TWI835719B - 經修飾之嚮導rna - Google Patents
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Abstract
本發明係關於經修飾之單嚮導及雙嚮導RNA，該等在基因編輯方法中具有提高之活體外及活體內活性。
Description
本發明係關於使用CRISPR/Cas系統進行基因編輯之領域，CRISPR/Cas是用以識別及切割外源性遺傳因子之原核生物免疫系統之一部分。CRISPR/Cas系統依賴於稱為CRISPR聯合蛋白質9(CRISPR-associated protein 9；Cas9)之單一核酸酶，其會在DNA中誘發位點特異性斷裂。Cas9被稱之為嚮導RNA(guide RNA；gRNA)的小RNA分子引導至特定DNA序列。嚮導RNA包含trRNA(亦稱為tracrRNA)及crisprRNA(crRNA)。trRNA及crRNA可包含於單嚮導RNA (sgRNA)內或雙嚮導RNA(dgRNA)之兩個獨立RNA分子中。Cas9並與trRNA及crRNA或sgRNA之組合係稱為Cas9核糖核蛋白複合物(ribonucleoprotein complex；RNP)。
寡核苷酸，且特定言之RNA有時會被核酸內切酶或核酸外切酶裂解在細胞及血清中降解。需要用於預防此類降解、改良gRNA之穩定性且增強基因編輯效率之改良方法及組合物，尤其用於治療應用。
在一些實施例中，提供包含經修飾之嚮導RNA的治療基因組編輯工具。本文所述的經修飾之嚮導RNA可改良嚮導RNA及嚮導RNA/Cas9複合物之穩定性，且改善Cas9(例如SpyCas9及等效物)裂解標靶DNA之活性。在一些實施例中，該嚮導RNA為sgRNA。在一些實施例中，該嚮導RNA為dgRNA。在一些實施例中，該嚮導RNA為tracrRNA。在一些實施例中，該嚮導RNA為crRNA。 本文所述的嚮導RNA包含至少一個經修飾核苷酸。該等修飾可包括2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)、2'-氟基(2'-F)、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵、G-C取代，及核苷酸之間的反向無鹼基鍵及其等等效物。本發明之實施例包括： 在一些實施例中，涵蓋單嚮導RNA (sgRNA)，其包含5'端修飾及以下中之一或多者中之一或多個修飾：上部莖區；髮夾1區；及髮夾2區，其中5'端修飾包含5'末端之5'端處前七個核苷酸內之至少兩個硫代磷酸酯鍵。在一些情況下，該修飾為經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，該修飾為經2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。 在一些實施例中，sgRNA包含US1至US12處之修飾及/或H1-1處之修飾及/或H2-1中之修飾。在一些實施例中，sgRNA包含H1-1至H1-12及/或H2-1至H2-15處之修飾。在一些實施例中，sgRNA包含上部莖區、髮夾1區及髮夾2區中每一者中之一或多個修飾。在一些實施例中，sgRNA包含髮夾1區與髮夾2區之間的經修飾之核苷酸。在一些實施例中，該sgRNA包含下部莖區中之修飾。 在一些實施例中，sgRNA包含5'末端及/或3'末端處之修飾。在一些實施例中，sgRNA包含3'末端中之3'端修飾。在一些實施例中，sgRNA包含3'末端之3'端處最後四個核苷酸中至少兩個的修飾。在一些實施例中，該sgRNA包含5'末端中之5'端修飾。在一些實施例中，sgRNA包含5'末端之5'端處前四個核苷酸中至少兩個的修飾。在一些實施例中，sgRNA包含3'末端中之3'端修飾及5'末端中之5'端修飾。在一些實施例中，sgRNA包含3'末端之3'端處最後四個核苷酸中至少兩個及5'末端之5'端處前四個核苷酸中至少兩個的修飾。在一些情況下，此等修飾為2'-O-Me、2'-F、2'-O-moe或鍵聯核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，sgRNA包含3'末端之3'端處最後四個核苷酸中至少兩個及/或5'末端之5'端處前四個核苷酸中至少兩個之間的PS鍵。在一些情況下，sgRNA包含具有超過一個如本文所述之修飾之5'末端及3'末端，該等修飾諸如PS鍵及2'-O-Me修飾。 在一些實施例中，sgRNA包含隆突區中之修飾。在一些實施例中，隆突區中50%的核苷酸經修飾，其中該修飾為2'-O-Me或2'-F。 在一些實施例中，sgRNA包含連接區(nexus region)中之修飾。在一些實施例中，sgRNA包含連接區中N15、N16、N17及/或N18處之修飾，其中該修飾為2'-O-Me或2'-F。在一些情況下，N16、N17及N18與PS鍵鍵聯。 在一些實施例中，sgRNA包含5'末端之5'端處至少前三個核苷酸及3'末端之3'端處最後三個核苷酸經修飾。 在一些實施例中，sgRNA包含3'末端及/或5'末端處之修飾。在一些情況下，5'末端之5'端處前四個核苷酸及3'末端之3'端處最後四個核苷酸與硫代磷酸酯(PS)鍵鍵聯。在一些實施例中，5'及3'修飾包含2'-O-Me或2'-O-moe。在一些實施例中，5'及3'修飾包含2'-F。在一些實施例中，5'及/或3'修飾包含鍵聯核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，5'及/或3'修飾包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F及鍵聯核苷酸之PS鍵中之一或多者。 在一些實施例中，sgRNA包含5'末端之5'端處前四個核苷酸及3'末端之3'端處最後四個核苷酸處之修飾。在一些情況下，此等修飾為鍵聯PS鍵(亦即鍵聯前四個及最後四個核苷酸之PS鍵)。在一些實施例中，sgRNA進一步包含5'末端之5'端處前三個核苷酸及3'末端之3'端處最後三個核苷酸處之2'-O-Me修飾。 在一些實施例中，sgRNA包含5'末端之5'端處之前四個核苷酸及3'末端之3'端處之最後四個核苷酸處之修飾，其中修飾至少為鍵聯四個核苷酸之PS鍵，且另外，其中5'末端之5'端處之前三個核苷酸及3'末端之3'端處之最後三個核苷酸包含2'-O-Me、2'-O-moe或2'-F修飾。 在一些實施例中，sgRNA包含修飾LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12，其中修飾為2'-O-Me或2'-F。 在一些實施例中，sgRNA包含隆突區中之核苷酸中之每一者處之修飾，其中該修飾為2'-O-Me或2'-F。 在一些實施例中，sgRNA包含上部莖區中之核苷酸中之每一者處之修飾，其中該修飾為2'-O-Me或2'-F。 在一些實施例中，sgRNA包含髮夾1區中之核苷酸中之每一者處之修飾，其中該修飾為2'-O-Me或2'-F。 在一些實施例中，sgRNA包含髮夾2區中之核苷酸中之每一者處之修飾，其中該修飾為2'-O-Me或2'-F。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含以下位置處之2'-O-Me修飾之核苷酸： a. 5'末端之5'端處之前三個核苷酸； b. 下部莖區中之LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及/或LS12； c. 隆突區中之B1及/或B2； d. 上部莖區中之各核苷酸； e. 連接區中之N16、N17及/或N18； f. 髮夾1區中之各核苷酸； g. 髮夾2區中之各核苷酸；及 h. 3'末端之3'端處之最後四個核苷酸。 在一些實施例中，B3至B6經2'-O-Me修飾。在一些情況下，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵，及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，sgRNA包含LS9及LS10處之2'-F修飾。在一些實施例中，sgRNA包含N15、N16、N17及N18處之2'F修飾。在一些實施例中，該sgRNA包含H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14及H2-15處之2'F修飾。在一些實施例中，sgRNA包含3'末端之3'端處之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸處之2'F修飾。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含以下位置處之2'-F修飾之核苷酸： a. 下部莖區中之LS9及LS10； b. 連接區中之N15、N16、N17及N18；及 c. 髮夾2區中之H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14及H2-15。 在一些實施例中，sgRNA包含3'末端處之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸處之2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵，及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，sgRNA包含5'末端之5'端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核苷酸及3'末端之3'端處之最後四個核苷酸中之三個處之2'-O-Me或2'-F修飾之核苷酸。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含： a. 5'末端之5'端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. LS1及/或LS6處之視情況存在之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. US至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； e. 髮夾1區與髮夾2區之間的視情況存在之2'-O-Me修飾之核苷酸； f. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 g. 3'末端之3'端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；且視情況 進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含： a. 5'末端之5'端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. LS1至LS6處之2'-F修飾之核苷酸； c. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； e. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； f. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 g. 3'末端之3'端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；且視情況 進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含： a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. LS2至LS5處之2'-F修飾之核苷酸； c. LS1及LS6處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； e. H1-1 - H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； f. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； g. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 h. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸，且視情況 進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含： a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. LS7、LS8、LS11及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； e. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； f. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 g. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸， 且視情況進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含： a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. LS7、LS8、LS11及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. LS9及LS10處之2'-F修飾之核苷酸； e. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； f. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； g. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 h. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸， 且視情況進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含： a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. LS8、LS10及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. LS7、LS9及LS11處之2'-O-F修飾之核苷酸； e. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； f. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； g. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 h. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸，且視情況 進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含： a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸 c. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； e. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； f. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 g. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸，且視情況 進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含： a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. LS9及LS10處之2'-F修飾之核苷酸； d. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； e. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； f. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； g. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 h. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸，且視情況 進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含： a. 5'末端之5'端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； e. H2-1至H2-8處之2'-O-Me修飾之核苷酸； f. H2-9至H2-15處之2'-F修飾之核苷酸； g. 3'末端處之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸處之2'-F修飾之核苷酸；及 h. 3'末端處之最後一個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸，且視情況 進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含： a. 5'末端之5'端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10及H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9及H1-11處之2'-F修飾之核苷酸； e. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-F修飾之核苷酸； f. H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14處之2'-F修飾之核苷酸； g. H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸； h. 3'末端處之倒數第二個及倒數第四個核苷酸處之2'-F修飾之核苷酸；及 i. 3'末端之3'端處之倒數第三個及最後一個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸， 且視情況進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含： a. LS8、LS10、LS12、H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10、H1-12、H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 b. LS7、LS9、LS11；H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9、H1-11、H1-13、H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14處之2'-F修飾之核苷酸，且視情況 進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵，及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵；且視情況進一步包含： c. 3'末端之3'端處之最後一個及倒數第三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及/或 d. 3'末端之3'端處之倒數第二個、倒數第四個及/或最後一個核苷酸處之2'-F修飾之核苷酸。 在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含SEQ ID No: 228至353中之任一者之核酸，包括表4之修飾。在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含SEQ ID No: 228至332中之任一者，包括表4之修飾。在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含SEQ ID No: 235至240、265至285及309至329中之任一者，包括表4之修飾。在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含SEQ ID No: 240。在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含SEQ ID No: 240，包括表4之修飾。在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含SEQ ID No: 242。在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含SEQ ID No: 358。在額外實施例中，sgRNA包含與SEQ ID No: 235至240、265至285及309至329中之任一者之核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核酸，其中對應於表4中之參考序列標識符之核苷酸之sgRNA之各核苷酸處之修飾與表4中之參考序列標識符中示出的修飾相同或等效，視情況進一步包含三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵，及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，sgRNA進一步包含至少三個鍵聯髮夾1區中之核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，sgRNA進一步包含至少三個鍵聯髮夾2區中之核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，sgRNA進一步包含至少三個鍵聯上部莖區中之核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，sgRNA與化膿性鏈球菌(S . pyogenes
)Cas9形成核糖核蛋白複合物。
序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式、以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。2017年12月7日創建的該ASCII複本命名為01155-0004-00PCT_SeqList.txt且大小為118,877位元組。 本申請案主張美國臨時申請案第62/431,756號之優先權，該臨時申請案申請於2016年12月8日，且其以全文引用的方式併入本文中。 本文提供用於基因編輯方法之經修飾之嚮導RNA，包括雙嚮導RNA及單嚮導RNA。經修飾之嚮導相比於其未經修飾之對應物更穩定且顯示改良之活體外及活體內功效。經工程改造及測試之嚮導RNA之序列顯示於表4中。表 4 ：
