoc-Wang树脂倒入玻璃反应器中，加入二氯甲烷(DCM)浸泡直至树脂溶胀；
(2)称取相当于树脂3倍摩尔量的每步投料的氨基酸(半胱氨酸、组氨酸精氨酸及赖氨酸)，3倍摩尔量的苯并三唑鎓盐型缩合剂(O-苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU))溶于二甲基甲酰胺(DMF)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；
(3)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；
(4)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；
(5)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；
(6)反复上述操作直至多肽链合成完成；
(7)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用TFA洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；
运用HPLC/MS或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽；
将上述方法合成的本发明实施例3细胞穿膜肽CHR1介导的质粒DNA转染方法，包括如下步骤：
(5)将质粒PdsRED与上述穿膜肽CHR3分别混合于磷酸盐缓冲液(PBS)中；
(6)计算质粒与穿膜肽含量间的N/P比(NH+3/PO-4)，调整两者间N/P比分别为0、1、5、10、20、40、80；将上述调整好N/P比的混合液进行琼脂糖电泳实验，确定最优N/P比。如图2c所示，N/P在20左右时，质粒与穿膜肽已结合的较好。
实施例4
本发明实施例4细胞穿膜肽CHR4，具有如下的序列：CHHHRRRRRRRRRHHHC；如序列表SEQIDNO：4所示。
本发明实施例4细胞穿膜肽CHR4采用化学合成法制备，所述制备方法与实施例3类似。如图2d所示，本发明实施例4细胞穿膜肽CHR4也能与质粒DNA较好的结合。
实施例5
本发明实施例5细胞穿膜肽CHR5，具有如下的序列：CHHHHHRRRKKKRRRHHHHHC；如序列表SEQIDNO：5所示。
本发明实施例5细胞穿膜肽CHR5采用化学合成法制备，所述制备方法与实施例3类似。如图2e所示，本发明实施例5细胞穿膜肽CHR5也能与质粒DNA较好的结合。
实施例6
本发明实施例6细胞穿膜肽CHR6，具有如下的序列：CHHHHHKKKKKKKKKHHHHHC；如序列表SEQIDNO：6所示。
本发明实施例5细胞穿膜肽CHR5采用化学合成法制备，所述制备方法与实施例2类似。如图2f所示，本发明实施例6细胞穿膜肽CHR5也能与质粒DNA较好的结合。
为了得到本发明实施例1-6细胞穿膜肽CHR1-6的穿膜效果，对其进行如下一系列试验予以证明：
实验1：本发明实施例细胞穿膜肽与质粒DNA结合后的穿膜效果实验
(1)本发明实施例CHR1-6的共6种穿膜肽分别和pEGFP或PdsRED按0，10、20、40、80的N/P比混合，室温或者37℃孵育半个小时或一个小时。对照组为穿膜肽Tat，同样分别与pEGFP或PdsRED按0，10、20、40、80的N/P比混合，阳性对照组使用
Figure BDA0001214855980000081
2000，实验方法按照说明书所示；
(2)实验细胞分别为BHK21和B16细胞系。培养细胞过夜，用没有血清的培养基洗两次，加入质粒DNA和穿膜肽复合物加入到500ul培养基中；
(3)6小时候去掉培养基加含有10％胎牛血清的新鲜培养基；
(4)1-4小时后显微镜观察，结果如图3a-3g及图4a-4g所示，在BHK21细胞系中，CHR1和CHR3与质粒DNA在N/P比为40的条件下结合，1-4小时的孵育时间内其各个时间点的穿膜效率就已远高于
Figure BDA0001214855980000082
2000；CHR2与质粒DNA在N/P比为80的条件下结合，1-4小时的孵育时间内其各个时间点的穿膜效率与
Figure BDA0001214855980000083
2000相当；CHR4与质粒DNA在N/P比为20的条件下结合，1-4小时的孵育时间内其各个时间点的穿膜效率就已远高于
Figure BDA0001214855980000084
2000；CHR5及CHR6与质粒DNA在N/P比为80的条件下结合，在各个时间点的穿膜效率也远高于
Figure BDA0001214855980000085
2000；在4小时的时间点上，如图3g所示，纵向对比CHR1-6与质粒DNA结合后的穿膜效率，发现CHR4与质粒DNA在N/P比为20时其穿膜效率是最高的，且远远高于
Figure BDA0001214855980000086
2000的穿膜效率。在B16细胞系中，CHR1与质粒DNA在N/P比为40的条件下结合，1-4小时的孵育时间内其各个时间点的穿膜效率已高于
Figure BDA0001214855980000087
2000；CHR4与质粒DNA在N/P比为20的条件下结合，孵育3h后其穿膜效率就已远高于
Figure BDA0001214855980000088
2000；CHR5与质粒DNA在N/P比为20的条件下结合，在孵育的各个时间点下的穿膜效率已高于
Figure BDA0001214855980000091
2000，在更大的N/P下，其穿膜效率更高；CHR5与质粒DNA在N/P比为40的条件下结合，在孵育的各个时间点下穿膜效率与
Figure BDA0001214855980000092
2000相当，在N/P比为80时，其穿膜效率远高于
