TW202334419A - 用於基因編輯之經修飾引導rna - Google Patents
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Abstract
本發明係關於在基因編輯方法中具有改良之活體外及活體內活性的經修飾之引導RNA。本發明亦關於具有經修飾之引導RNA的奈瑟氏腦膜炎菌(
N. meningitidis) Cas9 (NmeCas9)基因編輯系統。
Description
本發明係關於使用CRISPR/Cas9系統進行基因編輯之領域,該系統為識別及切割外源性遺傳元件之原核免疫系統之一部分。
CRISPR/Cas9系統依賴於稱為CRISPR相關蛋白9 (Cas9)之單一核酸酶,其於DNA中誘發位點特異性斷裂。Cas9藉由稱為引導RNA (gRNA)之小RNA分子引導至特定DNA序列。完整引導RNA包含tracrRNA (trRNA)及crisprRNA (crRNA)。包含引導區的crRNA亦可稱為gRNA,應理解為了形成完整gRNA,其應為trRNA或與trRNA共價或非共價締合。trRNA及crRNA可包含於單引導RNA (sgRNA)內或包含於雙引導RNA (dgRNA)之兩個各別RNA分子中。Cas9與gRNA之組合稱為Cas9核糖核蛋白複合物(RNP)。
CRISPR/Cas9系統存在於各種細菌物種中,且可具有不同特性,包括關於gRNA長度及裂解中之序列特異性程度。奈瑟氏腦膜炎菌(
Neisseria meningitidis) Cas9 (NmeCas9)具有有利的低脫靶裂解速率,但使用相對較長gRNA,其使活體外gRNA合成複雜化。
寡核苷酸及尤其RNA有時在細胞及血清中藉由非酶性的核酸內切酶或核酸外切酶裂解而降解。可在各種位置進行修飾以減少或防止此類降解來合成寡核苷酸。鑒於寡核苷酸合成之循環性質及不完美產率,縮短gRNA同時保持或甚至改良其活性將為所需的,例如以使得可以較高產率獲得gRNA,或包含gRNA之組合物具有較大均勻性或較少不完全或不正確產物。另外,尤其對於治療應用,需要用於防止此類降解、改良gRNA之穩定性且提高基因編輯效率之經改良方法及組合物。本發明旨在滿足此等需求中之一或多者,提供其他益處,或至少為公眾提供有用選擇。
本發明係關於使用奈瑟氏腦膜炎菌CRISPR/Cas9系統之基因編輯。NmeCas9小於釀膿鏈球菌Cas9 (SpyCas9),允許NmeCas9適用於基於信使RNA(mRNA)之遞送方法。然而,NmeCas9形成具有比SpyCas9引導RNA長之gRNA的RNP。NmeCas9習知使用之gRNA的長度為145或更多個核苷酸(Ibraheim等人 Genome Biology (2018) 19:137),縮短gRNA同時保留甚至提高其活性對於防止降解及提高gRNA之穩定性及提高基因編輯效率將為合乎需要的。
在一些實施例中,提供基因體編輯工具,其包含具有如本文所述之一或多個縮短區之引導RNA (gRNA)。本文所述之縮短區可促進具有更高產率或均一性之gRNA的合成,或者可提高gRNA及gRNA/Cas9複合物之穩定性,或者提高Cas9裂解目標DNA之活性。
在一些實施例中,提供具有如本文所述之一或多個縮短區或取代之crisprRNA (crRNA)或tracrRNA (trRNA)。在一些實施例中,雙引導RNA (dgRNA)包含經修飾crRNA或經修飾trRNA。在一些實施例中,單引導RNA (sgRNA)包含經修飾crRNA或經修飾trRNA。本文所述之縮短區或取代可促進具有更高產率或均一性之gRNA的合成,或者可提高gRNA及gRNA/Cas9複合物之穩定性,或者提高Cas9裂解目標DNA之活性。相比於NmeCas9 145聚體sgRNA,本發明所揭示之gRNA的合成可增加gRNA之粗產率。類似地,如藉由全長產物之比例所量測之gRNA樣品純度(例如粗純度)可增加。引導RNA可以較高產率獲得,或包含gRNA之組合物可具有較高均一性或較少不完整或不正確產物。引導RNA純度可使用離子對逆相高效液相層析(IP-RP-HPLC)及離子交換HPLC方法評估,例如與Kanavarioti等人,Sci Rep
9, 1019 (2019) (doi:10.1038/s41598-018-37642-z)中相同。使用波長為260 nm之UV光譜法,可藉由層析圖中主峰之吸光度與所有峰之累積吸光度之比來確定粗純度及最終純度。合成產率係以最終樣品在260 nm下之吸光度與輸入材料之理論吸光度的比率測定。
涵蓋以下實施例。
在一些實施例中,提供一種引導RNA (gRNA),其包含引導區及保守區,該保守區包含以下中之一或多者:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65;或
(b)經縮短之髮夾1區,其中該經縮短之髮夾1缺少2-10個、視情況2-8個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失,且視情況位置82-96中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96;或
(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失,且視情況核苷酸113-134中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135;
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失;
其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,提供一種引導RNA (gRNA),其包含引導區及保守區,該保守區包含以下中之一或多者:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區相對於SEQ ID NO: 500缺少18-22個核苷酸,其中
(i)核苷酸37-48及53-64缺失;且
(ii)核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65;或
(b)經縮短之髮夾1區,其中經縮短之髮夾1缺少2個核苷酸,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸86及91缺失或核苷酸85及92缺失;或
(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少18個核苷酸,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134缺失;且
其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144-145缺失;
其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
前述實施例之引導RNA (gRNA)包含引導區及保守區,該保守區包含:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少18-22個核苷酸,其中
(i)核苷酸37-48及53-64相對於SEQ ID NO: 500缺失;且
(ii)核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65;
(b)經縮短之髮夾1區,其中經縮短之髮夾1相對於SEQ ID NO: 500缺少2個核苷酸,其中核苷酸86及91缺失或核苷酸85及92缺失;
(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少18個核苷酸,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134缺失;且
(d)其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144-145缺失;
其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在其他實施例中,經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區相對於SEQ ID NO: 500缺少22個核苷酸。在其他實施例中,核苷酸36藉由包含核苷酸序列UGAAAC之序列連接至核苷酸65。在其他實施例中,核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。在其他實施例中,核苷酸36藉由包含核苷酸序列UUCGAAAGAC (SEQ ID NO:950)之序列連接至核苷酸65。
在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾。在一些實施例中,gRNA包含3'端修飾。在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾及3'端修飾。在一些實施例中,gRNA包含重複/反重複區之上莖區中之修飾。在一些實施例中,gRNA包含髮夾1區中之修飾。在一些實施例中,gRNA包含髮夾2區中之修飾。
在一些實施例中,前述修飾中之任一者為選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵或反向無鹼基修飾之核苷酸,視情況其中gRNA包含至少兩個獨立地選自以下之修飾:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵及反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中,5'端修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:(i) 2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸,(ii) 2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸,(iii)2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸,(iv)核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵,或(v)反向無鹼基修飾之核苷酸,視情況,其中gRNA包含至少兩個獨立地選自(i)-(v)之5'端修飾。
在一些實施例中,3'端修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:(i) 2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸,(ii) 2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸,(iii)2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸,(iv)核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵,或(v)反向無鹼基修飾之核苷酸,視情況,其中gRNA包含至少兩個獨立地選自(i)-(v)之3'端修飾。
在一些實施例中,5'端修飾包含:
i. 前1-4個核苷酸中之一或多者的修飾,其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe或2'-F;
ii. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對第一核苷酸之修飾,及視情況存在之連至下一核苷酸或該3'尾之第一核苷酸的一或兩個PS鍵聯;
iii. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對第一或第二核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯;
iv. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對第一、第二或第三核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯;或
v. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對第一、第二、第三或第四核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯,
視情況,其中gRNA包含至少兩個獨立地選自(i)-(v)之5'端修飾。
如前述技術方案中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含:
i. 最後1-4個核苷酸中之一或多者的修飾,其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe或2'-F;
ii. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對最後一個核苷酸之修飾,及視情況存在之連至下一核苷酸或該3'尾之第一核苷酸之一或兩個PS鍵聯;
iii. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對最後一個或倒數第二個核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯;
iv. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對最後一個、倒數第二個或倒數第三個核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯;或
v. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對最後一個、倒數第二個、倒數第三個或倒數第四個核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯,
視情況其中gRNA包含至少兩個獨立地選自(i)-(v)之3'端修飾。
在一些實施例中,重複/反重複區、髮夾1區或髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:(i) 2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸,(ii) 2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸,(iii) 2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸,或(iv)核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵,視情況其中重複/反重複區、髮夾1區或髮夾2區中之修飾包含至少兩個獨立地選自(i)-(iv)之修飾。
在一些實施例中,重複/反重複區、髮夾1區或髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:(i) 2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸,(ii) 2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸,或(iii)核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵,視情況其中重複/反重複區、髮夾1區或髮夾2區中之修飾包含至少兩個獨立地選自(i)-(iii)之修飾。
在一些實施例中,重複/反重複區、髮夾1區或髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:(i) 2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸,或(ii)核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵,視情況其中重複/反重複區、髮夾1區或髮夾2區中之修飾包含至少兩個獨立地選自(i)及(ii)之修飾。
在一些實施例中,提供一種包含與本文所揭示之脂質奈米粒子(LNP)締合之gRNA的組合物。在一些實施例中,提供一種包含本文所揭示之gRNA的LNP組合物。在一些實施例中,組合物進一步包含核酸酶或編碼核酸酶之mRNA。
本文提供以下額外實施例。
實施例1為一種引導RNA (gRNA),其包含引導區及保守區,該保守區包含以下中之一或多者:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65;或
(b)經縮短之髮夾1區,其中該經縮短之髮夾1缺少2-10個、視情況2-8個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失,且視情況位置82-96中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96;或
(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失,且視情況核苷酸113-134中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135;
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失;
其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
實施例2為如實施例1之gRNA,其中gRNA為單引導RNA (sgRNA)且其中gRNA包含(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65。
實施例3為如實施例1或2之gRNA,其中該引導區具有(i)相對於SEQ ID NO: 500,在位置1-24內一個核苷酸之插入或1-4個核苷酸之缺失,或(ii) 24個核苷酸之長度。
實施例4為如實施例3之gRNA,其中該引導區具有25、24、23、22、21或20個核苷酸之長度,視情況其中該引導區具有25、24、23或22個核苷酸之長度。
實施例5為如實施例4之gRNA,其中該引導區具有23-24個核苷酸之長度。
實施例6為如實施例1-5中任一項之gRNA,其中該gRNA進一步包含3'尾。
實施例7為如實施例6之gRNA,其中3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。
實施例8為如實施例7之gRNA,其中該3'尾包含1、2、3、4或5個核苷酸。
實施例9為如實施例6-8中任一項之gRNA,其中該3'尾以包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸終止。
實施例10為如實施例6-9中任一項之gRNA,其中該3'尾之長度為1個核苷酸。
實施例11為如實施例6-10中任一項之gRNA,其中該3'尾由包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸組成。
實施例12為如實施例6-11中任一項之gRNA,其中該3'尾包含存在於該3'尾中之核苷酸中之任何一或多者的修飾。
實施例13為如實施例6-12中任一項之gRNA,其中3'尾之修飾為2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸及核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯中之一或多者。
實施例14為如實施例6-13中任一項之gRNA,其中該3'尾經完全修飾。
實施例15為如實施例1-14中任一項之gRNA,其中該gRNA之3'核苷酸為包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸。
實施例16為如實施例1-5中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144及145中之一或多者缺失。
實施例17為如實施例1-5中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144及145均缺失。
實施例18為如實施例1-5中任一項之gRNA,其中該gRNA不包含3'尾。
實施例19為如實施例1-18中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸。
實施例20為如實施例1-19中任一項之gRNA,其中經縮短之重複/反重複區具有28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸之長度。
實施例21為如實施例1-20中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區缺少12-24個、視情況18-24個核苷酸、視情況20-22個核苷酸。
實施例22為如實施例1-21中任一項之gRNA,其中經縮短之重複/反重複區具有28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。
實施例23為如實施例1-22中任一項之gRNA,其中經縮短之重複/反重複區具有28、29、30、31、32、33或34個核苷酸,或30、31或32個核苷酸之長度。
實施例24為如實施例1-23中任一項之gRNA,其中SEQ ID NO: 500之核苷酸37-64形成上莖,且該經縮短之重複/反重複區之上莖的一或多個鹼基對缺失。
實施例25為如實施例1-24中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區之上莖包含不超過一個、兩個、三個或四個鹼基對。
實施例26為如實施例1-25中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的位置39-48中之所有者及位置53-62中之所有者均缺失,且視情況核苷酸38或63經取代。
實施例27為如實施例1-26中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的位置38-48中之所有者及位置53-63中之所有者均缺失,且視情況核苷酸37或64經取代。
實施例28為如實施例1-27中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的核苷酸37-48及53-64中之所有者均缺失,且視情況核苷酸36或65經取代。
實施例29為如實施例1-28中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有長度為11個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
實施例30為如實施例1-29中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有單一雙螺旋部分。
實施例31為如實施例1-29中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有第一雙螺旋部分及第二雙螺旋部分。
實施例32為如實施例31之gRNA,其中第二雙螺旋部分之長度為2-3個鹼基配對核苷酸。
實施例33為如實施例31之gRNA,其中該第一雙螺旋部分之長度為11個鹼基配對核苷酸且該第二雙螺旋部分之長度為3個鹼基配對核苷酸。
實施例34為如實施例1-33中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,該經縮短之重複/反重複區之該上莖包括一或多個取代。
實施例35為如實施例1-34中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸49-52中之一或多者經取代。
實施例36為如實施例1-33中任一項之gRNA,其中經縮短之重複/反重複區未經取代。
實施例37為如實施例1-36中任一項之gRNA,其中經縮短之重複/反重複區具有12-22個經修飾之核苷酸。
實施例38為如實施例37之gRNA,其中經縮短之重複/反重複區不包含核苷酸76處之修飾。
實施例39為如實施例37之gRNA,其中經縮短之重複/反重複不包含核苷酸76處之硫代磷酸酯(PS)修飾。
實施例40為如實施例1-39中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區缺少2-10個核苷酸,視情況2-8個或2-4個核苷酸。
實施例41為如實施例1-40中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾1區具有13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸之長度。
實施例42為如實施例1-41中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區具有長度為4-8個、視情況7-8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
實施例43為如實施例1-41中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區具有單一雙螺旋部分。
實施例44為如實施例1-43中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區之一或兩個鹼基對缺失。
實施例45為如實施例1-44中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區之莖的長度為七個或八個鹼基配對核苷酸。
實施例46為如實施例1-45中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區之位置85-86中之一或多者及核苷酸91-92中之一或多者缺失。
實施例47為如實施例1-46中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區之核苷酸86及91或核苷酸85及92缺失。
實施例48為如實施例1-47中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,經縮短之髮夾1區之核苷酸82-95中之一或多者經取代。
實施例49為如實施例1-48中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸87-90中之一或多者經取代。
實施例50為如實施例1-48中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾1區未經取代。
實施例51為如實施例1-49中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾1區具有6-15個經修飾之核苷酸。
實施例52為如實施例1-50中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸。
實施例53為如實施例1-51中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。
實施例54為如實施例1-52中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區具有28、29、30、31、32、33或34個核苷酸之長度。
實施例55為如實施例1-53中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區之核苷酸113-121中之一或多者及核苷酸126-134中之一或多者缺失。
實施例56為如實施例1-54中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區包含不配對區。
實施例57為如實施例1-55中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區具有兩個雙螺旋部分。
實施例58為如實施例1-56中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區具有長度為4個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
實施例59為如實施例57-58中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區具有長度為4-8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
實施例60為如實施例57-59中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區具有長度為4-6個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
實施例61為如實施例1-60中任一項之gRNA,其中SEQ ID NO: 500之核苷酸109-138形成上莖,且經縮短之髮夾2區之上莖包含一個、兩個、三個或四個鹼基對。
實施例62為如實施例1-61中任一項之gRNA,其中核苷酸113與134、核苷酸114與133、核苷酸115與132、核苷酸116與131、核苷酸117與130、核苷酸118與129、核苷酸119與128、核苷酸120與127及核苷酸121與126中之至少一對缺失。
實施例63為如實施例1-62中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區之位置113-121及126-134中之所有者均缺失。
實施例64為如實施例1-63中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,經縮短之髮夾2區之核苷酸113-134中之一或多者經取代。
實施例65為如實施例1-64中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸122-125中之一或多者經取代。
實施例66為如實施例1-64中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區未經取代。
實施例67為如實施例1-66中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區具有6-15個經修飾之核苷酸。
實施例68為如實施例1-67中任一項之gRNA,其中該gRNA之該引導區包含至少兩個經修飾之核苷酸、視情況至少四個經修飾之核苷酸。
實施例69為如實施例1-68中任一項之gRNA,其中gRNA之引導區包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個經修飾之核苷酸,視情況1、2或3個經修飾之核苷酸。
實施例70為如實施例1-69中任一項之gRNA,其中gRNA之引導區包含4、5、6、7、8、9、10、11或12個經修飾之核苷酸。
實施例71為如實施例1-70中任一項之gRNA,其中gRNA之引導區包含6、7、8、9、10、11或12個經修飾之核苷酸。
實施例72為如實施例1-71中任一項之gRNA,其中該引導區在該引導區之前三個核苷酸之3'不包含經修飾之核苷酸。
實施例73為如實施例1-66中任一項之gRNA,其中該引導區不包含經修飾之核苷酸。
實施例74為如實施例1-72中任一項之gRNA,其中該gRNA包含5'端修飾。
實施例75為如實施例1-74中任一項之gRNA,其中該gRNA包含3'端修飾。
實施例76為如實施例1-75中任一項之gRNA,其中該gRNA包含5'端修飾及3'端修飾。
實施例77為如實施例1-76中任一項之gRNA,其包含該重複/反重複區之上莖區中之修飾。
實施例78為如實施例1-77中任一項之gRNA,其包含該髮夾1區中之修飾。
實施例79為如實施例1-78中任一項之gRNA,其包含該髮夾2區中之修飾。
實施例80為如實施例79之gRNA,其中髮夾2區中之修飾包含在核苷酸106-109之1、2、3或4個核苷酸處之修飾。
實施例81為如實施例80之gRNA,其中髮夾2區中之修飾包含核苷酸106-109中之各者處之修飾。
實施例82為如實施例80或81中任一項之gRNA,其中修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾。
實施例83為如實施例1-82中任一項之gRNA,其包含3'端修飾,且包含該重複/反重複區之上莖區中之修飾。
實施例84為如實施例1-83中任一項之gRNA,其包含3'端修飾及該髮夾1區中之修飾。
實施例85為如實施例1-83中任一項之gRNA,其包含3'端修飾及該髮夾2區中之修飾。
實施例86為如實施例1-85中任一項之gRNA,其包含5'端修飾,且包含該重複/反重複區之上莖區中之修飾。
實施例87為如實施例1-86中任一項之gRNA,其包含5'端修飾及該髮夾1區中之修飾。
實施例88為如實施例1-87中任一項之gRNA,其包含5'端修飾及該髮夾2區中之修飾。
實施例89為如實施例1-88中任一項之gRNA,其包含5'端修飾、重複/反重複區之上莖區中之修飾及3'端修飾。
實施例90為如實施例1-89中任一項之gRNA,其包含5'端修飾、該髮夾1區中之修飾及3'端修飾。
實施例91為如實施例1-90中任一項之gRNA,其包含5'端修飾、該髮夾1區中之修飾、該髮夾2區中之修飾及3'端修飾。
實施例92為如實施例1-91中任一項之gRNA,其包含5'端修飾、該重複/反重複區中之修飾、該髮夾1區中之修飾、該髮夾2區中之修飾及3'端修飾。
實施例93為如實施例1-92中任一項之gRNA,其中重複/反重複區中之修飾不包含核苷酸76處之硫代磷酸酯(PS)修飾。
實施例94為如實施例1-93中任一項之gRNA,其中重複/反重複區中之修飾不包含核苷酸76處之修飾。
實施例95為如實施例74-94中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或反向無鹼基修飾之核苷酸。
實施例96為如實施例74-95中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或反向無鹼基修飾之核苷酸。
實施例97為如實施例74-96中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含以下中之任一者:
i. 前1、2、3或4個核苷酸中之任何一或多者之修飾;
ii. 一個經修飾之核苷酸;
iii. 兩個經修飾之核苷酸;
iv. 三個經修飾之核苷酸;及
v. 四個經修飾之核苷酸。
實施例98為如實施例74-97中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含以下中之一或多者:
i. 核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯;
ii. 2'-OMe修飾之核苷酸;
iii. 2'-O-moe修飾之核苷酸;
iv. 2'-F修飾之核苷酸;及
v. 反向無鹼基修飾之核苷酸。
實施例99為如實施例74-98中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含以下中之任一者:
i. 最後4、3、2或1個核苷酸中之任何一或多者之修飾;
ii. 一個經修飾之核苷酸;
iii. 兩個經修飾之核苷酸;
iv. 三個經修飾之核苷酸;及
v. 四個經修飾之核苷酸。
實施例100為如實施例74-99中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含以下中之一或多者:
i. 核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯;
ii. 2'-OMe修飾之核苷酸;
iii. 2'-O-moe修飾之核苷酸;
iv. 2'-F修飾之核苷酸;及
v. 反向無鹼基修飾之核苷酸。
實施例101為如實施例74-100中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含至少一個PS鍵聯,且其中存在以下中之一或多者:
i. 存在一個PS鍵聯,且該鍵聯介於第一個核苷酸與第二個核苷酸之間;
ii. 前三個核苷酸之間存在兩個PS鍵聯;
iii. 前四個核苷酸中之任何一或多者之間存在PS鍵聯;及
iv. 前五個核苷酸中之任何一或多者之間存在PS鍵聯。
實施例102為如實施例101之gRNA,其中5'端修飾進一步包含至少一個經2'-OMe、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。
實施例103為如實施例1-102中任一項之gRNA,其中5'端修飾包含:
i. 前1-4個核苷酸中之一或多者的修飾,其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe或2'-F;
ii. 2'-Ome、2'-O-moe或2'-F對第一核苷酸之修飾,及視情況存在之連至下一核苷酸或該3'尾之第一核苷酸的一或兩個PS鍵聯;
iii. 2'-Ome、2'-O-moe或2'-F對第一或第二核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯;
iv. 2'-Ome、2'-O-moe或2'-F對第一、第二或第三核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯;或
v. 2'-Ome、2'-O-moe或2'-F對第一、第二、第三或第四核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯。
實施例104為如實施例1-103中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含至少一個PS鍵聯,且其中存在以下中之一或多者:
i. 存在一個PS鍵聯,且該鍵聯介於最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間;
ii. 最後三個核苷酸之間存在兩個PS鍵聯;及
iii. 最後四個核苷酸中之任何一或多者之間存在PS鍵聯。
實施例105為如實施例104之gRNA,其中該3'端修飾進一步包含至少一個2'-Ome、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。
實施例106為如實施例1-105中任一項之gRNA,其中3'端修飾包含:
i. 最後1-4個核苷酸中之一或多者的修飾,其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe或2'-F;
ii. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對最後一個核苷酸之修飾,及視情況存在之連至下一核苷酸或該3'尾之第一核苷酸之一或兩個PS鍵聯;
iii. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對最後一個或倒數第二個核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯;
iv. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對最後一個、倒數第二個或倒數第三個核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯;或
v. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對最後一個、倒數第二個、倒數第三個或倒數第四個核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯。
實施例107為如實施例1-106中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸或核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
實施例108為如實施例1-106中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸或核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
實施例109為如實施例1-106中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸或核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
實施例110為如實施例1-109中任一項之gRNA,其中重複/反重複區中之修飾不包含核苷酸76處之硫代磷酸酯修飾。
實施例111為如實施例1-110中任一項之gRNA,其中重複/反重複區中之修飾不包含核苷酸76處之修飾。
實施例112為如實施例1-111中任一項之gRNA,其中至少20%、30%、40%或50%之核苷酸為經修飾之核苷酸。
實施例113為如實施例112之gRNA,其中gRNA包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或其組合。
實施例114為如實施例1-113中任一項之gRNA,其中修飾包含核苷酸106-109中之1、2、3或4個核苷酸處之修飾。
實施例115為如實施例113或114中任一項之gRNA,其中該修飾包含核苷酸106-109中之各者處之修飾。
實施例116為如實施例114-115中任一項之gRNA,其中修飾包含2'-O-甲基修飾。
實施例117為如實施例112-116中任一項之gRNA,其中gRNA包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或其組合。
實施例118為如實施例1-117中任一者之gRNA,其中該引導區之核苷酸1-3經修飾,且該引導區中除核苷酸1-3以外的核苷酸未經修飾。
實施例119為如實施例1-118中任一項之gRNA,其中核苷酸144之3'尾存在於該gRNA中,且包含核苷酸141-144處之2'-O-Me修飾之核苷酸及分別在核苷酸141-142及142-143之間的兩個PS鍵聯。
實施例120為如實施例1-119中任一項之gRNA,其中49-52、87-90或122-125之一或多個位置經取代。
實施例121為包含SEQ ID NO: 1-19及21-42中之任一者的單引導RNA (sgRNA)。
實施例122為如實施例1-121中任一項之gRNA,其包含與SEQ ID No: 1-19及21-42中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列。
實施例123為如實施例1-121中任一項之gRNA,其包含與SEQ ID No: 1-19及21-42中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列,其中與表1中之參考序列標識符之核苷酸對應的該gRNA之各核苷酸處的修飾與表2中之參考序列標識符中所示的修飾一致或等效。
實施例124為如實施例1-122中任一項之gRNA,其包含與SEQ ID NO: 1-5、7、8、11、12、13、15、16、18、19、21、23、24、26、27、28、30、31、33、34、35、37、39、41、101-291、301-494、931-946、951及952中之任一者之核苷酸序列的自X至3'端的序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的核苷酸序列,其中X為保守區之第一核苷酸。
實施例125為如實施例121-124中任一項之gRNA,其進一步含有包含2'-O-Me修飾之核苷酸的3'尾。
實施例126為如實施例1-125中任一項之gRNA,其中該gRNA將核酸酶導引至目標序列以進行結合。
實施例127為如實施例1-126中任一項之gRNA,其中該gRNA將核酸酶導引至目標序列以在該目標序列內誘導雙股斷裂。
實施例128為如實施例1-127中任一項之gRNA,其中該gRNA將核酸酶導引至目標序列以在該目標序列內誘導單股斷裂。
實施例129為如實施例126-129中任一項之gRNA,其中該核酸酶為Nme Cas9。
實施例130為如實施例1-129中任一項之gRNA,其中gRNA包含保守取代,視情況其中保守取代維持至少一個鹼基對。
實施例131為一種組合物,其包含與脂質奈米粒子(LNP)締合的如實施例1-130中任一項之gRNA。
實施例132為一種LNP組合物,其包含如實施例1-130中任一項之gRNA。
實施例133為一種組合物,其包含如實施例1-130中任一項之gRNA,或如實施例131-132中任一項之組合物,其進一步包含核酸酶或編碼核酸酶之mRNA。
實施例134為如實施例133之組合物,其中該核酸酶為Cas蛋白。
實施例135為如實施例134之組合物,其中該Cas蛋白為Nme Cas9。
實施例136為如實施例135之組合物,其中該Nme Cas9為Nme1 Cas9、Nme2 Cas9或Nme3 Cas9。
實施例137為如實施例133-136中任一項之組合物,其中核酸酶具有雙股裂解活性。
實施例138為如實施例133-137中任一項之組合物,其中核酸酶具有切口酶活性。
實施例139為如實施例133-138中任一項之組合物,其中核酸酶具有dCas DNA結合域。
實施例140為如實施例133-139中任一項之組合物,其中該核酸酶經修飾。
實施例141為如實施例140之組合物,其中經修飾之核酸酶包含異源功能域。
實施例142為如實施例141之組合物,其中異源功能域為脫胺酶。
實施例143為如實施例142之組合物,其進一步包含UGI或編碼UGI之mRNA。
實施例144為如實施例142-143中任一項之組合物,其中異源功能域為胞苷脫胺酶。
實施例145為如實施例140-144中任一項之組合物,其中該經修飾之核酸酶包含核定位信號(NLS)。
實施例146為如實施例133-145中任一項之組合物,其包含編碼核酸酶之mRNA。
實施例147為如實施例146之組合物,其中該mRNA包含SEQ ID NO: 636-638中之任一者的序列。
實施例148為一種醫藥調配物,其包含如實施例1-130中任一項之gRNA或如實施例131-147中任一項之組合物及醫藥學上可接受之載劑。
實施例149為一種修飾目標DNA之方法,其包含將Cas蛋白或編碼Cas蛋白之核酸及以下中之任何一或多者遞送至細胞:
i. 如實施例1-130中任一項之gRNA;
ii. 如實施例131-147中任一項之組合物;及
iii. 如實施例148之醫藥調配物。
實施例150為如實施例149之方法,其中該方法引起基因插入或缺失。
實施例151為如實施例149或150之方法,其中該方法導致至少一個鹼基編輯。
實施例152為如實施例149-151中任一項之方法,其進一步包含將模板遞送至該細胞,其中該模板之至少一部分在Cas蛋白所誘導之雙股斷裂位點處或附近併入至目標DNA中。
實施例153為如實施例1-130中任一項之gRNA,如實施例131-147之組合物,或如實施例148之醫藥調配物,其用於製備供治療疾病或病症用的藥劑。
實施例154為如實施例1-130中任一項之gRNA、如實施例131-147之組合物、或如實施例148之醫藥調配物的用途,其用於製造供治療疾病或病症用的藥劑。
本申請案主張2021年11月3日申請之美國臨時申請案第63/275,426號及2022年6月14日申請之美國臨時申請案第63/352,161號之優先權,該等申請案之內容均以全文引用之方式併入。
本文提供用於基因編輯方法之經縮短之gRNA。經工程改造且經測試之gRNA之序列的實例展示於表1-2中。
本文所提供的某些gRNA為用於基因編輯方法中之單引導RNA (sgRNA)。
本文所提供的某些gRNA為用於基因編輯方法中之雙引導RNA (dgRNA)。
本發明進一步提供此等gRNA在活體外(例如,活體外培養之細胞,用於離體療法或基因編輯細胞之其他用途)或在諸如人類之個體的細胞中(例如,用於活體內療法)改變目標核酸之基因體的例示性用途。
表 1. gRNA 之例示性序列
表 2. 例示性 sgRNA
表 2( 續 )
長度 (nt) | SEQ ID NO: | 序列 |
145 | 500 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUGUAGCUCCCUUUCUCAUUUCGGAAACGAAAUGAGAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCUUCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUA |
101 | 1 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU |
105 | 2 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU |
107 | 3 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUGGAAACCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU |
101 | 4 | mN*mNNNNNNNNmNNNmNNNNNNNNNNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
97-102 | 5 | (N) 20-25mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
77 | 6 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
101 | 7 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
97-102 | 8 | (N) 20-25mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
77 | 9 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
105 | 10 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUUCGAAAGACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU |
105 | 11 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
101 | 12 | mN*mNNNNNNNNmNNNmNNNNNNNNNNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
97-102 | 13 | (N) 20-25mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
77 | 14 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
101 | 15 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
97-102 | 16 | (N) 20-25mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
77 | 17 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
105 | 18 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
101 | 19 | mN*mNNNNNNNNmNNNmNNNNNNNNNNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
97-102 | 21 | (N) 20-25mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
77 | 22 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
101 | 23 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
97-102 | 24 | (N) 20-25mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
77 | 25 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
105 | 26 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
101 | 27 | mN*mNNNNNNNNmNNNmNNNNNNNNNNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
97-102 | 28 | (N) 20-25mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGm AmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
77 | 29 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
101 | 30 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
97-102 | 31 | (N) 20-25mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
77 | 32 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
97-102 | 33 | (N) 20-25mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
105 | 34 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
101-106 | 35 | (N) 20-25mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
81 | 36 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
101-106 | 37 | (N)20-25 mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
81 | 38 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
101-106 | 39 | (N)20-25 mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
81 | 40 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
101-106 | 41 | (N)20-25 mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
81 | 42 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
引導物 ID | SEQ ID NO. | sgRNA 未經修飾序列 | SEQ ID NO. | sgRNA 經修飾序列 |
G017564 | 101 | GUGUGUCCCUCUCCCCACCCGUCCGUUGUAGCUCCCUGGAAACCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU | 301 | mG*mUGUGUCCCmUCUmCCCCACCCGUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmGmAmAmAmCmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCAACGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGUUUAmU*mU |
G017565 | 102 | GGCCUGGCUGAUGAGGCCGCACAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUC | 302 | mG*mG*mC*CUGGCUGAUGAGGCCGCACAUGUUGUAGCUCCCU*mG*mA*mA*mA*CCGUUGCUACAAUAAGGCCGUmC*mU*mG*mA*mA*mA*mA*mGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCmU*mU*mC*mUGGCAUCGUUU*mA*mU*mC |
G017566 | 103 | GGCCUGGCUGAUGAGGCCGCACAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUC | 303 | mG*mG*mC*CUGGCUGAUGAGGCCGCACAUGUUGUAGCUCCCU*mG*mA*mA*mA*CCGUUGCUACAAUAAGGCCGUmC*mG*mA*mA*mA*mGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCmU*mU*mC*mUGGCAUCGUUU*mA*mU*mC |
G020031 | 104 | GUGUGUCCCUCUCCCCACCCGUCCGUUGUAGCUCCCUGGAAACCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU | 304 | GUGUGUCCCUCUCCCCACCCGUCCGUUGUAGCUCCCUGGAAACCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU |
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G021248 | 206 | CUACAAGCUUACCCAGAGGCAAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 406 | mC*mUACAAGCUmUACmCCAGAGGCAAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021249 | 207 | CAGAAUUGAGAGACUCAGCCCAGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 407 | mC*mAGAAUUGAmGAGmACUCAGCCCAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021250 | 208 | GAUCCACAAGCUCCUGACAGGAUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 408 | mG*mAUCCACAAmGCUmCCUGACAGGAUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021251 | 209 | AUCCACAAGCUCCUGACAGGAUGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 409 | mA*mUCCACAAGmCUCmCUGACAGGAUGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021252 | 210 | GGACUGGUAUUUGUGUCUGAAGCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 410 | mG*mGACUGGUAmUUUmGUGUCUGAAGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021253 | 211 | UGCUGAUCCCUGCCAAGCUGACUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 411 | mU*mGCUGAUCCmCUGmCCAAGCUGACUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021254 | 212 | CAGCAACCCCCAGAAUUGAGAGACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 412 | mC*mAGCAACCCmCCAmGAAUUGAGAGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021255 | 213 | GCUUCUCCUGGUGAAGGGGCUUUUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 413 | mG*mCUUCUCCUmGGUmGAAGGGGCUUUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021256 | 214 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 414 | mC*mCAAGUGUCmUUCmCAGUACGAUUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021257 | 215 | CGAUGGCCAGAGUCGUUGGCUGUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 415 | mC*mGAUGGCCAmGAGmUCGUUGGCUGUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
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G021293 | 251 | UUCUACAAACUUCUCAUCUGUGGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 451 | mU*mUCUACAAAmCUUmCUCAUCUGUGGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021294 | 252 | CUUCUACAAACUUCUCAUCUGUGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 452 | mC*mUUCUACAAmACUmUCUCAUCUGUGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021295 | 253 | AUCCGCGAAUUCAUGGAACGGGGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 453 | mA*mUCCGCGAAmUUCmAUGGAACGGGGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021296 | 254 | CCAAACAACUUGGUGUGUCCACUUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 454 | mC*mCAAACAACmUUGmGUGUGUCCACUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021297 | 255 | UCUCAAUUCUGGGGGUUGCUGACGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 455 | mU*mCUCAAUUCmUGGmGGGUUGCUGACGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021298 | 256 | GCUACUGCUUUGGCAAGAUCCUGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 456 | mG*mCUACUGCUmUUGmGCAAGAUCCUGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
G021299 | 257 | UUCUUUCUUUAAAAAGUUUGAUCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 457 | mU*mUCUUUCUUmUAAmAAAGUUUGAUCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU |
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G029386 | 290 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 940 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCmGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
G029387 | 290 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 941 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCmAmAmCmGmCmUmCmUmGmCmCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
G029388 | 290 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 942 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUmCmG*mU*mU |
G029389 | 290 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 943 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCmAmUmCmG*mU*mU |
G029390 | 290 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 944 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCmAmAmCmGmCmUmCmUmGmCmCmUmUmCmUGGCmAmUmCmG*mU*mU |
G029391 | 290 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 945 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCmAmAmCmGmCmUmCmUmGmCmCmUmUmCmUGGCAUmCmG*mU*mU |
G029392 | 290 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 946 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCmGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUmCmG*mU*mU |
G032572 | 290 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 951 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
G031771 | 295 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUUCGAAAGACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 952 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
N表示具有任何鹼基(例如A、C、G或U)之核苷酸。(mN*)
3表示三個連續核苷酸,其各自分別具有與下一核苷酸之任何鹼基、2'-OMe及3'PS鍵聯。(N)
20-25表示20-25個,亦即20、21、22、23、24或25個連續N。A、C、G及U分別表示具有腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及尿嘧啶鹼基之核苷酸。
核苷酸修飾在表1-2中如下指示:m:2'-OMe;*:PS鍵聯;f:2'-氟;(invd):反向無鹼基;moe:2'-moe;e:ENA;d:去氧核糖核苷酸(亦請注意,T始終為去氧核糖核苷酸);x:UNA。在某些實施例中,在sgRNA經修飾序列中,各A、C、G、U及N獨立地為核糖(2'-OH)。在某些實施例中,各A、C、G、U及N為核糖(2'-OH)。因此,舉例而言,mA表示2'-O-甲基腺苷;xA表示具有腺嘌呤核鹼基的UNA核苷酸;eA表示具有腺嘌呤核鹼基的ENA核苷酸;且dA表示腺苷去氧核糖核苷酸。
sgRNA名稱有時用緊接著G之後的一或多個前置零提供。此不影響名稱之含義。因此,舉例而言,G000282、G0282、G00282及G282係指相同sgRNA。
表 3 例示性 NmeCas9 sgRNA (SEQ ID NO: 500)
定義
1-24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 |
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN | G | U | U | G | U | A | G | C | U | C | C | C | U | U | U | C | U | C | A | U | U | U | C | G |
下莖 | 上莖 | |||||||||||||||||||||||
引導區 | 重複 / 反 重複區 |
49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 |
G | A | A | A | C | G | A | A | A | U | G | A | G | A | A | C | C | G | U | U | G | C | U | A | C | A | A | U | A |
環 | 上莖 | 下莖 | ||||||||||||||||||||||||||
重複 / 反 重複區 |
78 | 79 | 80 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 | 91 | 92 | 93 | 94 | 95 | 96 | 97 | 98 | 99 | 100 | 101 | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 |
A | G | G | C | C | G | U | C | U | G | A | A | A | A | G | A | U | G | U | G | C | C | G | C | A | A | C | G | C | U | C |
莖 | 環 | 莖(96:不配對) | 下莖 | 隆突 | ||||||||||||||||||||||||||
髮夾 1 | 髮夾 2 |
109 | 110 | 111 | 112 | 113 | 114 | 115 | 116 | 117 | 118 | 119 | 120 | 121 | 122 | 123 | 124 | 125 | 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | 132 | 133 | 134 |
U | G | C | C | C | C | U | U | A | A | A | G | C | U | U | C | U | G | C | U | U | U | A | A | G | G |
上莖 | 環 | 上莖 | |||||||||||||||||||||||
髮夾 2 |
135 | 136 | 137 | 138 | 139 | 140 | 141 | 142 | 143 | 144 | 145 |
G | G | C | A | U | C | G | U | U | U | A |
上莖 | 隆突 | 下莖 | ||||||||
髮夾 2 | 尾 |
冠詞「一(a/an)」在本文中用於指一種或多於一種(亦即,至少一種)該冠詞之文法對象。作為實例,「元件」意謂一個元件或超過一個元件,例如複數個元件。
術語「包括」在本文中用於意謂片語「包括但不限於」,且可與其互換使用,使得列表中之項目的敍述不排除可經取代或添加至所列項目之其他類似項目。
除非上下文另有明確說明,否則術語「或」在本文中用於意謂術語「及/或」且可與該術語互換使用。舉例而言,「有義股或反義股」應理解為「有義股或反義股或有義股及反義股」。
術語「約」在本文中用於意謂在此項技術中的許可差的典型範圍內。舉例而言,「約」可理解為與平均值差約2個標準差。在某些實施例中,約意謂±10%。在某些實施例中,約意謂+5%、+2%或+1%。當約存在於一系列數或範圍之前時,應理解,「約」可修飾系列中之數或範圍中之每一者。至少,且不試圖將均等論之應用限於申請專利範圍之範疇,各數值參數至少應根據所報導之有效數位之個數且藉由應用普通捨入技術來解釋。
一個數或一系列數前的術語「至少」應理解為包括與術語「至少」相鄰的數及可邏輯地包括在內的所有後續數或整數,如上下文所明示。舉例而言,核酸分子中之核苷酸數目必須為整數。舉例而言,「20個核苷酸之核酸分子之至少17個核苷酸」意謂17、18、19或20個核苷酸具有指定特性。當至少存在於一系列數或範圍之前時,應理解,「至少」可修飾該系列或範圍中之數中之每一者。
如本文所用,「不超過」或「小於」應理解為與片語相鄰的值,及上下文邏輯所示的邏輯較低值或整數至零。舉例而言,「不超過2個核苷酸鹼基對」之雙螺旋區具有2、1或0個核苷酸鹼基對。當「不超過」或「小於」存在於一系列數或範圍之前時,應理解,該系列或範圍中之數中之各者經修飾。
如本文所用,範圍包括上限及下限兩者。
如本文所用,應理解當值之最大量由100% (例如,100%抑制)表示時,該值係根據偵測方法解釋的。舉例而言,100%抑制應理解為低於分析之偵測水準之水準的抑制。
如本文所用之「編輯效率」或「編輯百分比(editing percentage/percent editing)」為所關注之目標區中具有核苷酸之插入、缺失或鹼基變化的序列讀段總數目相對於藉由Cas RNP裂解或切口之後的序列讀段總數目的比率。
如本文所用之「區」描述核酸之部分。區域亦可稱為「模組」或「域」。sgRNA之區域可執行特定功能,例如導引RNP之核酸內切酶活性,例如如Briner AE等人,
Molecular Cell56:333-339 (2014)中所述,或具有預測結構。sgRNA之例示性區域描述於表3中。
如本文所用之「髮夾」或「髮夾結構」描述當核酸股摺疊且與同一股之另一段形成鹼基對時所產生的核酸雙螺旋體。髮夾可形成包含環或U形之結構。在一些實施例中,髮夾可由RNA環構成。髮夾可經由單一核酸分子中之兩個互補序列結合在一起、在分子摺疊或褶皺的情況下形成。在一些實施例中,髮夾包含莖或莖環結構。在一些實施例中,髮夾包含環及莖。如本文所用,當兩個髮夾存在於gRNA中時,「髮夾區」可指sgRNA之保守區的髮夾1及髮夾2以及髮夾1與髮夾2之間的插入序列(例如「n」)。
如本文所用,「形成雙螺旋部分」應理解為能夠形成不間斷的雙螺旋部分或預測形成不間斷的雙螺旋部分,例如藉由鹼基配對。雙螺旋部分可包含兩個互補序列,例如第一髮夾莖區及與第一髮夾莖區互補之第二髮夾莖區。如本文所用,雙螺旋部分具有至少2個鹼基對之長度。雙螺旋部分視情況包含2至10個鹼基對,且形成該雙螺旋部分的兩個股可例如藉由核苷酸環接合。雙螺旋體中之鹼基配對可包括華特生-克里克鹼基配對,視情況與鹼基層疊組合。如本文所用,雙螺旋部分可包括一股上之單個核苷酸不連續性,其中一股上之各連續核苷酸與互補股上之核苷酸鹼基配對,互補股可具有一個非鹼基配對核苷酸之不連續性,例如,如髮夾1中SEQ ID NO: 500之核苷酸96,其中不連續性緊鄰沃森-克里克鹼基對之5'及3'側翼。此不同於重複-反重複區中之非配對核苷酸36及65,以及髮夾2中之非配對核苷酸106-108及139,其構成不連續性,產生兩個雙螺旋部分,如本文所定義。RNA結構為此項技術中熟知的,且工具可用於RNA之結構預測(參見例如Sato等人, Nature Comm. 12:941 (2021);rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html處之RNAstructure及rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi處之RNAfold WebServer)。准許摺疊且形成環以允許核鹼基充分接近鹼基對所需的橋接長度及結構可撓性為此項技術中熟知的。
如本文所用,「經RNA引導之DNA結合劑」意謂具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物,或此類複合物之DNA結合次單位,其中DNA結合活性具有序列特異性且依賴於RNA序列。例示性RNA引導之DNA結合劑包括Cas裂解酶(其具有雙股裂解活性)、Cas切口酶(其具有單股裂解活性)及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。如本文所用,「Cas核酸酶」涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。dCas DNA結合劑可為包含非功能性核酸酶域(RuvC或HNH域)之死核酸酶。在一些實施例中,Cas裂解酶或Cas切口酶涵蓋經修飾以允許例如經由與FokI域融合而進行DNA裂解之dCas DNA結合劑。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑具有核酸酶活性,例如裂解酶或切口酶活性。
Cas9分子之例示性核苷酸及多肽序列提供於下文中。用於鑑定編碼Cas9多肽序列之替代核苷酸序列(包括替代天然存在之變體)的方法為此項技術中已知的。亦涵蓋與編碼本文所提供之胺基酸序列之Cas9核酸序列、胺基酸序列或核酸序列中之任一者具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的序列。Cas9之例示性開放閱讀框架提供於表4A中。
如本文所用,「核糖核蛋白」(ribonucleoprotein,RNP)或「RNP複合物(RNP complex)」係指引導RNA以及經RNA引導之DNA結合劑,諸如Cas核酸酶,例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA結合劑(例如Cas9)。在一些實施例中,引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑,諸如Cas9導引至目標序列,且該引導RNA與目標序列雜交且該結合劑結合於目標序列;在結合劑為裂解酶或切口酶之情況下,結合之後進行裂解或切口。
如本文所用之「莖環」描述核苷酸之二級結構,其形成鹼基成對的「莖」,該「莖」終止於不配對核酸之環。當同一核酸股之兩個區域在序列上至少部分地互補時且當以相反方向讀取時,可以形成莖。如本文所用之「環」描述鹼基不配對(亦即,不互補)、可以將莖封端的核苷酸區域。「四環」描述4個核苷酸之環。如本文所用,sgRNA之上莖可以包含四環。
「引導RNA」、「gRNA」及「引導物」在本文中可互換使用以指crRNA (亦稱為CRISPR RNA)與trRNA (亦稱為tracrRNA)之組合。crRNA及trRNA可以單一RNA分子(單引導RNA,sgRNA)或以兩個獨立RNA分子(雙引導RNA,dgRNA)形式締合。「引導RNA」或「gRNA」係指各類型。trRNA可為天然存在之序列或與天然存在之序列相比具有修飾或變異之trRNA序列。引導RNA可包括如本文所述之經修飾RNA。在一些實施例中,如本文所用之引導RNA不包括接合引導RNA內之兩個核苷酸的非核苷酸連接子。除非上下文另外明確指示,否則本文所述之引導RNA適用於與Nme Cas9,例如Nme1、Nme2或Nme3 Cas9一起使用。舉例而言,圖24顯示呈可能的二級結構之Nme2 sgRNA之例示性示意圖。