「嚮導RNA」及「gRNA」在本文中可互換地用於共同地指sgRNA、trRNA (亦稱為tracrRNA)或crRNA (亦稱為CRISPR RNA)。crRNA及trRNA可以聯合在一個RNA分子上(單嚮導RNA [sgRNA])或呈兩個獨立RNA分子(雙嚮導RNA [dgRNA])聯合。「嚮導RNA」或「gRNA」係指各類型。 trRNA序列可為天然存在的，或相比於天然存在的序列，trRNA序列可包括修飾或變化。 如本文所用之「編輯效率」或「編輯百分比」或「編輯%」為相比於藉由Cas RNP裂解之後的序列讀段總數之具有向所關注的目標區中之插入或缺失之序列讀段總數。 如本文所用之「髮夾」描述當核酸鏈摺疊且與相同鏈之另一部分形成鹼基對時產生之核酸環。髮夾可形成包含環或U-形之結構。在一些實施例中，髮夾可由RNA環組成。髮夾可由在單一核酸分子中結合在一起之兩個互補序列形成，伴以分子之摺疊或起皺。在一些實施例中，髮夾包含莖或莖環結構。 如本文所用之「區」描述保守核酸群組。區亦可稱為「模組」或「域」。gRNA之區可執行特定功能，例如導引RNP之核酸內切酶活性，例如如Briner AE 等人 , Molecular Cell 56 : 333 - 339 ( 2014 )
中所述。gRNA之區描述於表1-3中。 如本文所用之「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」描述gRNA，例如連同核酸酶，諸如Cas蛋白質。在一些實施例中，RNP包含Cas9及gRNA。 如本文所用之「莖環」描述形成結束於不成對核酸之環中之鹼基配對「莖」之核苷酸的二級結構。具有相同核酸鏈之兩個區在以相反方向讀取時，序列至少部分互補的情況下，可形成莖。如本文所用之「環」描述可能覆蓋莖之不鹼基配對(亦即不互補)之核苷酸之區。「四環」描述4個核苷酸之環。如本文所用，sgRNA之上部莖可包含四環。 在涉及dgRNA之某些實施例中，如本文所用之「莖」區描述在crRNA與trRNA之某些區(例如各RNA之下部與上部莖區)之間形成鹼基配對區之核苷酸的二級結構。dgRNA之「莖」區亦可在此項技術中稱作「旗桿」區。 如本文所用之「治療」涵蓋任何投與或施用用於個體之疾病的治療劑，且包括抑制疾病、遏制其發展、緩解疾病之一或多種症狀、治癒疾病或預防疾病之一或多種症狀的復發。 1. 修飾類型 A. 2'-O-甲基修飾 咸信經修飾之糖控制核苷酸糖環之起皺，該起皺為影響寡核苷酸對於互補鏈之結合親和力、雙螺旋形成及與核酸酶之相互作用的物理特性。糖環上之取代可因此改變此等糖之確認及起皺。舉例而言，2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾可增加寡核苷酸之結合親和力及核酸酶穩定性，儘管如實例中所示，寡核苷酸中之給定位置處之任何修飾的效應需要憑經驗確定。 術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」係用於指示已經2'-O-Me修飾之核苷酸。 2'-O-甲基核糖核苷酸形式之核糖核苷酸之修飾可如下描繪：B. 2'-O-(2-甲氧基乙基)修飾 在一些實施例中，修飾可為2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)。2'-O-moe核糖核苷酸形式之核糖核苷酸之修飾可如下描繪：術語「moeA」、「moeC」、「moeU」或「moeG」係用於指示已經2'-O-moe修飾之核苷酸。 C. 2'-氟基修飾 已顯示影響核苷酸糖環之另一化學修飾為鹵素取代。舉例而言，核苷酸糖環上之2'-氟基(2'-F)取代可增加寡核苷酸結合親和力及核酸酶穩定性。 在本申請案中，術語「fA」、「fC」、「fU」或「fG」係用於指示已經2'-F取代之核苷酸。 2'-F之取代可如下描繪：D. 硫代磷酸酯修飾 硫代磷酸酯(PS)鍵聯或鍵係指硫取代磷酸二酯鍵聯，例如核苷酸鹼基之間的鍵中之一個非橋聯磷酸酯氧的鍵。當硫代磷酸酯用於產生寡核苷酸時，經修飾之寡核苷酸亦可稱為S-寡核苷酸。 「*」係用於描繪PS修飾。在本申請案中，術語A*、C*、U*或G*係用於指示鍵聯至具有PS鍵之下一個(例如3')核苷酸之核苷酸。 在本申請案中，術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」係用於指示已經2'-O-Me取代且鍵聯至具有PS鍵之下一個(例如3')核苷酸之核苷酸。類似地，術語「fA*」、「fC*」、「fU*」或「fG*」係用於指示已經2'-F取代且鍵聯至具有PS鍵之下一個(例如3')核苷酸之核苷酸。本文所述之實施例涵蓋PS鍵聯或鍵之等效物。 下圖顯示將S-取代為非橋聯磷酸酯氧，產生PS鍵來替代磷酸二酯鍵：E. G-C取代 在一些實施例中，gRNAs經不包含化學修飾之序列取代修飾。在一些實施例中，經修飾之gRNA經未發現於親本gRNA序列中之G-C配對(例如在下部及/或上部莖區中)工程改造。在一些實施例中，經修飾之gRNA經未發現於親本gRNA序列中之G-U失配(「GU擺動(GU wobbles)」或失配之配對)工程改造。 F. 反向無鹼基修飾 無鹼基核苷酸是指缺乏含氮鹼基之彼等核苷酸。下圖描繪具有缺乏鹼基之無鹼基(亦稱為脫嘌呤)位點的寡核苷酸：反向鹼基係指具有自正常5'至3'鍵反向之鍵(亦即5'至5'鍵或3'至3'鍵)之彼等鹼基。舉例而言：無鹼基核苷酸可附接有反向鍵。舉例而言，無鹼基核苷酸可經由5'至5'鍵附接至末端5'核苷酸，或無鹼基核苷酸可經由3'至3'鍵附接至末端3'核苷酸。末端5'或3'核苷酸處之反向無鹼基核苷酸亦可稱作反向無鹼基端帽。在本申請案中，術語「invd」指示反向無鹼基核苷酸鍵。 以上修飾及其等效物包括在本文所述之實施例之範疇內。 2. 嚮導RNA組合物 本發明涵蓋包含嚮導RNA之組合物。在一些實施例中，嚮導RNA包含trRNA。在一些實施例中，嚮導RNA包含crRNA。在一些實施例中，嚮導RNA包含crRNA及trRNA。在一些實施例中，嚮導RNA在一個RNA分子上包含crRNA及trRNA作為sgRNA。在一些實施例中，嚮導RNA在兩個RNA分子上包含crRNA及trRNA作為dgRNA。在dgRNA中，兩個RNA分子可經由鹼基配對締合。 在一些實施例中，嚮導RNA包含5'末端區。在一些實施例中，嚮導RNA不包含5'末端區。在一些實施例中，5'末端區包含如關於sgRNA在Briner AE 等人 , Molecular Cell 56 : 333 - 339 ( 2014 )
中所述的「間隔」區(但在本文中適用於所有嚮導RNA)。在一些實施例中，5'末端區包含5'端修飾。具有或不具有間隔區之5'末端區可與crRNA、trRNA、sgRNA及/或dgRNA締合。間隔區在本文中且由其他文獻有時亦稱為「嚮導區」、「嚮導域」或「目標域」。如本文所用之「靶序列」係指嚮導區/域向其導引核酸酶以進行裂解之核酸的序列。在一些實施例中，spyCas9蛋白質可藉由存在於間隔區中之核苷酸，藉由嚮導區/域導向至靶核酸分子之靶序列。在一些實施例中，嚮導RNA不包含間隔區。 在一些實施例中，本文所述之嚮導RNA包含或由表4中示出的序列中之任一者組成。然而，應注意，當序列顯示嚮導/間隔區時，應認識到，組合物可包含或不包含此區。另外，涵蓋嚮導RNA，其包含表4中示出及藉由SEQ ID No在其中識別之序列中之任一者之修飾。亦即，核苷酸可相同或不同，但顯示之修飾模式可與表4之嚮導序列之修飾模式相同或類似。修飾模式包括gRNA或gRNA區(例如5'末端區、下部莖區、隆突區、上部莖區、連接區、髮夾1區、髮夾2區、3'末端區)之修飾之相對定位及標識。在一些實施例中，修飾模式含有表4之序列欄中示出的序列中之任一者，或經該序列之一或多個區之修飾的至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些實施例中，修飾模式與表4之序列欄中示出的序列中之任一者之修飾模式至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，修飾模式經表4中示出的序列之一或多個區，例如5'末端區、下部莖區、隆突區、上部莖區、連接區、髮夾1區、髮夾2區及/或3'末端區至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。舉例而言，在一些實施例中，涵蓋嚮導RNA，其中修飾模式與經5'末端區之序列之修飾模式至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋嚮導RNA，其中修飾模式經下部莖區至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋嚮導RNA，其中修飾模式經隆突區至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋嚮導RNA，其中修飾模式經上部莖區至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋嚮導RNA，其中修飾模式經連接區至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋嚮導RNA，其中修飾模式經髮夾1區至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋嚮導RNA，其中修飾模式經髮夾2區至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋嚮導RNA，其中修飾模式經3'末端區至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，修飾模式在0、1、2、3、4、5或6個核苷酸處不同於表4之序列，或此類序列之區(例如5'末端、下部莖、隆突、上部莖、連接、髮夾1、髮夾2、3'末端)的修飾模式。在一些實施例中，gRNA包含在0、1、2、3、4、5或6個核苷酸處不同於表4之序列之修飾的修飾。在一些實施例中，gRNA包含在0、1、2、3、4、5或6個核苷酸處不同於表4之序列之區(例如5'末端、下部莖、隆突、上部莖、連接、髮夾1、髮夾2、3'末端)之修飾的修飾。 在一些實施例中，gRNA包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，gRNA包含2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾之核苷酸。在一些實施例中，gRNA包含2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，gRNA包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。 在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾、3'端修飾或5'及3'端修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，5'端修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)及/或2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含至少一個硫代磷酸酯(PS)鍵及2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)及/或2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸中之一或多者。端修飾可包含硫代磷酸酯(PS)、2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)及/或2'-氟基(2'-F)修飾。本文所述之實施例亦涵蓋等效端修飾。在一些實施例中，gRNA包含與gRNA之一或多個區之修飾組合之端修飾。 A. sgRNA之組合物 在一些實施例中，本發明之組合物及方法包含gRNA，其包含將諸如Cas9之核酸酶導引至標靶DNA序列之crRNA及trRNA。在一些實施例中，本文所述之gRNA可聯合在一個RNA分子上(單嚮導RNA或sgRNA)。 在一些實施例中，本發明包含sgRNA，其包含或由SEQ ID No: 228至332中所述之序列中之任一者組成。 在一些實施例中，提供包含SEQ ID No: 235至240、265至285及309至329之經修飾序列中之任一者之sgRNA。在一些實施例中，涵蓋sgRNA，其包含SEQ ID No: 235至240、265至285及309至329之經修飾序列中之任一者，其中sgRNA進一步包含與靶序列互補之5'「間隔」序列(「嚮導序列」)，且將Cas9導引至其標靶以進行裂解。在一些情況下，本發明包含sgRNA，其包含與SEQ ID No: 235至240、265至285及309至329中之任一者之核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核酸，其中修飾模式與參考序列標識符中示出的修飾模式相同。 1. sgRNA之域Briner AE 等人
,Molecular Cell
56:333-339 (2014)描述在本文中稱為「域」之sgRNA之功能域，包括負責定向之「間隔」域、「下部莖」、「隆突」、「上部莖」(其可包括四環)、「連接」及「髮夾1」及「髮夾2」域。參見Briner等人，第334頁，圖1A。表 1
及圖21A提供如本文所用之sgRNA之域的描述。在表1中，區之間的「n」表示核苷酸的可變數目，例如0到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。在一些實施例中，n等於0。在一些實施例中，n等於1。表 1 ： sgRNA 之區 ( 線性查看 ， 5 ' 至 3 ')
(下文繼續)
a) 5'末端區 在一些實施例中，sgRNA包含如表1中所示之5'末端處之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA之5'末端包含用以將Cas蛋白質導引至靶核苷酸序列之間隔區或嚮導區。在一些實施例中，5'末端不包含間隔區或嚮導區。在一些實施例中，5'末端包含間隔子及不用以將Cas蛋白質導引至靶核苷酸區之額外核苷酸。 在一些實施例中，嚮導區包含sgRNA之5'端處之前1至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。在一些實施例中，嚮導區包含20個核苷酸。在一些實施例中，嚮導區可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個或超過25個核苷酸。在一些實施例中，嚮導區可包含17個核苷酸。在一些實施例中，嚮導區可包含18個核苷酸。在一些實施例中，嚮導區可包含19個核苷酸。 在一些實施例中，嚮導區之選擇係基於用於編輯之相關基因內之靶序列而判定。舉例而言，在一些實施例中，sgRNA包含與相關基因之靶序列互補的嚮導區。 在一些實施例中，相關基因中之靶序列可與sgRNA之嚮導區互補。在一些實施例中，sgRNA之嚮導區與相關基因中之其對應靶序列之間的互補性或一致性程度可為約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，sgRNA之嚮導區與相關基因之目標區可100%互補或一致。在其他實施例中，sgRNA之嚮導區及相關基因之目標區可含有至少一個失配。舉例而言，sgRNA之嚮導區及相關基因之靶序列可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個失配，其中靶序列之總長度為至少約17、18、19、20或超過20個鹼基對。在一些實施例中，sgRNA之嚮導區及相關基因之目標區可含有1至6個失配，其中嚮導序列包含至少約17、18、19、20或超過20個核苷酸。在一些實施例中，sgRNA之嚮導區及相關基因之目標區可含有1、2、3、4、5或6個失配，其中嚮導序列包含約20個核苷酸。5'末端可包含不視為嚮導區(亦即不用以將cas9蛋白質導引至靶核酸)之核苷酸。 b) 下部莖區 在一些實施例中，sgRNA包含當線性地查看時，由隆突區及上部莖區分離之下部莖(LS)區。參見表1。 在一些實施例中，下部莖區包含1至12個核苷酸，例如在一個實施例中，下部莖區包含LS1至LS12。在一些實施例中，下部莖區包含比表1及圖21A中所示出少的核苷酸。在一些實施例中，下部莖區包含比表1及圖21A中所示出多的核苷酸。當下部莖區包含比表1及圖21A之示意圖中所示出少或多的核苷酸時，應維持如將為熟習此項技術者顯而易見之修飾模式。 在一些實施例中，當以相反方向讀取時，下部莖區具有核酸序列互補之核苷酸。在一些實施例中，下部莖區之核酸序列中之互補性產生sgRNA中之莖之二級結構(例如該等區可彼此鹼基配對)。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，下部莖區可不彼此完全互補。 c) 隆突區 在一些實施例中，sgRNA包含隆突區，其包含六個核苷酸B1至B6。當線性地查看時，隆突區分為兩個區。參見表1。在一些實施例中，隆突區包含六個核苷酸，其中前兩個核苷酸之後為上部莖區，接著為隆突區之後四個核苷酸。在一些實施例中，隆突區包含比表1及圖21A中所示出少的核苷酸。在一些實施例中，隆突區包含比表1及圖21A中所示出多的核苷酸。當隆突區包含比表1及圖21A之示意圖中所示出少或多的核苷酸時，應維持如將為熟習此項技術者顯而易見之修飾模式。 在一些實施例中，隆突區之存在導致sgRNA中之上部與下部莖模組之間的定向扭結。 d) 上部莖區 在一些實施例中，sgRNA包含上部莖區，其包含12個核苷酸。在一些實施例中，上部莖區包含環序列。在一些情況下，環為四環(由四個核苷酸組成之環)。 在一些實施例中，上部莖區包含比表1及圖21A中所示出少的核苷酸。在一些實施例中，上部莖區包含比表1及圖21A中所示出多的核苷酸。當上部莖區包含比表1及圖21A之示意圖中所示出少或多的核苷酸時，應維持如將為熟習此項技術者顯而易見之修飾模式。 在一些實施例中，當以相反方向讀取時，上部莖區具有核酸序列互補之核苷酸。在一些實施例中，上部莖區之核酸序列中之互補性產生sgRNA中之莖之二級結構(例如該等區可彼此鹼基配對)。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，上部莖區可不彼此完全互補。 e) 連接區 在一些實施例中，sgRNA包含位於下部莖區與髮夾1區之間的連接區。在一些實施例中，連接區包含18個核苷酸。在一些實施例中，連接區包含如表1及圖21A中所示之核苷酸N1至N18。 在一些實施例中，連接區包含比表1及圖21A中所示出少的核苷酸。在一些實施例中，連接區包含比表1及圖21A中所示出多的核苷酸。當連接區包含比表1及圖21A之示意圖中所示出少或多的核苷酸時，應維持如將為熟習此項技術者顯而易見之修飾模式。 在一些實施例中，當以相反方向讀取時，連接區具有核酸序列互補之核苷酸。在一些實施例中，核酸序列中之互補性產生sgRNA中之莖及/或莖環之二級結構(例如連接區中之某些核苷酸可彼此鹼基配對)。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，連接區可不彼此完全互補。 f) 髮夾區 在一些實施例中，sgRNA包含一或多個髮夾區。在一些實施例中，髮夾區在連接區下游(例如相對於其為3')。在一些實施例中，將緊鄰連接區下游之核苷酸之區稱為「髮夾1區」或「H1」。在一些實施例中，將相對於髮夾1為3'之核苷酸之區稱為「髮夾2區」或「H2」。在一些實施例中，髮夾區包含髮夾1區及髮夾2區。在一些實施例中，sgRNA僅包含髮夾1區或髮夾2區。 在一些實施例中，髮夾1區包含12個緊鄰連接區下游之核酸。在一些實施例中，髮夾1區包含如表1及圖21A中所示之核苷酸H1-1至H1-12。 在一些實施例中，髮夾2區包含15個髮夾1區下游之核酸。在一些實施例中，髮夾2區包含如表1及圖21A中所示之核苷酸H2-1至H2-15。 在一些實施例中，一或多個核苷酸存在於髮夾1區與髮夾2區之間。髮夾1區與髮夾2區之間的一或多個核苷酸可經修飾或未經修飾。在一些實施例中，髮夾1區與髮夾2區藉由一個核苷酸分離。在一些實施例中，髮夾區包含比表1及圖21A中所示出少的核苷酸。在一些實施例中，髮夾區包含比表1及圖21A中所示出多的核苷酸。當髮夾區包含比表1及圖21A之示意圖中所示出少或多的核苷酸時，應維持如將為熟習此項技術者顯而易見之修飾模式。 在一些實施例中，當以相反方向讀取時，髮夾區具有核酸序列互補之核苷酸。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，髮夾區可不彼此完全互補(例如髮夾區之頂部或環包含不成對核苷酸)。 在一些實施例中，sgRNA包含經核苷酸「n」置換髮夾1區，其中「n」為1與50、40、30、20、15、10、5、4、3及2之間的整數。在一些實施例中，sgRNA之髮夾1區經2個核苷酸置換。 g) 3'末端區 在一些實施例中，sgRNA包含髮夾區之後的核苷酸。在一些實施例中，3'末端區包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個或超過20個核苷酸，例如不與髮夾區之二級結構締合。在一些實施例中，3'末端區包含1、2、3或4個不與髮夾區之二級結構締合之核苷酸。在一些實施例中，3'末端區包含4個不與髮夾區之二級結構締合之核苷酸。在一些實施例中，3'末端區包含1、2或3個不與髮夾區之二級結構締合之核苷酸。 2. sgRNA之修飾 在一些實施例中，本發明包含sgRNA，其包含以下區中之一或多者內之一或多個修飾：5'末端處之核苷酸；下部莖區；隆突區；上部莖區；連接區；髮夾1區；髮夾2區；及3'末端處之核苷酸。 在一些實施例中，修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包含2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包含2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。 在一些實施例中，sgRNA包含其5'端處之前4個核苷酸中之1、2、3或4個處之修飾。在一些實施例中，5'末端處之前三個或四個核苷酸，及3'末端處之最後三個或四個核苷酸經修飾。在一些實施例中，5'末端處之前四個核苷酸，及3'末端處之最後四個核苷酸與硫代磷酸酯(PS)鍵鍵聯。在一些實施例中，修飾包含2'-O-Me。在一些實施例中，修飾包含2'-F。在一些實施例中，修飾包含2'-O-moe。 在一些實施例中，sgRNA包含5'端處之前4個核苷酸中之1、2、3或4個處之修飾。在一些實施例中，sgRNA包含3'端處之前4個核苷酸中之1、2、3或4個處之修飾。在一些實施例中，5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-O-Me或2'-O-moe修飾。 在一些實施例中，5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-F修飾。 