Figure BDA0001214855980000093
2000；在4小时的时间点上，如图4g所示，纵向对比CHR1-6与质粒DNA结合后的穿膜效率，发现CHR5与质粒DNA在N/P比为20的条件下结合，其穿膜效率已明显强于
Figure BDA0001214855980000094
2000。
BHK21或B16细胞系细胞经上述处理4h后经流式细胞仪检测，得到荧光定量结果，如图5所示，在BHK21细胞系中，CHR4及CHR5在4uM时，其荧光强度就已强于
Figure BDA0001214855980000095
2000，而CHR2及CHR3在16uM时，荧光强度才大于
Figure BDA0001214855980000096
2000；如图6所示，在B16细胞系中，CHR4及CHR6在4uM时，其荧光强度就已强于
Figure BDA0001214855980000097
2000，CHR1、CHR3及CHR5在8uM时，其荧光强度高于
Figure BDA0001214855980000098
2000，CHR2在16uM时，荧光强度才大于
Figure BDA0001214855980000099
2000。
实验2：本发明实施例细胞穿膜肽的细胞毒性实验
(1)取对数生长期培养细胞BHK21和B16，以每孔1×104个细胞接种于96孔板，37℃，5％二氧化碳培养箱培养24小时，使细胞贴壁；
(2)至对数生长期，换成无血清的培养液，继续培养1小时；
(3)配置不同浓度的穿膜肽CHR1-6，同时设置三个阴性对照孔、Tat实验孔及阳性对照孔(
Figure BDA00012148559800000910
2000)，阳性对照孔(
Figure BDA00012148559800000911
2000)按照说明书操作进行实验。37℃，5％二氧化碳培养箱培养1-24h；
(4)孵育时间结束后，每孔加入PBS洗涤；
(5)贴壁细胞每孔加入20ul MTT(0.5％)，继续孵育4-6h之后弃掉培养液，每孔加入150ul DMSO(二甲基亚砜)，震荡10min；
(6)比色：选择490nm或570nm波长，在酶标仪免疫检测仪上测定光吸收值，处理数据得到细胞存活率，结果如图7a-7f所示，对于BHK21细胞系，本发明细胞穿膜肽CHR1-6在1-16umol/L的浓度范围内，CHR2、CHR3、CHR5和CHR6处理后细胞存活率均高于阳性对照组，而CHR1和CHR4仅在16umol/L浓度处理细胞后，其细胞存活率略低于阳性对照组；如图8a-8f所示，对于B16细胞系，本发明细胞穿膜肽CHR1-6在1-16umol/L的浓度范围内，CHR1、CHR2、CHR4和CHR5处理后细胞存活率均高于阳性对照组，而CHR3和CHR6仅在16umol/L浓度处理细胞后，其细胞存活率低于阳性对照组。上述实验结果证明本发明实施例1-6涉及的细胞穿膜肽CHR1-6安全低毒。
上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：
(1)本发明细胞穿膜肽分子量小，氨基酸残基个数少，穿膜效果显著，效率明显高于穿膜肽Tat及
Figure BDA0001214855980000101
2000转染试剂。
(2)本发明细胞穿膜肽免疫原性低，安全低毒，毒性远远低于穿膜肽Tat及
Figure BDA0001214855980000102
2000。
(3)本发明细胞穿膜肽由固相合成方法而得，所述合成方法既可以在实验室水平也可在工业水平进行，操作简单且便于质量管控。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
SEQUENCE LISTING
<110> 肽泽（武汉）生物科技有限公司
<120> 一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用
<130> 2016
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Cys His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg His His His Cys
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Cys His His His Lys Lys Lys Lys Lys Lys His His His Cys
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Cys His His His Lys Arg Lys Arg Lys Arg His His His Cys
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Cys His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His His His
1 5 10 15
Cys
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Cys His His His His His Arg Arg Arg Lys Lys Lys Arg Arg Arg His
1 5 10 15
His His His His Cys
20
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Cys His His His His His Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys His
1 5 10 15
His His His His Cys
20

