TW202237837A - 經導入化學修飾核酸之穩定型標的編輯引導ｒｎａ - Google Patents

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福田将虎
小泉誠
岩下真三
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學校法人福岡大學
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Abstract

本發明係提供一種寡核苷酸，其可誘導細胞內ADAR之編輯活性，並且生體內之穩定性優異。寡核苷酸包含識別標的RNA之第一寡核苷酸、以及與第一寡核苷酸之其5’端連結之第二寡核苷酸。第一寡核苷酸包含對應標的之核苷酸殘基、3’端之10至24個殘基之寡核苷酸、及5’端之3至6個殘基之寡核苷酸。第二寡核苷酸係於3’末端缺失對應標的RNA之核苷酸殘基、或是具有不形成互補對之核苷酸殘基，殘基數為2至10個。對應標的之核苷酸殘基的3’端為2’-去氧核苷酸殘基，對應標的之核苷酸殘基3’端的寡核苷酸中，從對應標的之核苷酸朝3’方向算起之第3個核苷酸殘基為2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基。

Description

經導入化學修飾核酸之穩定型標的編輯引導RNA
本發明係關於經導入化學修飾核酸之穩定型標的編輯引導RNA。
以基因編輯技術之開發為契機，生物設計圖之遺傳訊息，亦即，經由改變細胞內DNA訊息控制生命現象之方法係作為疾病治療途徑而開始被用在醫療及藥品研發之技術領域中。DNA為細胞內恆定且不變之分子，因此DNA改變之效果會永續地殘留在對象細胞或對象生物。另一方面，RNA為暫時性遺傳訊息分子。因此RNA訊息之改變可給予對象生物非永續且暫時性的遺傳訊息改變效果。
就RNA改變技術而言，例如，國際公開第2016/097212號中，已記載用於標的RNA序列中之核苷酸之特異性位點編輯(Site-specific editing)之寡核苷酸構築物，該寡核苷酸構築物係包括含與一部分標的RNA互補之反義序列的標的指向性部分、以及與存在於細胞中且可進行核苷酸編輯之RNA編輯實體結合而可進行招募(recruit)的招募部分。又，例如，國際公開第2017/010556號中，已記載位置特異性RNA突變之導入方法，該方法係於標的RNA與標的編輯引 導RNA之複合物使雙股特異性腺苷酸去胺酶(ADAR)作用。又，Nature Biotechnology,37,133-138(2019)中，已記載於招募ADAR之反義寡核苷酸導入修飾核酸。
就具有RNA編輯活性之腺苷酸去胺酶而言，已知ADAR1及ADAR2之同功型，此等被認為在生體內係表現細胞種類特異性。例如，ADAR1被視為幾乎不表現於人類骨格肌。另一方面，ADAR2被視為幾乎不表現於人類骨髓細胞。又，一般認為人類細胞內表現較多ADAR1。
若能誘導細胞內之ADAR1編輯活性，被認為可進行細胞種類特異性之RNA編輯。又，被認為於人類細胞中，可更有效地進行RNA編輯。因此，本發明之一態樣係以提供於細胞內可誘導ADAR之編輯活性，於生體內有優異穩定性的寡核苷酸為目的。
用於解決前述課題之具體手段如下，本發明包含下列態樣。
(1-1)一種寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其包含識別標的RNA之第一寡核苷酸、及與前述第一寡核苷酸5’端連結之第二寡核苷酸；前述第一寡核苷酸包含對應前述標的RNA中之腺苷酸殘基之對應標的之核苷酸殘基、與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結並具有與前述標的RNA互補之鹼基序列的10至24個殘基之寡核苷酸、以及與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結並具有與前述標的RNA互補之鹼基序列的3至6個殘基之寡核苷酸；前述第二寡核苷酸係 於其3’末端缺失對應前述標的RNA之核苷酸殘基的核苷酸殘基，或是具有不與前述標的RNA之核苷酸殘基形成互補對的核苷酸殘基；前述第二寡核苷酸之殘基數為2至10，至少其3’末端以外之核苷酸殘基與前述標的RNA形成互補之雙股結構；選自包含前述對應標的之核苷酸殘基以及其3’端及5’端之各1個殘基之計數區域(counter region)中之至少1個殘基為野生型核糖核苷酸殘基以外之核苷酸殘基；該寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽誘導針對前述標的RNA之特異性位點編輯。
(1-2)如(1-1)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸之殘基數為4至8。
(1-3)如(1-1)或(1-2)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸之3’末端係缺失對應前述標的RNA之核苷酸殘基的核苷酸殘基。
(1-4)如(1-1)至(1-3)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述特異性位點編輯係起因於腺苷酸去胺酶1所致之酵素反應。
(1-5)如(1-1)至(1-4)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係於前述第一寡核苷酸與第二寡核苷酸之間包含含烯氧基單元之連結部。
(1-6)如(1-1)至(1-5)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸包含硫代磷酸酯鍵。
(1-7)如(1-1)至(1-6)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸包含選自由2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、2’-去氧-2’-氟核糖核苷酸殘基、交聯型核苷酸殘基、及2’-去氧核糖核苷酸所成群組中之至少1種修飾核苷酸殘基。
(1-8)如(1-1)至(1-7)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述計數區域包含硫代磷酸酯鍵。
(1-9)如(1-1)至(1-8)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述對應標的之核苷酸殘基包含硫代磷酸酯鍵。
(1-10)如(1-1)至(1-9)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述對應標的之核苷酸殘基之3’端及5’端之各1個殘基中的至少1個殘基為2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、或去氧核苷酸殘基。
(1-11)如(1-1)至(1-10)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸包含選自由2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、2’-去氧-2’-氟核糖核苷酸殘基、及交聯型核苷酸殘基所成群組中之至少1種修飾核苷酸殘基。
(1-12)如(1-1)至(1-11)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸具有2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(1-13)如(1-12)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，在與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸中，由前述對應標的之核苷酸朝3’方向數之第3個核苷酸殘基為2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基。
(1-14)如(1-1)至(1-11)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸具有交聯型核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(1-15)如(1-14)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，在與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸中，自前述對應標的之核苷酸朝3’方向數之第3個核苷酸殘基為交聯型核苷酸殘基。
(1-16)如(1-1)至(1-11)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸具有2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(1-17)如(1-16)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，在與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸中，由前述對應標的之核苷酸朝3’方向數之第3個核苷酸殘基為2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基。
(1-18)如(1-1)至(1-17)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，於前述第一寡核苷酸中，與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結之寡核苷酸具有連結2’-O-烷基核糖核苷酸殘基之鹼基序列。
(1-19)如(1-1)至(1-17)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，於前述第一寡核苷酸中，與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結之寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(1-20)如(1-1)至(1-17)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，於前述第一寡核苷酸中，與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結之寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(1-21)如(1-1)至(1-20)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸具有連結2’-O-烷基核糖核苷酸殘基之鹼基序列。
(1-22)如(1-1)至(1-20)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(1-23)如(1-1)至(1-20)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(1-24)如(1-1)至(1-23)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述標的RNA中，胞苷酸殘基與作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端連結，前述第一寡核苷酸中，與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之核苷酸殘基係具有作為鹼基之次黃嘌呤殘基。
(1-25)如(1-1)至(1-24)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述對應標的之核苷酸殘基為N-烷基嘧啶核苷酸殘基。
(1-26)如(1-1)至(1-25)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸及第二寡核苷酸分別係核苷酸殘基以硫代磷酸酯鍵連結而成。
(1-27)一種遺傳性疾病治療劑，係含有(1-1)至(1-26)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
(1-28)一種醫藥組成物，係含有作為活性成分之(1-1)至(1-26)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
(1-29)如(1-28)所述之醫藥組成物，係用於遺傳性疾病之預防、或治療。
(1-30)如(1-29)所述之醫藥組成物，其中，前述遺傳性疾病為可藉由將前述標的RNA之腺苷酸殘基轉變成肌苷酸殘基而治療之疾病。
(1-31)如(1-29)所述之醫藥組成物，其中，前述遺傳性疾病係以基因中之鳥苷酸殘基突變成腺苷酸殘基為原因為的遺傳性疾病。
(1-32)一種(1-1)至(1-26)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽之用途，係用於製造疾病之預防用、或治療用醫藥。
(1-33)如(1-1)至(1-26)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係用於疾病之預防、或治療之用途。
(1-34)一種用於疾病之預防或治療之方法，係將(1-1)至(1-26)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽之藥理學上之有效量投予至溫血動物。
(1-35)如(1-34)所述之方法，其中，前述疾病為遺傳性疾病。
(1-36)如(1-35)所述之方法，其中，前述遺傳性疾病為可藉由將前述標的RNA之腺苷酸殘基轉變成肌苷酸殘基而治療之疾病。
(1-37)如(1-35)所述之方法，其中，前述遺傳性疾病係以基因中之鳥苷酸殘基突變成腺苷酸殘基為原因遺傳性疾病。
(1-38)如(1-34)至(1-37)中之任一項所述之方法，其中，前述溫血動物為人類。
(1-39)一種寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係包含識別標的RNA之第一寡核苷酸、連結於前述第一寡核苷酸5’端之第二寡核苷酸、以及與前述 第一寡核苷酸和前述第二寡核苷酸連結的含烯氧基單元之連結部；前述第一寡核苷酸包含對應前述標的RNA中之腺苷酸殘基之對應標的之核苷酸殘基、與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結並具有與前述標的RNA互補之鹼基序列的10至24個殘基之寡核苷酸、以及與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結並具有與前述標的RNA互補之鹼基序列的3至6個殘基之寡核苷酸；前述第二寡核苷酸之殘基數為2至10，於其3’末端缺失對應前述標的RNA之核苷酸殘基的核苷酸殘基，或是具有不與前述標的RNA之核苷酸殘基形成互補對的核苷酸殘基，至少其3’末端以外之核苷酸殘基與前述標的RNA形成互補之雙股結構、或具有與前述標的RNA互補的之鹼基序列從而形成與前述標的RNA互補之雙股結構；選自包含前述對應標的之核苷酸殘基以及其3’端及5’端之各1個殘基之計數區域中之至少1個殘基為野生型核糖核苷酸殘基以外之核苷酸殘基；該寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽誘導針對前述標的RNA之特異性位點編輯。
(2-1)一種寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係包含識別標的RNA之第一寡核苷酸、以及與前述第一寡核苷酸5’端連結之第二寡核苷酸；前述第一寡核苷酸包含對應前述標的RNA中之腺苷酸殘基之對應標的之核苷酸殘基、與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結並具有與前述標的RNA互補之鹼基序列的10至24個殘基之寡核苷酸、以及與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結並具有與前述標的RNA互補之鹼基序列的3至6個殘基之寡核苷酸；前述第二寡核苷酸係於其3’末端缺失對應於前述標的RNA之核苷酸殘基的核苷酸殘基，或是具有不與前述標的RNA之核苷酸殘基形成互補對的核苷酸殘基(以下，不與第二寡核苷酸之標的RNA之核苷酸殘基形成互補對的核苷酸殘基及對 應標的之核苷酸殘基亦一併稱為「非互補核苷酸殘基」)；前述第二寡核苷酸之殘基數為2至10，至少其3’末端以外之核苷酸殘基與前述標的RNA形成互補之雙股結構；該寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽具有包含前述對應標的之核苷酸殘基以及其3’端及5’端之各1個殘基之計數區域；與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之核苷酸殘基為2’-去氧核苷酸殘基；在與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸中，自前述對應標的之核苷酸朝3’方向數之第3個核苷酸殘基為2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基；該寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽誘導針對前述標的RNA之特異性位點編輯。
