JP2021532819A - 新規のcrispr関連タンパク質及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の態様において、メタゲノムから得られた新規のCas12aタンパク質が、提供される。
以降、本発明は、以下の例によってさらに詳細に記載される。しかしながら、以下の例は、単なる例示目的であり、本発明の範囲はそれに限定されない。
メタゲノムヌクレオチド配列をNCBI Genbank BLASTデータベースからダウンロードし、ローカルBLASTpデータベースを構築した。加えて、16個のCas12a及び様々なCRISPR関連タンパク質(Cas1)のアミノ酸配列を、Uniprotデータベースからダウンロードした。MetaCRTプログラムを使用して、メタゲノム中のCRISPR反復及びスペーサー配列を見いだした。次いで、CRISPR配列を有するメタゲノム配列だけを抽出し、その遺伝子を、Prodigalプログラムを使用して予測した。
Cas12a候補を、ESPriptプログラムを使用してAsCas12a及びLbCas12aの構造に基づいて整列させた。WT mgCas12a−1及びWT mgCas12a−2の場合、アミノ酸の部分の置換を作製し、そのエンドヌクレアーゼ活性を増大させた。925番目のアミノ酸Lys(K)をGlu(Q)で置換したWT mgCas12a−1を、mgCas12a−1と命名した。加えて、930番目のアミノ酸Lys(K)をGlu(Q)で置換したWT mgCas12a−2を、mgCas12a−2と命名した。得られたバリアントを、ヒト、シロイヌナズナ及び大腸菌のコドン使用頻度を考慮してコドン最適化に供し、次いで、その遺伝子合成をBionicsに依頼した。ここで、ヒトコドンに最適化したmgCas12a−1及びmgCas12a−2のヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号7及び配列番号8に示す。加えて、ESPriptプログラムを使用して整列させた既存のCas12a[AsCas12a(配列番号9)、LbCas12a(配列番号10)及びFnCas12a(配列番号11)]及びCas12a候補(mgCas12a−1及びmgCas12a−2)のアミノ酸配列を図3〜図8に例示し;その配列情報を比較及び要約することによって得た結果を、図9A及び図9Bに例示する。
終夜培養した大腸菌ロゼッタ(DE3)5mLを、100mg/mLカナマイシン抗生物質で補充した液体TB培地500mLに植菌した。培地を、OD600が0.6に達するまでインキュベーター内で、37℃で培養した。タンパク質発現のために、0.4μMイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)による処理を実行し、次いでさらなる培養を22℃で16〜18時間実行した。遠心分離後、得られた細胞を溶解緩衝液(20mM HEPES pH7.5、100mM KCl、20mMイミダゾール、10%グリセロール及びEDTA不含プロテアーゼ阻害剤カクテル)10mLと混合し、次いで超音波処理に供して細胞破砕した。破砕物を、それぞれ6000rpmで20分間、3回遠心分離し、0.22ミクロンフィルターによって次いで濾過した。
レタス(Lactuca sativa)のキシロシルトランスフェラーゼをPCRによって増幅してプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を予測し、その結果ガイドRNA(gRNA)を設計した。mgCas12a−1及びmgCas12a−2のリボ核タンパク質(RNP)複合体の場合、各mgCas12aタンパク質を、分子比1:1.25でgRNAと室温で20分間混合して各RNP複合体を作製した。精製したキシロシルトランスフェラーゼPCR産物を、様々な濃度でRNPによる処理に供した。次いで、濃度調整を、NEBuffer 1.1(1×緩衝液成分、10mM Bis−トリス−プロパン−HCl、10mM MgCl2及び100μg/mL BSA)、NEBuffer 2.1(1×緩衝液成分、50mM NaCl、10mMトリス−HCl、10mM MgCl2及び100μg/mL BSA)及びNEBuffer 3.1(1×緩衝液成分、100mM NaCl、50mMトリス−HCl、10mM MgCl2及び100μg/mL BSA)で行い、in vitro切断分析を37℃で実行した。ここで、NEBuffer 1.1、NEBuffer 2.1及びNEBuffer 3.1は、25℃でそれぞれpH7.0、pH7.9及びpH7.9値を有した。各反応が完了した後、反応を65℃で10分間のインキュベーションによって停止させ、完了した反応を1.5%アガロースゲル電気泳動法によって確認した。結果を図10〜図12に例示する。図10〜図12において、mgCas12a−1及びmgCas12a−2は、それぞれhemgCas12a−1及びhemgCas12a−2によって示される。加えて、キシロシルトランスフェラーゼ中の標的核酸配列及びcrRNAを結合する位置を図中に示し、この図を図13に例示する。
実施例5.動物細胞におけるmgCas12aの遺伝子編集効率の分析
実施例5.1.CCR5及びDNMT1の遺伝子編集のためのmgCas12a−1又はmgCas12a−2を含むRNPの作製
実施例5.1において抽出したゲノムDNAを、下の表2に示したCCR5又はDNMT1用のアダプタプライマーを使用して増幅させた。
実施例6.1.植物プロトプラストの単離