在一些實施例中，提供sgRNA，其中LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，sgRNA之隆突區中之核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，sgRNA之上部莖區中之核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，sgRNA之連接區中之N16、N17及N18經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，sgRNA之髮夾1區中之核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，sgRNA之髮夾2區中之核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾。 在一些實施例中，sgRNA包含以下核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸：5'末端處之前三個核苷酸；LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12；隆突區中之B1及B2；sgRNA之上部莖區中之核苷酸中之每一者；連接區中之N16、N17及N18；髮夾1區中之核苷酸中之每一者；髮夾2區中之核苷酸中之每一者；及3'末端處之最後四個核苷酸。 在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，sgRNA進一步包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核酸，及3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核酸。在一些實施例中，LS9及LS10經2'-F修飾。在一些實施例中，N15、N16、N17及N18經2'-F修飾。在一些實施例中，H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、HS-14及H2-15經2'-F修飾。在一些實施例中，3'末端處之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸經2'-F修飾。 在一些實施例中，提供包含以下核苷酸處之2'-F修飾之核酸的單嚮導RNA (sgRNA)：下部莖區中之LS9及LS10；連接區中之N15、N16、N17及N18；以及髮夾2區中之H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、HS-14及H2-15。在一些實施例中，sgRNA進一步包含3'末端處之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸處之2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，sgRNA進一步包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核酸，及3'末端處之最後四個核苷酸中之三個處之2'-O-Me或2'-F修飾之核酸。 在一些實施例中，提供單嚮導RNA (sgRNA)，其包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；LS1及LS6處之2'-O-Me修飾之核苷酸；US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸；H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，提供單嚮導RNA (sgRNA)，其包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；LS1至LS6處之2'-F修飾之核苷酸；US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H1-1至 H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；髮夾1區與髮夾2區之間的「n」處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，提供單嚮導RNA (sgRNA)，其包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；LS2至LS5處之2'-F修飾之核苷酸；LS1及LS6處之2'-O-Me修飾之核苷酸；US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；髮夾1區與髮夾2區之間的「n」處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，提供單嚮導RNA (sgRNA)，其包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；LS7、LS8、LS11及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；髮夾1區與髮夾2區之間的「n」處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，提供單嚮導RNA (sgRNA)，其包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；LS8、LS10及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；LS7、LS9及LS11處之2'-O-F修飾之核苷酸；H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸；H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，提供單嚮導RNA (sgRNA)，其包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸；H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，提供單嚮導RNA (sgRNA)，其包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；LS9及LS10處之2'-F修飾之核苷酸；US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸；H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，提供單嚮導RNA (sgRNA)，其包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸；H2-1至H2-8處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H2-9至H2-15處之2'-F修飾之核苷酸；3'末端處之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸處之2'-F修飾之核苷酸；及3'末端處之最後一個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，提供單嚮導RNA (sgRNA)，其包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10及H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9及H1-11處之2'-F修飾之核苷酸；髮夾1區與髮夾2區之間的2'-F修飾之核苷酸；H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14處之2'-F修飾之核苷酸；H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；3'末端處之倒數第二個及倒數第四個核苷酸處之2'-F修飾之核苷酸；及3'末端處之倒數第三個及最後一個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，本文揭示單嚮導RNA (sgRNA)，其包含核苷酸LS8、LS10、LS12、H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10、H1-12、H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15處之2'-O-Me修飾；及LS7、LS9、LS11；H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9、H1-11、H1-13、H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14處之2'-F修飾。在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，sgRNA進一步包含3'末端處之最後一個及倒數第三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及3'末端處之倒數第二個及倒數第三個核苷酸處之2'-F修飾之核苷酸。 在一些實施例中，本文揭示包含SEQ ID No: 228至232中之任一者之核酸的sgRNA。在一些實施例中，本文揭示包含SEQ ID No: 235至240、265至285及309至329中之任一者之核酸的sgRNA。在一些實施例中，本文揭示sgRNA，其包含與SEQ ID No: 235至240、265至285及309至329中之任一者之核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核酸，其中修飾模式與參考序列標識符中示出的修飾模式相同。在一些實施例中，sgRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些實施例中，提供sgRNA，其包含5'端修飾及以下中之一或多者中之一或多個修飾：上部莖區；髮夾1區；及髮夾2區，其中5'端修飾包含5'末端之前七個核苷酸內之至少兩個硫代磷酸酯鍵。 在一些實施例中，提供sgRNA，其包含5'端修飾及以下中之一或多者中之一或多個修飾：上部莖區；髮夾1區；及髮夾2區，其中5'端修飾包含RNA之5'端處之一或多個硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，一或多個硫代磷酸酯鍵鍵聯5'末端核苷酸。 在一些實施例中，提供sgRNA，其包含5'端修飾及以下中之一或多者中之一或多個修飾：上部莖區；髮夾1區；及髮夾2區，其中5'端修飾包含5'末端之前七個核苷酸內之一或多個硫代磷酸酯鍵。 在一些實施例中，提供sgRNA，其包含SEQ ID No: 228至332之經修飾sgRNA序列中之任一者。 在一些實施例中，提供sgRNA，其包含或由SEQ ID No: 235至240、265至285及309至329之經修飾sgRNA序列中之任一者組成。 在一些實施例中，本發明包含sgRNA，其包含SEQ ID No: 235至240、265至285及309至329之經修飾序列中之任一者，其中sgRNA進一步包含與靶序列至少部分互補之5'間隔序列，且將Cas9導引至其標靶以進行裂解。 在一些實施例中，本發明包含sgRNA，其包含與SEQ ID No: 235至240、265至285及309至329中之任一者之核苷酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核苷酸，其中修飾模式與參考序列標識符中示出的修飾模式相同。亦即，相比於序列中所示出的，核苷酸A、U、C及G可相差99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%，但修飾保持不變。 在一些實施例中，本發明包含sgRNA，其包含以下區中之一或多者內之一或多個修飾：5'末端處之核苷酸；下部莖區；隆突區；上部莖區；連接區；髮夾1區；髮夾2區；及3'末端處之核苷酸。 在一些實施例中，修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包含2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，修飾包含反向無鹼基核苷酸。 在一些實施例中，提供sgRNA，其包含以下處之2'-O-Me修飾之核苷酸：5'末端區中之前三個核苷酸；下部莖區中之LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12；隆突區中之B1及B2；上部莖區中之核苷酸中之每一者；連接區中之N16、N17及N18；髮夾1區中之核苷酸中之每一者；髮夾1區與髮夾2區之間的一個核苷酸；髮夾2區中之核苷酸中之每一者；及3'末端處之最後四個核苷酸。在一個實施例中，sgRNA進一步包含5'末端處之前四個核苷酸之間的三個PS鍵及3'末端處之最後四個核苷酸之間的三個PS鍵。 在一些實施例中，提供sgRNA，其包含以下處之2'-O-Me修飾之核苷酸：5'末端區中之前三個核苷酸；下部莖區中之LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12；隆突區中之B1至B6；上部莖區中之核苷酸中之每一者；連接區中之N16、N17及N18；髮夾1區中之核苷酸中之每一者；髮夾1區與髮夾2區之間的一個核苷酸；髮夾2區中之核苷酸中之每一者；及3'末端處之最後四個核苷酸。在一個實施例中，sgRNA進一步包含5'末端處之前四個核苷酸之間的三個PS鍵及3'末端處之最後四個核苷酸之間的三個PS鍵。 在一些實施例中，提供sgRNA，其包含以下處之2'-F修飾之核苷酸：下部莖區中之LS9及LS10；連接區中之15-N18；髮夾2區中之H2-9至HS-15；及3'末端區中之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸。 在一些實施例中，提供sgRNA，其包含以下處之2'-F修飾之核苷酸：下部莖區中之各核苷酸；連接區中之15-N18；髮夾2區中之H2-9至HS-15；及3'末端區中之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸。 在一些實施例中，提供單嚮導RNA (sgRNA)，其包含LS8、LS10、LS12、H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10、H1-12、H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13、H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸，及3'末端之最後一個及倒數第三個核苷酸；以及LS7、LS9、LS11；H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9、H1-11、H1-13、H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12、H2-14處之2'-F修飾，及3'末端處之倒數第二個及倒數第四個核苷酸。 本發明涵蓋以下實施例中之每一者： 實施例01. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含以下區中之一或多者中之一或多個修飾： a. 5'末端； b. 下部莖區； c. 隆突區； d. 上部莖區； e. 連接區； f. 髮夾1區； g. 髮夾2區；及 h. 3'末端。 實施例02. 如實施例1之sgRNA，其中該修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。 實施例03. 如實施例1之sgRNA，其中該修飾包含2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。 實施例04. 如實施例1之sgRNA，其中該修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。 實施例05. 如實施例1至3中任一項之sgRNA，其中5'末端處之前三個或四個核苷酸，及3'末端處之最後三個或四個核苷酸經修飾。 實施例06. 如實施例1至5中任一項之sgRNA，其中5'末端處之前四個核苷酸，及3'末端處之最後四個核苷酸與硫代磷酸酯(PS)鍵鍵聯。 實施例07. 如實施例5之sgRNA，其中該修飾包含2'-O-Me。 實施例08. 如實施例5之sgRNA，其中該修飾包含2'-F。 實施例09. 如實施例1至7中任一項之sgRNA，其中5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-O-Me修飾。 實施例10. 如實施例1至8中任一項之sgRNA，其中5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-F修飾。 實施例11. 如實施例1至10中任一項之sgRNA，其中LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12經2'-O-Me修飾。 實施例12. 如實施例1至11中任一項之sgRNA，其中隆突區中之核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾。 實施例13. 如實施例1至12中任一項之sgRNA，其中上部莖區中之核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾。 實施例14. 如實施例1至13中任一項之sgRNA，其中連接區中之N16、N17及N18經2'-O-Me修飾。 實施例15. 如實施例1至14中任一項之sgRNA，其中髮夾1區中之核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾。 實施例16. 如實施例1至15中任一項之sgRNA，其中髮夾2區中之核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾。 實施例17. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含以下核苷酸處之2'-O-Me修飾之核酸： a. 5'末端處之前三個核苷酸； b. 下部莖區中之LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12； c. 隆突區中之B1及B2； d. 上部莖區中之各核苷酸； e. 連接區中之N16、N17及N18； f. 髮夾1區中之各核苷酸； g. 髮夾2區中之各核苷酸；及 h. 3'末端處之最後四個核苷酸。 實施例18. 如實施例17之sgRNA，其中B3至B6經2'-O-Me修飾。 實施例19. 如實施例17之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例20. 如實施例1至10中任一項之sgRNA，其中LS9及LS10經2'-F修飾。 實施例21. 如實施例1至10及20中任一項之sgRNA，其中N15、N16、N17及N18經2'-F修飾。 實施例22. 如實施例1至10及20至21中任一項之sgRNA，其中H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14及H2-15經2'-F修飾。 實施例23. 如實施例1至10及21至22中任一項之sgRNA，其中3'末端處之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸經2'-F修飾。 實施例24. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含以下位置處之2'-F修飾之核苷酸： a. 下部莖區中之LS9及LS10； b. 連接區中之N15、N16、N17及N18；及 c. 髮夾2區中之H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14及H2-15。 實施例25. 如實施例24之sgRNA，其進一步包含3'末端處之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸處之2'-F修飾之核苷酸。 實施例26. 如實施例24或25中任一項之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例27. 如實施例24至26中任一項之sgRNA，其進一步包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核苷酸，及3'末端處之最後四個核苷酸中之三個處之2'-O-Me或2'-F修飾之核苷酸。 實施例28. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含 a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. LS1及LS6處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； e. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； f. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 g. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。 實施例29. 如實施例28之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例30. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含 a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. LS1至LS6處之2'-F修飾之核苷酸； c. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； e. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； f. H2-1至 H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 g. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。 實施例31. 如實施例30之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例32. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含 a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. LS2至LS5處之2'-F修飾之核苷酸； c. LS1及LS6處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； e. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； f. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； g. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 h. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。 實施例33. 如實施例32之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例34. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含 a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. LS7、LS8、LS11及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； e. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； f. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 g. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。 實施例35. 如實施例34之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例36. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含 a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. LS7、LS8、LS11及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. LS9及LS10處之2'-F修飾之核苷酸； e. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； f. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； g. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 h. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。 實施例37. 如實施例36之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例38. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含 a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. LS8、LS10及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. LS7、LS9及LS11處之2'-O-F修飾之核苷酸； e. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； f. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； g. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 h. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。 實施例39. 如實施例32之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例40. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含 a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸 c. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； e. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； f. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 g. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。 實施例41. 如實施例40之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例42. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含 a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. LS9及LS10處之2'-F修飾之核苷酸； d. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； e. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； f. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； g. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 h. 3'末端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。 實施例43. 如實施例43之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例44. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含 a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-O-Me修飾之核苷酸； e. H2-1至H2-8處之2'-O-Me修飾之核苷酸； f. H2-9至H2-15處之2'-F修飾之核苷酸； g. 3'末端處之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸處之2'-F修飾之核苷酸；及 h. 3'末端處之最後一個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。 實施例45. 如實施例44之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例46. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含 a. 5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸； b. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； c. H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10及H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸； d. H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9及H1-11處之2'-F修飾之核苷酸； e. 髮夾1區與髮夾2區之間的2'-F修飾之核苷酸； f. H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14處之2'-F修飾之核苷酸； g. H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸； h. 3'末端處之倒數第二個及倒數第四個核苷酸處之2'-F修飾之核苷酸；及 i. 3'末端處之倒數第三個及最後一個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。 實施例47. 如實施例46之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例48. 一種單嚮導RNA (sgRNA)，其包含 a. LS8、LS10、LS12、H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10、H1-12、H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 b. LS7、LS9、LS11；H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9、H1-11、H1-13、H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14處之2'-F修飾之核苷酸。 實施例49. 如實施例48之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例50. 如實施例48至49中任一項之sgRNA，其進一步包含 a. 3'末端處之最後一個及倒數第三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及 b. 3'末端處之倒數第二個及倒數第三個核苷酸處之2'-F修飾之核苷酸。 實施例51. 一種sgRNA，其包含SEQ ID No: 228至332中之任一者之核酸。 實施例52. 一種sgRNA，其包含SEQ ID No: 235至240、265至285及309至329中之任一者之核酸。 實施例53. 一種sgRNA，其包含與SEQ ID No: 235至240、265至285及309至329中之任一者之核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核酸，其中修飾模式與參考序列標識符中示出的修飾模式相同。 實施例54. 如實施例51至53中任一項之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 B. dgRNA之組合物 在一些實施例中，本發明之組合物及方法包含gRNA，其包含將諸如Cas9之核酸酶導引至標靶DNA序列之crRNA及trRNA。在一些實施例中，gRNA締合，但在兩個獨立RNA分子上(雙嚮導RNA或dgRNA)。表 2
及圖21C提供如本文所用之crRNA之域的描述。5'末端區可包含crRNA之5'末端處或附近之間隔區且用以將Cas9導引至DNA中之目標區，例如如本文所述。在表2中，區之間的「n」表示核苷酸的可變數目，例如0到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。在一些實施例中，n等於0。本文所述之dgRNA中之任一者可包括任何域之間的「n」。表 3
及圖21C提供如本文所用之trRNA之域的描述。在表3中，區之間的「n」表示核苷酸的可變數目，例如0到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。在一些實施例中，n等於0。本文所述之dgRNA中之任一者可包括任何域之間的「n」。 1. dgRNA之域 如Briner 2014
中所述，dgRNA可基於在本文中稱為「域」之特定功能域，包括負責定向之間隔域、下部莖、隆突、上部莖、連接及髮夾域開發。在dgRNA中，crRNA包含gRNA之一些組分且trRNA包含gRNA之一些組分。 crRNA之區提供於表 2
及圖 21C
中。trRNA之區提供於表 3
及圖 21C
中。圖21C顯示例示性dgRNA之示意圖。表 2 ： crRNA 之區 ( 線性查看 ， 5 ' 至 3 ') 表 3 ： trRNA 之 區 ( 線性查看 ， 5 ' 至 3 ')
a) 5'末端區 在一些實施例中，dgRNA包含如表2-3及圖21C中所示之crRNA及trRNA之5'末端處之核苷酸。 在一些實施例中，crRNA之5'末端包含用以將Cas蛋白質導引至標靶核苷酸序列之間隔區或嚮導區。在一些實施例中，5'末端不包含間隔區或嚮導區。在一些實施例中，5'末端包含間隔子及不用以將Cas蛋白質導引至靶核苷酸區之額外核苷酸。 在一些實施例中，嚮導區包含crRNA之5'端之前1至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。在一些實施例中，嚮導區包含20個核苷酸。在一些實施例中，嚮導區可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個或超過25個核苷酸。在一些實施例中，嚮導區可包含17個核苷酸。在一些實施例中，嚮導區可包含18個核苷酸。在一些實施例中，嚮導區可包含19個核苷酸。 在一些實施例中，嚮導區之選擇係基於用於編輯之相關基因內之靶序列而判定。舉例而言，在一些實施例中，crRNA包含與相關基因之靶序列互補的嚮導區。 在一些實施例中，相關基因中之靶序列可與crRNA之嚮導區互補。在一些實施例中，crRNA之嚮導區與相關基因中之其對應靶序列之間的互補性或一致性程度可為約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，crRNA之嚮導區與相關基因之目標區可100%互補或一致。在其他實施例中，crRNA之嚮導區及相關基因之目標區可含有至少一個失配。舉例而言，crRNA之嚮導區及相關基因之靶序列可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個失配，其中靶序列之總長度為至少約17、18、19、20或超過20個鹼基對。在一些實施例中，crRNA之嚮導區及相關基因之目標區可含有1至6個失配，其中嚮導序列包含至少約17、18、19、20或超過20個核苷酸。在一些實施例中，crRNA之嚮導區及相關基因之目標區可含有1、2、3、4、5或6個失配，其中嚮導序列包含約20個核苷酸。 在一些實施例中，trRNA包含5'末端區。在一些實施例中，trRNA包含部分形成dgRNA之上部莖區之5'末端區。trRNA之5'末端區不與靶基因之區互補。 b) 下部莖區 在一些實施例中，dgRNA包含下部莖(LS)區。下部莖區包含如圖21C中所描繪地締合之crRNA下部莖區及trRNA下部莖區。在一些實施例中，crRNA之下部莖區與trRNA之下部莖區至少部分互補。在一些實施例中，crRNA之下部莖區與trRNA之下部莖區完全互補。 在一些實施例中，crRNA及trRNA之下部莖區各自包含6個核苷酸。在一些實施例中，crRNA及trRNA之下部莖區各自包含比表2及3及圖21C中所示出少的核苷酸。在一些實施例中，下部莖區包含比表2及3及圖21C中所示出多的核苷酸。當下部莖區包含比表2及3及圖21C之示意圖中所示出少或多的核苷酸時，維持如將為熟習此項技術者顯而易見之修飾模式。在一些實施例中，crRNA之下部莖區中之核苷酸的數目不同於trRNA之下部莖區中之核苷酸的數目。 c) 隆突區 在一些實施例中，dgRNA包含隆突(B)區。在一些實施例中，crRNA包含一個隆突區且trRNA包含一個隆突區。在一些實施例中，各隆突區包含1至4個核苷酸。在一些實施例中，crRNA之隆突區包含兩個核苷酸，且trRNA之隆突區包含四個核苷酸。 在一些實施例中，crRNA隆突區位於crRNA之下部莖區與上部莖區之間。在一些實施例中，crRNA之隆突區包含兩個核苷酸。在一些實施例中，crRNA之隆突區包含如表2及圖21C所示之核苷酸B1及B2。 在一些實施例中，trRNA隆突區位於trRNA之上部莖區與下部莖區之間。在一些實施例中，trRNA之隆突區包含四個核苷酸。在一些實施例中，trRNA之隆突區包含如表3及圖21C所示之核苷酸B1至B4。 在一些實施例中，隆突區之存在導致dgRNA中之上部與下部莖模組之間的定向扭結。crRNA隆突區及trRNA隆突區可部分互補。crRNA隆突區及trRNA隆突區可不互補。 在一些實施例中，crRNA及trRNA之隆突區包含比表2及3及圖21C中所示出多的核苷酸。當隆突區包含比表2及3及圖21C之示意圖中所示出少或多的核苷酸時，維持如將為熟習此項技術者顯而易見之修飾模式。在一些實施例中，crRNA之隆突區中之核苷酸的數目不同於trRNA之隆突區中之核苷酸的數目。 d) 上部莖區 在一些實施例中，dgRNA包含上部莖(US)區。上部莖區包含如圖21C中所描繪地締合之crRNA上部莖區及trRNA上部莖區。在一些實施例中，crRNA之上部莖區與trRNA之上部莖區至少部分互補。在一些實施例中，crRNA之上部莖區與trRNA之上部莖區完全互補。 在一些實施例中，crRNA之上部莖區包含十四個核苷酸。在一些實施例中，trRNA之上部莖區包含十一個核苷酸。在一些實施例中，crRNA及trRNA之上部莖區各自包含比表2及3及圖21C中所示出少的核苷酸。在一些實施例中，crRNA及trRNA之上部莖區包含比表2及3及圖21C中所示出多的核苷酸。當上部莖區包含比表2及3及圖21C之示意圖中所示出少或多的核苷酸時，維持如將為熟習此項技術者顯而易見之修飾模式。 在一些實施例中，crRNA之上部莖包含如表2及圖21C中所示之核苷酸US1至US14。 在一些實施例中，trRNA之上部莖包含如表3及圖21C中所示之核苷酸US1至US11。 e) 連接區 在一些實施例中，dgRNA包含含有連接區之trRNA。在一些實施例中，連接區在trRNA之下部莖區與髮夾1區之間。在一些實施例中，連接區緊鄰地位於trRNA之下部莖區下游。在一些實施例中，連接區包含十八個核苷酸。在一些實施例中，trRNA之連接區包含如表3及圖21C所示之核苷酸N1至N18。在一些實施例中，連接區包含比表3及圖21C中所示出少的核苷酸。在一些實施例中，trRNA之連接區包含比表3及圖21C中所示出多的核苷酸。當連接區包含比3及圖21C中所示出少或多的核苷酸時，維持如將為熟習此項技術者顯而易見之修飾模式。 在一些實施例中，當以相反方向讀取時，連接區具有核酸序列互補之核苷酸。在一些實施例中，核酸序列中之互補性產生sgRNA中之莖及/或莖環之二級結構(例如連接區中之某些核苷酸可彼此鹼基配對)。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，連接區可不彼此完全互補。 f) 髮夾區 在一些實施例中，trRNA之髮夾區在連接區下游。在一些實施例中，將緊鄰連接區下游之核苷酸之區稱為「髮夾1區」。在一些實施例中，將緊鄰髮夾1區下游之核苷酸之區稱為「髮夾2區」。在一些實施例中，髮夾區包含髮夾1區及髮夾2區。在一些情況下，髮夾1區及髮夾2區藉由一或多個核苷酸「n」分離。在一些實施例中，n=1。在一些實施例中，trRNA僅包含髮夾1區或髮夾2區。 已顯示經2個核苷酸置換trRNA之髮夾1區允許編輯Cas RNP之活性(參見US20150376586，圖16)。在一些實施例中，trRNA包含經核苷酸「n」置換髮夾1區，其中「n」為1與50、40、30、20、15、10、5、4、3及2之間的整數。在一些實施例中，trRNA之髮夾1區經2個核苷酸置換。 在一些實施例中，trRNA之髮夾1區包含十二個緊鄰連接區下游之核苷酸。在一些實施例中，trRNA之髮夾1區包含如表3及圖21C中所示之核苷酸H1-1至H1-12。 在一些實施例中，非髮夾核苷酸存在於trRNA之髮夾1區與髮夾2區之間。在一些實施例中，一至兩個非髮夾核苷酸存在於髮夾1區與髮夾2區之間。 在一些實施例中，trRNA之髮夾2區包含十五個在髮夾1之後(相對於其為3')的核苷酸。在一些實施例中，trRNA之髮夾2區包含如表3及圖21C中所示之核苷酸H2-1至H2-15。在一些實施例中，trRNA之髮夾2區包含如表3中所示之核苷酸H2-1至H2-15，且髮夾1區與髮夾2區之間的「n」為1或2。 在一些實施例中，trRNA之髮夾區包含比表3及圖21C中所示出多的核苷酸。當髮夾區包含比表3及圖21C中所示出少或多的核苷酸時，維持如將為熟習此項技術者顯而易見之修飾模式。 在一些實施例中，當以相反方向讀取時，髮夾區具有核酸序列互補之核苷酸。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，髮夾區可不彼此完全互補(例如髮夾區之頂部或環包含不成對核苷酸)。 在一些實施例中，trRNA包含經核苷酸「n」置換髮夾1區，其中「n」為1與50、40、30、20、15、10、5、4、3及2之間的整數。在一些實施例中，trRNA之髮夾1區經2個核苷酸置換。 g) 3'末端區 在一些實施例中，dgRNA包含含有3'末端區之trRNA，該3'末端區在髮夾區之後(相對於其為3')包含額外核苷酸。在一些實施例中，3'末端區包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個或超過20個不與髮夾區之二級結構締合之核苷酸。在一些實施例中，3'末端區包含1、2、3或4個不與髮夾區之二級結構締合之核苷酸。在一些實施例中，3'末端區包含4個不與髮夾區之二級結構締合之核苷酸。在一些實施例中，3'末端區包含1、2或3個不與髮夾區之二級結構締合之核苷酸。 2. dgRNA之修飾 在一些實施例中，dgRNA包含經修飾之crRNA及未經修飾之trRNA。在一些實施例中，dgRNA包含未經修飾之crRNA及經修飾之trRNA。在一些實施例中，dgRNA之crRNA及trRNA均包含修飾。 在一些實施例中，本文所述之gRNA在兩個獨立RNA分子上(雙嚮導RNA或dgRNA)。參見表2、3及圖21C。 在一些實施例中，本發明包含dgRNA，其包含或由以下者組成：a)SEQ ID No: 1至187之crRNA序列中之任一者；及b)SEQ ID No: 188至227中所述之trRNA序列中之任一者。 在一些實施例中，提供包含1至187之經修飾crRNA序列中之任一者之dgRNA。 在一些實施例中，提供包含188至227之經修飾trRNA序列中之任一者之dgRNA。 在一些實施例中，提供包含SEQ ID No: 19至31、53至73及104至130之經修飾crRNA序列中之任一者之dgRNA。在一些實施例中，本發明包含dgRNA，其包含SEQ ID No: 19至31、53至73及104至130之經修飾序列中之任一者，其中crRNA進一步包含與靶序列至少部分互補之5'間隔序列，且將Cas9導引至其標靶以進行裂解。 在一些實施例中，本發明包含crRNA，其包含SEQ ID No: 1至187中所述之序列中之任一者。在一些實施例中，本發明包含crRNA，其包含或由SEQ ID No: 19至31、53至73及104至130中所述之序列中之任一者組成。在一些實施例中，本發明包含crRNA，其包含SEQ ID No: 19至31、53至73及104至130中所述之序列中之任一者及間隔區。 在一些實施例中，本發明包含trRNA，其包含或由SEQ ID No: 188至277中所述之序列中之任一者組成。 在一些實施例中，本發明包含crRNA，其包含與SEQ ID No: 1至187中之任一者之核苷酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核苷酸，其中修飾模式與參考序列標識符中示出的修飾模式相同。亦即，相比於序列中所示出的，核苷酸A、U、C及G可相差99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%，但修飾保持不變。 