(2-2)如(2-1)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸之殘基數為4至8個。
(2-3)如(2-1)或(2-2)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸之3’末端缺失對應前述標的RNA之核苷酸殘基的核苷酸殘基。
(2-4)如(2-1)至(2-3)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述特異性位點編輯係起因於腺苷酸去胺酶1所致之酵素反應。
(2-5)如(2-1)至(2-4)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係於前述第一寡核苷酸與第二寡核苷酸之間包含含烯氧基單元之連結部。
(2-6)如(2-1)至(2-5)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸包含硫代磷酸酯鍵。
(2-7)如(2-1)至(2-6)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸包含選自由2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、2’-去氧 -2’-氟核糖核苷酸殘基、交聯型核苷酸殘基、及2’-去氧核糖核苷酸所成群組中之至少1種修飾核苷酸殘基。
(2-8)如(2-1)至(2-7)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述計數區域包含硫代磷酸酯鍵。
(2-9)如(2-1)至(2-8)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述對應標的之核苷酸殘基包含硫代磷酸酯鍵。
(2-10)如(2-1)至(2-9)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結之核苷酸殘基為2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、或去氧核苷酸殘基。
(2-11)如(2-1)至(2-10)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸包含選自由2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、2’-去氧-2’-氟核糖核苷酸殘基、及交聯型核苷酸殘基所成群組中之至少1種修飾核苷酸殘基。
(2-12)如(2-1)至(2-11)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸具有2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(2-13)如(2-1)至(2-12)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸具有交聯型核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(2-14)如(2-1)至(2-13)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸具有2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(2-15)如(2-1)至(2-14)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，於前述第一寡核苷酸中，與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結之寡核苷酸具有連結2’-O-烷基核糖核苷酸殘基之鹼基序列。
(2-16)如(2-1)至(2-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，於前述第一寡核苷酸中，與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結之寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(2-17)如(2-1)至(2-16)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，於前述第一寡核苷酸中，與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結之寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(2-18)如(2-1)至(2-17)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸具有連結2’-O-烷基核糖核苷酸殘基之鹼基序列。
(2-19)如(2-1)至(2-18)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(2-20)如(2-1)至(2-19)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(2-21)如(2-1)至(2-20)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述標的RNA於編輯標的之腺苷酸殘基5’端以胞苷酸殘基連結， 前述第一寡核苷酸之與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之核苷酸殘基為2’-去氧肌苷酸殘基。
(2-22)如(2-1)至(2-20)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述標的RNA中，脲苷酸殘基與作為編輯標的之腺苷腺苷酸殘基5’端連結，前述第一寡核苷酸中，與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之核苷酸殘基為2’-去氧腺苷酸殘基。
(2-23)如(2-1)至(2-20)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述標的RNA中，腺苷酸殘基與作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端連結，前述第一寡核苷酸中，與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之核苷酸殘基為胸苷酸殘基或2’-去氧脲苷酸殘基。
(2-24)如(2-1)至(2-20)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述標的RNA中，鳥苷酸殘基與作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端連結，前述第一寡核苷酸中，與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之核苷酸殘基為2’-去氧肌苷酸殘基。
(2-25)如(2-1)至(2-24)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述對應標的之核苷酸殘基係N-烷基嘧啶核苷酸殘基或2’-去氧胞苷酸殘基。
(2-26)如(2-1)至(2-25)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸及第二寡核苷酸分別係核苷酸殘基以硫代磷酸酯鍵連結而成。
(2-27)如(2-1)至(2-26)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸於自前述對應標的之核苷酸朝3’方向數第10個以後之核苷酸殘基具有交聯型核苷酸殘基。
(2-28)如(2-27)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸之自前述對應標的之核苷酸朝3’方向數第10個以後之核苷酸殘基所包含之寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(2-29)如(2-1)至(2-28)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸於自其3’末端之核苷酸殘基朝5’方向數第2個以後之核苷酸殘基具有交聯型核苷酸殘基。
(2-30)如(2-29)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸之自其3’末端之核苷酸殘基朝5’方向數第2個以後核苷酸殘基所包含寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
(2-31)如(2-1)至(2-30)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係下列式之任一者所示者：
U(M)^T(L)^G(M)^A(L)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(L)^U(M)^T(L)^G(M) (AD1_ASS1.39)、
A(M)^A(L)^G(M)^A(L)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^U(M) (AD1_PANK2.39)、
A(M)^T(L)^G(M)^T(L)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(L)^A(M)^C(L)^U(M) (AD1_NPHS2.39)、
G(M)^C(L)^A(M)^T(L)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^C(M) (AD1_GRIA2.39)、
U(M)^G(L)^A(M)^U(L)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(L)^G(M)^U(L)^U(M) (AD1_ASS1.52)、
G(M)^C(E)^A(M)^T(E)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^C(M) (AD1_GRIA2.39e)、
U(M)^T(E)^G(M)^A(E)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(E)^U(M)^T(E)^G(M) (AD1_ASS1.39e)、
A(M)^A(E)^G(M)^A(E)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^U(M) (AD1_PANK2.39e)、
A(M)^T(E)^G(M)^T(E)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(E)^A(M)^C(E)^U(M) (AD1_NPHS2.39e)、
C(M)^A(E)^U(M)^C(E)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M) (AD1_GRIA2.52e)、
U(M)^G(E)^A(M)^T(E)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(E)^G(M)^T(E)^U(M) (AD1_ASS1.52e)、
)A(M)^G(E)^A(M)^A(E)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M) (AD1_PANK2.52e)、
U(M)^G(E)^U(M)^C(E)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^T(E)^U(M)^A(E)^C(M) (AD1_NPHS2.52e)、
G(M)^T(L)^C(M)^C(L)^C(M)^U(F)^U(F)^C(M)^U(M)^c^i^U(M)^C(F)^G(M)^A(F)^U(M)^G(F)^G(M)^U(F)^C(M)^A(L)^G(M)^C(L)^A(M) (AD1_A1AT.39)。
上式中，大寫文字表示核糖核苷酸殘基，小寫文字表示2’-去氧核糖核苷酸殘基，N(M)表示2’-O-甲基-核糖核苷酸殘基N(F)表示2’-去氧-2’-氟-核糖核苷酸殘基，N(L)表示2’-O,4’-C-亞甲基化核糖核苷酸殘基，N(E)表示2’-O,4’-C-伸乙基化核糖核苷酸殘基，「^」表示核苷單元間經-P(=S)(OH)結合。
(2-32)如(2-1)至(2-31)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述寡核苷酸及其醫藥上可接受之鹽於5’末端或3’末端中，通 過連結子或磷酸二酯鍵(包含硫代磷酸酯鍵)鍵結包含GalNAc、膽固醇及脂肪酸之傳遞分子。
(2-33)一種用於與前述標的RNA關聯之疾病之治療之遺傳性疾病治療劑，係含有(2-1)至(2-32)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
(2-34)一種用於治療與前述標的RNA關聯之疾病之醫藥組成物，其含有作為活性成分之(2-1)至(2-32)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
(2-35)如(2-34)所述之醫藥組成物，係用於遺傳性疾病之預防或治療。
(2-36)如(2-35)所述之醫藥組成物，其中，前述遺傳性疾病為可藉由將前述標的RNA之腺苷酸殘基轉變成肌苷酸殘基而治療之疾病。
(2-37)如(2-35)所述之醫藥組成物，其中，前述遺傳性疾病係以基因中之鳥苷酸殘基突變成腺苷酸殘基為原因的遺傳性疾病。
(2-38)一種(2-1)至(2-32)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽之用途，係用於製造與前述標的RNA關聯之疾病之預防用、或治療用醫藥。
(2-39)如(2-1)至(2-32)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係用於與前述標的RNA關聯之疾病之預防、或治療之用途。
(2-40)一種用於與前述標的RNA關聯之疾病之預防或治療之方法，係將(2-1)至(2-32)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽之藥理學上之有效量投予至溫血動物。
(2-41)如(2-40)所述之方法，其中，前述疾病為遺傳性疾病。
(2-42)如(2-41)所述之方法，其中，前述遺傳性疾病為可藉由將前述標的RNA之腺苷酸殘基轉變成肌苷酸殘基而治療之疾病。
(2-43)如(2-41)所述之方法，其中，前述遺傳性疾病係以基因中之鳥苷酸殘基突變成腺苷酸殘基為原因的遺傳性疾病。
(2-44)如(2-34)至(2-37)中之任一項所述之醫藥組成物，其中，前述疾病包含選自由I型瓜胺酸血症、血友病(血栓症)、ALS、與泛酸鹽激酶關聯之神經退化性疾病、高胱胺酸尿症、局部節段型腎絲球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis)、α 1抗胰蛋白酶缺乏症、苯酮尿症、厚皮性骨膜病(pachydermoperiostosis)、亞歷山大氏病(Alexander's disease)、原發性高草酸尿症、吉伯特氏症候群(Gilbert's Syndrome)、視網膜色素病變(retinitis pigmentosa)、遠端肌病變(distal myopathy)及血色沉著病(hemochromatosis)所成群組中之至少1種疾病。
(2-45)如(2-38)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽之用途，其中，前述疾病包含選自由I型瓜胺酸血症、血友病(血栓症)、ALS、與泛酸鹽激酶關聯之神經退化性疾病、高胱胺酸尿症、局部節段型腎絲球硬化症、α 1抗胰蛋白酶缺乏症、苯酮尿症、厚皮性骨膜病、亞歷山大氏病、原發性高草酸尿症、吉伯特氏症候群、視網膜色素病變、遠端肌病變及血色沉著病所成群組中之至少1種疾病。
(2-46)如(2-39)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述疾病包含選自由I型瓜胺酸血症、血友病(血栓症)、ALS、與泛酸鹽激酶關聯之神經退化性疾病、高胱胺酸尿症、局部節段型腎絲球硬化症、α 1抗胰蛋白酶缺乏症、苯酮尿症、厚皮性骨膜病、亞歷山大氏病、原發性高草酸尿症、吉伯特氏 症候群、視網膜色素病變、遠端肌病變及血色沉著病所成群組中之至少1種疾病。