如本文所用,特定sgRNA區段之5'端的核苷酸(例如6個核苷酸)為該區段之第六個核苷酸,或5'端之「核苷酸6」,例如XXXXXN,其中N為5'端之第6個核苷酸。「位於5'端之第6個核苷酸處或其之後」的核苷酸範圍始於第6個核苷酸且沿著鏈向3'端延續。類似地,當自鏈之3'端計數時,鏈之3'端之核苷酸(例如5個核苷酸)為第5個核苷酸,例如NXXXX。引導區中之編號位置或範圍係指如自5'端確定的位置,除非指定另一個參考點;例如,引導區中之「核苷酸5」為5'端之第5個核苷酸。
術語「保守區」係指如表3中所示之奈瑟氏腦膜炎菌Cas9 (「NmeCas9」) gRNA之保守區。第一列展示核苷酸之編號;第二列展示例示性序列(例如SEQ ID NO: 500);且第三及第四列展示該等區。經縮短之保守區缺少表3中所示之至少一個核苷酸,如下文所詳細論述。
如本文所用,gRNA中之「經縮短」區為相比於表3中所示之對應保守區缺少至少1個核苷酸之gRNA的保守區。類似地,關於sgRNA之「經縮短」意謂其保守區包含之核苷酸比表3中所示之sgRNA保守區更少。「經縮短」在任何情況下均不暗示對產生gRNA之過程或方式的任何特定限制。
如本文所用,關於多核苷酸之「經取代」或「取代」係指核鹼基之改變,其改變該核鹼基用於沃森-克里克配對之較佳鹼基或破壞鹼基堆積相互作用。當引導RNA之某個區域如本文所用「未經取代」時,該區域之序列可與NmeCas9 sgRNA (例如,SEQ ID NO:500)或任何其他gRNA (例如,SEQ ID NO: 1-19、21-42、301-494及931-946之一部分)之對應保守區比對,僅具有缺口及匹配(亦即,無錯配),其中若鹼基具有用於沃森-克里克配對之相同較佳標準搭配鹼基(A、C、G或T/U)或具有如圖25中所示之配對鹼基堆疊相互作用,則認為該等鹼基匹配。
如本文所用,關於多核苷酸之「保守取代」係指如下核鹼基改變,其意謂交換鹼基配對之核苷酸的位置,使得可維持鹼基配對。舉例而言,G-C對變成C-G對,A-U對變成U-A對,或其他天然或經修飾鹼基配對。
如本文所用,關於不配對核苷酸(例如重複/反重複區、髮夾1區或髮夾2區之環,亦即分別為SEQ ID NO: 500中之核苷酸49-52、87-90及122-125,或其他不配對核苷酸)之「經取代」及其類似者係指用不同核苷酸置換核苷酸序列之一或多個核苷酸(例如1、2、3或4個核苷酸),該不同核苷酸不干擾該等不配對核苷酸形成結構(例如隆突或環),因此可准許例如在重複/反重複區、髮夾1區或髮夾2區中形成一或多個雙螺旋部分。
在一些實施例中,gRNA包含與本文所述之gRNA之相應或指定核苷酸之「修飾模式匹配」的核苷酸。此意謂與修飾模式匹配的核苷酸具有與本文所述之gRNA之相應位置處的核苷酸相同的修飾(例如硫代磷酸酯、2'-氟、2'-OMe等),不論彼等位置處之核鹼基是否匹配。舉例而言,若在第一gRNA中,核苷酸5及6分別具有2'-OMe及硫代磷酸酯修飾,則此gRNA在核苷酸5及6處具有與第二gRNA相同的修飾模式,該第二gRNA亦在核苷酸5及6處分別具有2'-OMe及硫代磷酸酯修飾,不論第一及第二gRNA中之位置5與6處之核鹼基是否相同或不同。然而,核苷酸6而非核苷酸7處之2'-OMe修飾在核苷酸6及7處的修飾模式與核苷酸7而非核苷酸6處之2'-OMe修飾不相同。類似地,與本文所述之gRNA之修飾模式至少75%匹配的修飾模式意謂至少75%核苷酸與本文所述之gRNA之相應位置具有相同修飾。相應位置可藉由成對或結構比對來測定。
如本文所用,「引導序列」或「引導區」及其類似者係指引導RNA內之序列,其與目標序列互補且用以藉由NmeCas9A「引導序列」(亦可稱為「靶向序列」或「間隔序列」)將引導RNA導引至目標序列以進行結合或修飾(例如裂解)。引導序列之長度可為20至25個核苷酸,例如,在Nme Cas9之情況下,例如,長度為20、21、22、23、24或25個核苷酸。
經RNA引導之DNA結合劑之目標序列包括基因體DNA之正及負股(亦即既定序列及該序列之反向互補序列),此係因為經RNA引導之DNA結合劑之核酸受質為雙股核酸。因此,在引導序列稱為「與目標序列互補」之情況下,應瞭解,引導序列可導引引導RNA以結合至目標序列之有義股或反義股(例如反向互補序列)。因此,在一些實施例中,在引導序列結合目標序列之反向互補序列之情況下,引導序列與目標序列(例如不包括PAM之目標序列)之某些核苷酸具有一致性,不同之處在於在引導序列中U取代T。
如本文所用,「5'端」係指gRNA之第一核苷酸,包括dgRNA (通常為dgRNA之crRNA的5'端)及sgRNA,亦即引導序列之5'端,其中5'位置未連接至另一核苷酸。
如本文所用,「5'端修飾」係指包含一(1)個至約七(7)個核苷酸,視情況至約四(4)個核苷酸中之一或多者在其5'端處具有修飾之引導區的gRNA,視情況其中gRNA之第一核苷酸(自5'端開始)經修飾。
如本文所用,「3'端」係指gRNA之端或末端核苷酸,其中3'位置與另一個核苷酸不連接。在一些實施例中,3'端在3'尾中。在一些實施例中,3'端在gRNA之保守區中。
如本文所用,「3'端修飾」係指在其3'端處,在一(1)至約七(7)個核苷酸中之一或多者,視情況約四(4)個核苷酸中具有修飾之gRNA,視情況其中gRNA之最後一個核苷酸(亦即,最3'核苷酸)經修飾。若3'尾存在,則1至約7個核苷酸,視情況約四(4)個核苷酸可在3'尾內。若3'尾不存在,則1至約7個核苷酸,視情況約四(4)個核苷酸可在sgRNA之保守區內。
「最後一個」、「倒數第二個」、「倒數第三個」核苷酸等分別指指定序列中的3'最多、第二個3'最多、第三個3;最多核苷酸等。舉例而言,在序列5'-AAACTG-3'中,最後一個、倒數第二個及倒數第三個核苷酸分別為G、T及C。片語「最後3個核苷酸」係指最後一個、倒數第二個及倒數第三個核苷酸;更一般而言,「最後N個核苷酸」係指最後一個至倒數第N個核苷酸(包括端點)。「3'末端之3'端的第三個核苷酸」等效於「倒數第三個核苷酸」。類似地,「5'末端之5'端的第三個核苷酸」等效於「5'末端之第三個核苷酸」。
如本文所用,「保護端修飾」(諸如保護5'端修飾或保護3'端修飾)係指sgRNA之末端之七個核苷酸,視情況四個核苷酸內的一或多個核苷酸之修飾,其減少sgRNA降解,諸如核酸外切降解。在一些實施例中,保護端修飾包含sgRNA末端之七個核苷酸,視情況四個核苷酸內之至少兩個或至少三個核苷酸的修飾。在一些實施例中,修飾包含硫代磷酸酯鍵聯、2'修飾,諸如2'-OMe或2'-氟、2'-H (DNA)、ENA、UNA,或其組合。在一些實施例中,修飾包含硫代磷酸酯鍵聯及2'-OMe修飾。在一些實施例中,至少三個末端核苷酸經修飾,例如經以下修飾:硫代磷酸酯鍵聯,或硫代磷酸酯鍵聯與2'-OMe修飾之組合。在一些實施例中,至少兩個末端核苷酸經修飾,例如經以下修飾:硫代磷酸酯鍵聯,或硫代磷酸酯鍵聯與2'-OMe修飾之組合。涵蓋熟習此項技術者已知之減少核酸外切降解的修飾。
在一些實施例中,「3'尾」在其3'端處之sgRNA的保守區之後包含約1-10個核苷酸,視情況約1-4個核苷酸。
若干Cas9直系同源物已獲自奈瑟氏腦膜炎菌(Esvelt等人, NAT. METHODS, 第10卷, 2013, 1116 - 1121;Hou等人, PNAS, 第110卷, 2013, 第15644 - 15649頁) (Nme1Cas9、Nme2Cas9及Nme3Cas9)。Nme2Cas9直系同源物在哺乳動物細胞中有效地起作用,識別N4CC PAM,且可用於活體內編輯(Ran等人,NATURE,第520卷,2015,第186至191頁;Kim等人,NAT. COMMUN.,第8卷,2017,第14500頁)。Nme2Cas9已展示為對脫靶編輯具有天然抗性(Lee等人,MOL. THER.,第24卷,2016,第645至654頁;Kim等人,2017)。亦參見例如,WO/2020081568 (例如,第28頁及42頁),其描繪Nme2Cas9 D16A切口酶,該案之內容以全文引用的方式併入本文中。另外,NmeCas9變異體為此項技術中已知的,參見例如Huang等人, Nature Biotech. 2022, doi.org/10.1038/s41587-022-01410-2,其描述靶向單核苷酸-嘧啶PAM之Cas9變異體。
如本文所用,「NmeCas9」(有時稱為「Cas9」)涵蓋NmeCas9,例如Nme1Cas9、Nme2Cas9及Nme3Cas9;本文所列之NmeCas9之變異體,及其等效物。參見例如Edraki等人, Mol. Cell 73:714-726, 2019。如本文所用,「Cas核酸酶」,亦稱為「Cas蛋白」涵蓋Cas裂解酶、進一步具有RNA引導之DNA裂解酶或切口酶活性之Cas切口酶及dCas DNA結合劑,其中裂解酶/切口酶活性不活化。在一些實施例中,NmeCas9具有雙股裂解活性。在一些實施例中,NmeCas9具有切口酶活性。在一些實施例中,NmeCas9包含dCas DNA結合域。
如本文所用,若第一序列與第二序列之比對顯示整個第二序列之X%或更多位置與第一序列匹配,則第一序列被視為「包含與第二序列具有至少X%一致的序列」。舉例而言,序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性之序列,此係因為第二序列之全部三個位置均存在匹配,因此比對將得到100%一致性。RNA與DNA之間的差異(一般而言,尿苷交換為胸苷或反之亦然)及核苷類似物(諸如經修飾之尿苷)的存在不會造成多核苷酸之間一致性或互補性的差異,只要相關核苷酸(諸如胸苷、尿苷或經修飾之尿苷)具有相同補體(例如對於胸苷、尿苷或經修飾之尿苷全體而言,為腺苷;另一實例為胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶,兩者具有鳥苷或經修飾之鳥苷作為補體)。因此,舉例而言,序列5'-AXG (其中X為任何經修飾之尿苷,諸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)被視為與AUG 100%一致,因為兩者與同一序列(5'-CAU)完全互補。例示性比對演算法為所屬領域中熟知的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)及尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)演算法。熟習此項技術者應理解何種演算法選擇及參數設置適合於待對準之給定序列對;對於具有一般類似長度及針對胺基酸之>50%預期一致性或針對核苷酸之>75%預期一致性的序列而言,由EBI於www.ebi.ac.uk網站伺服器提供的尼德曼-翁施演算法介面之具有預設設置的尼德曼-翁施演算法通常為適合的。
「mRNA」在本文中用於指一種多核苷酸,其為RNA或經修飾之RNA且包含可轉譯成多肽之開放閱讀框架(亦即,可充當受質供核糖體及胺基醯基化tRNA轉譯)。mRNA可包含磷酸酯-糖主鏈,其包括核糖殘基或其類似物,例如2'-甲氧基核糖殘基。在一些實施例中,核酸磷酸酯-糖主鏈中之糖類基本上由核糖殘基、2'-甲氧基核糖殘基或其組合組成。通常而言,mRNA不含大量胸苷殘基(例如0個殘基或小於30、20、10、5、4、3或2個胸苷殘基;或小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%或0.1%的胸苷含量)。mRNA可在其一些或全部尿苷位置處含有經修飾之尿苷。經修飾mRNA包含其中磷酸酯、糖或核鹼基中之一或多者與標準腺苷、胞苷、胍或尿苷核苷酸不同的至少一個核苷酸。
如本文所用,「個體」係指動物界之任何成員。在一些實施例中,「個體」係指人類。在一些實施例中,「個體」係指非人類動物。在一些實施例中,「個體」係指靈長類動物。在一些實施例中,「個體」係指非人類靈長類動物。在一些實施例中,個體包括但不限於哺乳動物、鳥、爬行動物、兩棲動物、魚、昆蟲或蠕蟲。在某些實施例中,非人類個體為哺乳動物(例如嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、貓、綿羊、牛、靈長類動物或豬)。在一些實施例中,個體可為轉殖基因動物、經基因工程改造之動物或純系。在本發明之某些實施例中,個體為成人、青少年或嬰兒。在一些實施例中,使用術語「個體(individual)」或「患者」,且其意欲與「個體(subject)」互換,其中個體為人類個體。
如本文所用,「治療(treatment)」係指投與或施加用於個體之疾病或病症的治療劑,且包括減緩或遏制疾病發展或進展、減輕疾病之一或多種病徵或症狀、治癒疾病或預防疾病之一或多種症狀復發。
如本文中所用,「遞送」及「投與」可互換地使用,且包括活體外及活體內應用。
如本文中所用,共同投與意謂複數種物質在時間上足夠接近地一起投與,以使得與藥劑一起作用。共同投與涵蓋在單個調配物中一起投與物質及在單獨調配物中在時間上足夠接近地投與物質以使得藥劑一起作用。
如本文中所用,片語「醫藥學上可接受」意謂在製備藥物組合物時有用的,該藥物組合物通常無毒且在生物學上並非不合需要且在其他方面對於醫藥用途並非不可接受的。醫藥學上可接受之物質通常係指非熱解物質。醫藥學上可接受可指無菌物質,尤其對於注射或輸注用之醫藥物質。
I. 具有一或多個經縮短之保守區之引導 RNA
本文提供包含一或多個經縮短之保守區之引導RNA (gRNA)。
在一些實施例中,本文提供之gRNA包含引導區及包含重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區之保守區,其中重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區中之一或多者經縮短。在一些實施例中,gRNA來自奈瑟氏腦膜炎菌
Cas9(NmeCas9)。
在一些實施例中,保守區包含以下中之一或多者:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65;或
(b)經縮短之髮夾1區,其中該經縮短之髮夾1缺少2-10個、視情況2-8個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失,且視情況位置82-96中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96;或
(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失,且視情況核苷酸113-134中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135;
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失;且
其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,保守區包含:
經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65;
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失;
其中保守區中之至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,保守區包含:
經縮短之髮夾1區,其中該經縮短之髮夾1缺少2-10個、視情況2-8個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失,且視情況位置82-96中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96;或
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失;
其中保守區中之至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,保守區包含:
經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失,且視情況核苷酸113-134中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135;
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失;
其中保守區中之至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,保守區包含:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65;且
(b)經縮短之髮夾1區,其中該經縮短之髮夾1缺少2-10個、視情況2-8個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失,且視情況位置82-96中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96;或
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失;
其中保守區中之至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,保守區包含:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65;且
(b)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失,且視情況核苷酸113-134中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135;
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失;
其中保守區中之至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,保守區包含:
(a)經縮短之髮夾1區,其中該經縮短之髮夾1缺少2-10個、視情況2-8個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失,且視情況位置82-96中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96;且
(b)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失,且視情況核苷酸113-134中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135;
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失;
其中保守區中之至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,保守區包含:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65;
(b)經縮短之髮夾1區,其中該經縮短之髮夾1缺少2-10個、視情況2-8個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失,且視情況位置82-96中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96;且
(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失,且視情況核苷酸113-134中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135;
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失;
其中保守區之至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,本文揭示之gRNA為sgRNA。
在一些實施例中,核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500缺失。
在一些實施例中,保守區之至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,gRNA之重複/反重複區為缺少2-24個核苷酸之經縮短之重複/反重複區,例如以上編號實施例或表1-2中指示或本文別處描述之任何重複/反重複區,其可與本文所述之經縮短之髮夾1區或髮夾2區中之任一者組合,包括但不限於以上編號實施例中指示及表1-2之序列中表示或本文別處描述之組合。在一些實施例中,位置49-52、87-90或122-125中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500經取代。在一些實施例中,所有位置49-52、87-90或122-125均相對於SEQ ID NO: 500經取代。在一些實施例中,表1-2中所提供或本文所描述之3'尾缺失。
在一些實施例中,gRNA之經縮短之重複/反重複區缺少18個核苷酸。在一些實施例中,gRNA之經縮短之重複/反重複區缺少22個核苷酸。
在一些實施例中,在gRNA之經縮短之重複/反重複區中,核苷酸36藉由6個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中,在gRNA之經縮短之重複/反重複區域中,核苷酸36藉由7個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中,在gRNA之經縮短之重複/反重複區中,核苷酸36藉由8個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中,在gRNA之經縮短之重複/反重複區中,核苷酸36藉由9個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中,在gRNA之經縮短之重複/反重複區中,核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。
在一些實施例中,在gRNA之經縮短之重複/反重複區中,核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 500缺失。在一些實施例中,在gRNA之經縮短之重複/反重複區中,核苷酸38、41-48、53-60及63相對於SEQ ID NO: 500缺失。
在一些實施例中,在gRNA之經縮短之重複/反重複區中,核苷酸36藉由6個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中,在gRNA之經縮短之重複/反重複區中,核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 500缺失,且核苷酸36藉由核苷酸37、49-52及64連接至核苷酸65。
在一些實施例中,在gRNA之經縮短之重複/反重複區中,核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中,在gRNA之經縮短之重複/反重複區中,核苷酸38、41-48、53-60及63相對於SEQ ID NO: 500缺失,且核苷酸36藉由核苷酸37、39、40、49-52、61、62及64連接至核苷酸65。
在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區之上莖的所有核苷酸38-48及核苷酸53-63均相對於SEQ ID NO: 500缺失。
在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區之上莖的所有核苷酸39-48及核苷酸53-62均相對於SEQ ID NO: 500缺失,且核苷酸38及63經取代。
在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有14個經修飾核苷酸。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有15個經修飾核苷酸。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有16個經修飾核苷酸。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有17個經修飾核苷酸。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有18個經修飾核苷酸。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有19個經修飾核苷酸。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有20個經修飾核苷酸。
在一些實施例中,經縮短之髮夾1區缺少2個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾1區缺少21個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾1區缺少2個核苷酸,且核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失。在一些實施例中,經縮短之髮夾1區缺少2個核苷酸,且核苷酸85及92相對於SEQ ID NO: 500缺失。在一些實施例中,在經縮短之髮夾1區中,核苷酸81藉由12個核苷酸連接至核苷酸96。在一些實施例中,在經縮短之髮夾1區中,核苷酸81藉由12個核苷酸連接至核苷酸96。在一些實施例中,在經縮短之髮夾1區中,核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,且核苷酸81藉由核苷酸82-85、87-90及92-95連接至核苷酸96。在一些實施例中,在經縮短之髮夾1區中,核苷酸85及92相對於SEQ ID NO: 500缺失,且核苷酸81藉由核苷酸82-84、86-91及93-95連接至核苷酸96。
在一些實施例中,經縮短之髮夾1區具有長度為7個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。在一些實施例中,經縮短之髮夾1區具有長度為8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
在經縮短之髮夾1區之莖中,長度為七個鹼基配對核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾1區之核苷酸85-86及核苷酸91-92缺失。
在一些實施例中,經縮短之髮夾1區具有13個經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,經縮短之髮夾2缺少18個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾2具有24個核苷酸。在一些實施例中,在經縮短之髮夾2中,核苷酸113-121及126-134相對於SEQ ID NO: 500缺失。在一些實施例中,經縮短之髮夾2缺少18個核苷酸,且核苷酸113-121及126-134相對於SEQ ID NO: 500缺失。在一些實施例中,在經縮短之髮夾2區中,核苷酸112藉由4個核苷酸連接至核苷酸135。在一些實施例中,在經縮短之髮夾2區中,核苷酸113-121及126-134相對於SEQ ID NO: 500缺失且核苷酸112藉由核苷酸122-125連接至核苷酸135。
在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有28個核苷酸之長度。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有32個核苷酸之長度。
在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區之上莖包含不超過一個鹼基對。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區之上莖包含不超過三個鹼基對。
在一些實施例中,經縮短之髮夾2區具有8個經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,引導RNA (gRNA)包含引導區及保守區,該保守區包含:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區相對於SEQ ID NO: 500缺少18-22個核苷酸,其中
(i)核苷酸38-48及53-63缺失;且
(ii)核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65;
(b)經縮短之髮夾1區,其中經縮短之髮夾1缺少2個核苷酸,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸86及91缺失或核苷酸85及92缺失;及
(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少18個核苷酸,其中核苷酸113-121及126-134相對於SEQ ID NO: 500缺失;且其中核苷酸144-145相對於SEQ ID NO: 500缺失;其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,引導RNA (gRNA)包含引導區及保守區,該保守區包含:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區相對於SEQ ID NO: 500缺少18-22個核苷酸,其中
(i)核苷酸38、41-48、53-60及63缺失;且
(ii)核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65;
(b)經縮短之髮夾1區,其中經縮短之髮夾1缺少2個核苷酸,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸86及91缺失或核苷酸85及92缺失;
(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少18個核苷酸,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134缺失;且
其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144-145缺失;
其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,提供一種引導RNA (gRNA),該gRNA包含引導區及保守區,該保守區包含以下中之一或多者:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區相對於SEQ ID NO: 500缺少18-22個核苷酸,其中
(i)核苷酸37-48及53-64缺失;且
(ii)核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65;或
(b)經縮短之髮夾1區,其中經縮短之髮夾1缺少2個核苷酸,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸86及91缺失或核苷酸85及92缺失;或
(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少18個核苷酸,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134缺失;且
其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144-145缺失;
其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在其他實施例中,經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區相對於SEQ ID NO: 500缺少22個核苷酸。在其他實施例中,核苷酸36藉由包含核苷酸序列UGAAAC之序列連接至核苷酸65。在其他實施例中,核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。在其他實施例中,核苷酸36藉由包含核苷酸序列UUCGAAAGAC (SEQ ID NO:950)之序列連接至核苷酸65。
在一些實施例中,前述實施例之引導RNA (gRNA)包含引導區及保守區,該保守區包含:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少18-22個核苷酸,其中
(i)核苷酸37-48及53-64相對於SEQ ID NO: 500缺失;且
(ii)核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65;
(b)經縮短之髮夾1區,其中經縮短之髮夾1相對於SEQ ID NO: 500缺少2個核苷酸,其中核苷酸86及91缺失或核苷酸85及92缺失;
(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少18個核苷酸,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134缺失;且
(d)其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144-145缺失;
其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
在其他實施例中,經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區相對於SEQ ID NO: 500缺少22個核苷酸。在其他實施例中,核苷酸36藉由包含核苷酸序列UGAAAC之序列連接至核苷酸65。在其他實施例中,核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。在其他實施例中,核苷酸36藉由包含核苷酸序列UUCGAAAGAC (SEQ ID NO:950)之序列連接至核苷酸65。
A. 經縮短之重複 / 反重複區
在一些實施例中,本文所述之gRNA包含保守區,其包含經縮短之重複/反重複區。在一些實施例中,重複-反重複區包含位於重複-反重複區之第一部分與第二部分之間的髮夾結構,其中重複-反重複區之第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中,本文所述之gRNA包含保守區,其包含重複/反重複區之經縮短之上莖區。在一些實施例中,重複/反重複區包含環(例如四環)。
在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸。在一些實施例中,(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況,核苷酸37-64中之一或多者經取代;及(ii)核苷酸36藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸65。
在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸。
在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區之長度為28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。
在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區缺少12-24個核苷酸、視情況18-24個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有28、29、30、31、32、33或34個核苷酸之長度。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有28個核苷酸之長度。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有29個核苷酸之長度。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有30個核苷酸之長度。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有31個核苷酸之長度。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有32個核苷酸之長度。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有33個核苷酸之長度。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有34個核苷酸之長度。
在一些實施例中,SEQ ID NO: 500之核苷酸37-64形成上莖,且經縮短之重複/反重複區之上莖的一或多個鹼基對缺失。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區之上莖包含不超過一個、兩個、三個或四個鹼基對。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區之上莖的所有位置38-48及所有位置53-63缺失。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區之上莖的所有核苷酸37-48及53-64缺失。如本文所用,「鹼基對」或「鹼基配對核苷酸」或「沃森-克里克配對核苷酸」包括任何能夠形成沃森-克里克鹼基對之對,包括A-T、A-U、T-A、U-A、C-G及G-C對,及包括具有相同鹼基配對偏好之前述核苷酸中之任一者之經修飾型式的對。如本文所用,鹼基對或鹼基配對之核苷酸亦包括藉由鹼基堆疊產生之鹼基對,例如重複/反重複區中之核苷酸25與76、33與68、34與67及37與64;及髮夾1區中之核苷酸78與100及83與94。
在一些實施例中,位置37-48中之一或多者缺失。在一些實施例中,位置37缺失。在一些實施例中,位置38缺失。在一些實施例中,位置39缺失。在一些實施例中,位置40缺失。在一些實施例中,位置41缺失。在一些實施例中,位置42缺失。在一些實施例中,位置43缺失。在一些實施例中,位置44缺失。在一些實施例中,位置45缺失。在一些實施例中,位置46缺失。在一些實施例中,位置47缺失。在一些實施例中,位置48缺失。
在一些實施例中,位置53-63中之一或多者缺失。在一些實施例中,位置53缺失。在一些實施例中,位置54缺失。在一些實施例中,位置55缺失。在一些實施例中,位置56缺失。在一些實施例中,位置57缺失。在一些實施例中,位置58缺失。在一些實施例中,位置59缺失。在一些實施例中,位置60缺失。在一些實施例中,位置61缺失。在一些實施例中,位置62缺失。在一些實施例中,位置63缺失。在一些實施例中,位置64缺失。
在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有長度為11個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有單一雙螺旋部分。
在一些實施例中,重複/反重複區中之鹼基配對核苷酸中之一或多者缺失。在一些實施例中,鹼基配對核苷酸中之一或多者係選自位置37與53、位置38與54、位置39與55、位置40與56、位置41與57、位置43與58、位置43與59、位置44與60、位置45與61、位置46與62、位置47與63及位置48與64。
在一些實施例中,重複/反重複區之上莖區包含1至5個鹼基對。
在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區之上莖包括一或多個相對於SEQ ID NO: 500之取代。
在一些實施例中,一或多個取代為維持鹼基配對之保守取代。舉例而言,G-C對變為C-G對或其他天然或經修飾之鹼基配對,或A-U對變為U-A對或其他天然或經修飾之鹼基配對。在一些實施例中,一或多個取代為交換鹼基配對核苷酸之位置的保守取代(例如,G-C對變為C-G對,或A-U對變為U-A對)。
在一些實施例中,核苷酸49-52中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500經取代。在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區未經取代。
在一些實施例中,經縮短之重複/反重複區具有12-22個經修飾核苷酸。
B. 經縮短之髮夾 1 區
在一些實施例中,本文所述之gRNA包含保守區,其包含經縮短之髮夾1區。在一些實施例中,髮夾1區包含髮夾1區之第一部分與第二部分之間的髮夾結構,其中第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中,本文所述之gRNA包含保守區,其包含髮夾1區之經縮短之上莖區。在一些實施例中,髮夾1包含環(例如四環)。
在一些實施例中,經縮短之髮夾1缺少2至10個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾1缺少2-8個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾1缺少2-4個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾缺少2個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾缺少3個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾缺少4個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾缺少5個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾缺少6個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾缺少7個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾缺少8個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾缺少9個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾缺少10個核苷酸。在一些實施例中,(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失,且視情況,核苷酸82-95中之一或多者經取代;及(ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96。
在一些實施例中,其中經縮短之髮夾1區缺少2至10個核苷酸。在一些實施例中,其中經縮短之髮夾1區具有13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸之長度。在一些實施例中,其中經縮短之髮夾1區具有長度為7至8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。如本文所用,當存在鹼基對82及95、83及94、85及93及86及92中之一或多者時,不認為核苷酸96中斷髮夾1之雙螺旋部分。
在一些實施例中,其中經縮短之髮夾1區具有單一雙螺旋部分。在一些實施例中,在經縮短之髮夾1區中,位置78與100及位置83與94具有鹼基層疊相互作用,且不構成雙螺旋部分中之不連續部分。
在一些實施例中,經縮短之髮夾1區之一或兩個鹼基對缺失。在一些實施例中,經縮短之髮夾1區之莖包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個鹼基對。在一些實施例中,經縮短之髮夾1區之莖的長度為七個或八個鹼基配對核苷酸。
在一些實施例中,經縮短之髮夾1區的位置85至86中之一或多者及核苷酸91至92中之一或多者缺失。在一些實施例中,經縮短之髮夾1區之核苷酸86及91缺失。在一些實施例中,經縮短之髮夾1區之核苷酸85及92缺失。在一些實施例中,經縮短之髮夾1區之核苷酸82-95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500經取代。在一些實施例中,核苷酸87-91中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500經取代。
在一些實施例中,經縮短之髮夾1區未經取代。在一些實施例中,其中經縮短之髮夾1區具有6-15個經修飾之核苷酸。
C. 經縮短之髮夾 2 區
在一些實施例中,本文所述之gRNA包含保守區,其包含經縮短之髮夾2區。在一些實施例中,髮夾2區包含髮夾2區之第一部分與第二部分之間的髮夾結構,其中第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中,(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少2-16個核苷酸。在一些實施例中,(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失,且視情況,核苷酸113-134中之一或多者經取代;及(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135。
在一些實施例中,本文所述之gRNA之保守區包含髮夾2區之經縮短之上莖區。在一些實施例中,髮夾1包含環(例如四環)。在一些實施例中,經縮短之髮夾2區缺少2-16個核苷酸。在一些實施例中,經縮短之髮夾2區具有26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。在一些實施例中,經縮短之髮夾2區具有28、29、30、31、32、33或34個核苷酸之長度。在一些實施例中,經縮短之髮夾2區之位置113-121中之一或多者及核苷酸126-134中之一或多者缺失。
經縮短之髮夾2區包含不配對區。不配對區,相對股上之核苷酸106-108及核苷酸139導致髮夾2內之雙螺旋部分之不連續,從而提供兩個雙螺旋部分,核苷酸102-105及140-143,以及核苷酸109-112及135-138。
在一些實施例中,經縮短之髮夾2區具有兩個雙螺旋部分。在一些實施例中,經縮短之髮夾2區具有一個長度為4個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。在一些實施例中,經縮短之髮夾2區具有一個長度為4-8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。在一些實施例中,經縮短之髮夾2區具有一個長度為4-6個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。在一些實施例中,經縮短之髮夾2區之上莖包含一個、兩個、三個或四個鹼基對。在一些實施例中,核苷酸113與134、核苷酸114與133、核苷酸115與132、核苷酸116與131、核苷酸117與130、核苷酸118與129、核苷酸119與128、核苷酸120與127及核苷酸121與126中之至少一對缺失。在一些實施例中,經縮短之髮夾2區的位置113至121及126至134中之所有者缺失。
在一些實施例中,其中經縮短之髮夾2區之核苷酸113至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500經取代。在一些實施例中,核苷酸122-125中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500經取代。
在一些實施例中,經縮短之髮夾2區未經取代。在一些實施例中,經縮短之髮夾2區具有6-15個經修飾之核苷酸。
D. 3 ' 尾
在一些實施例中,gRNA包含3'尾。在一些實施例中,3'尾之長度為1-20個核苷酸,且藉由磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵連接至gRNA之保守區的3'端。在一些實施例中,3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施例中,3'尾包含1、2、3、4或5個核苷酸。在一些實施例中,3'尾包含1或2個核苷酸。
在一些實施例中,3'尾之長度為1-10個核苷酸、1-5個核苷酸、1-4個核苷酸、1-3個核苷酸及1-2個核苷酸。在一些實施例中,3'尾包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施例中,3'尾具有1個核苷酸之長度。在一些實施例中,3'尾具有2個核苷酸之長度。在一些實施例中,3'尾具有3個核苷酸之長度。在一些實施例中,3'尾具有4個核苷酸之長度。在一些實施例中,3'尾具有1-2個核苷酸之長度。
在一些實施例中,3'尾以包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸終止。在一些實施例中,3'尾之長度為1個核苷酸。在一些實施例中,3'尾由包含尿嘧啶或經修飾之尿嘧啶的核苷酸組成。在一些實施例中,其中3'尾包含存在於3'尾中之核苷酸中之任何一或多者的修飾。在其他實施例中,其中3'尾之修飾為經2'-O-甲基(2'-OMe )修飾之核苷酸及核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵中之一或多者。
在一些實施例中,3'尾完全被修飾。
在一些實施例中,gRNA之3'核苷酸為包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸。
在一些實施例中,核苷酸144及145中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失。在一些實施例中,核苷酸144及145兩者相對於SEQ ID NO: 500缺失。
在一些實施例中,gRNA不包含3'尾。在一些實施例中,不包含3'尾的引導物之3'端以包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸終止。在一些實施例中,3'尾由包含尿嘧啶或經修飾之尿嘧啶的核苷酸組成。在一些實施例中,3'末端核苷酸為經修飾之核苷酸。在一些實施例中,3'端之修飾為經2'-O-甲基(2'-OMe )修飾之核苷酸及核苷酸末端核苷酸與倒數第二核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵中之一或多者。
在一些實施例中,3'端,亦即髮夾2之無另外尾之末端或3'尾之末端包含或進一步包含一或多個修飾,例如核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵、2'-OMe修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸、反向無鹼基修飾之核苷酸及其組合。在一些實施例中,3'端包含或進一步包含一或多個修飾,例如核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-OMe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸及其組合。在一些實施例中,3'端包含核苷酸141與142之間及142與143之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯;位置142及143中之各者處之2'-OMe修飾之核苷酸。
在一些實施例中,3'端,亦即髮夾2之無另外尾之末端或3'尾之末端包含或進一步包含核苷酸之間的一或多個硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中,3'端包含或進一步包含一或多個2'-OMe修飾之核苷酸。在一些實施例中,3'端包含或進一步包含一或多個2'-O-moe修飾之核苷酸。在一些實施例中,3'端包含或進一步包含一或多個2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中,3'端包含或進一步包含一或多個反向無鹼基修飾之核苷酸。在一些實施例中,3'端包含或進一步包含一或多個保護性端修飾。在一些實施例中,3'端包含或進一步包含以下中之一或多者之組合:核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-OMe修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸及反向無鹼基修飾之核苷酸。
E. 引導序列
在一些實施例中,gRNA進一步包含引導序列。在一些實施例中,引導序列包含在重複/反重複區之最5'核苷酸之5'的20、21、22、23、24或25個核苷酸,視情況22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中,引導序列包含22、23、24、25或更多個核苷酸。在一些實施例中,引導序列具有24個核苷酸之長度。在一些實施例中,引導序列具有23個核苷酸之長度。在一些實施例中,引導序列具有22個核苷酸之長度。在一些實施例中,引導序列具有21個核苷酸之長度。在一些實施例中,引導序列具有20個核苷酸之長度。
在一些實施例中,引導區具有:(i)相對於SEQ ID NO: 500,位置1至24內一個核苷酸之插入或1至4個核苷酸之缺失;或(ii) 24個核苷酸之長度。
在一些實施例中,引導序列之選擇係基於用於編輯之所關注基因內之目標序列而確定。舉例而言,在一些實施例中,gRNA包含與所關注基因之目標序列互補之引導序列。
在一些實施例中,所關注基因中之目標序列可與gRNA之引導序列互補。在一些實施例中,gRNA之引導序列與其在所關注基因中之對應目標序列之間的互補性或一致性程度可為約90%、95%或100%。在一些實施例中,gRNA之引導區與所關注基因之目標區可100%互補或一致。在其他實施例中,gRNA之引導序列及所關注基因之目標序列可含有至少一個錯配。舉例而言,gRNA之引導序列及所關注基因之目標序列可包含1個、視情況2個或3個錯配,其中目標序列之總長度為至少約22、23、24或更多個核苷酸。在一些實施例中,gRNA之引導序列及所關注基因之目標區可包含1個、視情況2個或3個錯配,其中引導序列包含約24個核苷酸。在某些實施例中,引導序列不含有錯配,亦即與目標序列完全互補。5'末端可包含不視為引導區(亦即,沒有將Cas9蛋白導引至目標核酸的功能)之核苷酸。
II. 經修飾之引導 RNA (gRNA)
本文揭示在各種位置包含修飾之引導RNA。在一些實施例中,包含修飾之gRNA的位置經修飾而具有以下修飾類型中之任何一或多者。術語「經修飾之gRNA」通常係指一種gRNA,其鹼基、糖及磷酸二酯鍵或主鏈部分(包括核苷酸磷酸酯)中之一或多者之化學結構具有修飾,全部如本文中所詳述及例示。
在一些實施例中,gRNA之引導區包含至少一個經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,gRNA之引導區包含至少兩個經修飾核苷酸、視情況至少四個經修飾核苷酸,其中各修飾獨立地視情況包含選自以下之經修飾核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合。
在一些實施例中,gRNA之引導區包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個經修飾之核苷酸。在一些實施例中,gRNA之引導區包含1、2或3個經修飾之核苷酸。在一些實施例中,gRNA之引導區包含4、5、6、7、8、9、10、11或12個經修飾之核苷酸。在一些實施例中,gRNA之引導區包含6、7、8、9、10、11或12個經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾。在一些實施例中,gRNA進一步包含3'端修飾。
在一些實施例中,引導區不包含在引導區之前三個核苷酸之3'的經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,引導區不包含經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,其中gRNA包含3'端修飾。在一些實施例中,gRNA包含重複/反重複區之上莖區中之修飾。在一些實施例中,gRNA包含髮夾1區中之修飾。在一些實施例中,gRNA包含髮夾2區中之修飾。在一些實施例中,gRNA包含3'端修飾,且包含重複/反向重複區之上部莖區中之修飾。在一些實施例中,gRNA包含3'端修飾及髮夾1區中之修飾。在一些實施例中,gRNA包含3'端修飾及髮夾2區中之修飾。在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾,且包含重複/反重複區之上莖區中之修飾。在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾及髮夾區1中之修飾。在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾及髮夾2區中之修飾。在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾、重複/反重複區之上部莖區中之修飾及3'端修飾。在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾、髮夾1區中之修飾及3'端修飾。在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾、髮夾1區中之修飾、髮夾2區中之修飾及3'端修飾。在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾、重複/反重複區中之修飾、髮夾1區中之修飾、髮夾2區中之修飾及3'端修飾。
在一些實施例中,gRNA不包含位置76處之修飾。在一些實施例中,gRNA不包含位置76處之PS修飾,亦即核苷酸76與77之間的PS修飾。
在一些實施例中,gRNA包含位置106-109處之一或多個,亦即1、2、3或4個修飾。在一些實施例中,gRNA包含位置106-109處之修飾。在一些實施例中,修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
在一些實施例中,gRNA包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中,gRNA包含2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾之核苷酸。在一些實施例中,gRNA包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中,gRNA包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。
在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾、3'端修飾,或5'及3'端修飾,諸如保護端修飾。在一些實施例中,5'端修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中,5'端修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)或2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中,5'端修飾包含至少一個硫代磷酸酯(PS)鍵及2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)或2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸中之一或多者。末端修飾可包含硫代磷酸酯(PS)、2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)或2'-氟(2'-F)修飾。本文所述之實施例亦涵蓋等效端修飾。在一些實施例中,gRNA包含與gRNA之一或多個區之修飾組合之端修飾。
例示性修飾模式展示於表1-2中。在某些實施例中,例示性修飾包括表1-2中所示之修飾模式,其中3'尾(若存在)缺失。額外例示性模式論述於下文。
本文所述之化學修飾類型 2'-O- 甲基修飾
咸信經修飾之糖類控制核苷酸糖環之褶皺,一種影響寡核苷酸對於互補股之結合親和力、雙螺旋體形成及與核酸酶之相互作用的物理特性。糖環上之取代因此可改變此等糖類之構形及褶皺。舉例而言,2'-O-甲基(2'-OMe)修飾可增加寡核苷酸之結合親和力及核酸酶穩定性,但如實例中所示,寡核苷酸中之指定位置處之任何修飾的影響需要憑經驗確定。
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示已經2'-OMe修飾之核苷酸。
核糖核苷酸及經修飾之2'-O-甲基核糖核苷酸可如下描繪:
2'-O-(2- 甲氧基乙基 ) 修飾
在一些實施例中,修飾可為2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)。經修飾之2'-O-moe核糖核苷酸可如下描繪:
術語「moeA」、「moeC」、「moeU」或「moeG」可用於表示已經2'-O-moe修飾之核苷酸。
2'- 氟修飾
已顯示可影響核苷酸糖環之另一化學修飾為鹵素取代。舉例而言,核苷酸糖環上之2'-氟(2'-F)取代可增加寡核苷酸結合親和力及核酸酶穩定性。
在本申請案中,術語「fA」、「fC」、「fU」或「fG」可用於表示已經2'-F取代之核苷酸。
不具有及具有2'-F取代之核糖核苷酸可如下描繪:
硫代磷酸酯修飾
硫代磷酸酯(PS)鍵聯或鍵係指一鍵,其中硫取代磷酸二酯鍵聯(例如核苷酸之間的磷酸二酯鍵聯)中之一個非橋接磷酸酯氧。當硫代磷酸酯用於產生寡核苷酸時,經修飾之寡核苷酸亦可被稱作S-寡核苷酸。
「*」可用於描述PS修飾。在本申請案中,術語A*、C*、U*或G*可用於表示經PS鍵連接至下一個(例如3')核苷酸之核苷酸。在本申請案通篇中,PS修飾係根據其3'碳鍵結至硫代磷酸酯的核苷酸分組;因此,指示PS修飾位於位置1處意謂硫代磷酸酯鍵結至核苷酸1之3'碳及核苷酸2之5'碳。
在本申請案中,術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」可以用於表示已經2'-OMe取代且經由PS鍵聯(其有時可以稱為「PS鍵」)連接至後續(例如3')核苷酸的核苷酸。類似地,術語「fA*」、「fC*」、「fU*」或「fG*」可用於表示已經2'-F取代且經由PS鍵聯連接至下一(例如3')核苷酸的核苷酸。本文所述之實施例涵蓋PS鍵聯或鍵之等效物。
下圖展示將S-取代非橋接磷酸酯氧,從而產生PS鍵聯替代磷酸二酯鍵聯:
鍵反向無鹼基修飾
無鹼基核苷酸係指缺少含氮鹼基之彼等核苷酸。下圖描繪一種寡核苷酸,其具有缺少鹼基的無鹼基(在此情況下,展示為無嘌呤核酸;無鹼基位點亦可為無嘧啶核酸位點,其中無鹼基位點之描述典型地參考華特生-克里克鹼基配對(Watson-Crick base pairing),例如無嘌呤核酸位點係指缺少含氮鹼基且典型地與嘧啶核酸位點存在鹼基成對的位點)位點,其中鹼基可在呋喃環之1'位置經另一部分取代(例如羥基,如下文所示,以形成核糖或去氧核糖位點,如下文所示,或氫):
反向鹼基係指鍵聯相對於正常5'至3'鍵聯(亦即,5'至5'鍵或3'至3'鍵聯)呈反向之彼等鹼基。舉例而言:
無鹼基核苷酸可經由反向鍵聯連接。舉例而言,無鹼基核苷酸可經由5'至5'鍵聯連接至末端5'核苷酸,或無鹼基核苷酸可經由3'至3'鍵聯連接至末端3'核苷酸。末端5'抑或3'核苷酸處之倒轉無鹼基核苷酸亦可稱為倒轉無鹼基端帽。在本申請案中,術語「invd」指示反向無鹼基核苷酸鍵聯。
去氧核糖核苷酸
在gRNA之情形下,去氧核糖核苷酸(其中糖包含2'-去氧位置)視為一種修飾,原因在於相對於標準RNA,核苷酸因質子取代2'位置之羥基而經修飾。除非另外指明,否則未修飾之RNA中之存在於位置U處的去氧核糖核苷酸修飾亦可包含T置換U核鹼基。
雙環核糖類似物
例示性雙環核糖類似物包括鎖定之核酸(LNA)、ENA、橋接之核酸(BNA),或其他LNA樣修飾。在一些情況下,雙環核糖類似物的2'及4'位置經由連接子連接。連接子可具有式-X-(CH
2)
n-,其中n為1或2;X為O、NR或S;且R為H或C
1-3烷基,例如甲基。雙環核糖類似物之實例包括LNA,其包含2'-O-CH
2-4'雙環結構(氧基-LNA)(參見WO 98/39352及WO 99/14226);2'-NH-CH
2-4'或2'-N(CH
3)-CH
2-4' (胺基-LNA)(Singh等人,
J. Org. Chem.63:10035-10039 (1998);Singh等人,
J. Org. Chem.63:6078-6079 (1998));及2'-S-CH
2-4' (硫基-LNA)(Singh等人,
J. Org. Chem.63:6078-6079 (1998);Kumar等人,
Biorg. Med. Chem. Lett.8:2219-2222 (1998))。
ENA
ENA修飾係指包含2'-
O,4'-
C-伸乙基修飾的核苷酸。ENA核苷酸之例示性結構展示如下,其中波浪線指示與相鄰核苷酸之連接(或視情況可為末端位置,應理解若3'末端核苷酸為ENA核苷酸,則3'位置可包含羥基而非磷酸酯)。關於ENA核苷酸之進一步論述,參見例如Koizumi等人,
Nucleic Acids Res. 31: 3267-3273 (2003)。
UNA
UNA或未鎖定的核酸修飾係指一種包含2',3'-seco-RNA修飾的核苷酸,其中2'與3'碳彼此不直接鍵結。UNA核苷酸之例示性結構展示如下,其中波浪線指示與相鄰磷酸酯的連接或置換磷酸酯的修飾(或視情況可為末端位置)。關於UNA核苷酸之進一步論述,參見例如Snead等人,
Molecular Therapy2: e103, doi:10.1038/mtna.2013.36 (2013)。
鹼基修飾
鹼基修飾為改變核鹼基結構或其相對於主鏈之鍵的任何修飾,包括異構化(如假尿苷)。在一些實施例中,鹼基修飾包括肌苷。在一些實施例中,修飾包含減少RNA核酸內切酶活性的鹼基修飾,其例如藉由干擾核糖核酸酶對裂解位點的識別及/或藉由使RNA結構(例如二級結構)穩定,從而減少核糖核酸酶對裂解位點的可及性。可以使RNA結構穩定的例示性鹼基修飾為假尿苷及5-甲基胞嘧啶。參見Peacock等人,
J Org Chem. 76: 7295-7300 (2011)。在一些實施例中,鹼基修飾可以如下提高或降低核酸的解鏈溫度(Tm),例如藉由增強華特生-克里克鹼基對的氫鍵、形成非典型鹼基對,或形成錯配的鹼基對。
以上修飾及其等效物包括在本文所述之實施例之範疇內。
3' 端修飾
在一些實施例中,3'端中之末端(亦即,最後) 1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸經修飾。在全篇中,此修飾可稱為「3'端修飾」。在一些實施例中,3'端中之末端(亦即,最後) 1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸包含超過一個修飾。在一些實施例中,3'端中之末端(亦即,最後) 1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸中之至少一者經修飾。在一些實施例中,3'端中之末端(亦即,最後) 1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸中之至少兩者經修飾。在一些實施例中,3'端中之末端(亦即,最後) 1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸中之至少三者經修飾。在一些實施例中,修飾包含PS鍵聯。在一些實施例中,對3'端之修飾為3'保護端修飾。在一些實施例中,3'端修飾包含3'保護端修飾。
在一些實施例中,3'端修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵或反向無鹼基修飾之核苷酸,視情況其中gRNA包含至少兩個獨立地選自以下之3'端修飾:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵及反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸及核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含最後1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸中之任何一或多者之修飾。在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含一個經修飾核苷酸。在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含兩個經修飾核苷酸。在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含三個經修飾核苷酸。在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含四個經修飾核苷酸。在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含五個經修飾核苷酸。在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含六個經修飾核苷酸。在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含七個經修飾核苷酸。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含1-7個或14個核苷酸之修飾。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含gRNA之3'端處之1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸之修飾。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含gRNA之3'端處之約1-3、1-4或1-5個核苷酸之修飾。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含以下中之任何一或多者:核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-O-Me修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸、反向無鹼基修飾之核苷酸及其組合。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的1、2、3或4個,視情況5、6或7個PS鍵聯。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含至少一個經2'-O-Me、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含一個PS鍵,其中該鍵介於最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間。在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含最後三個核苷酸之間的兩個PS鍵。在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含最後四個核苷酸之間的四個PS鍵。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含最後四個核苷酸中之任何一或多者之間的PS鍵聯。在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含最後三個核苷酸中之任何一或多者之間的PS鍵聯。在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含最後2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸中之任何一或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含最後1-4個,視情況1至7個核苷酸中之一或多者的修飾,其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個核苷酸之修飾,及視情況存在的連至3'端之下一核苷酸或第一核苷酸的一或兩個PS鍵聯。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個或倒數第二個核苷酸的修飾,及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個或倒數第三核苷酸的修飾,及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個、倒數第三個或倒數第四個核苷酸的修飾,及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中,3'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個、倒數第三個、倒數第四個或倒數第五個核苷酸的修飾,及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中,包含3'端修飾之gRNA包含或進一步包含3'尾,其中該3'尾包含存在於3'尾中之核苷酸中之任何一或多者的修飾。在一些實施例中,3'尾完全被修飾。在一些實施例中,3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至6個、1至7個、1至8個、1至9個或1至10個核苷酸,視情況其中此等核苷酸中之任何一或多者經修飾。在一些實施例中,3'尾包含1-4個核苷酸,視情況1-2個核苷酸。
在一些實施例中,提供包含3'端修飾之gRNA,其中3'端修飾包含如SEQ ID NO: 4-9及301-494中之任一者中所示之3'端修飾。在一些實施例中,提供包含5'端修飾之gRNA,其中5'端修飾包含如SEQ ID NO: 4-9及301-494中之任一者中所示之5'端修飾。在一些實施例中,提供包含3'保護端修飾之gRNA。
在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾及3'端修飾。
5 ' 端修飾
在一些實施例中,5'端經修飾,例如gRNA之前1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸經修飾。在全篇中,此修飾可稱為「5'端修飾」。在一些實施例中,5'端之前1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸包含超過一個修飾。在一些實施例中,5'端處之末端(亦即,前) 1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸中之至少一者經修飾。在一些實施例中,5'端處之末端1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸中之至少兩者經修飾。在一些實施例中,5'端處之末端1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸中之至少三者經修飾。在一些實施例中,5'端修飾為5'保護端修飾。
在一些實施例中,gRNA之5'端及3'端均經修飾。在一些實施例中,僅gRNA之5'端經修飾。在一些實施例中,僅gRNA之保守區之3'端經修飾。
在一些實施例中,gRNA包含gRNA之5'末端區處之前4個核苷酸,視情況前7個核苷酸中之1、2、3或4者,視情況5、6或7者處之修飾。在一些實施例中,gRNA包含3'端處之4個末端核苷酸,視情況7個末端核苷酸中之1、2、3或4者,視情況5、6或7者處之修飾。在一些實施例中,5'端處之前4個核苷酸中之1、2、3或4者,或3'端處之末端4個核苷酸中之1、2、3或4者經修飾。在一些實施例中,5'端處之前4個核苷酸中之2、3或4者與硫代磷酸酯(PS)鍵鍵聯。
在一些實施例中,對5'末端或3'末端之修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)或2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾。在一些實施例中,修飾包含對核苷酸之2'-氟(2'-F)修飾。在一些實施例中,修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中,修飾包含倒轉無鹼基核苷酸。在一些實施例中,修飾包含保護端修飾。在一些實施例中,修飾包含超過一個修飾,其選自保護端修飾、2'-O-Me、2'-O-moe、2'-氟(2'-F)、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵及倒轉無鹼基核苷酸。在一些實施例中,涵蓋等效修飾。
在一些實施例中,gRNA包含5'末端處之前一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個核苷酸之間的一或多個硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中,gRNA包含3'末端處之最後一個、兩個、三個或四個,視情況五個、六個或七個核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。在一些實施例中,gRNA包含3'末端處之最後一個、兩個、三個或四個,視情況五個、六個或七個核苷酸與5'末端之5'端的前一個、兩個、三個或四個,視情況五個、六個或七個核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。在一些實施例中,除PS鍵聯之外,5'及3'末端核苷酸可包含2'-O-Me、2'-O-moe或2'-F修飾之核苷酸。
在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾,例如其中引導區之第一個核苷酸經修飾。在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾,其中引導區之第一個核苷酸包含5'保護端修飾。
在一些實施例中,5'端修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵或反向無鹼基修飾之核苷酸,視情況其中gRNA包含至少兩個獨立地選自以下之5'端修飾:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵及反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸及核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含gRNA之引導區之核苷酸1-4,視情況1至7中之任何一或多者之修飾。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含一個經修飾之核苷酸。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含兩個經修飾之核苷酸。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含三個經修飾之核苷酸。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含四個經修飾之核苷酸。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含五個經修飾之核苷酸。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含六個經修飾之核苷酸。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含七個經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含1-7、1-5、1-4、1-3或1-2個核苷酸之修飾。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含自5'端起1、2、3或4個,視情況5、6或7個核苷酸之修飾。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含自5'端起約1-3個、1-4個、1-5個、1-6個或1-7個核苷酸之修飾。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端處之第一個核苷酸的修飾。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端的第一及第二核苷酸的修飾。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端之第一、第二及第三核苷酸的修飾。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端之第一、第二、第三及第四核苷酸的修飾。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端之第一、第二、第三、第四及第五核苷酸的修飾。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端之第一、第二、第三、第四、第五及第六核苷酸的修飾。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端之第一、第二、第三、第四、第五、第六及第七核苷酸的修飾。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、或2'-O-Me修飾之核苷酸、或2'-O-moe修飾之核苷酸、或2'-F修飾之核苷酸、或反向無鹼基修飾之核苷酸、或其組合。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的1、2、3、4、5、6或7個PS鍵聯。在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的約1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至6個或1至7個PS鍵聯。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含至少一個PS鍵聯,其中若存在一個PS鍵聯,則該鍵聯介於引導區之核苷酸1與2之間。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含至少兩個PS鍵聯,且該鍵聯介於引導區之核苷酸1與2之間及2與3之間。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1與2、2與3及3與4中之任何一或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4及4與5中之任何一或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5及5與6中之任何一或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5、5與6及7與8中之任何一或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1-7中之一或多者的修飾,其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對引導區之第一核苷酸的修飾,及視情況存在之連至後續核苷酸的PS鍵聯;