在一些實施例中，本發明包含trRNA，其包含與SEQ ID No: 188至277中之任一者之核苷酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核苷酸，其中修飾模式與參考序列標識符中示出的修飾模式相同。亦即，相比於序列中所示出的，核苷酸A、U、C及G可相差99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%，但各核苷酸上之修飾保持不變。 3. 具有修飾之crRNA、trRNA及dgRNA 在一些實施例中，crRNA包含5'末端區、下部莖區、隆突區、上部莖區及3'末端區中之一或多者內之一或多個經修飾之核苷酸。 在一些實施例中，修飾包含2'-O-Me。 在一些實施例中，修飾包含2'-F。 在一些實施例中，修飾包含鍵聯一或多個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，修飾為鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之三個PS鍵及鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之三個PS鍵。 在一些實施例中，修飾包含反向無鹼基核苷酸。 在一些實施例中，提供crRNA，其包含上部莖區中之各核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，crRNA之US-1至US-14各經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，crRNA之LS1及LS6經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，crRNA之LS5經2'-O-Me修飾。 在一些實施例中，提供crRNA，其包含上部莖區中之核苷酸中之每一者，及下部莖區中之LS1及LS6處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，crRNA進一步包含5'及/或3'末端區中，例如5'及/或3'端修飾中之一或多個2'-O-Me或2'-O-moe修飾之核苷酸。 在一些實施例中，提供crRNA，其包含上部莖區中之核苷酸中之每一者、下部莖區中之LS1、LS5及LS6處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，crRNA進一步包含5'及/或3'末端區中，例如5'及/或3'端修飾中之一或多個2'-O-Me或2'-O-moe修飾之核苷酸。 在一些實施例中，本發明包含crRNA，其包含下部莖區中之LS1、LS2及LS6處之2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，crRNA進一步包含隆突區中之B1及B2中之每一者處之2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，本發明包含crRNA，其包含下部莖區中之LS1、LS2及LS6，及隆突區中之B1及B2中之每一者處之2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，crRNA進一步包含5'及/或3'末端區中，例如5'及/或3'端修飾中之一或多個2'-O-Me或2'-O-moe修飾之核苷酸。 在一些實施例中，crRNA包含下部莖區中之核苷酸LS1及LS6；隆突區中之核酸中之每一者；及上部莖區中之核酸中之每一者處之2'-O-Me修飾之核苷酸。在一些實施例中，crRNA之LS5核苷酸亦經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，crRNA之LS2、LS3及LS4未經修飾。在一些實施例中，crRNA進一步包含5'及/或3'末端區中，例如5'及/或3'端修飾中之一或多個2'-O-Me或2'-O-moe修飾之核苷酸。 在一些實施例中，crRNA包含下部莖區中之LS1、LS2及LS6，及隆突區中之核苷酸中之每一者處之2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，crRNA包含下部莖區中之LS1、LS2及LS6處，及隆突區中之B2及B2處之2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，crRNA包含下部莖區中之LS1-LS6，及隆突區中之核苷酸中之每一者處之2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，crRNA進一步包含5'及/或3'末端區中，例如5'及/或3'端修飾中之一或多個2'-O-Me或2'-O-moe修飾之核苷酸。 在一些實施例中，本發明包含trRNA，其包含以下區中之一或多者內之一或多個經修飾之核苷酸：5'末端區；上部莖區；隆突區；下部莖區；連接區；髮夾1區；髮夾1區與髮夾2區之間的中間區；髮夾2區；及3'末端區。 在一些實施例中，修飾包含2'-O-Me。 在一些實施例中，修飾包含2'-F。 在一些實施例中，修飾包含鍵聯一或多個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，修飾為鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之三個PS鍵及鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之三個PS鍵。 在一些實施例中，修飾包含反向無鹼基核苷酸。 在一些實施例中，trRNA包含以下各處之2'-O-Me修飾之核苷酸：上部莖區中之各核酸；隆突區中之B1及B2；下部莖區中之LS1及LS2；連接區中之N3、N4、N5、N15、N16、N17及N18；髮夾1區中之各核苷酸；髮夾1區與髮夾2區之間的一個核苷酸；及髮夾2區中之各核苷酸。在一些實施例中，trRNA進一步包含5'及/或3'末端區中，例如5'及/或3'端修飾中之一或多個2'-O-Me或2'-O-moe修飾之核苷酸。 在一些實施例中，trRNA包含以下各處之2'-O-Me修飾之核苷酸：上部莖區中之各核酸；隆突區中之各核苷酸；下部莖區中之LS1、LS2、LS5及LS6；連接區中之N3至N5、N10至N18；髮夾1區中之各核苷酸；髮夾1區與髮夾2區之間的一個核苷酸；及髮夾2區中之各核苷酸。在一些實施例中，crRNA進一步包含5'及/或3'末端區中，例如5'及/或3'端修飾中之一或多個2'-O-Me或2'-O-moe修飾之核苷酸。 在一些實施例中，trRNA包含連接區中之N15至N18處之2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，trRNA進一步包含5'及/或3'末端區中，例如5'及/或3'端修飾中之一或多個2'-F修飾之核苷酸。 在一些實施例中，trRNA包含下部莖區中之LS4及LS5，及連接區中之N13至N18處之2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，trRNA進一步包含5'及/或3'末端區中，例如5'及/或3'端修飾中之一或多個2'-F修飾之核苷酸。 在一些實施例中，trRNA包含下部莖區中之LS1、LS3及LS5處之2'-F修飾之核苷酸，及下部莖區中之LS2、LS4及LS6處之2'-O-Me修飾之核苷酸。 在一些實施例中，本文揭示crispr RNA (crRNA)，其包含以下區中之一或多者內之一或多個修飾：5'末端處之前五個核苷酸；下部莖區；隆突區；上部莖區；及3'末端處之最後五個核苷酸。在一些實施例中，修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包含2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，5'末端處之前三個核苷酸，及3'末端處之最後三個核苷酸經修飾。在一些實施例中，5'末端處之前四個核苷酸，及3'末端處之最後四個核苷酸與硫代磷酸酯(PS)鍵鍵聯。在一些實施例中，修飾包含2'-O-Me。在一些實施例中，修飾包含2'-F。在一些實施例中，5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-O-Me修飾。在一些實施例中，5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-F修飾。在一些實施例中，LS1及LS6經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，上部莖區中之核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾。 在一些實施例中，本發明包含crispr RNA (crRNA)，其包含以下核苷酸處之2'-O-Me修飾之核酸：下部莖區中之LS1及LS6；及上部莖區中之各核苷酸。在一些實施例中，crRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，crRNA進一步包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核酸，及3'末端處之最後三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核酸。在一些實施例中，LS1、LS2及LS6經2'-F修飾。在一些實施例中，隆突區中之各核苷酸經2'-F修飾。 在一些實施例中，本文揭示crispr RNA (crRNA)，其包含以下核苷酸處之2'-F修飾之核酸：下部莖區中之LS1、LS2及LS6；及隆突區中之各核苷酸。在一些實施例中，crRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，crRNA進一步包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核酸，及3'末端處之最後三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核酸。 在一些實施例中，提供crRNA，其包含SEQ ID No: 1至187中之任一者之核酸。在一些實施例中，提供crRNA，其包含SEQ ID No: 19至31、53至73、104至130及161至187中之任一者之核酸。在一些實施例中，提供crRNA，其包含與SEQ ID No: 19至31、53至73、104至130及161至187中之任一者之核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核酸，其中修飾模式與參考序列標識符中示出的修飾模式相同。在一些實施例中，crRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 本發明亦涵蓋tracr RNA (trRNA)，其包含以下區中之一或多者內之一或多個修飾：5'末端處之前五個核苷酸；上部莖區；隆突區；下部莖區；連接區；髮夾1區；髮夾2區；及3'末端處之最後五個核苷酸。在一些實施例中，修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包含2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，5'末端處之前四個核苷酸，及3'末端處之最後四個核苷酸與硫代磷酸酯(PS)鍵鍵聯。在一些實施例中，5'末端處之前三個核苷酸，及3'末端處之最後三個核苷酸經修飾。在一些實施例中，修飾包含2'-O-Me。在一些實施例中，修飾包含2'-F。在一些實施例中，5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-O-Me修飾。在一些實施例中，5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-F修飾。在一些實施例中，上部莖區中之各核苷酸經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，隆突區內之B1及B2經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，連接區中之N3、N4、N5、N15、N16、N17及N18經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，髮夾1區中之各核苷酸經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，髮夾2區中之各核苷酸經2'-O-Me修飾。 在一些實施例中，本發明包含tracr RNA (trRNA)，其包含以下核苷酸處之2'-O-Me修飾之核酸：上部莖區中之各核苷酸；隆突區內之B1及B2；連接區中之N3、N4、N5、N15、N16、N17及N18；髮夾1區中之各核苷酸；及髮夾2區中之各核苷酸。在一些實施例中，trRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，trRNA進一步包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核苷酸，及3'末端處之最後三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核酸。在一些實施例中，N15、N16、N17及N18經2'-F修飾。在一些實施例中，LS1、LS3及LS5經2'-F修飾，且LS2、LS4及LS6經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，trRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。在一些實施例中，trRNA進一步包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核酸，及3'末端處之最後三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核酸。 在一些實施例中，提供trRNA，其包含SEQ ID No: 188至227中之任一者之核酸。在一些實施例中，提供trRNA，其包含與SEQ ID No: 188至227中之任一者之核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核酸，其中修飾模式與參考序列標識符中示出的修飾模式相同。在一些實施例中，trRNA進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 在一些情況下，提供包含crRNA及trRNA之雙嚮導，其中crRNA包含SEQ ID No: 1至187中之任一者之核酸，且其中trRNA包含SEQ ID No: 188至227中之任一者之核酸。 本發明涵蓋包含本文所揭示之crRNA及本文所揭示之trRNA的雙嚮導，亦涵蓋包含本文所揭示之crRNA及未經修飾之trRNA之雙嚮導。在一些實施例中，提供包含未經修飾之crRNA及本文所揭示之經修飾之trRNA之雙嚮導。 在一些實施例中，並涵蓋以下各者： 實施例55. 一種crispr RNA (crRNA)，其包含以下區中之一或多者內之一或多個修飾： a. 5'末端處之前五個核苷酸； b. 下部莖區； c. 隆突區； d. 上部莖區；及 e. 3'末端處之最後五個核苷酸。 實施例56. 如實施例55之crRNA，其中該修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。 實施例57. 如實施例55之crRNA，其中該修飾包含2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。 實施例58. 如實施例55之crRNA，其中該修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。 實施例59. 如實施例55至58中任一項之crRNA，其中5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸經修飾。 實施例60. 如實施例55至58中任一項之crRNA，其中5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與硫代磷酸酯(PS)鍵鍵聯。 實施例61. 如實施例59之crRNA，其中該修飾包含2'-O-Me。 實施例62. 如實施例59之crRNA，其中該修飾包含2'-F。 實施例63. 如實施例55至62中任一項之crRNA，其中5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-O-Me修飾。 實施例64. 如實施例55至62中任一項之crRNA，其中5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-F修飾。 實施例65. 如實施例55至60中任一項之crRNA，其中LS1及LS6經2'-O-Me修飾。 實施例66. 如實施例55至60及65中任一項之crRNA，其中上部莖區中之核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾。 實施例67. 一種crispr RNA (crRNA)，其包含以下處之2'-O-Me修飾之核苷酸： a. 下部莖區中之LS1及LS6；及 b. 上部莖區中之各核苷酸。 實施例68. 如實施例67之crRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例69. 如實施例67或68之crRNA，其進一步包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核苷酸，及3'末端處之最後三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核苷酸。 實施例70. 如實施例55至60中任一項之crRNA，其中LS1、LS2及LS6經2'-F修飾。 實施例71. 如實施例55至60及70中任一項之crRNA，其中隆突區中之各核苷酸經2'-F修飾。 實施例72. 一種crispr RNA (crRNA)，其包含以下處之2'-F修飾之核苷酸： a. 下部莖區中之LS1、LS2及LS6；及 b. 隆突區中之各核苷酸。 實施例73. 如實施例70至72中任一項之crRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例74. 如實施例72或73之crRNA，其進一步包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核苷酸，及3'末端處之最後三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核苷酸。 實施例75. 一種crRNA，其包含SEQ ID No: 1至187中之任一者之核酸。 實施例76. 一種crRNA，其包含SEQ ID No: 19至31、53至73、104至130及161至187中之任一者之核酸。 實施例77. 一種crRNA，其包含與SEQ ID No: 19至31、53至73、104至130及161至187中之任一者之核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核酸，其中修飾模式與參考序列標識符中示出的修飾模式相同。 實施例78. 如實施例75至77中任一項之crRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例79. 一種tracr RNA (trRNA)，其包含以下區中之一或多者內之一或多個修飾： a. 5'末端處之前五個核苷酸； b. 上部莖區； c. 隆突區； d. 下部莖區； e. 連接區； f. 髮夾1區； g. 髮夾2區；及 h. 3'末端處之最後五個核苷酸。 實施例80. 如實施例79之trRNA，其中該修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。 實施例81. 如實施例79之trRNA，其中該修飾包含2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。 實施例82. 如實施例79之trRNA，其中該修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。 實施例83. 如實施例79至82中任一項之trRNA，其中5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與硫代磷酸酯(PS)鍵鍵聯。 實施例84. 如實施例79至82中任一項之trRNA，其中5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸經修飾。 實施例85. 如實施例84之trRNA，其中該修飾包含2'-O-Me。 實施例86. 如實施例84之trRNA，其中該修飾包含2'-F。 實施例87. 如實施例79至86中任一項之trRNA，其中5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-O-Me修飾。 實施例88. 如實施例79至86中任一項之trRNA，其中5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-F修飾。 實施例89. 如實施例79至84中任一項之trRNA，其中上部莖區中之各核苷酸經2'-O-Me修飾。 實施例90. 如實施例79至84及89中任一項之trRNA，其中隆突區內之B1及B2經2'-O-Me修飾。 實施例91. 如實施例79至84及89至90中任一項之trRNA，其中連接區中之N3、N4、N5、N15、N16、N17及N18經2'-O-Me修飾。 實施例92. 如實施例79至84及89至91中任一項之trRNA，其中髮夾1區中之各核苷酸經2'-O-Me修飾。 實施例93. 如實施例79至84及89至92中任一項之trRNA，其中髮夾2區中之各核苷酸經2'-O-Me修飾。 實施例94. 一種tracr RNA (trRNA)，其包含以下處之2'-O-Me修飾之核苷酸： a. 上部莖區中之各核苷酸； b. 隆突區內之B1及B2； c. 連接區中之N3、N4、N5、N15、N16、N17及N18； d. 髮夾1區中之各核苷酸；及 e. 髮夾2區中之各核苷酸。 實施例95. 如實施例94之trRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例96. 如實施例94或95之crRNA，其進一步包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核苷酸，及3'末端處之最後三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核酸。 實施例97. 如實施例79至84中任一項之trRNA，其中N15、N16、N17及N18經2'-F修飾。 實施例98. 如實施例79至84及97中任一項之trRNA，其中LS1、LS3及LS5經2'-F修飾，且LS2、LS4及LS6經2'-O-Me修飾。 