タバコ種子を、50% Cloroxによる1分間の処理によって殺菌した。殺菌した種子を種子発芽のために培地上に置き、1週間栽培した。次いで、種子を栽培に使用するマゼンタ色の箱に移し、3週間成長させた。使用した電照栽培条件は照明16時間及び暗闇8時間であり、種子を温度25℃〜28℃で成長させた。植物の場合、4〜6週間成長した葉を使用した。葉をガラスプレート上に置き、葉の内側部分だけを使用するように葉端及び柄をそこから切断した。ここで、葉を0.5mm又はより小さい断片に切断した。切断した葉断片を、酵素溶液10mL中に置き、室温で、暗所で、回転振とう機(50rpm)上で3〜4時間インキュベートした。
crRNA、mgCas12aタンパク質及びNEBuffer1.1を、最終容量20μLになるように2mL e管に添加し、次いで、反応を室温で10分間進行させた。実施例6.1において得たプロトプラスト200μL(5×105個細胞)並びに反応させたcrRNA及びmgCas12タンパク質(容積20μL)をe管(2mL)に添加し、よく混合し、クリーンベンチ内で10分間次いで培養した。その後、インキュベートした容積と同じ容積のPEG溶液220μLをそれに添加し、慎重に混合した。混合物を室温で15分間培養した。次いで、W5溶液840μLをそれに添加し、よく混合した。100xgで2分間遠心分離した後、上清を廃棄した。次いで、培養をW5溶液中で2日間実行した。次いで、細胞を採取し、DNAをそこから抽出した。
FnCas12a、WT mgCas12a−1又はWT mgCas12a−2タンパク質及びcrRNAからなる各リボ核タンパク質(RNP)複合体を形成するために、FnCas12a、WT mgCas12a−1又はWT mgCas12a−2タンパク質6pmol及びcrRNA 7.5pmolを、NEB1.1緩衝液及び1×蒸留水と室温で30分間混合した。crRNA依存的Cas12a(FnCas12a、WT mgCas12a−1又はWT mgCas12a−2)を使用してdsDNA切断活性を同定するために、標的dsDNA(直鎖状又は環状)0.3pmolをそれに添加し、次いで反応を37℃で2時間進行させた。ここで、HsCCR5、HsDNMT1及びHsEMX1を、DNAとして使用した。加えて、実験に使用した直鎖状DNA(配列番号27〜配列番号29)は、PCR精製した産物であり、環状DNA(配列番号30〜配列番号32)は、精製したプラスミドであった。SDS及びEDTA(ゲルローディング色素、NEB)をそれに添加し、次いで、混合物を−20℃で10分間貯蔵して反応を停止させた。各DNAを1%アガロースゲルにロードし、次いで電気泳動に供してFnCas12a、WT mgCas12a−1又はWT mgCas12a−2に起因するDNA切断活性を確認した。結果を、図16A(直鎖状DNA)及び図16B(環状DNA)に例示する。図16A及び図16Bにおいて、Sは基質を示し、ゲルの下に示した各数字は、基質DNAバンドがどの程度濃いかを示す。
Cas12a(AsCas12a、FnCas12a又はLbCas12a)及びmgCas12a(WT mgCas12a−1、d_mgCas12a−1、WTmgCas12a−2又はd_mgCas12a−2)のランダムなDNase機能を同定するために、実験を、実施例7と同じ様式で実行した。ここで、d−mgCas12a−1及びd_mgCas12a−2は、Asp(WT mgCas12a−1の877位又はWT mgCas12a−2の873位)のAlaによる置換によってWT mgCas12a−1及びWT mgCas12a−2からそれぞれ得られたタンパク質のことを指す。
Cas12aが、crRNAがなくてもFnCas12a、WT mgCas12a−1又はWT mgCas12a−2タンパク質に対してランダムなDNase機能を有するかどうか同定するために、実験を、crRNAを含まない条件を使用したことを除いて、実施例7と同じ様式で時間を変動させて実行した。結果を図18A及び図18Bに例示する。図18A及び図18Bに例示した通り、FnCas12a、WT mgCas12a−1又はWT mgCas12a−2タンパク質は、crRNAがなくても、ランダムなDNase機能を有し、中でもFnCas12aタンパク質のランダムなDNase機能が最初に現れた。
新たなCas12a(d_mgCas12a又はWT mgCas12a)が、既存のCas12a(AsCas12a、FnCas12a又はLbCas12a)配列の5’末端に位置するハンドルを使用してDNA切断を実行し得るかどうか同定するために、実験を、AsCas12a、FnCas12a又はLbCas12aのそれぞれのハンドルを使用したことを除いて、実施例7と同じ様式で反応時間を変動させて実行した。結果を図19に例示する。
加えて、二価イオン(CaCl2、CoCl2、CuSO4、FeCl2、MnSO4、NiSO4又はZnSO4)中でのFnCas12a、mgCas12a−1又はmgCas12a−2タンパク質のDNA切断活性を同定するために、実験を、予め定めた量の二価イオンをNEBuffer 1.1の代わりに使用したことを除いて、実施例4と同じ様式で実行した。結果を図20A及び図20Bに例示する。図20A及び図20Bに例示した通り、FnCas12a、mgCas12a−1又はmgCas12a−2タンパク質は、同じ二価イオン中で類似のDNA切断活性を呈した。
Claims (20)
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するCas12aタンパク質。