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對引導區之第一或第二核苷酸的修飾,及視情況存在於第一與第二核苷酸之間或第二與第三核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對該可變區之第一、第二或第三核苷酸的修飾,及視情況存在於第一與第二核苷酸之間、第二與第三核苷酸之間或第三與第四核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對該可變區之第一、第二、第三或第四核苷酸的修飾,及視情況存在於第一與第二核苷酸之間、第二與第三核苷酸之間、第三與第四核苷酸之間或第四與第五核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中,5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對該可變區之第一、第二、第三、第四或第五核苷酸的修飾,及視情況存在於第一與第二核苷酸之間、第二與第三核苷酸之間、第三與第四核苷酸之間、第四與第五核苷酸之間或第五與第六核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中,提供包含5'端修飾之gRNA,其中5'端修飾包含如SEQ ID NO: 4-9及301-494、931-946中之任一者中所示之5'端修飾。
在一些實施例中,sgRNA含有包含5'保護端修飾的5'端修飾。在一些實施例中,提供包含5'端修飾之gRNA,其中5'端修飾包含在引導區之核苷酸1、2及3處的2'-OMe修飾之核苷酸。
在一些實施例中,提供包含5'端修飾的gRNA,其中5'端修飾包含引導區之核苷酸1、2及3處之經2'-OMe修飾之核苷酸及引導區之核苷酸1與2、2與3及3與4之間的PS鍵聯。
在一些實施例中,提供包含5'端修飾的gRNA,其中5'端修飾包含在引導區之核苷酸1、2、3、4及5處的2'-OMe修飾之核苷酸。
在一些實施例中,提供包含5'端修飾之gRNA,其中5'端修飾包含引導區之核苷酸1、2、3、4及5處之經2'-OMe修飾之核苷酸及引導區之核苷酸1與2、2與3及3與4之間的PS鍵聯。
在一些實施例中,提供包含5'端修飾及3'端修飾之gRNA。在一些實施例中,gRNA包含5'及3'末端處之經修飾之核苷酸,及表3中所述之一或多個其他區中的經修飾之核苷酸。
在一些實施例中,sgRNA包含不位於5'或3'端的經修飾之核苷酸。例示性修飾模式描述於下文及表1中。
重複 / 反重複修飾
在一些實施例中,提供包含重複/反重複區修飾之gRNA,其中重複/反重複區修飾包含對上莖區中之核苷酸25-76中之任何一或多者之修飾。
在一些實施例中,提供包含重複/反重複區修飾之gRNA,其中上莖修飾包含重複/反重複區中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸之修飾。
在一些實施例中,提供包含上莖修飾之gRNA,其中上莖修飾包含重複/反重複區中約1-18、1-16、1-15、5-18、5-15、8-18、8-15、10-18、10-15或12-15個核苷酸之修飾。
在一些實施例中,提供包含重複/反重複修飾之gRNA,其中重複/反重複修飾包含2'-OMe修飾之核苷酸。在一些實施例中,提供包含重複/反重複修飾之gRNA,其中重複/反重複修飾包含2'-O-moe修飾之核苷酸。在一些實施例中,提供包含重複/反重複修飾之gRNA,其中重複/反重複修飾包含2'-F修飾之核苷酸。
在一些實施例中,提供包含重複/反重複修飾之gRNA,其中重複/反重複修飾包含2'-OMe修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸或其組合。
在一些實施例中,sgRNA包含如表1或2中之任一序列中所示之重複/反重複修飾。在一些實施例中,gRNA不包含重複/反重複區中之位置76處之修飾。在一些實施例中,gRNA不包含位置76處之PS修飾。
在一些實施例中,將此類重複/反重複修飾與5'保護端修飾(例如如表1或2中之對應序列所示)組合。在一些實施例中,將此類重複/反重複修飾與3'保護端修飾(例如如表1或2中之相應序列所示)組合。在一些實施例中,將此類重複/反重複修飾與如表1或2中之對應序列所示的5'及3'端修飾組合。
在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾及重複/反重複修飾。在一些實施例中,gRNA包含3'端修飾及重複/反重複修飾。在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾、3'端修飾及重複/反重複修飾。
髮夾修飾
在一些實施例中,gRNA包含髮夾區(例如髮夾1區或髮夾2區)中之修飾。在一些實施例中,髮夾區修飾包含至少一個經修飾之核苷酸,其選自2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸或其組合。
在一些實施例中,髮夾區修飾處於髮夾1區中。在一些實施例中,髮夾區修飾處於髮夾2區中。在一些實施例中,修飾位於髮夾1及髮夾2區內,視情況其中髮夾1與2之間的核苷酸亦經修飾。
在一些實施例中,髮夾修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
在一些實施例中,髮夾修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
在一些實施例中,髮夾區修飾包含至少一個經修飾之核苷酸,其選自2'H修飾之核苷酸(DNA)、PS修飾之核苷酸、2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸,或其組合。
在一些實施例中,gRNA包含髮夾2區中之位置106-109處之一或多個,亦即1、2、3或4個修飾。在一些實施例中,gRNA包含位置106-109處之修飾。在一些實施例中,修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
在一些實施例中,gRNA包含3'端修飾及髮夾區中之修飾。在一些實施例中,3'端修飾在髮夾區內,亦即在髮夾2中。
在一些實施例中,gRNA包含5'端修飾及髮夾區中之修飾。
在一些實施例中,gRNA包含重複/反重複修飾及髮夾區中之修飾。
在一些實施例中,gRNA包含如表1或2中之任一序列所示的髮夾修飾。在一些實施例中,此類髮夾修飾與如表1或2中之對應序列所示之5'端修飾組合。在一些實施例中,此類髮夾修飾與如表1或2中之對應序列所示之3'端修飾組合。在一些實施例中,此類髮夾修飾與如表1或2中之對應序列所示之5'及3'端修飾組合。
在一些實施例中,gRNA包含3'端修飾、髮夾區中之修飾、重複/反重複修飾及5'端修飾。
例示性引導 RNA
在一些實施例中,提供一種gRNA,其包含5'端修飾及以下中之一或多者中之一或多個修飾:重複/反重複區;髮夾1區;及髮夾2區,其中一或多個修飾與表1-2中之參考序列標識符中所示之修飾模式至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致。
在一些實施例中,本文所述之gRNA包含表1-2中所示之任何序列。在一些實施例中,本文所述之gRNA由表1-2中所示之任何序列組成。在一些實施例中,本文所述之gRNA由表1-2中所示之任何序列組成,其中移除任何3'尾序列。另外,涵蓋包含表1或2中所示且其中藉由SEQ ID NO鑑別之任何序列之修飾的gRNA。亦即,核苷酸可相同或不同,但所示修飾模式可與表1-2之引導序列的修飾模式相同或相似。修飾模式包括gRNA修飾之相對位置及一致性。
在一些實施例中,修飾模式含有表1-2之序列欄中所示之任一序列,或序列之一或多個區上的至少50%、55%、60%、70%、75%,較佳至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%修飾。在一些實施例中,修飾模式與表1-2之序列欄中所示之任一序列之修飾模式至少50%、55%、60%、70%、75%,較佳至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中,在表3中所示之序列的一或多個(例如1、2、3、4或5個)區內,修飾模式與表1-2中之模式至少50%、55%、60%、70%、75%,較佳至少80%、85%、90%或95%一致。
舉例而言,在一些實施例中,涵蓋修飾模式與引導序列內之序列之修飾模式至少50%、55%、60%、70%、75%,較佳至少80%、85%、90%或95%一致之gRNA。在一些實施例中,涵蓋修飾模式在重複/反重複區內至少50%、55%、60%、70%、75%,較佳至少80%、85%、90%或95%一致之gRNA。在一些實施例中,涵蓋修飾模式在髮夾1區內至少50%、55%、60%、70%、75%,較佳至少80%、85%、90%或95%一致之gRNA。在一些實施例中,涵蓋修飾模式在髮夾2區內至少50%、55%、60%、70%、75%、80%,較佳至少85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致之gRNA。在一些實施例中,涵蓋修飾模式在3'尾內至少50%、55%、60%、70%、80%或90%一致之gRNA。在一些實施例中,修飾模式不同於表1-2之序列或此序列之表3中所列區域之修飾模式在0、1、2、3、4、5或6個核苷酸。在一些實施例中,gRNA包含在0、1、2、3、4、5或6個核苷酸的修飾不同於表1-2之序列之修飾。在一些實施例中,gRNA包含在0、1、2、3、4、5或6個核苷酸的修飾不同於表1-2之序列之表3中所列區域之修飾。
在一些實施例中,提供一種gRNA,其包含SEQ ID NO: 1-19、21-42、301-494、931-946、951及952中所述之任一序列。在一些實施例中,提供一種gRNA,其由SEQ ID NO: 1-19、21-42、301-494、931-946、951及952中所述之任一序列組成。在一些實施例中,提供一種gRNA,其包含SEQ ID NO: 1-19、21-42、301-494、931-946、951及952中所述之任一序列,包括表1-2中所示之修飾。在一些實施例中,提供一種gRNA,其由SEQ ID NO: 1-19、21-42、301-494、931-946、951及952中所述之任一序列組成,包括表1-2中所示之修飾。在一些實施例中,提供一種gRNA,其包含SEQ ID NO: 1-19、21-42、301-494、931-946、951及952中所述之任一序列或由其組成,包括表1-2中所示之修飾,其中3'尾(若存在)缺失。
在一些實施例中,提供gRNA,其包含SEQ ID NO: 6或9之序列中之任一者,其中gRNA進一步包含與目標序列互補且將Cas9導引至其目標以進行裂解之引導序列。在一些實施例中,提供一種gRNA,其包含與SEQ ID NO: 6或9中之任一者之核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核酸,其中修飾模式與表1-2中之參考序列標識符中所示之修飾模式一致。
圖25、圖37及圖38顯示呈可能的二級結構之例示性sgRNA。
在一些實施例中,單引導RNA (sgRNA)包含:
引導序列,其包含:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區與經縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-134相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸,
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯,
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中,提供一種單引導RNA (sgRNA),其包含:
包含以下之引導區:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導區之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區與經縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-134相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯,
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中,提供一種單引導RNA (sgRNA),其包含:
包含以下之引導區:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導區之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38-47及54-63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、48、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區與經縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-134相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯;
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中,單引導RNA (sgRNA)包含:
包含以下之引導區:
前兩個核苷酸1-2處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2之間的PS鍵聯;及
引導區之核苷酸10及13處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其包含:
核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 500缺失;
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70、73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區與經縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯;
經縮短之髮夾1區,其包含:
核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失;
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94、99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其包含:
核苷酸112-120及127-134相對於SEQ ID NO: 500缺失;
核苷酸102-105、110、111、122-125、135、136、138、139、141-143處之2'-O-Me修飾之核苷酸,
核苷酸140-141、141-142與142-143之間的三個PS鍵聯,
其中該sgRNA不包含3'尾。
在一些實施例中,單引導RNA (sgRNA)包含:
引導序列,其包含:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區與經縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸,
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯,
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中,提供一種單引導RNA (sgRNA),其包含:
包含以下之引導區:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導區之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區與經縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯,
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中,提供一種單引導RNA (sgRNA),其包含:
包含以下之引導區:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導區之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38-47及54-63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、48、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區與經縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯;
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中,單引導RNA (sgRNA)包含:
包含以下之引導區:
前兩個核苷酸1-2處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2之間的PS鍵聯;及
引導區之核苷酸10及13處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其包含:
核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 500缺失;
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70、73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區與經縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯;
經縮短之髮夾1區,其包含:
核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失;
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94、99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其包含:
核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 500缺失;
核苷酸102-105、110、111、122-125、135、136、138、139、141-143處之2'-O-Me修飾之核苷酸,
核苷酸140-141、141-142與142-143之間的三個PS鍵聯,
其中該sgRNA不包含3'尾。
在一些實施例中,單引導RNA (sgRNA)包含:
引導序列,其包含:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38、41-48及53-60及63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、39-40、49-52、61-62、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區與經縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸,
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯,
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中,單引導RNA (sgRNA)包含:
引導序列,其包含:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸,
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯,
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中,單引導RNA (sgRNA)包含:
引導序列,其包含:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區與經縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、106-109、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸,
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯,
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中,單引導RNA (sgRNA)包含:
引導序列,其包含:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38-48及53-63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、106-109、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸,
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯,
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中,單引導RNA (sgRNA)包含:
引導序列,其包含:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38、41-48及53-60及63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、39-40、49-52、61-62、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸,
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯,
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中,單引導RNA (sgRNA)包含:
引導序列,其包含:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38、41-48及53-60及63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、39-40、49-52、61-62、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區與經縮短之髮夾1區之間的核苷酸76-77之間的PS鍵聯;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、106-109、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸,
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯,
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中,單引導RNA (sgRNA)包含:
引導序列,其包含:
前四個核苷酸1-4處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
核苷酸1-2、2-3及3-4之間的PS鍵聯;及
引導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之重複/反重複區,其中核苷酸38、41-48及53-60及63相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸25、29、30、31、32、37、39-40、49-52、61-62、64、65、69、70及73處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區,其中核苷酸86及91相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾1區與經縮短之髮夾2區之間的核苷酸101處之2'-O-Me修飾之核苷酸;
經縮短之髮夾2區,其中核苷酸112-120及127-135相對於SEQ ID NO: 500缺失,其包含:
核苷酸104、106-109、110、111、122-125、142及143處之2'-O-Me修飾之核苷酸,
核苷酸141-142與142-143之間的PS鍵聯,
其中核苷酸144-145中之一或兩者相對於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
套組及組合物
涵蓋包含本文所述之gRNA中之任一者及載劑、賦形劑、稀釋劑或其類似物的組合物。在一些情況下,賦形劑或稀釋劑呈惰性。在一些情況下,賦形劑或稀釋劑不呈惰性。在某些實施例中,載劑、賦形劑或稀釋劑為非熱原的。在某些實施例中,載劑、賦形劑或稀釋劑為無菌的。在一些實施例中,提供一種醫藥調配物,其包含本文所述之gRNA中之任一者及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或其類似物。在一些實施例中,醫藥調配物進一步包含LNP。在一些實施例中,醫藥調配物進一步包含Cas9蛋白或編碼Cas9蛋白的mRNA。在一些實施例中,醫藥調配物包含gRNA、LNP及Cas蛋白或編碼Cas蛋白之mRNA中之任何一或多者。在一些實施例中,gRNA為sgRNA。在一些實施例中,Cas蛋白為單體Cas蛋白,例如Cas9蛋白。在一些實施例中,Cas蛋白為Nme Cas蛋白。在一些實施例中,Cas蛋白包括多個次單元。
亦提供包含一或多種本文所述之gRNA、組合物或醫藥調配物之套組。在一些實施例中,套組進一步包含溶劑、溶液、緩衝液(各自與組合物或醫藥調配物分開)、說明書或乾燥劑中之一或多者。
包含經 RNA 引導之 DNA 結合劑或編碼經 RNA 引導之 DNA 結合劑之 mRNA 的組合物
在一些實施例中,提供組合物或醫藥調配物,其包含至少一種本文所述之gRNA、較佳sgRNA及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸(例如mRNA)。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑為Cas蛋白。在一些實施例中,gRNA連同Cas蛋白或編碼Cas蛋白之核酸(例如mRNA)被稱為Cas RNP。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑為與gRNA起作用以將經RNA引導之DNA結合劑導引至目標核酸序列之結合劑。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑為來自II型CRISPR/Cas系統的Cas蛋白。在一些實施例中,Cas蛋白為Cas9。在一些實施例中,Cas9蛋白為野生型Cas9。在一些實施例中,Cas9蛋白衍生自奈瑟氏腦膜炎菌Cas9 (NmeCas9)。在一些實施例中,提供包含至少一種gRNA及核酸酶或編碼NmeCas9之mRNA的組合物。在一些實施例中,提供包含至少一種gRNA及核酸酶或編碼NmeCas9之mRNA的組合物。在一些實施例中,Cas誘發目標DNA中之雙股斷裂。本文所述之實施例涵蓋NmeCas9及其同源物及變異體之等效物、本文所揭示之其他Cas蛋白。
經RNA引導之DNA結合劑(包括Cas9)涵蓋經修飾者及其變異體。具有一個非活性催化域(RuvC或HNH)之經修飾形式稱為「切口酶」。切口酶僅切割目標DNA上之一個股,從而產生單股斷裂。單鏈斷裂亦可稱為「鏈裂」。在一些實施例中,組合物及方法包含切口酶。在一些實施例中,組合物及方法包含切口酶RNA引導之DNA結合劑,諸如切口酶Cas,例如切口酶Cas9,其誘導目標DNA出現切口,而非雙股斷裂。
在一些實施例中,核酸酶(例如經RNA引導之DNA結合劑)可經修飾而僅含有一個功能核酸酶域。舉例而言,經RNA引導之DNA結合劑可經修飾以使得核酸酶域之一發生突變或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中,使用具有活性降低之RuvC域之切口酶Cas。在一些實施例中,使用具有非活性RuvC域之切口酶Cas。在一些實施例中,使用具有活性降低之HNH域之切口酶Cas。在一些實施例中,使用具有非活性HNH域之切口酶Cas。
在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑核酸酶域內之保守胺基酸經取代以減少或改變核酸酶活性。在一些實施例中,Cas蛋白可在RuvC或RuvC樣核酸酶域中包含胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括H588A(基於奈瑟氏腦膜炎菌Cas9蛋白)。在一些實施例中,Cas蛋白可包含HNH或HNH樣核酸酶域中之胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括D16A (基於NmeCas9蛋白)。
在一些實施例中,本文所述之RNP複合物包含切口酶或編碼切口酶之mRNA及與目標序列之有義股及反義股分別互補的一對gRNA (其中之一或兩者可為sgRNA)。在此實施例中,gRNA (例如sgRNA)將切口酶導引至目標序列且藉由在目標序列之對置股上產生切口(亦即,雙重切口)來引入雙股斷裂(DSB)。在一些實施例中,使用雙重切口可改良特異性且減少脫靶效應。在一些實施例中,切口酶RNA引導之DNA結合劑連同經選擇以緊密接近之兩個個別gRNA (例如sgRNA)一起使用,以在目標DNA中產生雙重切口。
在一些實施例中,使用嵌合Cas蛋白,其中蛋白質之一個結構域或區域經不同蛋白質之一部分置換。在一些實施例中,Cas核酸酶域可經來自諸如Fok1之不同核酸酶的域置換。在一些實施例中,Cas蛋白可為經修飾之核酸酶。
在一些實施例中,核酸酶(例如RNA引導之DNA結合劑)可經修飾以誘導點突變或鹼基變化,例如去胺作用。
在一些實施例中,Cas蛋白包含融合蛋白,其包含連接至異源功能域之Cas核酸酶(例如Cas9),該Cas核酸酶為切口酶或為無催化活性的。在一些實施例中,Cas蛋白包含融合蛋白,其包含連接至異源功能域之無催化活性Cas核酸酶(例如Cas9) (參見例如WO2014152432)。在一些實施例中,無催化活性Cas9為無催化活性奈瑟氏腦膜炎菌Cas9。在一些實施例中,無催化活性Cas包含使Cas不活化的突變。在一些實施例中,異源功能域為調節基因表現、組蛋白或DNA的結構域。在一些實施例中,異源功能域為轉錄活化域或轉錄抑制域。在一些實施例中,核酸酶為無催化活性Cas核酸酶,諸如dCas9。
在一些實施例中,異源功能域為去胺酶,諸如胞苷去胺酶或腺嘌呤去胺酶。在某些實施例中,異源功能域為C至T鹼基轉換器(胞苷去胺酶),諸如脂蛋白元B mRNA編輯酶(APOBEC)去胺酶。諸如去胺酶之異源功能域可為含有具有切口酶活性之Cas核酸酶或無催化活性之Cas核酸酶的融合蛋白的一部分。
在一些實施例中,目標序列可鄰近於PAM。在一些實施例中,PAM可鄰近於或在靶序列之3'端之1、2、3或4個核苷酸內。PAM之長度及序列可視所用Cas蛋白而定。舉例而言,PAM可選自特定Nme Cas9蛋白或Nme Cas9直系同源物之共有或特定PAM序列(Edraki等人, 2019)。在一些實施例中,Nme Cas9 PAM之長度可包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。非限制性例示性PAM序列包括NCC、N4GAYW、N4GYTT、N4GTCT、NNNNCC(a)、NNNNCAAA (其中N定義為任何核苷酸,W定義為A或T,且R定義為A或G;且(a)為較佳的,但並非必需的,A在第二C)之後)。在一些實施例中,PAM序列可為NCC。
在一些實施例中,異源功能域可促進將經RNA引導之DNA結合劑輸送至細胞核中。舉例而言,異源功能域可為核定位訊號(NLS)。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑可與1-10個NLS融合。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑可與1-5個NLS融合。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑可與一個NLS融合。在使用一個NLS之情況下,NLS較佳在經RNA引導之DNA結合劑序列之N末端處融合。其亦可插入RNA引導之DNA結合劑序列內。在其他實施例中,經RNA引導之DNA結合劑可與多於一個NLS融合。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑可與2、3、4或5個NLS融合。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在一些實施例中,NLS可融合至RNA引導之DNA結合劑序列之N末端。在一些實施例中,NLS可僅與RNA引導之DNA結合劑序列之N末端融合。在一些實施例中,RNA引導之DNA結合劑可不具有插入RNA引導之DNA結合劑序列內之NLS。在某些實施例中,RNA引導之DNA結合劑序列之C末端可不具有NLS。
在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在某些情況下,兩個NLS可相同(例如,兩個SV40 NLS)或不同。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑與胺基末端處之兩個NLS序列(例如SV40)融合。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合,一個NLS在N端處且一個在C端處。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑不與C末端處之NLS融合。在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑不包括插入經RNA引導之DNA結合劑序列內之NLS。NLS可在經RNA引導之DNA結合劑之C末端處稠合。一或多個連接子視情況包括在融合位點處。
在一些實施例中,NLS可為單聯(monopartite)序列,諸如SV40 NLS、PKKKRKV (SEQ ID NO: 669)或PKKKRRV (SEQ ID NO: 670)。在一些實施例中,NLS可為雙聯序列,諸如核質蛋白之NLS、KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 682)。在一些實施例中,NLS序列可包含LAAKRSRTT (SEQ ID NO: 671)、QAAKRSRTT (SEQ ID NO: 672)、PAPAKRERTT (SEQ ID NO: 673)、QAAKRPRTT (SEQ ID NO: 674)、RAAKRPRTT (SEQ ID NO: 675)、AAAKRSWSMAA (SEQ ID NO: 676)、AAAKRVWSMAF (SEQ ID NO: 677)、AAAKRSWSMAF (SEQ ID NO: 678)、AAAKRKYFAA (SEQ ID NO: 679)、RAAKRKAFAA (SEQ ID NO: 680)、或RAAKRKYFAV (SEQ ID NO: 681)。NLS可為核內小核糖核蛋白輸入蛋白(snurportin)-1內輸協助因子(importin)-β (IBB域,例如SPN1-impβ序列。參見Huber等人, 2002, J. Cell Bio., 156, 467-479。在一特定實施例中,單一PKKKRKV (SEQ ID NO:669)。在一些實施例中,第一及第二NLS獨立地選自SV40 NLS、核質蛋白NLS、雙聯NLS、c-myc樣NLS及包含序列KTRAD之NLS。在某些實施例中,第一及第二NLS可相同(例如兩個SV40 NLS)。在某些實施例中,第一及第二NLS可不同。
在一些實施例中,第一NLS為SV40NLS且第二NLS為核質蛋白NLS。
在一些實施例中,SV40 NLS包含SEQ ID NO: 683或684之序列。在一些實施例中,核質蛋白NLS包含SEQ ID NO: 682之序列。在一些實施例中,雙聯NLS包含SEQ ID NO: 685之序列。在一些實施例中,c-myc樣NLS包含SEQ ID NO: 686之序列。
在一些實施例中,經RNA引導之DNA結合劑包含與SEQ ID NO: 600-603、605、607-620或707-712中之任一者(如表4A中所示)至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中,編碼經RNA引導之DNA結合劑之多核苷酸包含與SEQ ID NO: 621-623、626-643、645、647-668、701-706及713-718中之任一者(如表4A中所示之NmeCas9 mRNA及ORF)至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中,編碼經RNA引導之DNA結合劑之mRNA包含開放閱讀框架(ORF),其包含與如表4A中所示之SEQ ID NO: 621-623、626-639及713-718中之任一者至少90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%或100%一致之序列。
使用方法
在一些實施例中,本文所述之gRNA (例如sgRNA)、組合物或醫藥調配物中之任何一或多者係用於製備供治療或預防個體之疾病或病症的藥劑。
在一些實施例中,本發明包含一種治療或預防個體之疾病或病症的方法,其包含投與本文所述之gRNA (例如sgRNA)、組合物或醫藥調配物中之任何一或多者。
在一些實施例中,本發明包含一種修飾目標DNA的方法或用途,包含投與或遞送本文所述之gRNA (例如sgRNA)、組合物或醫藥調配物中之任何一或多者。
在一些實施例中,本發明包含調節目標基因之方法或用途,其包含投與或遞送本文所述之gRNA (例如sgRNA)、組合物或醫藥調配物中之任何一或多者。在一些實施例中,調節為編輯目標基因。在一些實施例中,調節為改變目標基因所編碼之蛋白質的表現。
如本文所用,「基因編輯」或「基因修飾」為例如藉由gRNA/Cas複合物誘導之DNA層級之改變。基因編輯或基因修飾可包含通常在已確定序列或基因體基因座內之插入、缺失或取代(鹼基取代,例如C至T,或點突變)。基因修飾改變DNA之核酸序列。基因修飾可位於單一核苷酸位置處。基因修飾可位於多個核苷酸,例如2、3、4、5或更多個核苷酸處,通常彼此非常接近,例如連續核苷酸。
在一些實施例中,該方法或用途引起基因編輯。在一些實施例中,該方法或用途引起目標基因內之雙股斷裂。在一些實施例中,該方法或用途引起在DSB之非同源端連接期間形成插入缺失突變。在一些實施例中,該方法或用途引起目標基因中之核苷酸插入或缺失。在一些實施例中,目標基因中之核苷酸插入或缺失引起讀框轉移突變或過早終止密碼子產生非功能蛋白質。在一些實施例中,目標基因中之核苷酸插入或缺失引起目標基因表現之阻斷或消除。在一些實施例中,該方法或用途包含DSB之同源定向修復。在一些實施例中,方法或用途進一步包含將模板遞送至細胞,其中將模板之至少一部分在或靠近核酸酶誘導之雙股斷裂位點併入目標DNA。在一些實施例中,該方法或用途引起目標基因內之單股斷裂。在一些實施例中,該方法或用途引起目標基因內之鹼基變化,例如藉由去胺作用。基因編輯通常發生在目標基因中與間隔序列形成雙螺旋體的部分內或附近。
在一些實施例中,該方法或用途引起基因調節。在一些實施例中,基因調節為基因表現之增加或減少、DNA之甲基化狀態變化,或組蛋白亞單元之修飾。在一些實施例中,該方法或用途引起目標基因所編碼之蛋白質之表現增加或減少。
可在活體外及活體內測試gRNA之功效。在一些實施例中,本發明包含本文所述之gRNA、組合物或醫藥調配物中之一或多者,其中gRNA當連同Cas核酸酶,例如Cas9或編碼Cas9之mRNA一起提供至細胞時引起基因調節。在一些實施例中,可量測gRNA在活體外或活體內之功效。
在一些實施例中,對包含gRNA之Cas RNP的活性與包含未經修飾之sgRNA或參考sgRNA之Cas RNP的活性進行比較,該參考sgRNA缺少存在於sgRNA中之修飾,諸如一或多個內部連接子或經縮短之區。在一些實施例中,sgRNA不包括內部連接子。
在一些實施例中,gRNA增加或減少靶蛋白表現之效率係藉由量測靶蛋白之量測定。
在一些實施例中,遞送Cas核酸酶及gRNA之後,藉由存在於基因體中之目標位置處之編輯來測定利用特定gRNA進行編輯之效率。在一些實施例中,經特定gRNA編輯之效率係藉由次世代定序(NGS)來量測。在一些實施例中,測定所關注之目標區域之編輯百分比。在一些實施例中,在遞送gRNA及Cas核酸酶之後量測在序列讀段總數上具有序列改變,例如插入或缺失(插入/缺失)或鹼基改變而無所關注之目標區域中之核苷酸插入或缺失的序列讀段總數。
在一些實施例中,藉由成功基因編輯引入的序列改變(例如核苷酸之插入或缺失,或鹼基取代,或點突變)之存在來量測利用特定gRNA進行編輯之效率。在一些實施例中,在生物化學分析中測試Cas核酸酶及gRNA之活性。在一些實施例中,在無細胞裂解分析中測試Cas核酸酶及gRNA之活性。在一些實施例中,在Neuro2A細胞中測試Cas核酸酶及gRNA之活性。在一些實施例中,在原代細胞(例如原代肝細胞)中測試Cas核酸酶及gRNA之活性。
在一些實施例中,活體內給與包含經修飾之gRNA及Cas蛋白或編碼Cas蛋白之mRNA的LNP之後,量測經修飾之gRNA之活性。
在一些實施例中,本文提供之gRNA或組合物之活體內功效係藉由在投與gRNA及Cas核酸酶之後編輯自組織(例如肝組織)提取之DNA中量測之功效來確定。
在一些實施例中,個體免疫反應之活化係藉由在活體內給與sgRNA以及Cas核酸酶mRNA或蛋白質(例如調配於LNP中)之後細胞介素之血清濃度來量測。在一些實施例中,細胞介素為干擾素-α (IFN-α)、介白素6 (IL-6)、單核球趨化蛋白1 (MCP-1)或腫瘤壞死因子α (TNF-α)。
在一些實施例中,相比於投與未經修飾之sgRNA,一起投與Cas RNP或Cas核酸酶mRNA與經修飾之gRNA (例如sgRNA)產生免疫細胞介素之較低血清濃度。在一些實施例中,本發明包含包括向個體投與本文所揭示之gRNA中之任一者的方法,其中該gRNA與未經類似修飾之對照gRNA相比引發個體血清中免疫細胞介素之濃度降低。
引導 RNA 之遞送
在一些實施例中,單獨或在一或多種載體上編碼之本文所揭示之gRNA組合物、組合物或醫藥調配物在脂質奈米粒子中調配或經由脂質奈米粒子投與;參見例如WO2017/173054,其內容特此以全文引用之方式併入。
脂質;調配物;遞送
本文揭示使用包含本文中所描述之核酸或組合物之脂質核酸組裝組合物的各種實施例。在一些實施例中,脂質核酸組裝組合物包含本文所述之gRNA,例如包含引導區及保守區之gRNA,該保守區包含以下中之一或多者:(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸,其中(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況,核苷酸37-64中之一或多者經取代;及(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65;或(b)經縮短之髮夾1區,其中經縮短之髮夾1缺少2-10個,視情況2-8個核苷酸,其中(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失,且視情況,位置82-96中之一或多者經取代;及(ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96;或(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少2-18個,視情況2-16個核苷酸,其中(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失,且視情況,核苷酸113-134中之一或多者經取代;及(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135;其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144-145中之一或兩者視情況缺失;其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
如本文所用,「脂質核酸組裝組合物」係指基於脂質之遞送組合物,包括脂質奈米粒子(LNP)及脂質複合體。LNP係指<100nM之脂質奈米粒子。LNP係藉由將脂質組分(例如於乙醇中)與水性核酸組分精確混合而形成,且LNP之大小均一。脂複合體為藉由使脂質及核酸組分大量混合而形成之粒子且大小在約100 nm與1微米之間。在某些實施例中,脂質核酸組裝體為LNP。如本文所用,「脂質核酸組裝體」包含複數個(亦即,超過一個)藉由分子間力以物理方式彼此締合之脂質分子。脂質核酸組裝體可包含pKa值為<7.5或<7之生物可用脂質。脂質核酸組裝體係藉由混合含核酸水溶液與基於有機溶劑之脂質溶液(例如100%乙醇)形成。適合溶液或溶劑包括或可含有:水、PBS、Tris緩衝液、NaCl、檸檬酸鹽緩衝液、乙醇、氯仿、二乙醚、環己烷、四氫呋喃、甲醇、異丙醇。醫藥學上可接受之緩衝液可視情況包含於包含脂質核酸組裝體之醫藥調配物中,例如用於離體療法。在一些實施例中,水溶液包含本文所描述之gRNA。在一些實施例中,水溶液進一步包含編碼RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas9)的mRNA。
如本文所使用,脂質奈米粒子(LNP)係指包含複數個(亦即,超過一個)藉由分子間力以物理方式彼此締合之脂質分子的粒子。LNP可例如為微球體(包括單層及多層囊泡,例如「脂質體」-在一些實施例中為大體上球形之層狀相脂質雙層-且在更特定實施例中可包含水性核心,例如包含大部分RNA分子)、乳液中之分散相、膠束或懸浮液中之內相。乳液、微胞及懸浮液可為用於局部及/或體表遞送之適合組合物。亦參見例如WO2017173054A1,其內容特此以全文引用之方式併入。熟習此項技術者已知能夠將核苷酸遞送至個體之任何LNP可與導引RNA及編碼RNA導引之切口酶之核酸及編碼本文所描述之胞苷去胺酶的核酸一起使用。
在一些實施例中,水溶液包含本文所述之gRNA且視情況進一步包含編碼經RNA引導之DNA結合劑,諸如Cas9之mRNA。包含脂質核酸組裝組合物之醫藥調配物可視情況包含醫藥學上可接受之緩衝液。
在一些實施例中,脂質核酸組裝組合物包括「胺脂質」(在本文中或其他地方有時描述為「可離子化脂質」或「可生物降解脂質」),以及視情況存在之「輔助脂質」、「中性脂質」及隱形脂質,諸如PEG脂質。在一些實施例中,取決於pH,胺脂質或可離子化脂質為陽離子型的。
胺脂質
在一些實施例中,脂質核酸組裝組合物包含「胺脂質」,其為例如可離子化脂質,諸如脂質A或其等效物,包括脂質A之縮醛類似物。
在一些實施例中,胺脂質為脂質A,其為十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯,亦稱為(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。脂質A可描繪為:
。
可根據WO2015/095340 (例如第84-86頁)合成脂質A。在一些實施例中,胺脂質為脂質A之等效物。
在一些實施例中,胺脂質為脂質A之類似物。在一些實施例中,脂質A類似物為脂質A之縮醛類似物。在特定脂質核酸組裝組合物中,縮醛類似物為C4-C12縮醛類似物。在一些實施例中,縮醛類似物為C5-C12縮醛類似物。在額外實施例中,縮醛類似物為C5-C10縮醛類似物。在其他實施例中,縮醛類似物係選自C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11及C12縮醛類似物。
適用於本文所描述之脂質核酸組裝體的胺脂質及其他「可生物降解脂質」為活體內或離體可生物降解的。胺脂質具有低毒性(例如,以大於或等於10 mg/kg之量在動物模型中得到耐受而不具有不良作用)。在一些實施例中,包含胺脂質之脂質核酸組裝體包括其中在8、10、12、24或48小時或3、4、5、6、7或10天內自血漿或工程化細胞清除至少75%之胺脂質的脂質核酸組裝體。在一些實施例中,包含胺脂質之脂質核酸組裝體包括其中在8、10、12、24或48小時或3、4、5、6、7或10天內自血漿清除至少50%核酸,例如mRNA或gRNA的脂質核酸組裝體。在一些實施例中,包含胺脂質之脂質核酸組裝體包括其中在8、10、12、24或48小時或3、4、5、6、7或10天內自血漿清除至少50%之脂質核酸組裝體之彼等,例如藉由量測脂質(例如,胺脂質)、核酸(例如,RNA/mRNA)或其他組分。在一些實施例中,量測脂質核酸組裝體之經脂質囊封相對於游離脂質、RNA或核酸組分。
可生物降解脂質包括例如WO/2020/219876、WO/2020/118041、WO/2020/072605、WO/2019/067992、WO/2017/173054、WO2015/095340及WO2014/136086之可生物降解脂質,且LNP包括其中所描述之LNP組合物,其脂質及組合物特此以引用之方式併入。
脂質清除率可如文獻中所述來量測。參見Maier, M.A.等人 Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics.
Mol. Ther.2013, 21(8), 1570-78 (「
Maier」)。舉例而言,在
Maier中,以0.3 mg/kg藉由靜脈內彈丸注射經由外側尾部靜脈向六至八週齡雄性C57Bl/6小鼠投與含有靶向螢光素酶之siRNA的LNP-siRNA系統。在給藥後0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96及168小時收集血液、肝臟及脾臟樣品。在收集組織之前向小鼠灌注生理鹽水且處理血液樣品以獲得血漿。處理且藉由LC-MS分析所有樣品。此外,
Maier描述了一種用於評定投與LNP-siRNA調配物之後的毒性之程序。舉例而言,以0、1、3、5及10 mg/kg (5隻動物/組)經由單一靜脈內彈丸注射以5 mL/kg之劑量體積向雄性史泊格-多利大鼠(Sprague-Dawley rat)投與靶向螢光素酶之siRNA。24小時之後,自清醒的動物之頸靜脈獲得約1 mL血液且分離血清。在給藥後72小時,將所有動物安樂死以用於屍體剖檢。進行臨床症狀、體重、血清化學、器官重量及組織病理學之評定。儘管
Maier描述了用於評定siRNA-LNP調配物之方法,但此等方法可適用於評定本發明之脂質核酸組裝組合物之投藥的清除率、藥物動力學及毒性。
此項技術中已知用於核酸之LNP遞送的可離子化及生物可用脂質為適合的。脂質可視其所處之介質之pH而離子化。舉例而言,在弱酸性介質中,諸如胺脂質之脂質可經質子化且因此帶有正電荷。相反地,在弱鹼性介質,諸如其中pH為大約7.35之血液中,脂質,諸如胺脂質可不經質子化且因此不帶電荷。
脂質帶有電荷之能力與其固有pKa有關。在一些實施例中,本發明之胺脂質可各自獨立地具有在約5.1至約7.4範圍內之pKa。在一些實施例中,本發明之生物可用脂質可各自獨立地具有在約5.1至約7.4,諸如約5.5至約6.6、約5.6至約6.4、約5.8至約6.2或約5.8至約6.5範圍內之pKa。舉例而言,本發明之胺脂質可各自獨立地具有在約5.8至約6.5範圍內之pKa。pKa在約5.1至約7.4範圍內之脂質有效用於活體內遞送負荷,例如遞送至肝臟。此外,已發現,pKa在約5.3至約6.4範圍內之脂質對活體內遞送至例如腫瘤為有效的。參見例如WO2014/136086。
額外脂質
適用於本發明之脂質核酸組裝組合物中的「中性脂質」包括例如多種中性、不帶電荷或兩性離子型脂質。適用於本發明之中性磷脂之實例包括但不限於:5-十七基苯-1,3-二醇(間苯二酚)、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、磷酸膽鹼(DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、磷脂醯膽鹼(PLPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DAPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、卵磷脂醯膽鹼(EPC)、二月桂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-肉豆蔻醯基-2-軟脂醯基磷脂醯膽鹼(MPPC)、1-軟脂醯基-2-肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(PMPC)、1-軟脂醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼(PSPC)、1,2-二花生醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DBPC)、1-硬脂醯基-2-軟脂醯基磷脂醯膽鹼(SPPC)、1,2-二十碳烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DEPC)、軟脂醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、溶血磷脂醯基膽鹼、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二亞油醯基磷脂醯膽鹼二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二軟脂醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、軟脂醯油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、溶血磷脂醯乙醇胺及其組合。在一個實施例中,中性磷脂可選自由以下組成之群:二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)及二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)。在另一實施例中,中性磷脂可為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)。
「輔助脂質」包括類固醇、固醇及烷基間苯二酚。適用於本發明中之輔助脂質包括但不限於膽固醇、5-十七基間苯二酚及膽固醇半丁二酸酯。在一個實施例中,輔助脂質可為膽固醇。在一個實施例中,輔助脂質可為膽固醇半丁二酸酯。
「隱形脂質」為改變奈米粒子可在活體內(例如血液中)存在之時長的脂質。隱形脂質可藉由例如減少粒子聚集且控制粒度來輔助調配過程。本文使所用之隱形脂質可調節脂質核酸組裝體之藥物動力學特性或有助於奈米粒子離體穩定性。適用於本發明之脂質核酸組裝組合物之隱形脂質包括但不限於具有連接至脂質部分之親水性頭基的隱形脂質。適用於本發明之脂質核酸組裝組合物之隱形脂質及關於此類脂質之生物化學的資訊可見於Romberg等人, Pharmaceutical Research, 第25卷, 第1期, 2008, 第55至71頁及Hoekstra等人, Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52中。額外適合PEG脂質揭示於例如WO 2006/007712中。
在一個實施例中,隱形脂質之親水性頭基包含選自基於PEG之聚合物的聚合物部分。隱形脂質可包含脂質部分。在一些實施例中,隱形脂質為PEG脂質。
在一個實施例中,隱形脂質包含選自基於以下之聚合物的聚合物部分:PEG (有時稱作聚(環氧乙烷))、聚(㗁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚胺基酸及聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺]。
在一個實施例中,PEG脂質包含基於PEG (有時稱作聚(環氧乙烷))之聚合物部分。
PEG脂質進一步包含脂質部分。在一些實施例中,脂質部分可源自二醯基甘油或二醯基甘油醯胺、包括包含具有獨立地包含約C4至約C40飽和或不飽和碳原子之烷基鏈長度的二烷基甘油或二烷基甘油醯胺基之彼等者,其中該鏈可包含一或多個官能基,諸如醯胺或酯。在一些實施例中,烷基鏈長度包含約C10至C20。二烷基甘油或二烷基甘油醯胺基可進一步包含一或多個經取代之烷基。鏈長可為對稱或不對稱的。
除非另外指示,否則如本文所使用,術語「PEG」意謂任何聚乙二醇或其他聚伸烷醚聚合物。在一個實施例中,PEG為乙二醇或環氧乙烷的視情況經取代之直鏈或分支鏈聚合物。在一個實施例中,PEG為未經取代的。在一個實施例中,PEG經例如一或多個烷基、烷氧基、醯基、羥基、或芳基取代。在一個實施例中,該術語包括PEG共聚物,諸如PEG-聚胺基甲酸酯或PEG-聚丙烯(參見例如J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992));在另一實施例中,該術語不包括PEG共聚物。在一個實施例中,PEG之分子量為約130至約50,000,在子實施例中,約150至約30,000,在子實施例中,約150至約20,000,在子實施例中,約150至約15,000,在子實施例中,約150至約10,000,在子實施例中,約150至約6,000,在子實施例中,約150至約5,000,在子實施例中,約150至約4,000,在子實施例中,約150至約3,000,在子實施例中,約300至約3,000,在子實施例中,約1,000至約3,000,及在子實施例中,約1,500至約2,500。
在一些實施例中,PEG (例如與脂質部分或脂質,諸如隱形脂質結合)為「PEG-2K」,亦稱為「PEG 2000」,其平均分子量為約2,000道爾頓。PEG-2K在本文中由下式(I)表示,其中n為45,意謂經數目平均化之聚合度包含約45個次單位
。然而,可使用此項技術中已知之其他PEG實施例,包括例如其中數目平均化聚合度包含約23個次單位(n=23)及/或68個次單位(n=68)之彼等。在一些實施例中,n可在約30至約60範圍內。在一些實施例中,n可在約35至約55範圍內。在一些實施例中,n可在約40至約50範圍內。在一些實施例中,n可在約42至約48範圍內。在一些實施例中,n可為45。在一些實施例中,R可選自H、經取代之烷基及未經取代之烷基。在一些實施例中,R可為未經取代之烷基。在一些實施例中,R可為甲基。
在本文所述之實施例中之任一者中,PEG脂質可選自PEG-二月桂醯甘油、PEG-二肉豆蔻醯甘油(例如1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油基-3-甲基聚氧基乙烯二醇2000 (PEG2k-DMG)或PEG-DMG (目錄號GM-020,來自NOF, Tokyo, Japan)、PEG-二棕櫚醯甘油、PEG-二硬脂醯甘油(PEG-DSPE) (目錄號DSPE-020CN,NOF, Tokyo, Japan)、PEG-二月桂基甘油醯胺、PEG-二肉豆蔻基甘油醯胺、PEG-二棕櫚醯甘油醯胺及PEG-二硬脂醯甘油醯胺、PEG-膽固醇(1-[8'-(膽甾-5-烯-3[β]-氧基)甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛基]胺甲醯基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB (3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DMG) (目錄號880150P,來自Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DSPE) (目錄號880120C,來自Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG;GS-020,NOF Tokyo, Japan)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)及1,2-二硬脂醯氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DSA)。在一個實施例中,PEG脂質可為1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙二醇2000 (PEG2k-DMG)。在一個實施例中,PEG脂質可為PEG2k-DMG。在一個實施例中,PEG脂質可為PEG2k-DMG。在一些實施例中,PEG脂質可為PEG2k-DSG。在一個實施例中,PEG脂質可為PEG2k-DSPE。在一個實施例中,PEG脂質可為PEG2k-DMA。在一個實施例中,PEG脂質可為PEG2k-C-DMA。在一個實施例中,PEG脂質可為化合物S027,其揭示於WO2016/010840(第[00240]至[00244]段)中。在一個實施例中,PEG脂質可為PEG2k-DSA。在一個實施例中,PEG脂質可為PEG2k-C11。在一些實施例中,PEG脂質可為PEG2k-C14。在一些實施例中,PEG脂質可為PEG2k-C16。在一些實施例中,PEG脂質可為PEG2k-C18。
在較佳實施例中,PEG脂質包括甘油基。在較佳實施例中,PEG脂質包括二肉豆蔻醯基甘油(DMG)基。在較佳實施例中,PEG脂質包含PEG-2k。在較佳實施例中,PEG脂質為PEG-DMG。在較佳實施例中,PEG脂質為PEG-2k-DMG。在較佳實施例中,PEG脂質為1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇2000。在較佳實施例中,PEG-2k-DMG為1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
LNP 遞送 gRNA
脂質奈米粒子(LNP)為遞送核苷酸及蛋白質負荷之熟知方式,且可用於遞送本文所揭示之gRNA (例如sgRNA)、組合物或醫藥調配物。在一些實施例中,LNP遞送核酸、蛋白質、或核酸連同蛋白質一起。如本文所使用,脂質奈米粒子(LNP)係指包含複數個(亦即,超過一個)藉由分子間力以物理方式彼此締合之脂質分子的粒子。LNP可為例如微球(包括單層及多層囊泡,例如「脂質體」-層狀相脂質雙層,其在一些實施例中為大體上球體,且在更特定實施例中可包含水性核心,例如包含相當大部分之RNA分子)、乳液中之分散相、膠束或懸浮液中之內相(參見例如WO2017173054,其內容特此以全文引用之方式併入)。可利用熟習此項技術者已知能夠向個體遞送核苷酸之任何LNP。
在一些實施例中,本發明包含向個體遞送本文所揭示之gRNA中之任一者之方法,其中gRNA與LNP締合。在一些實施例中,gRNA/LNP亦與Cas核酸酶或編碼Cas核酸酶之多核苷酸(例如mRNA或DNA)締合。
在一些實施例中,本發明包含一種包含所揭示之任一種gRNA及LNP的組合物。在一些實施例中,組合物進一步包含Cas9或編碼Cas9之多核苷酸(例如mRNA或DNA)。
在一些實施例中,本文提供一種將本文所描述之引導RNA中之任一者遞送至個體之細胞或細胞群,包括活體內遞送至個體內之細胞或細胞群的方法,其中該等組分中之任何一或多者與LNP締合。在一些實施例中,該方法進一步包含RNA引導之DNA結合劑(例如,Cas9或編碼Cas9之多核苷酸(例如mRNA或DNA))。
在一些實施例中,本發明提供一種組合物,其包含單獨或與LNP組合的本文所描述之引導RNA中之任一者或本文所揭示之供體構築體。在一些實施例中,該組合物進一步包含RNA引導之DNA結合劑(例如,Cas9或編碼Cas9之多核苷酸(例如mRNA或DNA))。
在一些實施例中,LNP包含陽離子脂質。在一些實施例中,LNP包含(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯,亦稱作3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸酯)。在一些實施例中,LNPs包含約4.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯之莫耳比(N:P)。在一些實施例中,LNP包含8-((7,7-雙(辛氧基)庚基)(2-羥乙基)胺基)辛酸壬酯。在一些實施例中,LNPs包含約4.5-6.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯之莫耳比(N:P)。在一些實施例中,LNPs包含約4.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯之莫耳比(N:P)。在一些實施例中,LNPs包含約6.0之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯之莫耳比(N:P)。
在一些實施例中,與本文所揭示之gRNA締合之LNP用於製備供治療疾病或病症用之藥劑。
電穿孔為遞送負荷之熟知方式,且任何電穿孔方法可用於遞送本文所揭示之任一種gRNA。在一些實施例中,電穿孔可用於遞送本文所揭示之gRNA中之任一者及Cas9或編碼Cas9之多核苷酸(例如mRNA或DNA)。
在一些實施例中,本發明包含一種向離體細胞遞送本文所揭示之任一種gRNA的方法,其中gRNA與LNP締合或與LNP不締合。在一些實施例中,gRNA/LNP或gRNA亦與Cas9或編碼Cas9之多核苷酸(例如mRNA或DNA)締合。(參見例如PCT/US2021/029446,其以引用之方式併入本文中)
在一些實施例中,載體包含一或多個編碼mRNA之核苷酸序列,該mRNA編碼RNA引導之DNA核酸酶,其可為Cas核酸酶,諸如NmeCas9。在一些實施例中,載體包含編碼RNA引導之DNA核酸酶之mRNA,該核酸酶可為Cas蛋白,諸如Cas9。在一個實施例中,Cas9為NmeCas9。
在一些實施例中,組分可以裸核酸形式、以與諸如脂質體或泊洛沙姆(poloxamer)之藥劑複合之核酸形式引入,或可藉由病毒載體(例如腺病毒、AAV、疱疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒)來遞送。用於非病毒遞送核酸之方法及組合物包括電穿孔、脂質體轉染、顯微注射、基因槍、病毒顆粒、脂質體、免疫脂質體、LNP、聚陽離子或脂質:核酸結合物、裸核酸(例如裸DNA/RNA)、人工病毒粒子及經藥劑增強之DNA攝取。使用例如Sonitron 2000系統(Rich-Mar)進行之聲致穿孔亦可用於遞送核酸。
在一些實施例中,與本文所揭示之gRNA締合之LNP用於製備供治療疾病或病症用之藥劑。
***
本說明書及例示性實施例不應視為限制性的。出於本說明書及所附申請專利範圍之目的,除非另外說明,否則表示數量、百分比或比例的所有數字,及說明書及申請專利範圍中所用之其他數值均應理解為在所有情況下藉由術語「約」修飾至其尚未如此修飾的程度。
表 4A 序列表
表 4B :額外序列
SEQ ID No. | 描述 | 序列 |
600 | 由mRNA A編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MTGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRSGKRTADGSEFESPKKKRKVE |
601 | 由mRNA B編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MTGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRSGKRTADGSEFESPKKKRKVE |
602 | 由mRNA C編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MTGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRSGKRTADGSEFESPKKKRKVE |
603 | 由mRNA D編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MTGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRSGKRTADGSEFESPKKKRKVE |
604 | 由mRNA E編碼之SpyCas9鹼基編輯劑之胺基酸序列 | MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV |
605 | 由mRNA F編碼之Nme1Cas9之胺基酸序列 | MAAFKPNSINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRTRRLLKREGVLQAANFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVAGNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRSDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSPELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRIQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLGRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKERNLNDTRYVNRFLCQFVADRMRLTGKGKKRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGEVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTLEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGQGHMETVKSAKRLDEGVSVLRVPLTQLKLKDLEKMVNREREPKLYEALKARLEAHKDDPAKAFAEPFYKYDKAGNRTQQVKAVRVEQVQKTGVWVRNHNGIADNATMVRVDVFEKGDKYYLVPIYSWQVAKGILPDRAVVQGKDEEDWQLIDDSFNFKFSLHPNDLVEVITKKARMFGYFASCHRGTGNINIRIHDLDHKIGKNGILEGIGVKTALSFQKYQIDELGKEIRPCRLKKRPPVRSGKRTADGSEFESPKKKRKVE |
606 | 由mRNA G編碼之UGI之胺基酸序列 | MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSKRTADGSEFESPKKKRKVE |
607 | 由mRNA H編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKSGGGSPKKKRKVSGGSGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVR |
608 | 由mRNA I編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MVPKKKRKVAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRYPYDVPDYAAAPAAKKKKLD |
609 | 由mRNA J編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVR |
610 | 由mRNA K編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVR |
611 | 由mRNA L編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MDGSGGGSPKKKRKVGGSGGGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVR |
612 | 由mRNA M編碼之具有HiBiT標籤之Nme2Cas9的胺基酸序列 | MDGSGGGSPKKKRKVGGSGGGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRSESATPESVSGWRLFKKIS |
613 | 由mRNA N編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MDGSGGGSPKKKRKVGGSGGGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRSGKRTADGSGGGSPAAKKKKLD |
614 | 由mRNA O編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MDGSGGGSPKKKRKVEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVR |
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616 | 由mRNA Q編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MDGSGGGSEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVR |
617 | 由mRNA R編碼之Nme2Cas9鹼基編輯劑之胺基酸序列 | MDGSGGGSPKKKRKVEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGGEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESAAFKPNPINYILGLAIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRSGKRTADGSEFESPKKKRKVE |
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620 | 由mRNA U編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | MKLGSIEFIKVNKGSGSGSGAPESATESGGTSTESEGSAGTSTESEGSAGSAGSTSTEEGTSTESEGSAGTSTESEGSAGTSESATESGGTSTESEGSSSTGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRSGKRTADGSEFESPKKKRKVE |
621 | 編碼Nme2Cas9之mRNA B | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGACCGGUGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGCUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGGAAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGAGUUCGAGUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
622 | 編碼Nme2Cas9之mRNA C | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGACCGGUGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGCUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGGAAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGAGUUCGAGUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAA |
623 | 編碼Nme2Cas9之mRNA D | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGACCGGUGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGCUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGGAAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGAGUUCGAGUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG |
624 | 編碼SpyCas9鹼基編輯劑之mRNA E | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGAGGCCUCCCCCGCCUCCGGCCCCCGGCACCUGAUGGACCCCCACAUCUUCACCUCCAACUUCAACAACGGCAUCGGCCGGCACAAGACCUACCUGUGCUACGAGGUGGAGCGGCUGGACAACGGCACCUCCGUGAAGAUGGACCAGCACCGGGGCUUCCUGCACAACCAGGCCAAGAACCUGCUGUGCGGCUUCUACGGCCGGCACGCCGAGCUGCGGUUCCUGGACCUGGUGCCCUCCCUGCAGCUGGACCCCGCCCAGAUCUACCGGGUGACCUGGUUCAUCUCCUGGUCCCCCUGCUUCUCCUGGGGCUGCGCCGGCGAGGUGCGGGCCUUCCUGCAGGAGAACACCCACGUGCGGCUGCGGAUCUUCGCCGCCCGGAUCUACGACUACGACCCCCUGUACAAGGAGGCCCUGCAGAUGCUGCGGGACGCCGGCGCCCAGGUGUCCAUCAUGACCUACGACGAGUUCAAGCACUGCUGGGACACCUUCGUGGACCACCAGGGCUGCCCCUUCCAGCCCUGGGACGGCCUGGACGAGCACUCCCAGGCCCUGUCCGGCCGGCUGCGGGCCAUCCUGCAGAACCAGGGCAACUCCGGCUCCGAGACCCCCGGCACCUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGCCAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUGACUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG 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625 | 編碼UGI之mRNA G | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGACCAACCUGUCCGACAUCAUCGAGAAGGAGACCGGCAAGCAGCUGGUGAUCCAGGAGUCCAUCCUGAUGCUGCCCGAGGAGGUGGAGGAGGUGAUCGGCAACAAGCCCGAGUCCGACAUCCUGGUGCACACCGCCUACGACGAGUCCACCGACGAGAACGUGAUGCUGCUGACCUCCGACGCCCCCGAGUACAAGCCCUGGGCCCUGGUGAUCCAGGACUCCAACGGCGAGAACAAGAUCAAGAUGCUGUCCGGCGGCUCCAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGAGUUCGAGUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGUGAUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
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629 | 編碼Nme2Cas9之mRNA K | GGGaagctcagaataaacgctcaactttggccggatctgccacCatggccgccttcaagcccaaccccatcaactacatcctgggcctggacatcggcatcgcctccgtgggctgggccatggtggagatcgacgaggaggagaaccccatccggctgatcgacctgggcgtgcgggtgttcgagcgggccgaggtgcccaagaccggcgactccctggccatggcccggcggctggcccggtccgtgcggcggctgacccggcggcgggcccaccggctgctgcgggcccggcggctgctgaagcgggagggcgtgctgcaggccgccgacttcgacgagaacggcctgatcaagtccctgcccaacaccccctggcagctgcgggccgccgccctggaccggaagctgacccccctggagtggtccgccgtgctgctgcacctgatcaagcaccggggctacctgtcccagcggaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagctgggcgccctgctgaagggcgtggccaacaacgcccacgccctgcagaccggcgacttccggacccccgccgagctggccctgaacaagttcgagaaggagtccggccacatccggaaccagcggggcgactactcccacaccttctcccggaaggacctgcaggccgagctgatcctgctgttcgagaagcagaaggagttcggcaacccccacgtgtccggcggcctgaaggagggcatcgagaccctgctgatgacccagcggcccgccctgtccggcgacgccgtgcagaagatgctgggccactgcaccttcgagcccgccgagcccaaggccgccaagaacacctacaccgccgagcggttcatctggctgaccaagctgaacaacctgcggatcctggagcagggctccgagcggcccctgaccgacaccgagcgggccaccctgatggacgagccctaccggaagtccaagctgacctacgcccaggcccggaagctgctgggcctggaggacaccgccttcttcaagggcctgcggtacggcaaggacaacgccgaggcctccaccctgatggagatgaaggcctaccacgccatctcccgggccctggagaaggagggcctgaaggacaagaagtcccccctgaacctgtcctccgagctgcaggacgagatcggcaccgccttctccctgttcaagaccgacgaggacatcaccggccggctgaaggaccgggtgcagcccgagatcctggaggccctgctgaagcacatctccttcgacaagttcgtgcagatctccctgaaggccctgcggcggatcgtgcccctgatggagcagggcaagcggtacgacgaggcctgcgccgagatctacggcgaccactacggcaagaagaacaccgaggagaagatctacctgccccccatccccgccgacgagatccggaaccccgtggtgctgcgggccctgtcccaggcccggaaggtgatcaacggcgtggtgcggcggtacggctcccccgcccggatccacatcgagaccgcccgggaggtgggcaagtccttcaaggaccggaaggagatcgagaagcggcaggaggagaaccggaaggaccgggagaaggccgccgccaagttccgggagtacttccccaacttcgtgggcgagcccaagtccaaggacatcctgaagctgcggctgtacgagcagcagcacggcaagtgcctgtactccggcaaggagatcaacctggtgcggctgaacgagaagggctacgtggagatcgaccacgccctgcccttctcccggacctgggacgactccttcaacaacaaggtgctggtgctgggctccgagaaccagaacaagggcaaccagaccccctacgagtacttcaacggcaaggacaactcccgggagtggcaggagttcaaggcccgggtggagacctcccggttcccccggtccaagaagcagcggatcctgctgcagaagttcgacgaggacggcttcaaggagtgcaacctgaacgacacccggtacgtgaaccggttcctgtgccagttcgtggccgaccacatcctgctgaccggcaagggcaagcggcgggtgttcgcctccaacggccagatcaccaacctgctgcggggcttctggggcctgcggaaggtgcgggccgagaacgaccggcaccacgccctggacgccgtggtggtggcctgctccaccgtggccatgcagcagaagatcacccggttcgtgcggtacaaggagatgaacgccttcgacggcaagaccatcgacaaggagaccggcaaggtgctgcaccagaagacccacttcccccagccctgggagttcttcgcccaggaggtgatgatccgggtgttcggcaagcccgacggcaagcccgagttcgaggaggccgacacccccgagaagctgcggaccctgctggccgagaagctgtcctcccggcccgaggccgtgcacgagtacgtgacccccctgttcgtgtcccgggcccccaaccggaagatgtccggcgcccacaaggacaccctgcggtccgccaagcggttcgtgaagcacaacgagaagatctccgtgaagcgggtgtggctgaccgagatcaagctggccgacctggagaacatggtgaactacaagaacggccgggagatcgagctgtacgaggccctgaaggcccggctggaggcctacggcggcaacgccaagcaggccttcgaccccaaggacaaccccttctacaagaagggcggccagctggtgaaggccgtgcgggtggagaagacccaggagtccggcgtgctgctgaacaagaagaacgcctacaccatcgccgacaacggcgacatggtgcgggtggacgtgttctgcaaggtggacaagaagggcaagaaccagtacttcatcgtgcccatctacgcctggcaggtggccgagaacatcctgcccgacatcgactgcaagggctaccggatcgacgactcctacaccttctgcttctccctgcacaagtacgacctgatcgccttccagaaggacgagaagtccaaggtggagttcgcctactacatcaactgcgactcctccaacggccggttctacctggcctggcacgacaagggctccaaggagcagcagttccggatctccacccagaacctggtgctgatccagaagtaccaggtgaacgagctgggcaaggagatccggccctgccggctgaagaagcggccccccgtgcggTCCGGAAAGCGGACCGCCGACGGCTCCGGAGGAGGAAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGtagctagcaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacattctctcgagAAAAAAAAAAAATGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGTAAAAAAAAAAAATATAAAAAAAAAAAACATAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGTAAAAAAAAAAACTCAAAAAAAAAAAGATAAAAAAAAAAAACCTAAAAAAAAAAAATGTAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAATGCAAAAAAAAAAAATCGAAAAAAAAAAAATCTAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAATAGAAAAAAAAAAAGTTAAAAAAAAAAAACTGAAAAAAAAAAAATTTAAAAAAAAAAAAT |
630 | 編碼Nme2Cas9之mRNA L | GGGaagctcagaataaacgctcaactttggccggatctgccacCatgGACGGCTCCGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGGCGGCTCCGGCGGCGGCgccgccttcaagcccaaccccatcaactacatcctgggcctggacatcggcatcgcctccgtgggctgggccatggtggagatcgacgaggaggagaaccccatccggctgatcgacctgggcgtgcgggtgttcgagcgggccgaggtgcccaagaccggcgactccctggccatggcccggcggctggcccggtccgtgcggcggctgacccggcggcgggcccaccggctgctgcgggcccggcggctgctgaagcgggagggcgtgctgcaggccgccgacttcgacgagaacggcctgatcaagtccctgcccaacaccccctggcagctgcgggccgccgccctggaccggaagctgacccccctggagtggtccgccgtgctgctgcacctgatcaagcaccggggctacctgtcccagcggaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagctgggcgccctgctgaagggcgtggccaacaacgcccacgccctgcagaccggcgacttccggacccccgccgagctggccctgaacaagttcgagaaggagtccggccacatccggaaccagcggggcgactactcccacaccttctcccggaaggacctgcaggccgagctgatcctgctgttcgagaagcagaaggagttcggcaacccccacgtgtccggcggcctgaaggagggcatcgagaccctgctgatgacccagcggcccgccctgtccggcgacgccgtgcagaagatgctgggccactgcaccttcgagcccgccgagcccaaggccgccaagaacacctacaccgccgagcggttcatctggctgaccaagctgaacaacctgcggatcctggagcagggctccgagcggcccctgaccgacaccgagcgggccaccctgatggacgagccctaccggaagtccaagctgacctacgcccaggcccggaagctgctgggcctggaggacaccgccttcttcaagggcctgcggtacggcaaggacaacgccgaggcctccaccctgatggagatgaaggcctaccacgccatctcccgggccctggagaaggagggcctgaaggacaagaagtcccccctgaacctgtcctccgagctgcaggacgagatcggcaccgccttctccctgttcaagaccgacgaggacatcaccggccggctgaaggaccgggtgcagcccgagatcctggaggccctgctgaagcacatctccttcgacaagttcgtgcagatctccctgaaggccctgcggcggatcgtgcccctgatggagcagggcaagcggtacgacgaggcctgcgccgagatctacggcgaccactacggcaagaagaacaccgaggagaagatctacctgccccccatccccgccgacgagatccggaaccccgtggtgctgcgggccctgtcccaggcccggaaggtgatcaacggcgtggtgcggcggtacggctcccccgcccggatccacatcgagaccgcccgggaggtgggcaagtccttcaaggaccggaaggagatcgagaagcggcaggaggagaaccggaaggaccgggagaaggccgccgccaagttccgggagtacttccccaacttcgtgggcgagcccaagtccaaggacatcctgaagctgcggctgtacgagcagcagcacggcaagtgcctgtactccggcaaggagatcaacctggtgcggctgaacgagaagggctacgtggagatcgaccacgccctgcccttctcccggacctgggacgactccttcaacaacaaggtgctggtgctgggctccgagaaccagaacaagggcaaccagaccccctacgagtacttcaacggcaaggacaactcccgggagtggcaggagttcaaggcccgggtggagacctcccggttcccccggtccaagaagcagcggatcctgctgcagaagttcgacgaggacggcttcaaggagtgcaacctgaacgacacccggtacgtgaaccggttcctgtgccagttcgtggccgaccacatcctgctgaccggcaagggcaagcggcgggtgttcgcctccaacggccagatcaccaacctgctgcggggcttctggggcctgcggaaggtgcgggccgagaacgaccggcaccacgccctggacgccgtggtggtggcctgctccaccgtggccatgcagcagaagatcacccggttcgtgcggtacaaggagatgaacgccttcgacggcaagaccatcgacaaggagaccggcaaggtgctgcaccagaagacccacttcccccagccctgggagttcttcgcccaggaggtgatgatccgggtgttcggcaagcccgacggcaagcccgagttcgaggaggccgacacccccgagaagctgcggaccctgctggccgagaagctgtcctcccggcccgaggccgtgcacgagtacgtgacccccctgttcgtgtcccgggcccccaaccggaagatgtccggcgcccacaaggacaccctgcggtccgccaagcggttcgtgaagcacaacgagaagatctccgtgaagcgggtgtggctgaccgagatcaagctggccgacctggagaacatggtgaactacaagaacggccgggagatcgagctgtacgaggccctgaaggcccggctggaggcctacggcggcaacgccaagcaggccttcgaccccaaggacaaccccttctacaagaagggcggccagctggtgaaggccgtgcgggtggagaagacccaggagtccggcgtgctgctgaacaagaagaacgcctacaccatcgccgacaacggcgacatggtgcgggtggacgtgttctgcaaggtggacaagaagggcaagaaccagtacttcatcgtgcccatctacgcctggcaggtggccgagaacatcctgcccgacatcgactgcaagggctaccggatcgacgactcctacaccttctgcttctccctgcacaagtacgacctgatcgccttccagaaggacgagaagtccaaggtggagttcgcctactacatcaactgcgactcctccaacggccggttctacctggcctggcacgacaagggctccaaggagcagcagttccggatctccacccagaacctggtgctgatccagaagtaccaggtgaacgagctgggcaaggagatccggccctgccggctgaagaagcggccccccgtgcggtagctagcaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacattctctcgagAAAAAAAAAAAATGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGTAAAAAAAAAAAATATAAAAAAAAAAAACATAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGTAAAAAAAAAAAACTCAAAAAAAAAAAGATAAAAAAAAAAAACCTAAAAAAAAAAAATGTAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAATGCAAAAAAAAAAAATCGAAAAAAAAAAAATCTAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAATAGAAAAAAAAAAAGTTAAAAAAAAAAAACTGAAAAAAAAAAAATTTAAAAAAAAAAAAT |
631 | 編碼具有HiBiT標籤之Nme2Cas9的mRNA M | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
632 | 編碼Nme2Cas9之mRNA N | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGGAAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGGAGGAGGAAGCCCCGCCGCCAAGAAGAAGAAGCUGGACUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
633 | 編碼Nme2Cas9之mRNA O | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
634 | 編碼具有HiBiT標籤Nme2Cas9的mRNA P | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
635 | 編碼Nme2Cas9之mRNA Q | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
636 | 編碼Nme2Cas9鹼基編輯劑之mRNA R | GGGaagctcagaataaacgctcaactttggccggatctgccaccATGGACGGCTCCGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCTCCGGCGGCGGCGAGGCCTCCCCCGCCTCCGGCCCCCGGCACCTGATGGACCCCCACATCTTCACCTCCAACTTCAACAACGGCATCGGCCGGCACAAGACCTACCTGTGCTACGAGGTGGAGCGGCTGGACAACGGCACCTCCGTGAAGATGGACCAGCACCGGGGCTTCCTGCACAACCAGGCCAAGAACCTGCTGTGCGGCTTCTACGGCCGGCACGCCGAGCTGCGGTTCCTGGACCTGGTGCCCTCCCTGCAGCTGGACCCCGCCCAGATCTACCGGGTGACCTGGTTCATCTCCTGGTCCCCCTGCTTCTCCTGGGGCTGCGCCGGCGAGGTGCGGGCCTTCCTGCAGGAGAACACCCACGTGCGGCTGCGGATCTTCGCCGCCCGGATCTACGACTACGACCCCCTGTACAAGGAGGCCCTGCAGATGCTGCGGGACGCCGGCGCCCAGGTGTCCATCATGACCTACGACGAGTTCAAGCACTGCTGGGACACCTTCGTGGACCACCAGGGCTGCCCCTTCCAGCCCTGGGACGGCCTGGACGAGCACTCCCAGGCCCTGTCCGGCCGGCTGCGGGCCATCCTGCAGAACCAGGGCAACTCCGGCTCCGAGACCCCCGGCACCTCCGAGTCCGCCACCCCCGAGTCCGCAGCGTTCAAACCAAATcccatcaactacatcctgggcctggccatcggcatcgcctccgtgggctgggccatggtggagatcgacgaggaggagaaccccatccggctgatcgacctgggcgtgcgggtgttcgagcgggccgaggtgcccaagaccggcgactccctggccatggcccggcggctggcccggtccgtgcggcggctgacccggcggcgggcccaccggctgctgcgggcccggcggctgctgaagcgggagggcgtgctgcaggccgccgacttcgacgagaacggcctgatcaagtccctgcccaacaccccctggcagctgcgggccgccgccctggaccggaagctgacccccctggagtggtccgccgtgctgctgcacctgatcaagcaccggggctacctgtcccagcggaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagctgggcgccctgctgaagggcgtggccaacaacgcccacgccctgcagaccggcgacttccggacccccgccgagctggccctgaacaagttcgagaaggagtccggccacatccggaaccagcggggcgactactcccacaccttctcccggaaggacctgcaggccgagctgatcctgctgttcgagaagcagaaggagttcggcaacccccacgtgtccggcggcctgaaggagggcatcgagaccctgctgatgacccagcggcccgccctgtccggcgacgccgtgcagaagatgctgggccactgcaccttcgagcccgccgagcccaaggccgccaagaacacctacaccgccgagcggttcatctggctgaccaagctgaacaacctgcggatcctggagcagggctccgagcggcccctgaccgacaccgagcgggccaccctgatggacgagccctaccggaagtccaagctgacctacgcccaggcccggaagctgctgggcctggaggacaccgccttcttcaagggcctgcggtacggcaaggacaacgccgaggcctccaccctgatggagatgaaggcctaccacgccatctcccgggccctggagaaggagggcctgaaggacaagaagtcccccctgaacctgtcctccgagctgcaggacgagatcggcaccgccttctccctgttcaagaccgacgaggacatcaccggccggctgaaggaccgggtgcagcccgagatcctggaggccctgctgaagcacatctccttcgacaagttcgtgcagatctccctgaaggccctgcggcggatcgtgcccctgatggagcagggcaagcggtacgacgaggcctgcgccgagatctacggcgaccactacggcaagaagaacaccgaggagaagatctacctgccccccatccccgccgacgagatccggaaccccgtggtgctgcgggccctgtcccaggcccggaaggtgatcaacggcgtggtgcggcggtacggctcccccgcccggatccacatcgagaccgcccgggaggtgggcaagtccttcaaggaccggaaggagatcgagaagcggcaggaggagaaccggaaggaccgggagaaggccgccgccaagttccgggagtacttccccaacttcgtgggcgagcccaagtccaaggacatcctgaagctgcggctgtacgagcagcagcacggcaagtgcctgtactccggcaaggagatcaacctggtgcggctgaacgagaagggctacgtggagatcgaccacgccctgcccttctcccggacctgggacgactccttcaacaacaaggtgctggtgctgggctccgagaaccagaacaagggcaaccagaccccctacgagtacttcaacggcaaggacaactcccgggagtggcaggagttcaaggcccgggtggagacctcccggttcccccggtccaagaagcagcggatcctgctgcagaagttcgacgaggacggcttcaaggagtgcaacctgaacgacacccggtacgtgaaccgcttcctgtgccagttcgtggccgaccacatcctgctgaccggcaagggcaagcggcgggtgttcgcctccaacggccagatcaccaacctgctgcggggcttctggggcctgcggaaggtgcgggccgagaacgaccggcaccacgccctggacgccgtggtggtggcctgctccaccgtggccatgcagcagaagatcacccggttcgtgcggtacaaggagatgaacgccttcgacggcaagaccatcgacaaggagaccggcaaggtgctgcaccagaagacccacttcccccagccctgggagttcttcgcccaggaggtgatgatccgggtgttcggcaagcccgacggcaagcccgagttcgaggaggccgacacccccgagaagctgcggaccctgctggccgagaagctgtcctcccggcccgaggccgtgcacgagtacgtgacccccctgttcgtgtcccgggcccccaaccggaagatgtccggcgcccacaaggacaccctgcggtccgccaagcggttcgtgaagcacaacgagaagatctccgtgaagcgggtgtggctgaccgagatcaagctggccgacctggagaacatggtgaactacaagaacggccgggagatcgagctgtacgaggccctgaaggcccggctggaggcctacggcggcaacgccaagcaggccttcgaccccaaggacaaccccttctacaagaagggcggccagctggtgaaggccgtgcgggtggagaagacccaggagtccggcgtgctgctgaacaagaagaacgcctacaccatcgccgacaacggcgacatggtgcgggtggacgtgttctgcaaggtggacaagaagggcaagaaccagtacttcatcgtgcccatctacgcctggcaggtggccgagaacatcctgcccgacatcgactgcaagggctaccggatcgacgactcctacaccttctgcttctccctgcacaagtacgacctgatcgccttccagaaggacgagaagtccaaggtggagttcgcctactacatcaactgcgactcctccaacggccggttctacctggcctggcacgacaagggctccaaggagcagcagttccggatctccacccagaacctggtgctgatccagaagtaccaggtgaacgagctgggcaaggagatccggccctgccggctgaagaagcggccccccgtgcggtccggaaagcggaccgccgacggctccgagttcgagtcccccaagaagaagcggaaggtggagtagTGActagcaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacattctcTCGAGAAAAAAAAAAAATGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAGGTAAAAAAAAAAAATATAAAAAAAAAAACATAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGTAAAAAAAAAAAACTCAAAAAAAAAAAGATAAAAAAAAAAAACCTAAAAAAAAAAAATGTAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAATGCAAAAAAAAAAAATCGAAAAAAAAAAAATCTAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAATAGAAAAAAAAAAAGTTAAAAAAAAAAAACTGAAAAAAAAAAAATTTAAAAAAAAAAAAT |
637 | 編碼Nme2Cas9鹼基編輯劑之mRNA S | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGAGGCCUCCCCCGCCUCCGGCCCCCGGCACCUGAUGGACCCCCACAUCUUCACCUCCAACUUCAACAACGGCAUCGGCCGGCACAAGACCUACCUGUGCUACGAGGUGGAGCGGCUGGACAACGGCACCUCCGUGAAGAUGGACCAGCACCGGGGCUUCCUGCACAACCAGGCCAAGAACCUGCUGUGCGGCUUCUACGGCCGGCACGCCGAGCUGCGGUUCCUGGACCUGGUGCCCUCCCUGCAGCUGGACCCCGCCCAGAUCUACCGGGUGACCUGGUUCAUCUCCUGGUCCCCCUGCUUCUCCUGGGGCUGCGCCGGCGAGGUGCGGGCCUUCCUGCAGGAGAACACCCACGUGCGGCUGCGGAUCUUCGCCGCCCGGAUCUACGACUACGACCCCCUGUACAAGGAGGCCCUGCAGAUGCUGCGGGACGCCGGCGCCCAGGUGUCCAUCAUGACCUACGACGAGUUCAAGCACUGCUGGGACACCUUCGUGGACCACCAGGGCUGCCCCUUCCAGCCCUGGGACGGCCUGGACGAGCACUCCCAGGCCCUGUCCGGCCGGCUGCGGGCCAUCCUGCAGAACCAGGGCAACUCCGGCUCCGAGACCCCCGGCACCUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGCAGCGUUCAAACCAAAUCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGCCAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGCUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUAGUGACUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
638 | 編碼Nme2Cas9鹼基編輯劑之mRNA T | GGGaagctcagaataaacgctcaactttggccggatctgccaccATGGAGGCCTCCCCCGCCTCCGGCCCCCGGCACCTGATGGACCCCCACATCTTCACCTCCAACTTCAACAACGGCATCGGCCGGCACAAGACCTACCTGTGCTACGAGGTGGAGCGGCTGGACAACGGCACCTCCGTGAAGATGGACCAGCACCGGGGCTTCCTGCACAACCAGGCCAAGAACCTGCTGTGCGGCTTCTACGGCCGGCACGCCGAGCTGCGGTTCCTGGACCTGGTGCCCTCCCTGCAGCTGGACCCCGCCCAGATCTACCGGGTGACCTGGTTCATCTCCTGGTCCCCCTGCTTCTCCTGGGGCTGCGCCGGCGAGGTGCGGGCCTTCCTGCAGGAGAACACCCACGTGCGGCTGCGGATCTTCGCCGCCCGGATCTACGACTACGACCCCCTGTACAAGGAGGCCCTGCAGATGCTGCGGGACGCCGGCGCCCAGGTGTCCATCATGACCTACGACGAGTTCAAGCACTGCTGGGACACCTTCGTGGACCACCAGGGCTGCCCCTTCCAGCCCTGGGACGGCCTGGACGAGCACTCCCAGGCCCTGTCCGGCCGGCTGCGGGCCATCCTGCAGAACCAGGGCAACTCCGGCTCCGAGACCCCCGGCACCTCCGAGTCCGCCACCCCCGAGTCCGCAGCGTTCAAACCAAATcccatcaactacatcctgggcctggccatcggcatcgcctccgtgggctgggccatggtggagatcgacgaggaggagaaccccatccggctgatcgacctgggcgtgcgggtgttcgagcgggccgaggtgcccaagaccggcgactccctggccatggcccggcggctggcccggtccgtgcggcggctgacccggcggcgggcccaccggctgctgcgggcccggcggctgctgaagcgggagggcgtgctgcaggccgccgacttcgacgagaacggcctgatcaagtccctgcccaacaccccctggcagctgcgggccgccgccctggaccggaagctgacccccctggagtggtccgccgtgctgctgcacctgatcaagcaccggggctacctgtcccagcggaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagctgggcgccctgctgaagggcgtggccaacaacgcccacgccctgcagaccggcgacttccggacccccgccgagctggccctgaacaagttcgagaaggagtccggccacatccggaaccagcggggcgactactcccacaccttctcccggaaggacctgcaggccgagctgatcctgctgttcgagaagcagaaggagttcggcaacccccacgtgtccggcggcctgaaggagggcatcgagaccctgctgatgacccagcggcccgccctgtccggcgacgccgtgcagaagatgctgggccactgcaccttcgagcccgccgagcccaaggccgccaagaacacctacaccgccgagcggttcatctggctgaccaagctgaacaacctgcggatcctggagcagggctccgagcggcccctgaccgacaccgagcgggccaccctgatggacgagccctaccggaagtccaagctgacctacgcccaggcccggaagctgctgggcctggaggacaccgccttcttcaagggcctgcggtacggcaaggacaacgccgaggcctccaccctgatggagatgaaggcctaccacgccatctcccgggccctggagaaggagggcctgaaggacaagaagtcccccctgaacctgtcctccgagctgcaggacgagatcggcaccgccttctccctgttcaagaccgacgaggacatcaccggccggctgaaggaccgggtgcagcccgagatcctggaggccctgctgaagcacatctccttcgacaagttcgtgcagatctccctgaaggccctgcggcggatcgtgcccctgatggagcagggcaagcggtacgacgaggcctgcgccgagatctacggcgaccactacggcaagaagaacaccgaggagaagatctacctgccccccatccccgccgacgagatccggaaccccgtggtgctgcgggccctgtcccaggcccggaaggtgatcaacggcgtggtgcggcggtacggctcccccgcccggatccacatcgagaccgcccgggaggtgggcaagtccttcaaggaccggaaggagatcgagaagcggcaggaggagaaccggaaggaccgggagaaggccgccgccaagttccgggagtacttccccaacttcgtgggcgagcccaagtccaaggacatcctgaagctgcggctgtacgagcagcagcacggcaagtgcctgtactccggcaaggagatcaacctggtgcggctgaacgagaagggctacgtggagatcgaccacgccctgcccttctcccggacctgggacgactccttcaacaacaaggtgctggtgctgggctccgagaaccagaacaagggcaaccagaccccctacgagtacttcaacggcaaggacaactcccgggagtggcaggagttcaaggcccgggtggagacctcccggttcccccggtccaagaagcagcggatcctgctgcagaagttcgacgaggacggcttcaaggagtgcaacctgaacgacacccggtacgtgaaccgcttcctgtgccagttcgtggccgaccacatcctgctgaccggcaagggcaagcggcgggtgttcgcctccaacggccagatcaccaacctgctgcggggcttctggggcctgcggaaggtgcgggccgagaacgaccggcaccacgccctggacgccgtggtggtggcctgctccaccgtggccatgcagcagaagatcacccggttcgtgcggtacaaggagatgaacgccttcgacggcaagaccatcgacaaggagaccggcaaggtgctgcaccagaagacccacttcccccagccctgggagttcttcgcccaggaggtgatgatccgggtgttcggcaagcccgacggcaagcccgagttcgaggaggccgacacccccgagaagctgcggaccctgctggccgagaagctgtcctcccggcccgaggccgtgcacgagtacgtgacccccctgttcgtgtcccgggcccccaaccggaagatgtccggcgcccacaaggacaccctgcggtccgccaagcggttcgtgaagcacaacgagaagatctccgtgaagcgggtgtggctgaccgagatcaagctggccgacctggagaacatggtgaactacaagaacggccgggagatcgagctgtacgaggccctgaaggcccggctggaggcctacggcggcaacgccaagcaggccttcgaccccaaggacaaccccttctacaagaagggcggccagctggtgaaggccgtgcgggtggagaagacccaggagtccggcgtgctgctgaacaagaagaacgcctacaccatcgccgacaacggcgacatggtgcgggtggacgtgttctgcaaggtggacaagaagggcaagaaccagtacttcatcgtgcccatctacgcctggcaggtggccgagaacatcctgcccgacatcgactgcaagggctaccggatcgacgactcctacaccttctgcttctccctgcacaagtacgacctgatcgccttccagaaggacgagaagtccaaggtggagttcgcctactacatcaactgcgactcctccaacggccggttctacctggcctggcacgacaagggctccaaggagcagcagttccggatctccacccagaacctggtgctgatccagaagtaccaggtgaacgagctgggcaaggagatccggccctgccggctgaagaagcggccccccgtgcggtccggaaagcggaccgccgacggctccgagttcgagtcccccaagaagaagcggaaggtggagtagTGActagcaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacattctcTCGAGAAAAAAAAAAAATGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAGGTAAAAAAAAAAAATATAAAAAAAAAAACATAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGTAAAAAAAAAAAACTCAAAAAAAAAAAGATAAAAAAAAAAAACCTAAAAAAAAAAAATGTAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAATGCAAAAAAAAAAAATCGAAAAAAAAAAAATCTAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAATAGAAAAAAAAAAAGTTAAAAAAAAAAAACTGAAAAAAAAAAAATTTAAAAAAAAAAAAT |
639 | 編碼Nme2Cas9之mRNA U | GGGaagctcagaataaacgctcaactttggccggatctgccacCATGaagCTGggcTCCatcGAGttcATCaagGTGaacAAGggcTCCggcTCCggcTCCGGCgccCCCgagTCCgccACCgagTCCggcGGCaccTCCaccGAGtccGAGggcTCCgccGGCaccTCCaccGAGtccGAGggctccGCCggcTCCgccGGCtccaccTCCaccGAGgagGGCaccTCCaccGAGtccGAGggctccGCCggcACCtccACCgagtccgagGGCtccGCCggcACCtccGAGtccgccACCgagTCCggcGGCaccTCCaccGAGtccGAGggcTCCtccTCCaccggtgccgccttcaagcccaaccccatcaactacatcctgggcctggacatcggcatcgcctccgtgggctgggccatggtggagatcgacgaggaggagaaccccatccggctgatcgacctgggcgtgcgggtgttcgagcgggccgaggtgcccaagaccggcgactccctggccatggcccggcggctggcccggtccgtgcggcggctgacccggcggcgggcccaccggctgctgcgggcccggcggctgctgaagcgggagggcgtgctgcaggccgccgacttcgacgagaacggcctgatcaagtccctgcccaacaccccctggcagctgcgggccgccgccctggaccggaagctgacccccctggagtggtccgccgtgctgctgcacctgatcaagcaccggggctacctgtcccagcggaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagctgggcgccctgctgaagggcgtggccaacaacgcccacgccctgcagaccggcgacttccggacccccgccgagctggccctgaacaagttcgagaaggagtccggccacatccggaaccagcggggcgactactcccacaccttctcccggaaggacctgcaggccgagctgatcctgctgttcgagaagcagaaggagttcggcaacccccacgtgtccggcggcctgaaggagggcatcgagaccctgctgatgacccagcggcccgccctgtccggcgacgccgtgcagaagatgctgggccactgcaccttcgagcccgccgagcccaaggccgccaagaacacctacaccgccgagcggttcatctggctgaccaagctgaacaacctgcggatcctggagcagggctccgagcggcccctgaccgacaccgagcgggccaccctgatggacgagccctaccggaagtccaagctgacctacgcccaggcccggaagctgctgggcctggaggacaccgccttcttcaagggcctgcggtacggcaaggacaacgccgaggcctccaccctgatggagatgaaggcctaccacgccatctcccgggccctggagaaggagggcctgaaggacaagaagtcccccctgaacctgtcctccgagctgcaggacgagatcggcaccgccttctccctgttcaagaccgacgaggacatcaccggccggctgaaggaccgggtgcagcccgagatcctggaggccctgctgaagcacatctccttcgacaagttcgtgcagatctccctgaaggccctgcggcggatcgtgcccctgatggagcagggcaagcggtacgacgaggcctgcgccgagatctacggcgaccactacggcaagaagaacaccgaggagaagatctacctgccccccatccccgccgacgagatccggaaccccgtggtgctgcgggccctgtcccaggcccggaaggtgatcaacggcgtggtgcggcggtacggctcccccgcccggatccacatcgagaccgcccgggaggtgggcaagtccttcaaggaccggaaggagatcgagaagcggcaggaggagaaccggaaggaccgggagaaggccgccgccaagttccgggagtacttccccaacttcgtgggcgagcccaagtccaaggacatcctgaagctgcggctgtacgagcagcagcacggcaagtgcctgtactccggcaaggagatcaacctggtgcggctgaacgagaagggctacgtggagatcgaccacgccctgcccttctcccggacctgggacgactccttcaacaacaaggtgctggtgctgggctccgagaaccagaacaagggcaaccagaccccctacgagtacttcaacggcaaggacaactcccgggagtggcaggagttcaaggcccgggtggagacctcccggttcccccggtccaagaagcagcggatcctgctgcagaagttcgacgaggacggcttcaaggagtgcaacctgaacgacacccggtacgtgaaccgcttcctgtgccagttcgtggccgaccacatcctgctgaccggcaagggcaagcggcgggtgttcgcctccaacggccagatcaccaacctgctgcggggcttctggggcctgcggaaggtgcgggccgagaacgaccggcaccacgccctggacgccgtggtggtggcctgctccaccgtggccatgcagcagaagatcacccggttcgtgcggtacaaggagatgaacgccttcgacggcaagaccatcgacaaggagaccggcaaggtgctgcaccagaagacccacttcccccagccctgggagttcttcgcccaggaggtgatgatccgggtgttcggcaagcccgacggcaagcccgagttcgaggaggccgacacccccgagaagctgcggaccctgctggccgagaagctgtcctcccggcccgaggccgtgcacgagtacgtgacccccctgttcgtgtcccgggcccccaaccggaagatgtccggcgcccacaaggacaccctgcggtccgccaagcggttcgtgaagcacaacgagaagatctccgtgaagcgggtgtggctgaccgagatcaagctggccgacctggagaacatggtgaactacaagaacggccgggagatcgagctgtacgaggccctgaaggcccggctggaggcctacggcggcaacgccaagcaggccttcgaccccaaggacaaccccttctacaagaagggcggccagctggtgaaggccgtgcgggtggagaagacccaggagtccggcgtgctgctgaacaagaagaacgcctacaccatcgccgacaacggcgacatggtgcgggtggacgtgttctgcaaggtggacaagaagggcaagaaccagtacttcatcgtgcccatctacgcctggcaggtggccgagaacatcctgcccgacatcgactgcaagggctaccggatcgacgactcctacaccttctgcttctccctgcacaagtacgacctgatcgccttccagaaggacgagaagtccaaggtggagttcgcctactacatcaactgcgactcctccaacggccggttctacctggcctggcacgacaagggctccaaggagcagcagttccggatctccacccagaacctggtgctgatccagaagtaccaggtgaacgagctgggcaaggagatccggccctgccggctgaagaagcggccccccgtgcggtccggaaagcggaccgccgacggctccgagttcgagtcccccaagaagaagcggaaggtggagtgactagcaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacattctcTCGAGAAAAAAAAAAAATGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGTAAAAAAAAAAAATATAAAAAAAAAAAACATAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGTAAAAAAAAAAAACTCAAAAAAAAAAAAGATAAAAAAAAAAAACCTAAAAAAAAAAAATGTAAAAAAAAAAAAGGGAAA |
640 | 由mRNA A編碼之Nme2Cas9之開放閱讀框架 | atgaccggtgccgccttcaagcccaaccccatcaactacatcctgggcctggacatcggcatcgcctccgtgggctgggccatggtggagatcgacgaggaggagaaccccatccggctgatcgacctgggcgtgcgggtgttcgagcgggccgaggtgcccaagaccggcgactccctggccatggcccggcggctggcccggtccgtgcggcggctgacccggcggcgggcccaccggctgctgcgggcccggcggctgctgaagcgggagggcgtgctgcaggccgccgacttcgacgagaacggcctgatcaagtccctgcccaacaccccctggcagctgcgggccgccgccctggaccggaagctgacccccctggagtggtccgccgtgctgctgcacctgatcaagcaccggggctacctgtcccagcggaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagctgggcgccctgctgaagggcgtggccaacaacgcccacgccctgcagaccggcgacttccggacccccgccgagctggccctgaacaagttcgagaaggagtccggccacatccggaaccagcggggcgactactcccacaccttctcccggaaggacctgcaggccgagctgatcctgctgttcgagaagcagaaggagttcggcaacccccacgtgtccggcggcctgaaggagggcatcgagaccctgctgatgacccagcggcccgccctgtccggcgacgccgtgcagaagatgctgggccactgcaccttcgagcccgccgagcccaaggccgccaagaacacctacaccgccgagcggttcatctggctgaccaagctgaacaacctgcggatcctggagcagggctccgagcggcccctgaccgacaccgagcgggccaccctgatggacgagccctaccggaagtccaagctgacctacgcccaggcccggaagctgctgggcctggaggacaccgccttcttcaagggcctgcggtacggcaaggacaacgccgaggcctccaccctgatggagatgaaggcctaccacgccatctcccgggccctggagaaggagggcctgaaggacaagaagtcccccctgaacctgtcctccgagctgcaggacgagatcggcaccgccttctccctgttcaagaccgacgaggacatcaccggccggctgaaggaccgggtgcagcccgagatcctggaggccctgctgaagcacatctccttcgacaagttcgtgcagatctccctgaaggccctgcggcggatcgtgcccctgatggagcagggcaagcggtacgacgaggcctgcgccgagatctacggcgaccactacggcaagaagaacaccgaggagaagatctacctgccccccatccccgccgacgagatccggaaccccgtggtgctgcgggccctgtcccaggcccggaaggtgatcaacggcgtggtgcggcggtacggctcccccgcccggatccacatcgagaccgcccgggaggtgggcaagtccttcaaggaccggaaggagatcgagaagcggcaggaggagaaccggaaggaccgggagaaggccgccgccaagttccgggagtacttccccaacttcgtgggcgagcccaagtccaaggacatcctgaagctgcggctgtacgagcagcagcacggcaagtgcctgtactccggcaaggagatcaacctggtgcggctgaacgagaagggctacgtggagatcgaccacgccctgcccttctcccggacctgggacgactccttcaacaacaaggtgctggtgctgggctccgagaaccagaacaagggcaaccagaccccctacgagtacttcaacggcaaggacaactcccgggagtggcaggagttcaaggcccgggtggagacctcccggttcccccggtccaagaagcagcggatcctgctgcagaagttcgacgaggacggcttcaaggagtgcaacctgaacgacacccggtacgtgaaccgcttcctgtgccagttcgtggccgaccacatcctgctgaccggcaagggcaagcggcgggtgttcgcctccaacggccagatcaccaacctgctgcggggcttctggggcctgcggaaggtgcgggccgagaacgaccggcaccacgccctggacgccgtggtggtggcctgctccaccgtggccatgcagcagaagatcacccggttcgtgcggtacaaggagatgaacgccttcgacggcaagaccatcgacaaggagaccggcaaggtgctgcaccagaagacccacttcccccagccctgggagttcttcgcccaggaggtgatgatccgggtgttcggcaagcccgacggcaagcccgagttcgaggaggccgacacccccgagaagctgcggaccctgctggccgagaagctgtcctcccggcccgaggccgtgcacgagtacgtgacccccctgttcgtgtcccgggcccccaaccggaagatgtccggcgcccacaaggacaccctgcggtccgccaagcggttcgtgaagcacaacgagaagatctccgtgaagcgggtgtggctgaccgagatcaagctggccgacctggagaacatggtgaactacaagaacggccgggagatcgagctgtacgaggccctgaaggcccggctggaggcctacggcggcaacgccaagcaggccttcgaccccaaggacaaccccttctacaagaagggcggccagctggtgaaggccgtgcgggtggagaagacccaggagtccggcgtgctgctgaacaagaagaacgcctacaccatcgccgacaacggcgacatggtgcgggtggacgtgttctgcaaggtggacaagaagggcaagaaccagtacttcatcgtgcccatctacgcctggcaggtggccgagaacatcctgcccgacatcgactgcaagggctaccggatcgacgactcctacaccttctgcttctccctgcacaagtacgacctgatcgccttccagaaggacgagaagtccaaggtggagttcgcctactacatcaactgcgactcctccaacggccggttctacctggcctggcacgacaagggctccaaggagcagcagttccggatctccacccagaacctggtgctgatccagaagtaccaggtgaacgagctgggcaaggagatccggccctgccggctgaagaagcggccccccgtgcggtccggaaagcggaccgccgacggctccgagttcgagtcccccaagaagaagcggaaggtggagtag |
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642 | 由mRNA C編碼之Nme2Cas9之開放閱讀框架 | atgaccggtgccgccttcaagcccaaccccatcaactacatcctgggcctggacatcggcatcgcctccgtgggctgggccatggtggagatcgacgaggaggagaaccccatccggctgatcgacctgggcgtgcgggtgttcgagcgggccgaggtgcccaagaccggcgactccctggccatggcccggcggctggcccggtccgtgcggcggctgacccggcggcgggcccaccggctgctgcgggcccggcggctgctgaagcgggagggcgtgctgcaggccgccgacttcgacgagaacggcctgatcaagtccctgcccaacaccccctggcagctgcgggccgccgccctggaccggaagctgacccccctggagtggtccgccgtgctgctgcacctgatcaagcaccggggctacctgtcccagcggaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagctgggcgccctgctgaagggcgtggccaacaacgcccacgccctgcagaccggcgacttccggacccccgccgagctggccctgaacaagttcgagaaggagtccggccacatccggaaccagcggggcgactactcccacaccttctcccggaaggacctgcaggccgagctgatcctgctgttcgagaagcagaaggagttcggcaacccccacgtgtccggcggcctgaaggagggcatcgagaccctgctgatgacccagcggcccgccctgtccggcgacgccgtgcagaagatgctgggccactgcaccttcgagcccgccgagcccaaggccgccaagaacacctacaccgccgagcggttcatctggctgaccaagctgaacaacctgcggatcctggagcagggctccgagcggcccctgaccgacaccgagcgggccaccctgatggacgagccctaccggaagtccaagctgacctacgcccaggcccggaagctgctgggcctggaggacaccgccttcttcaagggcctgcggtacggcaaggacaacgccgaggcctccaccctgatggagatgaaggcctaccacgccatctcccgggccctggagaaggagggcctgaaggacaagaagtcccccctgaacctgtcctccgagctgcaggacgagatcggcaccgccttctccctgttcaagaccgacgaggacatcaccggccggctgaaggaccgggtgcagcccgagatcctggaggccctgctgaagcacatctccttcgacaagttcgtgcagatctccctgaaggccctgcggcggatcgtgcccctgatggagcagggcaagcggtacgacgaggcctgcgccgagatctacggcgaccactacggcaagaagaacaccgaggagaagatctacctgccccccatccccgccgacgagatccggaaccccgtggtgctgcgggccctgtcccaggcccggaaggtgatcaacggcgtggtgcggcggtacggctcccccgcccggatccacatcgagaccgcccgggaggtgggcaagtccttcaaggaccggaaggagatcgagaagcggcaggaggagaaccggaaggaccgggagaaggccgccgccaagttccgggagtacttccccaacttcgtgggcgagcccaagtccaaggacatcctgaagctgcggctgtacgagcagcagcacggcaagtgcctgtactccggcaaggagatcaacctggtgcggctgaacgagaagggctacgtggagatcgaccacgccctgcccttctcccggacctgggacgactccttcaacaacaaggtgctggtgctgggctccgagaaccagaacaagggcaaccagaccccctacgagtacttcaacggcaaggacaactcccgggagtggcaggagttcaaggcccgggtggagacctcccggttcccccggtccaagaagcagcggatcctgctgcagaagttcgacgaggacggcttcaaggagtgcaacctgaacgacacccggtacgtgaaccgcttcctgtgccagttcgtggccgaccacatcctgctgaccggcaagggcaagcggcgggtgttcgcctccaacggccagatcaccaacctgctgcggggcttctggggcctgcggaaggtgcgggccgagaacgaccggcaccacgccctggacgccgtggtggtggcctgctccaccgtggccatgcagcagaagatcacccggttcgtgcggtacaaggagatgaacgccttcgacggcaagaccatcgacaaggagaccggcaaggtgctgcaccagaagacccacttcccccagccctgggagttcttcgcccaggaggtgatgatccgggtgttcggcaagcccgacggcaagcccgagttcgaggaggccgacacccccgagaagctgcggaccctgctggccgagaagctgtcctcccggcccgaggccgtgcacgagtacgtgacccccctgttcgtgtcccgggcccccaaccggaagatgtccggcgcccacaaggacaccctgcggtccgccaagcggttcgtgaagcacaacgagaagatctccgtgaagcgggtgtggctgaccgagatcaagctggccgacctggagaacatggtgaactacaagaacggccgggagatcgagctgtacgaggccctgaaggcccggctggaggcctacggcggcaacgccaagcaggccttcgaccccaaggacaaccccttctacaagaagggcggccagctggtgaaggccgtgcgggtggagaagacccaggagtccggcgtgctgctgaacaagaagaacgcctacaccatcgccgacaacggcgacatggtgcgggtggacgtgttctgcaaggtggacaagaagggcaagaaccagtacttcatcgtgcccatctacgcctggcaggtggccgagaacatcctgcccgacatcgactgcaagggctaccggatcgacgactcctacaccttctgcttctccctgcacaagtacgacctgatcgccttccagaaggacgagaagtccaaggtggagttcgcctactacatcaactgcgactcctccaacggccggttctacctggcctggcacgacaagggctccaaggagcagcagttccggatctccacccagaacctggtgctgatccagaagtaccaggtgaacgagctgggcaaggagatccggccctgccggctgaagaagcggccccccgtgcggtccggaaagcggaccgccgacggctccgagttcgagtcccccaagaagaagcggaaggtggagtag |
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644 | 由mRNA E編碼之SpyCas9鹼基編輯劑之開放閱讀框架 | ATGgaggcctcccccgcctccggcccccggcacctgatggacccccacatcttcacctccAACTTCAACAACggcATCggccggCACAAGaccTACCTGTGCTACgaggtggagcggCTGGACAACggcacctccgtgAAGATGGACCAGCACcggggcTTCCTGCACAACCAGgccAAGAACCTGCTGTGCggcTTCTACggccggCACgccgagCTGcggTTCCTGGACCTGgtgccctccCTGCAGCTGGACcccgccCAGATCTACcgggtgaccTGGTTCATCtccTGGtcccccTGCTTCtccTGGggcTGCgccggcgaggtgcgggccTTCCTGCAGgagAACaccCACgtgcggCTGcggATCTTCgccgcccggATCTACGACTACGACcccCTGTACAAGgaggccCTGCAGATGCTGcggGACgccggcgccCAGgtgtccATCATGaccTACGACgagTTCAAGCACTGCTGGGACaccTTCgtgGACCACCAGggcTGCcccTTCCAGcccTGGGACggcCTGGACgagCACtccCAGgccCTGtccggccggCTGcgggccATCCTGCAGAACCAGggcAACtccggctccgagacccccggcacctccgagtccgccacccccgagtccgacaagaagtactccatcggcctggCcatcggcaccaactccgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgccctccaagaagttcaaggtgctgggcaacaccgaccggcactccatcaagaagaacctgatcggcgccctgctgttcgactccggcgagaccgccgaggccacccggctgaagcggaccgcccggcggcggtacacccggcggaagaaccggatctgctacctgcaggagatcttctccaacgagatggccaaggtggacgactccttcttccaccggctggaggagtccttcctggtggaggaggacaagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgcggaagaagctggtggactccaccgacaaggccgacctgcggctgatctacctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaactccgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggagaaccccatcaacgcctccggcgtggacgccaaggccatcctgtccgcccggctgtccaagtcccggcggctggagaacctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaacggcctgttcggcaacctgatcgccctgtccctgggcctgacccccaacttcaagtccaacttcgacctggccgaggacgccaagctgcagctgtccaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgttcctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgtccgacatcctgcgggtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgtccgcctccatgatcaagcggtacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaggccctggtgcggcagcagctgcccgagaagtacaaggagatcttcttcgaccagtccaagaacggctacgccggctacatcgacggcggcgcctcccaggaggagttctacaagttcatcaagcccatcctggagaagatggacggcaccgaggagctgctggtgaagctgaaccgggaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggctccatcccccaccagatccacctgggcgagctgcacgccatcctgcggcggcaggaggacttctaccccttcctgaaggacaaccgggagaagatcgagaagatcctgaccttccggatcccctactacgtgggccccctggcccggggcaactcccggttcgcctggatgacccggaagtccgaggagaccatcaccccctggaacttcgaggaggtggtggacaagggcgcctccgcccagtccttcatcgagcggatgaccaacttcgacaagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcactccctgctgtacgagtacttcaccgtgtacaacgagctgaccaaggtgaagtacgtgaccgagggcatgcggaagcccgccttcctgtccggcgagcagaagaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaggtgaccgtgaagcagctgaaggaggactacttcaagaagatcgagtgcttcgactccgtggagatctccggcgtggaggaccggttcaacgcctccctgggcacctaccacgacctgctgaagatcatcaaggacaaggacttcctggacaacgaggagaacgaggacatcctggaggacatcgtgctgaccctgaccctgttcgaggaccgggagatgatcgaggagcggctgaagacctacgcccacctgttcgacgacaaggtgatgaagcagctgaagcggcggcggtacaccggctggggccggctgtcccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagaccatcctggacttcctgaagtccgacggcttcgccaaccggaacttcatgcagctgatccacgacgactccctgaccttcaaggaggacatccagaaggcccaggtgtccggccagggcgactccctgcacgagcacatcgccaacctggccggctcccccgccatcaagaagggcatcctgcagaccgtgaaggtggtggacgagctggtgaaggtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgagatggcccgggagaaccagaccacccagaagggccagaagaactcccgggagcggatgaagcggatcgaggagggcatcaaggagctgggctcccagatcctgaaggagcaccccgtggagaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaacggccgggacatgtacgtggaccaggagctggacatcaaccggctgtccgactacgacgtggaccacatcgtgccccagtccttcctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgacccggtccgacaagaaccggggcaagtccgacaacgtgccctccgaggaggtggtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgatcacccagcggaagttcgacaacctgaccaaggccgagcggggcggcctgtccgagctggacaaggccggcttcatcaagcggcagctggtggagacccggcagatcaccaagcacgtggcccagatcctggactcccggatgaacaccaagtacgacgagaacgacaagctgatccgggaggtgaaggtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgacttccggaaggacttccagttctacaaggtgcgggagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtggtgggcaccgccctgatcaagaagtaccccaagctggagtccgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagtccgagcaggagatcggcaaggccaccgccaagtacttcttctactccaacatcatgaacttcttcaagaccgagatcaccctggccaacggcgagatccggaagcggcccctgatcgagaccaacggcgagaccggcgagatcgtgtgggacaagggccgggacttcgccaccgtgcggaaggtgctgtccatgccccaggtgaacatcgtgaagaagaccgaggtgcagaccggcggcttctccaaggagtccatcctgcccaagcggaactccgacaagctgatcgcccggaagaaggactgggaccccaagaagtacggcggcttcgactcccccaccgtggcctactccgtgctggtggtggccaaggtggagaagggcaagtccaagaagctgaagtccgtgaaggagctgctgggcatcaccatcatggagcggtcctccttcgagaagaaccccatcgacttcctggaggccaagggctacaaggaggtgaagaaggacctgatcatcaagctgcccaagtactccctgttcgagctggagaacggccggaagcggatgctggcctccgccggcgagctgcagaagggcaacgagctggccctgccctccaagtacgtgaacttcctgtacctggcctcccactacgagaagctgaagggctcccccgaggacaacgagcagaagcagctgttcgtggagcagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatctccgagttctccaagcgggtgatcctggccgacgccaacctggacaaggtgctgtccgcctacaacaagcaccgggacaagcccatccgggagcaggccgagaacatcatccacctgttcaccctgaccaacctgggcgcccccgccgccttcaagtacttcgacaccaccatcgaccggaagcggtacacctccaccaaggaggtgctggacgccaccctgatccaccagtccatcaccggcctgtacgagacccggatcgacctgtcccagctgggcggcgacggcggcggctcccccaagaagaagcggaaggtgTgA |