(2-47)如(2-40)至(2-43)中之任一項所述之方法，其中，前述疾病包含選自由I型瓜胺酸血症、血友病(血栓症)、ALS、與泛酸鹽激酶關聯之神經退化性疾病、高胱胺酸尿症、局部節段型腎絲球硬化症、α 1抗胰蛋白酶缺乏症、苯酮尿症、厚皮性骨膜病、亞歷山大氏病、原發性高草酸尿症、吉伯特氏症候群、視網膜色素病變、遠端肌病變及血色沉著病所成群組中之至少1種疾病。
(3-1)一種下式所示之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係具有核苷酸殘基間之鍵結包含硫代磷酸酯鍵的20至40個殘基，使用於將標的RNA中之編輯標的之腺苷酸殘基轉變成肌苷酸殘基的基因編輯：
5’-O1-O2-N1-N2-N3-N4-N5-O3-O4-3’；
上式中，N1為2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、核糖核苷酸殘基、2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基或2’-去氧核糖核苷酸殘基，
N2為鹼基係胞嘧啶或3-甲基脲嘧啶之核糖核苷酸殘基、2’-O-烷基核糖核苷酸殘基或2’-去氧核糖核苷酸殘基，
N3為2’-去氧核糖核苷酸殘基，
N4為2’-O-烷基核糖核苷酸殘基或2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基，
N5為2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基，
O1為不存在，或為2至10個殘基之寡核苷酸，該寡核苷酸至少包含1個交聯型核苷酸殘基，交聯型核苷酸殘基以外為2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基或2’-O-烷基核糖核苷酸殘基，
O2為2至10個殘基之寡核苷酸，包含2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基及2’-O-烷基核糖核苷酸殘基，
O3為5至20個殘基之寡核苷酸，包含2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基及2’-O-烷基核糖核苷酸殘基，
O4為不存在，或為2至10個殘基之寡核苷酸，該寡核苷酸至少包含1個交聯型核苷酸殘基，交聯型核苷酸殘基以外為2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基或2’-O-烷基核糖核苷酸殘基；
前述寡核苷酸中，N2對應編輯標的之腺苷酸殘基，O2於自3’端開始第2至5個核苷酸的區域中，係缺失對應所對應之標的RNA之核苷酸殘基的核苷酸殘基，或具有不與所對應之標的RNA之核苷酸殘基形成互補對之核苷酸殘基，
前述寡核苷酸之鹼基序列中，N3之鹼基可為與相鄰於編輯標的之腺苷酸殘基5’端之鹼基互補或非互補之鹼基，N1、N4、N5、O1、O3及O4之鹼基與標的RNA所對應之核苷酸殘基之鹼基完全互補，
於O2中，缺失之核苷酸殘基及不與所對應之標的RNA之核苷酸殘基形成互補對之核苷酸殘基以外的O2之鹼基，係與標的RNA所對應之核苷酸殘基之鹼基完全互補。
(3-2)如(3-1)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，編輯標的之腺苷酸殘基5’端之核苷酸殘基與N3形成互補對時，N3為2’-去氧腺苷酸殘基、2’-去氧肌苷酸殘基(惟，排除作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端之核苷酸殘基為腺苷酸殘基及脲苷酸殘基之情形)、胸苷酸殘基或2’-去氧脲苷酸殘基(排除作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端之核苷酸殘基為鳥苷酸殘基之情形)；編輯 標的之腺苷酸殘基5’端之核苷酸殘基不與N3形成互補對時，N3為2’-去氧肌苷酸殘基。
(3-3)如(3-1)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，於前述標的RNA中，胞苷酸殘基連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端時，N3為2’-去氧肌苷酸殘基，脲苷酸殘基連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端時，N3為2’-去氧腺苷酸殘基，腺苷酸殘基連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端時，N3為胸苷酸殘基或2’-去氧脲苷酸殘基，鳥苷酸殘基連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端時，N3為2’-去氧肌苷酸殘基。
(3-4)如(3-1)至(3-3)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，N1及N4為2’-O-烷基核糖核苷酸殘基。
(3-5)如(3-1)至(3-4)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，O2及O3之至少一者包含2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互配置之序列。
(3-6)如(3-1)至(3-5)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，O3包含2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互配置之序列。
(3-7)如(3-1)至(3-6)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，O1及O4之至少一者包含1、2或3個交聯型核苷酸殘基。
(3-8)如(3-7)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其特徵為交聯型核苷酸殘基以彼此不相鄰之方式配置。
(3-9)如(3-1)至(3-8)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，O1及O4之至少一者包含交聯型核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互配置之序列。
(3-10)如(3-1)至(3-9)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述交聯型核苷酸殘基為D-核呋喃糖中交聯有2’-O,4’-C-亞甲基之核苷酸(LNA)殘基或交聯有2’-O,4’-C-伸乙基之核苷酸(ENA)殘基。
(3-11)如(3-1)至(3-10)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，N2之鹼基為胞嘧啶，N2為核糖核苷酸殘基、2’-O-烷基核糖核苷酸殘基或2’-去氧核糖核苷酸殘基。
(3-12)如(3-1)至(3-11)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，核苷酸殘基間之鍵結均為硫代磷酸酯鍵。
(3-13)如(3-1)至(3-12)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係包含序列編號51、54、61、62或63之鹼基序列(惟，鹼基序列中之U可經T取代)。
(3-14)如(3-1)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係下式之任一者所示者：
U(M)^T(L)^G(M)^A(L)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(L)^U(M)^T(L)^G(M) (AD1_ASS1.39)、
A(M)^A(L)^G(M)^A(L)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^U(M) (AD1_PANK2.39)、
A(M)^T(L)^G(M)^T(L)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(L)^A(M)^C(L)^U(M) (AD1_NPHS2.39)、
G(M)^C(L)^A(M)^T(L)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^C(M) (AD1_GRIA2.39)、
U(M)^G(L)^A(M)^U(L)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(L)^G(M)^U(L)^U(M) (AD1_ASS1.52)、
G(M)^C(E)^A(M)^T(E)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^C(M) (AD1_GRIA2.39e)、
U(M)^T(E)^G(M)^A(E)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(E)^U(M)^T(E)^G(M) (AD1_ASS1.39e)、
A(M)^A(E)^G(M)^A(E)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^U(M) (AD1_PANK2.39e)、
A(M)^T(E)^G(M)^T(E)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(E)^A(M)^C(E)^U(M) (AD1_NPHS2.39e)、
C(M)^A(E)^U(M)^C(E)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M) (AD1_GRIA2.52e)、
U(M)^G(E)^A(M)^T(E)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(E)^G(M)^T(E)^U(M) (AD1_ASS1.52e)、
A(M)^G(E)^A(M)^A(E)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M) (AD1_PANK2.52e)、
U(M)^G(E)^U(M)^C(E)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^T(E)^U(M)^A(E)^C(M) (AD1_NPHS2.52e)、
G(M)^T(L)^C(M)^C(L)^C(M)^U(F)^U(F)^C(M)^U(M)^c^i^U(M)^C(F)^G(M)^A(F)^U(M)^G(F)^G(M)^U(F)^C(M)^A(L)^G(M)^C(L)^A(M) (AD1_A1AT.39)。
式中，大寫文字表示核糖核苷酸殘基(RNA)，小寫文字表示2’-去氧核苷酸殘基(DNA)，N(M)表示D-核呋喃糖為經2’-O-甲基化之核糖核苷酸殘基(2’-O-甲基-核糖核苷酸殘基)，N(F)表示經D-核呋喃糖之2’-去氧-2’-氟化之核糖核苷酸殘基(2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基)，N(L)表示經D-核呋喃糖之2’-O,4’-C-亞甲基化之核糖核苷酸殘基，N(E)表示經D-核呋喃糖之2’-O,4’-C-伸乙基化之核糖核苷酸殘基，「^」表示核苷單元間經-P(=S)(OH)-鍵結。
(3-15)如(3-1)至(3-14)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述寡核苷酸及其醫藥上可接受之鹽於5’末端或3’末端中，包含GalNAc、膽固醇及脂肪酸之傳遞分子係藉由連結子或磷酸二酯鍵(包含硫代磷酸酯鍵)結合。
(3-16)一種醫藥組成物，係含有作為有效成分之(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
(3-17)一種1鹼基編輯誘導劑，係以(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽作為有效成分。
(3-18)如(3-16)所述之醫藥組成物，係用於預防、或治療可藉由將前述標的RNA之腺苷酸殘基轉變成肌苷酸殘基而治療之疾病。
(3-19)如(3-18)所述之醫藥組成物，其中，前述疾病為遺傳性疾病。
(3-20)如(3-19)所述之醫藥組成物，其中，前述疾病包含選自由I型瓜胺酸血症、血友病(血栓症)、ALS、與泛酸鹽激酶關聯之神經退化性疾病、高胱胺酸尿症、局部節段型腎絲球硬化症、α 1抗胰蛋白酶缺乏症、苯酮尿症、厚皮性骨膜病、亞歷山大氏病、原發性高草酸尿症、吉伯特氏症候群、視網膜色素病變、遠端肌病變及血色沉著病所成群組中之至少1種疾病。
(3-21)一種醫藥組成物，係含有(3-13)或(3-14)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽作為有效成分。
(3-22)一種1鹼基編輯誘導劑，係以(3-13)或(3-14)所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽作為有效成分。
(3-23)如(3-21)所述之醫藥組成物，係用於預防或治療可藉由將前述標的RNA之腺苷酸殘基轉變成肌苷酸殘基而治療之疾病。
(3-24)如(3-23)所述之醫藥組成物，其中，前述疾病為遺傳性疾病。
(4-1)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為ASS1基因之mRNA，編輯標的為ASS1 mRNA之第1524個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列係與ASS1 mRNA之第1500至1540個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-2)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為F5基因之mRNA，編輯標的為F5 mRNA之第1696個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與mRNA之第1672至1712個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-3)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為GRIA2基因之mRNA，編輯標的為GRIA2 mRNA之第2135個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與GRIA2 mRNA之第2111至2151個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-4)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為PANK2基因之mRNA，編輯標的為PANK2 mRNA之第1728個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與PANK2 mRNA之第1704至1744個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-5)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為CBS基因之mRNA，編輯標的為CBS mRNA之第1575個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與CBS mRNA之第1551至1591個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-6)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為NPHS2基因之mRNA，編輯標的為NPHS2 mRNA之第497個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與NPHS2 mRNA之第473至513個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-7)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為SERPINA1基因之mRNA，編輯標的為SERPINA1 mRNA之第1143個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與SERPINA1 mRNA之第1119至1159個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-8)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為PAH基因之mRNA，編輯標的為PAH