Claims (10)

1.一种细胞穿膜肽，其特征在于：所述细胞穿膜肽为如下的序列：CHm-X-HnC；其中，所述C为半胱氨酸残基，所述H为组氨酸残基；所述X为a个赖氨酸残基，b个精氨酸残基，或者由c个赖氨酸残基与d个精氨酸残基组成；且3≤m≤5，3≤n≤5，6≤a≤9，6≤b≤9，6≤c+d≤9。
2.如权利要求1所述的细胞穿膜肽的制备方法，其特征在于：所述方法包括：
1)提供一树脂，将所述树脂在第一溶剂中浸泡至树脂溶胀；所述树脂选自Fmoc-Wang树脂和H-Cys(Trt)-2cl树脂；所述第一溶剂包括二氯甲烷；
2)将氨基酸、缩合剂溶于第二溶剂，形成混合物；所述第二溶剂选自二甲基甲酰胺、二氯甲烷及四氢呋喃；所述氨基酸与树脂的投料摩尔量比例为1-10；所述缩合剂与树脂的投料摩尔量比例为1-10；
3)将所述混合物加入所述溶胀的树脂中形成反应体系，反应1-4h；
4)去除反应后反应体系中的溶液，洗涤，气体鼓动，抽干；
5)在经由步骤4)后的反应体系中加入脱帽液，气体鼓动，抽干；
6)去除经由步骤5)后的反应体系中的溶液，洗涤，气体鼓动，抽干；获得合成的多肽链；
7)在所述多肽链中加入切割液，在4-30℃下搅拌1-4h，过滤得滤液，洗涤所述滤液；
8)将所述滤液萃取，离心得到多肽粗品。
3.根据权利要求2所述的细胞穿膜肽的制备方法，其特征在于：所述缩合剂选自碳二亚型缩合剂和苯并三唑鎓盐型缩合剂。
4.根据权利要求2所述的细胞穿膜肽的制备方法，其特征在于：所述氨基酸选自半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸以及精氨酸。
5.根据权利要求2所述的细胞穿膜肽的制备方法，其特征在于：所述步骤8)中，所述萃取包括：在所述滤液中，加入无水乙醚，放置1-4h；所述无水乙醚与滤液的体积比为5-60。
6.如权利要求1所述的细胞穿膜肽在制备护肤品的应用，其特征在于：所述细胞穿膜肽在C端或N端共价或非共价连接载物分子，并携带载物分子穿过细胞膜进入细胞。
7.如权利要求1所述的细胞穿膜肽在制备药物、转染试剂或诊断试剂中的应用，其特征在于：所述细胞穿膜肽在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。
8.根据权利要求7所述的细胞穿膜肽在制备药物、转染试剂或诊断试剂中的应用，其特征在于：所述标记物选自荧光素、生物素以及亲和基团；所述载物分子选自糖类、多肽、药物分子前体、纳米粒子。
9.根据权利要求7所述的细胞穿膜肽在制备药物、转染试剂或诊断试剂中的应用，其特征在于：所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA。
10.根据权利要求9所述的细胞穿膜肽在制备药物、转染试剂或诊断试剂中的应用，其特征在于：所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合，包括如下步骤：
(1)将质粒DNA与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中；
(2)调整所述质粒DNA与穿膜肽含量间的N/P比为0-80；
(3)培养过夜的细胞，用无血清的培养基洗涤，将含有所述质粒DNA和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中；
(4)4-6h后去掉培养基，添加含有10-15％FCS的培养基，静置1-4h。
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Denomination of invention: The invention relates to a cell membrane penetrating peptide and a preparation method and application thereof

Effective date of registration: 20211119

Granted publication date: 20200428

Pledgee: Bank of Hankou Limited by Share Ltd. Sales Department

Pledgor: TAIZE (WUHAN) BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

Registration number: Y2021420000127