實施例99. 如實施例87至98中任一項之trRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例100. 如實施例98或99之trRNA，其進一步包含5'末端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核苷酸，及3'末端處之最後三個核苷酸處之2'-O-Me或2'-F修飾之核苷酸。 實施例101. 一種trRNA，其包含SEQ ID No: 188至227中之任一者之核酸。 實施例102. 一種trRNA，其包含與SEQ ID No: 188至227中之任一者之核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核酸，其中修飾模式與參考序列標識符中示出的修飾模式相同。 實施例103. 如實施例101至102中任一項之trRNA，其進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。 實施例104. 一種包含crRNA及trRNA之雙嚮導，其中crRNA包含SEQ ID No: 1至187中之任一者之核苷酸，且其中trRNA包含SEQ ID No: 188至227中之任一者之核酸。 實施例105. 一種雙嚮導，其包含如實施例55至78中任一項之crRNA及如實施例79至103中任一項之trRNA。 實施例106. 一種雙嚮導，其包含如實施例55至78中任一項之crRNA及未經修飾之trRNA。 實施例107. 一種雙嚮導，其包含未經修飾之crRNA及如實施例79至103中任一項之trRNA。 C. 末端核苷酸之修飾 在一些實施例中，本文所述之嚮導RNA中之任一者之5'或3'末端核苷酸經修飾。在一些實施例中，嚮導RNA，包括例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA兩者之3'末端區中之末端(亦即最後)1、2、3、4、5、6或7個核苷酸經修飾。在一些實施例中，嚮導RNA之3'末端區中之末端(亦即最後)1、2、3、4、5、6或7個核苷酸包含超過一個修飾。在一些實施例中，3'末端區處之末端(亦即最後)1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少一者經修飾。在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即最後)1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少兩者經修飾。在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即最後)1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少三者經修飾。在一些實施例中，修飾包含PS鍵。 在一些實施例中，5'末端區之5'端經修飾，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA兩者之前1、2、3、4、5、6或7個核苷酸經修飾。在一些實施例中，嚮導RNA之3'末端區中之前1、2、3、4、5、6或7個核苷酸包含超過一個修飾。在一些實施例中，5'端處之末端(亦即第一)1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少一者經修飾。在一些實施例中，5'端處之末端1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少兩者經修飾。在一些實施例中，5'端處之末端1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少三者經修飾。在一些實施例中，修飾包含PS鍵。 在一些實施例中，嚮導RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA兩者之5'及3'末端(例如端部)均經修飾。在一些實施例中，僅嚮導RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA兩者之5'末端經修飾。在一些實施例中，僅嚮導RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA兩者之3'末端經修飾。 在一些實施例中，gRNA包含gRNA之5'端處之前7個核苷酸中之1、2、3、4、5、6或7者處之修飾。在一些實施例中，gRNA包含3'端處之7個末端核苷酸中之1、2、3、4、5、6或7者處之修飾。在一些實施例中，5'端處之前4個核苷酸中之2、3或4者，及/或3'端處之末端4個核苷酸中之2、3或4者經修飾。在一些實施例中，5'端處之前4個核苷酸中之2、3或4者與硫代磷酸酯(PS)鍵鍵聯。 在一些實施例中，對5'末端及/或3'末端之修飾包含對核苷酸之2'-O-甲基(2'-O-Me)或2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾。在一些實施例中，修飾包含對核苷酸之2'-氟基(2'-F)修飾。在一些實施例中，修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，修飾包含反向無鹼基核苷酸。在一些實施例中，修飾包含超過一個選自2'-O-Me、2'-O-moe、2'-氟基(2'-F)、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵及反向無鹼基核苷酸之修飾。在一些實施例中，涵蓋等效修飾。 在一些實施例中，嚮導RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA兩者包含5'末端處之前一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個核苷酸之間的一或多個硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，嚮導RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA兩者包含3'末端處之前一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個核苷酸之間的一或多個PS鍵。在一些實施例中，嚮導RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA兩者包含5'末端及3'末端處之最後一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個核苷酸之間的一或多個PS鍵。在一些實施例中，除PS鍵以外，5'及3'末端核苷酸可包含2'-O-Me、2'-O-moe或2'-F修飾之核苷酸。 在一些實施例中，嚮導RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA兩者包含5'及3'末端處之經修飾之核苷酸，及表1-3及圖21A或21C中所述之一或多個其他區中之經修飾之核苷酸。 在一些實施例中，crRNA、trRNA或crRNA及trRNA兩者包含不在5'或3'末端處之經修飾之核苷酸。特定修飾模式描述於下文及表4中。 3. gRNA及Cas蛋白質之遞送 在一些實施例中，除至少一個gRNA以外，本文提供之組合物另外包含核酸酶。在一些實施例中，核酸酶為Cas蛋白質。在一些實施例中，gRNA連同Cas蛋白質稱作Cas RNP。在一些實施例中，Cas蛋白質係來自Type-II CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas蛋白質為Cas9。在一些實施例中，Cas9蛋白質為野生型Cas9。在一些實施例中，Cas9蛋白質源自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes
)Cas9蛋白質，例如化膿性鏈球菌Cas9。在一些實施例中，Cas9蛋白質不源自化膿性鏈球菌，但以與化膿性鏈球菌Cas9相同之方式起作用，使得對化膿性鏈球菌Cas9具有特異性的gRNA將導引非化膿性鏈球菌Cas9至其目標位點。在一些實施例中，Cas誘發標靶DNA中之雙鏈斷裂。本文所述之實施例涵蓋化膿性鏈球菌Cas9蛋白質之等效物。 Cas9涵蓋其經修飾型式及變異體。具有一個非活性催化域(RuvC或HNH)之Cas9之經修飾型式被稱為「切口酶」。切口酶僅切割標靶DNA上之一個鏈，因此產生單鏈斷裂。單鏈斷裂亦可稱為「切口」。在一些實施例中，組合物及方法包含切口酶。在一些實施例中，組合物及方法包含在標靶DNA中誘發切口而非雙鏈斷裂之切口酶Cas9。 在一些實施例中，Cas蛋白質可經修飾以僅含有一個功能核酸酶域。舉例而言，Cas蛋白質可經修飾以使得核酸酶域中之一者經突變或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC域之切口酶Cas。在一些實施例中，使用具有非活性RuvC域之切口酶Cas。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH域之切口酶Cas。在一些實施例中，使用具有非活性HNH域之切口酶Cas。 在一些實施例中，Cas蛋白質核酸酶域內之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas蛋白質可包含RuvC或RuvC樣核酸酶域中之胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括D10A(基於化膿性鏈球菌Cas9蛋白質)。在一些實施例中，Cas蛋白質可包含HNH或HNH樣核酸酶域中之胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A(基於化膿性鏈球菌Cas9蛋白質)。 在一些實施例中，本文所述之RNP複合物包含切口酶及一對分別與靶序列之有義鏈及反義鏈互補之嚮導RNA。在此實施例中，嚮導RNA將切口酶導引至靶序列且藉由在靶序列之相對鏈上產生切口(亦即雙重切口)引入雙鏈斷裂(DSB)。在一些實施例中，使用雙重切口可提高特異性及減少脫靶效應。在一些實施例中，連同靶向DNA之相對鏈之兩個獨立嚮導RNA使用切口酶Cas以在標靶DNA中產生雙重切口。在一些實施例中，連同經選擇以非常接近之兩個獨立嚮導RNA使用切口酶Cas以在標靶DNA中產生雙重切口。 在一些實施例中，使用嵌合Cas蛋白質，其中蛋白質之一個域或區經不同蛋白質之一部分置換。在一些實施例中，Cas核酸酶域可經來自諸如Fok1之不同核酸酶的域置換。在一些實施例中，Cas蛋白質可經核酸酶修飾。 在一些實施例中，Cas蛋白質包含融合蛋白，其包含連接至異源功能域之催化非活性Cas9(參見例如WO2014152432)。在一些實施例中，催化非活性Cas9來自化膿性鏈球菌。在一些實施例中，催化非活性Cas9包含使Cas9不活化之突變。在一些實施例中，異源功能域為修飾基因表現、組蛋白或DNA之域。在一些實施例中，異源功能域為轉錄活化域或轉錄抑制因子域。 A. PAM 在一些實施例中，靶序列可鄰近於PAM。在一些實施例中，PAM可鄰近於或在靶序列之3'端之1、2、3或4個核苷酸內。PAM之長度及序列可取決於使用之Cas蛋白質。舉例而言，PAM可選自一致序列或用於特定Cas9蛋白質或Cas9直系同源物之特定PAM序列，包括揭示於Ran等人，Nature 520:186-191 (2015)之圖1中之彼等，該文獻以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，PAM可包含長度為2、3、4、5、6、7、8、9或10個之核苷酸。非限制性例示性PAM序列包括NGG、NAG、NGA、NGAG、NGCG、NNGRRT、TTN、NGGNG、NG、NAAAAN、NNAAAAW、NNNNACA、GNNNCNNA及NNNNGATT(其中N定義為任何核苷酸，且W定義為A或T，且R定義為A或G)。在一些實施例中，PAM序列可為NGG。在一些實施例中，PAM序列可為NGGNG。在一些實施例中，PAM序列可為NNAAAAW。 B. 經修飾gRNA之遞送 脂質奈米粒子(LNP)為遞送核苷酸及蛋白質負荷之熟知方法，且可用於遞送本文所揭示之gRNA、mRNA、Cas9及RNP。在一些實施例中，LNP遞送核酸、蛋白質或核酸連同蛋白質。 在一些實施例中，本發明包含向個體遞送本文所揭示之gRNA中之任一者之方法，其中gRNA與LNP聯合。在一些實施例中，gRNA/LNP亦與Cas9或編碼Cas9之mRNA聯合。 在一些實施例中，本發明包含含有所揭示之gRNA中之任一者及LNP之組合物。在一些實施例中，組合物進一步包含Cas9或編碼Cas9之mRNA。 在一些實施例中，LNPs包含陽離子脂質。在一些實施例中，LNP包含(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯，亦稱作3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸酯)。在一些實施例中，LNPs包含約4.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯之莫耳比(N:P)。 在一些實施例中，與本文所揭示gRNA聯合之LNP係用於製備供治療疾病或病症用之藥物。 電穿孔為遞送負荷之熟知方法，且任何電穿孔方法可用於遞送本文所揭示之gRNA中之任一者。在一些實施例中，電穿孔可用於遞送本文所揭示之gRNA中之任一者及Cas9或編碼Cas9之mRNA。 在一些實施例中，本發明包含向本文所揭示之gRNA中之任一者遞送離體細胞之方法，其中gRNA與LNP聯合或不與LNP聯合。在一些實施例中，gRNA/LNP或gRNA亦與Cas9或編碼Cas9之mRNA聯合。 4. 基因調節方法 在一些實施例中，本發明包含醫藥調配物，其包含本文所揭示之gRNA中之任一者以及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，本發明包含醫藥調配物，其包含本文所揭示之gRNA中之任一者及LNP以及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，本發明包含醫藥調配物，其包含本文所揭示之gRNA中之任一者、Cas9蛋白質或編碼Cas9蛋白質之mRNA及LNP以及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥調配物用於製備供治療疾病或病症用之藥物。在一些實施例中，本發明包含治療人類患者之方法，其包含投與本文所述之gRNA或醫藥調配物中之任一者。 在一些實施例中，本發明包含修飾標靶DNA之方法或用途，其包含投與或遞送Cas蛋白質或Cas mRNA及本文所揭示之gRNA中之任何一或多者。 在一些實施例中，本發明包含調節靶基因之方法或用途，其包含投與或遞送Cas蛋白質或Cas mRNA及本文所揭示之gRNA中之任何一或多者。在一些實施例中，調節為靶基因編輯。在一些實施例中，調節為藉由靶基因編碼之蛋白質之表現的變化。 在一些實施例中，該方法或用途導致基因編輯。在一些實施例中，該方法或用途導致靶基因內之雙鏈斷裂。在一些實施例中，該方法或用途導致在DSB之非同源末端接合期間形成插入缺失突變。在一些實施例中，該方法或用途導致靶基因中之核苷酸的插入或缺失。在一些實施例中，靶基因中之核苷酸的插入或缺失導致移碼突變或提前終止密碼子，其產生非功能蛋白質。在一些實施例中，靶基因中之核苷酸的插入或缺失導致靶基因表現之敲除或消除。在一些實施例中，該方法或用途包含DSB之同源性導向的修復。在一些實施例中，該方法或用途進一步包含向細胞遞送模板，其中模板之至少一部分併入至藉由Cas蛋白質誘發之雙鏈斷裂位點處或附近之標靶DNA中。 在一些實施例中，該方法或用途導致基因調節。在一些實施例中，基因調節為基因表現之增加或減少、DNA之甲基化狀態之變化或組蛋白亞單位之修飾。在一些實施例中，該方法或用途導致藉由靶基因編碼之蛋白質之表現增加或減少。 在一些實施例中，本文所揭示之gRNA中之任一者可適用於製備供治療疾病或病症用之藥物。 A. 基因調節之量測 可在活體外及活體內測試經修飾之gRNA之功效。在一些實施例中，本發明包含本文所揭示之gRNA中之一或多者，其中gRNA在連同Cas9提供至細胞時導致基因調節。在一些實施例中，gRNA之功效可在活體外或活體內分析中量測。 1. 活體外量測Cas功效 在一些實施例中，將包含經修飾之sgRNA之Cas RNP之活性相比於包含未經修飾之sgRNA之Cas RNP之活性。 在一些實施例中，將包含含有經修飾之trRNA之dgRNA之Cas RNP的活性相比於包含含有未經修飾之trRNA之dgRNA之Cas RNP的活性。 在一些實施例中，將包含含有經修飾之crRNA之dgRNA之Cas RNP的活性相比於包含含有未經修飾之crRNA之dgRNA之Cas RNP的活性。 在一些實施例中，將包含含有經修飾之crRNA及經修飾之trRNA之dgRNA之Cas RNP的活性相比於包含未經修飾之crRNA及未經修飾之trRNA之Cas RNP的活性。 在一些實施例中，gRNA增加或減少靶蛋白表現之效率係藉由量測靶蛋白之量測定。在一些實施例中，本發明包含本文所述之gRNA中之任一者，其中gRNA增加或減少產生自靶向基因之蛋白質之量。在一些實施例中，本發明包含調節蛋白質表現之方法，其包含向個體投與本文所揭示之gRNA中之任一者，其中gRNA將Cas9導引至編碼靶蛋白之基因，且相比於不將Cas9靶向至該基因之gRNA對照，靶蛋白表現增加或減少。 在一些實施例中，經特定gRNA編輯之效率係藉由遞送Cas9及gRNA(包含crRNA及trRNA之sgRNA或dgRNA)之後存在於基因組中之目標位置處之編輯測定。在一些實施例中，經特定gRNA編輯之效率係藉由下一代測序來量測。在一些實施例中，測定所關注的目標區之編輯百分比。在一些實施例中，在遞送gRNA及Cas9之後量測相比於序列讀段總數之具有向所關注的目標區中之核苷酸插入或缺失之序列讀段總數。在一些實施例中，本發明包含增加基因編輯效率之方法，其包含向細胞投與或遞送本文所述之經修飾之gRNA中之任一者，其中基因編輯之百分比相比於未經類似修飾之對照gRNA增加。 在一些實施例中，經特定gRNA編輯之效率係藉由經成功基因編輯引入之核苷酸插入或缺失的存在來量測。在一些實施例中，本發明包含在基因中產生核苷酸插入或缺失之方法，其包含向細胞投與或遞送本文所述之經修飾之gRNA中之任一者，其中相比於未經類似修飾之對照gRNA插入或缺失核苷酸。在一些實施例中，在生物化學分析中測試Cas9及gRNAs之活性。在一些實施例中，在無細胞裂解分析中測試Cas9及gRNA之活性。在一些實施例中，在Neuro2A細胞中測試Cas9及gRNA之活性。 在一些實施例中，相比於包含未經修飾之crRNA及trRNA之未經修飾之sgRNA或dgRNA，Cas9及包含經修飾之crRNA及/或trRNA之sgRNA或dgRNA顯示類似、較大或減小之活性。在一些實施例中，相比於包含未經修飾之crRNA及trRNA之未經修飾之sgRNA或dgRNA，Cas9及包含經修飾之crRNA及/或trRNA之經修飾之sgRNA或dgRNA顯示增強之活性。 2. 活體內量測Cas功效 在一些實施例中，經修飾之gRNA之活性係在活體內投配包含經修飾之gRNA及Cas蛋白質或編碼Cas蛋白質之mRNA的LNP之後量測。 在一些實施例中，本文提供之gRNA或組合物之活體內功效係藉由在投與gRNA及Cas9之後編輯自組織(例如肝組織)提取之DNA中量測之功效測定。 3. 活體內量測免疫系統活化 如本文所揭示之gRNA之修飾可減少個體對活體內投配gRNA之免疫反應。在一些實施例中，個體之免疫反應的活化係藉由活體內投配包含trRNA及crRNA之sgRNA或dgRNA連同Cas9 mRNA或蛋白質(例如在LNP中調配)之後的細胞介素之血清濃度來量測。在一些實施例中，細胞介素為干擾素-α(IFN-α)、介白素6(IL-6)、單核球趨化蛋白1(MCP-1)及/或腫瘤壞死因子α(TNF-α)。在一些實施例中，本發明包含降低個體對遞送gRNA之免疫反應的方法，其包含投與本文所揭示之gRNA中之任一者，其中gRNA在投與後藉由個體之免疫系統產生降低之反應。在一些實施例中，本發明包含相比於未經類似修飾之對照gRNA，在投與後降低個體之免疫系統中之活化的方法。 在一些實施例中，相比於投與未經修飾之sgRNA，投與Cas RNP或Cas9 mRNA連同經修飾之gRNA(例如sgRNA或dgRNA)產生免疫細胞介素之較低血清濃度。在一些實施例中，本發明包含降低個體之免疫細胞介素之血清濃度之方法，其包含投與本文所揭示之gRNA中之任一者，其中相比於未經類似修飾之對照gRNA，gRNA在個體之血清中產生免疫細胞介素之較低濃度。 本說明書及例示性實施例不應視為限制性的。出於本說明書及所附申請專利範圍之目的，除非另外規定，否則表示量、百分比或比例，及說明書及申請專利範圍中使用之其他數值之所有數目應理解為在所有情況下藉由術語「大約」修飾，程度為其尚未如此修飾。因此，除非有相反指示，否則本說明書及所附申請專利範圍中所闡述之數值參數為可視設法獲得之所需特性而變化的近似值。至少，且不試圖將均等論之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位之個數且藉由應用一般捨入技術來解釋。 應注意，如本說明書及所述申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」及任何字語之任何單數使用包括複數個指示物，除非明確且不含糊地限制於一個指示物。如本文所用，術語「包括」及其語法變體意欲為非限制性的，使得清單中之項之引述不排除可取代或添加至所列項之其他類似項。 實例 提供以下實例以說明某些所揭示之實施例且不應理解為以任何方式限制本發明之範疇。 實例1-材料及方法 A. 合成性嚮導RNA(gRNA) 藉由商業供應商以如表4中所提供之經修飾核苷酸及鍵結方式，利用化學方式合成呈雙嚮導(dgRNA，亦即crRNA及trRNA)及單嚮導(sgRNA)兩種型式之gRNA。 B. Cas9 mRNA之活體外轉錄(「IVT」) 含有N1-甲基假-U之封端及聚腺苷酸化Cas9 mRNA係藉由使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶之活體外轉錄產生。含有T7啟動子及100個核苷酸(nt)之聚(A/T)區之質體DNA係藉由XbaI線性化且獲自商業製造商。用於產生Cas9修飾之mRNA的IVT反應物在37℃下在以下條件下培育4小時：50 ng/µL線性化質體；2 mM之GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTP (Trilink)中之每一者；10 mM ARCA (Trilink)；5 U/µL T7 RNA聚合酶(NEB)；1 U/µL鼠類RNA酶抑制劑(NEB)；0.004 U/µL無機大腸桿菌焦磷酸酶(NEB)；及1×反應緩衝液。在4小時培育之後，添加TURBO脫氧核糖核酸酶(ThermoFisher)至0.01 U/µL之最終濃度，且再培育反應物30分鐘以移除DNA模板。Cas9 mRNA使用標準方案純化自酶及核苷酸，包括二氧化矽結合管柱，諸如MegaClear Transcription Clean-up套組(ThermoFisher)或使用LiCl繼之以EtOH與NaOAc之沈澱步驟。藉由量測260 nm處之光吸收(Nanodrop)測定轉錄物濃度，且藉由以Bioanlayzer (Agilent)進行毛細電泳法而分析轉錄物。 C. Neuro2A細胞中之Cas9 mRNA及gRNA轉染 小鼠細胞株Neuro2A在補充有10%胎牛血清之DMEM培養基中培養且在轉染之前24小時以每孔15,000個細胞之密度平鋪於96孔盤中。在轉染當天，自細胞抽吸培養基且經新鮮培養基替換。脂染胺-2000(Invitrogen)在Opti-MEM (Invitrogen)中以1:50(v/v)稀釋。Cas9 mRNA及單嚮導RNA在Opti-MEM中分開稀釋。對於雙嚮導型式，crRNA及trRNA在Opti-MEM中以1:1莫耳比在一起稀釋。Cas9 mRNA及gRNA分開與稀釋之脂染胺-2000以1:1(v/v)混合，產生兩種脂複合體。在培育5分鐘之後，將脂複合體連續添加至細胞，以得到100 ng Cas9 mRNA/孔之最終濃度及0.4 μL總脂質體轉染試劑。對於各實驗以兩個劑量測試嚮導，包括25 nM及2.5 nM、16.7 nM及1.67 nM、10 nM及1 nM、8.3 nM及0.83 nM以及3 nM及0.3 nM。對於雙嚮導，此濃度包括等莫耳量之crRNA及trRNA，使得例如25 nM crRNA及25 nM trRNA產生25 nM總雙嚮導。細胞在轉染後24小時溶解，且溶解物直接用於藉由NGS分析編輯之PCR反應。 具有1xNLS之Cas9 mRNA(SEQ ID NO: 359)： 具有2xNLS及HA標籤之Cas9 mRNA(SEQ ID NO: 360)： D. 初生肝細胞 根據製造商之方案(Invitrogen，方案11.28.2012)培養初生小鼠肝細胞(PMH)(Gibco)。簡言之，將細胞解凍且再懸浮於具有補充劑之肝細胞解凍培養基(Gibco，目錄號CM7000)中，接著在100 g下離心10分鐘。丟棄上清液且粒化之細胞再懸浮於肝細胞平鋪培養基加上補充包(Invitrogen，目錄號A1217601及CM3000)中。細胞經計數且以每孔15,000個細胞之密度平鋪於Bio-coat膠原蛋白I塗佈之96孔盤(ThermoFisher，目錄號877272)上且在37℃及5% CO2