mRNA之第896個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與PAH mRNA之第872至912個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-9)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為SLCO2A1基因之pre-mRNA，編輯標的為SLCO2A1 pre-mRNA之第81034個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與SLCO2A1 pre-mRNA之第81010至81050個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-10)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為GFAP基因之mRNA，編輯標的為GFAP mRNA之第2168個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與GFAP mRNA之第2144至2184個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-11)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為AGXT基因之mRNA，編輯標的為AGXT mRNA之第550個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與AGXT mRNA之第526至566個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-12)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為UGT1A1基因之mRNA，編輯標的為UGT1A1 mRNA之第229個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與UGT1A1 mRNA之第205至245個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-13)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為EYS基因之mRNA，編輯標的為EYS mRNA之第8478個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與EYS mRNA之第8454至8494個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-14)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為GNE基因之mRNA，編輯標的為GNE mRNA之第924個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與GNE mRNA之第900至940個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
(4-15)如(3-1)至(3-15)中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，標的RNA為HFE基因之mRNA，編輯標的為HFE mRNA之第1005個核苷酸，除了非互補核苷酸及N3以外之核苷酸序列與HFE mRNA之第981至1021個核苷酸所包含之連續的20至40個鹼基之區域完全互補。
藉由本發明之一態樣，能提供一種寡核苷酸，係可於細胞內誘導ADAR1之編輯活性，並且具有優異的生體內之穩定性。
【圖1A】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖1B】顯示藉由細胞內之寡核苷酸之RNA編輯所致之發光強度變化的圖表。
【圖2A】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖2B】顯示藉由細胞內之寡核苷酸之RNA編輯所致之發光強度變化的圖表。
【圖3】顯示藉由源自細胞內之內生性ADAR之寡核苷酸之RNA編輯所致之發光強度變化的圖表。
【圖4A】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對hGAPDH之編輯比率的圖表。
【圖4B】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對hGAPDH之編輯比率的圖表。
【圖5】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對hGAPDH之編輯比率的圖表。
【圖6】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對hGAPDH之編輯比率的圖表。
【圖7A】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對hGAPDH之編輯比率的圖表。
【圖7B】顯示藉由源自細胞內之內生性ADAR之寡核苷酸對hGAPDH之編輯比率的圖表。
【圖8】顯示藉由寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖9】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖10】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對hGAPDH之編輯比率的圖表。
【圖11】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對hGAPDH之編輯比率的圖表。
【圖12A】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對hGAPDH之編輯比率的圖表。
【圖12B】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對hGAPDH之編輯比率的圖表。
【圖13A】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對hGAPDH之編輯比率的圖表。
【圖13B】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對hGAPDH之編輯比率的圖表。
【圖14A】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之模型標的RNA之ADAR1存在下之編輯比率的圖表。
【圖14B】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之模型標的RNA之ADAR2存在下之編輯比率的圖表。
【圖15A】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖15B】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之ASS1基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖15C】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之PANK2基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖15D】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之NPHS2基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖15E】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之GRIA2基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖16】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之PAH.2基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖17A】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之ASS1基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖17B】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之PANK2基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖17C】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之NPHS2基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖18A】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之ASS1基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖18B】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之PANK2基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖18C】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之NPHS2基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖18D】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之GRIA2基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖19】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對編輯標的5’端具有鳥苷酸殘基之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖20】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對編輯標的5’端具有腺苷酸殘基之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖21A】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對編輯標的5’端具有鳥苷酸殘基之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖21B】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對編輯標的5’端具有腺苷酸殘基之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖22】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對編輯標的5’端具有鳥苷酸殘基或腺苷酸殘基之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖23A】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之A1AT基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖23B】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之A1AT基因序列之模型標的RNA之編輯比率的圖表。
【圖24】顯示藉由細胞內之寡核苷酸所致之對具有源自疾病之序列之A1AT基因序列之模型標的RNA修復的圖表。
本說明書中之「步驟」一詞不只是獨立的步驟，即使是與其他步驟無法明確區分時，只要能達到該步驟期望之目的，亦包含於本用語。又，組成物中之各成分含量在組成物中相當於各成分之物質存在複數時，只要無特別指明，意指組成物中所存在之該複數物質之合計量。再者，本說明書所述之數值範圍之 上限及下限係可分別任意地選擇並組合作為數值範圍所例示之數值。以下，詳細說明本發明之實施形態。惟，以下所示之實施形態係為了將本發明之技術具體化而例示之寡核苷酸、醫藥組成物及疾病之預防用或治療用之方法，本發明不限定於以下所示之寡核苷酸、醫藥組成物及疾病之預防用或治療用之方法。
標的編輯引導RNA
誘導對標的RNA之特異性位點編輯之寡核苷酸(以下亦稱為「標的編輯引導RNA」、「gRNA」)包含識別標的RNA之第一寡核苷酸、及與第一寡核苷酸5’端連結之第二寡核苷酸。第一寡核苷酸可包含對應於標的RNA中之腺苷酸殘基之對應標的之核苷酸殘基、與對應標的之核苷酸殘基3’端連結並具有與標的RNA互補之鹼基序列的10至24個殘基之寡核苷酸、以及與對應標的之核苷酸殘基5’端連結並具有與標的RNA互補之鹼基序列的3至6個殘基之寡核苷酸。第二寡核苷酸係可於其3’末端缺失對應前述標的RNA之核苷酸殘基的核苷酸殘基，或是可具有不與前述標的RNA之核苷酸殘基形成互補對之核苷酸殘基。又，第二寡核苷酸之殘基數為2至10個，至少其3’末端以外之核苷酸殘基可與前述標的RNA形成互補之雙股結構。選自包含對應標的之核苷酸殘基、以及其3’端及5’端之各1個殘基的計數區域之至少1個殘基可為野生型核糖核苷酸殘基以外之核苷酸殘基。
構成標的編輯引導RNA之第二寡核苷酸，係具有標的RNA之1個核苷酸殘基不形成互補對，並且對應其核苷酸殘基以外之核苷酸殘基與標的RNA形成互補的雙股結構之鹼基序列。亦即，第二寡核苷酸具有與標的RNA形成不完全雙股結構之鹼基序列。於識別標的RNA之第一寡核苷酸5’端具有上述特徵之鹼基序列之短鏈的第二寡核苷酸之標的編輯引導RNA，係可優先地誘導細胞內之ADAR1編輯活性。此係可推測為例如，不形成互補對之核苷酸殘基之存在，係 對於ADAR1之招募而言，可利於其動作。又，藉由在計數區域包含野生型核糖核苷酸殘基以外之核苷酸殘基，生體內之穩定性更為優異。
於一態樣中，標的編輯寡核苷酸包含識別標的RNA之第一寡核苷酸、及與第一寡核苷酸5’端連結之第二寡核苷酸。第一寡核苷酸可包含對應標的RNA中之腺苷酸殘基之對應標的之核苷酸殘基、與對應標的之核苷酸殘基3’端連結並具有與標的RNA互補之鹼基序列的10至24個殘基之寡核苷酸、及與對應標的之核苷酸殘基5’端連結並具有與標的RNA互補之鹼基序列的3至6個殘基之寡核苷酸。第二寡核苷酸可於其3’末端缺失對應前述標的RNA之核苷酸殘基的核苷酸殘基，或是具有不與標的RNA之核苷酸殘基形成互補對之核苷酸殘基。第二寡核苷酸之殘基數為2至10個，至少其3’末端以外之核苷酸殘基可與標的RNA形成互補之雙股結構。標的編輯寡核苷酸中，與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之核苷酸殘基可為2’-去氧核苷酸殘基，在與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之寡核苷酸中，自對應標的之核苷酸朝3’方向數之第3個核苷酸殘基可為2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基。
標的編輯寡核苷酸，係於對應標的之核苷酸殘基3’端具有2’-去氧核苷酸殘基，在與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之寡核苷酸中，藉由於自對應標的之核苷酸朝3’方向數之第3個核苷酸殘基具有2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基，可使生體內之穩定性更優異，可更有效地誘導細胞內之ADAR之編輯活性。
於一態樣中，標的編輯寡核苷酸以下式(I)所示，可為核苷酸殘基間之鍵結包含硫代磷酸酯鍵之具有20至40個殘基的寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。標的編輯寡核苷酸之長度較佳可為20至30個殘基，更佳可為21、22、23、24、25、26、27或28個殘基。又，核苷酸殘基間之鍵結較佳可為全是硫代磷酸酯鍵。標的編輯寡核苷酸可使用於例如，將作為標的RNA之編輯標的之腺苷酸殘基轉變成肌苷酸殘基之基因編輯。
5’-O1-O2-N1-N2-N3-N4-N5-O3-O4-3’ (I)