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659 | 由mRNA S編碼之Nme2Cas9鹼基編輯劑之開放閱讀框架 | ATGGAGGCCTCCCCCGCCTCCGGCCCCCGGCACCTGATGGACCCCCACATCTTCACCTCCAACTTCAACAACGGCATCGGCCGGCACAAGACCTACCTGTGCTACGAGGTGGAGCGGCTGGACAACGGCACCTCCGTGAAGATGGACCAGCACCGGGGCTTCCTGCACAACCAGGCCAAGAACCTGCTGTGCGGCTTCTACGGCCGGCACGCCGAGCTGCGGTTCCTGGACCTGGTGCCCTCCCTGCAGCTGGACCCCGCCCAGATCTACCGGGTGACCTGGTTCATCTCCTGGTCCCCCTGCTTCTCCTGGGGCTGCGCCGGCGAGGTGCGGGCCTTCCTGCAGGAGAACACCCACGTGCGGCTGCGGATCTTCGCCGCCCGGATCTACGACTACGACCCCCTGTACAAGGAGGCCCTGCAGATGCTGCGGGACGCCGGCGCCCAGGTGTCCATCATGACCTACGACGAGTTCAAGCACTGCTGGGACACCTTCGTGGACCACCAGGGCTGCCCCTTCCAGCCCTGGGACGGCCTGGACGAGCACTCCCAGGCCCTGTCCGGCCGGCTGCGGGCCATCCTGCAGAACCAGGGCAACTCCGGCTCCGAGACCCCCGGCACCTCCGAGTCCGCCACCCCCGAGTCCGCAGCGTTCAAACCAAATcccatcaactacatcctgggcctggccatcggcatcgcctccgtgggctgggccatggtggagatcgacgaggaggagaaccccatccggctgatcgacctgggcgtgcgggtgttcgagcgggccgaggtgcccaagaccggcgactccctggccatggcccggcggctggcccggtccgtgcggcggctgacccggcggcgggcccaccggctgctgcgggcccggcggctgctgaagcgggagggcgtgctgcaggccgccgacttcgacgagaacggcctgatcaagtccctgcccaacaccccctggcagctgcgggccgccgccctggaccggaagctgacccccctggagtggtccgccgtgctgctgcacctgatcaagcaccggggctacctgtcccagcggaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagctgggcgccctgctgaagggcgtggccaacaacgcccacgccctgcagaccggcgacttccggacccccgccgagctggccctgaacaagttcgagaaggagtccggccacatccggaaccagcggggcgactactcccacaccttctcccggaaggacctgcaggccgagctgatcctgctgttcgagaagcagaaggagttcggcaacccccacgtgtccggcggcctgaaggagggcatcgagaccctgctgatgacccagcggcccgccctgtccggcgacgccgtgcagaagatgctgggccactgcaccttcgagcccgccgagcccaaggccgccaagaacacctacaccgccgagcggttcatctggctgaccaagctgaacaacctgcggatcctggagcagggctccgagcggcccctgaccgacaccgagcgggccaccctgatggacgagccctaccggaagtccaagctgacctacgcccaggcccggaagctgctgggcctggaggacaccgccttcttcaagggcctgcggtacggcaaggacaacgccgaggcctccaccctgatggagatgaaggcctaccacgccatctcccgggccctggagaaggagggcctgaaggacaagaagtcccccctgaacctgtcctccgagctgcaggacgagatcggcaccgccttctccctgttcaagaccgacgaggacatcaccggccggctgaaggaccgggtgcagcccgagatcctggaggccctgctgaagcacatctccttcgacaagttcgtgcagatctccctgaaggccctgcggcggatcgtgcccctgatggagcagggcaagcggtacgacgaggcctgcgccgagatctacggcgaccactacggcaagaagaacaccgaggagaagatctacctgccccccatccccgccgacgagatccggaaccccgtggtgctgcgggccctgtcccaggcccggaaggtgatcaacggcgtggtgcggcggtacggctcccccgcccggatccacatcgagaccgcccgggaggtgggcaagtccttcaaggaccggaaggagatcgagaagcggcaggaggagaaccggaaggaccgggagaaggccgccgccaagttccgggagtacttccccaacttcgtgggcgagcccaagtccaaggacatcctgaagctgcggctgtacgagcagcagcacggcaagtgcctgtactccggcaaggagatcaacctggtgcggctgaacgagaagggctacgtggagatcgaccacgccctgcccttctcccggacctgggacgactccttcaacaacaaggtgctggtgctgggctccgagaaccagaacaagggcaaccagaccccctacgagtacttcaacggcaaggacaactcccgggagtggcaggagttcaaggcccgggtggagacctcccggttcccccggtccaagaagcagcggatcctgctgcagaagttcgacgaggacggcttcaaggagtgcaacctgaacgacacccggtacgtgaaccgcttcctgtgccagttcgtggccgaccacatcctgctgaccggcaagggcaagcggcgggtgttcgcctccaacggccagatcaccaacctgctgcggggcttctggggcctgcggaaggtgcgggccgagaacgaccggcaccacgccctggacgccgtggtggtggcctgctccaccgtggccatgcagcagaagatcacccggttcgtgcggtacaaggagatgaacgccttcgacggcaagaccatcgacaaggagaccggcaaggtgctgcaccagaagacccacttcccccagccctgggagttcttcgcccaggaggtgatgatccgggtgttcggcaagcccgacggcaagcccgagttcgaggaggccgacacccccgagaagctgcggaccctgctggccgagaagctgtcctcccggcccgaggccgtgcacgagtacgtgacccccctgttcgtgtcccgggcccccaaccggaagatgtccggcgcccacaaggacaccctgcggtccgccaagcggttcgtgaagcacaacgagaagatctccgtgaagcgggtgtggctgaccgagatcaagctggccgacctggagaacatggtgaactacaagaacggccgggagatcgagctgtacgaggccctgaaggcccggctggaggcctacggcggcaacgccaagcaggccttcgaccccaaggacaaccccttctacaagaagggcggccagctggtgaaggccgtgcgggtggagaagacccaggagtccggcgtgctgctgaacaagaagaacgcctacaccatcgccgacaacggcgacatggtgcgggtggacgtgttctgcaaggtggacaagaagggcaagaaccagtacttcatcgtgcccatctacgcctggcaggtggccgagaacatcctgcccgacatcgactgcaagggctaccggatcgacgactcctacaccttctgcttctccctgcacaagtacgacctgatcgccttccagaaggacgagaagtccaaggtggagttcgcctactacatcaactgcgactcctccaacggccggttctacctggcctggcacgacaagggctccaaggagcagcagttccggatctccacccagaacctggtgctgatccagaagtaccaggtgaacgagctgggcaaggagatccggccctgccggctgaagaagcggccccccgtgcggtccggaaagcggaccgccgacggctccgagttcgagtcccccaagaagaagcggaaggtggagtag |
660 | 由mRNA U編碼之Nme2Cas9之開放閱讀框架 | ATGaagCTGggcTCCatcGAGttcATCaagGTGaacAAGggcTCCggcTCCggcTCCGGCgccCCCgagTCCgccACCgagTCCggcGGCaccTCCaccGAGtccGAGggcTCCgccGGCaccTCCaccGAGtccGAGggctccGCCggcTCCgccGGCtccaccTCCaccGAGgagGGCaccTCCaccGAGtccGAGggctccGCCggcACCtccACCgagtccgagGGCtccGCCggcACCtccGAGtccgccACCgagTCCggcGGCaccTCCaccGAGtccGAGggcTCCtccTCCaccggtgccgccttcaagcccaaccccatcaactacatcctgggcctggacatcggcatcgcctccgtgggctgggccatggtggagatcgacgaggaggagaaccccatccggctgatcgacctgggcgtgcgggtgttcgagcgggccgaggtgcccaagaccggcgactccctggccatggcccggcggctggcccggtccgtgcggcggctgacccggcggcgggcccaccggctgctgcgggcccggcggctgctgaagcgggagggcgtgctgcaggccgccgacttcgacgagaacggcctgatcaagtccctgcccaacaccccctggcagctgcgggccgccgccctggaccggaagctgacccccctggagtggtccgccgtgctgctgcacctgatcaagcaccggggctacctgtcccagcggaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagctgggcgccctgctgaagggcgtggccaacaacgcccacgccctgcagaccggcgacttccggacccccgccgagctggccctgaacaagttcgagaaggagtccggccacatccggaaccagcggggcgactactcccacaccttctcccggaaggacctgcaggccgagctgatcctgctgttcgagaagcagaaggagttcggcaacccccacgtgtccggcggcctgaaggagggcatcgagaccctgctgatgacccagcggcccgccctgtccggcgacgccgtgcagaagatgctgggccactgcaccttcgagcccgccgagcccaaggccgccaagaacacctacaccgccgagcggttcatctggctgaccaagctgaacaacctgcggatcctggagcagggctccgagcggcccctgaccgacaccgagcgggccaccctgatggacgagccctaccggaagtccaagctgacctacgcccaggcccggaagctgctgggcctggaggacaccgccttcttcaagggcctgcggtacggcaaggacaacgccgaggcctccaccctgatggagatgaaggcctaccacgccatctcccgggccctggagaaggagggcctgaaggacaagaagtcccccctgaacctgtcctccgagctgcaggacgagatcggcaccgccttctccctgttcaagaccgacgaggacatcaccggccggctgaaggaccgggtgcagcccgagatcctggaggccctgctgaagcacatctccttcgacaagttcgtgcagatctccctgaaggccctgcggcggatcgtgcccctgatggagcagggcaagcggtacgacgaggcctgcgccgagatctacggcgaccactacggcaagaagaacaccgaggagaagatctacctgccccccatccccgccgacgagatccggaaccccgtggtgctgcgggccctgtcccaggcccggaaggtgatcaacggcgtggtgcggcggtacggctcccccgcccggatccacatcgagaccgcccgggaggtgggcaagtccttcaaggaccggaaggagatcgagaagcggcaggaggagaaccggaaggaccgggagaaggccgccgccaagttccgggagtacttccccaacttcgtgggcgagcccaagtccaaggacatcctgaagctgcggctgtacgagcagcagcacggcaagtgcctgtactccggcaaggagatcaacctggtgcggctgaacgagaagggctacgtggagatcgaccacgccctgcccttctcccggacctgggacgactccttcaacaacaaggtgctggtgctgggctccgagaaccagaacaagggcaaccagaccccctacgagtacttcaacggcaaggacaactcccgggagtggcaggagttcaaggcccgggtggagacctcccggttcccccggtccaagaagcagcggatcctgctgcagaagttcgacgaggacggcttcaaggagtgcaacctgaacgacacccggtacgtgaaccgcttcctgtgccagttcgtggccgaccacatcctgctgaccggcaagggcaagcggcgggtgttcgcctccaacggccagatcaccaacctgctgcggggcttctggggcctgcggaaggtgcgggccgagaacgaccggcaccacgccctggacgccgtggtggtggcctgctccaccgtggccatgcagcagaagatcacccggttcgtgcggtacaaggagatgaacgccttcgacggcaagaccatcgacaaggagaccggcaaggtgctgcaccagaagacccacttcccccagccctgggagttcttcgcccaggaggtgatgatccgggtgttcggcaagcccgacggcaagcccgagttcgaggaggccgacacccccgagaagctgcggaccctgctggccgagaagctgtcctcccggcccgaggccgtgcacgagtacgtgacccccctgttcgtgtcccgggcccccaaccggaagatgtccggcgcccacaaggacaccctgcggtccgccaagcggttcgtgaagcacaacgagaagatctccgtgaagcgggtgtggctgaccgagatcaagctggccgacctggagaacatggtgaactacaagaacggccgggagatcgagctgtacgaggccctgaaggcccggctggaggcctacggcggcaacgccaagcaggccttcgaccccaaggacaaccccttctacaagaagggcggccagctggtgaaggccgtgcgggtggagaagacccaggagtccggcgtgctgctgaacaagaagaacgcctacaccatcgccgacaacggcgacatggtgcgggtggacgtgttctgcaaggtggacaagaagggcaagaaccagtacttcatcgtgcccatctacgcctggcaggtggccgagaacatcctgcccgacatcgactgcaagggctaccggatcgacgactcctacaccttctgcttctccctgcacaagtacgacctgatcgccttccagaaggacgagaagtccaaggtggagttcgcctactacatcaactgcgactcctccaacggccggttctacctggcctggcacgacaagggctccaaggagcagcagttccggatctccacccagaacctggtgctgatccagaagtaccaggtgaacgagctgggcaaggagatccggccctgccggctgaagaagcggccccccgtgcggtccggaaagcggaccgccgacggctccgagttcgagtcccccaagaagaagcggaaggtggagtga |
661 | 編碼Sp. Cas9之ORF | ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG |
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664 | 編碼Sp. Cas9之ORF | AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGCCUCGACAUCGGCACCAACAGCGUCGGCUGGGCCGUCAUCACCGACGAGUACAAGGUCCCCAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUCGGCAACACCGACCGCCACAGCAUCAAGAAGAACCUCAUCGGCGCCCUCCUCUUCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGCCUCAAGCGCACCGCCCGCCGCCGCUACACCCGCCGCAAGAACCGCAUCUGCUACCUCCAGGAGAUCUUCAGCAACGAGAUGGCCAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUCGAGGAGAGCUUCCUCGUCGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGCCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUCGACGAGGUCGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUCCGCAAGAAGCUCGUCGACAGCACCGACAAGGCCGACCUCCGCCUCAUCUACCUCGCCCUCGCCCACAUGAUCAAGUUCCGCGGCCACUUCCUCAUCGAGGGCGACCUCAACCCCGACAACAGCGACGUCGACAAGCUCUUCAUCCAGCUCGUCCAGACCUACAACCAGCUCUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCAGCGGCGUCGACGCCAAGGCCAUCCUCAGCGCCCGCCUCAGCAAGAGCCGCCGCCUCGAGAACCUCAUCGCCCAGCUCCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUCUUCGGCAACCUCAUCGCCCUCAGCCUCGGCCUCACCCCCAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUCGCCGAGGACGCCAAGCUCCAGCUCAGCAAGGACACCUACGACGACGACCUCGACAACCUCCUCGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUCUUCCUCGCCGCCAAGAACCUCAGCGACGCCAUCCUCCUCAGCGACAUCCUCCGCGUCAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUCAGCGCCAGCAUGAUCAAGCGCUACGACGAGCACCACCAGGACCUCACCCUCCUCAAGGCCCUCGUCCGCCAGCAGCUCCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUCGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUCCUCGUCAAGCUCAACCGCGAGGACCUCCUCCGCAAGCAGCGCACCUUCGACAACGGCAGCAUCCCCCACCAGAUCCACCUCGGCGAGCUCCACGCCAUCCUCCGCCGCCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUCAAGGACAACCGCGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUCACCUUCCGCAUCCCCUACUACGUCGGCCCCCUCGCCCGCGGCAACAGCCGCUUCGCCUGGAUGACCCGCAAGAGCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUCGUCGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCUUCAUCGAGCGCAUGACCAACUUCGACAAGAACCUCCCCAACGAGAAGGUCCUCCCCAAGCACAGCCUCCUCUACGAGUACUUCACCGUCUACAACGAGCUCACCAAGGUCAAGUACGUCACCGAGGGCAUGCGCAAGCCCGCCUUCCUCAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUCGACCUCCUCUUCAAGACCAACCGCAAGGUCACCGUCAAGCAGCUCAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACAGCGUCGAGAUCAGCGGCGUCGAGGACCGCUUCAACGCCAGCCUCGGCACCUACCACGACCUCCUCAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUCGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUCGAGGACAUCGUCCUCACCCUCACCCUCUUCGAGGACCGCGAGAUGAUCGAGGAGCGCCUCAAGACCUACGCCCACCUCUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUCAAGCGCCGCCGCUACACCGGCUGGGGCCGCCUCAGCCGCAAGCUCAUCAACGGCAUCCGCGACAAGCAGAGCGGCAAGACCAUCCUCGACUUCCUCAAGAGCGACGGCUUCGCCAACCGCAACUUCAUGCAGCUCAUCCACGACGACAGCCUCACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUCAGCGGCCAGGGCGACAGCCUCCACGAGCACAUCGCCAACCUCGCCGGCAGCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUCCAGACCGUCAAGGUCGUCGACGAGCUCGUCAAGGUCAUGGGCCGCCACAAGCCCGAGAACAUCGUCAUCGAGAUGGCCCGCGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGCGAGCGCAUGAAGCGCAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUCGGCAGCCAGAUCCUCAAGGAGCACCCCGUCGAGAACACCCAGCUCCAGAACGAGAAGCUCUACCUCUACUACCUCCAGAACGGCCGCGACAUGUACGUCGACCAGGAGCUCGACAUCAACCGCCUCAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCCCAGAGCUUCCUCAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUCACCCGCAGCGACAAGAACCGCGGCAAGAGCGACAACGUCCCCAGCGAGGAGGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGCCAGCUCCUCAACGCCAAGCUCAUCACCCAGCGCAAGUUCGACAACCUCACCAAGGCCGAGCGCGGCGGCCUCAGCGAGCUCGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGCCAGCUCGUCGAGACCCGCCAGAUCACCAAGCACGUCGCCCAGAUCCUCGACAGCCGCAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUCAUCCGCGAGGUCAAGGUCAUCACCCUCAAGAGCAAGCUCGUCAGCGACUUCCGCAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCCGCGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUCAACGCCGUCGUCGGCACCGCCCUCAUCAAGAAGUACCCCAAGCUCGAGAGCGAGUUCGUCUACGGCGACUACAAGGUCUACGACGUCCGCAAGAUGAUCGCCAAGAGCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUCGCCAACGGCGAGAUCCGCAAGCGCCCCCUCAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUCUGGGACAAGGGCCGCGACUUCGCCACCGUCCGCAAGGUCCUCAGCAUGCCCCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACCGAGGUCCAGACCGGCGGCUUCAGCAAGGAGAGCAUCCUCCCCAAGCGCAACAGCGACAAGCUCAUCGCCCGCAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACAGCCCCACCGUCGCCUACAGCGUCCUCGUCGUCGCCAAGGUCGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCUCAAGAGCGUCAAGGAGCUCCUCGGCAUCACCAUCAUGGAGCGCAGCAGCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUCGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUCAAGAAGGACCUCAUCAUCAAGCUCCCCAAGUACAGCCUCUUCGAGCUCGAGAACGGCCGCAAGCGCAUGCUCGCCAGCGCCGGCGAGCUCCAGAAGGGCAACGAGCUCGCCCUCCCCAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUACCUCGCCAGCCACUACGAGAAGCUCAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUCUUCGUCGAGCAGCACAAGCACUACCUCGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCAGCGAGUUCAGCAAGCGCGUCAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAGGUCCUCAGCGCCUACAACAAGCACCGCGACAAGCCCAUCCGCGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUCUUCACCCUCACCAACCUCGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGCAAGCGCUACACCAGCACCAAGGAGGUCCUCGACGCCACCCUCAUCCACCAGAGCAUCACCGGCCUCUACGAGACCCGCAUCGACCUCAGCCAGCUCGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGCAAGGUCUAG |
665 | 編碼Sp. Cas9之ORF | ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGTGA |
666 | Sp. Cas9之胺基酸序列 | MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV |
667 | 具有HiBiT標籤之Cas9之開放閱讀框架 | AUGGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGACAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUGA |
668 | 具有HiBiT標籤之Cas9之胺基酸序列 | MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKVSESATPESVSGWRLFKKIS |
669 | SV40 NLS | PKKKRKV |
670 | 替代SV40 NLS | PKKKRRV |
671 | 例示性NLS 1 | LAAKRSRTT |
672 | 例示性NLS 2 | QAAKRSRTT |
673 | 例示性NLS 3 | PAPAKRERTT |
674 | 例示性NLS 4 | QAAKRPRTT |
675 | 例示性NLS 5 | RAAKRPRTT |
676 | 例示性NLS 6 | AAAKRSWSMAA |
677 | 例示性NLS 7 | AAAKRVWSMAF |
678 | 例示性NLS 8 | AAAKRSWSMAF |
679 | 例示性NLS 9 | AAAKRKYFAA |
680 | 例示性NLS 10 | RAAKRKAFAA |
681 | 例示性NLS 11 | RAAKRKYFAV |
682 | 核質蛋白NLS | KRPAATKKAGQAKKKK |
683 | 替代SV40 NLS | PKKKRKVE |
684 | 替代SV40 NLS | KKKRKVE |
685 | 雙聯NLS | KRTADGSEFESPKKKRKVE |
686 | c-myc樣NLS | PAAKKKKLD |
687-700 | 未使用 | |
701 | 編碼Nme2Cas9之例示性序列(mRNA AA) | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA |
702 | 編碼Nme1Cas9之例示性序列 (mRNA AB) | GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCGCCACCAUGGCAGCAUUCAAGCCGAACUCGAUCAACUACAUCCUGGGACUGGACAUCGGAAUCGCAUCGGUCGGAUGGGCAAUGGUCGAAAUCGACGAAGAAGAAAACCCGAUCAGACUGAUCGACCUGGGAGUCAGAGUCUUCGAAAGAGCAGAAGUCCCGAAGACAGGAGACUCGCUGGCAAUGGCAAGAAGACUGGCAAGAUCGGUCAGAAGACUGACAAGAAGAAGAGCACACAGACUGCUGAGAACAAGAAGACUGCUGAAGAGAGAAGGAGUCCUGCAGGCAGCAAACUUCGACGAAAACGGACUGAUCAAGUCGCUGCCGAACACACCGUGGCAGCUGAGAGCAGCAGCACUGGACAGAAAGCUGACACCGCUGGAAUGGUCGGCAGUCCUGCUGCACCUGAUCAAGCACAGAGGAUACCUGUCGCAGAGAAAGAACGAAGGAGAAACAGCAGACAAGGAACUGGGAGCACUGCUGAAGGGAGUCGCAGGAAACGCACACGCACUGCAGACAGGAGACUUCAGAACACCGGCAGAACUGGCACUGAACAAGUUCGAAAAGGAAUCGGGACACAUCAGAAACCAGAGAUCGGACUACUCGCACACAUUCUCGAGAAAGGACCUGCAGGCAGAACUGAUCCUGCUGUUCGAAAAGCAGAAGGAAUUCGGAAACCCGCACGUCUCGGGAGGACUGAAGGAAGGAAUCGAAACACUGCUGAUGACACAGAGACCGGCACUGUCGGGAGACGCAGUCCAGAAGAUGCUGGGACACUGCACAUUCGAACCGGCAGAACCGAAGGCAGCAAAGAACACAUACACAGCAGAAAGAUUCAUCUGGCUGACAAAGCUGAACAACCUGAGAAUCCUGGAACAGGGAUCGGAAAGACCGCUGACAGACACAGAAAGAGCAACACUGAUGGACGAACCGUACAGAAAGUCGAAGCUGACAUACGCACAGGCAAGAAAGCUGCUGGGACUGGAAGACACAGCAUUCUUCAAGGGACUGAGAUACGGAAAGGACAACGCAGAAGCAUCGACACUGAUGGAAAUGAAGGCAUACCACGCAAUCUCGAGAGCACUGGAAAAGGAAGGACUGAAGGACAAGAAGUCGCCGCUGAACCUGUCGCCGGAACUGCAGGACGAAAUCGGAACAGCAUUCUCGCUGUUCAAGACAGACGAAGACAUCACAGGAAGACUGAAGGACAGAAUCCAGCCGGAAAUCCUGGAAGCACUGCUGAAGCACAUCUCGUUCGACAAGUUCGUCCAGAUCUCGCUGAAGGCACUGAGAAGAAUCGUCCCGCUGAUGGAACAGGGAAAGAGAUACGACGAAGCAUGCGCAGAAAUCUACGGAGACCACUACGGAAAGAAGAACACAGAAGAAAAGAUCUACCUGCCGCCGAUCCCGGCAGACGAAAUCAGAAACCCGGUCGUCCUGAGAGCACUGUCGCAGGCAAGAAAGGUCAUCAACGGAGUCGUCAGAAGAUACGGAUCGCCGGCAAGAAUCCACAUCGAAACAGCAAGAGAAGUCGGAAAGUCGUUCAAGGACAGAAAGGAAAUCGAAAAGAGACAGGAAGAAAACAGAAAGGACAGAGAAAAGGCAGCAGCAAAGUUCAGAGAAUACUUCCCGAACUUCGUCGGAGAACCGAAGUCGAAGGACAUCCUGAAGCUGAGACUGUACGAACAGCAGCACGGAAAGUGCCUGUACUCGGGAAAGGAAAUCAACCUGGGAAGACUGAACGAAAAGGGAUACGUCGAAAUCGACCACGCACUGCCGUUCUCGAGAACAUGGGACGACUCGUUCAACAACAAGGUCCUGGUCCUGGGAUCGGAAAACCAGAACAAGGGAAACCAGACACCGUACGAAUACUUCAACGGAAAGGACAACUCGAGAGAAUGGCAGGAAUUCAAGGCAAGAGUCGAAACAUCGAGAUUCCCGAGAUCGAAGAAGCAGAGAAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAAGACGGAUUCAAGGAAAGAAACCUGAACGACACAAGAUACGUCAACAGAUUCCUGUGCCAGUUCGUCGCAGACAGAAUGAGACUGACAGGAAAGGGAAAGAAGAGAGUCUUCGCAUCGAACGGACAGAUCACAAACCUGCUGAGAGGAUUCUGGGGACUGAGAAAGGUCAGAGCAGAAAACGACAGACACCACGCACUGGACGCAGUCGUCGUCGCAUGCUCGACAGUCGCAAUGCAGCAGAAGAUCACAAGAUUCGUCAGAUACAAGGAAAUGAACGCAUUCGACGGAAAGACAAUCGACAAGGAAACAGGAGAAGUCCUGCACCAGAAGACACACUUCCCGCAGCCGUGGGAAUUCUUCGCACAGGAAGUCAUGAUCAGAGUCUUCGGAAAGCCGGACGGAAAGCCGGAAUUCGAAGAAGCAGACACACUGGAAAAGCUGAGAACACUGCUGGCAGAAAAGCUGUCGUCGAGACCGGAAGCAGUCCACGAAUACGUCACACCGCUGUUCGUCUCGAGAGCACCGAACAGAAAGAUGUCGGGACAGGGACACAUGGAAACAGUCAAGUCGGCAAAGAGACUGGACGAAGGAGUCUCGGUCCUGAGAGUCCCGCUGACACAGCUGAAGCUGAAGGACCUGGAAAAGAUGGUCAACAGAGAAAGAGAACCGAAGCUGUACGAAGCACUGAAGGCAAGACUGGAAGCACACAAGGACGACCCGGCAAAGGCAUUCGCAGAACCGUUCUACAAGUACGACAAGGCAGGAAACAGAACACAGCAGGUCAAGGCAGUCAGAGUCGAACAGGUCCAGAAGACAGGAGUCUGGGUCAGAAACCACAACGGAAUCGCAGACAACGCAACAAUGGUCAGAGUAGACGUCUUCGAAAAGGGAGACAAGUACUACCUGGUCCCGAUCUACUCGUGGCAGGUCGCAAAGGGAAUCCUGCCGGACAGAGCAGUCGUCCAGGGAAAGGACGAAGAAGACUGGCAGCUGAUCGACGACUCGUUCAACUUCAAGUUCUCGCUGCACCCGAACGACCUGGUCGAAGUCAUCACAAAGAAGGCAAGAAUGUUCGGAUACUUCGCAUCGUGCCACAGAGGAACAGGAAACAUCAACAUCAGAAUCCACGACCUGGACCACAAGAUCGGAAAGAACGGAAUCCUGGAAGGAAUCGGAGUCAAGACAGCACUGUCGUUCCAGAAGUACCAGAUCGACGAACUGGGAAAGGAAAUCAGACCGUGCAGACUGAAGAAGAGACCGCCGGUCAGAUCCGGAAAGAGAACAGCAGACGGAUCGGAAUUCGAAUCGCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGAAUGAUAGCUAGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG |
703 | 編碼具有HiBiT標籤之Nme2Cas9的例示性序列 (mRNA V) | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUCGA |
704 | 編碼具有HiBiT標籤之Nme1Cas9的例示性序列 (mRNA X) | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCAGCAUUCAAGCCAAACUCAAUCAAUUACAUCCUGGGACUGGACAUCGGCAUCGCAUCCGUCGGGUGGGCUAUGGUCGAAAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGCCUGAUCGAUCUGGGCGUGCGCGUGUUUGAGAGGGCAGAGGUGCCUAAGACCGGCGACAGCCUGGCCAUGGCACGGAGACUGGCACGCUCCGUGAGGCGCCUGACCCGGAGAAGGGCCCACAGACUGCUGAGGACACGCCGGCUGCUGAAGAGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCAACUUCGAUGAGAAUGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAAUACCCCUUGGCAGCUGAGGGCAGCCGCCCUGGACCGCAAGCUGACACCUCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCUCAGAGAAAGAACGAGGGCGAGACAGCCGAUAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGAGUGGCAGGAAAUGCACACGCCCUGCAGACCGGCGACUUUCGCACACCAGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGAGCGGCCACAUCCGCAAUCAGCGGUCUGACUAUAGCCACACCUUCUCCCGGAAGGAUCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUUGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCACACGUGUCUGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACACUGCUGAUGACACAGCGGCCCGCCCUGAGCGGCGACGCAGUGCAGAAGAUGCUGGGACACUGCACCUUUGAGCCAGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAAUACCUACACAGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACAAAGCUGAACAAUCUGAGGAUCCUGGAGCAGGGAAGCGAGCGCCCACUGACCGACACAGAGAGGGCCACCCUGAUGGAUGAGCCCUACCGCAAGUCCAAGCUGACAUAUGCACAGGCAAGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUUAAGGGCCUGAGAUACGGCAAGGAUAACGCCGAGGCCUCUACACUGAUGGAGAUGAAGGCCUAUCACGCCAUCAGCAGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCACUGAAUCUGUCUCCCGAGCUGCAGGAUGAGAUCGGCACCGCCUUUAGCCUGUUCAAGACCGACGAGGAUAUCACAGGCAGACUGAAGGACAGGAUCCAGCCAGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCAGCUUUGAUAAGUUCGUGCAGAUCAGCCUGAAGGCCCUGCGGAGGAUCGUGCCACUGAUGGAGCAGGGCAAGAGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAAAUCUACGGCGAUCACUAUGGCAAGAAGAACACAGAGGAGAAAAUCUACCUGCCCCCUAUCCCCGCCGAUGAGAUCAGGAACCCUGUGGUGCUGCGCGCCCUGUCUCAGGCAAGAAAAGUGAUCAACGGAGUGGUGCGCCGGUACGGCAGCCCCGCCAGAAUCCACAUCGA703GACAGCCAGGGAAGUGGGCAAGUCCUUUAAGGACAGAAAGGAGAUCGAGAAGAGGCAGGAGGAGAACAGAAAGGAUAGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCAGAGAGUACUUUCCUAAUUUCGUGGGCGAGCCAAAGUCCAAGGAUAUCCUGAAGCUGAGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGUCUGUAUUCUGGCAAGGAGAUCAACCUGGGCCGCCUGAAUGAGAAGGGCUAUGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCUUUUUCUCGGACCUGGGACGAUAGCUUCAACAAUAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCUGAGAACCAGAAUAAGGGCAACCAGACACCCUACGAGUAUUUCAACGGCAAGGACAAUAGCCGCGAGUGGCAGGAGUUUAAGGCAAGGGUGGAGACAAGCAGGUUCCCUCGGUCCAAGAAGCAGAGAAUCCUGCUGCAGAAGUUUGACGAGGAUGGCUUCAAGGAGAGGAACCUGAAUGACACCCGCUACGUGAAUCGGUUUCUGUGCCAGUUCGUGGCCGAUAGAAUGAGGCUGACCGGCAAGGGCAAGAAGAGAGUGUUUGCCUCCAACGGCCAGAUCACAAAUCUGCUGAGGGGCUUCUGGGGCCUGAGAAAGGUGAGGGCAGAGAACGACAGGCACCACGCACUGGAUGCAGUGGUGGUGGCAUGUUCUACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACACGCUUUGUGCGGUAUAAGGAGAUGAAUGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGAUAAGGAGACAGGCGAGGUGCUGCACCAGAAGACACACUUUCCUCAGCCAUGGGAGUUCUUUGCCCAGGAAGUGAUGAUCCGGGUGUUUGGCAAGCCUGACGGCAAGCCAGAGUUCGAGGAGGCCGAUACCCUGGAGAAGCUGAGAACACUGCUGGCAGAGAAGCUGAGCUCCAGGCCCGAGGCAGUGCACGAGUACGUGACCCCACUGUUCGUGUCUAGAGCCCCCAACAGGAAGAUGAGCGGCCAGGGCCACAUGGAGACAGUGAAGUCCGCCAAGAGACUGGACGAGGGCGUGUCUGUGCUGAGGGUGCCUCUGACACAGCUGAAGCUGAAGGAUCUGGAGAAGAUGGUGAAUCGCGAGCGGGAGCCAAAGCUGUAUGAGGCCCUGAAGGCAAGGCUGGAGGCACACAAGGACGAUCCUGCCAAGGCCUUUGCCGAGCCAUUCUACAAGUAUGAUAAGGCCGGCAACAGAACCCAGCAGGUGAAGGCCGUGAGGGUGGAGCAGGUGCAGAAGACAGGCGUGUGGGUGCGCAACCACAAUGGCAUCGCCGACAAUGCUACCAUGGUGCGGGUGGACGUGUUUGAGAAGGGCGAUAAGUACUAUCUGGUGCCCAUCUACAGCUGGCAGGUGGCCAAGGGCAUCCUGCCUGAUAGAGCCGUGGUGCAGGGCAAGGACGAGGAGGAUUGGCAGCUGAUCGACGAUUCCUUCAACUUUAAGUUCUCUCUGCACCCCAAUGACCUGGUGGAAGUGAUCACCAAGAAGGCCAGGAUGUUUGGCUACUUCGCCUCCUGCCACCGCGGCACAGGCAACAUCAAUAUCCGGAUCCACGACCUGGAUCACAAGAUCGGCAAGAACGGCAUCCUGGAGGGCAUCGGCGUGAAGACAGCCCUGAGCUUCCAGAAGUAUCAGAUCGACGAGCUGGGCAAGGAGAUCAGACCUUGUAGGCUGAAGAAGCGCCCACCCGUGCGGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUCGA |
705 | 編碼具有HiBiT標籤之Nme1Cas9的例示性序列 (mRNA Y) | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACUCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGACCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCAACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCGGCAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGUCCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCCCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGAUCCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGGCCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGCGGAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCGGAUGCGGCUGACCGGCAAGGGCAAGAAGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCGAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCUGGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCCAGGGCCACAUGGAGACCGUGAAGUCCGCCAAGCGGCUGGACGAGGGCGUGUCCGUGCUGCGGGUGCCCCUGACCCAGCUGAAGCUGAAGGACCUGGAGAAGAUGGUGAACCGGGAGCGGGAGCCCAAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCCACAAGGACGACCCCGCCAAGGCCUUCGCCGAGCCCUUCUACAAGUACGACAAGGCCGGCAACCGGACCCAGCAGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGCAGGUGCAGAAGACCGGCGUGUGGGUGCGGAACCACAACGGCAUCGCCGACAACGCCACCAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCGAGAAGGGCGACAAGUACUACCUGGUGCCCAUCUACUCCUGGCAGGUGGCCAAGGGCAUCCUGCCCGACCGGGCCGUGGUGCAGGGCAAGGACGAGGAGGACUGGCAGCUGAUCGACGACUCCUUCAACUUCAAGUUCUCCCUGCACCCCAACGACCUGGUGGAGGUGAUCACCAAGAAGGCCCGGAUGUUCGGCUACUUCGCCUCCUGCCACCGGGGCACCGGCAACAUCAACAUCCGGAUCCACGACCUGGACCACAAGAUCGGCAAGAACGGCAUCCUGGAGGGCAUCGGCGUGAAGACCGCCCUGUCCUUCCAGAAGUACCAGAUCGACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUCGA |
706 | 編碼具有HiBiT標籤之Nme3Cas9的例示性序列 (mRNA Z) | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCGACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUGCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAACCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGUCCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACACCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCCCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGAUCCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGGCCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGCGGAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCGGAUGCGGCUGACCGGCAAGGGCAAGAAGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCGAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCCAGGGCCACAUGGAGACCGUGAAGUCCGCCAAGCGGCUGGACGAGGGCGUGUCCGUGCUGCGGGUGCCCCUGACCCAGCUGAAGCUGAAGGACCUGGAGAAGAUGGUGAACCGGGAGCGGGAGCCCAAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCCACAAGGACGACCCCGCCAAGGCCUUCGCCGAGCCCUUCUACAAGUACGACAAGGCCGGCAACCGGACCCAGCAGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGCAGGUGCAGAAGACCGGCGUGUGGGUGCGGAACCACAACGGCAUCGCCGACAACGCCACCAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCGAGAAGGGCGACAAGUACUACCUGGUGCCCAUCUACUCCUGGCAGGUGGCCAAGGGCAUCCUGCCCGACCGGGCCGUGGUGGCCUACGCCGACGAGGAGGACUGGACCGUGAUCGACGAGUCCUUCCGGUUCAAGUUCGUGCUGUACUCCAACGACCUGAUCAAGGUGCAGCUGAAGAAGGACUCCUUCCUGGGCUACUUCUCCGGCCUGGACCGGGCCACCGGCGCCAUCUCCCUGCGGGAGCACGACCUGGAGAAGUCCAAGGGCAAGGACGGCAUGCACCGGAUCGGCGUGAAGACCGCCCUGUCCUUCCAGAAGUACCAGAUCGACGAGAUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
707 | Nme2Cas9之例示性胺基酸序列 (mRNA AA胺基酸) | MDGSGGGSPKKKRKVEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVR* |
708 | Nme1Cas9之例示性胺基酸序列 (mRNA BB胺基酸) | MAAFKPNSINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRTRRLLKREGVLQAANFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVAGNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRSDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSPELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRIQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLGRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKERNLNDTRYVNRFLCQFVADRMRLTGKGKKRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGEVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTLEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGQGHMETVKSAKRLDEGVSVLRVPLTQLKLKDLEKMVNREREPKLYEALKARLEAHKDDPAKAFAEPFYKYDKAGNRTQQVKAVRVEQVQKTGVWVRNHNGIADNATMVRVDVFEKGDKYYLVPIYSWQVAKGILPDRAVVQGKDEEDWQLIDDSFNFKFSLHPNDLVEVITKKARMFGYFASCHRGTGNINIRIHDLDHKIGKNGILEGIGVKTALSFQKYQIDELGKEIRPCRLKKRPPVRSGKRTADGSEFESPKKKRKVE* |
709 | 具有HiBiT標籤之Nme2Cas9之例示性胺基酸序列 (mRNA V胺基酸) | MDGSGGGSPKKKRKVEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRSESATPESVSGWRLFKKIS* |
710 | 具有HiBiT標籤之Nme1Cas9之例示性胺基酸序列 (mRNA X胺基酸) | MDGSGGGSPKKKRKVEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGGAAFKPNSINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRTRRLLKREGVLQAANFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVAGNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRSDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSPELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRIQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLGRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKERNLNDTRYVNRFLCQFVADRMRLTGKGKKRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGEVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTLEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGQGHMETVKSAKRLDEGVSVLRVPLTQLKLKDLEKMVNREREPKLYEALKARLEAHKDDPAKAFAEPFYKYDKAGNRTQQVKAVRVEQVQKTGVWVRNHNGIADNATMVRVDVFEKGDKYYLVPIYSWQVAKGILPDRAVVQGKDEEDWQLIDDSFNFKFSLHPNDLVEVITKKARMFGYFASCHRGTGNINIRIHDLDHKIGKNGILEGIGVKTALSFQKYQIDELGKEIRPCRLKKRPPVRSESATPESVSGWRLFKKIS* |
711 | 具有HiBiT標籤之Nme1Cas9之例示性胺基酸序列 (mRNA Y胺基酸) | MDGSGGGSPKKKRKVEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGGAAFKPNSINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRTRRLLKREGVLQAANFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVAGNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRSDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSPELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRIQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLGRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKERNLNDTRYVNRFLCQFVADRMRLTGKGKKRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGEVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTLEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGQGHMETVKSAKRLDEGVSVLRVPLTQLKLKDLEKMVNREREPKLYEALKARLEAHKDDPAKAFAEPFYKYDKAGNRTQQVKAVRVEQVQKTGVWVRNHNGIADNATMVRVDVFEKGDKYYLVPIYSWQVAKGILPDRAVVQGKDEEDWQLIDDSFNFKFSLHPNDLVEVITKKARMFGYFASCHRGTGNINIRIHDLDHKIGKNGILEGIGVKTALSFQKYQIDELGKEIRPCRLKKRPPVRSESATPESVSGWRLFKKIS* |
712 | 具有HiBiT標籤之Nme3Cas9之例示性胺基酸序列 (mRNA Z胺基酸) | MDGSGGGSPKKKRKVEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVADNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKECGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELNLLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLSLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHTISRALEKEGLKDKKSPLNLSPELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRIQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLGRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKERNLNDTRYVNRFLCQFVADRMRLTGKGKKRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGEVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGQGHMETVKSAKRLDEGVSVLRVPLTQLKLKDLEKMVNREREPKLYEALKARLEAHKDDPAKAFAEPFYKYDKAGNRTQQVKAVRVEQVQKTGVWVRNHNGIADNATMVRVDVFEKGDKYYLVPIYSWQVAKGILPDRAVVAYADEEDWTVIDESFRFKFVLYSNDLIKVQLKKDSFLGYFSGLDRATGAISLREHDLEKSKGKDGMHRIGVKTALSFQKYQIDEMGKEIRPCRLKKRPPVRSESATPESVSGWRLFKKIS* |
713 | Nme2Cas9之例示性開放閱讀框架 (mRNA AA ORF) | augGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCgccgccuucaagcccaaccccaucaacuacauccugggccuggacaucggcaucgccuccgugggcugggccaugguggagaucgacgaggaggagaaccccauccggcugaucgaccugggcgugcggguguucgagcgggccgaggugcccaagaccggcgacucccuggccauggcccggcggcuggcccgguccgugcggcggcugacccggcggcgggcccaccggcugcugcgggcccggcggcugcugaagcgggagggcgugcugcaggccgccgacuucgacgagaacggccugaucaagucccugcccaacacccccuggcagcugcgggccgccgcccuggaccggaagcugaccccccuggagugguccgccgugcugcugcaccugaucaagcaccggggcuaccugucccagcggaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagcugggcgcccugcugaagggcguggccaacaacgcccacgcccugcagaccggcgacuuccggacccccgccgagcuggcccugaacaaguucgagaaggaguccggccacauccggaaccagcggggcgacuacucccacaccuucucccggaaggaccugcaggccgagcugauccugcuguucgagaagcagaaggaguucggcaacccccacguguccggcggccugaaggagggcaucgagacccugcugaugacccagcggcccgcccuguccggcgacgccgugcagaagaugcugggccacugcaccuucgagcccgccgagcccaaggccgccaagaacaccuacaccgccgagcgguucaucuggcugaccaagcugaacaaccugcggauccuggagcagggcuccgagcggccccugaccgacaccgagcgggccacccugauggacgagcccuaccggaaguccaagcugaccuacgcccaggcccggaagcugcugggccuggaggacaccgccuucuucaagggccugcgguacggcaaggacaacgccgaggccuccacccugauggagaugaaggccuaccacgccaucucccgggcccuggagaaggagggccugaaggacaagaaguccccccugaaccuguccuccgagcugcaggacgagaucggcaccgccuucucccuguucaagaccgacgaggacaucaccggccggcugaaggaccgggugcagcccgagauccuggaggcccugcugaagcacaucuccuucgacaaguucgugcagaucucccugaaggcccugcggcggaucgugccccugauggagcagggcaagcgguacgacgaggccugcgccgagaucuacggcgaccacuacggcaagaagaacaccgaggagaagaucuaccugccccccauccccgccgacgagauccggaaccccguggugcugcgggcccugucccaggcccggaaggugaucaacggcguggugcggcgguacggcucccccgcccggauccacaucgagaccgcccgggaggugggcaaguccuucaaggaccggaaggagaucgagaagcggcaggaggagaaccggaaggaccgggagaaggccgccgccaaguuccgggaguacuuccccaacuucgugggcgagcccaaguccaaggacauccugaagcugcggcuguacgagcagcagcacggcaagugccuguacuccggcaaggagaucaaccuggugcggcugaacgagaagggcuacguggagaucgaccacgcccugcccuucucccggaccugggacgacuccuucaacaacaaggugcuggugcugggcuccgagaaccagaacaagggcaaccagacccccuacgaguacuucaacggcaaggacaacucccgggaguggcaggaguucaaggcccggguggagaccucccgguucccccgguccaagaagcagcggauccugcugcagaaguucgacgaggacggcuucaaggagugcaaccugaacgacacccgguacgugaaccgguuccugugccaguucguggccgaccacauccugcugaccggcaagggcaagcggcggguguucgccuccaacggccagaucaccaaccugcugcggggcuucuggggccugcggaaggugcgggccgagaacgaccggcaccacgcccuggacgccguggugguggccugcuccaccguggccaugcagcagaagaucacccgguucgugcgguacaaggagaugaacgccuucgacggcaagaccaucgacaaggagaccggcaaggugcugcaccagaagacccacuucccccagcccugggaguucuucgcccaggaggugaugauccggguguucggcaagcccgacggcaagcccgaguucgaggaggccgacacccccgagaagcugcggacccugcuggccgagaagcuguccucccggcccgaggccgugcacgaguacgugaccccccuguucgugucccgggcccccaaccggaagauguccggcgcccacaaggacacccugcgguccgccaagcgguucgugaagcacaacgagaagaucuccgugaagcggguguggcugaccgagaucaagcuggccgaccuggagaacauggugaacuacaagaacggccgggagaucgagcuguacgaggcccugaaggcccggcuggaggccuacggcggcaacgccaagcaggccuucgaccccaaggacaaccccuucuacaagaagggcggccagcuggugaaggccgugcggguggagaagacccaggaguccggcgugcugcugaacaagaagaacgccuacaccaucgccgacaacggcgacauggugcggguggacguguucugcaagguggacaagaagggcaagaaccaguacuucaucgugcccaucuacgccuggcagguggccgagaacauccugcccgacaucgacugcaagggcuaccggaucgacgacuccuacaccuucugcuucucccugcacaaguacgaccugaucgccuuccagaaggacgagaaguccaagguggaguucgccuacuacaucaacugcgacuccuccaacggccgguucuaccuggccuggcacgacaagggcuccaaggagcagcaguuccggaucuccacccagaaccuggugcugauccagaaguaccaggugaacgagcugggcaaggagauccggcccugccggcugaagaagcggccccccgugcgguag |
714 | Nme1Cas9之例示性開放閱讀框架 (mRNA AB ORF) | AUGGCAGCAUUCAAGCCGAACUCGAUCAACUACAUCCUGGGACUGGACAUCGGAAUCGCAUCGGUCGGAUGGGCAAUGGUCGAAAUCGACGAAGAAGAAAACCCGAUCAGACUGAUCGACCUGGGAGUCAGAGUCUUCGAAAGAGCAGAAGUCCCGAAGACAGGAGACUCGCUGGCAAUGGCAAGAAGACUGGCAAGAUCGGUCAGAAGACUGACAAGAAGAAGAGCACACAGACUGCUGAGAACAAGAAGACUGCUGAAGAGAGAAGGAGUCCUGCAGGCAGCAAACUUCGACGAAAACGGACUGAUCAAGUCGCUGCCGAACACACCGUGGCAGCUGAGAGCAGCAGCACUGGACAGAAAGCUGACACCGCUGGAAUGGUCGGCAGUCCUGCUGCACCUGAUCAAGCACAGAGGAUACCUGUCGCAGAGAAAGAACGAAGGAGAAACAGCAGACAAGGAACUGGGAGCACUGCUGAAGGGAGUCGCAGGAAACGCACACGCACUGCAGACAGGAGACUUCAGAACACCGGCAGAACUGGCACUGAACAAGUUCGAAAAGGAAUCGGGACACAUCAGAAACCAGAGAUCGGACUACUCGCACACAUUCUCGAGAAAGGACCUGCAGGCAGAACUGAUCCUGCUGUUCGAAAAGCAGAAGGAAUUCGGAAACCCGCACGUCUCGGGAGGACUGAAGGAAGGAAUCGAAACACUGCUGAUGACACAGAGACCGGCACUGUCGGGAGACGCAGUCCAGAAGAUGCUGGGACACUGCACAUUCGAACCGGCAGAACCGAAGGCAGCAAAGAACACAUACACAGCAGAAAGAUUCAUCUGGCUGACAAAGCUGAACAACCUGAGAAUCCUGGAACAGGGAUCGGAAAGACCGCUGACAGACACAGAAAGAGCAACACUGAUGGACGAACCGUACAGAAAGUCGAAGCUGACAUACGCACAGGCAAGAAAGCUGCUGGGACUGGAAGACACAGCAUUCUUCAAGGGACUGAGAUACGGAAAGGACAACGCAGAAGCAUCGACACUGAUGGAAAUGAAGGCAUACCACGCAAUCUCGAGAGCACUGGAAAAGGAAGGACUGAAGGACAAGAAGUCGCCGCUGAACCUGUCGCCGGAACUGCAGGACGAAAUCGGAACAGCAUUCUCGCUGUUCAAGACAGACGAAGACAUCACAGGAAGACUGAAGGACAGAAUCCAGCCGGAAAUCCUGGAAGCACUGCUGAAGCACAUCUCGUUCGACAAGUUCGUCCAGAUCUCGCUGAAGGCACUGAGAAGAAUCGUCCCGCUGAUGGAACAGGGAAAGAGAUACGACGAAGCAUGCGCAGAAAUCUACGGAGACCACUACGGAAAGAAGAACACAGAAGAAAAGAUCUACCUGCCGCCGAUCCCGGCAGACGAAAUCAGAAACCCGGUCGUCCUGAGAGCACUGUCGCAGGCAAGAAAGGUCAUCAACGGAGUCGUCAGAAGAUACGGAUCGCCGGCAAGAAUCCACAUCGAAACAGCAAGAGAAGUCGGAAAGUCGUUCAAGGACAGAAAGGAAAUCGAAAAGAGACAGGAAGAAAACAGAAAGGACAGAGAAAAGGCAGCAGCAAAGUUCAGAGAAUACUUCCCGAACUUCGUCGGAGAACCGAAGUCGAAGGACAUCCUGAAGCUGAGACUGUACGAACAGCAGCACGGAAAGUGCCUGUACUCGGGAAAGGAAAUCAACCUGGGAAGACUGAACGAAAAGGGAUACGUCGAAAUCGACCACGCACUGCCGUUCUCGAGAACAUGGGACGACUCGUUCAACAACAAGGUCCUGGUCCUGGGAUCGGAAAACCAGAACAAGGGAAACCAGACACCGUACGAAUACUUCAACGGAAAGGACAACUCGAGAGAAUGGCAGGAAUUCAAGGCAAGAGUCGAAACAUCGAGAUUCCCGAGAUCGAAGAAGCAGAGAAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAAGACGGAUUCAAGGAAAGAAACCUGAACGACACAAGAUACGUCAACAGAUUCCUGUGCCAGUUCGUCGCAGACAGAAUGAGACUGACAGGAAAGGGAAAGAAGAGAGUCUUCGCAUCGAACGGACAGAUCACAAACCUGCUGAGAGGAUUCUGGGGACUGAGAAAGGUCAGAGCAGAAAACGACAGACACCACGCACUGGACGCAGUCGUCGUCGCAUGCUCGACAGUCGCAAUGCAGCAGAAGAUCACAAGAUUCGUCAGAUACAAGGAAAUGAACGCAUUCGACGGAAAGACAAUCGACAAGGAAACAGGAGAAGUCCUGCACCAGAAGACACACUUCCCGCAGCCGUGGGAAUUCUUCGCACAGGAAGUCAUGAUCAGAGUCUUCGGAAAGCCGGACGGAAAGCCGGAAUUCGAAGAAGCAGACACACUGGAAAAGCUGAGAACACUGCUGGCAGAAAAGCUGUCGUCGAGACCGGAAGCAGUCCACGAAUACGUCACACCGCUGUUCGUCUCGAGAGCACCGAACAGAAAGAUGUCGGGACAGGGACACAUGGAAACAGUCAAGUCGGCAAAGAGACUGGACGAAGGAGUCUCGGUCCUGAGAGUCCCGCUGACACAGCUGAAGCUGAAGGACCUGGAAAAGAUGGUCAACAGAGAAAGAGAACCGAAGCUGUACGAAGCACUGAAGGCAAGACUGGAAGCACACAAGGACGACCCGGCAAAGGCAUUCGCAGAACCGUUCUACAAGUACGACAAGGCAGGAAACAGAACACAGCAGGUCAAGGCAGUCAGAGUCGAACAGGUCCAGAAGACAGGAGUCUGGGUCAGAAACCACAACGGAAUCGCAGACAACGCAACAAUGGUCAGAGUAGACGUCUUCGAAAAGGGAGACAAGUACUACCUGGUCCCGAUCUACUCGUGGCAGGUCGCAAAGGGAAUCCUGCCGGACAGAGCAGUCGUCCAGGGAAAGGACGAAGAAGACUGGCAGCUGAUCGACGACUCGUUCAACUUCAAGUUCUCGCUGCACCCGAACGACCUGGUCGAAGUCAUCACAAAGAAGGCAAGAAUGUUCGGAUACUUCGCAUCGUGCCACAGAGGAACAGGAAACAUCAACAUCAGAAUCCACGACCUGGACCACAAGAUCGGAAAGAACGGAAUCCUGGAAGGAAUCGGAGUCAAGACAGCACUGUCGUUCCAGAAGUACCAGAUCGACGAACUGGGAAAGGAAAUCAGACCGUGCAGACUGAAGAAGAGACCGCCGGUCAGAUCCGGAAAGAGAACAGCAGACGGAUCGGAAUUCGAAUCGCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGAAUGA |
715 | 具有HiBiT標籤之Nme2Cas9之例示性開放閱讀框架 (mRNA V ORF) | augGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUAG |
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717 | 具有HiBiT標籤之Nme1Cas9之例示性胺基酸開放閱讀框架 (mRNA Y ORF) | augGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACUCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGACCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCAACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCGGCAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGUCCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCCCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGAUCCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGGCCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGCGGAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCGGAUGCGGCUGACCGGCAAGGGCAAGAAGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCGAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCUGGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCCAGGGCCACAUGGAGACCGUGAAGUCCGCCAAGCGGCUGGACGAGGGCGUGUCCGUGCUGCGGGUGCCCCUGACCCAGCUGAAGCUGAAGGACCUGGAGAAGAUGGUGAACCGGGAGCGGGAGCCCAAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCCACAAGGACGACCCCGCCAAGGCCUUCGCCGAGCCCUUCUACAAGUACGACAAGGCCGGCAACCGGACCCAGCAGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGCAGGUGCAGAAGACCGGCGUGUGGGUGCGGAACCACAACGGCAUCGCCGACAACGCCACCAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCGAGAAGGGCGACAAGUACUACCUGGUGCCCAUCUACUCCUGGCAGGUGGCCAAGGGCAUCCUGCCCGACCGGGCCGUGGUGCAGGGCAAGGACGAGGAGGACUGGCAGCUGAUCGACGACUCCUUCAACUUCAAGUUCUCCCUGCACCCCAACGACCUGGUGGAGGUGAUCACCAAGAAGGCCCGGAUGUUCGGCUACUUCGCCUCCUGCCACCGGGGCACCGGCAACAUCAACAUCCGGAUCCACGACCUGGACCACAAGAUCGGCAAGAACGGCAUCCUGGAGGGCAUCGGCGUGAAGACCGCCCUGUCCUUCCAGAAGUACCAGAUCGACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUAG |
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G000502(未經修飾) | 758 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
G000502 | 759 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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RNA9-102 | 761 | GGCGCTTCGCCAGCCATTCCTGCGTTGTAGCCTTCTGAAAAGAAGGCTACAATAAGGCCGTCTGAAAAGATGTGCCGCAACGCTCTGCTTCTGCATCGTtt |
RNA7-106 | 762 | GGCGCTTCGCCAGCCATTCCTGCGTTGTAGCTCCCTCTGAAAAGCCGTTGCTACAATAAGGCCGTCTGAAAAGATGTGCCGCAACGCTCTGCTTCTGCATCGTtt |
RNA8-106 | 763 | GGCGCTTCGCCAGCCATTCCTGCGTTGTAGCTCCCTTTCTGAAAAGAACCGTTGCTACAATAAGGCCGTCTGAAAAGATGTGCCGCAACGCTCTGCTTCTGCAtt |
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G029392 | 946 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCmGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUmCmG*mU*mU |
G024739 | 947 | AGGACCAGCCUCAGACACAAAUACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU |
G024741 | 948 | CUGCCUCGGACGGCAUCUAGAACUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU |
G024743 | 949 | AGGCAGAGGAGGAGCAGACGAUGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU |
應理解,若相對於RNA提及DNA序列(包含Ts),則Ts應經Us (取決於上下文,其可經修飾或未經修飾)置換,且反之亦然。
核苷酸修飾在表4中如下指示:m:2'-OMe;*:PS鍵聯;f:2'-氟;(invd):反向無鹼基;moe:2'-moe;e:ENA;d:去氧核糖核苷酸(亦請注意,T始終為去氧核糖核苷酸);x:UNA。在某些實施例中,在sgRNA經修飾序列中,各A、C、G、U及N獨立地為核糖(2'-OH)。在某些實施例中,各A、C、G、U及N為核糖(2'-OH)。因此,舉例而言,mA表示2'-O-甲基腺苷;xA表示具有腺嘌呤核鹼基的UNA核苷酸;eA表示具有腺嘌呤核鹼基的ENA核苷酸;且dA表示腺苷去氧核糖核苷酸。如本文所使用,(L1)係指具有約15至21個原子之橋連長度的內部連接子。
sgRNA名稱有時用緊接著G之後的一或多個前置零提供。此不影響名稱之含義。因此,舉例而言,G000282、G0282、G00282及G282係指相同sgRNA。類似地,crRNA及/或trRNA名稱有時分別用緊接著CR或TR之後的一或多個前置零提供,其不影響名稱之含義。因此,舉例而言,CR000100、CR00100、CR0100及CR100係指相同crRNA,且TR000200、TR00200、TR0200及TR200係指相同trRNA。
實例
提供以下實例以說明某些所揭示實施例且不應視為以任何方式限制本發明之範疇。
實例 1. 材料及方法 核酸酶 mRNA 之活體外轉錄 ( 「 IVT 」 )
含有N1-甲基假U之經封端且聚腺苷酸化之mRNA係使用常規方法藉由活體外轉錄產生。舉例而言,根據製造商之方案用XbaI使含有T7啟動子、用於轉錄之序列及聚腺苷酸化區之質體DNA線性化。藉由加熱使XbaI不活化。由酶及緩衝鹽純化經線性化質體。用於產生經修飾mRNA之IVT反應係藉由在37℃培育以下進行:50 ng/µL線性化質體;各2-5 mM之GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTP (Trilink);10-25 mM ARCA (Trilink);5 U/µL T7 RNA聚合酶;1 U/µL鼠類RNase抑制劑(NEB);0.004 U/µL無機大腸桿菌焦磷酸酶(NEB);及1×反應緩衝液。將TURBO DNA酶(Thermo Fisher)添加至0.01 U/µL之最終濃度,且將反應物在37℃培育以移除DNA模板。
根據製造商之方案使用MegaClear Transcription Clean-up套組(Thermo Fisher)或RNeasy Maxi套組(Qiagen)純化mRNA。或者,經由沈澱方案,在一些情況下接著基於HPLC之純化,來純化mRNA。簡言之,在DNase消化之後,使用LiCl沈澱、乙酸銨沈澱及乙酸鈉沈澱來純化mRNA。對於經HPLC純化之mRNA,在LiCl沈澱及復原之後,藉由RP-IP HPLC純化mRNA (參見例如Kariko等人, Nucleic Acids Research, 2011, 第39卷, 第21期el42)。合併選擇彙集之溶離份且藉由如上文所描述之乙酸鈉/乙醇沈澱去鹽。在另一替代方法中,mRNA用LiCl沈澱法純化,隨後藉由切向流過濾進一步純化。藉由量測260 nm處之吸光度(Nanodrop)測定RNA濃度,且藉由毛細電泳法用Bioanalyzer (Agilent)來分析轉錄物。
根據SEQ ID No: 661-665 (參見表4A中之序列),自編碼開放閱讀框架之質體DNA生成釀膿鏈球菌(「Spy」) Cas9 mRNA。當本段中引用的序列在下文中針對RNA提及時,應理解T應替換為U (其可為如上文所述之經修飾之核苷)。實例中所用之信使RNA包括5'帽及3'聚腺苷酸化序列,例如多至100 nt,且在表4A中鑑定。引導RNA藉由此項技術中已知之方法以化學合成。
由商業供應商或使用標準活體外合成技術用經修飾之核苷酸化學合成引導RNA。
肝細胞製備
如下製備原代小鼠肝細胞(PMH)、原代大鼠肝細胞(PRH)、原代人類肝細胞(PHH)及原代食蟹獼猴肝細胞(PCH)。將PMH (Gibco,MCM837,除非另外規定)、PRH (Gibco,Rs977,除非另外規定)、PCH (In Vitro ADMET Laboratories,10136011,除非另外規定)、PHH (Gibco,Hu8284,除非另外規定)解凍且再懸浮於50 mL冷凍保存肝細胞回收培養基(CHRM) (Invitrogen,CM7000)中,接著離心。細胞藉由以下接種補充劑再懸浮於肝細胞培養基中:具有FBS含量之威廉姆斯氏E培養基平板補充劑(Gibco,目錄號A13450)。細胞藉由離心粒化,再懸浮於培養基中,且以20,000個細胞/孔(對於PMH)及30,000個細胞/孔(對於PHH)之密度接種於經Bio-coat膠原蛋白I塗佈之96孔盤(Corning # 354407)上。使接種之細胞在37℃及5% CO
2氛圍下在組織培養恆溫箱中靜置且黏附4-6小時。在培育之後,檢查細胞之單層形成且洗滌一次,且用100 µL肝細胞維持培養基接種:威廉姆斯氏E培養基(Gibco,目錄號A12176-01)加上補充劑包(Gibco,目錄號CM3000)。
HEK 細胞製備
將HEK-293細胞(ATCC,CRL-1573,除非另外規定)解凍且再懸浮於具有10% FBS含量(Gibco #A31605-02)及1%青黴素-鏈黴素(Gibco #15070063)之無血清達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Corning #10-013-CV)中。細胞經計數且接種於96孔組織培養盤(Falcon,#353072)上具有10% FBS含量(Gibco #A31605-02)之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Corning #10-013-CV)中。使接種之細胞在37℃及5% CO
2氛圍下在組織培養恆溫箱中靜置且黏附18小時。
製備含有 sgRNA 及 Cas9 mRNA 之 LNP 調配物
一般而言,以各種莫耳比將脂質奈米粒子組分溶解於100%乙醇中。將RNA負荷(例如Cas9 mRNA及gRNA)溶解於25 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl (pH 5.0)中,產生大致0.45 mg/mL之RNA負荷濃度。所用LNP含有之可離子化脂質(十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯,亦稱為(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯) (本文中亦稱為脂質A)、膽固醇、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)及1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙二醇2000 (PEG2k-DMG)呈50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。所使用之LNP包含單一RNA物種,諸如Cas9 mRNA或sgRNA。用Cas9 mRNA及引導RNA之混合物類似地製備LNP。
使用交叉流技術,利用含脂質之乙醇與兩個體積之RNA溶液及一個體積之水的衝擊射流混合來製備LNP。首先,經由混合十字管使乙醇中之脂質與兩個體積之RNA溶液混合。接著,經由線內T形件將第四物料流與十字管之輸出流混合(參見WO2016010840,圖2)。將LNP在室溫下保持1小時且進一步用水稀釋(大致1:1 v/v)。將稀釋之LNP緩衝液交換至50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖,pH 7.5 (TSS)中,且按需要藉由此項技術中已知之方法濃縮。接著使用0.2 μm無菌過濾器過濾所得混合物。最終LNP經表徵以確定囊封效率、多分散性指數及平均粒度。將最終LNP儲存於4℃或-80℃下直至進一步使用。
sgRNA 及 Cas9 mRNA 脂質體轉染
使用預混合脂質調配物進行Cas9 mRNA及gRNA之脂質體轉染。脂質體轉染試劑含有可離子化脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG,莫耳比為50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG。將此混合物在100%乙醇中復原,接著以約6.0之脂質胺與RNA磷酸酯之莫耳比(N:P)與RNA (例如Cas9 mRNA及gRNA)混合。
次世代定序 ( 「 NGS 」 ) 及編輯效率分析
使用商業套組根據製造商之方案,例如QuickExtract™ DNA提取溶液(Lucigen,目錄號QE09050)提取基因體DNA。為了定量地測定基因體中之目標位置處之編輯效率,使用深度定序來鑑定藉由基因編輯引入之插入及缺失的存在。圍繞所關注基因(例如TRAC)內之目標位點設計PCR引子,且擴增所關注基因體區域。按本領域中之標準進行引子序列設計。
根據製造商之方案(Illumina)進行額外PCR以添加用於定序之化學物質。擴增子在Illumina MiSeq儀器上定序。在消除具有低品質評分之讀數之後,將讀數與人類參考基因體(例如,hg38)比對。將與所關注靶區重疊之讀段與局部基因體序列重新比對以改良該比對。接著計算野生型讀段之數目相對於含有C至T突變、C至A/G突變或插入/缺失之讀段之數目。在以所預測之Cas9裂解位點為中心的20 bp區中對插入及缺失進行評分。插入/缺失百分比定義為在20 bp評分區內插入或缺失一或多個鹼基之定序讀數之總數目除以定序讀數(包括野生型)之總數目。在包括20 bp sgRNA靶序列之上游10 bp及下游10 bp之40 bp區中對C至T突變或C至A/G突變進行評分。C至T編輯百分比定義為在40 bp區域內具有一或多個C至T突變之定序讀段之總數目除以定序讀段(包括野生型)之總數目。類似地計算C至A/G突變之百分比。
實例 2. 在人類胚胎腎 (HEK) 細胞中使用經截短 NmeCas9 引導物之活體外編輯
設計且測試靶向SEAP基因之經截短Nme-Cas9 sgRNA以評估各修飾對引導物功能之影響。保留其編輯功效之引導物中之修飾被認為具有良好耐受性,且包括於未來研究中。
實例 2.1 sgRNA 修飾模式之質體評估 HEK 細胞製備
將來自(Invivogen,目錄號hkb-il1b)之HEK-Blue
TM細胞,一種具有SEAP報導子體HEK報導體細胞株解凍且再懸浮於15 mL生長培養基(DMEM,4.5 g/l葡萄糖、2 mM L-麩醯胺酸、10% (v/v)胎牛血清(FBS)、50 U/ml青黴素、50 mg/ml鏈黴素、100 mg/ml Normocin™中,接著離心。丟棄上清液且將粒化細胞再懸浮於生長培養基中。細胞以10,000個細胞/孔之密度接種於96孔組織培養盤(Falcon,#353072)上,該培養盤具有測試培養基:DMEM、4.5 g/l葡萄糖、2 mM L-麩醯胺酸、10% (v/v)加熱不活化FBS (56℃下30分鐘)、50 U/ml青黴素、50 mg/ml鏈黴素、100 mg/ml Normocin™)。使接種之細胞在37℃及5% CO
2氛圍下在組織培養恆溫箱中靜置且黏附18小時。
基於質體之轉染
使用標準吉布森組裝(Gibson Assembly)方法設計及選殖與HEK-Blue
TM細胞之SEAP卡匣具有相同的23-nt互補性,但具有不同sgRNA骨架截短之NmeCas9 sgRNA截短變異體,以用於質體生成。將最終質體反應物接種於補充有安比西林(Teknova,L5104)之Luria培養液(LB)盤(Teknova,L8000)上,且在37℃下在組織培養恆溫箱中培育。將質體菌落接種於補充有100 μg/mL安比西林(Teknova,A2135)之4 ml Luria培養液盤(Teknova,L8000)中且在37℃下培育隔夜。根據製造商說明書使用Zyppy質體純化套組(Zymo Research,D4036)純化質體。
培育後,使用Qubit HS分析(Invitrogen,目錄號Q32851)來量測質體濃度且將其稀釋至50 ng/µL。將各sgRNA之質體DNA及編碼Nme1Cas9 (SEQ ID NO: 645)之pcDNA3.1轉染質體在Opti-MEM (Thermo Fisher,L3000015)中稀釋,且根據製造商說明書使用Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher,目錄號51985091)偵測陽離子脂質體-DNA複合物。簡言之,將脂染胺-DNA混合物在室溫下培育15分鐘。培育後,將10 µl混合物添加至HEK-Blue
TM細胞且在37℃及5% CO
2氛圍下在組織培養恆溫箱中培育72小時。轉染後,收集細胞。如實例1中所述地進行基因體DNA分離及NGS分析。
確定與SEAP基因座具有相同的23-nt互補性但具有不同sgRNA支架截短之未修飾sgRNA設計的編輯效率。分析在三輪迭代篩選中進行,以鑑定單獨或組合改變編輯效率之截短。使用相同的方案及對照質體(RNAWT-145)製備及分析細胞。各分析一式三份地包括樣品。具有標準差(SD)之平均編輯結果顯示於表5及圖1中。觀測到的相對較低水平之編輯效率可由編輯內源性人類SEAP基因以及工程化至HEK-Blue
TM細胞中之外源性SEAP表現卡匣的SEAP sgRNA產生。NGS引子經設計使得僅定量外源性SEAP基因座處之編輯事件。然而,在內源性基因座處進行編輯預計不會改變使用截短之SEAP sgRNA在外源性SEAP基因座處讀取之相對編輯水平。
表 5. HEK-Blue
TM 細胞 中之平均編輯百分比
實例 2.2. HEK-293 細胞中之 gRNA 化學修飾的評估
實驗 | 質體ID | 平均編輯% | SD |
第1輪 | RNAWT-145 | 6.8 | 0.3 |
RNA9-102 | 0.3 | 0.0 | |
RNA7-106 | 5.0 | 0.6 | |
RNA8-106 | 0.6 | 0.2 | |
RNA6-110 | 4.3 | 0.6 | |
RNA6b-110 | 0.4 | 0.0 | |
RNA5-112 | 0.4 | 0.1 | |
RNA4-116 | 0.6 | 0.3 | |
RNA3-122 | 1.9 | 0.1 | |
RNA2-126 | 6.6 | 0.3 | |
ES-100 | 4.6 | 1.7 | |
ES-121 | 5.0 | 0.8 | |
第2輪 | RNAWT-145 | 7.5 | 0.8 |
RNA17-101 | 3.7 | 0.5 | |
RNA18-103 | 4.4 | 0.4 | |
RNA15-105 | 0.1 | 0.0 | |
RNA16-105 | 4.2 | 0.2 | |
RNA13-107 | 4.1 | 0.4 | |
RNA14-109 | 6.4 | 0.5 | |
RNA12-111 | 8.3 | 0.8 | |
RNA11-113 | 6.9 | 1.0 | |
RNA10-115 | 10.2 | 0.6 | |
第3輪 | RNAWT-145 | 10.5 | 1.0 |
R10B-111 | 7.6 | 1.2 | |
R10E-109 | 8.7 | 1.2 | |
R10F-113 | 5.7 | 0.5 | |
R10G-113 | 4.6 | 0.6 | |
R10H-113 | 5.4 | 0.8 | |
R10I-113 | 4.4 | 1.1 | |
R10J-113 | 3.2 | 0.9 | |
R19-112 | 4.7 | 0.9 |
進一步評估上文所述之研究中測試之所選截短sgRNA之引導物修飾模式以評估修飾對引導物編輯效率的影響。自慢病毒表現構築體表現Nme2 Cas9之穩定細胞株(在本文中稱為HEK-Nme2)經工程化以用於組成性Nme2 Cas9表現。
HEK 細胞製備
HEK-293 (ATCC,CRL-1573)細胞在維持培養基(DMEM (Corning,#10-013-CV)、10% FBS (Gibco,#A31605-02))中解凍。接著將細胞以200,000個細胞/孔之細胞密度接種於6孔盤(Corning,#353046)中具有10% FBS含量(Gibco,#A31605-02)之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Corning #10-013-CV)中。在凝聚胺(密理博Sigma,TR-1003)存在下遵循製造商之方案用編碼Nme2 Cas9 (SEQ ID NO: 640)之Cellecta #SVCRU617-L慢病毒載體轉導細胞。
將細胞在37℃及5% CO
2氛圍下在組織培養恆溫箱中培育10天。隨後洗滌細胞,在細胞分選儀(Sony Biotechnologies,SH800Z)上進行處理且使用FlowJo套裝軟體來分析GFP發光。用2之MOI製備之所選HEK-Nme2細胞的多株混合物用於後續研究。
將上文所述之經轉導HEK-Nme2細胞解凍且再懸浮於具有10% FBS含量(Gibco #A31605-02)及1%青黴素-鏈黴素(Gibco #15070063)之無血清達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Corning #10-013-CV)中。細胞經計數且以20,000個細胞/孔之密度接種於96孔組織培養盤(Falcon,#353072)上具有10% FBS含量(Gibco #A31605-02)之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Corning #10-013-CV)中。使接種之細胞在37℃及5% CO
2氛圍下在組織培養恆溫箱中靜置且黏附18小時。
使用 MessengerMAX 之細胞轉染
在sgRNA之情況下測試由2'-O甲基(2'-OMe)及硫代磷酸酯(PS)修飾組成之引導物修飾模式以評估修飾對引導物編輯效率的影響。
藉由在1 µl 100 µM crRNA、1 µL 100 µM tracrRNA及8 µL雙螺旋緩衝液(Integrated DNA Technologies,#11-05-01-12)之混合物中將經修飾、截短tracrRNA黏接至靶向VEGFA上之兩個位點(T25或T47,WO2019094791中先前公佈之目標位點)中之一者的經修飾crRNA來產生截短之雙引導RNA (dgRNA)。Nme2-Cas9 tracrRNA及crRNA溶液在95℃下黏接3分鐘,接著以0.1C/s之增量溫度降低至20℃。將樣品保持在冰上直至使用。將初始濃度為10 μM之雙引導RNA在Opti-MEM (Thermo Fisher,#51985091)中稀釋至10 μL中250 nM之濃度,且根據製造商說明書與Lipofectamine MessengerMAX (Invitrogen,目錄號LMRNA001)混合。對於各濃度,將20 μL等份溶液添加至各組織培養孔中,且在37℃及5% CO
2氛圍下在組織培養恆溫箱中培育72小時。
培育後,分離基因體DNA且進行NGS分析,如上文所述。
如在實例1中對於含有表6中指示的16個黏接至crRNA (CR0#####)之截短tracrRNA (TR0#####)、靶向VEGFA基因中之兩個基因體位點(T25、T47)之dgRNA所述,以50 nM之dgRNA濃度評估編輯效率。分析中包括重複樣品。具有標準差(SD)之平均編輯結果顯示於表6及圖2中。
表 6. HEK-Nme2 細胞中之活體外編輯
實例 3. 用經化學修飾之 Nme2Cas9 sgRNA 進行活體外編輯 實例 3.1 HEK-Nme2 細胞中之經修飾 sgRNA 之評估
Tracr ID | VEGFA 位點1 (T25-CR018648) | VEGFA 位點2 (T47-CR018656) | ||
平均% 編輯 | SD | 平均% 編輯 | SD | |
TR018227 | 7.1 | 0.1 | 26.0 | 2.1 |
TR018228 | 8.6 | 0.2 | 28.4 | 8.7 |
TR018229 | 4.9 | 1.1 | 25.7 | 6.3 |
TR018230 | 2.1 | 0.1 | 23.7 | 1.5 |
TR018231 | 1.1 | 0.2 | 23.6 | 5.2 |
TR018232 | 2.4 | 0.8 | 30.3 | 4.3 |
TR018233 | 2.2 | 0.6 | 26.8 | 1.6 |
TR018234 | 0.0 | 0.0 | 32.6 | 2.4 |
TR018235 | 6.1 | 0.2 | 20.3 | 3.4 |
TR018236 | 8.0 | 0.6 | 30.8 | 3.3 |
TR018237 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.1 |
TR018238 | 5.5 | 0.0 | 32.6 | 2.3 |
TR018239 | 1.6 | 0.1 | 26.8 | 5.5 |
TR018240 | 1.0 | 0.2 | 9.4 | 2.5 |
TR018241 | 2.4 | 0.4 | 11.3 | 0.5 |
TR018242 | 2.4 | 0.4 | 34.3 | 2.2 |
在sgRNA之情況下測試由2'-O甲基(2'-OMe)及硫代磷酸酯(PS)修飾組成之引導物修飾模式以評估修飾對引導物編輯效率的影響。
HEK 細胞製備
如實例2中所述地製備HEK-Nme2細胞。細胞經計數且以30,000個細胞/孔之密度接種(Falcon,#353072)。如實例2.2中所述地轉染細胞。轉染後七十二小時,如實例1中所述地製備細胞用於NGS分析。
如實例2.2中所述,對43種靶向位點T47處之VEGFA基因之sgRNA的編輯效率進行了評估。在各分析中,用一式三份測試之樣品進行兩個單獨的實驗。兩個實驗中獲得之結果係類似的,因此來自單一實驗之具有標準差(SD)之平均編輯結果顯示於表7及圖3中。表中之「ND」表示由於實驗失敗而無法確定的值。
表 7. HEK-Nme2 細胞 中之平均編輯百分比
實例 3.2 HEK-293 細胞中之替代 sgRNA 修飾模式的評估
引導物ID | 平均% 編輯 | SD | 引導物ID | 平均% 編輯 | SD | 引導物ID | 平均% 編輯 | SD |
G020031 | 3.9 | 1.0 | G020046 | 28.1 | 5.1 | G020060 | 6.3 | 0.5 |
G020032 | 20.4 | 1.3 | G020047 | 12.6 | 3.0 | G020061 | 11.1 | 5.8 |
G020033 | 1.1 | 0.0 | G020048 | 13.5 | 4.2 | G020062 | 4.2 | 2.0 |
G020034 | 15.5 | 1.4 | G020049 | 1.1 | 0.1 | G020063 | ND | ND |
G020035 | 1.4 | 0.2 | G020050 | 11.1 | 1.7 | G020064 | 25.7 | 2.9 |
G020036 | 14.4 | 2.3 | G020051 | 12.9 | 3.3 | G020065 | ND | ND |
G020037 | 13.8 | 0.9 | G020052 | 5.8 | 1.3 | G020066 | 37.5 | 4.4 |
G020038 | 5.9 | 1.8 | G020053 | 20.0 | 4.2 | G020067 | 39.0 | 5.5 |
G020039 | 20.0 | 5.0 | G020054 | 46.6 | 8.2 | G020068 | 54.3 | 2.5 |
G020040 | 47.2 | 5.0 | G020055 | 34.7 | 2.2 | G020069 | 28.2 | 3.8 |
G020041 | 45.3 | 5.5 | G020056 | 17.6 | 2.9 | G020070 | 1.5 | 0.4 |
G020042 | 54.3 | 5.1 | G020057 | 9.5 | 3.3 | G020071 | 43.3 | 5.5 |
G020043 | 42.7 | 11.3 | G020058 | 14.3 | 2.0 | G020072 | 48.3 | 2.6 |
G020044 | 54.5 | 0.5 | G020059 | 6.6 | 3.7 | G020073 | 61.5 | 1.2 |
G020045 | 5.7 | 3.9 |
在HEK-293細胞(ATCC,CRL-1573)中測試具有替代修飾模式之額外Nme2 sgRNA以評估額外化學修飾對引導物編輯效率的影響。如實例1中所述製備及轉染細胞,以50 nM之最終濃度遞送100 ng Nme2 mRNA及sgRNA。以15,000個細胞/孔之密度接種細胞。轉染後七十二小時,分離基因體DNA且經由NGS進行分析,如實例1中所述。
評估如上所提供之54種靶向位點T47處之VEGFA基因之經化學修飾之sgRNA的編輯效率。在各分析中測試一式三份樣品。具有標準差(SD)之平均編輯結果顯示於表8及圖4中。
表 8. HEK-293 細胞 中之平均編輯百分比
實例 4. 在原代小鼠肝細胞 (PMH) 中使用所選引導物進行活體外編輯
引導物ID | 平均編輯% | SD | 引導物ID | 平均編輯% | SD | 引導物ID | 平均編輯% | SD |
G020044 | 76.2 | 3.9 | G020721 | 76.1 | 5.9 | G020739 | 84.8 | 0.4 |
G020054 | 78.1 | 9.4 | G020722 | 76.2 | 5.7 | G020740 | 78.9 | 3.7 |
G020057 | 47.3 | 5.8 | G020723 | 73.3 | 5.1 | G020741 | 66.6 | 2.5 |
G020058 | 32.8 | 7.1 | G020724 | 73.7 | 2.5 | G020742 | 82.4 | 2.4 |
G020063 | 54.1 | 2.7 | G020725 | 82.4 | 2.9 | G020743 | 80.9 | 3.1 |
G020065 | 72.2 | 0.2 | G020726 | 72.2 | 1.2 | G020744 | 79.0 | 5.0 |
G020070 | 9.3 | 0.3 | G020727 | 79.3 | 0.8 | G020745 | 79.7 | 1.9 |
G020073 | 75.5 | 0.6 | G020728 | 85.3 | 5.3 | G020746 | 85.5 | 4.3 |
G020711 | 34.7 | 8.6 | G020729 | 76.9 | 0.5 | G020747 | 21.9 | 3.4 |
G020712 | 39.9 | 3.3 | G020730 | 80.6 | 2.4 | G020748 | 84.2 | 2.0 |
G020713 | 47.2 | 3.6 | G020731 | 81.4 | 1.8 | G020749 | 75.7 | 1.2 |
G020714 | 60.7 | 7.7 | G020732 | 80.7 | 1.0 | G020750 | 75.2 | 2.5 |
G020715 | 69.0 | 1.9 | G020733 | 78.7 | 4.6 | G020751 | 72.0 | 5.4 |
G020716 | 62.2 | 9.5 | G020734 | 77.3 | 6.3 | G020752 | 78.4 | 2.7 |
G020717 | 75.9 | 2.2 | G020735 | 80.6 | 2.8 | G020753 | 77.3 | 10.2 |
G020718 | 81.3 | 1.4 | G020736 | 78.5 | 2.7 | G020754 | 80.7 | 1.1 |
G020719 | 74.3 | 6.4 | G020737 | 70.4 | 4.6 | G020755 | 73.6 | 2.0 |
G020720 | 73.0 | 3.4 | G020738 | 73.7 | 5.6 | G020756 | 76.5 | 4.0 |
進行經修飾之sgRNA篩選以評估靶向小鼠TTR基因內之不同位點之95種不同sgRNA的編輯效率。基於該研究,選擇兩個sgRNA (G021320及G021256)用於劑量反應分析中之評估。將此兩個測試引導物與具有20個核苷酸引導序列之小鼠TTR SpyCas9引導物(G000502)進行比較。靶向小鼠TTR基因之所測試NmeCas9 sgRNA包括如下之24個核苷酸的引導序列(如由N表示)及引導骨架:mN*mNNNNNNNNmNNNmNNNNNNNNNNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU (SEQ ID NO: 4),其中除非另外規定,否則A、C、G、U及N分別為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶及任何核糖核苷酸。m指示2'O-甲基修飾,且*指示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。引導物之未經修飾及經修飾之型式提供於表1-2中。
如下所述,將引導物及Cas9 mRNA脂質體轉染至原代小鼠肝細胞(PMH)中。如實例1中所述來製備PMH (In Vitro ADMET Laboratories MCM114)。如實例1中所述地進行脂質體轉染,具有sgRNA及mRNA之劑量反應。簡言之,將細胞在37℃、5% CO
2下培育24小時,之後用脂複合體處理。將脂複合體在37℃下在含有10%胎牛血清(FBS)之維持培養基中培育10分鐘。培育後,在以300 ng Cas9 mRNA及50 nM sgRNA之最大劑量開始之8點、3倍劑量反應分析中將脂複合體添加至小鼠肝細胞中。在各條件下,信使RNA劑量與gRNA劑量成比例,儘管表9中僅列出gRNA劑量。細胞在處理後72小時溶解,且如實例1中所述地進行NGS分析。
在一式三份樣品中進行編輯效率對引導物濃度之劑量反應。表9展示在各引導物濃度及所計算EC
50值下之平均編輯百分比及標準差(SD)。平均值及標準差(SD)繪示於圖5中。
表 9. 原代小鼠肝細胞中之平均編輯百分比
實例 5. 使用稀釋曲線在原代小鼠肝細胞 (PMH) 中進行活體外編輯 實例 5.1. 使用稀釋系列進行經修飾 sgRNA 評估
樣品 | EC 50(nM) | SgRNA (nM) | 平均編輯% | SD |
SpyCas9 mRNA + G000502 | 22.0 | 50 | 95.7 | 0.3 |
16.7 | 40.9 | 14.8 | ||
5.6 | 6.4 | 3.3 | ||
1.9 | 0.8 | 0.3 | ||
0.6 | 0.2 | 0.08 | ||
0.2 | 0.1 | 0 | ||
0.1 | 0.1 | 0 | ||
0 | 0.1 | 0 | ||
Nme2 Cas9 mRNA Q (SEQ ID NO: 635) + G021320 | 18.7 | 50 | 86.5 | 0.9 |
16.7 | 41.8 | 2.1 | ||
5.6 | 5.8 | 1.4 | ||
1.9 | 1.2 | 0.3 | ||
0.6 | 0.4 | 0.2 | ||
0.2 | 0.1 | 0.1 | ||
0.1 | 0.1 | 0 | ||
0 | 0.1 | 0 | ||
Nme2 Cas9 mRNA Q (SEQ ID NO: 635) + G021256 | 20.9 | 50 | 92.3 | 0.5 |
16.7 | 35.1 | 2 | ||
5.6 | 2.6 | 0.5 | ||
1.9 | 0.6 | 0.4 | ||
0.6 | 0.1 | 0 | ||
0.2 | 0.1 | 0 | ||
0.1 | 0.1 | 0 | ||
0 | 0.1 | 0 |
如表1-2中所示地設計具有各種骨架結構之經修飾sgRNA,其全部靶向小鼠pcsk9基因中先前公佈之位點(參見WO2019094791),且使用原代小鼠肝細胞(PMH)測試編輯效率。使用PMH細胞(In Vitro ADMET Laboratories)如實例1中所述地製備細胞且以20,000個細胞/孔之密度接種。根據製造商之方案使用MessengerMax (Invitrogen)以1 ng/µl Nme2 Cas9 mRNA (mRNA U)及表10中所指示濃度之sgRNA轉染細胞。分析中包括重複樣品。在轉染後72小時收集細胞且藉由NGS進行分析,如實例1中所述。具有標準差之平均編輯百分比展示於表10及圖6中。
表 10. PMH 中之平均編輯百分比
實例 5.2. mRNA poly-A 尾修飾及負荷比率之評估
引導物濃度(nM) | G017564 | G017565 | G017566 | |||
平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | |
50.0 | 25.7 | 3.2 | 25.6 | 4.9 | 27.7 | 0.4 |
25.0 | 27.8 | 1.4 | 20.0 | 1.7 | 26.4 | 4.7 |
12.5 | 15.3 | 1.7 | 12.9 | 0.8 | 18.2 | 1.7 |
6.3 | 10.6 | 0.6 | 8.7 | 0.9 | 12.6 | 0.9 |
3.1 | 5.3 | 0.2 | 3.6 | 0.3 | 6.7 | 0.7 |
1.6 | 5.0 | 1.1 | 3.6 | 0.6 | 4.8 | 0.2 |
0.8 | 1.3 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 2.8 | 0.3 |
0.4 | 0.8 | 0.3 | 0.5 | 0.1 | 1.8 | 0.1 |
0.2 | 0.3 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.7 | 0.1 |
0.1 | 0.1 | 0.0 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | 0.1 |
0.0 | 0.1 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.3 | 0.1 |
靶向小鼠pcsk9基因之sgRNA選自表10以評估由poly-A尾修飾及sgRNA:mRNA比率之特定組合產生的引導物編輯效率。除非另外指出,否則如實例1中所述地製備、處理及分析所用PMH細胞。以15,000個細胞/孔之密度接種PMH (Gibco)。
LNP一般如實例1所述來製備。LNP以50/9/38/3之脂質組成製備,分別表示為可離子化脂質A/膽固醇/DSPC/PEG之莫耳比。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。LNP囊封gRNA G017566或編碼相同Nme2Cas9開放閱讀框架(ORF)但具有不同經編碼poly-A尾之三種mRNA中之一者,如表11中所指示。保持sgRNA施加恆定且改變mRNA施加量之初步實驗表明,按重量計1:1之sgRNA:mRNA比率產生最高編輯百分比。在當前實例中,將增加劑量之mRNA LNP及gRNA LNP施加至如表11中所述之100 µl培養基中之細胞,維持按重量計1:1之sgRNA:mRNA比率。表11及圖7顯示平均編輯百分比及標準差(SD)。
表 11. PMH 中之平均編輯百分比
實例 5.3. 使用 LNP 之 相對於 sgRNA 或 pgRNA 之 sgRNA:mRNA 比率
總RNA (ng) | mRNA CSEQ ID NO: 622 | mRNA B SEQ ID NO:621 | mRNA D SEQ ID NO: 623 | |||
平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | 平均編輯% | N | |
333. | 49.1 | 0.9 | 44.3 | 0.0 | 39.6 | 1 |
111. | 37.5 | 3.2 | 43.4 | 0.2 | 30.3 | 1 |
37. | 12.8 | 0.2 | 15.6 | 1.0 | 9.3 | 1 |
12.3 | 1.3 | 0.2 | 2.2 | 0.0 | 1.1 | 1 |
4.1 | 0.1 | 0.0 | 0.2 | 0.0 | 0.0 | 1 |
1.4 | 0.1 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 1 |
0.5 | 0.1 | 0.0 | 0.1 | 0.1 | 0.0 | 1 |
進行研究以評估含有PEG連接子之sgRNA設計(pgRNA)之編輯效率。該研究比較兩種具有相同引導序列的靶向TTR之gRNA,其中一種在引導物之恆定區中包括三個PEG連接子(pgRNA,G021846),且一種不包括(G021845),如表12中所示。引導物及mRNA調配於單獨的LNP中且混合至所要比率,以經由脂質奈米粒子(LNP)遞送至原代小鼠肝細胞(PMH)。
除非另外指出,否則如實例1中所述地製備、處理及分析PMH細胞。來自In Vitro ADMET Laboratories之PMH細胞(批號MCM114)以15,000個細胞/孔之密度接種。如下文所描述用LNP處理細胞。LNP一般如實例1所述來製備。LNP以50/9/38/3之脂質組成製備,分別表示為可離子化脂質A/膽固醇/DSPC/PEG之莫耳比。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。LNP囊封單一RNA物種,gRNA G021845、gRNA G021846或mRNA (mRNA M;SEQ ID NO: 631),如實例1中所述。
用不同量的按RNA負荷之重量計1:4、1:2、1:1、2:1、4:1或8:1之gRNA與mRNA比率的LNP來處理PMH細胞。各分析中包括重複樣品。以1 ng/μL總RNA濃度起始之8點3倍劑量反應曲線分析引導物,如表12中所示。平均編輯百分比結果展示於表12中。圖8A展示sgRNA G021845之平均編輯百分比,且圖8B展示sgRNA G021846之平均編輯百分比。表中之「ND」表示由於實驗失敗而無法偵測到的值。
表 12. PMH 中之平均編輯百分比
實例 5.4 使用 LNP 在 PMH 中 經修飾之聚乙二醇化引導物 (pgRNA) 之活體外編輯 分析具有小鼠 TTR 基因中之相同靶向位點的經修飾 pgRNA 以評估 PMH 細胞中之編輯效率。
負荷比(gRNA:mRNA) | LNP 劑量(ng/uL) | sgRNA (G021845) | pgRNA (G021846) | ||
平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | ||
1:4 | 1 | 88.1 | 1.7 | ND | ND |
0.3 | 68.7 | 5.7 | 78 | 0.3 | |
0.1 | 28.1 | 4.1 | 39.8 | 8.2 | |
0.03 | 8.7 | 2 | 5.1 | 0 | |
0.01 | 1.5 | 0.4 | 4 | 1.2 | |
0.004 | 0.6 | 0.5 | 0.2 | 0 | |
0.001 | 0.3 | 0.2 | 0.6 | 0.3 | |
1:2 | 1 | 90.6 | 0 | 91.2 | 2.9 |
0.3 | 78 | 2.4 | 85.6 | 1.4 | |
0.1 | 41.5 | 5.8 | 56.6 | 4.4 | |
0.03 | 23 | 5.4 | 17.5 | 0 | |
0.01 | 6.1 | 4.3 | 18.6 | 0.5 | |
0.004 | 0.1 | 0.1 | 3.4 | 1.7 | |
0.001 | 0.1 | 0 | 2.4 | 0.7 | |
1:1 | 1 | 90.9 | 1.4 | 94.7 | 0.6 |
0.3 | 71.8 | 4.2 | 84.7 | 0.9 | |
0.1 | 45.7 | 3.2 | 64.3 | 5.3 | |
0.03 | 27.4 | 1 | 44.8 | 11.5 | |
0.01 | 4.7 | 2.5 | 10.2 | 4.3 | |
0.004 | 0.2 | 0 | 1.7 | 0.7 | |
0.001 | 0.1 | 0 | 0.7 | 0.5 | |
2:1 | 1 | 92.4 | 1.6 | 94.5 | 0.8 |
0.3 | 80 | 1.3 | 85.7 | 0.2 | |
0.1 | 45.4 | 0 | 68 | 7.9 | |
0.03 | 47.2 | 3 | 49.3 | 0 | |
0.01 | 18.1 | 1.8 | 28.8 | 4.1 | |
0.004 | 0.8 | 0.7 | 3.8 | 2.4 | |
0.001 | 0.2 | 0.1 | 0.8 | 0.3 | |
4:1 | 1 | 87.9 | 1.9 | 90.1 | 0 |
0.3 | 80.2 | 2.2 | 84 | 0.1 | |
0.1 | 43.4 | 0 | 60.4 | 0.1 | |
0.03 | 46.2 | 0.5 | 46.1 | 0 | |
0.01 | 11.3 | 2.3 | 26.7 | 4.9 | |
0.004 | 0.4 | 0.2 | 1.5 | 0.4 | |
0.001 | 0.4 | 0.1 | 0.5 | 0.3 | |
8:1 | 1 | 89.2 | 0 | 87.5 | 0 |
0.3 | 76.7 | 3.9 | 78.6 | 3.1 | |
0.1 | 59.5 | 9.4 | 59.4 | 1.1 | |
0.03 | 36.4 | 7 | 45.3 | 0.5 | |
0.01 | 8.2 | 1.2 | 18.7 | 2.9 | |
0.004 | 0.6 | 0.6 | 2.6 | 0.3 | |
0.001 | 0.1 | 0 | 0.6 | 0.2 |
除非另外指出,否則如實例1中所述地製備、處理及分析PMH細胞。來自In Vitro ADMET Laboratories之PMH細胞(批號MC148)以15,000個細胞/孔之密度接種。LNP調配物如實例1中所述地製備。LNP以50/9/38/3之脂質組成製備,分別表示為可離子化脂質A/膽固醇/DSPC/PEG之莫耳比。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比且用表I中所指示之gRNA或用mRNA來調配LNP。
用按重量計30 ng總mRNA (mRNA P)之LNP及表13中所指示之量的gRNA之LNP來處理100 µl培養基中之PMH。一式兩份地操作樣品。PMH之平均編輯結果展示於表13及圖9中。
表 13. PMH 中之平均編輯百分比
實例 6. 化學修飾篩選 實例 6.1. HEK-293 細胞中之化學修飾篩選
引導物ID | LNP sgRNA (ng/µL) | 平均編輯% | SD | 引導物ID | LNP sgRNA (ng/µL) | 平均編輯% | SD |
G021844 | 0.7 | 96.6 | 0.5 | G023416 | 0.7 | 91.5 | 1.8 |
0.23 | 95.0 | 0.5 | 0.23 | 84.8 | 0.1 | ||
0.08 | 80.0 | 5.9 | 0.08 | 56.4 | 2.7 | ||
0.03 | 51.9 | 1.9 | 0.03 | 28.2 | 3.6 | ||
0.009 | 13.9 | 0.4 | 0.009 | 10.0 | 1.7 | ||
0.003 | 4.6 | 0.9 | 0.003 | 3.2 | 0.0 | ||
0.001 | 0.8 | 0.1 | 0.001 | 0.8 | 0.3 | ||
0.0003 | 0.2 | 0.1 | 0.0003 | 0.2 | 0.0 | ||
0.0001 | 0.1 | 0.0 | 0.0001 | 0.1 | 0.0 | ||
0.00004 | 0.2 | 0.1 | 0.00004 | 0.1 | 0.0 | ||
0.00001 | 0.1 | 0.0 | 0.00001 | 0.1 | 0.0 | ||
0 | 0.1 | 0.0 | 0 | 0.1 | 0.0 | ||
G023413 | 0.7 | 96.4 | 0.4 | G023417 | 0.7 | 90.5 | 1.8 |
0.23 | 92.5 | 0.7 | 0.23 | 71.6 | 0.2 | ||
0.08 | 73.9 | 0.9 | 0.08 | 30.9 | 6.7 | ||
0.03 | 36.4 | 2.6 | 0.03 | 12.8 | 1.3 | ||
0.009 | 10.3 | 1.5 | 0.009 | 4.8 | 1.5 | ||
0.003 | 2.4 | 0.7 | 0.003 | 0.4 | 0.4 | ||
0.001 | 0.6 | 0.1 | 0.001 | 0.2 | 0.1 | ||
0.0003 | 0.3 | 0.0 | 0.0003 | 0.1 | 0.0 | ||
0.0001 | 0.1 | 0.0 | 0.0001 | 0.1 | 0.1 | ||
0.00004 | 0.1 | 0.0 | 0.00004 | 0.1 | 0.0 | ||
0.00001 | 0.1 | 0.0 | 0.00001 | 0.1 | 0.0 | ||
0 | 0.1 | 0.0 | 0 | 0.1 | 0.0 | ||
G023414 | 0.7 | 96.5 | 0.2 | G023418 | 0.7 | 96.8 | 0.3 |
0.23 | 92.7 | 0.4 | 0.23 | 90.8 | 1.7 | ||
0.08 | 74.1 | 2.7 | 0.08 | 63.3 | 1.8 | ||
0.03 | 45.7 | 1.5 | 0.03 | 27.7 | 2.4 | ||
0.009 | 13.7 | 0.7 | 0.009 | 8.8 | 0.5 | ||
0.003 | 4.3 | 1.3 | 0.003 | 1.9 | 0.6 | ||
0.001 | 0.7 | 0.1 | 0.001 | 0.7 | 0.2 | ||
0.0003 | 0.2 | 0.0 | 0.0003 | 0.2 | 0.1 | ||
0.0001 | 0.2 | 0.1 | 0.0001 | 0.1 | 0.0 | ||
0.00004 | 0.2 | 0.1 | 0.00004 | 0.1 | 0.0 | ||
0.00001 | 0.1 | 0.0 | 0.00001 | 0.1 | 0.0 | ||
0 | 0.1 | 0.0 | 0 | 0.2 | 0.1 | ||
G023415 | 0.7 | 96.5 | 0.5 | G023419 | 0.7 | 96.6 | 0.6 |
0.23 | 92.6 | 0.7 | 0.23 | 93.4 | 1.3 | ||
0.08 | 73.1 | 0.2 | 0.08 | 71.1 | 3.3 | ||
0.03 | 34.4 | 0.8 | 0.03 | 29.0 | 4.6 | ||
0.009 | 14.2 | 0.2 | 0.009 | 9.7 | 4.1 | ||
0.003 | 3.9 | 0.4 | 0.003 | 2.3 | 0.5 | ||
0.001 | 0.5 | 0.2 | 0.001 | 0.4 | 0.0 | ||
0.0003 | 0.2 | 0.0 | 0.0003 | 0.1 | 0.0 | ||
0.0001 | 0.2 | 0.0 | 0.0001 | 0.2 | 0.0 | ||
0.00004 | 0.1 | 0.0 | 0.00004 | 0.2 | 0.0 | ||
0.00001 | 0.1 | 0.0 | 0.00001 | 0.1 | 0.0 | ||
0 | 0.1 | 0.0 | 0 | 0.1 | 0.0 |
確定靶向兩個不同VEGFA目標位點(TS-25,TS-47)之經化學修飾之crRNA的編輯效率。各dgRNA含有經化學修飾之crRNA及tracRNA之組合。化學修飾包括crRNA及tracrRNA兩者之5'及3'端處對鹼基之硫代磷酸酯(PS)或2'-O'甲基(2'-OMe)修飾(EndMod)。
如實例2中所描述製備HEK-Nme2細胞,除了在此研究中使用MOI為0.8之細胞。細胞以10,000個細胞/孔之密度接種。接著經由實例2.2中所述之MessengerMax方案以25 nM dgRNA之最終濃度用雙引導RNA轉染細胞。分析中包括重複樣品。72小時後,自細胞提取基因體DNA (gDNA)且準備用於NGS分析,如實例1中所述。使用GraphPad Prism軟體(第9版)評估NGS分析結果。平均編輯百分比展示於表14及圖10A-圖10B中。
表14. crRNA及tracrRNA之不同組合的平均編輯百分比
TracrRNA ID | 位點TS-25 | 位點TS-47 | ||||
crRNA ID | 平均編輯% | SD | crRNA ID | 平均編輯% | SD | |
TR018617 | CR017872 UnMod | 4.20 | 2.20 | CR018650 UnMod | 3.25 | 0.25 |
TR018618 | 3.05 | 1.05 | 6.90 | 1.50 | ||
TR018619 | 0.75 | 0.25 | 8.55 | 2.15 | ||
TR018620 | 0.10 | 0.00 | 1.95 | 0.05 | ||
TR018621 | 0.25 | 0.05 | 3.80 | 1.50 | ||
TR018622 | 0.10 | 0.00 | 1.15 | 0.75 | ||
TR018617 | CR017873 EndMod | 3.80 | 2.30 | CR018651 EndMod | 7.70 | 0.10 |
TR018618 | 17.30 | 5.00 | 26.70 | 3.60 | ||
TR018619 | 9.00 | 2.90 | 20.85 | 4.25 | ||
TR018620 | 3.05 | 0.45 | 13.15 | 3.85 | ||
TR018621 | 9.40 | 2.30 | 18.35 | 3.55 | ||
TR018622 | 0.50 | 0.20 | 1.20 | 0.40 | ||
TR018617 | CR018473 RaMod | 4.95 | 1.75 | CR018652 RaMod | 9.10 | 2.90 |
TR018618 | 18.85 | 4.15 | 27.50 | 5.40 | ||
TR018619 | 18.00 | 2.50 | 28.45 | 3.05 | ||
TR018620 | 3.15 | 0.25 | 8.60 | 3.60 | ||
TR018621 | 15.15 | 1.25 | 19.60 | 3.00 | ||
TR018622 | 0.30 | 0.10 | 1.40 | 0.10 | ||
TR018617 | CR018645 RA-maxPS | 3.35 | 1.55 | CR018653 RA-maxPS | 2.80 | 0.40 |
TR018618 | 15.60 | 4.80 | 12.35 | 0.85 | ||
TR018619 | 12.75 | 1.95 | 25.95 | 1.35 | ||
TR018620 | 2.30 | 0.50 | 5.75 | 1.45 | ||
TR018621 | 9.40 | 0.00 | 10.95 | 2.55 | ||
TR018622 | 0.15 | 0.05 | 0.70 | 0.70 | ||
TR018617 | CR018646 maxPS | 5.20 | 1.90 | CR018654 maxPS | 4.30 | 1.70 |
TR018618 | 15.75 | 3.85 | 1.70 | 0.10 | ||
TR018619 | 9.50 | 0.90 | 21.30 | 1.70 | ||
TR018620 | 2.20 | 0.00 | 6.60 | 2.60 | ||
TR018621 | 9.55 | 1.05 | 9.15 | 4.65 | ||
TR018622 | 0.15 | 0.05 | 2.55 | 1.15 | ||
TR018617 | CR018647 Target- 2'-OMe | 4.65 | 1.75 | CR018655 Target- 2'-OMe | 5.00 | 0.80 |
TR018618 | 12.15 | 4.25 | 26.85 | 2.25 | ||
TR018619 | 8.05 | 1.45 | 26.30 | 1.00 | ||
TR018620 | 4.00 | 0.40 | 9.55 | 0.95 | ||
TR018621 | 9.70 | 1.50 | 15.65 | 2.85 | ||
TR018622 | 0.10 | 0.00 | 1.25 | 0.25 | ||
TR018617 | CR018648 Max-2'-OMe | 7.00 | 3.10 | CR018656 Max-2'-OMe | 10.50 | 0.50 |
TR018618 | 23.40 | 8.00 | 21.10 | 1.90 | ||
TR018619 | 11.70 | 4.30 | 25.05 | 0.65 | ||
TR018620 | 3.30 | 0.00 | 13.90 | 0.90 | ||
TR018621 | 13.30 | 2.20 | 23.60 | 0.70 | ||
TR018622 | 0.20 | 0.00 | 1.25 | 0.45 | ||
TR018617 | CR018649 Max-2'-OMe | 1.55 | 0.05 | CR018657 Max-2'-OMe | 6.55 | 0.15 |
TR018618 | 14.60 | 4.10 | 11.65 | 0.65 | ||
TR018619 | 4.35 | 1.25 | 29.05 | 2.35 | ||
TR018620 | 1.25 | 0.15 | 9.40 | 1.80 | ||
TR018621 | 10.85 | 3.55 | 20.45 | 6.65 | ||
TR018622 | 0.10 | 0.00 | 1.70 | 0.10 |
測試經化學修飾之crRNA及tracrRNA之額外組合以評估編輯效率。確定了靶向VEGFA基因內之前述TS47位點之經化學修飾dgRNA的編輯效率。各dgRNA含有經化學修飾之crRNA及tracrRNA之組合。如實例2中所述地獲得及製備HEK-Nme2細胞。細胞(MOI=2)以10,000個細胞/孔之密度接種。接著經由先前在實例2.2中所述之MessengerMax方案以25 nM dgRNA之最終濃度用雙引導RNA轉染細胞。分析中包括重複樣品。72小時後,自細胞提取gDNA,準備用於NGS分析,且分析NGS結果,如上文及實例1中所述。平均編輯百分比顯示於表15及圖11中。
表15. 經修飾crRNA及tracrRNA之平均編輯百分比
實例6.2 PMH中之引導序列化學修飾的評估
tracrRNA ID | CR018473 | CR018474 | CR018475 | CR018476 | ||||
平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | |
TR018477 | 20.5 | 0.1 | 32.8 | 1.9 | 14.2 | 4.1 | 22.2 | 2.1 |
TR018478 | 5.8 | 1.3 | 25.6 | 4.0 | 6.1 | 0.2 | 14.2 | 0.3 |
TR018479 | 35.7 | 2.3 | 37.9 | 2.7 | 19.9 | 1.7 | 15.4 | 0.6 |
TR018480 | 37.4 | 0.4 | 29.7 | 0.5 | 20.2 | 1.3 | 1.2 | 0.3 |
TR018481 | 24.9 | 1.0 | 29.9 | 0.1 | 1.9 | 0.2 | 23.6 | 0.7 |
TR018482 | 0.3 | 0.1 | 0.5 | 0.1 | 0.9 | 0.3 | 0.8 | 0.1 |
TR018483 | 30.3 | 1.4 | 31.8 | 1.7 | 16.9 | 0.4 | 21.1 | 3.1 |
TR018484 | 16.2 | 1.8 | 18.2 | 1.2 | 17.9 | 1.1 | 23.2 | 3.0 |
TR018485 | 26.1 | 0.2 | 6.6 | 1.3 | 1.5 | 0.4 | 5.9 | 1.1 |
TR018486 | 32.0 | 4.8 | 17.9 | 0.8 | 2.8 | 0.1 | 15.7 | 0.3 |
TR018487 | 8.0 | 1.6 | 30.1 | 1.0 | 12.2 | 0.0 | 21.8 | 0.7 |
TR018488 | 36.2 | 0.8 | 25.1 | 1.2 | 21.0 | 1.0 | 31.0 | 0.3 |
TR018489 | 34.9 | 0.4 | 20.1 | 1.6 | 19.5 | 0.5 | 29.4 | 1.3 |
TR018490 | 21.9 | 0.3 | 28.5 | 0.3 | 10.2 | 1.6 | 13.8 | 1.4 |
TR018491 | 24.7 | 1.2 | 28.3 | 1.4 | 19.6 | 1.4 | 26.1 | 0.0 |
TR018492 | 13.6 | 1.5 | 18.3 | 0.3 | 12.4 | 3.0 | 18.7 | 1.9 |
TR018493 | 19.9 | 0.8 | 8.4 | 2.0 | 9.6 | 1.9 | 22.7 | 3.2 |
TR018494 | 1.1 | 0.9 | 0.4 | 0.2 | 0.3 | 0.2 | 0.3 | 0.1 |
TR018495 | 19.4 | 1.6 | 27.8 | 0.7 | 1.4 | 0.7 | 1.9 | 0.3 |
TR018496 | 38.7 | 0.9 | 35.5 | 1.0 | 13.3 | 1.7 | 32.9 | 1.7 |
TR018497 | 27.5 | 1.1 | 16.6 | 0.5 | 13.1 | 0.2 | 23.0 | 0.7 |
TR018498 | 28.0 | 1.2 | 38.1 | 1.0 | 18.6 | 2.9 | 24.9 | 1.7 |
TR018499 | 33.9 | 0.1 | 36.4 | 0.5 | 26.6 | 0.9 | 37.8 | 1.2 |
TR018500 | 0.7 | 0.5 | 0.5 | 0.2 | 3.1 | 0.7 | 4.7 | 1.3 |
測試在引導序列中具有化學修飾之聚乙二醇化引導RNA (pgRNA)在PMH中之兩個不同小鼠TTR區(外顯子1及外顯子3)處的編輯功效。如實例1中所述來製備PMH (In Vitro ADMET Laboratories)。如表16中所示之Nme2 Cas9 mRNA (mRNA O SEQ ID NO:633)及靶向小鼠TTR中之兩個不同基因座之gRNA的脂質體轉染使用了如實例1中所述之預混合脂質組合物。使用具有100 ng/100 μl之Nme2 mRNA且具有表16中所指示濃度之gRNA的脂質複合體來處理細胞。將細胞在維持培養基 + 10% FBS (Corning #35-010-CF)中在37℃下培育72小時。培育後,分離基因體DNA且進行NGS分析,如實例1中所描述。
測定三種gRNA濃度(3 nM、8 nM或25 nM)下各種引導物修飾模式之編輯效率。分析中包括重複樣品。具有N79 pgRNA設計之測試引導物(G023066或G023067)之平均編輯結果展示於表16及圖12A至圖12B中,該設計在gRNA之目標結合區中之指定核苷酸位置處缺少2'-OMe。表17及圖12C至圖12D展示具有末端修飾pgRNA設計之測試引導物(G023070或G023104)之平均編輯百分比,該等設計在gRNA之目標結合區中之指定核苷酸位置處具有額外2'-OMe修飾。表中之「ND」表示由於實驗失敗而無法偵測到的值。
表16. 引導序列中之指定位置處缺少2'-OMe修飾的N79 pgRNA之平均編輯百分比。
ND = 由於技術失敗未報告資料。
表17. pgRNA之目標結合區中之指定位置處具有額外2'-OMe修飾的末端修飾pgRNA之平均編輯百分比。
ND = 由於技術失敗未報告資料。
實例 7. 在 HepG2 細胞中使用 Nme2- 鹼基編輯劑及化學修飾之 sgRNA 進行鹼基編輯
基因座 | 引導序列修飾 | 引導物 | gRNAN 濃度 | |||||
3 nM | 8 nM | 25 nM | ||||||
平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | |||
外顯子-1 | 高修飾pgRNA | G023067 | ND | ND | 61.8 | 0.3 | 76.3 | 4.6 |
無修飾 | G023069 | 5.1 | 0.4 | 13.0 | 0.2 | 33.8 | 0.3 | |
末端修飾 | G023070 | 23.7 | 3.9 | 48.1 | 0.3 | 61.2 | 2.0 | |
位置4 | G023078 | 36.5 | 4.1 | 50.7 | 3.5 | 69.5 | 0.1 | |
位置5 | G023079 | 57.7 | 0.5 | 63.2 | 3.5 | 71.2 | 3.0 | |
位置8 | G023080 | 47.3 | 4.2 | 46.1 | 2.9 | 78.4 | 0.2 | |
位置9 | G023081 | 50.4 | 2.2 | 46.8 | 5.6 | 57.4 | 4.1 | |
位置11 | G023082 | 31.2 | 2.3 | 39.3 | 1.9 | 50.7 | 3.6 | |
位置13 | G023083 | 46.5 | 3.7 | 49.2 | 3.8 | 46.6 | 9.2 | |
位置18 | G023084 | 46.8 | 1.8 | 47.7 | 7 | 60.7 | 4.1 | |
位置22 | G023085 | 9.5 | 2.6 | 35.2 | 5.8 | 49.6 | 3.9 | |
外顯子-3 | 高修飾pgRNA | G023066 | 38.8 | 4.0 | 79.2 | 4.2 | 88.0 | 1.0 |
無修飾 | G023103 | 1.3 | 0.5 | 20 | 0.2 | 37.3 | 1.6 | |
末端修飾 | G023104 | 20.3 | 4.7 | 50.1 | 4.9 | 62.1 | 5.1 | |
位置4 | G023112 | 56.7 | 3.8 | 64.3 | 3.2 | 77.2 | 2.0 | |
位置5 | G023113 | 41.0 | 8.9 | 68.4 | 1.3 | 81.8 | 1.8 | |
位置8 | G023114 | 56.3 | 2.2 | 76.8 | 14 | 87.5 | 0.5 | |
位置9 | G023115 | 59.5 | 9.0 | 63.6 | 1.9 | 80.8 | 0.9 | |
位置11 | G023116 | 49.4 | 10.3 | 49.5 | 7.1 | 67.8 | 0.2 | |
位置13 | G023117 | 49.0 | 9.4 | 55.1 | 5.7 | 70.3 | 1.2 | |
位置18 | G023118 | 52.9 | 7.3 | 56.6 | 6.0 | 74.4 | 3.4 | |
位置22 | G023119 | 21.7 | 4.1 | 30.5 | 3.3 | 40.8 | 1.2 |
基因座 | 引導序列修飾 | 引導物 | gRNA 濃度 | |||||
3 nM | 8 nM | 25 nM | ||||||
平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | |||
外顯子-1 | 高修飾pgRNA | G023067 | ND | ND | 61.8 | 0.3 | 76.3 | 4.6 |
無修飾 | G023069 | 5.1 | 0.4 | 13.0 | 0.2 | 33.8 | 0.3 | |
末端修飾 | G023070 | 23.7 | 3.9 | 48.1 | 0.3 | 61.2 | 2.0 | |
位置4 | G023071 | 22.4 | 4.0 | 51.0 | 5.3 | 54.2 | 0.6 | |
位置5 | G023072 | 18.8 | 2.1 | 45.8 | 5.3 | 60.5 | 1.2 | |
位置8 | G023120 | 65.3 | 26 | 41.3 | 5.0 | 38.6 | 7.2 | |
位置9 | G023073 | 31.1 | 3.1 | 47.7 | 1.0 | 62.4 | 6.3 | |
位置11 | G023074 | 24.0 | 5.6 | 52.0 | 1.7 | 66.5 | 1.4 | |
位置13 | G023075 | ND | ND | 48.2 | 3.6 | 62.5 | 0.8 | |
位置18 | G023076 | 17.2 | 1.6 | 43.1 | 0.2 | 48.1 | 2.8 | |
位置22 | G023077 | 30.6 | 2.5 | 59.1 | 7.2 | ND | ND | |
外顯子-3 | 高修飾pgRNA | G023066 | 38.8 | 4.0 | 79.2 | 4.2 | 88.0 | 1.0 |
無修飾 | G023103 | 1.3 | 0.5 | 20.0 | 0.2 | 37.3 | 1.6 | |
末端修飾 | G023104 | 20.3 | 4.7 | 50.1 | 4.9 | 62.1 | 5.1 | |
位置4 | G023105 | 7.0 | 1.4 | 52.6 | 6.8 | 51.6 | 2.2 | |
位置5 | G023106 | 22.8 | 4.2 | ND | ND | 63.8 | 3.4 | |
位置8 | G023122 | 34.6 | 5.4 | 53.2 | 6.5 | 66.9 | 1.9 | |
位置9 | G023107 | 19.3 | 5.1 | ND | ND | ND | ND | |
位置11 | G023108 | 27.1 | 7.5 | 49.6 | 6.8 | 50.5 | 0.7 | |
位置13 | G023109 | 13.6 | 2.8 | 41.6 | 3.4 | ND | ND | |
位置18 | G023110 | 25.1 | 8.8 | 46.2 | 3.9 | 54.1 | 1.1 | |
位置22 | G023111 | 22.3 | 6.6 | 56.8 | 1.1 | 61.2 | 3.9 |
用HepG2細胞中之各種導引設計測試包含融合至Nme2Cas9 D16A切口酶之APOBEC3A去胺酶結構域的鹼基編輯劑構築體的鹼基轉化效率。
HepG2細胞組成性過度表現溶質載體家族10成員1 (SLC10A1) (HepG2-NTCP, Seeger等人Mol Ther Nucleic Acids. 2014 Dec; 3(12): e216)經解凍且再懸浮於補充有10%胎牛血清(FBS)之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(DMEM) (培養基Y)中,隨後離心。丟棄上清液且將細胞再懸浮於培養基Y中,且以25,000個細胞/孔之密度將96孔膠原蛋白塗佈之板(Corning,目錄號354407)接種於100μL培養基Y中。
Nme2Cas9鹼基編輯劑mRNA係藉由活體外轉錄基本上如實例1中所述地自編碼mRNA R (2XNLS N末端,1xC-末端NLS Nme2鹼基編輯劑)、mRNA S (2XNLS N末端,NLS Nme2鹼基編輯劑ORF)及mRNA T (1X C末端NLS Nme2鹼基編輯劑ORF)之質體製備。使用相同方法自質體轉錄SpyCas9 mRNA及尿嘧啶醣苷酶抑制劑(UGI) mRNA (SEQ ID NO: 625)。
使用常規方法合成具有不同PAM序列(G020927、G020928)或VEGF(G020073)之靶向NTCP之經化學修飾之NmeCas9 sgRNA及靶向NTCP之SpyCas9 sgRNA (G020929)。
將導引RNA、編輯劑mRNA及UGI mRNA以1:1:1重量比與含有分別為50:38:9:3莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG之預混合轉染試劑混合。試劑以約6.0之脂質胺與RNA磷酸(N:P)莫耳比組合。RNA-脂質混合物與10% FBS培養基近似1:1混合且培育10分鐘。培育後,自400 ng總編輯劑RNA/孔開始,以8點、2倍連續稀釋用RNA-脂質混合物處理細胞。
處理後72小時,溶解細胞以進行NGS分析,如實例1中所提供。
編輯效率對導引濃度之劑量反應一式三份進行。表18展示在各引導物濃度下計算之平均編輯百分比及計算之EC50值。VEGFA中之目標位點由於高GC含量而易於形成插入/缺失。所有編輯劑mRNA達成相同的最大C至T編輯。EC50存在細微差異,其中mRNA S優於mRNA R及mRNA T。
表18. HepG2-NTCP細胞中VEGFA基因座(G020073)及Nme2鹼基編輯劑處之平均編輯百分比。
實例 8. 在 PMH 中使用化學修飾之 sgRNA 進行鹼基編輯
mRNA | Nme- 鹼基編輯劑(ng) | C 至T % | C 至A/G % | 插入/ 缺失% | ||||||||
平均值 | SD | n | EC50 | 平均值 | SD | n | 平均值 | SD | n | |||
mRNA R | 0 | 0.20 | 0.14 | 2 | 6.86 | 0.80 | 0.00 | 2 | 0.70 | 0.14 | 2 | |
6.25 | 36.05 | 1.63 | 2 | 2.30 | 0.28 | 2 | 14.25 | 0.21 | 2 | |||
12.5 | 49.70 | 1.13 | 2 | 2.95 | 0.49 | 2 | 16.35 | 1.06 | 2 | |||
25 | 57.60 | 0.42 | 2 | 2.75 | 0.07 | 2 | 17.45 | 0.21 | 2 | |||
50 | 67.15 | 1.34 | 2 | 2.65 | 0.07 | 2 | 17.90 | 0.14 | 2 | |||
100 | 70.50 | 0.99 | 2 | 2.65 | 0.07 | 2 | 18.80 | 0.28 | 2 | |||
200 | 72.75 | 0.49 | 2 | 2.90 | 0.57 | 2 | 18.75 | 0.49 | 2 | |||
400 | 72.00 | 0.14 | 2 | 3.10 | 0.14 | 2 | 20.40 | 0.99 | 2 | |||
mRNA S | 0 | 0.50 | 0.00 | 1 | 3.86 | 1.00 | 0.00 | 1 | 0.60 | 0.00 | 1 | |
6.25 | 49.60 | 3.25 | 2 | 2.10 | 0.14 | 2 | 14.05 | 0.21 | 2 | |||
12.5 | 57.05 | 0.78 | 2 | 2.50 | 0.42 | 2 | 16.50 | 0.14 | 2 | |||
25 | 66.95 | 0.49 | 2 | 2.40 | 0.00 | 2 | 16.25 | 0.21 | 2 | |||
50 | 71.45 | 0.35 | 2 | 2.40 | 0.00 | 2 | 17.25 | 0.07 | 2 | |||
100 | 71.60 | 0.85 | 2 | 2.55 | 0.35 | 2 | 17.90 | 0.14 | 2 | |||
200 | 73.70 | 0.28 | 2 | 2.65 | 0.07 | 2 | 19.00 | 0.28 | 2 | |||
400 | 73.80 | 0.14 | 2 | 3.05 | 0.35 | 2 | 18.70 | 0.42 | 2 | |||
mRNA T | 0 | 0.55 | 0.49 | 2 | 4.84 | 1.05 | 0.21 | 2 | 0.55 | 0.07 | 2 | |
6.25 | 45.55 | 0.21 | 2 | 2.60 | 0.28 | 2 | 17.15 | 0.64 | 2 | |||
12.5 | 56.40 | 1.84 | 2 | 2.80 | 0.00 | 2 | 19.40 | 0.14 | 2 | |||
25 | 64.95 | 1.06 | 2 | 3.15 | 0.35 | 2 | 19.40 | 1.70 | 2 | |||
50 | 70.70 | 0.28 | 2 | 3.25 | 0.21 | 2 | 20.00 | 0.71 | 2 | |||
100 | 72.20 | 2.83 | 2 | 2.75 | 0.21 | 2 | 19.80 | 1.56 | 2 | |||
200 | 70.90 | 0.99 | 2 | 3.15 | 0.35 | 2 | 19.70 | 0.85 | 2 | |||
400 | 71.80 | 0.14 | 2 | 3.45 | 0.21 | 2 | 20.95 | 0.35 | 2 | |||
用原代小鼠肝細胞(PMH)中之各種導引設計測試包含融合至Nme2Cas9切口酶之APOBEC3A去胺酶結構域的鹼基編輯劑構築體的鹼基轉化效率。如實例1中所述地將PMH (In Vitro ADMET Laboratories,目錄號MC148)解凍及接種。Nme2Cas9鹼基編輯劑mRNA mRNA R、mRNA S及mRNA T;及尿嘧啶醣苷酶抑制劑(UGI) mRNA (SEQ ID NO: 625)如實例1中所描述來製備且與靶向小鼠TTR之一系列經化學修飾之sgRNA配對且以128 ng鹼基編輯劑mRNA之單次劑量篩選。處理後72小時,溶解細胞以進行NGS分析,如實例1中所提供。代表性引導物之平均編輯(編輯類型之比)展示於表19中。
表19. 使用靶向TTR基因座之經修飾gRNA及Nme2鹼基編輯劑之PMH細胞中之平均編輯百分比。
n/a = 當僅報導1個複製品時,SD不適用。
實例 9. Nme2-mRNA 研究 實例 9.1 - 原代小鼠 肝細胞中之活體外編輯
mRNA | 引導物 | C 至T % | C 至A/G % | 插入/ 缺失% | ||||||
平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | ||
mRNA R | G021237 | 69.00 | 5.94 | 2 | 3.65 | 1.63 | 2 | 9.00 | 3.39 | 2 |
G021249 | 47.15 | 2.33 | 2 | 1.20 | 0.14 | 2 | 1.45 | 1.34 | 2 | |
G021321 | 7.25 | 0.92 | 2 | 0.25 | 0.21 | 2 | 91.25 | 0.92 | 2 | |
mRNA S | G021237 | 76.75 | 1.34 | 2 | 4.35 | 1.48 | 2 | 7.95 | 1.34 | 2 |
G021249 | 54.05 | 4.17 | 2 | 1.20 | 0.28 | 2 | 1.60 | 0.42 | 2 | |