- 配列番号1の前記アミノ酸配列を有する前記Cas12aタンパク質が、配列番号2のヌクレオチド配列によってコードされている、請求項1に記載のCas12aタンパク質。
- 前記タンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項1に記載のCas12aタンパク質。
- 配列番号1の前記アミノ酸配列を有する前記Cas12aタンパク質が、pH7.0〜pH7.9で最適な活性を有する、請求項1に記載のCas12aタンパク質。
- 925位のリジン(Lys)が別のアミノ酸で置換されている、配列番号1のアミノ酸配列を有するCas12aタンパク質。
- 前記別のアミノ酸が、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、チロシン(Tyr)、アラニン(Ala)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、バリン(Val)、フェニルアラニン(Phe)、メチオニン(Met)、トリプトファン(Trp)、グリシン(Gly)、プロリン(Pro)及びシステイン(Cys)からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項5に記載のCas12aタンパク質。
- 配列番号3のアミノ酸配列を有するCas12aタンパク質。
- 配列番号3の前記アミノ酸配列を有する前記Cas12aタンパク質が、配列番号4のヌクレオチド配列によってコードされている、請求項7に記載のCas12aタンパク質。
- 前記タンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項7に記載のCas12aタンパク質。
- 配列番号3の前記アミノ酸配列を有する前記Cas12aタンパク質が、pH7.0〜pH7.9で最適な活性を有する、請求項7に記載のCas12aタンパク質。
- 930位のリジン(Lys)が別のアミノ酸で置換されている、配列番号3のアミノ酸配列を有するCas12aタンパク質。
- 前記別のアミノ酸が、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、チロシン(Tyr)、アラニン(Ala)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、バリン(Val)、フェニルアラニン(Phe)、メチオニン(Met)、トリプトファン(Trp)、グリシン(Gly)、プロリン(Pro)及びシステイン(Cys)からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項11に記載のCas12aタンパク質。
- 877位のアスパラギン酸(Asp)が別のアミノ酸で置換されている配列番号1のアミノ酸配列を有するCas12aタンパク質。
- 前記別のアミノ酸が、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)、グルタミン酸(Glu)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、チロシン(Tyr)、アラニン(Ala)、リジン(Lys)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、バリン(Val)、フェニルアラニン(Phe)、メチオニン(Met)、トリプトファン(Trp)、グリシン(Gly)、プロリン(Pro)及びシステイン(Cys)からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項13に記載のCas12aタンパク質。
- 前記タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性が低下している、請求項13に記載のCas12aタンパク質。
- 873位のアスパラギン酸(Asp)が別のアミノ酸で置換されている配列番号3のアミノ酸配列を有するCas12aタンパク質。
- 前記別のアミノ酸が、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)、グルタミン酸(Glu)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、チロシン(Tyr)、アラニン(Ala)、リジン(Lys)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、バリン(Val)、フェニルアラニン(Phe)、メチオニン(Met)、トリプトファン(Trp)、グリシン(Gly)、プロリン(Pro)及びシステイン(Cys)からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項16に記載のCas12aタンパク質。
- 前記タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性が低下している、請求項16に記載のCas12aタンパク質。
- 活性成分として:mgCas12a;及びがん細胞に特異的に存在する核酸配列を標的とするcrRNAを含む、がんを処置するための医薬組成物。
- 前記mgCas12aが、配列番号1、配列番号3、配列番号5及び配列番号6からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか1つを有する、請求項19に記載の医薬組成物。
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