上式(I)中，N1可為2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、核糖核苷酸殘基、2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基或2’-去氧核糖核苷酸殘基，較佳可為2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、核糖核苷酸殘基或2’-去氧核糖核苷酸殘基。N2可為鹼基係胞嘧啶或3-甲基脲嘧啶之核糖核苷酸殘基、2’-O-烷基核糖核苷酸殘基或2’-去氧核糖核苷酸殘基。N3可為2’-去氧核糖核苷酸殘基。N4可為2’-O-烷基核糖核苷酸殘基或2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基。N5可為2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基。
O1可不存在，或為2至10個殘基之寡核苷酸。O1包含至少1個交聯型核苷酸殘基，交聯型核苷酸殘基以外可為2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基或2’-O-烷基核糖核苷酸殘基。O2為2至10個殘基之寡核苷酸，可包含2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基及2’-O-烷基核糖核苷酸殘基。O2較佳為3、4、5、6、7或8個殘基，更佳為3或4個殘基之寡核苷酸，可包含2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基及2’-O-烷基核糖核苷酸殘基。O3為5至20個殘基之寡核苷酸，可包含2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基及2’-O-烷基核糖核苷酸殘基。O3較佳為5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個殘基，更佳為6或7殘基之寡核苷酸，可包含2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基及2’-O-烷基核糖核苷酸殘基。O4可不存在，或為2至10個殘基之寡核苷酸，較佳可為2、3、4、5、6、7或8個殘基，更佳為4或5個殘基之寡核苷酸。O4包含至少1個交聯型核苷酸殘基，交聯型核苷酸殘基以外可為2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基或2’-O-烷基核糖核苷酸殘基。
O2及O3之至少一者可包含2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互配置之序列，較佳為由2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互配置之序列構成。於O2中，2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基之連結的重複數可為例如1以上3以 下，較佳可為1或2。於O3中，2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基之連結的重複數可為例如1以上10以下，較佳可為2以上6以下，更佳可為3或4。2’-去氧核糖核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互連結之鹼基序列可自2’-去氧核糖核苷酸殘基朝3’方向相互連結，亦可為自2’-O-烷基核糖核苷酸殘基朝3’方向相互連結。O1及O4之至少一者可包含1、2或3個交聯型核苷酸殘基，此時，可以交聯型核苷酸殘基彼此不相鄰之方式配置。O1及O4之至少一者可包含交聯型核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互配置之序列。於O1及O4中，交聯型核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基之連結的重複數可為例如1以上3以下，較佳可為2。2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列可為自2’-O-烷基核糖核苷酸殘基朝3’方向相互連結，亦可為自交聯型核苷酸殘基朝3’方向相互連結。
N1及N4較佳可為2’-O-烷基核糖核苷酸殘基。又，N2較佳可為鹼基為胞嘧啶之核糖核苷酸殘基、2’-O-烷基核糖核苷酸殘基或2’-去氧核糖核苷酸殘基。
標的編輯寡核苷酸中，N2為對應作為編輯標的之腺苷酸殘基，O2係自3’端開始之第2至5個核苷酸殘基之區域中，缺失與對應標的RNA之核苷酸殘基對應之核苷酸殘基，或可具有不與對應標的RNA之核苷酸殘基形成互補對之核苷酸殘基。
標的編輯寡核苷酸之鹼基序列中，N3之鹼基可為與作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端相鄰之鹼基互補或非互補之鹼基。N1、N4、N5、O1、O3及O4之鹼基係可與標的RNA之對應核苷酸殘基之鹼基完全互補。於O2中，所缺失之核苷酸殘基、及與對應標的RNA之核苷酸殘基不形成互補對之核苷酸殘基以外的O2之鹼基，係可與標的RNA之對應核苷酸殘基之鹼基完全互補。
式(I)所示之標的編輯寡核苷酸中，作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端之核苷酸殘基與N3形成互補對時，N3可為2’-去氧腺苷酸殘基、2’-去氧肌苷酸殘基(惟，排除作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端之核苷酸殘基為腺苷酸殘基及脲苷酸殘基之情形)、胸苷酸殘基或2’-去氧脲苷酸殘基(排除作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端之核苷酸殘基為鳥苷酸殘基之情形)。又，作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端之核苷酸殘基與N3不形成互補對時，N3可為2’-去氧肌苷酸殘基。
標的編輯寡核苷酸係藉由具有式(I)所示之結構，生體內之穩定性更為優異，可更有效地誘導細胞內之ADAR之編輯活性。
於本實施形態之標的編輯引導RNA中，相較於以往類型之標的編輯引導RNA，由於長度較短，可單純地降低製造成本。又，易於化學合成，易於將核酸醫藥品開發等所使用之現有人工核酸等之修飾核苷酸適用於標的編輯引導RNA。藉此，通過細胞內抗分解性之提升、細胞導入效率之提升等，可提供更高功能之標的編輯引導RNA。再者，藉由標的編輯引導RNA係由編輯誘導所需之最底限度的殘基數所構成，可維持對標的RNA之特異性，並可抑制編輯標的之腺苷酸殘基以外位置的標的外編輯。
標的編輯引導RNA例如藉由將觸發標的編輯之ADAR中之ADAR1優先招募至標的RNA，而誘導對標的RNA之特異性位點編輯。ADAR係將雙股RNA中之腺苷酸殘基藉由水解性脫胺反應轉變成肌苷酸殘基之酵素，廣泛存在於哺乳動物之細胞。由於肌苷酸殘基之結構與鳥苷酸殘基類似，RNA訊息之轉譯時被轉譯成鳥苷酸殘基，因而其結果為RNA訊息被編輯。編碼胺基酸之部分產生如此之RNA編輯時，就算基因上無DNA突變仍產生胺基酸置換等，而可控制標的基因之功能。
標的編輯引導RNA係被導入哺乳動物之細胞時，可優先地將細胞中存在之ADAR1招募至標的RNA，從而誘導對標的RNA之特異性位點編輯。
本實施形態之標的編輯引導RNA可誘導細胞內ADAR1優先地編輯活性。ADAR1優先意指例如，於試管內(in vitro)，對ADAR1之編輯誘導活性相對於對ADAR2之編輯誘導活性的比超過1，較佳為1.5以上、2以上或5以上。此外，細胞內之對ADAR1及ADAR2之編輯誘導活性，使用了利用相同表現載體所建構之ADAR1表現質體與ADAR2表現質體，於細胞內以相同條件轉染使之表現時，是指對相同標的編輯部位之編輯誘導效率係ADAR1較高。
標的編輯引導RNA所包含之第一寡核苷酸係識別標的RNA。標的RNA只要為包含作為編輯對象之腺苷酸殘基者，則無特別限制，可為細胞性RNA、病毒性RNA之任一種，通常為編碼蛋白質之mRNA前驅物(包含pre-mRNA)或mRNA。標的RNA之編輯部位可存在於非轉譯區域、剪接區域、外顯子(exon)、內含子(intron)、或影響RNA之穩定性、結構或功能之任意區域。又，標的RNA可為包含應修正或變更之突變者。或者是，標的RNA係其序列可為以編碼與野生型不同之表現型的方式而經突變者。
標的RNA較佳為編碼蛋白質之RNA。經編碼之蛋白質具體可列舉：血清素受體、麩胺酸受體、膜電位依賴型鉀通道、STAT3、NFkBIA、MAPK14等與訊息傳遞有關之磷酸化蛋白質等。
標的編輯引導RNA可適用於例如遺傳性疾病之治療。遺傳性疾病可為例如，藉由將標的RNA之腺苷酸殘基轉變成肌苷酸殘基而可治療之疾病。又，遺傳性疾病可為例如，以基因中之鳥苷酸殘基突變成腺苷酸殘基為原因之遺傳性疾病。遺傳性疾病可舉例如：囊腫纖維化(cystic fibrosis)、白化症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、阿茲海默症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、氣喘、β-地中海型貧血、CADASIL症候群、夏馬杜三氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、遠端脊髓性肌肉萎縮症(distal spinal muscular atrophy，DSMA)、杜興氏/貝克氏肌肉失 養症(Duchenne/Becker muscular dystrophy)、失養性水疱性表皮鬆解症(dystrophic epidermolysis bullosa)、表皮鬆解性水皰症(epidermolysis bullosa)、法布瑞氏症(Fabry disease)、與第五凝血因子萊頓(Factor 5 Leiden)關聯之障害、家族性腺性息肉症(familial adenomatous polyposis)、息肉症、半乳糖血症、高歇氏病(Gaucher's disease)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏症、血友病、遺傳性血色素沉著病、韓特氏症(Hunter syndrome)、亨丁頓氏舞蹈症(Huntington disease)、賀勒氏症(Hurler's syndrome)、炎症性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、遺傳性多凝集素症候症(Inherited polyagglutination syndrome)、萊伯氏先天性黑朦症(Leber congenital amaurosis)、萊希氏-尼亨氏症(Lesch-Nyhan Syndrome)、林奇氏症(Lynch syndrome)、馬方氏症(Marfan syndrome)、黏多糖病(mucopolysaccharidosis)、肌肉失養症(muscular dystrophy)、肌強直性失養症(myotonic dystrophy)型I及I、神經纖維瘤病(neurofibromatosis)、尼曼氏-匹克氏症(Niemann-Pick disease)A、B及C型、與NY-eso-1關聯之胰臟癌、帕金森氏症、皮傑氏症(Peutz-Jeghers syndrome)、苯酮尿症、龐貝氏症(Pompe disease)、原發性纖毛運動障礙(primary ciliary dyskinesia)、如凝血酶原G20210A突變之與凝血酶原突變關聯之疾病、肺高血壓症、視網膜色素病變、山多夫氏病(Sandhoff disease)、嚴重合併性免疫不全病(severe combined immunodeficiency disease，SCID)、鐮形血球貧血症、脊髓性肌肉萎縮症(spinal muscular atrophy)、斯特格氏症(Stargardt disease)、戴氏-薩克斯氏病(Tay-Sachs disease)、尤塞氏綜合症(Usher syndrome)、X性聯遺傳免疫不全病、癌症之各種形態(例如與BRCA1及2關聯之乳癌、卵巢癌等)等。
遺傳性疾病之具體例可列舉：I型瓜胺酸血症(ASS1)、II型瓜胺酸血症(SLC25A13)、血友病(Factor V Leiden)、原發性高草酸尿症(AGXT)、遠端肌病變(GNE)、囊腫纖維化(CFCFTR)、高胱胺酸尿症(CBS)、賀勒氏症：黏多糖病 (IDUA(SLC26A1))亞歷山大氏病(GFAP)、視網膜色素病變(EYS)苯酮尿症(PAH)、血色沉著病(HFE)、吉伯特氏症候群(UGT1A1)等。此外，括弧內為標的基因名。
適用於遺傳性疾病之治療之標的編輯引導RNA，係例如可包含選自由序列編號49至55及序列編號60至63所成群組中之任一鹼基序列，較佳可包含選自由序列編號51、54、61、62及63所成群組中之任一鹼基序列。此外，標的編輯引導RNA係在以序列編號特定之鹼基序列中，可包含U經取代成T之鹼基序列。
作為I型瓜胺酸血症之原因的ASS1基因的c.1168G>A突變(rs121908641)，係人類精胺基琥珀酸合成酶1(Homo sapiens argininosuccinate synthase 1，ASS1)轉錄突變體1的mRNA(GenBank Accession No：NM_000050.4)之第1524個核苷酸之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該ASS1 mRNA之第1500至1540個所包含之連續20至40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第1504至1534個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第1510至1534所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為血友病(血栓症)之原因之第五因子基因的c.1601G>A突變(rs6025)，係人類第五凝血因子(Homo sapiens coagulation factor V，F5)的mRNA(GenBank Accession No：NM_000130.5)之第1696個核苷酸之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該F5 mRNA之第1672至1712個所包含之連續20至40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第1676至1706個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第1682至1706個所包含之連續20至25鹼基之區域完全互補。
GRIA2基因之轉錄後修飾異常，係可為肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)之原因。人類麩胺酸離子型受體AMPA型次單元2(Homo sapiens glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 2，GRIA2)轉錄突變體1的mRNA(GenBank Accession No：nm_000826.4)之第2135個腺苷酸之A至I的RNA編輯異常可能是該轉錄後修飾異常。