氛圍下培育5小時以允許形成單層。在5小時之後，移除平鋪培養基且經含有LNP調配之Cas9 mRNA及嚮導RNA加上3%小鼠血清之補充之肝細胞培養基(Invitrogen，目錄號A1217601及CM4000)替換。LNP自每孔100 ng Cas9 mRNA及大致30 nM嚮導RNA之起始劑量水準稀釋，進行連續稀釋直至每孔0.1 ng mRNA及0.03 nM嚮導RNA。細胞在37℃及5% CO2
氛圍下培育大致48小時，隨後進行如本文所述之細胞溶解及NGS分析。 E. 脂質奈米粒子(「LNP」)調配物 LNP以約4.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比調配。脂質奈米粒子組分以如下莫耳比溶解於100%乙醇中：45 mol%(12.7 mM)陽離子脂質(例如(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯，亦稱作3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸酯)；44 mol%(12.4 mM)輔助脂質(例如膽固醇)；9 mol%(2.53 mM)中性脂質(例如DSPC)；及2 mol%(.563 mM)PEG(例如PEG2k-DMG)。RNA負荷係在25 mM乙酸鈉緩衝液，pH 4.5中製備，產生大致0.45 mg/mL之RNA負荷濃度。 LNP係藉由根據製造商之方案，使用Precision Nanosystems NanoAssemblrTM
台式儀器將脂質及RNA溶液微流體混合而形成。使用差分流動速率在混合期間維持水相與有機溶劑之2:1比率。LNP 調配程序 A ：
在混合之後，收集LNP，在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，大致1:1)中稀釋，且接著將其餘的緩衝液交換至PBS中(樣品體積100倍過量)，在4℃下在使用10 kDa Slide-a-LyzerTM G2透析卡(ThermoFisher Scientific)平緩攪拌下隔夜。LNP使用10kDa Amicon自旋過濾器濃縮(在4000 g在4℃下離心)以達成所需濃度。所得混合物接著使用0.2 μm無菌過濾器過濾。所得濾液儲存於2-8℃下。LNP 調配程序 B ：
在混合之後，收集LNP，在pH 7.5之50 mM Tris中稀釋(大致1:1)，且接著將LNP交換至pH 7.5之50 mM Tris中(樣品體積100倍過量)，在4℃下在使用10 kDa Slide-a-LyzerTM G2透析卡(ThermoFisher Scientific)平緩攪拌下隔夜。LNP使用10kDa Amicon自旋過濾器濃縮(在4000 g在4℃下離心)以達成所需濃度之兩倍。此等濃縮之LNP與pH 7.5之50 mM Tris、90 mM NaCl、10%蔗糖(2× TSS)1:1混合。所得混合物接著使用0.2 μm無菌過濾器過濾。所得濾液儲存於-80℃下。LNP 調配物程序 C ：
RNA負荷在pH 5之25 mM檸檬酸鈉、100 mM氯化鈉中製備，產生大致0.45 mg/mL之RNA負荷之濃度。在混合之後，LNP以3:1之比率於水中收集。LNP在室溫下培育一小時且與水1:1混合。接著，其使用製造商之方案，在PD-10管柱(GE Healthcare)上緩衝液交換至1× TSS(pH 7.5之50 mM Tris，45 mM NaCl，5%蔗糖)中。LNP使用10kDa Amicon自旋過濾器濃縮(在4000 g在4℃下離心)以達成所需濃度。所得混合物接著使用0.2 μm無菌過濾器過濾。所得濾液儲存於-80℃下。 F. 用於命中裂解效率之下一代測序(「NGS」)及分析 為了定量地測定基因組中之目標位置處之編輯效率，深度測序用於識別藉由基因編輯引入之插入及缺失的存在。 在目標位點(例如TTR、FVII)周圍設計PCR引物，且擴增所關注的基因組區域。引物序列提供於下表5中。表 5
根據製造商之方案(Illumina)進行額外PCR以對於測序添加所需化學性質。在Illumina MiSeq儀器上對擴增子測序。在消除具有低品質評分之讀段之後，將讀段與人類參考基因組(例如hg38)比對。將含有讀段之所得檔案映射至參考基因組(BAM檔案)，其中選擇與所關注的目標區重疊之讀段且計算野生型讀段的數目相對於含有插入、取代或缺失之讀段的數目。 編輯百分比(例如「編輯效率」或「編輯%」)定義為具有插入或缺失之序列讀段的總數相比於包括野生型之序列讀段之總數。 G. 活體內之LNP遞送 在6-10週齡範圍內之CD-1雌性小鼠用於各研究。對動物稱重且根據體重分組以基於組平均體重製備投配溶液。經由側尾靜脈以每隻動物0.2 mL(每公斤體重大致10 mL)之體積投配LNP。在給藥後大致6小時處對動物觀測副作用。在投藥後二十四小時處量測體重，且動物藉由在異氟烷麻醉下經由心臟穿刺放血而在各個時間點安樂死。將血液收集至血清分離管中或含有用於如本文所述之血漿之緩衝檸檬酸鈉的管中。對於涉及活體內編輯之研究，肝組織收集自來自各動物之中葉以用於DNA提取及分析。 H. 細胞介素誘導分析 對於此分析，藉由尾靜脈切口收集大致50-100 μL血液用於血清細胞介素量測。使血液在室溫下凝塊大致2小時，且接著在1000xg下離心10分鐘，隨後收集血清。量測IL-6、TNF-α、IFN-α及MCP-1之基於Luminex之磁珠多重分析(Affymetrix ProcartaPlus，目錄號Exp040-00000-801)用於收集樣品中之細胞介素分析。如製造商之方案中所指導地製備套組試劑及標準品。將25 μL小鼠血清添加至含有25 μL稀釋抗體塗佈之磁珠的孔中。將盤在室溫下培育2小時且接著洗滌。稀釋生物素抗體(50 μL)添加至珠粒且在室溫下培育1小時。再次洗滌珠粒，隨後添加50 μL稀釋抗生蛋白鏈菌素-PE至各孔，接著培育30分鐘。再次洗滌珠粒且接著懸浮於100 μL洗滌緩衝劑中且在Bio-Plex 200儀器(Bio-Rad)上讀取。使用Bioplex Manager版本6.1分析程式套，藉由使用五參數邏輯曲線擬合脫離標準曲線計算之細胞介素濃度分析資料。 I. 基因組DNA分離 對於活體內研究，使用基於珠粒之提取套組MagMAX-96 DNA多樣品套組(ThermoFisher，目錄號4413020)根據製造商之方案自10 mg組織中提取基因組DNA，該方案包括使組織在溶解緩衝液中均質化(大致400 μL/10 mg組織)。所有DNA樣品標準化至100 ng/μL濃度以用於PCR及後續NGS分析，如本文所述。 J. 甲狀腺素轉運蛋白(TTR)ELISA分析 收集血液且如所指示地分離血清。使用小鼠前白蛋白(甲狀腺素轉運蛋白)ELISA套組(Aviva Systems Biology，目錄號OKIA00111)測定總TTR血清水準。根據製造商之方案製備套組試劑及標準品。藉由1×分析稀釋劑將小鼠血清稀釋至10,000倍之最終稀釋度。此如下進行：進行兩個連續50倍稀釋，產生2500倍稀釋。進行最終4倍稀釋步驟以使得總樣品稀釋度為10,000倍。標準曲線稀釋液(各100 μL)及稀釋之血清樣品均添加至預塗有捕捉抗體之ELISA盤之各孔中。盤在室溫下培育30分鐘，隨後洗滌。添加酶-抗體共軛物(100 μL/孔)進行20分鐘培育。移除非結合抗體共軛物且再次洗滌該盤，隨後添加顯色受質溶液。培育該盤10分鐘，隨後添加100 μL終止溶液，例如硫酸(大致0.3 M)。在SpectraMax M5盤讀取器上以450 nm之吸光度讀取該盤。使用脫離標準曲線之四參數邏輯曲線擬合藉由SoftMax Pro軟體版本6.4.2計算血清TTR水準。對於分析稀釋調節最終血清值。 實例2-對經修飾之gRNA工程改造及活體外測試 以雙嚮導型式(dgRNA)設計經修飾之gRNA，如表4中所示。因此，經修飾之crRNA及trRNA均經設計及化學合成以允許形成dgRNA之經修飾及未經修飾之組分之配對。此等配對以如圖式中所指示之濃度轉染至Neuro2A細胞中且藉由NGS來量測編輯效率(例如編輯%)，如實例1中所述。 靶向小鼠TTR基因之某些來自表4之經修飾之crRNA經Cas9 mRNA及未經修飾之trRNA(TR000002)轉染。測試之嚮導包括SEQ ID No: 1至18。如圖1中所示，相比於未經修飾之對照，經修飾之crRNAs中的一些(連同未經修飾之trRNA)賦予類似或增強之活性，而其他經修飾之crRNA降低活性。 並行地，來自表4之經修飾之trRNA經靶向小鼠TTR基因之相同序列的Cas9 mRNA連同未經修飾之crRNA(CR000686)轉染。測試之嚮導包括SEQ ID No: 188至200及204。如圖2中所示，相比於未經修飾之對照，許多經修飾之trRNA(連同未經修飾之crRNA)賦予類似或增強之活性，而經修飾之trRNA中的一些降低活性。 除取代化學修飾之核苷酸以外，測試之crRNA及trRNA配對中的一些亦經序列取代工程改造，例如產生未發現於親本序列中之G-C配對。測試之嚮導包括SEQ ID No: 15及201；16及202；1及188。如圖3中所示，相比於未經修飾之對照，一個此類配對(SEQ ID No: 16及202)產生類似或增強之活性，而配對中之兩個降低活性。 隨後，測試來自表4之經修飾之crRNA及經修飾之trRNA之配對。如圖4中所示，相比於未經修飾之對照，經修飾之crRNA與經修飾之trRNA之配對中的一些賦予類似或增強之活性，而配對中的一些降低活性。在圖4中，行標題描繪用於實驗中之不同trRNA，且列標題描繪使用之不同crRNA。為了確定用於實驗中之組合，將行與列匹配。TR000002及CR000686為未經修飾之對照(參見右下方細胞)。 基於dgRNA設計，對於對應單嚮導RNA (sgRNA)工程改造以具有經修飾之crRNA及trRNA中的一些之態樣，如表4及圖15D中所描繪。此等sgRNA，SEQ ID No: 228至234亦在Neuro2A細胞中測試，且如圖5中所示，經修飾之sgRNA中之每一者顯示與僅含有5'及3'端修飾之對照(G0000209；SEQ ID NO: 228)類似的活性。 對於表4及圖6中描繪之額外dgRNA嚮導進行類似實驗集合。測試之嚮導包括SEQ ID No: 32至47及1。亦靶向小鼠TTR基因之經修飾之crRNA經Cas9 mRNA及未經修飾之trRNA (TR000002)轉染。如圖6中所示，相比於未經修飾之對照(CR000686)，一些經修飾之crRNA(連同未經修飾之trRNA)賦予類似或增強之活性，而其他經修飾之crRNA降低活性。 並行地，如圖7中所示，來自表4之經修飾之trRNA經靶向小鼠TTR基因之相同序列之Cas9 mRNA連同未經修飾之crRNA(CR000686)轉染。測試之嚮導包括SEQ ID No: 205至222及1。如圖7中所示，相比於未經修飾之對照(TR000002)，許多經修飾之trRNA(連同未經修飾之crRNA)賦予類似或增強之活性，而經修飾之trRNA中的一些降低活性。 除取代化學修飾之核苷酸以外，來自表4之測試之crRNA及trRNA配對中的一些亦經序列取代工程改造，例如產生未發現於親本序列中之G-C配對或G-U失配(「GU擺動」)。如圖8中所示，相比於未經修飾之對照，修飾及配對中的一些賦予類似或增強之活性，而一些(例如「GU擺動」或失配之配對)降低活性。圖8顯示使用SEQ ID No: 223至227及188中示出的trRNA嚮導與SEQ ID No: 48至52及1中示出的crRNA嚮導之結果。 隨後，如圖9中所示地測試來自表4之經修飾之crRNA及經修飾之trRNA之選定配對。相比於未經修飾之控制，經修飾之crRNA與經修飾之trRNA之配對中的一些賦予類似或增強之活性，而配對中的一些降低活性。在圖9中，行標題描繪用於實驗中之不同trRNA，且列標題描繪使用之不同crRNA。為了確定用於實驗中之組合，將行與列匹配。未經修飾之對照為TR000002及CR000686。 亦在純粹生物化學分析(亦即無細胞裂解分析)中測試來自表4之經修飾之gRNA(dgRNA及sgRNA)中的一些。有趣的是，許多在Neuro2A細胞中在很大程度上非活性之經修飾之gRNA在生物化學分析中具活性，指示此類生物化學分析可能無法預測細胞阻止經修飾之gRNA活性(資料未示出)。 實例3.對於其他標靶進一步測試經修飾之gRNA 已確定某些修飾影響gRNA活性，隨後測試此等修飾是否將在靶向(1)相同基因中之獨立序列或(2)不同基因中之序列時影響活性。因此，靶向小鼠TTR基因中之另一序列以及小鼠因子-VII(FVII)基因中之序列的gRNA經工程改造及合成以具有實例2中測試之某些修飾模式(參見表4)。此等gRNA以如圖式中所指示之濃度轉染至Neuro2A細胞中且藉由NGS來量測編輯效率(例如編輯%)，如實例1中所述。 靶向小鼠TTR基因(與實例2中所靶向不同的序列)或小鼠FVII基因之來自表4之經修飾之crRNA經Cas9 mRNA及未經修飾之trRNA(TR000002)轉染。測試之嚮導包括圖12A及12B中所展示之彼等。相比於未經修飾之對照，一些經修飾之crRNA(連同未經修飾之trRNA)賦予類似或增強之活性，而其他經修飾之crRNA降低活性。 並行地，來自表4之經修飾之trRNA經靶向小鼠TTR基因之相同序列(CR000705；與實例2中所靶向不同之序列)或與小鼠FVII基因相同之序列(CR000657)的Cas9 mRNA連同未經修飾之crRNA轉染。如圖13A及13B中所示，相比於未經修飾之對照，許多經修飾之trRNA(連同未經修飾之crRNA)賦予類似或增強之活性，而經修飾之trRNA中的一些降低活性。此數據顯示某些修飾模式傾向於經不同序列具有類似效應。 基於上文所述之dgRNA設計，對應單嚮導RNA (sgRNA)經工程改造以具有經修飾之crRNA及trRNA中的一些之態樣。參見表4。亦在Neuro2A細胞中測試此等sgRNA。結果顯示於圖10(小鼠TTR)及圖11(小鼠FVII)中。此等實驗顯示一些修飾模式即使在靶向不同基因時亦產生類似效應。 實例4.活體內測試經修飾之gRNA 在活體外測試之後，將經修飾之sgRNA在六個獨立研究中遞送至動物以判定修飾是否賦予活體內編輯任何益處。 LNP經IVT Cas9 mRNA連同化學修飾之sgRNA(靶向TTR或FVII)調配，如實例1中所述。按RNA組分之重量計，mRNA:sgRNA之比率大致為1:1。除非另外規定，否則用於此實例中所述之研究中之Cas9 mRNA具有SEQ ID NO: 360之序列且LNP係使用上文所述之LNP調配程序A調配。 在一個實驗中，以2 mg/kg向小鼠(n=5隻每組)投與LNP之單次劑量且在給藥後四小時收集血液用於血清細胞介素分析。給藥後7天，在屍檢時收集肝及血液分別用於編輯效率之NGS量測及血清TTR分析。此實驗中之sgRNA中之每一者靶向TTR基因中之相同序列，sgRNA之間的唯一差別為對各者作出的修飾(參見圖14A至D及15A至E；表4 SEQ ID No: 228至234)。G000209(測試兩個批次)充當較少修飾之對照，僅分別在sgRNA之5'及3'末端處之三個末端核苷酸處及之間具有2'-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵。(參見圖15D)。 圖14A至D中展示之結果顯示相比於較少修飾之G000209對照，在更大程度上修飾之sgRNA傾向於對於分析之細胞介素中之每一者誘發較小反應。在更大程度上修飾之sgRNA亦在治療之動物之肝中賦予較大編輯效率，其中相比於較少修飾之對照(G000209批次)之約44-47%，在更大程度上修飾之sgRNA中之兩者(例如G000263及G000267)之編輯%達到約60%(圖15A)。重要的是，與表型相關之編輯效率在TTR水準之血清敲除類似於或顯著大於較少修飾之對照時變化(參見例如圖15A至15B中之G000263及G000267相對於G000209批次)。末端修飾之G000209與高度修飾之G000267之間的差異概述於圖15D及15E中(2'-O-Me修飾之核苷酸以粗體顯示，且*表示硫代磷酸酯鍵)。 在另一活體內研究中，測試三種靶向小鼠TTR基因中之獨立序列之sgRNA。以2 mg/kg、1 mg/kg或0.3 mg/kg向小鼠(n=5隻每組)投與LNP之單次劑量。在給藥後四小時收集血液用於血清細胞介素分析。給藥後7天，在屍檢時收集肝及血液分別用於編輯效率之NGS量測及血清TTR分析。在此研究中，sgRNA中之每一者靶向TTR基因中之相同序列(與前述活體內研究中靶向之序列不同的序列)，其中一個sgRNA完全未經修飾(G000201 (SEQ ID NO: 243))，另一個僅具有末端修飾(G000211 (SEQ ID NO: 241))，分別在sgRNA之5'及3'末端處之三個末端核苷酸處及之間具有2'-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵)，且第三個sgRNA具有與前述活體內研究中之G000267相同之修飾模式(G000282 (SEQ ID NO: 242))。 如圖16A至16D中所示，sgRNA中之每一者對於測試之細胞介素中之每一者以劑量依賴性方式產生類似反應。對於編輯效率，未經修飾之sgRNA(G000201(SEQ ID NO: 243))賦予極小活體內編輯，而在很大程度上修飾之sgRNA(G000282(SEQ ID NO: 242))在2 mg/kg之劑量下賦予達到約60%之水準，其顯著大於在較少修飾之sgRNA(G000211(SEQ ID NO: 241))之情況下實現之水準（圖17A及B）。如同前述活體內研究，編輯水準與血清TTR敲除之量相關(圖17C及D)。 隨後藉由靶向小鼠TTR基因中之不同TTR序列(靶向與兩個前述活體內研究中靶向之序列不同的序列)之另外三個sgRNA之集合進行與第二活體內研究類似之研究。以2 mg/kg、1 mg/kg或0.3 mg/kg向小鼠(n=5隻每組)投與LNP之單次劑量。在給藥後四小時收集血液用於血清細胞介素分析。給藥後7天，在屍檢時收集肝及血液分別用於編輯效率之NGS量測及血清TTR分析。在此研究中，sgRNA中之每一者靶向TTR基因中之相同序列(與前述兩個活體內研究中靶向之序列不同的序列)，其中一個sgRNA完全未經修飾(G000285；(SEQ ID NO: 332))，另一個僅具有末端修飾(G000269(SEQ ID NO: 330))，分別在sgRNA之5'及3'末端處之三個末端核苷酸處及之間具有2'-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵)，且第三個sgRNA具有與前述兩個活體內研究中之G000267及G000282相同的修飾模式(G000283(SEQ ID NO: 331))。 在此研究中，未經修飾之sgRNA(G000285(SEQ ID NO: 332))賦予極小活體內編輯，而在很大程度上修飾之sgRNA(G000283(SEQ ID NO: 331))在2 mg/kg之劑量下賦予達到約60%之水準，其顯著大於在較少修飾之sgRNA(G000269(SEQ ID NO: 330))之情況下實現之水準(圖18A至18B)。如同前述活體內研究，編輯水準與血清TTR敲除之量相關(圖18C)。 在第四活體內研究中，對於另一基因(FVII)評估對gRNA之修飾的效應。對於研究內比較，包括第一活體內研究中測試之sgRNA中之兩個(G000209及G000267)。以2 mg/kg、1 mg/kg或0.3 mg/kg向小鼠(n=5隻每組)投與LNP之單次劑量且在給藥後四小時收集血液用於血清細胞介素分析。在給藥後6天，在屍檢時收集肝用於編輯效率之NGS量測。在此研究中，sgRNA中之每一者靶向TTR或FVII基因中之相同序列，其中各基因之一個sgRNA僅具有末端修飾，對於FVII為(G000208(SEQ ID NO: 286))，對於TTR為G000209，兩者分別在sgRNA之5'及3'末端處之三個末端核苷酸處及之間具有2'-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵)，且第二個sgRNA與對於FVII之前述活體內研究中之G000267、G000282及G000283(G000373(SEQ ID NO: 287)；對於TTR之G000267(SEQ ID NO: 234)具有相同的修飾模式)。 如圖19A至19D中所示，sgRNA中之每一者對於測試之細胞介素中之每一者以劑量依賴性方式產生類似反應。對於編輯效率，相比於較少修飾之型式(G000208(SEQ ID NO: 286))，靶向FVII之在更大程度上修飾之sgRNA(G000373(SEQ ID NO: 287))的編輯效率在測試之劑量中之每一者中增加(圖18A)。亦對於靶向TTR之sgRNA觀測到此等結果(圖20A至20B)。 在另一活體內研究中，測試另外十個與G000282靶向小鼠TTR基因中之相同序列的sgRNA。G000282亦包括於研究中用於比較目的。以1 mg/kg或0.5 mg/kg向小鼠(n=5隻每組)投與LNP之單次劑量。使用上文所述之LNP調配程序B調配用於此研究中之LNP。給藥後七(7)天，在屍檢時收集肝及血液分別用於編輯效率之NGS量測及血清TTR分析。在此研究中，sgRNA中之每一者靶向TTR基因中之相同序列。測試之各sgRNA之修飾模式變化且包括sgRNA之5'末端區、3'末端區、髮夾1區、髮夾2區、連接區、下部莖區、隆突區及上部莖區中之2'-OMe、2'-F及PS修飾。此研究之結果顯示於圖22A至22C中，包括編輯%(圖22A)、平均編輯及標準差(圖22B)及血清TTR水準(圖22C)。根據本文所描述之方法在初生小鼠肝細胞中測試此等相同sgRNA。此劑量反應TTR編輯研究之結果顯示於圖24A至24C中，包括編輯%(圖24A)、劑量反應曲線(圖24B)及EC50值(圖24C)。 在另一活體內研究中，測試另外十三個與G000282靶向小鼠TTR基因中之相同序列的sgRNA。G000282亦包括於研究中用於比較目的。以1 mg/kg向小鼠(n=5隻每組)投與LNP之單次劑量。使用上文所述之LNP調配程序C調配用於此研究中之LNP。用於此研究中之Cas9 mRNA具有SEQ ID NO: 359之序列。在給藥後四小時收集血液用於血清細胞介素分析。在給藥後7天，在屍檢時收集肝及血液分別用於編輯效率之NGS量測及血清TTR分析。在此研究中，sgRNA中之每一者靶向TTR基因中之相同序列。測試之sgRNA包括sgRNA之5'末端區、3'末端區、髮夾1區、髮夾2區及上部莖區中之額外2'-OMe及PS修飾。此研究之結果顯示於圖23A-23C中，包括編輯%(圖23A)、平均編輯%(圖23B)及血清TTR水準(圖23C)。