G021321 | 0.50 | n/a | 1 | 0.10 | n/a | 1 | 99.00 | n/a | 1 | |
mRNA T | G021237 | 73.55 | 5.44 | 2 | 5.15 | 2.47 | 2 | 12.50 | 1.70 | 2 |
G021249 | 53.30 | 5.52 | 2 | 1.05 | 0.21 | 2 | 2.15 | 1.63 | 2 | |
G021321 | 7.05 | 1.20 | 2 | 0.55 | 0.21 | 2 | 90.40 | 2.97 | 2 |
分析具有不同NLS置放的編碼Nme2Cas9 ORF之信使mRNA在原代小鼠肝細胞(PMH)中之編輯效率。
如實例1中所述地製備PMH。根據製造商之方案使用Lipofectamine MessengerMAX轉染試劑(Invitrogen LMRNA001)進行脂質體轉染,以用靶向小鼠PCSK9之100 nM sgRNA G020361及表20中所列濃度之mRNA轉化細胞。分析中包括一式三份樣品。在37℃下在維持培養基中培育72小時之後,收集細胞且如實例1中所述地進行NGS分析。具有標準差(SD)之平均編輯結果顯示於表20及圖13中。
表20. PMH中PCSK9基因座處之平均編輯百分比
實例 9.2 - Nme2 ORF 變異體及具有化學修飾變異之引導物的劑量反應
構築體 | mRNA 濃度(ng/ μL) | 平均編輯% | SD |
mRNA H SEQ ID NO: 626 | 2.00 | 0.07 | 0.05 |
0.66 | 0.07 | 0.05 | |
0.22 | 0.03 | 0.05 | |
0.07 | 0.03 | 0.05 | |
0.03 | 0.03 | 0.05 | |
0.008 | 0.00 | 0.00 | |
0.003 | 0.00 | 0.00 | |
0.00 | 0.05 | 0.05 | |
mRNA I SEQ ID NO: 627 | 2.00 | 22.53 | 1.59 |
0.66 | 10.37 | 2.25 | |
0.22 | 0.80 | 0.22 | |
0.07 | 0.07 | 0.05 | |
0.03 | 0.07 | 0.05 | |
0.008 | 0.03 | 0.05 | |
0.003 | 0.03 | 0.05 | |
0.00 | 0.20 | 0.28 | |
mRNA J SEQ ID NO: 628 | 2.00 | 26.30 | 0.86 |
0.66 | 10.07 | 1.27 | |
0.22 | 0.93 | 0.33 | |
0.07 | 0.03 | 0.05 | |
0.03 | 0.03 | 0.05 | |
0.008 | 0.03 | 0.05 | |
0.003 | 0.03 | 0.05 | |
0.00 | 0.05 | 0.05 | |
mRNA K SEQ ID NO: 629 | 2.00 | 14.20 | 1.84 |
0.66 | 6.70 | 1.16 | |
0.22 | 0.53 | 0.17 | |
0.07 | 0.07 | 0.09 | |
0.03 | 0.03 | 0.05 | |
0.008 | 0.00 | 0.00 | |
0.003 | 0.00 | 0.00 | |
0.00 | 0.05 | 0.05 | |
mRNA L SEQ ID NO: 630 | 2.00 | 23.30 | 0.80 |
0.66 | 10.57 | 1.54 | |
0.22 | 0.70 | 0.42 | |
0.7 | 0.07 | 0.05 | |
0.03 | 0.07 | 0.05 | |
0.008 | 0.07 | 0.05 | |
0.003 | 0.03 | 0.05 | |
0.00 | 0.05 | 0.05 | |
mRNA N SEQ ID NO: 631 | 2.00 | 22.63 | 2.25 |
0.66 | 11.00 | 0.00 | |
0.22 | 0.97 | 0.19 | |
0.07 | 0.17 | 0.09 | |
0.03 | 0.03 | 0.05 | |
0.008 | 0.03 | 0.05 | |
0.003 | 0.00 | 0.00 | |
0.00 | 0.05 | 0.05 | |
mRNA C SEQ ID NO: 632 | 2.00 | 19.90 | 0.16 |
0.66 | 8.40 | 2.20 | |
0.22 | 0.70 | 0.22 | |
0.07 | 0.03 | 0.05 | |
0.03 | 0.00 | 0.00 | |
0.008 | 0.03 | 0.05 | |
0.003 | 0.00 | 0.00 | |
0.00 | 0.00 | 0.00 |
對編碼具有不同NLS配置之Nme2Cas9 ORF的信使mRNA在原代人類肝細胞(PHH)及HEK-293細胞中之編輯效率進行了分析。使用具有靶向VEGFA基因座TS47之相同引導序列的gRNA進行分析,且gRNA具有不同長度及化學修飾模式。如實例1中所述地製備PHH細胞。將HEK293細胞解凍且以30,000個細胞/孔之密度接種於96孔盤中具有10% FBS之DMEM (Corning,10-013-CV)中,且培育24小時。使用Lipofectamine MessengerMAX轉染試劑(Invitrogen LMRNA001)根據製造商之方案進行脂質體轉染。以100 nM gRNA及1 ng/μL mRNA之最高劑量開始之劑量反應1:3稀釋系列用於用表LS3.1及LS3.2中所列濃度之gRNA轉化細胞。分析中包括重複樣品。在37℃下培育72小時之後,收集細胞且如實例1中所述地進行NGS分析。具有標準差(SD)之平均編輯結果展示於表21A及圖14A-圖14C (對於HEK細胞)以及表21B及圖14D-圖14F (對於PHH)中。
表 21A. HEK 細胞 中之平均編輯百分比
表 21B. PHH 細胞中之平均編輯百分比
實例 9.3 - 在 PMH 中 使用 LNP 之 Nme2 NLS 變異體之劑量反應
mRNA | gRNA [nM] | G020055 | G020073 | ||||
平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | ||
mRNA C | 100 | 76.05 | 5.18 | 4 | 90.50 | 4.15 | 4 |
33.33 | 61.68 | 14.86 | 4 | 75.55 | 8.65 | 4 | |
11.11 | 32.93 | 8.59 | 4 | 63.53 | 11.92 | 4 | |
3.70 | 14.63 | 4.08 | 4 | 39.88 | 2.40 | 4 | |
1.23 | 5.95 | 1.42 | 4 | 13.00 | 5.36 | 4 | |
0.41 | 3.35 | 0.60 | 4 | 6.03 | 1.05 | 4 | |
0.14 | 2.05 | 0.50 | 4 | 3.65 | 0.47 | 4 | |
0.00 | 1.50 | 0.22 | 4 | 1.30 | 0.22 | 4 | |
mRNA I | 100 | 85.55 | 7.06 | 4 | 88.08 | 4.90 | 4 |
33.33 | 65.33 | 17.06 | 4 | 77.13 | 4.78 | 4 | |
11.11 | 34.98 | 12.93 | 4 | 48.63 | 4.83 | 4 | |
3.70 | 21.25 | 13.09 | 4 | 22.43 | 6.49 | 4 | |
1.23 | 8.03 | 8.06 | 4 | 9.80 | 2.12 | 4 | |
0.41 | 2.83 | 1.94 | 4 | 5.55 | 0.94 | 4 | |
0.14 | 2.15 | 0.83 | 4 | 2.45 | 0.60 | 4 | |
mRNA J | 100 | 87.03 | 3.79 | 4 | 90.93 | 1.14 | 4 |
33.33 | 72.25 | 4.18 | 4 | 72.08 | 3.88 | 4 | |
11.11 | 40.05 | 5.01 | 4 | 42.83 | 9.02 | 4 | |
3.70 | 11.65 | 5.34 | 4 | 16.63 | 6.64 | 4 | |
1.23 | 5.78 | 0.86 | 4 | 7.00 | 1.47 | 4 | |
0.41 | 2.60 | 0.42 | 4 | 4.50 | 2.76 | 4 | |
0.14 | 1.53 | 0.50 | 4 | 1.78 | 0.24 | 4 | |
0.00 | 1.33 | 0.13 | 4 | 1.53 | 0.25 | 4 |
mRNA | gRNA [nM] | G020055 | G020073 | ||||
平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | ||
mRNA C | 100 | 27.70 | 4.29 | 3 | 31.43 | 3.63 | 3 |
33.33 | 32.98 | 5.10 | 4 | 31.58 | 2.49 | 4 | |
11.11 | 25.55 | 2.53 | 4 | 33.58 | 1.06 | 4 | |
3.70 | 13.80 | 3.68 | 4 | 19.38 | 3.86 | 4 | |
1.23 | 6.20 | 0.68 | 4 | 12.83 | 3.60 | 4 | |
0.41 | 2.70 | 0.81 | 4 | 6.35 | 1.41 | 4 | |
0.14 | 2.25 | 0.66 | 4 | 3.18 | 1.05 | 4 | |
0.00 | 1.65 | 0.24 | 4 | 1.50 | 0.18 | 4 | |
mRNA I | 100 | 25.00 | 2.73 | 4 | 29.88 | 1.67 | 4 |
33.33 | 25.73 | 3.69 | 4 | 26.60 | 4.95 | 4 | |
11.11 | 26.08 | 3.23 | 4 | 22.98 | 3.09 | 4 | |
3.70 | 14.55 | 3.74 | 4 | 19.03 | 3.55 | 4 | |
1.23 | 7.65 | 0.70 | 4 | 7.28 | 3.41 | 4 | |
0.41 | 4.18 | 0.97 | 4 | 4.15 | 0.62 | 4 | |
0.14 | 2.18 | 0.15 | 4 | 2.83 | 0.93 | 4 | |
0.00 | 1.40 | 0.12 | 4 | 1.35 | 0.17 | 4 | |
mRNA J | 100 | 27.90 | 1.57 | 4 | 36.38 | 5.06 | 4 |
33.33 | 26.50 | 3.59 | 4 | 32.95 | 2.27 | 4 | |
11.11 | 21.23 | 3.98 | 4 | 29.88 | 3.59 | 4 | |
3.70 | 14.85 | 2.37 | 4 | 14.88 | 2.81 | 4 | |
1.23 | 6.78 | 2.29 | 4 | 6.43 | 0.74 | 4 | |
0.41 | 2.73 | 1.35 | 4 | 3.13 | 0.49 | 4 | |
0.14 | 2.63 | 1.69 | 4 | 2.45 | 0.73 | 4 | |
0.00 | 1.40 | 0.12 | 4 | 1.50 | 0.16 | 4 |
分析具有不同NLS置放的編碼Nme2Cas9 ORF之信使mRNA在原代小鼠肝細胞(PMH)中之編輯效率。該分析測試靶向小鼠TTR基因座之引導物,且包括sgRNA及pgRNA兩種設計。
如同實例1製備PMH。LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備,如表22中所指示。LNP以50/9/38/3之脂質組成製備,分別表示為可離子化脂質A/膽固醇/DSPC/PEG之莫耳比。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。
用按RNA重量計60 ng/100 μl含有gRNA之LNP及含有如表22中所指示之mRNA之LNP來處理細胞。將細胞在含有維持補充劑及10%胎牛血清之威廉姆斯氏E培養基(Gibco,A1217601)中在37℃下培育72小時。在37℃下培育72小時後,收集細胞且藉由NGS評估編輯,如實例1中所述。平均編輯百分比資料展示於表22及圖15中。
表 22. 原代小鼠肝細胞中小鼠 TTR 基因座處之平均編輯百分比。
實例 9.4 - 在 PMH 中 使用 LNP 之 Nme2 NLS 變異體之劑量反應
樣品 | mRNA LNP (ng RNA) | 平均編輯% | SD | N |
mRNA P (2xNLS) G021536 | 40.000 | 92.30 | 0.85 | 3 |
13.330 | 82.67 | 1.61 | 3 | |
4.440 | 62.27 | 2.96 | 3 | |
1.480 | 32.80 | 4.54 | 3 | |
0.490 | 11.23 | 1.37 | 3 | |
0.160 | 3.40 | 0.71 | 3 | |
0.050 | 0.80 | 0.22 | 3 | |
0.018 | 0.30 | 0.08 | 3 | |
0.006 | 0.20 | 0.08 | 3 | |
0.002 | 0.13 | 0.05 | 3 | |
0.001 | 0.13 | 0.05 | 3 | |
0.000 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
mRNA P (2xNLS) G021844 (pgRNA) | 40.000 | 96.17 | 0.12 | 3 |
13.330 | 91.83 | 0.34 | 3 | |
4.440 | 75.37 | 6.80 | 3 | |
1.480 | 44.53 | 13.11 | 3 | |
0.490 | 18.30 | 5.77 | 3 | |
0.160 | 5.50 | 1.43 | 3 | |
0.050 | 1.63 | 0.71 | 3 | |
0.018 | 0.33 | 0.05 | 3 | |
0.006 | 0.17 | 0.05 | 3 | |
0.002 | 0.07 | 0.05 | 3 | |
0.001 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
0.000 | 0.07 | 0.05 | 3 | |
mRNA M (1xNLS) G021536 | 40.000 | 84.27 | 1.23 | 3 |
13.330 | 66.23 | 5.39 | 3 | |
4.440 | 33.80 | 5.14 | 3 | |
1.480 | 10.17 | 5.51 | 3 | |
0.490 | 4.20 | 0.92 | 3 | |
0.160 | 1.10 | 0.45 | 3 | |
0.050 | 0.33 | 0.17 | 3 | |
0.018 | 0.23 | 0.09 | 3 | |
0.006 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
0.002 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
0.001 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
0.000 | 0.07 | 0.05 | 3 | |
mRNA M (1xNLS) G021844 (pgRNA) | 40.000 | 88.83 | 0.37 | 3 |
13.330 | 74.37 | 4.63 | 3 | |
4.440 | 39.00 | 3.72 | 3 | |
1.480 | 16.40 | 2.52 | 3 | |
0.490 | 4.03 | 0.77 | 3 | |
0.160 | 1.27 | 0.05 | 3 | |
0.050 | 0.23 | 0.05 | 3 | |
0.018 | 0.20 | 0.08 | 3 | |
0.006 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
0.002 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
0.001 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
0.000 | 0.10 | 0.00 | 3 |
分析具有不同NLS置放的編碼Nme2Cas9 ORF之信使mRNA在原代小鼠肝細胞(PMH)中之編輯效率。
如實例1中所述地製備PMH (Gibco,MC148)。LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備。LNP以50/9/38/3之脂質組成製備,分別表示為可離子化脂質A/膽固醇/DSPC/PEG之莫耳比。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。
用按RNA重量計30 ng/100 μl含有gRNA G021844之LNP及含有如表LS4中所指示之mRNA之LNP來處理細胞。將細胞在含有維持補充劑及10%胎牛血清之威廉姆斯氏E培養基(Gibco,A1217601)中培育24小時。培育72小時後,收集細胞且藉由NGS評估編輯,如實例1中所述。平均編輯百分比資料展示於表23及圖16中。
表 23. 用 LNP 處理之 PMH 中之平均編輯百分比。
實例10 - NmeCas9蛋白表現
實例10.1 原代人類肝細胞中之蛋白質表現
mRNA | mRNA LNP (ng/ μL) | 平均值 | SD | N | EC 50(ng/ μL) |
mRNA C | 0.30 | 86.30 | 4.46 | 3 | 0.0082 |
0.10 | 84.17 | 5.52 | |||
0.03 | 75.80 | 1.91 | |||
0.01 | 43.90 | 14.36 | |||
0.004 | 34.03 | 8.64 | |||
0.001 | 15.63 | 4.35 | |||
0.0004 | 6.17 | 2.41 | |||
0.0001 | 3.47 | 0.62 | |||
0.00005 | 2.37 | 0.34 | |||
0.00002 | 3.00 | 0.64 | |||
0.00001 | 2.60 | 0.57 | |||
0.00 | 2.70 | 0.16 | |||
mRNA J | 0.30 | 91.30 | 2.92 | 3 | 0.0053 |
0.10 | 89.60 | 4.23 | |||
0.03 | 80.93 | 8.17 | |||
0.01 | 62.85 | 14.35 | |||
0.004 | 39.95 | 5.15 | |||
0.001 | 16.70 | 3.79 | |||
0.0004 | 7.73 | 2.98 | |||
0.0001 | 4.23 | 0.95 | |||
0.00005 | 2.80 | 0.70 | |||
0.00002 | 3.23 | 0.54 | |||
0.00001 | 2.67 | 0.48 | |||
0.00 | 3.60 | 0.57 | |||
mRNA Q | 0.30 | 90.67 | 4.40 | 3 | 0.0065 |
0.10 | 86.77 | 5.43 | |||
0.03 | 80.27 | 6.65 | |||
0.01 | 56.90 | 5.48 | |||
0.004 | 35.45 | 1.35 | |||
0.001 | 12.63 | 3.16 | |||
0.0004 | 5.17 | 0.56 | |||
0.0001 | 2.73 | 0.17 | |||
0.00005 | 2.97 | 0.41 | |||
0.00002 | 2.73 | 0.21 | |||
0.00001 | 2.87 | 0.56 | |||
0.00 | 2.43 | 0.82 | |||
mRNA N | 0.30 | 93.93 | 2.20 | 3 | 00045 |
0.10 | 90.97 | 1.77 | |||
0.03 | 82.80 | 8.24 | |||
0.01 | 68.67 | 10.18 | |||
0.004 | 42.07 | 2.25 | |||
0.001 | 24.13 | 4.21 | |||
0.0004 | 10.60 | 0.94 | |||
0.0001 | 4.67 | 0.66 | |||
0.00005 | 3.30 | 1.84 | |||
0.00002 | 3.37 | 0.69 | |||
0.00001 | 2.53 | 0.90 | |||
0.00 | 2.33 | 1.48 | |||
mRNA P | 0.30 | 94.47 | 1.04 | 3 | 0.0036 |
0.10 | 95.03 | 0.96 | |||
0.03 | 91.27 | 2.36 | |||
0.01 | 74.77 | 6.91 | |||
0.004 | 50.57 | 4.89 | |||
0.001 | 22.67 | 0.25 | |||
0.0004 | 8.27 | 0.74 | |||
0.0001 | 4.93 | 0.70 | |||
0.00005 | 3.37 | 0.74 | |||
0.00002 | 2.93 | 0.68 | |||
0.00001 | 2.87 | 0.05 | |||
0.00 | 2.87 | 0.45 | |||
mRNA M | 0.30 | 92.00 | 0.80 | 3 | 0.0093 |
0.10 | 91.40 | 1.90 | |||
0.03 | 79.70 | 0.70 | |||
0.01 | 53.10 | 6.80 | |||
0.004 | 22.47 | 14.28 | |||
0.001 | 8.20 | 4.20 | |||
0.0004 | 4.57 | 1.57 | |||
0.0001 | 2.73 | 0.31 | |||
0.00005 | 3.07 | 0.21 | |||
0.00002 | 2.93 | 0.09 | |||
0.00001 | 2.77 | 0.66 | |||
0.00 | 3.47 | 1.09 | |||
mRNA O | 0.30 | 89.40 | 7.00 | 3 | 0.0042 |
0.10 | 86.83 | 12.52 | |||
0.03 | 78.17 | 15.41 | |||
0.01 | 64.83 | 12.48 | |||
0.004 | 47.33 | 9.03 | |||
0.001 | 20.67 | 7.12 | |||
0.0004 | 8.60 | 2.95 | |||
0.0001 | 2.47 | 1.33 | |||
0.00005 | 4.13 | 0.37 | |||
0.00002 | 2.80 | 0.62 | |||
0.00001 | 11.13 | 231. | |||
0.00 | 6.13 | 2.16 |
為了量化各mRNA構築體之表現,在LNP遞送編碼SpyCas9或NmeCas9之mRNA至原代人類肝細胞後量測mRNA及蛋白質表現量。
如實例1中所述地製備PHH細胞。LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備。LNP含有分別為50:38:9:3莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。
給與細胞一種含有mRNA之LNP (僅mRNA),或兩種含有mRNA或gRNA之LNP。各LNP以16.7 ng總RNA負荷/100 µl施加至細胞。用LNP處理後,將細胞在含有維持補充劑及10%胎牛血清之威廉姆斯氏E培養基(Gibco,A1217601)中在37℃下培育24小時。培育24小時後,收集細胞且經由Nano-Glo HiBiT溶解偵測系統(Promega,N3030)遵循製造商說明書來定量表現。使用HiBiT對照蛋白質(Promega,N3010)將原始發光標準化為標準曲線。將表24及圖17中所示之不同Cas9變異體之蛋白質表現標準化為僅用SpyCas9 mRNA遞送之對應肝細胞中量測之SpyCas9表現。與表24中顯示之資料一致,當用來自PHH細胞提取物之抗HiBiT抗體藉由西方墨點偵測或藉由PMH、PCH、PHH及PRH細胞中之HiBiT偵測量測時,來自此等相同構築體之蛋白質表現對於NmeCas9構築體高於SpyCas9構築體。
表 24. 相比於僅用 SpyCas9 mRNA 遞送 之 對應肝細胞中之 SpyCas9 表現的 Cas9 變異體之平均表現倍數,如藉由 HiBiT 分析所量測
實例 10.2 : T 細胞中之蛋白質表現
mRNA | gRNA | 細胞類型 | 表現倍數 | |
平均值 | N | |||
Spy Cas9 mRNA | 無 | PMH | 1 | 2 |
PRH | 1 | 3 | ||
PCH | 1 | 3 | ||
PHH | 1 | 3 | ||
G000502 | PMH | 0.8 | 2 | |
PRH | 2.7 | 3 | ||
PCH | 1.8 | 3 | ||
PHH | 0.6 | 3 | ||
Nme2 Cas9 mRNA M | 無 | PMH | 6.8 | 2 |
PRH | 19.2 | 3 | ||
PCH | 7.3 | 3 | ||
PHH | 4.3 | 3 | ||
G021536 | PMH | 5.1 | 2 | |
PRH | 11.5 | 3 | ||
PCH | 4.1 | 3 | ||
PHH | 3.0 | 3 |
為了量化各mRNA構築體之表現,在LNP遞送編碼SpyCas9或Nme2Cas9之mRNA至T細胞後,量測蛋白質表現量。
健康人類供體血球分離術為商業獲得的(Hemacare,目錄號)。根據製造商說明書在MultiMACS Cell24 Separator Plus儀器上使用EasySep人類T細胞分離套組(Stem Cell Technology,目錄號17951)藉由負選擇分離來自兩個供體(W106及W864)之T細胞。將分離之T細胞冷凍保存於CS10冷凍培養基(Cryostor,目錄號07930)中以供將來使用。
解凍後,將T細胞在由補充有細胞介素(200 IU/ml IL2、5 ng/ml IL7及5 ng/mL IL15)及2.5%人類血清(Gemini,100-512)之CTS OpTmizer基礎培養基(CTS OpTmizer培養基(Gibco,A1048501),含有1X GlutaMAX、10mM HEPES緩衝液、1%青黴素/鏈黴素))構成之完全T細胞生長培養基中培養。在37℃下隔夜靜置之後,將密度為1e6/mL之T細胞用T細胞TransAct試劑(1:100稀釋,Miltenyi)活化且在組織培養恆溫箱中培育48小時。
用遞送編碼具有HiBiT標籤之Nme2-mRNA或Spy mRNA之mRNA的LNP處理活化T細胞。LNP一般如同實例1來製備。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。囊封Nme2Cas9 mRNA之LNP使用脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG,莫耳比分別為50:38:9:3。囊封SpyCas9 mRNA之LNP使用脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG,莫耳比分別為50:10:38.5:1.5。在此實驗中未提供引導RNA。
在即將對T細胞進行LNP處理之前,將LNP在37℃下以13.33 μg/ml總RNA之LNP濃度與10 μg/mL ApoE3 (Peprotech,目錄號350-02)一起在完全T細胞培養基中預培育5分鐘,該培養基補充有細胞介素(200 IU/ml IL2 (Peprotech,目錄號200-02)、5 ng/ml IL7 (Peprotech,目錄號200-07)及5 ng/ml IL15 (Peprotech,目錄號200-15)及2.5%人類血清(Gemini,100-512)。培育後,接著將LNP與T細胞在完全T細胞培養基中以1:1體積混合,細胞介素用於ApoE培育。在LNP處理後24小時、48小時及72小時收集T細胞用於蛋白質表現分析。藉由Nano-Glo® HiBiT Lytic Assay (Promega)溶解T細胞,且經由Nano-Glo® Nano-Glo HiBiT細胞外偵測系統(Promega,目錄號N2420)遵循製造商說明書定量Cas9蛋白水平。使用Biotek Neo2盤讀取器來量測發光。使用來自標準對照之蛋白質數目及發光讀數在GraphPad上繪製線性回歸,迫使線經過X = 0,Y = 0。使用Y= ax + 0方程式計算每個溶解物之蛋白質數目。
將樣品標準化為0.83 μg/ml LNP劑量之SpyCas9的平均值。表25A-25B及圖18A-18F顯示供體1或供體2在LNP處理後24、48及72小時時mRNA在活化細胞中之相對Cas9蛋白表現。Cas9以劑量依賴性方式在活化T細胞中表現。與活化T細胞中之SpyCas9樣品相比,Nme2Cas9樣品之蛋白質表現更高。
表25A. 供體1標準化為平均SpyCas9 0.83 μg/ml樣品之蛋白質表現
表25B. 供體2標準化為平均SpyCas9 0.83 μg/ml樣品之蛋白質表現
實例 11. 使用脂質奈米粒子 (LNP) 在小鼠肝臟中之活體內編輯
時間點 ( 小時 ) | LNP (ug/mL) | T 細胞供體 1 | |||||
mRNA P | mRNA M | Spy Cas9 | |||||
平均值 | N | 平均值 | N | 平均值 | N | ||
24 h | 6.67 | 89.3 | 2 | 86.5 | 2 | 26.5 | 2 |
3.33 | 67.7 | 2 | 50.3 | 2 | 11.3 | 2 | |
1.67 | 32.4 | 2 | 13.5 | 2 | 4.4 | 2 | |
0.83 | 7.3 | 2 | 2.9 | 2 | 1.0 | 2 | |
0.42 | 1.6 | 2 | 0.8 | 2 | 0.2 | 2 | |
0.21 | 0.4 | 2 | 0.3 | 2 | 0.1 | 2 | |
0.10 | 0.2 | 2 | 0.1 | 2 | 0.0 | 2 | |
0.00 | 0.0 | 2 | 0.0 | 2 | 0.0 | 2 | |
48 h | 6.67 | 657.2 | 2 | 987.0 | 2 | 165.9 | 2 |
3.33 | 487.4 | 2 | 551.0 | 2 | 58.5 | 2 | |
1.67 | 271.0 | 2 | 165.1 | 2 | 21.4 | 2 | |
0.83 | 64.5 | 2 | 32.3 | 2 | 4.3 | 2 | |
0.42 | 11.8 | 2 | 7.8 | 2 | 1.0 | 2 | |
0.21 | 3.2 | 2 | 2.6 | 2 | 0.1 | 2 | |
0.10 | 1.1 | 2 | 0.7 | 2 | 0.1 | 2 | |
0.00 | 0.0 | 2 | 0.0 | 2 | 0.0 | 2 | |
72 h | 6.67 | 53.8 | 2 | 125.6 | 2 | 24.6 | 2 |
3.33 | 40.8 | 2 | 75.6 | 2 | 11.6 | 2 | |
1.67 | 23.1 | 2 | 25.0 | 2 | 3.5 | 2 | |
0.83 | 5.6 | 2 | 4.0 | 2 | 1.0 | 2 | |
0.42 | 1.0 | 2 | 1.3 | 2 | 0.2 | 2 | |
0.21 | 0.2 | 2 | 0.4 | 2 | 0.0 | 2 | |
0.10 | 0.2 | 2 | 0.0 | 2 | 0.1 | 2 | |
0.00 | 0.0 | 2 | 0.0 | 2 | 0.0 | 2 |
時間點 ( 小時 ) | LNP (ug/mL) | T 細胞供體 2 | |||||
mRNA P | mRNA M | SpyCas9 | |||||
平均值 | SD | 平均值 | SD | 平均值 | SD | ||
24 h | 6.67 | 151.5 | 2 | 134.0 | 2 | 36.2 | 2 |
3.33 | 98.2 | 2 | 64.5 | 2 | 17.2 | 2 | |
1.67 | 37.6 | 2 | 19.4 | 2 | 4.9 | 2 | |
0.83 | 10.4 | 2 | 4.5 | 2 | 1.0 | 2 | |
0.42 | 2.4 | 2 | 1.0 | 2 | 0.2 | 2 | |
0.21 | 0.7 | 2 | 0.4 | 2 | 0.1 | 2 | |
0.10 | 0.3 | 2 | 0.2 | 2 | 0.0 | 2 | |
0.00 | 0.0 | 2 | 0.0 | 2 | 0.0 | 2 | |
48 h | 6.67 | 713.6 | 2 | 1067.3 | 2 | 119.0 | 2 |
3.33 | 507.5 | 2 | 587.1 | 2 | 54.9 | 2 | |
1.67 | 229.0 | 2 | 149.2 | 2 | 15.9 | 2 | |
0.83 | 59.1 | 2 | 33.8 | 2 | 3.6 | 2 | |
0.42 | 10.5 | 2 | 8.3 | 2 | 1.0 | 2 | |
0.21 | 3.1 | 2 | 2.8 | 2 | 0.3 | 2 | |
0.10 | 1.0 | 2 | 1.9 | 2 | 0.2 | 2 | |
0.00 | 0.0 | 2 | 0.2 | 2 | 0.0 | 2 | |
72 h | 6.67 | 53.8 | 2 | 108.2 | 2 | 17.1 | 2 |
3.33 | 40.7 | 2 | 60.5 | 2 | 8.3 | 2 | |
1.67 | 19.3 | 2 | 18.2 | 2 | 3.1 | 2 | |
0.83 | 4.7 | 2 | 3.8 | 2 | 1.0 | 2 | |
0.42 | 1.3 | 2 | 1.4 | 2 | 0.3 | 2 | |
0.21 | 0.4 | 2 | 0.4 | 2 | 0.1 | 2 | |
0.10 | 0.3 | 2 | 0.0 | 2 | 0.4 | 2 | |
0.00 | 0.0 | 2 | 0.1 | 2 | 0.0 | 2 |
如實例1中所述地調配用於所有活體內研究中之LNP。在各別實例中注意到與方案之偏差。用於LNP製備之運輸及儲存溶液(TSS)在實驗中作為僅媒劑陰性對照給藥。
小鼠模型中之活體內編輯
測試所選引導物設計之活體內編輯效率。涉及小鼠的各研究中使用6-10週齡範圍內的CD-1雌性小鼠。給藥前對動物進行稱重。LNP一般如實例1中所述地調配。LNP含有分別為50:38:9:3莫耳比之可離子化脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。脂質核酸組裝體用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比調配。
以每隻動物0.2 mL之體積(每公斤體重約10 mL),經由外側尾部靜脈給與LNP。在投與後二十四小時量測體重。LNP遞送後約6-7天,在給藥後異氟醚麻醉下藉由放血對動物實施安樂死。經由心臟穿刺將血液收集至血清分離管中。對於涉及活體內編輯之研究,肝組織收集自來自各動物之左內側葉以用於DNA提取及分析。
對於活體內研究,使用基於珠粒之提取套組,例如Zymo Quick-DNA 96套組(Zymo Research,目錄號D3010)根據製造商之方案自組織提取基因體DNA。如實例1中所述地進行NGS分析。
動物研究中所用的轉甲狀腺素蛋白 (TTR) ELISA 分析
收集血液且如上文所描述分離血清。使用小鼠前白蛋白(甲狀腺素轉運蛋白)ELISA套組(Aviva Systems Biology,目錄號OKIA00111)測定總TTR血清水準。根據製造商之方案製備套組試劑及標準品。藉由1×分析稀釋劑將小鼠血清稀釋至10,000倍之最終稀釋度。10,000-fold. 將標準曲線稀釋液(各100 μL)與稀釋之血清樣品均添加至預塗有捕捉抗體之ELISA盤之各孔中。培養盤在室溫下培育30分鐘,隨後洗滌。添加酶-抗體結合物(每孔100 μL),培育20分鐘。移除非結合之抗體結合物且再次洗滌培養盤,隨後添加顯色受質溶液。將培養盤培育10分鐘,隨後添加100 μL終止溶液,例如硫酸(約0.3 M)。在Clariostar盤讀取器上以450 nm之吸光度讀取該盤。使用脫離標準曲線之四參數邏輯曲線擬合,藉由SoftMax Pro軟體版本6.4.2或Mars軟體版本3.31計算血清TTR含量。根據分析稀釋度調整最終血清值。相對於對照組,測定蛋白質阻斷百分比(KD%)值,除非另外指示,否則對照組通常為經媒劑(TSS)假治療之動物。藉由將各樣品TTR值除以TSS組之平均值,接著調整為百分比值來計算TSS百分比。
實例 11.1. 使用共調配 LNP 之活體內編輯
在小鼠模型中進一步評估實例D.2中測試之經修飾sgRNA的編輯效率。測試了具有靶向小鼠PCSK9之相同引導序列但具有不同長度之保守區的引導RNA設計,如實例1中所述地製備LNP。使用分別為50:38:9:3莫耳比之可離子化脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG製備LNP。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。如表26中所指示之靶向PCSK9基因之gRNA及mRNA C在LNP中以gRNA與mRNA按重量計1:2共調配。以1 mg/kg如上文所述之總RNA的劑量向雌性CD-1小鼠(n=5)投與LNP。給藥後7天對小鼠實施安樂死。含有所指示gRNA之LNP之編輯效率展示於表26中且繪示於圖19中。
表 26. 小鼠肝臟中之平均編輯百分比。
實例 11.2. 使用 pgRNA 及 mRNA LNP 之活體內編輯
引導物 | 劑量(mg/kg) | 平均編輯% | SD |
媒劑 | - | 0.0 | 0.0 |
G017564 | 1 | 2.5 | 0.9 |
G017565 | 1 | 2.2 | 1.0 |
G017566 | 1 | 2.2 | 1.2 |
在活體內評估經修飾pgRNA之編輯效率。除實例11.1之先前研究中指定之引導修飾以外,重複/反重複區、髮夾1及髮夾2之各環中之四個核苷酸亦經間隔子-18個PEG連接子取代。
LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備。LNP含有分別為50:38:9:3莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。
含有表27中所指示之靶向TTR基因之gRNA的LNP如上文所描述以0.1 mg/kg或0.3 mg/kg總RNA之劑量向雌性CD-1小鼠(n=5)投與。含有mRNA (mRNA M;SEQ ID NO: 631)之LNP及含有pgRNA (G021846或G021844)之LNP分別以按RNA重量計1:2之比率同時遞送。給藥後7天將小鼠安樂死。
含有指定pgRNA之LNP之編輯效率、血清TTR減弱及%TSS展示於表27中且分別繪示於圖20A-圖20C中。
表 27. 肝臟 編輯、血清 TTR 蛋白及 TTR 蛋白減弱
引導物 | 劑量(mg/kg) | 平均編輯% | SD | 平均血清TTR ( μg/ml) | SD | 平均%TSS | SD |
TSS | NA | 0.1 | 0 | 733.1 | 131.2 | 100 | 17.9 |
G021846 | 0.1 | 21.9 | 2.8 | 369.5 | 56.2 | 50.4 | 7.7 |
0.3 | 33.8 | 2.9 | 269.8 | 21.3 | 36.8 | 2.6 | |
G021844 | 0.1 | 59.6 | 3.9 | 84.1 | 26.6 | 11.5 | 3.6 |
0.3 | 71.6 | 1.8 | 24.4 | 9.2 | 3.3 | 1.2 |
在不同劑量水平之替代mRNA的情況下,在小鼠中評估來自上文所述之研究的pgRNA (G021844)。LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備。含有pgRNA (G21844)或mRNA (mRNA P或mRNA M)之LNP如實例1中所述地調配。用分別為50:38:9:3莫耳比之可離子化脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG製備所使用之LNP。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。G000502及G021844均靶向小鼠TTR基因之外顯子3。含有pgRNA之LNP及含有mRNA之LNP基於組合RNA重量,分別以按RNA重量計2:1之引導物:mRNA比率同時給藥。額外LNP分別與按重量計1:2比率(較佳SpyCas9引導物:mRNA比率)之G000502及SpyCas9 mRNA共同調配。
表28中所指示之LNP以0.1 mg/kg或0.03 mg/kg總RNA之劑量向雌性CD-1小鼠(n=4)投與。含有指定gRNA之LNP之編輯效率展示於表28中且繪示於圖20D-圖20E中。
表 28. 肝臟編輯及血清 TTR 蛋白減弱
實例 11.3. 使用 sgRNA 及 mRNA LNP 之活體內編輯
引導物 | mRNA | 劑量(mg/kg) | 平均編輯% | SD | 平均血清TTR ( μg/ml) | SD |
TSS | TSS | NA | 0.12 | 0.04 | 937.4 | 100.5 |
G000502 | SpyCas9 | 0.1 | 44.50 | 6.9 | 370.7 | 80.1 |
G021844 | mRNA P SEQ ID NO: 634 | 0.03 | 37.70 | 2.9 | 398.7 | 41.9 |
0.1 | 65.40 | 2.2 | 92.8 | 27.5 | ||
mRNA M SEQ ID NO: 631 | 0.03 | 32.02 | 2.1 | 527.4 | 93.6 | |
0.1 | 62.50 | 17.4 | 268.6 | 236.8 |
LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備。用分別為50:38:9:3莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG製備所使用之LNP。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。sgRNA經設計以靶向pcsk9基因(G020361)或Rosa26基因(G020848)。
以1 mg/kg總RNA之劑量向雌性CD-1小鼠(n=5)投與含有sgRNA或mRNA之LNP。測試之mRNA(mRNA C (SEQ ID NO:622)、mRNA J (SEQ ID NO: 628)、mRNA Q (SEQ ID NO: 635)、mRNA N (SEQ ID NO: 632)被設計成具有不同數目及佈置之NLS。LNP基於RNA負荷之組合重量以按RNA重量計1:1之gRNA:mRNA比率同時給藥。平均編輯百分比展示於表29中且繪示於圖21中。
表 29. 小鼠肝臟中之平均編輯百分比。
實例 12. 使用 NmeCas9 及 sgRNA 或 pgRNA 之 活體內編輯
引導物 | mRNA | 劑量(mg/kg) | 平均插入 / 缺失 % | SD |
TSS | TSS | NA | 0.1 | 0.0 |
G020361 | mRNA C | 1 | 3.7 | 1.5 |
mRNA J | 1 | 2.1 | 0.8 | |
mRNA Q | 1 | 4.5 | 1.8 | |
mRNA N | 1 | 3.6 | 1.0 | |
G020848 | mRNA C | 1 | 0.8 | 0.3 |
mRNA J | 1 | 0.4 | 0.1 | |
mRNA Q | 1 | 0.7 | 0.2 | |
mRNA N | 1 | 0.9 | 0.5 |
在小鼠模型中測試用Nme2Cas9測試的經修飾pgRNA之編輯效率。所測試之所有Nme sgRNA均包含靶向mTTR之相同24nt引導序列。
LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備。用分別為50:38:9:3莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG製備所使用之LNP。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。LNP以按gRNA與mRNA負荷之重量計2:1之比率混合。劑量係基於gRNA及mRNA之組合RNA重量計算。用於LNP製備之運輸及儲存溶液(TSS)在實驗中作為僅媒劑陰性對照給藥。
將6-10週齡範圍內之CD-1雌性小鼠用於涉及小鼠之各研究中(n=5/組,除了TSS對照之n=4)。根據表30中所列之劑量,經由尾部靜脈注射靜脈內投與調配物。在給藥後至少24小時,定期觀測動物之不良反應。治療後六天,在異氟醚麻醉下藉由心臟穿刺將動物安樂死;收集肝臟組織用於下游分析。收集重量在5與15 mg之間的肝臟穿孔以分離基因體DNA及總RNA。用NGS定序分析基因體DNA樣品,如實例1中所描述。含有指定mRNA及gRNA之LNP之編輯效率展示於表30中且繪示於圖22中。
表 30. 小鼠肝臟中之平均編輯百分比
實例 13. 使用 Nme2Cas9 gRNA 之活體內鹼基編輯
mRNA | gRNA | 劑量(mg/kg) | |||
平均編輯% | SD | N | |||
TSS | TSS | - | 0.08 | 0.05 | 4 |
mRNA P (2x N末端NLS,HiBiT) | G021536 (101-nt Nme sgRNA) | 0.03 | 21.68 | 6.87 | 5 |
0.1 | 63.22 | 3.28 | 5 | ||
mRNA P (2x N末端NLS,HiBiT) | G021844 (93-nt Nme pgRNA) | 0.03 | 36.28 | 9.45 | 5 |
0.1 | 66.44 | 3.55 | 5 | ||
mRNA O (2 x N末端NLS) | G021844 (93-nt Nme pgRNA) | 0.03 | 40.88 | 14.16 | 5 |
0.1 | 66.02 | 5.01 | 5 |
在小鼠模型中用Nme鹼基編輯劑構築體測試具有不同mRNA之經修飾gRNA的編輯效率。此實驗與實例12並行地進行且使用相同對照樣品。LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備。用分別為50:38:9:3莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG製備所使用LNP。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。所使用之LNP如實例1中所描述調配,不同之處在於各組分、引導RNA或mRNA個別地調配於LNP中,且LNP在投與之前混合,如表31中所描述。對於Nme2Cas9及Nme2Cas9鹼基編輯器樣本,LNP以按gRNA與編輯劑mRNA負荷之重量計2:1之比率混合。對於SpyCas9鹼基編輯劑樣本,LNP以按gRNA與編輯劑mRNA負荷之重量計1:2之比率混合。如表31及圖14中所指示之劑量係基於gRNA與編輯劑mRNA之組合RNA重量計算。用額外0.03 mpk UGI mRNA處理鹼基編輯劑樣本。用於LNP製備之運輸及儲存溶液(TSS)在實驗中作為僅媒劑陰性對照給藥。
將6-10週齡範圍內之CD-1雌性小鼠用於涉及小鼠之各研究中(n=5/組,除了TSS對照之n=4)。根據表31中所列之劑量,經由尾部靜脈注射靜脈內投與調配物。在給藥後至少24小時,定期觀測動物之不良反應。治療後六天,在異氟醚麻醉下藉由心臟穿刺將動物安樂死;收集肝臟組織用於下游分析。收集重量在5與15 mg之間的肝臟穿孔以分離基因體DNA及總RNA。使用DNA分離套組(ZymoResearch,D3010)提取基因體DNA且用NGS定序分析樣品,如實例1中所描述。含有指定gRNA之LNP之編輯效率展示於表31中且繪示於圖23中。
表 31. 小鼠肝臟中之平均編輯百分比。
實例 14. NmeCas9 gRNA 在具有 Nme2Cas9 之 PMH 中之 劑量反應曲線
樣品 | 劑量(mg/kg) | C 至T % | C 至A/G % | 插入/ 缺失% | ||||||
平均值 | SD | n | 平均值 | SD | n | 平均值 | SD | n | ||
TSS | 0 | 0.00 | 0.00 | 4 | 0.10 | 0.00 | 4 | 0.08 | 0.05 | 4 |
mRNA O + G021844 (Nme2Cas9 + pgRNA) | 0.03 | 0.00 | 0.00 | 5 | 0.08 | 0.04 | 5 | 40.88 | 14.16 | 5 |
0.1 | 0.00 | 0.00 | 5 | 0.02 | 0.04 | 5 | 66.02 | 5.01 | 5 | |
mRNA S + mRNA G + G021844 (Nme2鹼基編輯劑 + UGI + pgRNA) | 0.03 | 25.60 | 5.28 | 5 | 3.50 | 0.76 | 5 | 11.14 | 2.18 | 5 |
0.1 | 46.34 | 1.53 | 5 | 5.74 | 0.33 | 5 | 13.52 | 0.90 | 5 | |
mRNA E + mRNA G + G000502 (SpyBC22n + UGI + sgRNA) | 0.03 | 9.28 | 2.82 | 5 | 0.94 | 0.54 | 5 | 7.34 | 1.61 | 5 |
0.1 | 30.72 | 8.51 | 5 | 2.86 | 0.23 | 5 | 15.60 | 2.58 | 5 |
在原代小鼠肝細胞(PMH)中用Nme2Cas9構築體測試經修飾gRNA之編輯效率。測試之所有Nme sgRNA均包含靶向小鼠TTR基因(mTTR)之相同24nt引導序列。
將PMH (Gibco,批號MC931)解凍且再懸浮於含有接種補充劑(威廉姆斯氏E培養基(Gibco,目錄號A12176-01))與地塞米松+混合液補充劑(Gibco,目錄號A15563,批號2019842)及具有FBS內含物之接種補充劑(Gibco,目錄號A13450,批號1970698)之肝細胞解凍培養基中,接著離心。丟棄上清液,且將粒化細胞再懸浮於肝細胞平板培養基加補充劑包(Invitrogen,目錄號A1217601及Gibco,目錄號CM3000)中。對細胞進行計數且以15,000個細胞/孔之濃度接種於經Bio-coat膠原蛋白I塗佈之96孔盤(Thermo Fisher,目錄號877272)上。使接種之細胞在37℃及5% CO
2氛圍下在組織培養恆溫箱中靜置且黏附4-6小時。培育後,檢查細胞之單層形成,且用肝細胞維持培養基(Invitrogen, 目錄號A1217601及Gibco, 目錄號CM4000)洗滌一次。
LNP一般如實例1中所描述以按gRNA與mRNA O之重量計1:2之負荷來製備。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比來製備所使用之LNP。用6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。使用自300 ng總RNA/100 µl孔(約32.25 nM gRNA濃度/孔)開始之8點4倍連續稀釋將各LNP施加至細胞,如表32中所示。用LNP處理後,將細胞在含有維持補充劑及3%胎牛血清之威廉姆斯氏E培養基(Gibco,A1217601)中在37℃下培育24小時。樣品均一式三份地進行。72小時後,收集細胞且藉由NGS進行分析,如實例1中所述。
含有指定gRNA之LNP之編輯效率及各自之對應EC50展示於表32中且繪示於圖26中。
表 32. 原代小鼠肝細胞中 TTR 基因座處之平均插入 / 缺失百分比。
實例 15. 使用 NmeCas9 gRNA 之活體內編輯
引導物 | 插入/ 缺失% | ng RNA | EC50 (ng RNA) | |||||||
300 | 75 | 18.75 | 4.68 | 1.17 | 0.29 | 0.07 | 0 | |||
G021536 | 平均值 | 97.7 | 96.4 | 90.9 | 43.1 | 13.9 | 1.3 | 0.3 | 0.0 | 5.23 |
SD | 0.5 | 0.3 | 5.0 | 10.1 | 6.5 | 0.7 | 0.1 | 0.0 | ||
G021844 | 平均值 | 96.7 | 96.9 | 93.8 | 60.6 | 27.2 | 4.0 | 0.5 | 0.3 | 2.86 |
SD | 0.8 | 0.3 | 1.9 | 7.5 | 13.4 | 2.7 | 0.3 | 0.1 | ||
G027492 | 平均值 | 97.1 | 96.5 | 95.2 | 64.3 | 30.2 | 6.2 | 0.5 | 0.0 | 2.49 |
SD | 1.4 | 0.4 | 1.6 | 13.4 | 15.9 | 3.5 | 0.4 | 0.1 | ||
G027493 | 平均值 | 96.5 | 94.9 | 82.7 | 32.4 | 8.6 | 0.9 | 0.0 | 0.0 | 6.95 |
SD | 0.1 | 0.6 | 6.4 | 6.2 | 5.5 | 0.8 | 0.1 | 0.0 | ||
G027494 | 平均值 | 96.0 | 91.7 | 78.3 | 19.6 | 6.7 | 0.7 | 0.0 | 0.0 | 9.06 |
SD | 1.0 | 2.2 | 8.9 | 7.6 | 4.0 | 0.4 | 0.1 | 0.0 | ||
G027495 | 平均值 | 96.0 | 94.6 | 83.8 | 22.0 | 11.6 | 1.8 | 0.2 | 0.1 | 8.31 |
SD | 0.5 | 1.8 | 6.8 | 9.5 | 7.3 | 1.8 | 0.1 | 0.1 | ||
G027496 | 平均值 | 96.2 | 93.2 | 77.8 | 13.2 | 5.4 | 0.4 | 0.1 | 0.0 | 10.22 |
SD | 0.7 | 2.9 | 8.4 | 3.4 | 2.7 | 0.4 | 0.1 | 0.0 |
在小鼠中用Nme2Cas9構築體測試經修飾gRNA之編輯效率。測試之所有Nme sgRNA均包含靶向小鼠TTR基因(mTTR)之相同24 nt引導序列。
LNP一般如實例1中所描述以按gRNA與mRNA O之重量計1:2之負荷來製備。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比來製備所使用之LNP。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。劑量係基於gRNA及mRNA之組合RNA重量計算。用於LNP製備之運輸及儲存溶液(TSS)在實驗中作為僅媒劑陰性對照給藥。
在涉及小鼠之各研究中使用約6-8週齡之CD-1雌性小鼠(所有組之n=5)。動物被定期餵食且進行標準維護。在劑量投與之前對動物進行稱重。經由尾部靜脈注射以0.03 mpk之劑量靜脈內投與TSS及LNP調配物。在給藥後至少24小時,定期觀測動物之不良反應。治療後七天,在異氟醚麻醉下藉由心臟放血將動物安樂死;收集用於血清製備之血液及肝臟組織用於下游分析。
使用血清TTR ELISA-前白蛋白ELISA (Aviva Systems;目錄號OKIA00111)根據製造商之方案產生表33及圖27中所示之血清TTR含量。相比於陰性對照(TSS),所有實驗組中之血清TTR含量顯著較低。
表 33. 血清 TTR 含量 ( μ g/ml) 。
引導物ID | 血清TTR ( μg/ml) | SD | %TSS |
TSS | 704.9 | 98.3 | 100% |
G021844 | 150.0 | 84.9 | 21% |
G021536 | 371.1 | 95.6 | 53% |
G027492 | 239.4 | 30.5 | 34% |
G027493 | 423.4 | 170.0 | 60% |
G027494 | 496.3 | 89.8 | 70% |
G027495 | 263.6 | 68.9 | 37% |
G027496 | 362.4 | 52.7 | 51% |
收集重量在5與15 mg之間的肝臟穿孔活檢以分離基因體DNA。使用DNA分離套組(ZymoResearch,D3012)提取基因體DNA且用NGS定序分析樣品(所有組之n=5),如實例1中所描述。含有指定gRNA之LNP之編輯效率展示於表34中且繪示於圖28中。
表 34. 小鼠肝臟樣品中 TTR 基因座處之平均插入 / 缺失百分比
實例 16. 使用 NmeCas9 gRNA 之活體內編輯
引導物 | 平均值 | SD |
TSS | 0.12 | 0.22 |
G021844 | 57.1 | 5.7 |
G021536 | 31.5 | 4.9 |
G027492 | 51.3 | 10.4 |
G027493 | 27.0 | 14.0 |
G027494 | 17.6 | 8.6 |
G027495 | 43.2 | 7.2 |
G027496 | 23.5 | 8.6 |
在小鼠中用Nme2Cas9 mRNA測試經修飾gRNA之編輯效率。所測試之所有Nme sgRNA均包含靶向mTTR之相同24nt引導序列。
LNP一般如實例1中所描述以按gRNA與mRNA O之重量計1:2之負荷來製備。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比來製備所使用之LNP。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。劑量係基於gRNA及mRNA之組合RNA重量計算。用於LNP製備之運輸及儲存溶液(TSS)在實驗中作為僅媒劑陰性對照給藥。
在涉及小鼠之各研究中使用約6週齡之CD-1雌性小鼠(所有組之n=5)。在劑量投與之前對動物稱重以用於劑量計算,且在投與後24小時對動物稱重以用於監測。經由尾部靜脈注射以0.01 mpk或0.03 mpk之劑量靜脈內投與TSS及LNP調配物。在給藥後至少24小時,定期觀測動物之不良反應。治療後七天,藉由在異氟醚麻醉下心臟放血使動物安樂死。藉由心臟穿刺收集血液用於血清TTR ELISA,且收集肝組織用於下游分析。
使用血清TTR ELISA-前白蛋白ELISA (Aviva Systems;目錄號OKIA00111)根據製造商之方案製備之血清TTR結果展示於圖29及表35中。
表 35. 治療之後的血清 TTR 量測結果。
引導物ID | 劑量(mpk) | 血清TTR ( μg/ml) | SD | N |
媒劑 | 663.5 | 61.5 | 5 | |
G021844 | 0.01 | 585.5 | 166.1 | 5 |
0.03 | 205.8 | 99.2 | 5 | |
G021536 | 0.01 | 749.2 | 425.3 | 5 |
0.03 | 252.6 | 50.2 | 4 | |
G027492 | 0.01 | 527.4 | 163.1 | 4 |
0.03 | 266.0 | 92.4 | 5 | |
G027495 | 0.01 | 626.9 | 157.7 | 5 |
0.03 | 310.0 | 118.1 | 5 |
收集重量為約5mg-15mg之肝臟穿孔活檢以分離基因體DNA及總RNA。使用DNA分離套組(ZymoResearch,D3012)提取基因體DNA且用NGS定序分析樣品(所有組之n=5),如實例1中所描述。含有指定gRNA之LNP之編輯效率展示於表36中且繪示於圖30中。
表 36. 小鼠肝臟樣品中 TTR 基因座處之平均插入 / 缺失百分比。
實例 17. 在 T 細胞中使用 Nme1Cas9 及 Nme3Cas9 mRNA 之引導物篩選
引導物ID | 劑量 | 平均值 | SD | N |
媒劑 | 0.00 | 0.1 | 0.07 | 5 |
G021844 | 0.01 | 19.7 | 2.9 | 5 |
0.03 | 49.6 | 7.9 | 5 | |
G021536 | 0.01 | 10.7 | 4.7 | 5 |
0.03 | 34.4 | 4.1 | 4 | |
G027492 | 0.01 | 21.1 | 9.2 | 4 |
0.03 | 44.6 | 9.4 | 5 | |
G027495 | 0.01 | 9.3 | 2.6 | 4 |
0.03 | 30.2 | 10.9 | 5 |
在具有Nme1Cas9或Nme3Cas9 mRNA之T細胞中使用TRAC基因座中具有9個不同目標序列之引導物測試了一種經修飾gRNA支架之編輯效率。
健康人類供體血球分離術為商業上獲得的(Hemacare,供體3786),且細胞經洗滌且再懸浮於CliniMACS® PBS/EDTA緩衝液(Miltenyi Biotec目錄號130-070-525)中且在MultiMACS™ Cell 24 Separator Plus裝置(Miltenyi Biotec)中進行處理。使用Straight from Leukopak® CD4/CD8 MicroBead套組,人類(Miltenyi Biotec目錄號130-122-352)經由陽性選擇分離T細胞。T細胞經等分且冷凍保存以在Cryostor® CS10 (StemCell Technologies目錄號07930)中使用。解凍後,將T細胞以1.0×10^
6個細胞/毫升之密度接種於由以下各者構成之T細胞生長培養基(TCGM)中:CTS OpTmizer T細胞擴增SFM及T細胞擴增補充物(Thermo Fisher目錄號A1048501)、5%人類AB血清(GeminiBio,目錄號100-512)、1×青黴素-鏈黴素、1× Glutamax、10 mM HEPES、200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech,目錄號200-02)、5 ng/mL重組人類介白素-7 (Peprotech,目錄號200-07)及5 ng/mL重組人類介白素-15 (Peprotech,目錄號200-15)。T細胞在此培養基中靜置24小時,此時其經以1:100體積比添加之T Cell TransAct™人類試劑(Miltenyi,目錄號130-111-160)活化。
對於Nme1Cas9引導物篩選,在P3緩衝液中製備含有編碼Nme1Cas9之mRNA (mRNA AB)的溶液。將靶向TRAC基因座中之各種位點之引導RNA在95℃下變性2分鐘,且在室溫下培育5分鐘。活化後四十八小時,收集T細胞,離心,且以12.5×10^
6個T細胞/毫升之濃度再懸浮於P3電穿孔緩衝液(Lonza)中。對於待電穿孔之各孔,將1×10^
5個T細胞與600 ng Nme1Cas9 mRNA及5μM gRNA在最終體積為20 µL之P3電穿孔緩衝液中混合。將此混合物一式兩份地轉移至96孔Nucleofector™盤中且使用製造商之脈衝碼電穿孔。經電穿孔之T細胞緊接著在不含細胞介素之CTS OpTmizer T細胞生長培養基中靜置15分鐘,隨後轉移至含有額外補充有細胞介素之CTS OpTmizer T細胞生長培養基的新平底96孔盤中。將所得盤在37℃下培育3天。在電穿孔後第3天,細胞在2個U形底盤中以1:2分裂。
在第電穿孔後第7天,藉由流式細胞分析技術分析接種之T細胞以確定T細胞受體之表面表現。簡言之,將T細胞與針對CD3 (BioLegend,目錄號317336)、CD4 (BioLegend,目錄號317434)、CD8 (BioLegend,目錄號301046)及Viakrome (Beckman Coulter,目錄號C36628)之抗體一起培育。隨後洗滌細胞,再懸浮於細胞染色緩衝液中且在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上進行處理。使用FlowJo套裝軟體分析流動式細胞量測術資料。T細胞基於大小、形狀、活力以及CD8及CD3之表現進行閘控。一式兩份地操作樣品。
CD3為T細胞受體複合物之細胞表面組分,且其在細胞表面處之存在被用作TRAC蛋白表現之替代標記。指定gRNA中之各者之CD3陰性細胞群體及對應標準差(SD)展示於表37中且繪示於圖31中。
表 37. 用 Nme1Cas9 進行 TRAC 編輯之後的平均 CD3 陰性 T 細胞百分比
引導物ID | 平均值 | SD |
G024103 | 0.95 | 0.02 |
G024104 | 1.52 | 0.04 |
G024108 | 52.82 | 0.40 |
G024109 | 1.69 | 0.14 |
G024110 | 2.24 | 0.39 |
G024111 | 2.10 | 0.06 |
G024112 | 1.81 | 0.14 |
G024113 | 1.19 | 0.26 |
G024114 | 0.97 | 0.05 |
對於用Nme3Cas9 mRNA篩選引導物,如此實例中所述地製備T細胞。在P3緩衝液中製備含有編碼Nme3Cas9之mRNA (mRNA Z)之溶液,以及Nme1Cas9 (mRNA AB)及Nme2Cas9 (mRNA O)之對照。如上文所述地進行NmeCas9 (例如Nme1Cas9、Nme2Cas9或Nme3Cas9) gRNA及mRNA之電穿孔。樣品一式三份地電穿孔。電穿孔後第3天,如上文所述地經由流式細胞分析技術分析細胞。
指定gRNA中之各者之CD3陰性細胞群體及對應標準差(SD)展示於表38中且繪示於圖32中。
表 38. 用 Nme3Cas9 進行 TRAC 編輯之後的平均 CD3 陰性 T 細胞百分比。
實例 18. 密碼子最佳化 NmeCas9 mRNA 之 表現
引導物ID | 平均值 | SD |
G028844 | 2.99 | 0.49 |
G028845 | 2.97 | 0.30 |
G028846 | 22.83 | 1.65 |
G028847 | 8.71 | 1.16 |
G028848 | 95.6 | 0.74 |
G028849 | 6.24 | 0.02 |
G028850 | 69.63 | 3.57 |
G028851 | 1.49 | 0.53 |
G028852 | 79.13 | 3.34 |
G028853 (Nme1對照) | 97.43 | 0.20 |
G021469 (Nme2對照) | 92.46 | 2.00 |
為了量化各mRNA構築體之表現,在將編碼Nme1Cas9、Nme2Cas9或Nme3Cas9之mRNA電穿孔至T細胞後量測蛋白質表現量。所有NmeCas9 mRNA構築體均具有相同的通式結構,具有在NmeCas9開放閱讀框之N末端的連續SV40及核質蛋白核定位信號編碼序列。構築體包括在NmeCas9開放閱讀框架之C末端的HiBiT標籤之編碼序列。該等組分由連接子連接且本文提供特異性序列。
健康人類供體血球分離術為商業上獲得的(Hemacare,供體3786),且細胞經洗滌且再懸浮於CliniMACS® PBS/EDTA緩衝液(Miltenyi Biotec目錄號130-070-525)中且在MultiMACS™ Cell 24 Separator Plus裝置(Miltenyi Biotec)中進行處理。使用Straight from Leukopak® CD4/CD8 MicroBead套組,人類(Miltenyi Biotec目錄號130-122-352)經由陽性選擇分離T細胞。T細胞經等分且在Cryostor® CS10 (StemCell Technologies目錄號07930)中冷凍保存以供將來使用。解凍後,將T細胞以1.0×10^
6個細胞/毫升之密度接種於由以下各者構成之T細胞生長培養基(TCGM)中:CTS OpTmizer T細胞擴增SFM及T細胞擴增補充物(Thermo Fisher目錄號A1048501)、5%人類AB血清(GeminiBio,目錄號100-512)、1×青黴素-鏈黴素、1× Glutamax、10 mM HEPES、200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech,目錄號200-02)、5 ng/mL重組人類介白素-7 (Peprotech,目錄號200-07)及5 ng/mL重組人類介白素-15 (Peprotech,目錄號200-15)。T細胞在此培養基中靜置24小時,此時其經以1:100體積比添加之T Cell TransAct™人類試劑(Miltenyi,目錄號130-111-160)活化。
在P3緩衝液中製備含有編碼NmeCas9之mRNA的溶液。將靶向TRAC基因座之引導RNA自儲存中取出,且在95℃下變性2分鐘,且在室溫下培育5分鐘。活化後四十八小時,收集T細胞,離心,且以12.5×10^
6個T細胞/毫升之濃度再懸浮於P3電穿孔緩衝液(Lonza)中。待電穿孔之各孔含有1×10^
5個細胞、表39中指定之NmeCas9 mRNA及表39中指定之1 μM gRNA (對於Nme1Cas9為G028853;對於Nme2Cas9為G021469;對於Nme3Cas9為G028848),最終體積為20 μL P3電穿孔緩衝液。使用自600 ng mRNA開始之三倍、五點連續稀釋來測試NmeCas9 mRNA。將適當gRNA及mRNA混合物一式三份轉移至96孔Nucleofector™盤中,且使用製造商之脈衝碼進行電穿孔。經電穿孔之T細胞緊接著在不含細胞介素之CTS OpTmizer T細胞生長培養基中靜置15分鐘,隨後轉移至含有額外補充有細胞介素之CTS OpTmizer T細胞生長培養基的新平底96孔盤中。將所得盤在37℃下培育24小時,隨後進行HiBiT發光分析,或培育96小時,隨後進行流式細胞分析技術。
在電穿孔後24小時收集T細胞用於蛋白表現分析。T細胞藉由Nano-Glo® HiBiT Lytic Assay (Promega)溶解。使用Biotek Neo2盤讀取器來量測發光。表39及圖33展示活化細胞中作為相對發光單位(RLU)之Cas9蛋白表現及對應標準差(SD)。
表 39. 作為 24 小時 T 細胞中之 Cas9 蛋白表現之相對量度的平均發光 (RLU) 。
mRNA (ng) | 600 | 200 | 66.6 | 22.2 | 7.4 | |
mRNA X (Nme1Cas9)G028853 | 平均值(RLU) | 6955.7 | 2941.0 | 1893.7 | 758.3 | 288.7 |
SD | 800.5 | 232.0 | 268.3 | 256.0 | 21.4 | |
mRNA Y (Nme1Cas9)G028853 | 平均值(RLU) | 10999.7 | 4967.6 | 2888.7 | 1423.0 | 479.3 |
SD | 1621.8 | 444.6 | 451.5 | 213.3 | 42.0 | |
mRNA V (Nme2Cas9)G021469 | 平均值(RLU) | 43026.7 | 15244.0 | 6522.3 | 2658.3 | 1067.3 |
SD | 7729.3 | 1288.1 | 229.0 | 174.3 | 127.1 | |
mRNA Z (Nme3Cas9)G028848 | 平均值(RLU) | 19217.3 | 6488.0 | 2386.0 | 1033.3 | 414.7 |
SD | 1311.8 | 521.0 | 394.3 | 93.6 | 50.2 |
編輯後第4天,T細胞藉由流式細胞分析技術進行分析以確定表面蛋白質表現。簡言之,將T細胞與在細胞染色緩衝液(BioLegend,目錄號420201)中稀釋之抗體的混合物一起在4℃下培育30分鐘。以1:100稀釋針對CD3 (BioLegend,目錄號317336)、CD4 (BioLegend,目錄號317434)、CD8 (BioLegend,目錄號301046)及Viakrome (Beckman Coulter,目錄號C36628)之抗體。隨後洗滌細胞,再懸浮於100 µL細胞染色緩衝液中且在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上進行處理。使用FlowJo套裝軟體分析流式細胞分析技術資料。T細胞基於大小、形狀、活力、CD8及CD3進行閘控。樣品均一式三份地進行。指定gRNA中之各者之CD3陰性細胞群體及對應標準差(SD)展示於表40中且繪示於圖34中。
表 40. TRAC 編輯之後 T 細胞之 CD3 陰性細胞百分比。
實例 19. 在原代食蟹獼猴肝細胞 (PCH) 中使用所選引導物進行活體外編輯
mRNA (ng) | 600 | 200 | 66.7 | 22.2 | 7.4 | |
mRNA X (Nme1Cas9)G028853 | 平均值 | 95.2 | 94.6 | 90.3 | 79.9 | 58.7 |
SD | 0.8 | 1.1 | 0.6 | 3.1 | 4.8 | |
mRNA Y (Nme1Cas9)G028853 | 平均值 | 97.2 | 96.2 | 93.7 | 88.7 | 75.0 |
SD | 0.8 | 1.1 | 0.9 | 1.4 | 1.3 | |
mRNA V (Nme2Cas9)G021469 | 平均值 | 87.7 | 84.6 | 80.3 | 66.6 | 42.7 |
SD | 3.3 | 3.9 | 2.4 | 1.6 | 0.1 | |
mRNA Z (Nme3Cas9)G028848 | 平均值 | 96.6 | 93.4 | 85.5 | 73.6 | 36.0 |
SD | 0.1 | 1.1 | 2.3 | 5.8 | 2.0 |
選擇三種NmeCas9 sgRNA (G024739、G024741及G024743)用於劑量反應分析中之評估。測試之靶向食蟹獼猴TTR基因之NmeCas9 sgRNA包括24個核苷酸之引導序列。
引導物之未經修飾及經修飾之型式提供於表41中。
表 41. 所選 gRNA 之 未經修飾及經修飾之型式。
引導物 ID | 未經修飾之序列 | 經修飾之序列 |
G024739 | AGGACCAGCCUCAGACACAAAUACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 947) | mA*mG*mG*mAmCCAmGmCCmUCmAGACAmCAAAmUACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 928) |
G024741 | CUGCCUCGGACGGCAUCUAGAACUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 948) | mC*mU*mG*mCmCUCmGmGAmCGmGCAUCmUAGAmACUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 929) |
G024743 | AGGCAGAGGAGGAGCAGACGAUGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 949) | mA*mG*mG*mCmAGAmGmGAmGGmAGCAGmACGAmUGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 930) |
如下所述,將gRNA及Cas9 mRNA脂質體轉染至原代食蟹獼猴肝細胞(PCH)中。如實例1中所述來製備(In Vitro ADMET Laboratories 10136011)。以40,000個細胞/孔之密度接種PCH。LNP調配物如實例1中所述地製備。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比之脂質組成來製備LNP。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比且用表41中所指示之gRNA來調配LNP。100 μL培養基中之PCH用含有sgRNA之LNP之8點、4倍稀釋系列(自70 ng開始)及按mRNA重量計固定30 ng劑量之囊封mRNA O之LNP處理。各孔中之sgRNA濃度指示於表42中。細胞在處理後72小時溶解,且如實例1中所述地進行NGS分析。在一式三份樣品中量測編輯效率對引導物濃度之劑量反應。表42及圖35顯示在各引導物濃度下之平均編輯百分比及標準差(SD)。
表 42. 在 PCH 中編輯後在 TTR 處之平均插入 / 缺失百分比。
實例 20. 在 PCH 中使用 mRNA 稀釋系列活體外編輯 LNP
G024739 | G024741 | G024743 | ||||
引導物LNP (ng/uL) | 平均值 | SD | 平均值 | SD | 平均值 | SD |
0.7 | 79.0 | 1.7 | 63.5 | 3.7 | 42.6 | 1.1 |
0.2 | 56.8 | 2.4 | 17.4 | 1.2 | 25.4 | 2.3 |
0.04 | 27.2 | 3.6 | 2.3 | 0.5 | 9.8 | 0.5 |
0.01 | 9.5 | 1.8 | 0.6 | 0.1 | 3.6 | 0.5 |
0.003 | 3.5 | 0.9 | 0.3 | 0.1 | 0.7 | 0.3 |
0.0007 | 0.9 | 0.3 | 0.1 | 1.3 | 0.3 | 0.1 |
0.0002 | 0.4 | 0.1 | 0.1 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
0.00004 | 0.2 | 0.0 | 0.1 | 1.3 | 0.0 | 0.0 |
分析在食蟹獼猴TTR基因中具有相同靶向位點之經修飾sgRNA以評估不同mRNA (mRNA O、mRNA AA)及調配物比率在PCH中之編輯效率。除非另有說明,否則此實例中PCH (In Vitro ADMET Laboratories,10136011)之製備、處理及分析均與實例1中所述相同。使用PCH且以50,000個細胞/孔之密度接種。LNP調配物如實例1中所述地製備。以具有50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比之脂質組成來製備LNP。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比且用表43中所指示之gRNA來調配LNP。100 μL培養基中之PCH用8點、3倍連續稀釋之混合(單獨調配)或共調配的具有各種gRNA:mRNA比率之LNP處理。最高劑量為按重量計3 ng/μL總RNA,且稀釋系列之gRNA:mRNA比率如表43中所指示。樣品均一式三份地進行。平均編輯百分比、標準差(SD)及計算EC50展示於表43及圖36中。
表 43. 在 PCH 中編輯後在 TTR 基因座處之平均插入 / 缺失百分比。
實例 21. 使用 NmeCas9 gRNA 之活體內編輯
LNP (ng/uL) | EC50 (ng/uL) | |||||||||
3 | 1 | 0.33 | 0.11 | 0.04 | 0.01 | 0.004 | 0.001 | |||
G024739:mRNA O LNP 混合2:1 | 平均編輯% | 64 | 64.3 | 45.7 | 25.6 | 6.5 | 1.6 | 0.2 | 0.1 | 0.17 |
SD | 6.9 | 12.8 | 5.1 | 8.5 | 2.0 | 0.9 | 0.0 | 1.3 | ||
G024739:mRNA AA LNP 混合2:1 | 平均編輯% | 58.2 | 69.2 | 46.5 | 29.3 | 7.4 | 0.6 | 0.1 | 0.0 | 0.13 |
SD | 4.5 | 12.2 | 13.8 | 7.6 | 3.3 | 0.3 | 0.0 | 0.0 | ||
G024739:mRNA AA LNP 混合1:2 | 平均編輯% | 56.5 | 67.1 | 53.4 | 25.4 | 5.8 | 0.7 | 0.1 | 0.0 | 0.13 |
SD | 4.7 | 10.9 | 16.0 | 11.7 | 2.4 | 0.5 | 0.0 | 0.0 | ||
G024739:mRNA O 共調配2:1 | 平均編輯% | 61.3 | 59.2 | 47.0 | 27.2 | 7.2 | 0.4 | 0.1 | 0.1 | 0.14 |
SD | 4.4 | 9.3 | 13.2 | 8.4 | 2.2 | 0.2 | 0.0 | 0.0 | ||
G024739:mRNA AA 共調配2:1 | 平均編輯% | 58.2 | 69.6 | 56.4 | 35.3 | 7.2 | 1.2 | 0.2 | 0.1 | 0.10 |
SD | 3.0 | 14.4 | 11.4 | 11.4 | 3.3 | 0.4 | 0.1 | 1.3 | ||