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該GRIA2 mRNA之第2111至2151個所包含之連續20至40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第2115至2145個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第2121至2145個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為與泛酸鹽激酶關聯之神經退化性疾病之原因的PANK2基因的c.1561G>A突變(rs137852959)，係人類泛酸激酶2(Homo sapiens pantothenate kinase 2，PANK2)轉錄突變體1的mRNA(GenBank Accession No：NM_153638.3)上之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該PANK2 mRNA之第1704至1744個所包含之連續20至40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第1708至1738個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第1714至1738個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為高胱胺酸尿症之原因之CBS基因的c.1330G>A突變(rs28934891)，係人類胱硫醚(Homo sapiens cystathionine beta-synthase，cystathionine)β合成酶(CBS)轉錄突變體1的mRNA(GenBank Accession No：NM_000071.2)之第1575個核苷酸之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該CBS mRNA之第1551至1591個所包含之連續20至40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第1555至1585個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第1561至1585個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為局部節段型腎絲球硬化症之原因之NPHS2基因的c.413G>A突變(rs74315342)，係人類NPHS2紅細胞膜整合蛋白家族成員(Homo sapiens NPHS2 stomatin family member)之足蛋白(NPHS2)轉錄突變體1的mRNA(GenBank Accession No：NM_014625.4)之第497個核苷酸之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該NPHS2 mRNA之第473至513個所包含之連續20至40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第477至507個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第483至507個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為α 1抗胰蛋白酶缺乏症之原因之SERPINA1基因的c.1096G>A突變(rs28929474)，係人類絲胺酸蛋白酶抑制子家族A成員1(Homo sapiens serpin family A member 1，SERPINA1)轉錄突變體1的mRNA(GenBank Accession No：NM_000295.5)之第1143個核苷酸之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該SERPINA1 mRNA之第1119至1159個所包含之連續20至40鹼基之區域完全互補，較佳為可與第1123至1153個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第1129至1153個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為苯酮尿症之原因之PAH基因的c.782G>A突變(rs5030849)，係人類苯丙胺酸羥化酶(Homo sapiens phenylalanine hydroxylase，PAH)轉錄突變體1的mRNA(GenBank Accession No：NM_000277.3)之第896個核苷酸之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該PAH mRNA之第872至912個所包含之連續20至40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第876至906個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第882至906個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為厚皮性骨膜病之原因之SLCO2A1基因的c.940+1G>A突變(rs765249238)，係人類溶質載體有機陰離子轉運子家族成員2A1(Homo sapiens solute carrier organic anion transporter family member 2A1，SLCO2A1)的mRNA(GenBank Accession No：NM_005630.3)之pre-mRNA上第81034個核苷酸之G突變成A(編輯標的係位於3號染色體之第133948892個負股上)。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該SLCO2A1 pre-mRNA之第81010至81050個所包含之連續20至40鹼基之區域完全互補，較佳為可與第81014至81044個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第81020至81044個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為亞歷山大氏病之原因之GFAP基因的c.716G>A突變(rs59565950)，係人類膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)轉錄突變體1的mRNA(GenBank Accession No：NM_002055.5)之第2168個核苷酸之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該GFAP mRNA之第2144至2184個所包含之連續20至40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第2148至2178個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第2154至2178個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為原發性高草酸尿症之原因之AGXT基因的c.508G>A突變(rs121908529)，係為人類丙胺酸-乙醛酸及絲胺酸-丙酮酸轉胺酶(Homo sapiens alanine- glyoxylate and serine- pyruvate aminotransferase，AGXT)的mRNA(GenBank Accession No：NM_000030.3)之第550個核苷酸之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該AGXT mRNA之第526至566個所包含之連續20至 40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第530至560個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第536至560個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為吉伯特氏症候群之原因之UGT1A1基因的c.211G>A突變(rs4148323)，係人類UDP葡萄糖醛酸基轉移酶家族1成員A1(Homo sapiens UDP glucuronosyltransferase family 1 member A1，UGT1A1)的mRNA(GenBank Accession No：NM_000463.3)之第229個核苷酸之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該UGT1A1 mRNA之第205至245個所包含之連續20至40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第209至239個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第215至239個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為視網膜色素病變之原因之EYS基因的c.7919G>A突變(rs527236066)，係人類眼睛關閉同源物(eyes shut homolog，EYS)轉錄突變體1的mRNA(GenBank Accession No：NM_001142800.2)之第8478個核苷酸之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該EYS mRNA之第8454至8494個所包含之連續20至40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第8458至8488個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第8464至8488個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為遠端肌病變之原因之GNE基因的c.797G>A突變(rs121908622)為人類葡萄糖胺(UDP-N-乙醯基)-2-表異構酶/N-乙醯基甘露胺糖激酶(Homo sapiens gtucosamine(UDP-N-acetyl)-2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase，GNE)轉錄突變體1的mRNA(GenBank Accession No：NM_001128227.3)之第924個核苷酸之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該GNE mRNA之第900至 940個所包含之連續20至40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第904至934個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第910至934個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
作為血色沉著病之原因之HFE基因的c.845G>A突變(rs1800562)，係人類鐵恆定調控素(homeostatic iron regulator，HFE)轉錄突變體1的mRNA(Gen Bank Accession No：NM_000410.3)之第1005個核苷酸之G突變成A。於一態樣中，寡核苷酸以該腺苷酸殘基為標的。例如，於一態樣中，寡核苷酸中非互補核苷酸殘基及N3以外之核苷酸序列，係可與該HFE mRNA之第981至1021個所包含之連續20至40個鹼基之區域完全互補，較佳為可與第985至1015個所包含之連續20至29個鹼基之區域，更佳為可與第991至1015個所包含之連續20至25個鹼基之區域完全互補。
第一寡核苷酸包含對應標的RNA中作為編輯標的之腺苷酸殘基之對應標的之核苷酸殘基、與對應標的之核苷酸殘基3’端連結並具有與標的RNA所對應之鹼基序列互補之鹼基序列之10至24個殘基的3’端寡核苷酸、及與對應標的之核苷酸殘基5’端連結並具有與標的RNA所對應之鹼基序列互補之鹼基序列之3至6個殘基的5’端寡核苷酸。分別與與對應標的之核苷酸殘基3’端與5’端連結之寡核苷酸藉，係與標的RNA形成雙股結構，全體形成互補股(以下，亦稱為第一互補股)，藉此識別標的RNA及標的RNA之編輯標的部位。於此，本說明書中之互補之鹼基序列中，除了包含形成華生-克里克(Watson-Crick)型鹼基對之鹼基序列以外，還包含例如，形成G-U鹼基對等熱力學上穩定之非華生-克里克型之搖擺(wobble)鹼基對。形成第一互補股之鹼基對中，對應標的之核苷酸殘基以外之全部皆可為華生-克里克型之鹼基對，亦可至少一部分為搖擺鹼基對。第一互補股包含搖擺鹼基對時，其數量可為1或2。為了方便，以下，有時將對應 標的之核苷酸殘基、其5’端之1個殘基、及其3’端之1個殘基之由3個殘基所構成之區域稱為計數區域，將第一寡核苷酸之計數區域以外稱為非計數區域。
於一態樣中，第一寡核苷酸中之與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之10至24個殘基的3’端寡核苷酸中，對應標的之核苷酸殘基3’端之第1個核苷酸殘基，係不與標的RNA所對應之核苷酸殘基形成互補對之核苷酸殘基，該核苷酸殘基以外之核苷酸殘基係可與標的RNA所對應之核苷酸殘基形成互補對，從而與標的RNA形成雙股結構。具體而言，例如，鳥苷酸殘基連結於標的RNA之作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端時，對應標的之核苷酸殘基之3’端之第1個核苷酸殘基可為2’-去氧肌苷酸殘基。
對應標的之核苷酸殘基係對應作為編輯標的之腺苷酸殘基之核苷酸殘基，例如為胞苷酸殘基、鳥苷酸殘基、腺苷酸殘基或其等衍生物。對應標的之核苷酸殘基較佳為不與作為編輯標的之腺苷酸殘基形成鹼基對之鹼基，更佳為胞苷酸殘基或其衍生物，再更佳為胞苷酸殘基。於一態樣中，對應標的之核苷酸殘基可為N-烷基嘧啶核苷酸殘基，較佳可為N-烷基胞苷酸殘基、N-烷基-2’-去氧胞苷酸殘基、N-烷基脲苷酸殘基或N-烷基去氧脲苷酸殘基。N-烷基嘧啶核苷酸殘基之烷基可為碳數1至6或1至4之烷基，較佳可為甲基或乙基。藉由對應標的之核苷酸殘基為N-烷基嘧啶核苷酸殘基，而有提升編輯誘導活性的情形。又，可進一步修飾N-烷基嘧啶核苷酸殘基之糖部分及磷酸酯鍵部分之至少一者。於後文描述糖部分及磷酸酯鍵部分之修飾。
於一態樣中，對應標的之核苷酸殘基可為2’-去氧胞苷酸殘基。可進一步修飾2’-去氧胞苷酸殘基之磷酸酯鍵部分。
於第一寡核苷酸中，與對應標的之核苷酸殘基3’端連結並具有與標的RNA互補之鹼基序列之寡核苷酸的殘基數可為10以上24以下，較佳為11以上、12以上或13以上，更佳為22以下、20以下、18以下、16以下或15以下。於一 態樣中，具有與標的RNA互補之鹼基序列之寡核苷酸的殘基數可為12以上20以下、12以上18以下、12以上16以下、14以上18以下、或14以上16以下。又，於一態樣中，具有與標的RNA互補之鹼基序列之寡核苷酸的殘基數可為14。殘基數為前述範圍時，有更為提升對ADAR1之選擇性之傾向。
於第一寡核苷酸中，與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之3’端寡核苷酸，係可具有相對於標的RNA不含有錯配(mismatch)鹼基對之互補鹼基序列。此時，標的RNA較佳為鳥苷酸殘基未連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基的5’端。亦即，與標的RNA之作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端連結之鹼基為腺苷酸殘基、胞苷酸殘基或脲苷酸殘基時，於第一寡核苷酸中，與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之寡核苷酸較佳為具有相對於標的RNA不含有錯配鹼基對之互補之鹼基序列。
於第一寡核苷酸中，與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之3’端寡核苷酸，係根據情況可包含相對於標的RNA之鹼基序列為非互補之鹼基。例如，在鳥苷酸殘基連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端之標的RNA中，有編輯誘導活性降低之情形。此時，第一寡核苷酸亦可藉由具有包含相對於該鳥苷酸殘基為非互補之鹼基的鹼基序列，進而提升編輯誘導活性。相對於該鳥苷酸殘基為非互補之鹼基，係可為例如鳥苷酸殘基。亦即，針對鳥苷酸殘基連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端之標的RNA，標的編輯引導RNA中，鳥苷酸殘基可連結於對應標的之核苷酸殘基的3’端。
於第一寡核苷酸中，與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之3’端寡核苷酸，係根據情況可與進行對應之標的RNA之核苷酸殘基形成非華生-克里克型之搖擺鹼基對，又，與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之3’端寡核苷酸，係根據情況可為2’-去氧核苷酸殘基。藉此，有提升編輯標的活性之情形。
例如，標的RNA中胞苷酸殘基連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端時，第一寡核苷酸係可可於對應標的之核苷酸殘基3’端連結具有作為鹼基之次黃嘌呤殘基的核苷酸殘基。亦即，連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端之胞苷酸殘基、及第一寡核苷酸之具有作為鹼基之次黃嘌呤殘基的核苷酸殘基，係可形成搖擺鹼基對。具有作為鹼基之次黃嘌呤殘基的核苷酸殘基，係可為肌苷酸殘基或2’-去氧肌苷酸殘基，較佳為2’-去氧肌苷酸殘基。又，具有作為鹼基之次黃嘌呤殘基的核苷酸殘基，係可進一步修飾糖部分及磷酸酯鍵部分之至少一者。於後文描述糖部分及磷酸酯鍵部分之修飾。
例如，標的RNA中脲苷酸殘基連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端時，第一寡核苷酸係可於對應標的之核苷酸殘基3’端連結具有作為鹼基之腺嘌呤基的核苷酸殘基。亦即，連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端之脲苷酸殘基、及第一寡核苷酸之具有作為鹼基之腺嘌呤基的核苷酸殘基係可形成鹼基對。具有作為鹼基之腺嘌呤基的核苷酸殘基係可為腺苷酸殘基或2’-去氧腺苷酸殘基，較佳為2’-去氧腺苷酸殘基。又，具有作為鹼基之腺嘌呤基的核苷酸殘基，係可進一步修飾糖部分及磷酸酯鍵部分之至少一者。於後文描述糖部分及磷酸酯鍵部分之修飾。