圖1顯示在藉由經修飾之crRNAs連同Cas9 mRNA及未經修飾之trRNA(TR000002)轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠甲狀腺素轉運蛋白(TTR)基因之下一代測序(NGS)所量測之編輯%。 圖2顯示在藉由經修飾之trRNA連同未經修飾之crRNA(CR000686)及Cas9 mRNA轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠TTR基因之NGS所量測之編輯%。 圖3顯示在藉由Cas9 mRNA及具有未發現於親本序列中之G-C配對之crRNA及trRNA轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠TTR基因之NGS所量測之編輯%。 圖4顯示在藉由經修飾之crRNA及trRNA連同Cas9 mRNA轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠TTR基因之NGS所量測之編輯%。標準差遵循該值。 圖5顯示在藉由經修飾之sgRNA連同Cas9 mRNA轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠TTR基因之NGS所量測之編輯%。 圖6顯示在藉由經修飾之crRNA及未經修飾之trRNA(TR000002)連同Cas9 mRNA轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠TTR基因之NGS所量測之編輯%。星號表示出於技術原因在此實驗中不顯示活性之雙嚮導。此雙嚮導在圖9中表示之實驗中再次測試，該雙嚮導在其中顯示編輯活性。 圖7顯示在藉由經修飾之trRNA連同未經修飾之crRNA(CR000686)及經修飾之trRNA連同Cas9 mRNA轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠TTR基因之NGS所量測之編輯%。 圖8顯示在藉由Cas9 mRNA及具有未發現於親本序列中之G-C配對或G-U失配之crRNA及trRNA配對轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠TTR基因之NGS所量測之編輯%。 圖9顯示在藉由經修飾之crRNA及經修飾之trRNA連同Cas9 mRNA轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠TTR基因之NGS所量測之編輯%。標準差遵循該值。 圖10顯示在藉由經修飾之sgRNA連同Cas9 mRNA轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠TTR基因之NGS所量測之編輯%。 圖11顯示在藉由經修飾之sgRNA連同Cas9 mRNA轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠因子VII(FVII)基因之NGS所量測之編輯%。 圖12A及12B顯示在藉由經修飾之crRNA及未經修飾之trRNA連同Cas9 mRNA轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠TTR (圖12A)或FVII (圖12B)之NGS所量測之編輯%。 圖13A及13B顯示在藉由經修飾之trRNA及未經修飾之crRNA連同Cas9 mRNA轉染Neuro2A細胞之後，如藉由小鼠TTR (圖13A)或FVII (圖13B)之NGS所量測之編輯%。 圖14A、14B、14C及14D顯示在活體內投與包含Cas9 mRNA及sgRNA之LNP之後，血清中之干擾素α(IFN-α，14A)、介白素6(IL-6，14B)、單核球趨化蛋白1(MCP-1，14C)及腫瘤壞死因子α(TNF-α，14D)含量。 圖15A、15B及15C顯示在投與包含Cas9 mRNA及sgRNA之LNP之後的活體內結果。圖15A顯示肝中之總編輯的百分比。圖15B顯示血清TTR水準。圖15C顯示圖15A之結果的平均值及標準差。圖15D概括對G000209 sgRNA(SEQ ID NO: 228)之修飾。圖15E概括對G000267 sgRNA(SEQ ID NO: 234)之修飾。在圖15D及15E中，呈粗體之核苷酸經2'-O-Me修飾。 圖16A、16B、16C及16D顯示在活體內投與包含Cas9 mRNA及sgRNA之LNP之後，血清中之干擾素α(IFN-α，16A)、腫瘤壞死因子α(TNF-α，16B)、介白素6(IL-6，16C)及單核球趨化蛋白1(MCP-1，16D)含量。 圖17A、17B、17C及17D顯示在投與包含Cas9 mRNA及sgRNA之LNP之後的活體內結果。圖17A顯示肝中之總編輯的百分比。圖17B顯示圖17A之結果的平均值及標準差。圖17C顯示血清TTR水準。圖17D顯示圖17B之結果的平均值及標準差。 圖18A、18B及18C顯示在投與包含Cas9 mRNA及sgRNA之LNP之後的活體內結果。圖18A顯示肝中之總編輯的百分比。圖18B概括肝編輯數據。圖18C顯示血清TTR水準。MPK=毫克/公斤；BLOD=低於檢測水準。 圖19A、19B、19C及19D顯示在活體內投與包含Cas9 mRNA及sgRNA之LNP之後，血清中之干擾素α(IFN-α，19A)、單核球趨化蛋白1(MCP-1，19B)、介白素6(IL-6，19C)及腫瘤壞死因子α(TNF-α，19D)含量。 圖20A及20B顯示在活體內投與包含Cas9 mRNA及sgRNA之LNP之後，FVII基因座(圖20A)及TTR基因座(圖20B)之肝中之編輯。 圖21A、21B及21C顯示註釋之sgRNA(SEQ ID NO: 341)(圖21A)、未註釋之dgRNA CR000686(SEQ ID NO: 1)及TR000002(SEQ ID NO: 188)(圖21B)及註釋之dgRNA CR000686(SEQ ID NO: 1)及TR000002(SEQ ID NO: 188)(圖21C)之示意圖。 圖22A、22B及22C顯示在投與包含Cas9 mRNA及sgRNA之LNP之後的活體內結果。圖22A顯示肝中之TTR基因座之總編輯的百分比。圖22B概括肝編輯數據。圖22C顯示血清TTR水準。 圖23A、23B及23C顯示在投與包含Cas9 mRNA及sgRNA之LNP之後的活體內結果。圖23A顯示肝中之TTR基因座之總編輯的百分比。圖23B概括肝編輯數據。圖23C顯示血清TTR水準。 圖24A、24B及24C顯示在投與包含Cas9 mRNA及sgRNA之LNP後，初生小鼠肝細胞中之編輯。FIG24A顯示TTR基因座之總編輯的編輯百分比。FIG24B顯示隨用於計算EC50之mRNA劑量而變之編輯百分比的歸一化變換。圖24C顯示測試之LNP的EC50值。
<110> 美商英特利亞醫療公司(INTELLIA THERAPEUTICS,INC.)
<120> 經修飾之嚮導RNA
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<212> RNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<211> 100
<212> RNA
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<212> RNA
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<220>
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
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<211> 80
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<211> 80
<212> RNA
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<212> RNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n is a,c,g,or u
<400> 357
<210> 358
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯鍵
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> N=任何核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯鍵
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> 硫代磷酸酯鍵
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(20)
<223> n為a,c,g，或u
<220>
<221> modified_base
<222> (29)..(40)
<223> 2'-O-Me修飾之核苷酸
<220>
<221> modified_base
<222> (69)..(100)
<223> 2'-O-Me修飾之核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(98)
<223> 硫代磷酸酯鍵
<220>
<221> misc_feature
<222> (98)..(99)
<223> 硫代磷酸酯鍵
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(100)
<223> 硫代磷酸酯鍵
<400> 358
<210> 359
<211> 4514
<212> RNA
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<220>
<221> source
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<211> 4603
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /附註=「人工序列之描述：mRNA轉錄物」
<400> 360
Claims (49)
- 一種單嚮導RNA(single guide RNA；sgRNA)，其包含：(i)上部莖區及髮夾區，其中(a)該上部莖區中之各核苷酸經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾，(b)該髮夾區包含髮夾1區及髮夾2區，且該髮夾2區中之各核苷酸經2'-O-Me修飾，或(a)及(b)二者；及(ii)5'端修飾，其在5'末端之5'端處之前七個核苷酸內包含至少兩個硫代磷酸酯(PS)鍵。
- 如請求項1之sgRNA，其中該sgRNA包含上部莖區中之一或多個修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其中該sgRNA包含髮夾1區中之一或多個修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其中該sgRNA包含髮夾2區中之一或多個修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其中該髮夾區包含髮夾1區及髮夾2區，且該sgRNA各在上部莖區、髮夾1區及髮夾2區中包含一或多個修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其中該髮夾區包含髮夾1區及髮夾2區，且該sgRNA包含髮夾1區與髮夾2區之間的經修飾之核苷酸。
- 如請求項1之sgRNA，其進一步包含含有修飾之下部莖區。
- 如請求項1之sgRNA，其進一步包含含有修飾之3'末端區。
- 如請求項8之sgRNA，其中該3'末端區之修飾為3'端修飾。
- 如請求項9之sgRNA，其中該3'末端之該3'端處之最後四個核苷酸中之至少兩者經2'-O-Me、2'-氟基(2'-F)或2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾進行修飾。
- 如請求項9之sgRNA，其進一步包含該3'末端之該3'端處之該最後四個核苷酸中之一或多者之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。
- 如請求項1之sgRNA，其進一步包含一或多個含有修飾之隆突區(bulge region)及含有修飾之連接區(nexus region)。
- 如請求項2至12中任一項之sgRNA，其中該修飾包含一或多個2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸或核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。
- 如請求項1之sgRNA，其中該5'末端之該5'端處之至少前三個核苷酸及3'末端(3' terminus)之3'端(3' end)處之最後三個核苷酸經修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其中該5'末端之該5'端處之前四個核苷酸及3'末端之3'端處之最後四個核苷酸與硫代磷酸酯(PS)鍵鍵聯。
- 如請求項15之sgRNA，其進一步包含該5'末端處、該3'末端處或二者處之2'-O-Me或2'-F修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其中該5'末端之該5'端處之前四個核苷酸及該3'末端之該3'端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中該5'末端之該5'端處之前三個核苷酸及3'末端之3'端處之最後三或四個核苷酸包含2'-O-Me修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其中該5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中該5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含一或多個2'-O-Me、2'-F或2'-O-moe修飾。
- 如請求項12之sgRNA，其中(1)一或多個LS1、LS6、LS7、LS8、LS11或LS12經2'-O-Me修飾；(2)該隆突區中之該等核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾；或(3)該隆突區中之該等核苷酸中之至少50%經2'-O-Me修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其中該上部莖區中之該等核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾進行修飾。
- 如請求項12之sgRNA，其中該連接區中之一或多個N16、N17或N18經2'-O-Me修飾，或其中該連接區中之一或多個N15、N16、N17或N18經修飾。
- 如請求項21之sgRNA，其中該連接區中之該等修飾係選自2'-O-Me及2'F。
- 如請求項1之sgRNA，其中該髮夾1區或髮夾2區之一或二者中之該等核苷酸中之每一者經2'-O-Me修飾進行修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其包含：a. 5'末端之5'端處之前三個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸；b. US1至US12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；c. H1-1至H1-12處之2'-O-Me修飾之核苷酸；d. H2-1至H2-15處之2'-O-Me修飾之核苷酸；及e. 3'末端之3'端處之最後四個核苷酸處之2'-O-Me修飾之核苷酸。
- 如請求項24之sgRNA，其進一步包含三個鍵聯該5'末端之該5'端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵，以及三個鍵聯該3'末端之該3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。
- 如請求項24之sgRNA，其進一步包含該5'末端之該5'端處之前七個核 苷酸內之至少一個硫代磷酸酯(PS)鍵。
- 如請求項1之sgRNA，其中該上部莖區自其5'端至3'端包含US1至US 12處，且該髮夾區包含髮夾1區及髮夾2區，其中該髮夾1區自其5'端至3'端包含H1-1至H1-12，該髮夾2區自其5'端至3'端包含H2-1至H2-15，且其中該sgRNA包含以下之處之2'-O-Me修飾之核苷酸組成之2'-O-Me修飾之核苷酸：a. 5'末端之5'端處前三個核苷酸；b. US1、US2、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12處之各核苷酸；c. H1-1、H1-2、H1-3、H1-4、H1-5、H1-6、H1-7、H1-8、H1-9、H1-10、H1-11、H1-12、H1-13及H1-14處之各核苷酸；d. 髮夾1區與髮夾2區之間的核苷酸；e. H2-1、H2-2、H2-3、H2-4、H2-5、H2-6、H2-7、H2-8、H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14及H2-15處之各核苷酸；及f. 3'末端之3'端處之最後四個核苷酸；且三個鍵聯5'末端之5'端處之前四個核苷酸之PS鍵及三個鍵聯3'末端之3'端處之最後四個核苷酸之PS鍵。
- 如請求項1之sgRNA，其中該sgRNA為包含SEQ ID No：235、236、240、265-283、309-327及331中之任一者之sgRNA。
- 一種sgRNA，其包含(SEQ ID NO：355)，其中該sgRNA之核苷酸係經如請求項1至26中任一項之sgRNA之修飾模式進行修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其包含
(SEQ ID No：242)，或
(SEQ ID NO：358)，其中*表示該核苷酸係經由PS鍵連接至下一個核苷酸，且小寫「m」表示該核苷酸係經2'-O-Me修飾，其中N係任何核苷酸。
- 如請求項1之sgRNA，其中該sgRNA與化膿性鏈球菌(S.pyogenes)Cas9形成核糖核蛋白複合物(ribonucleoprotein complex)。
- 如請求項1之sgRNA，其中該sgRNA包含上部莖區中之各核苷酸處之2'-O-Me修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其中該sgRNA包含髮夾1區及髮夾2區中之核苷酸中之50%或大於50%處之2'-O-Me修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其中該sgRNA包含上部莖區中之各核苷酸處之2'-O-Me修飾，以及髮夾1區及髮夾2區中之核苷酸中之50%或大於50%處之2'-O-Me修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其中該sgRNA包含起始於H2-1或H2-2處之各核苷酸至3'末端之最後一個核苷酸處之2'-O-Me修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其包含SEQ ID NO：357之核苷酸序列。
- 如請求項1之sgRNA，其包含以下處之2'-O-Me修飾之核苷酸：a. 5'末端之5'端處前三個核苷酸；b. 上部莖區中之各核苷酸；c. 髮夾1區中之各核苷酸；d. 髮夾1區與髮夾2區之間的核苷酸；e. 髮夾2區中之各核苷酸；及f. 3'末端之3'端處之最後四個核苷酸。
- 如請求項1之sgRNA，其中該5'末端之該5'端處之前四個核苷酸及3'末端之3'端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，且其中該5'末端之該5'端處之前三個核苷酸及3'末端之3'端處之最後三個核苷酸經2'-O-Me修飾，且其中該上部莖區中之各核苷酸經2'-O-Me修飾。
- 如請求項1之sgRNA，其中該5'末端之該5'端處之前四個核苷酸及3'末端之3'端處之最後四個核苷酸與PS鍵鍵聯，其中該5'末端之該5'端處之前三個核苷酸及3'末端之3'端處之最後四個核苷酸經2'-O-Me修飾，且其中該上部莖區中之各核苷酸經2'-O-Me修飾。
- 一種醫藥組合物，其包含與脂質奈米粒子(lipid nanoparticle；LNP)聯合之如請求項1至39中任一項之sgRNA。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至39中任一項之sgRNA及核酸酶或編碼該核酸酶之mRNA。
- 如請求項41之醫藥組合物，其中該核酸酶為Cas9蛋白質。
- 如請求項41之醫藥組合物，其中該核酸酶為化膿性鏈球菌(S.pyogenes)Cas9。
- 如請求項41之醫藥組合物，其中該核酸酶為切口酶(nickase)或經修飾之核酸酶。
- 如請求項44之醫藥組合物，其中該經修飾之核酸酶包含核定位信號(nuclear localization signal；NLS)。
- 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至39中任一項之sgRNA及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種修飾標靶DNA之方法，其包含於活體外將如請求項1至39中任一項之sgRNA及Cas蛋白質或編碼Cas蛋白質之核酸遞送至細胞。
- 如請求項1之sgRNA，其係用於製備供治療疾病或病症用之藥物。
- 一種如請求項1至39中任一項之sgRNA之用途，其係用於製備治療有需要基因編輯之疾病或病症之藥物。
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