G024739:mRNA AA 共調配1:2 | 平均編輯% | 47.0 | 62.8 | 56.1 | 38 | 12.3 | 1.3 | 0.1 | 0.1 | 0.07 |
SD | 5.8 | 10.5 | 15.3 | 13.9 | 4.3 | 0.1 | 0.0 | 1.3 |
在小鼠中用Nme2Cas9構築體測試經修飾gRNA之編輯效率。測試之所有Nme sgRNA均包含靶向小鼠TTR基因(mTTR)之相同24 nt引導序列。
LNP一般如實例1中所描述以按gRNA與mRNA O之重量計1:2之負荷來製備。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比來製備所使用之LNP。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。劑量係基於gRNA及mRNA之組合RNA重量計算。用於LNP製備之運輸及儲存溶液(TSS)在實驗中作為僅媒劑陰性對照給藥。
在涉及小鼠之各研究中使用約6-8週齡之CD-1雌性小鼠。動物被定期餵食且進行標準維護。在劑量投與之前對動物進行稱重。經由尾部靜脈注射以0.03 mpk之劑量靜脈內投與TSS及LNP調配物。在給藥後至少24小時,定期觀測動物之不良反應。治療後十四天,在異氟醚麻醉下藉由心臟放血將動物安樂死;收集用於血清製備之血液及肝臟組織用於下游分析。
使用血清TTR ELISA-前白蛋白ELISA (Aviva Systems;目錄號OKIA00111)根據製造商之方案對所有實驗組產生表44及圖39中所示之血清TTR含量且相比於陰性對照(TSS)。
表 44 . 血清 TTR 含量 ( μ g/ml) 。
收集重量在5與15 mg之間的肝臟穿孔活檢以分離基因體DNA。使用DNA分離套組(ZymoResearch,D3012)提取基因體DNA且用NGS定序分析樣品,如實例1中所描述。含有指定gRNA之LNP之編輯效率展示於表45中且繪示於圖40中。
表 45. 小鼠肝臟樣品中 TTR 基因座處之平均插入 / 缺失百分比
實例 22. NmeCas9 gRNA 在具有 Nme2Cas9 之 PMH 中之 劑量反應曲線
引導物ID | 血清TTR ( μg/ml) | SD | %TSS | N |
TSS | 673.7 | 44.13 | 100 | 5 |
G021536 | 378.2 | 83.0 | 56.1 | 7 |
G029377 | 419.3 | 83.5 | 62.2 | 9 |
G029384 | 270.1 | 63.90 | 40.1 | 4 |
G029392 | 375.4 | 58.23 | 55.7 | 4 |
G029391 | 509.1 | 115.3 | 75.6 | 4 |
G029390 | 623.2 | 144.3 | 92.5 | 4 |
引導物 | 平均編輯% | SD | N |
TSS | 0.1 | 0 | 5 |
G021536 | 27.2 | 4.58 | 7 |
G029377 | 25.7 | 6.77 | 9 |
G029384 | 34.9 | 4.05 | 4 |
G029392 | 20.9 | 6.14 | 4 |
G029391 | 5.4 | 2.60 | 4 |
G029390 | 5.5 | 3.66 | 4 |
在原代小鼠肝細胞(PMH)中用Nme2Cas9構築體測試經修飾gRNA之編輯效率。測試之所有Nme sgRNA均包含靶向小鼠TTR基因(mTTR)之相同24nt引導序列。
將PMH (Gibco,批號MC931)解凍且再懸浮於肝細胞解凍培養基中,接著離心。丟棄上清液且將粒化細胞再懸浮於具有接種補充劑地塞米松+混合液補充劑(Gibco,目錄號A15563,批號2459010)及FBS內含物(Gibco,目錄號A13450,批號2486425)之肝細胞平板培養基(威廉姆斯氏E培養基(Gibco,目錄號A12176-01))中。對細胞進行計數且以15,000個細胞/孔之濃度接種於經Bio-coat膠原蛋白I塗佈之96孔盤(Corning,參考號356407,批號08722018)上。使接種之細胞在37℃及5% CO
2氛圍下在組織培養恆溫箱中靜置且黏附4-6小時。培育後,檢查細胞之單層形成且用具有平板培養基補充劑(Gibco,目錄號A15564,批號2459014)之肝細胞維持培養基(威廉姆斯氏E培養基)洗滌一次。
LNP一般如實例1中所描述以按gRNA與mRNA O之重量計1:2之負荷來製備。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比來製備所使用之LNP。用6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。如表46中所示,在最高劑量(300 ng mRNA O及46.5 nM gRNA (約150 ng gRNA))下使用自450 ng總負荷/100 µl孔開始之8點3倍連續稀釋將各LNP施加至細胞。用LNP處理後,將細胞在含有平板培養基補充劑(Gibco,目錄號A15564,批號2459014)及3%胎牛血清之威廉姆斯氏E培養基中在37℃下培育24小時。72小時後,收集細胞且藉由NGS進行分析,如實例1中所述。
含有指定gRNA之LNP之編輯效率及各自之對應EC50展示於表46中且繪示於圖41中。
表 46. 原代小鼠肝細胞中 TTR 基因座處之平均插入 / 缺失百分比。
實例 23. NmeCas9 gRNA 在具有 Nme2Cas9 之 PMH 中之 劑量反應曲線
引導物 | 插入/ 缺失% | nM gRNA | EC50 (nM gRNA) | |||||||
46.5 | 15.5 | 5.1 | 1.7 | 0.5 | 0.19 | 0.064 | 0.02 | |||
G021536 | 平均值 | 97.20 | 97.83 | 97.73 | 96.75 | 95.55 | 83.83 | 48.33 | 15.53 | 0.071 |
SD | 0.63 | 0.25 | 0.45 | 1.70 | 0.50 | 2.17 | 4.99 | 0.90 | ||
N | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | ||
G029377 | 平均值 | 96.65 | 96.68 | 96.90 | 96.73 | 93.63 | 83.65 | 46.88 | 16.73 | 0.075 |
SD | 0.82 | 1.42 | 1.04 | 0.59 | 2.40 | 1.92 | 3.14 | 1.05 | ||
N | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | ||
G029380 | 平均值 | 95.90 | 97.00 | 96.08 | 95.55 | 88.38 | 62.00 | 22.85 | 5.38 | 0.136 |
SD | 2.27 | 0.99 | 1.23 | 1.28 | 2.04 | 0.84 | 1.47 | 1.05 | ||
N | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | ||
G029379 | 平均值 | 97.13 | 96.75 | 96.43 | 95.20 | 90.65 | 62.20 | 22.00 | 5.33 | 0.139 |
SD | 0.49 | 1.33 | 1.11 | 1.16 | 1.61 | 1.47 | 1.64 | 0.43 | ||
N | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | ||
G029378 | 平均值 | 95.88 | 97.00 | 96.05 | 94.90 | 87.05 | 53.03 | 16.28 | 3.40 | 0.172 |
SD | 1.54 | 0.94 | 1.15 | 1.56 | 2.00 | 2.00 | 1.37 | 0.86 | ||
N | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | ||
G029381 | 平均值 | 97.08 | 96.05 | 96.65 | 95.50 | 87.90 | 52.28 | 16.83 | 3.40 | 0.175 |
SD | 0.82 | 1.95 | 0.93 | 0.94 | 1.71 | 3.03 | 2.35 | 0.48 | ||
N | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 |
在原代小鼠肝細胞(PMH)中用Nme2Cas9構築體測試經修飾gRNA之編輯效率。測試之所有Nme sgRNA均包含靶向小鼠TTR基因(mTTR)之相同24nt引導序列。
將PMH (Gibco,批號MC931)解凍且再懸浮於肝細胞解凍培養基中,接著離心。丟棄上清液且將粒化細胞再懸浮於具有接種補充劑地塞米松+混合液補充劑(Gibco,目錄號A15563,批號2459010)及FBS內含物(Gibco,目錄號A13450,批號2486425)之肝細胞平板培養基(威廉姆斯氏E培養基(Gibco,目錄號A12176-01))中。對細胞進行計數且以15,000個細胞/孔之濃度接種於經Bio-coat膠原蛋白I塗佈之96孔盤(Corning,參考號356407,批號08722018)上。使接種之細胞在37℃及5% CO
2氛圍下在組織培養恆溫箱中靜置且黏附4-6小時。培育後,檢查細胞之單層形成且用具有平板培養基補充劑(Gibco,目錄號A15564,批號2459014)之肝細胞維持培養基(威廉姆斯氏E培養基)洗滌一次。
LNP一般如實例1中所描述以按gRNA與mRNA O之重量計1:2之負荷來製備。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比來製備所使用之LNP。用6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。如表47中所示,在最高劑量(300 ng mRNA O及46.5 nM gRNA (亦即,150 ng gRNA))下使用自450 ng總負荷/100 µl孔開始之8點3倍連續稀釋將各LNP施加至細胞。用LNP處理後,將細胞在含有平板培養基補充劑(Gibco,目錄號A15564,批號2459014)及3%胎牛血清之威廉姆斯氏E培養基中在37℃下培育24小時。一式兩份地操作樣品。72小時後,收集細胞且藉由NGS進行分析,如實例1中所述。
含有指定gRNA之LNP之編輯效率及各自之對應EC50展示於表47中且繪示於圖42中。
表 47. 原代小鼠肝細胞中 TTR 基因座處之平均插入 / 缺失百分比。
實例 24. 額外實施例
引導物 | 插入/ 缺失% | nM gRNA | EC50 (nM gRNA) | |||||||
46.5 | 15.5 | 5.1 | 1.7 | 0.5 | 0.19 | 0.064 | 0.02 | |||
G029384 | 平均值 | 96.70 | 97.30 | 96.57 | 95.37 | 92.70 | 78.67 | 43.77 | 13.87 | 0.077 |
SD | 0.85 | 0.52 | 1.71 | 1.01 | 1.95 | 3.73 | 4.00 | 1.50 | ||
N | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | ||
G021536 | 平均值 | 97.13 | 96.91 | 96.58 | 95.77 | 90.42 | 73.29 | 36.63 | 10.49 | 0.092 |
SD | 0.00 | 0.23 | 0.03 | 0.76 | 1.26 | 1.96 | 1.53 | 0.10 | ||
N | 18.00 | 18.00 | 18.00 | 18.00 | 18.00 | 18.00 | 18.00 | 18.00 | ||
G029383 | 平均值 | 96.93 | 96.83 | 96.13 | 94.37 | 90.50 | 73.20 | 34.77 | 9.07 | 0.094 |
SD | 0.90 | 1.08 | 2.21 | 2.75 | 3.05 | 2.92 | 2.23 | 0.91 | ||
N | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | ||
G029388 | 平均值 | 96.60 | 97.03 | 96.67 | 95.23 | 89.63 | 71.13 | 34.07 | 9.90 | 0.100 |
SD | 0.95 | 0.98 | 2.05 | 2.80 | 0.76 | 2.75 | 3.74 | 3.12 | ||
N | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | ||
G029392 | 平均值 | 96.57 | 95.87 | 96.60 | 95.23 | 90.30 | 72.50 | 31.13 | 6.87 | 0.101 |
SD | 1.47 | 2.03 | 1.47 | 2.72 | 3.15 | 1.56 | 1.74 | 0.81 | ||
N | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | ||
G029382 | 平均值 | 96.83 | 97.37 | 96.50 | 95.87 | 89.43 | 69.10 | 33.80 | 9.87 | 0.104 |
SD | 0.67 | 0.47 | 1.30 | 1.12 | 3.41 | 4.92 | 4.06 | 0.61 | ||
N | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | ||
G029386 | 平均值 | 97.17 | 97.20 | 96.23 | 95.80 | 91.70 | 71.53 | 32.57 | 9.43 | 0.105 |
SD | 0.55 | 1.13 | 0.38 | 1.32 | 0.95 | 0.61 | 1.62 | 0.93 | ||
N | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | ||
G029385 | 平均值 | 96.80 | 95.90 | 96.67 | 94.87 | 87.83 | 66.95 | 25.60 | 7.20 | 0.123 |
SD | 0.80 | 0.14 | 1.23 | 1.53 | 3.11 | 2.47 | 2.52 | 0.87 | ||
N | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | ||
G029387 | 平均值 | 94.07 | 95.65 | 95.23 | 94.00 | 81.90 | 56.83 | 22.67 | 5.97 | 0.149 |
SD | 0.15 | 0.35 | 0.71 | 0.56 | 2.69 | 1.80 | 0.47 | 0.49 | ||
N | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | ||
G029391 | 平均值 | 95.70 | 95.77 | 95.43 | 94.30 | 85.40 | 56.03 | 19.83 | 4.70 | 0.156 |
SD | 1.40 | 2.49 | 2.98 | 2.96 | 3.03 | 2.62 | 2.40 | 0.69 | ||
N | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | ||
G029389 | 平均值 | 96.80 | 96.40 | 95.87 | 94.60 | 85.53 | 54.23 | 17.63 | 3.40 | 0.164 |
SD | 1.14 | 0.99 | 2.32 | 1.93 | 2.16 | 4.05 | 1.75 | 0.62 | ||
N | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | ||
G029390 | 平均值 | 96.00 | 95.40 | 94.60 | 93.07 | 77.60 | 42.13 | 11.70 | 2.20 | 0.219 |
SD | 1.49 | 3.49 | 3.97 | 2.97 | 2.29 | 4.10 | 2.49 | 0.70 | ||
N | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 |
以下編號條項提供對本文實施例之額外支持及描述。
第1項為一種引導RNA (gRNA),其包含引導區及保守區,該保守區包含以下中之一或多者:
(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65;或
(b)經縮短之髮夾1區,其中該經縮短之髮夾1缺少2-10個、視情況2-8個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失,且視情況位置82-96中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96;或
(c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失,且視情況核苷酸113-134中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135;
其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144-145中之一或兩者視情況缺失;
其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
第2項為如第1項之gRNA,其中gRNA為單引導RNA (sgRNA)且其中gRNA包含(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸,其中
(i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代;及
(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65。
第3項為如第1或2項之gRNA,其中該引導區具有(i)相對於SEQ ID NO: 500,在位置1-24內一個核苷酸之插入或1-4個核苷酸之缺失,或(ii) 24個核苷酸之長度。
第4項為如前一項之gRNA,其中該引導區具有25、24、23、22、21或20個核苷酸之長度,視情況其中該引導區具有25、24、23或22個核苷酸之長度。
第5項為如前一項之gRNA,其中引導區具有23-24個核苷酸之長度。
第6項為如前述項中任一項之gRNA,其中該gRNA進一步包含3'尾。
第7項為如前一項之gRNA,其中該3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。
第8項為如前一項之gRNA,其中該3'尾包含1、2、3、4或5個核苷酸。
第9項為如第6-8項中任一項之gRNA,其中該3'尾以包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸終止。
第10項為如第6-9項中任一項之gRNA,其中該3'尾之長度為1個核苷酸。
第11項為如第6-10項中任一項之gRNA,其中該3'尾由包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸組成。
第12項為如第6-11項中任一項之gRNA,其中該3'尾包含存在於該3'尾中之核苷酸中之任何一或多者的修飾。
第13項為如第6-12項中任一項之gRNA,其中該3'尾之修飾為2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸及核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯中之一或多者。
第14項為如第6-13項中任一項之gRNA,其中該3'尾經完全修飾。
第15項為如第前述項中任一項之gRNA,其中該gRNA之3'核苷酸為包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸。
第16項為如第1-5項中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144及145中之一或多者缺失。
第17項為如第1-5項中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144及145均缺失。
第18項為如第1-5項中任一項之gRNA,其中該gRNA不包含3'尾。
第19項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸。
第20項為如前述項中任一項之gRNA,其中經縮短之重複/反重複區具有28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸之長度。
第21項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區缺少12-24個、視情況18-24個核苷酸、視情況20-22個核苷酸。
第22項為如前述項中任一項之gRNA,其中經縮短之重複/反重複區具有28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。
第23項為如前述項中任一項之gRNA,其中經縮短之重複/反重複區具有28、29、30、31、32、33或34個核苷酸,或30、31或32個核苷酸之長度。
第24項為如前述項中任一項之gRNA,其中SEQ ID NO: 500之核苷酸37-64形成上莖,且該經縮短之重複/反重複區之上莖的一或多個鹼基對缺失。
第25項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區之上莖包含不超過一個、兩個、三個或四個鹼基對。
第26項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的位置39-48中之所有者及位置53-62中之所有者均缺失,且視情況核苷酸38或63經取代。
第27項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的位置38-48中之所有者及位置53-63中之所有者均缺失,且視情況核苷酸37或64經取代。
第28項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的核苷酸37-48及53-64中之所有者均缺失,且視情況核苷酸36或65經取代。
第29項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有長度為11個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
第30項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有單一雙螺旋部分。
第31項為如前述項中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,經縮短之重複/反重複區之上莖包括一或多個取代。
第32項為如前述項中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸49-52中之一或多者經取代。
第33項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區未經取代。
第34項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有12-22個經修飾之核苷酸。
第35項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區缺少2-10個核苷酸,視情況2-8個或2-4個核苷酸。
第36項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區具有13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸之長度。
第37項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區具有長度為4-8個,視情況7-8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
第38項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區具有單一雙螺旋部分。
第39項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區之一或兩個鹼基對缺失。
第40項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區之莖的長度為七個或八個鹼基配對核苷酸。
第41項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區之位置85-86中之一或多者及核苷酸91-92中之一或多者缺失。
第42項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區之核苷酸86及91或核苷酸85及92缺失。
第43項為如前述項中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,該經縮短之髮夾1區之核苷酸82-95中之一或多者經取代。
第44項為如前述項中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸87-90中之一或多者經取代。
第45項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區未經取代。
第46項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區具有6-15個經修飾之核苷酸。
第47項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸。
第48項為如前述項中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。
第49項為如前述項中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區具有28、29、30、31、32、33或34個核苷酸之長度。
第50項為如前述項中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區之核苷酸113-121中之一或多者及核苷酸126-134中之一或多者缺失。
第51項為如前述項中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區包含不配對區。
第52項為如前述項中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區具有兩個雙螺旋部分。
第53項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區具有長度為4個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
第54項為如第52-53項中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區具有長度為4-8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
第55項為如第52-54項中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區具有長度為4-6個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
第56項為如前述項中任一項之gRNA,其中SEQ ID NO: 500之核苷酸113-134形成上莖,且經縮短之髮夾2區之上莖包含一個、兩個、三個或四個鹼基對。
第57項為如前述項中任一項之gRNA,其中核苷酸113與134、核苷酸114與133、核苷酸115與132、核苷酸116與131、核苷酸117與130、核苷酸118與129、核苷酸119與128、核苷酸120與127及核苷酸121與126中之至少一對缺失。
第58項為如前述項中任一項之gRNA,其中經縮短之髮夾2區之位置113-121及126-134中之所有者均缺失。
第59項為如前述項中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,該經縮短之髮夾2區之核苷酸113-134中之一或多者經取代。
第60項為如前述項中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸122-125中之一或多者經取代。
第61項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區未經取代。
第62項為如前述項中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區具有6-15個經修飾之核苷酸。
第63項為如前述項中任一項之gRNA,其中該gRNA之該引導區包含至少兩個經修飾之核苷酸、視情況至少四個經修飾之核苷酸。
第64項為如前述項中任一項之gRNA,其中gRNA之引導區包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個經修飾之核苷酸,視情況1、2或3個經修飾之核苷酸。
第65項為如前述項中任一項之gRNA,其中gRNA之引導區包含4、5、6、7、8、9、10、11或12個經修飾之核苷酸。
第66項為如前述項中任一項之gRNA,其中gRNA之引導區包含6、7、8、9、10、11或12個經修飾之核苷酸。
第67項為如前述項中任一項之gRNA,其中引導區在引導區之前三個核苷酸之3'不包含經修飾之核苷酸。
第68項為如前述項中任一項之gRNA,其中該引導區不包含經修飾之核苷酸。
第69項為如前述項中任一項之gRNA,其中該gRNA包含5'端修飾。
第70項為如前述項中任一項之gRNA,其中該gRNA包含3'端修飾。
第71項為如前述項中任一項之gRNA,其中該gRNA包含5'端修飾及3'端修飾。
第72項為如前述項中任一項之gRNA,其包含該重複/反重複區之上莖區中之修飾。
第73項為如前述項中任一項之gRNA,其包含髮夾1區中之修飾。
第74項為如前述項中任一項之gRNA,其包含該髮夾2區中之修飾。
第75項為如前述項中任一項之gRNA,其包含3'端修飾,且包含重複/反重複區之上莖區中之修飾。
第76項為如前述項中任一項之gRNA,其包含3'端修飾及該髮夾1區中之修飾。
第77項為如前述項中任一項之gRNA,其包含3'端修飾及該髮夾2區中之修飾。
第78項為如前述項中任一項之gRNA,其包含5'端修飾,且包含重複/反重複區之上莖區中之修飾。
第79項為如前述項中任一項之gRNA,其包含5'端修飾及該髮夾1區中之修飾。
第80項為如前述項中任一項之gRNA,其包含5'端修飾及該髮夾2區中之修飾。
第81項為如前述項中任一項之gRNA,其包含5'端修飾、重複/反重複區之上莖區中之修飾及3'端修飾。
第82項為如前述項中任一項之gRNA,其包含5'端修飾、髮夾1區中之修飾及3'端修飾。
第83項為如前述項中任一項之gRNA,其包含5'端修飾、該髮夾1區中之修飾、該髮夾2區中之修飾及3'端修飾。
第84項為如前述項中任一項之gRNA,其包含5'端修飾、該重複/反重複區中之修飾、該髮夾1區中之修飾、該髮夾2區中之修飾及3'端修飾。
第85項為如第69-84項中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或反向無鹼基修飾之核苷酸。
第86項為如第69-85項中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或反向無鹼基修飾之核苷酸。
第87項為如第69-86項中任一項之gRNA,其中5'端修飾包含以下中之任一者:
i. 前1、2、3或4個核苷酸中之任何一或多者之修飾;
ii. 一個經修飾之核苷酸;
iii. 兩個經修飾之核苷酸;
iv. 三個經修飾之核苷酸;及
v. 四個經修飾之核苷酸。
第88項為如第69-87項中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含以下中之一或多者:
i. 核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯;
ii. 2'-OMe修飾之核苷酸;
iii. 2'-O-moe修飾之核苷酸;
iv. 2'-F修飾之核苷酸;及
v. 反向無鹼基修飾之核苷酸。
第89項為如第69-88項中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含以下中之任一者:
i. 最後4、3、2或1個核苷酸中之任何一或多者之修飾;
ii. 一個經修飾之核苷酸;
iii. 兩個經修飾之核苷酸;
iv. 三個經修飾之核苷酸;及
v. 四個經修飾之核苷酸。
第90項為如第69-89項中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含以下中之一或多者:
i. 核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯;
ii. 2'-OMe修飾之核苷酸;
iii. 2'-O-moe修飾之核苷酸;
iv. 2'-F修飾之核苷酸;及
v. 反向無鹼基修飾之核苷酸。
第91項為如第69-90中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含至少一個PS鍵聯,且其中存在以下中之一或多者:
i. 存在一個PS鍵聯,且該鍵聯介於第一個核苷酸與第二個核苷酸之間;
ii. 前三個核苷酸之間存在兩個PS鍵聯;
iii. 前四個核苷酸中之任何一或多者之間存在PS鍵聯;及
iv. 前五個核苷酸中之任何一或多者之間存在PS鍵聯。
第92項為如第91項之gRNA,其中該5'端修飾進一步包含至少一個經2'-OMe、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。
第93項為如前述項中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含:
i. 前1-4個核苷酸中之一或多者的修飾,其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe或2'-F;
ii. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對第一核苷酸之修飾,及視情況存在之連至下一核苷酸或該3'尾之第一核苷酸的一或兩個PS鍵聯;
iii. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對第一或第二核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯;
iv. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對第一、第二或第三核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯;或
v. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對第一、第二、第三或第四核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯。
第94項為如前述項中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含至少一個PS鍵聯,且其中存在以下中之一或多者:
i. 存在一個PS鍵聯,且該鍵聯介於最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間;
ii. 最後三個核苷酸之間存在兩個PS鍵聯;及
iii. 最後四個核苷酸中之任何一或多者之間存在PS鍵聯。
第95項為如第94項之gRNA,其中該3'端修飾進一步包含至少一個經2'-OMe、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。
第96項為如前述項中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含:
i. 最後1-4個核苷酸中之一或多者的修飾,其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe或2'-F;
ii. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對最後一個核苷酸之修飾,及視情況存在之連至下一核苷酸或該3'尾之第一核苷酸之一或兩個PS鍵聯;
iii. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對最後一個或倒數第二個核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯;
iv. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對最後一個、倒數第二個或倒數第三個核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯;或
v. 2'-OMe、2'-O-moe或2'-F對最後一個、倒數第二個、倒數第三個或倒數第四個核苷酸之修飾,及視情況存在之一或多個PS鍵聯。
第97項為如前述項中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸或核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
第98項為如前述項中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸或核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
第99項為如前述項中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸或核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
第100項為如前述項中任一項之gRNA,其中至少20%、30%、40%或50%之核苷酸為經修飾之核苷酸。
第101項為如第100項之gRNA,其中gRNA包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或其組合。
第102項為如第100或101項之gRNA,其包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或其組合。
第103項為如前述項中任一項之gRNA,其中該引導區之核苷酸1-3經修飾,且該引導區中除核苷酸1-3以外的核苷酸未經修飾。
第104項為如前述項中任一項之gRNA,其中核苷酸144之3'尾存在於該gRNA中,且包含核苷酸141-144處之2'-O-Me修飾之核苷酸及分別在核苷酸141-142及142-143之間的兩個PS鍵聯。
第105項為如前述項中任一項之gRNA,其中49-52、87-90或122-125之一或多個位置經取代。
第106項為包含SEQ ID NO: 1-9中之任一者的單引導RNA (sgRNA)。
第107項為如前述項中任一項之gRNA,其包含與SEQ ID No: 1-9中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列。
第108項為如前述項中任一項之gRNA,其包含與SEQ ID No: 1-9中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列,其中與表1中之參考序列標識符之核苷酸對應的該gRNA之各核苷酸處的修飾與表2中之參考序列標識符中所示的修飾一致或等效。
第109項為如前述項中任一項之gRNA,其包含與SEQ ID NO: 1-5、7、8、101-291及301-494中之任一者之核苷酸序列的自X至3'端的序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的核苷酸序列,其中X為保守區之第一核苷酸。
第110項為如第106-109項中任一項之gRNA,其進一步含有包含2'-O-Me修飾之核苷酸的3'尾。
第111項為如前述項中任一項之gRNA,其中該gRNA將核酸酶導引至目標序列以進行結合。
第112項為如前述項中任一項之gRNA,其中該gRNA將核酸酶導引至目標序列以在該目標序列內誘導雙股斷裂。
第113項為如前述項中任一項之gRNA,其中該gRNA將核酸酶導引至目標序列以在該目標序列內誘導單股斷裂。
第114項為如第111-113項中任一項之gRNA,其中該核酸酶為Nme Cas9。
第115項為如前述項中任一項之gRNA,其中gRNA包含保守取代,視情況其中保守取代維持至少一個鹼基對。
第116項為一種組合物,其包含與脂質奈米粒子(LNP)締合的如前述項中任一項之gRNA。
第117項為一種LNP組合物,其包含如前述項中任一項之gRNA。
第118項為一種組合物,其包含如第1-115項中任一項之gRNA,或如第116-117項中任一項之組合物,其進一步包含核酸酶或編碼該核酸酶之mRNA。
第119項為如第118項之組合物,其中該核酸酶為Cas蛋白。
第120項為如第119項之組合物,其中該Cas蛋白為Nme Cas9。
第121項為如第120項之組合物,其中該Nme Cas9為Nme1 Cas9、Nme2 Cas9或Nme3 Cas9。
第122項為如第118-121項中任一項之組合物,其中核酸酶具有雙股裂解活性。
第123項為如第118-122項中任一項之組合物,其中核酸酶具有切口酶活性。
第124項為如第118-123項中任一項之組合物,其中核酸酶具有dCas DNA結合域。
第125項為如第118-124項中任一項之組合物,其中該核酸酶經修飾。
第126項為如第125項之組合物,其中經修飾之核酸酶包含異源功能域。
第127項為如第126項之組合物,其中該異源功能域為脫胺酶。
第128項為如第127項之組合物,其進一步包含UGI或編碼UGI之mRNA。
第129項為如第127-128項中任一項之組合物,其中該異源功能域為胞苷脫胺酶。
第130項為如第125-129項中任一項之組合物,其中該經修飾之核酸酶包含核定位信號(NLS)。
第131項為如第118-130項中任一項之組合物,其包含編碼核酸酶之mRNA。
第132項為如第131項之組合物,其中該mRNA包含SEQ ID NO: 636-638中之任一者之序列。
第133項為一種醫藥調配物,其包含如第1-115項中任一項之gRNA或如第116-132項中任一項之組合物及醫藥學上可接受之載劑。
第134項為一種修飾目標DNA之方法,其包含將Cas蛋白或編碼Cas蛋白之核酸及以下中之任何一或多者遞送至細胞:
i. 如第1-115項中任一項之gRNA;
ii. 如第116-132項中任一項之組合物;及
iii. 如第133項之醫藥調配物。
第135項為如第134項之方法,其中該方法導致基因中之插入或缺失。
第136項為如第134或135項之方法,其中該方法導致至少一個鹼基編輯。
第137項為如第134-136項中任一項之方法,其進一步包含將模板遞送至該細胞,其中該模板之至少一部分在Cas蛋白所誘導之雙股斷裂位點處或附近併入至目標DNA中。
第138項為如第1-115項中任一項之gRNA,如第116-132項之組合物,或如第133項之醫藥調配物,其用於製備供治療疾病或病症用之藥劑。
第139項為如第1-115項中任一項之gRNA、如第116-132項之組合物或如第133項之醫藥調配物之用途,其用於製造供治療疾病或病症用之藥劑。
圖1顯示使用截短gRNA在HEK-Blue
TM細胞中具有標準差之平均編輯結果。
圖2顯示靶向HEK-Nme2細胞中之VEGFA之雙引導RNA (dgRNA)的平均編輯百分比結果。
圖3顯示靶向位點T47處之VEGFA基因之HEK-Nme2細胞中化學修飾之sgRNA的平均編輯百分比結果。
圖4顯示靶向位點T47處之VEGFA基因之HEK-293細胞中經修飾之sgRNA的平均編輯百分比結果。
圖5顯示在增加劑量之Nme2Cas9 mRNA及化學修飾之sgRNA下,PMH中TTR基因座處之平均編輯百分比。
圖6顯示在具有經修飾sgRNA之PMH中PCSK9基因座處之平均編輯百分比。
圖7顯示具有若干Nme2Cas9 mRNA與經修飾sgRNA之PMH中之平均編輯百分比。
圖8A顯示使用不同比率之sgRNA及Nme2Cas9 mRNA時PMH中TTR基因座處之平均編輯百分比。
圖8B顯示使用不同比率之pgRNA及Nme2Cas9 mRNA時PMH中TTR基因座處之平均編輯百分比。
圖9針對pgRNA及Nme2Cas9 mRNA顯示PMH中TTR基因座處之平均編輯百分比。
圖10A針對經修飾crRNA及trRNA與Nme2Cas9 mRNA之組合顯示HEK-Nme2細胞中VEGFA TS-25基因座處之平均編輯百分比。
圖10B針對經修飾crRNA及trRNA與Nme2Cas9 mRNA之組合顯示HEK-Nme2細胞中VEGFA TS-47基因座處之平均編輯百分比。
圖11針對經修飾crRNA及trRNA與Nme2Cas9 mRNA之組合顯示由不同crRNA及tracrRNA組合組成之HEK-Nme2細胞dgRNA中VEGFA TS-47基因座處之平均編輯百分比。
圖12A針對在引導序列中具有2'-OMe修飾之pgRNA顯示PMH中TTR外顯子1處之平均編輯百分比。
圖12B針對在引導序列中具有2'-OMe修飾之pgRNA顯示PMH中TTR外顯子3處之平均編輯百分比。
圖12C針對在引導序列中具有輕度2'-OMe修飾之pgRNA顯示PMH中TTR外顯子1處之平均編輯百分比。
圖12D針對在引導序列中具有輕度2'-OMe修飾之pgRNA顯示PMH中TTR外顯子3處之平均編輯百分比。
圖13顯示PMH中PCSK9基因座處之平均編輯百分比。
圖14A顯示用mRNA C (SEQ ID NO: 622)處理之HEK細胞中VEGFA基因座處之平均編輯結果。
圖14B顯示用mRNA I (SEQ ID NO: 627)處理之HEK細胞中VEGFA基因座處之平均編輯結果。
圖14C顯示用mRNA J (SEQ ID NO: 628)處理之HEK細胞中VEGFA基因座處之平均編輯結果。
圖14D顯示用mRNA C (SEQ ID NO: 622)處理之PHH細胞中VEGFA基因座處之平均編輯結果。
圖14E顯示用mRNA I (SEQ ID NO: 627)處理之PHH細胞中VEGFA基因座處之平均編輯結果。
圖14F顯示用mRNA J (SEQ ID NO: 628)處理之PHH細胞中VEGFA基因座處之平均編輯結果。
圖15顯示用被設計成具有1或2個核定位序列之NmeCas9構築體處理之PMH細胞中小鼠TTR基因座處之平均編輯百分比。
圖16顯示用pgRNA及各種Nme2Cas9 mRNA處理之PMH細胞中小鼠TTR基因座處之平均編輯百分比。
圖17顯示與PMH、PRH、PCH及PHH細胞中之SpyCas9蛋白表現相比,Nme2Cas9蛋白表現的倍數變化。
圖18A-18F顯示與來自治療後24小時、48小時及72小時分析之2個供體的T細胞中之SpyCas9蛋白表現相比,Nme2Cas9蛋白表現的倍數變化。
圖19顯示用sgRNA及Nme2Cas9處理之小鼠肝臟中TTR基因座處之平均編輯百分比。
圖20A顯示用pgRNA及Nme2Cas9處理之後小鼠肝臟中TTR基因座處之平均編輯百分比。
圖20B顯示用pgRNA及Nme2Cas9處理之後的平均血清TTR蛋白。
圖20C顯示用pgRNA及Nme2Cas9處理之後的平均TTR減弱百分比。
圖20D顯示用pgRNA及各種Nme2Cas9處理之後小鼠肝臟中TTR基因座處之平均編輯百分比。
圖20E顯示用pgRNA及各種Nme2Cas9處理之後的血清TTR蛋白減弱。
圖21顯示用各種Nme2Cas9構築體處理後小鼠肝臟中之平均編輯百分比。
圖22顯示用pgRNA及各種Nme2Cas9處理後小鼠肝臟中之平均編輯百分比。
圖23顯示用各種鹼基編輯劑處理後小鼠肝臟中之平均編輯百分比。
圖24顯示呈可能的二級結構之Nme2 sgRNA之例示性示意圖,該二級結構包括重複/反重複區及髮夾區(其包括髮夾1及髮夾2區),且進一步指示引導區(或靶向區) (用帶虛線輪廓之灰色填充指示)、不適合單一或配對缺失之鹼基(用帶實線輪廓之灰色填充指示)、適合單一或配對缺失之鹼基(空心圓)。
圖25顯示呈可能的二級結構之例示性sgRNA (G021536;SEQ ID NO: 490)。甲基化以粗體顯示;硫代磷酸酯鍵由『*』指示。沃森-克里克鹼基配對由雙螺旋部分中核苷酸之間的『—』指示。非沃森-克里克鹼基配對由雙螺旋部分中核苷酸之間的『•』指示。
圖26顯示原代小鼠肝細胞中TTR基因座處之編輯百分比。
圖27顯示小鼠中之血清TTR含量。
圖28顯示小鼠肝臟樣品中TTR基因座處之編輯百分比。
圖29顯示小鼠中處理之後的血清TTR量測結果。
圖30顯示小鼠肝臟樣品中TTR基因座處之編輯百分比。
圖31顯示用Nme1Cas9進行TRAC編輯之後的平均CD3陰性T細胞百分比。
圖32顯示用Nme3Cas9進行TRAC編輯之後的平均CD3陰性T細胞百分比。
圖33顯示24小時處T細胞中Nme-HiBiT構築體之表現。
圖34顯示作為NmeCas9 mRNA量之函數的CD3陰性細胞群體。
圖35顯示PCH中所選gRNA之劑量反應曲線。
圖36顯示PCH中LNP稀釋系列之劑量反應曲線。
圖37顯示呈可能的二級結構之例示性sgRNA (引導物ID G032572;SEQ ID NO: 951)。未經修飾之核苷酸以粗體顯示且甲基化以淺色字體顯示;硫代磷酸酯鍵由『*』指示。沃森-克里克鹼基配對由雙螺旋部分中核苷酸之間的『—』指示。非沃森-克里克鹼基配對由雙螺旋部分中核苷酸之間的『•』指示。
圖38顯示呈可能的二級結構之例示性sgRNA (引導物ID G031771;SEQ ID NO: 952)。未經修飾之核苷酸以粗體顯示且甲基化以淺色字體顯示;硫代磷酸酯鍵由『*』指示。沃森-克里克鹼基配對由雙螺旋部分中核苷酸之間的『—』指示。非沃森-克里克鹼基配對由雙螺旋部分中核苷酸之間的『•』指示。
圖39顯示小鼠中之血清TTR含量。
圖40顯示小鼠肝臟樣品中TTR基因座處之編輯百分比。
圖41顯示PMH中所選gRNA之劑量反應曲線。
圖42顯示PMH中所選gRNA之劑量反應曲線。
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Claims (154)
- 一種引導RNA (gRNA),其包含引導區及保守區,該保守區包含以下一或多者: (a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複(anti-repeat)區缺少2-24個核苷酸,其中 (i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代;及 (ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65;或 (b)經縮短之髮夾1區,其中該經縮短之髮夾1缺少2-10個、視情況2-8個核苷酸,其中 (i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失,且視情況位置82-96中之一或多者經取代;及 (ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96;或 (c)經縮短之髮夾2區,其中該經縮短之髮夾2缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸,其中 (i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失,且視情況核苷酸113-134中之一或多者經取代;及 (ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135; 其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144-145中之一或兩者視情況缺失; 其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
- 如請求項1之gRNA,其中該gRNA為單引導RNA (sgRNA)且其中該gRNA包含(a)經縮短之重複/反重複區,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸,其中 (i)相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失,且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代;及 (ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65。
- 如請求項1或2之gRNA,其中該引導區具有(i)相對於SEQ ID NO: 500,在位置1-24內一個核苷酸之插入或1-4個核苷酸之缺失,或(ii) 24個核苷酸之長度。
- 如請求項3之gRNA,其中該引導區具有25、24、23、22、21或20個核苷酸之長度,視情況其中該引導區具有25、24、23或22個核苷酸之長度。
- 如請求項4之gRNA,其中該引導區具有23-24個核苷酸之長度。
- 如請求項1至5中任一項之gRNA,其中該gRNA進一步包含3'尾。
- 如請求項6之gRNA,其中該3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。
- 如請求項7之gRNA,其中該3'尾包含1、2、3、4或5個核苷酸。
- 如請求項6至8中任一項之gRNA,其中該3'尾以包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸終止。
- 如請求項6至9中任一項之gRNA,其中該3'尾之長度為1個核苷酸。
- 如請求項6至10中任一項之gRNA,其中該3'尾由包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸組成。
- 如請求項6至11中任一項之gRNA,其中該3'尾包含存在於該3'尾之核苷酸中之任一或多者的修飾。
- 如請求項6至12中任一項之gRNA,其中該3'尾之修飾為2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸及核苷酸之間的硫代磷酸酯(phosphorothioate) (PS)鍵聯中之一或多者。
- 如請求項6至13中任一項之gRNA,其中該3'尾經完全修飾。
- 如請求項1至14中任一項之gRNA,其中該gRNA之3'核苷酸為包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸。
- 如請求項1至5中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144及145中之一或多者缺失。
- 如請求項1至5中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸144及145均缺失。
- 如請求項1至5中任一項之gRNA,其中該gRNA不包含3'尾。
- 如請求項1至18中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸。
- 如請求項1至19中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸之長度。
- 如請求項1至20中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區缺少12-24個、視情況18-24個核苷酸、視情況20-22個核苷酸。
- 如請求項1至21中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。
- 如請求項1至22中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有28、29、30、31、32、33或34個核苷酸,或30、31或32個核苷酸之長度。
- 如請求項1至23中任一項之gRNA,其中SEQ ID NO: 500之核苷酸37-64形成上莖,且該經縮短之重複/反重複區之上莖的一或多個鹼基對缺失。
- 如請求項1至24中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區之上莖包含不超過一個、兩個、三個或四個鹼基對。
- 如請求項1至25中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的所有位置39-48及所有位置53-62均缺失,且視情況核苷酸38或63經取代。
- 如請求項1至26中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的所有位置38-48及所有位置53-63均缺失,且視情況核苷酸37或64經取代。
- 如請求項1至27中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的所有核苷酸37-48及53-64均缺失,且視情況核苷酸36或65經取代。
- 如請求項1至28中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有長度11個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
- 如請求項1至29中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有單一雙螺旋部分。
- 如請求項1至29中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有第一雙螺旋部分及第二雙螺旋部分。
- 如請求項31之gRNA,其中該第二雙螺旋部分之長度為2-3個鹼基配對核苷酸。
- 如請求項31之gRNA,其中該第一雙螺旋部分之長度為11個鹼基配對核苷酸且該第二雙螺旋部分之長度為3個鹼基配對核苷酸。
- 如請求項1至33中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,該經縮短之重複/反重複區之上莖包括一或多個取代。
- 如請求項1至34中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸49-52中之一或多者經取代。
- 如請求項1至33中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區未經取代。
- 如請求項1至36中任一項之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區具有12-22個經修飾之核苷酸。
- 如請求項37之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複區不包含在核苷酸76之修飾。
- 如請求項37之gRNA,其中該經縮短之重複/反重複不包含在核苷酸76之硫代磷酸酯(PS)修飾。
- 如請求項1至39中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區缺少2-10個核苷酸、視情況2-8個或2-4個核苷酸。
- 如請求項1至40中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區具有13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸之長度。
- 如請求項1至41中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區具有長度4-8個、視情況7-8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
- 如請求項1至41中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區具有單一雙螺旋部分。
- 如請求項1至43中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區之一或兩個鹼基對缺失。
- 如請求項1至44中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區之莖的長度為七個或八個鹼基配對核苷酸。
- 如請求項1至45中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區的位置85-86中之一或多者及核苷酸91-92中之一或多者缺失。
- 如請求項1至46中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區之核苷酸86及91或核苷酸85及92缺失。
- 如請求項1至47中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,該經縮短之髮夾1區的核苷酸82-95中之一或多者經取代。
- 如請求項1至48中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸87-90中之一或多者經取代。
- 如請求項1至48中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區未經取代。
- 如請求項1至49中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾1區具有6-15個經修飾之核苷酸。
- 如請求項1至50中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸。
- 如請求項1至51中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。
- 如請求項1至52中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區具有28、29、30、31、32、33或34個核苷酸之長度。
- 如請求項1至53中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區之核苷酸113-121中之一或多者及核苷酸126-134中之一或多者缺失。
- 如請求項1至54中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區包含不配對(unpaired)區。
- 如請求項1至55中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區具有兩個雙螺旋部分。
- 如請求項1至56中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區具有長度為4個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
- 如請求項57至58中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區具有長度為4-8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
- 如請求項57至59中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區具有長度為4-6個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
- 如請求項1至60中任一項之gRNA,其中SEQ ID NO: 500之核苷酸109-138形成該上莖,且該經縮短之髮夾2區之上莖包含一個、兩個、三個或四個鹼基對。
- 如請求項1至61中任一項之gRNA,其中核苷酸113與134、核苷酸114與133、核苷酸115與132、核苷酸116與131、核苷酸117與130、核苷酸118與129、核苷酸119與128、核苷酸120與127及核苷酸121與126中之至少一對缺失。
- 如請求項1至62中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區之所有位置113-121及126-134均缺失。
- 如請求項1至63中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,該經縮短之髮夾2區之核苷酸113-134中之一或多者經取代。
- 如請求項1至64中任一項之gRNA,其中相對於SEQ ID NO: 500,核苷酸122-125中之一或多者經取代。
- 如請求項1至64中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區未經取代。
- 如請求項1至66中任一項之gRNA,其中該經縮短之髮夾2區具有6-15個經修飾之核苷酸。
- 如請求項1至67中任一項之gRNA,其中該gRNA之引導區包含至少兩個經修飾核苷酸、視情況至少四個經修飾核苷酸。
- 如請求項1至68中任一項之gRNA,其中該gRNA之引導區包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個經修飾之核苷酸,視情況1、2或3個經修飾之核苷酸。
- 如請求項1至69中任一項之gRNA,其中該gRNA之引導區包含4、5、6、7、8、9、10、11或12個經修飾之核苷酸。
- 如請求項1至70中任一項之gRNA,其中該gRNA之引導區包含6、7、8、9、10、11或12個經修飾之核苷酸。
- 如請求項1至71中任一項之gRNA,其中該引導區不包含在該引導區之前三個核苷酸之3'經修飾之核苷酸。
- 如請求項1至66中任一項之gRNA,其中該引導區不包含經修飾之核苷酸。
- 如請求項1至72中任一項之gRNA,其中該gRNA包含5'端修飾。
- 如請求項1至74中任一項之gRNA,其中該gRNA包含3'端修飾。
- 如請求項1至75中任一項之gRNA,其中該gRNA包含5'端修飾及3'端修飾。
- 如請求項1至76中任一項之gRNA,其包含該重複/反重複區之上莖區中之修飾。
- 如請求項1至77中任一項之gRNA,其包含該髮夾1區中之修飾。
- 如請求項1至78中任一項之gRNA,其包含該髮夾2區中之修飾。
- 如請求項79之gRNA,其中該髮夾2區中之修飾包含在核苷酸106-109之1、2、3或4個核苷酸之修飾。
- 如請求項80之gRNA,其中該髮夾2區中之修飾包含在各核苷酸106-109之修飾。
- 如請求項80或81中任一項之gRNA,其中該修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾。
- 如請求項1至82中任一項之gRNA,其包含3'端修飾,且包含該重複/反重複區之上莖區中之修飾。
- 如請求項1至83中任一項之gRNA,其包含3'端修飾及該髮夾1區中之修飾。
- 如請求項1至83中任一項之gRNA,其包含3'端修飾及該髮夾2區中之修飾。
- 如請求項1至85中任一項之gRNA,其包含5'端修飾,且包含該重複/反重複區之上莖區中之修飾。
- 如請求項1至86中任一項之gRNA,其包含5'端修飾及該髮夾1區中之修飾。
- 如請求項1至87中任一項之gRNA,其包含5'端修飾及該髮夾2區中之修飾。
- 如請求項1至88中任一項之gRNA,其包含5'端修飾、該重複/反重複區之上莖區中之修飾,及3'端修飾。
- 如請求項1至89中任一項之gRNA,其包含5'端修飾、該髮夾1區中之修飾,及3'端修飾。
- 如請求項1至90中任一項之gRNA,其包含5'端修飾、該髮夾1區中之修飾、該髮夾2區中之修飾,及3'端修飾。
- 如請求項1至91中任一項之gRNA,其包含5'端修飾、該重複/反重複區中之修飾、該髮夾1區中之修飾、該髮夾2區中之修飾,及3'端修飾。
- 如請求項1至92中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區中之修飾不包含在核苷酸76之硫代磷酸酯(PS)修飾。
- 如請求項1至93中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區中之修飾不包含在核苷酸76之修飾。
- 如請求項74至94中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯,或反向(inverted)無鹼基修飾之核苷酸。
- 如請求項74至95中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯,或反向無鹼基修飾之核苷酸。
- 如請求項74至96中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含以下任一者: i. 前1、2、3或4個核苷酸中之任一或多者之修飾; ii. 一個經修飾之核苷酸; iii. 兩個經修飾之核苷酸; iv. 三個經修飾之核苷酸;及 v. 四個經修飾之核苷酸。
- 如請求項74至97中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含以下一或多者: i. 核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯; ii. 2'-OMe修飾之核苷酸; iii. 2'-O-moe修飾之核苷酸; iv. 2'-F修飾之核苷酸;及 v. 反向無鹼基修飾之核苷酸。
- 如請求項74至98中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含以下任一者: i. 最後4、3、2或1個核苷酸中之任一或多者之修飾; ii. 一個經修飾之核苷酸; iii. 兩個經修飾之核苷酸; iv. 三個經修飾之核苷酸;及 v. 四個經修飾之核苷酸。
- 如請求項74至99中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含以下一或多者: i. 核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯; ii. 2'-OMe修飾之核苷酸; iii. 2'-O-moe修飾之核苷酸; iv. 2'-F修飾之核苷酸;及 v. 反向無鹼基修飾之核苷酸。
- 如請求項74至100中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含至少一個PS鍵聯,且其中以下一或多者: i. 存在一個PS鍵聯,且該鍵聯介於第一個核苷酸與第二個核苷酸之間; ii. 前三個核苷酸之間存在兩個PS鍵聯; iii. 前四個核苷酸中之任一或多者之間存在PS鍵聯;及 iv. 前五個核苷酸中之任一或多者之間存在PS鍵聯。
- 如請求項101之gRNA,其中該5'端修飾進一步包含至少一個2'-OMe、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。
- 如請求項1至102中任一項之gRNA,其中該5'端修飾包含: i. 前1-4個核苷酸中之一或多者的修飾,其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe或2'-F; ii. 第一核苷酸之2'-Ome、2'-O-moe或2'-F之修飾,及視情況與下一核苷酸或該3'尾之第一核苷酸的一或兩個PS鍵聯; iii. 第一或第二核苷酸之2'-Ome、2'-O-moe或2'-F修飾,及視情況一或多個PS鍵聯; iv. 第一、第二或第三核苷酸之2'-Ome、2'-O-moe或2'-F修飾,及視情況一或多個PS鍵聯;或 v. 第一、第二、第三或第四核苷酸之2'-Ome、2'-O-moe或2'-F修飾,及視情況一或多個PS鍵聯。
- 如請求項1至103中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含至少一個PS鍵聯,且其中以下一或多者: vi. 存在一個PS鍵聯,且該鍵聯介於最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間; vii. 最後三個核苷酸之間存在兩個PS鍵聯;及 viii. 最後四個核苷酸中之任一或多者之間存在PS鍵聯。
- 如請求項104之gRNA,其中該3'端修飾進一步包含至少一個2'-Ome、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。
- 如請求項1至105中任一項之gRNA,其中該3'端修飾包含: ix. 最後1-4個核苷酸中之一或多者的修飾,其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe或2'-F; x. 最後一個核苷酸之2'-OMe、2'-O-moe或2'-F之修飾,及視情況與下一核苷酸或該3'尾之第一核苷酸之一或兩個PS鍵聯; xi. 最後一個或倒數第二個核苷酸之2'-OMe、2'-O-moe或2'-F修飾,及視情況一或多個PS鍵聯; xii. 最後一個、倒數第二個或倒數第三個核苷酸之2'-OMe、2'-O-moe或2'-F修飾,及視情況一或多個PS鍵聯;或 xiii. 最後一個、倒數第二個、倒數第三個或倒數第四個核苷酸之2'-OMe、2'-O-moe或2'-F修飾,及視情況一或多個PS鍵聯。
- 如請求項1至106中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸,或核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
- 如請求項1至106中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸,或核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
- 如請求項1至106中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸,或核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
- 如請求項1至109中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區中之修飾不包含在核苷酸76之硫代磷酸酯修飾。
- 如請求項1至110中任一項之gRNA,其中該重複/反重複區中之修飾不包含在核苷酸76之修飾。
- 如請求項1至111中任一項之gRNA,其中至少20%、30%、40%或50%之該等核苷酸為經修飾之核苷酸。
- 如請求項112之gRNA,其中該gRNA包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯,或其組合。
- 如請求項1至113中任一項之gRNA,其中該修飾包含在核苷酸106-109中之1、2、3或4個核苷酸之修飾。
- 如請求項113或114中任一項之gRNA,其中該修飾包含在各核苷酸106-109之修飾。
- 如請求項114至115中任一項之gRNA,其中該修飾包含2'-O-甲基修飾。
- 如請求項112至116中任一項之gRNA,其中該gRNA包含選自以下之經修飾之核苷酸:2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯,或其組合。
- 如請求項1至117中任一項之gRNA,其中該引導區之核苷酸1-3經修飾,且該引導區中除核苷酸1-3以外的核苷酸未經修飾。
- 如請求項1至118中任一項之gRNA,其中核苷酸144之3'尾存在於該gRNA中,且包含在核苷酸141-144之2'-O-Me修飾之核苷酸及分別在核苷酸141-142及142-143之間的兩個PS鍵聯。
- 如請求項1至120中任一項之gRNA,其中49-52、87-90或122-125之一或多個位置經取代。
- 一種單引導RNA (sgRNA),其包含SEQ ID NO: 1-19及21-42中之任一者。
- 如請求項1至121中任一項之gRNA,其包含與SEQ ID No: 1-19及21-42中任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列。
- 如請求項1至121中任一項之gRNA,其包含與SEQ ID No: 1-19及21-42中任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列,其中該gRNA與表1中之參考序列標識符(identifier)之核苷酸對應之各核苷酸的修飾與表2中之參考序列標識符中所示的修飾一致或等效。
- 如請求項1至122中任一項之gRNA,其包含與SEQ ID No: 1-5、7、8、11、12、13、15、16、18、19、21、23、24、26、27、28、30、31、33、34、35、37、39、41、101-291、301-494、931-946、951及952中任一者之核苷酸序列的自X至3'端的序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的核苷酸序列,其中X為該保守區之第一核苷酸。
- 如請求項121至124中任一項之gRNA,其進一步含有包含2'-O-Me修飾之核苷酸的3'尾。
- 如請求項1至125中任一項之gRNA,其中該gRNA將核酸酶導引至目標序列以進行結合。
- 如請求項1至126中任一項之gRNA,其中該gRNA將核酸酶導引至目標序列以在該目標序列內誘導雙股斷裂。
- 如請求項1至127中任一項之gRNA,其中該gRNA將核酸酶導引至目標序列以在該目標序列內誘導單股斷裂。
- 如請求項126至129中任一項之gRNA,其中該核酸酶為Nme Cas9。
- 如請求項1至129中任一項之gRNA,其中該gRNA包含保守取代,視情況其中該保守取代維持至少一個鹼基對。
- 一種組合物,其包含如請求項1至130中任一項之gRNA與脂質奈米粒子(LNP)締合。
- 一種LNP組合物,其包含如請求項1至130中任一項之gRNA。
- 一種包含如請求項1至130中任一項之gRNA之組合物,或如請求項131至132中任一項之組合物,其進一步包含核酸酶或編碼該核酸酶之mRNA。
- 如請求項133之組合物,其中該核酸酶為Cas蛋白。
- 如請求項134之組合物,其中該Cas蛋白為Nme Cas9。
- 如請求項135之組合物,其中該Nme Cas9為Nme1 Cas9、Nme2 Cas9或Nme3 Cas9。
- 如請求項133至136中任一項之組合物,其中該核酸酶具有雙股裂解活性。
- 如請求項133至137中任一項之組合物,其中該核酸酶具有切口酶活性。
- 如請求項133至138中任一項之組合物,其中該核酸酶具有dCas DNA結合域。
- 如請求項133至139中任一項之組合物,其中該核酸酶經修飾。
- 如請求項140之組合物,其中該經修飾核酸酶包含異源功能域。
- 如請求項141之組合物,其中該異源功能域為脫胺酶。
- 如請求項142之組合物,其進一步包含UGI或編碼UGI之mRNA。
- 如請求項142至143中任一項之組合物,其中該異源功能域為胞苷脫胺酶。
- 如請求項140至144中任一項之組合物,其中該經修飾核酸酶包含核定位信號(NLS)。
- 如請求項133至145中任一項之組合物,其包含編碼該核酸酶之mRNA。
- 如請求項146之組合物,其中該mRNA包含SEQ ID NO: 636-638中任一者的序列。
- 一種醫藥調配物,其包含如請求項1至130中任一項之gRNA或如請求項131至147中任一項之組合物及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種修飾目標DNA的方法,其包含將Cas蛋白或編碼Cas蛋白的核酸及以下中之任一或多者遞送至細胞: i. 如請求項1至130中任一項之gRNA; ii. 如請求項131至147中任一項之組合物;及 iii. 如請求項148之醫藥調配物。
- 如請求項149之方法,其中該方法導致基因中之插入或缺失。
- 如請求項149或150之方法,其中該方法導致至少一個鹼基編輯。
- 如請求項149至151中任一項之方法,其進一步包含將模板遞送至該細胞,其中該模板之至少一部分在該Cas蛋白所誘導之雙股斷裂位點處或附近併入目標DNA中。
- 如請求項1至130中任一項之gRNA、如請求項131至147之組合物或如請求項148之醫藥調配物,其用於製備治療疾病或病症之藥劑。
- 一種如請求項1至130中任一項之gRNA、如請求項131至147之組合物或如請求項148之醫藥調配物的用途,其用於製造治療疾病或病症之藥劑。
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