例如，標的RNA中腺苷酸殘基連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端時，第一寡核苷酸係可於對應標的之核苷酸殘基3’端連結具有作為鹼基之嘧啶基的核苷酸殘基。亦即，連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端之腺苷酸殘基、及第一寡核苷酸之具有作為鹼基之嘧啶基的核苷酸殘基係可形成鹼基對。具有作為鹼基之嘧啶基的核苷酸殘基係可為胸苷酸殘基或2’-去氧脲苷酸殘基。又，具有作為鹼基之嘧啶基的核苷酸殘基，係可進一步修飾糖部分及磷酸酯鍵部分之至少一者。於後文描述糖部分及磷酸酯鍵部分之修飾。
例如，標的RNA中鳥苷酸殘基連結於作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端時，第一寡核苷酸係可於對應標的之核苷酸殘基3’端連結作為鹼基之次黃嘌呤殘基。次黃嘌呤殘基可為2’-去氧肌苷酸殘基。又，次黃嘌呤殘基係可進一步修飾糖部分及磷酸酯鍵部分之至少一者。於後文描述糖部分及磷酸酯鍵部分之修飾。
第一寡核苷酸可於自對應標的之核苷酸殘基朝3’方向數第10個以後，較佳為第11個以後之核苷酸殘基中，具有至少1種交聯型核苷酸殘基。交聯型核苷酸殘基係可在D-核呋喃糖之2’位與4’位間交聯。於後文描述交聯型核苷酸殘基之具體例。交聯型核苷酸殘基可包含經2’-O,4’-C-亞甲基交聯之核苷酸(LNA)及經2’-O,4’-C-伸乙基交聯之核苷酸(ENA)之至少一者。又，交聯型核苷酸殘基，係可進一步修飾鹼基部分及磷酸酯鍵部分之至少一者。於後文描述鹼基部分及磷酸酯鍵部分之修飾。
第一寡核苷酸中，包含自對應標的之核苷酸朝3’方向數第10個以後，較佳為第11個以後之核苷酸殘基的寡核苷酸，係可具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基之連結之重複數可為例如1以上3以下，較佳可為2。2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列可自2’-O-烷基核糖核苷酸殘基朝3’方向相互連結，亦可自交聯型核苷酸殘基朝3’方向相互連結。於後文描述2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基之具體例。又，2’-O-烷基核糖核苷酸殘基或交聯型核苷酸殘基，係可進一步修飾鹼基部分及磷酸酯鍵部分之至少一者。於後文描述鹼基部分及磷酸酯鍵部分之修飾。
於第一寡核苷酸中，與對應標的之核苷酸殘基5’端連結並具有與標的RNA互補之鹼基序列之5’端寡核苷酸的殘基數可為3以上6以下，較佳為3以 上5以下、3以上4以下或3。殘基數為前述範圍時，有更為提升對ADAR1之選擇性之傾向。
第二寡核苷酸係與標的RNA形成包含1個以上不形成互補鹼基對之核苷酸殘基之雙股結構(以下，亦稱為第二互補股)。第二寡核苷酸之殘基數可為2以上10以下或4以上8以下。第二寡核苷酸之殘基數為例如3以上，較佳為4以上或5以上，又例如10以下，較佳為9以下、8以下或7以下。於一態樣中，第二寡核苷酸之殘基數可為6。殘基數為前述範圍時，有更為增進編輯誘導之傾向。第二互補股中不形成互補鹼基對之核苷酸殘基數為例如3個以下或2個以下，較佳為1個。
第二互補股中不形成互補鹼基對之核苷酸殘基，係可於標的RNA或第二寡核苷酸之一者中，藉由缺失對應另一者之核苷酸殘基核苷酸殘基，而存在不成為鹼基對之核苷酸殘基。又，第二互補股中不形成互補鹼基對之核苷酸殘基，係於標的RNA及第二寡核苷酸中，藉由包含所對應之核苷酸殘基之鹼基對，係藉由彼此為具有非互補核酸鹼基之錯配鹼基對(非互補鹼基對)，而可為存在於標的RNA及第二寡核苷酸兩者中之核苷酸殘基。於一實施形態中，不形成互補鹼基對之核苷酸殘基可為存在於標的RNA或第二寡核苷酸之一者中之不形成鹼基對的核苷酸殘基，較佳可為存在於標的RNA中之不形成鹼基對的核苷酸殘基。藉此，有更為增進編輯誘導之傾向。此處之錯配鹼基對意指於標的RNA及第二寡核苷酸中，對應之2個核苷酸殘基所具有的核酸鹼基為不形成穩定鹼基對之組合。
第二互補股中不形成互補鹼基對之核苷酸殘基的位置，較佳為在標的RNA上，自第一互補股與第二互補股之結合位置之3’端之第1個殘基至第3個殘基之任一者，更佳為第1個殘基。又，第二互補股中不形成互補鹼基對之核苷酸殘基的位置，更佳為在第二寡核苷酸上，自第一互補股與第二互補股之結合位置之5’端之第1個殘基至第3個殘基之任一者，更佳為第1個殘基。
第二互補股中不形成互補鹼基對之核苷酸殘基中，對應自標的RNA之第一互補股與第二互補股之結合位置之3’端之第1個殘基的核苷酸殘基之核苷酸殘基，係可為因第二寡核苷酸的缺失所衍生者。又，第二互補股中不形成互補對之核苷酸殘基，係可為源自標的RNA之第一互補股與第二互補股之結合位置之3’端之第1個殘基的核苷酸殘基、與第二寡核苷酸3’末端之核苷酸殘基所形成之錯配鹼基對所衍生者。
於第二寡核苷酸中，缺失對應標的RNA之核苷酸殘基的核苷酸殘基時，第二寡核苷酸除了缺失核苷酸殘基之部分以外，可具有與標的RNA互補之鹼基序列。又，第二寡核苷酸具有不與對應於標的RNA之核苷酸殘基之核苷酸殘基形成互補對之核苷酸殘基時，第二寡核苷酸除了不形成互補對之核苷酸殘基以外，可具有與標的RNA互補之鹼基序列。
第二寡核苷酸可於自其3’末端之核苷酸殘基朝5’方向數第2個以後，較佳為第3個以後之核苷酸殘基具有至少1種交聯型核苷酸殘基。交聯型核苷酸殘基係D-核呋喃糖之2’位與4’位間可經交聯。於後文描述交聯型核苷酸殘基之具體例。交聯型核苷酸殘基可包含經2’-O,4’-C-亞甲基交聯之核苷酸(LNA)及經2’-O,4’-C-伸乙基交聯之核苷酸(ENA)之至少一者。又，交聯型核苷酸殘基，係可進一步修飾鹼基部分及磷酸酯鍵部分之至少一者。於後文描述鹼基部分及磷酸酯鍵部分之修飾。
第二寡核苷酸中，包含自其3’末端之核苷酸殘基朝5’方向數第2個以後，較佳為第3個以後之核苷酸殘基的寡核苷酸，係可具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基之連結之重複數可為例如1以上3以下，較佳可為2。2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列可自2’-O-烷基核糖核苷酸殘基朝5’方向相互連結，亦可自交聯型核苷酸殘基朝5’方向相 互連結。於後文描述2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基之具體例。又，2’-O-烷基核糖核苷酸殘基或交聯型核苷酸殘基，係可進一步修飾鹼基部分及磷酸酯鍵部分之至少一者。於後文描述鹼基部分及磷酸酯鍵部分之修飾。
標的編輯引導RNA之一態樣中，與標的RNA形成第一互補股之第一寡核苷酸，係包含作為對應標的之核苷酸殘基之胞苷酸殘基、具有與標的RNA之鹼基序列互補之鹼基序列且與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之殘基數為12至18或14至16個之3’端寡核苷酸、以及具有與標的RNA之鹼基序列互補之鹼基序列且與對應標的之核苷酸殘基5’端連結之殘基數為3個之5’端寡核苷酸，第二寡核苷酸包含缺失對應自標的RNA之第一互補股與第二互補股之結合位置之3’端之第1個殘基的核苷酸殘基，第2個殘基以後具有互補鹼基序列且殘基數為4至8個之寡核苷酸。
構成標的編輯引導RNA之核苷酸可選自野生型核糖核苷酸(RNA)、野生型去氧核糖核苷酸(DNA)、RNA/DNA之嵌合體、此等修飾物之修飾核苷酸之任一者。構成標的編輯引導RNA之核苷酸可藉由鍵結於核苷酸之糖部分之羥基的磷酸二酯鍵而相互連結。前述磷酸二酯鍵可利用糖部分之2’位羥基、3’位羥基、或5’位羥基而形成。構成標的編輯引導RNA之核苷酸可形成野生型之3’-5’磷酸二酯鍵。構成標的編輯引導RNA之核苷酸之至少1個可為修飾核苷酸。就修飾核苷酸而言，可例示經糖部分修飾者、經磷酸二酯鍵修飾者、經鹼基修飾者及此等組合。
糖部分之修飾可舉例如：D-核呋喃糖之2’-O-烷基化核糖核苷酸(例如，2’-O-甲基化、2’-O-胺基乙基化、2’-O-丙基化、2’-O-烯丙基化、2’-O-甲氧基乙基化、2’-O-丁基化、2’-O-戊基化、2’-O-炔丙基化等)；D-核呋喃糖之2’位與4’位間經交聯之交聯型核糖核苷酸(例如，2’-O,4’-C-伸乙基化、2’-O,4’-C-亞甲基化、2’-O,4’-C-伸丙基化、2’-O,4’-C-四亞甲基化、 2’-O,4’-C-五亞甲基化、2’-S,4’-C-亞甲基化、D-核呋喃糖之2’-去氧-2’-C，4’-C-亞甲基氧基亞甲基化物、S-cEt(2’,4’-約束(constrained)乙基)、AmNA等)；3’-去氧-3’-胺基-2’-去氧-D-核呋喃糖：3’-去氧-3’-胺基-2’-去氧-2’-氟-D-核呋喃糖；2’-去氧-2’-氟-D-核呋喃糖；D-去氧核糖等。
磷酸二酯鍵部分之修飾可列舉：硫代磷酸酯鍵(包含衍生自磷原子不對稱之光學異構物)、甲基磷酸酯鍵、甲基硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、亞磷醯胺(phosphoramidite)鍵等。
鹼基部分之修飾可列舉：鹵化；甲基化、乙基化、丙基化、異丙基化、環丙基化、丁基化、異丁基化、第二丁基化、第三丁基化、環丁基化等碳數1至6或1至4之烷基化；羥化；胺化；脫胺化；二甲基化等。具體可列舉：胞嘧啶之5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化、N4-甲基化等；胸腺嘧啶之5-二甲基化(脲嘧啶)、5-氟化、5-溴化、5-碘化等；腺嘌呤之N6-甲基化、8-溴化等；鳥糞嘌呤之N2-甲基化、8-溴化等。
標的編輯引導RNA中，選自計數區域之至少1個殘基、至少2個殘基、或3個殘基均可為野生型核糖核苷酸(RNA)殘基以外之核苷酸殘基，較佳為至少1個殘基、至少2個殘基、或3個殘基均為修飾核苷酸殘基。計數區域之修飾核苷酸殘基，係可修飾糖部分及磷酸二酯鍵之至少一者，可至少修飾糖部分，可至少修飾磷酸二酯鍵，或可修飾糖部分及磷酸二酯鍵。例如，對應標的之核苷酸殘基可為具有硫代磷酸酯鍵之胞苷酸殘基。又，例如，對應標的之核苷酸殘基5’端或3’端之各1個殘基，係可修飾糖部分及磷酸二酯鍵之至少一者，可至少修飾糖部分，可至少修飾磷酸二酯鍵，或可至少修飾糖部分及磷酸二酯鍵。計數區域之糖部分之修飾可為例如，2’-O-烷基化、2’-去氧-2’-氟化、2’-去氧化等。
第一寡核苷酸之計數區域以外之寡核苷酸殘基(非計數區域)內，於至少1個殘基、至少3個殘基、或所有殘基中，係可修飾糖部分及磷酸二酯鍵之至 少一者，可至少修飾糖部分，可至少修飾磷酸二酯鍵，或可至少修飾糖部分及磷酸二酯鍵。非計數區域之糖部分之修飾可為例如，2’-O-烷基化、2’-去氧-2’-氟化、2’位與4’位間之交聯化、2’-去氧化(DNA化)等。第一寡核苷酸具有複數個修飾核苷酸殘基時，複數個修飾核苷酸殘基可連續配置，亦可間隔配置。又，第一寡核苷酸之所有核苷酸殘基可經硫代磷酸酯鍵連結而構成。
第一寡核苷酸之與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之3’端寡核苷酸，係可具有選自由2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基、2’-O-烷基核糖核苷酸殘基及交聯型核苷酸殘基所成群組中之2種修飾核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。亦即，與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之3’端寡核苷酸，係可具有2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互連結之鹼基序列，可具有交聯型核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互連結之鹼基序列，可具有2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。此處所使用之具有2種修飾核苷酸殘基相互連結之鹼基序列，意指下列兩種意思：作為對象之寡核苷酸(此處係指第一寡核苷酸之3’端寡核苷酸)部分具有2種修飾核苷酸殘基相互連結之鹼基序列、或作為對象之寡核苷酸全體具有2種修飾核苷酸殘基相互連結之鹼基序列，本說明書之以下說明亦使用相同意思。
第一寡核苷酸之3’端寡核苷酸，係可一部分核苷酸殘基以硫代磷酸酯鍵連結而構成，亦可所有核苷酸殘基以硫代磷酸酯鍵連結而構成。
於第一寡核苷酸之3’端寡核苷酸中，自對應標的之核苷酸殘基朝3’方向數之第3個核苷酸殘基可為選自由2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基、2’-O-烷基核糖核苷酸殘基及交聯型核苷酸殘基所成群組中之修飾核苷酸殘基。再者，於3’端寡核苷酸中，自對應標的之核苷酸殘基朝3’方向數之第3個核苷酸殘基為選自由2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基、2’-O-烷基核糖核苷酸殘基及交聯型核苷酸殘基所成群組中之修飾核苷酸殘基，第4個核苷酸殘基與第3個核苷酸殘基可為 不同修飾核苷酸殘基。此處之自對應標的之核苷酸殘基朝3’方向數之第3個核苷酸殘基表示不含對應標的之核苷酸殘基本身，而以與標的對応寡核苷酸殘基之3’方向相鄰之核苷酸殘基作為第1個並朝3’方向數之第3個核苷酸殘基。
第一寡核苷酸之與對應標的之核苷酸殘基5’端連結之5’端寡核苷酸，係可具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基連續之鹼基序列。2’-O-烷基核糖核苷酸殘基所連續之鹼基序列，係可與對應標的之核苷酸殘基相鄰。2’-O-烷基核糖核苷酸殘基所連續之鹼基序列之殘基數可為例如2或3。又，5’端寡核苷酸可具有連結2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、及2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基或交聯型核苷酸殘基之鹼基序列。
第一寡核苷酸之5’端寡核苷酸，係可一部分核苷酸殘基以硫代磷酸酯鍵連結而構成，亦可所有核苷酸殘基以硫代磷酸酯鍵連結而構成。
第二寡核苷酸，係於至少1個殘基、至少3個殘基、或所有殘基之各者中，可修飾糖部分及磷酸二酯鍵之至少一者，可至少修飾糖部分，可至少修飾磷酸二酯鍵，或可至少修飾糖部分及磷酸二酯鍵。第二寡核苷酸之糖部分之修飾可為例如，2’-O-烷基化、2’-去氧-2’-氟化、2’位與4’位間之交聯化、2’-去氧化(DNA化)等。第二寡核苷酸具有複數個修飾核苷酸殘基時，複數個修飾核苷酸殘基可連續配置，亦可間隔配置。
第二寡核苷酸可具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基所連續之鹼基序列。第二寡核苷酸可具有選自由2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基、2’-O-烷基核糖核苷酸殘基及交聯型核苷酸殘基所成群組中之2種相互連結之鹼基序列，可具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基相互連結之鹼基序列，可具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。再者，從ADAR1選擇性之觀點而言，第二寡核苷酸係自第二寡核苷酸3’末端之核苷酸殘基朝5’方向數之第2個核苷酸殘基可為選自由2’-去氧-2’-氟核苷酸殘 基、2’-O-烷基核糖核苷酸殘基及交聯型核苷酸殘基所成群組中之1種，可為2’-O-烷基核糖核苷酸殘基。此處之自第二寡核苷酸3’末端之核苷酸殘基朝5’方向數之第2個核苷酸殘基表示不含3’末端之核苷酸殘基本身，以與3’末端之寡核苷酸殘基之5’方向相鄰之核苷酸殘基作為第1個並朝5’方向數之第2個核苷酸殘基。
標的編輯引導RNA係於第一寡核苷酸與第二寡核苷酸之間可包括含烯氧基單元之連結部。連結部可含碳數1至8之伸烷基氧基，亦可含碳數1至8之由伸烷基氧基單元所成之聚伸烷基氧基。連結部可於第一寡核苷酸5’端、及第二寡核苷酸3’端各自以磷酸二酯鍵、或經修飾之磷酸二酯鍵進行。亦即，連結部係第一寡核苷酸5’末端之糖部分之羥基、與第二寡核苷酸3’末端之糖部分之羥基各自以磷酸二酯鍵、或經修飾之磷酸二酯鍵進行鍵結。標的編輯引導RNA在連結部包含伸烷基氧基單元時，亦可顯示優異之標的編輯活性。
連結部包含聚伸烷基氧基時，構成聚伸烷基氧基之伸烷基氧基單元之碳數可為例如，2至4、2至3、或2。亦即，伸烷基氧基單元可為伸乙基氧基單元、伸丙基氧基單元、或伸丁基氧基單元，也可為伸乙基氧基單元。構成聚伸烷基氧基之伸烷基氧基單元數可為例如2至10、2至8、2至7、或3至6。構成聚伸烷基氧基之各伸烷基氧基單元可相同或不同。
連結部包含伸烷基氧基時，伸烷基氧基之碳數可為例如2至8、2至7、或3至6。
於一態樣中，標的編輯引導RNA包含識別標的RNA之第一寡核苷酸、與前述第一寡核苷酸5’端連結之第二寡核苷酸、以及與前述第一寡核苷酸及前述第二寡核苷酸連結且含烯氧基單元之連結部；前述第一寡核苷酸包含對應前述標的RNA中之腺苷酸殘基之對應標的之核苷酸殘基、與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結並具有與前述標的RNA互補之鹼基序列的10至24個殘基 之寡核苷酸、以及與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結並具有與前述標的RNA互補之鹼基序列的3至6個殘基之寡核苷酸；前述第二寡核苷酸之殘基數為2至10，於其3’末端缺失對應前述標的RNA之核苷酸殘基的核苷酸殘基，或是具有不與前述標的RNA之核苷酸殘基形成互補對的核苷酸殘基，至少其3’末端以外之核苷酸殘基與前述標的RNA形成互補之雙股結構，或具有與前述標的RNA互補的之鹼基序列從而形成與前述標的RNA互補之雙股結構，選自包含前述對應標的之核苷酸殘基以及其3’端及5’端之各1個殘基之計數區域之至少1個殘基為野生型核糖核苷酸殘基以外之核苷酸殘基，標的編輯引導RNA可為誘導針對前述標的RNA之特異性位點編輯寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。構成包含連結部之標的編輯引導RNA的第一寡核苷酸及第二寡核苷酸亦可由已記載之修飾核苷酸殘基所構成。
於一態樣中，標的編輯引導RNA係包含識別標的RNA之第一寡核苷酸、與前述第一寡核苷酸5’端連結之第二寡核苷酸、以及與前述第一寡核苷酸及前述第二寡核苷酸連結且含烯氧基單元之連結部；前述第一寡核苷酸包含對應前述標的RNA中之腺苷酸殘基之對應標的之核苷酸殘基、與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結並具有與前述標的RNA互補之鹼基序列的10至24個殘基之寡核苷酸、以及與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結並具有與前述標的RNA互補之鹼基序列的3至6個殘基之寡核苷酸；前述第二寡核苷酸之殘基數為2至10，具有與前述標的RNA互補之鹼基序列從而與前述標的RNA形成互補之雙股結構，選自包含前述對應標的之核苷酸殘基以及其3’端及5’端之各1個殘基之計數區域之至少1個殘基為野生型核糖核苷酸殘基以外之核苷酸殘基，該標的編輯引導RNA係可為誘導針對前述標的RNA之特異性位點編輯的寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。構成包含連結部之標的編輯引導RNA的第一寡核苷酸及第二寡核苷酸亦可由已記載之修飾核苷酸殘基所構成。
於一態樣中，標的編輯引導RNA可為選自由下列記載之(AD1_ASS1.39)、(AD1_PANK2.39)、(AD1_NPHS2.39)、(AD1_GRIA2.39)、(AD1_ASS1.52)、(AD1_GRIA2.39e)、(AD1_ASS1.39e)、(AD1_PANK2.39e)、(AD1_NPHS2.39e)、(AD1_GRIA2.52e)、(AD1_ASS1.52e)、(AD1_PANK2.52e)、(AD1_NPHS2.52e)及(AD1_A1AT.39)所成群組中之任一式所示之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
(AD1_ASS1.39)U(M)^T(L)^G(M)^A(L)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(L)^U(M)^T(L)^G(M)
(AD1_PANK2.39)A(M)^A(L)^G(M)^A(L)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^U(M)
(AD1_NPHS2.39)A(M)^T(L)^G(M)^T(L)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(L)^A(M)^C(L)^U(M)
(AD1_GRIA2.39)G(M)^C(L)^A(M)^T(L)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^C(M)
(AD1_ASS1.52) U(M)^G(L)^A(M)^U(L)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(L)^G(M)^U(L)^U(M)
(AD1_GRIA2.39e)G(M)^C(E)^A(M)^T(E)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^C(M)
(AD1_ASS1.39e)U(M)^T(E)^G(M)^A(E)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(E)^U(M)^T(E)^G(M)
(AD1_PANK2.39e)A(M)^A(E)^G(M)^A(E)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^U(M)
(AD1_NPHS2.39e)A(M)^T(E)^G(M)^T(E)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(E)^A(M)^C(E)^U(M)
(AD1_GRIA2.52e)C(M)^A(E)^U(M)^C(E)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M)
(AD1_ASS1.52e) U(M)^G(E)^A(M)^T(E)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(E)^G(M)^T(E)^U(M)
(AD1_PANK2.52e)A(M)^G(E)^A(M)^A(E)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M)
(AD1_NPHS2.52e)U(M)^G(E)^U(M)^C(E)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^T(E)^U(M)^A(E)^C(M)
(AD1_A1AT.39)G(M)^T(L)^C(M)^C(L)^C(M)^U(F)^U(F)^C(M)^U(M)^c^i^U(M)^C(F)^G(M)^A(F)^U(M)^G(F)^G(M)^U(F)^C(M)^A(L)^G(M)^C(L)^A(M)
式中，大寫文字表示核糖核苷酸殘基(RNA)。小寫文字表示2’-去氧核糖核苷酸殘基(DNA)。N(M)表示D-核呋喃糖之2’-O-甲基化核糖核苷酸殘基。N(F)表示D-核呋喃糖之2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基。N(L)表示D-核呋喃糖之2’-O,4’-C-亞甲基交聯化核糖核苷酸殘基。N(E)表示D-核呋喃糖之2’-O,4’-C-伸乙基交聯化核糖核苷酸殘基。「^」表示核苷單元間以-P(=S)(OH)-鍵結，亦即，表示硫代磷酸酯鍵。
標的編輯引導RNA可使用市售之合成器(例如，珀金埃爾默(PerkinElmer公司)之利用亞磷醯胺法所成之模型392)等，並根據習知文獻(參照例如，Nucleic Acid Reserch,12,4539(1984))所述之方法合成。所用之亞磷醯胺試劑係可使用市售之試劑，亦可使用根據習知文獻所述之方法適當合成之試劑。將亞磷 醯胺試劑耦合後，藉由與硫、四乙基秋蘭姆二硫化物(tetraethyl thiuram disulfide，TETD，Applied Biosystems公司)、Beaucage試劑(Glen Research公司)、黃原膠氫化物(xanthane hydride)等試劑反應，而可導入硫代磷酸酯鍵(例如，Tetrahedron Letters,32,3005(1991),J.Am.Chem.Soc.,112,1253(1990)，參照PCT/WO98/54198)。
寡核苷酸(標的編輯引導RNA)可以醫藥上可接受之鹽之形態而使用。「醫藥上可接受之鹽」係指寡核苷酸之鹽。如此之鹽可列舉：如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽之鹼土金屬鹽、鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等金屬鹽；如銨鹽之無機鹽；如第三辛基胺鹽、二苄胺鹽、嗎啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯甘胺酸烷基酯鹽、伸乙基二胺鹽、N-甲基還原葡萄糖胺鹽、胍鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、二環己胺鹽、N,N’-二苄基伸乙基二胺鹽、氯普魯卡因(chloroprocaine)鹽、普羅卡因(procaine)鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙胺鹽、哌
Figure 110145878-A0202-12-0060-226
鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽之有機鹽等的胺鹽；如氟化氫酸鹽、鹽酸鹽、溴化氫酸鹽、碘化氫酸鹽之鹵化氫酸鹽、硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽之低等烷基磺酸鹽；如苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽之芳基磺酸鹽；如乙酸鹽、蘋果酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等有機酸鹽；如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天門冬胺酸鹽之胺基酸鹽等。寡核苷酸之醫藥上可接受之鹽之形態較佳為寡核苷酸之鹼金屬鹽，更佳為鈉鹽。此等鹽可藉由習知方法製造。
又，寡核苷酸及其醫藥上可接受之鹽有時可作為溶劑合物(例如，水合物)存在，亦可為如此之溶劑合物。
於寡核苷酸及其醫藥上可接受之鹽中，存在著衍生自磷原子之不對稱之光學異構物，於本發明之寡核苷酸中，亦包含如此之光學異構物。如此之光 學異構物可以習知方法合成(例如，Org.Lett.,114,967(2009)、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,8,2359(1998)等)。
寡核苷酸及其醫藥上可接受之鹽於5’末端或3’末端中，GalNAc、膽固醇、脂肪酸等傳遞分子可通過連結子或磷酸二酯鍵(包含硫代磷酸酯鍵)等結合。如此之傳遞分子及連結子之例可舉出Bioconjugate Chem.2019,30,366所述者。結合有傳遞分子之寡核苷酸及其醫藥上可接受之鹽可藉由習知製造方法製造。本說明書所記載之寡核苷酸及其醫藥上可接受之鹽亦包含如此之結合有傳遞分子之形態。
將寡核苷酸、其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物使用於疾病之治療時，其本身或與適當之醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑等混合，以錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑或糖漿劑等，可經口、或藉由注射劑、坐劑、貼付劑或外用劑等非經口而進行投予。
此等製劑係使用賦形劑(例如，如乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇之糖衍生物；如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、α澱粉、糊精之澱粉衍生物；如結晶纖維素之纖維素衍生物；阿拉伯膠；葡聚醣；如聚三葡萄糖之有機系賦形劑；如輕質無水矽酸、合成矽酸鋁、矽酸鈣、偏矽酸鋁酸鎂之矽酸鹽衍生物；如磷酸氫鈣之磷酸鹽；如碳酸鈣之碳酸鹽；如硫酸鈣之硫酸鹽等無機系賦形劑等)、潤滑劑(例如，如硬酯酸；硬酯酸鈣、硬酯酸鎂之硬酯酸金屬鹽；滑石；膠體二氧化矽；如蠟粒、鯨蠟之蠟類；硼酸；己二酸；如硫酸鈉之硫酸鹽；乙二醇；延胡索酸；安息香酸鈉；DL白胺酸；如硫酸月桂酯鈉、硫酸月桂酯鎂之硫酸月桂酯鹽：如無水矽酸、矽酸水合物之矽酸類；上述澱粉衍生物等)、結合劑(例如，羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯二醇(Macrogol)、與前述賦形劑相同之化合物等)、崩解劑(例如，如低取代度羥基丙基纖維素、羧基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈣、內部交聯羧基甲基纖維素鈉之纖維素衍生 物；如羧基甲基澱粉、接基甲基澱粉鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮之經化學修飾之澱粉‧纖維素類等)、乳化劑(例如，如皂土、矽酸鎂鋁(Veegum)之膠體性黏土；如羥化鎂、羥化鋁之金屬羥化物；如硫酸月桂酯鈉、硬酯酸鈣之陰離子界面活性劑；如氯化烷基二甲基苄基銨(benzalkonium chloride)之陽離子界面活性劑；如聚氧伸乙基烷基醚、聚氧伸乙基山梨醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯之非離子界面活性劑等)、穩定劑(如對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯之對羥苯甲酸酯類；如氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇之醇類；氯化烷基二甲基苄基銨；如酚、甲酚之酚類；硫柳汞(thimerosal)；去氫乙酸；山梨酸等)、矯味矯臭劑(例如，通常所使用之甘味料、酸味料、香料等)、稀釋劑等添加劑而以習知方法製造。
包含寡核苷酸、其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物之治療劑可含有0.1至250μmoles/ml之寡核苷酸，較佳為可含有1至50μmoles/ml。又，可含有預定量之寡核苷酸、其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、0.02至10%w/v之碳水化合物或多元醇、及0.01至0.4%w/v之醫藥上可接受之界面活性劑而構成治療劑。
上述碳水化合物特佳為單糖類及雙糖類之至少1種。此等碳水化合物及多元醇之例可列舉：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇及山梨糖醇。此等可單獨使用亦可併用。
又，較佳之界面活性劑之例可列舉：聚氧伸乙基山梨醇單至三酯、烷基苯基聚氧伸乙基、牛膽酸鈉、膽酸鈉、及多元醇酯。其中特佳為聚氧伸乙基山梨醇單至三酯，此處之特佳之酯為油酸酯、月桂酸酯、硬脂酸酯及棕櫚酸酯。此等可單獨使用亦可併用。
包含寡核苷酸、其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物之治療劑更佳為可含有0.03M至0.09M之醫藥上可接受之中性鹽，例如，氯化鈉、氯化鉀及/或氯化鈣。
包含寡核苷酸、其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物之治療劑更佳為可含有0.002至0.05M之醫藥上可接受之緩衝劑。較佳緩衝劑之例可列舉：檸檬酸鈉、甘胺酸鈉、磷酸鈉、參(羥基甲基)胺基甲烷。此等緩衝劑可單獨使用亦可併用。
再者，上述治療藥可以溶液狀態供給。惟，由於有時必須有一定期間之保存等，以將寡核苷酸穩定化從而防止治療效果降低為目的而言，通常較佳為將其冷凍乾燥，此情形中，使用時以溶解液(注射用蒸餾水等)再構成(reconstruction)，亦即，成為投予之液體狀態使用即可。因此，本發明之治療藥為了使各成分在預定濃度範圍內以溶解液再構成從而使用，亦包含經冷凍乾燥狀態者。以促進冷凍乾燥物之溶解性為目的，可進一步含有白蛋白、甘胺酸等胺基酸。
對人類投予寡核苷酸、其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物投予時，例如，可以成人每1日約0.01mg/kg至100mg/kg(體重)，較佳為0.1mg/kg至20mg/kg(體重)之投予量以1次或分成數次進行皮下注射、點滴靜脈注射、或靜脈注射，其投予量及投予次數可依照疾病之種類、症狀、年齢、投予方法等適當地變更。
疾病之處置方法
疾病之處置方法包含向對象投予上述治療劑之步驟。疾病之處置方法可包含向對象投予藥理學上之有效量之上述治療劑之步驟。本說明書中所使用之「處置」係只要對疾病所施加的任意處置即可，可舉例如：疾病之治療、改善、進行之抑制(惡化之防止)、預防等(較佳為治療或預防)。處置之對象可為包含人類之溫血動物，亦可為非人類之溫血動物，亦可為人類。
標的RNA之特異性位點編輯方法
標的RNA之特異性位點編輯方法，係包含於腺苷酸去胺酶存在下，使標的RNA、與屬於誘導對標的RNA之特異性位點編輯的寡核苷酸之標的編輯引導RNA進行接觸之步驟。標的編輯引導RNA與標的RNA部分形成雙股，可藉由招募腺苷酸去胺酶，將標的RNA所包含之腺苷酸殘基於特異性位點轉變成肌苷酸殘基。標的RNA之特異性位點編輯方法可進一步包含準備標的編輯引導RNA之步驟。
標的RNA之特異性位點編輯方法，係例如可將上述標的編輯引導RNA導入至具有標的RNA之真核細胞而進行。將標的編輯引導RNA導入真核細胞之方法中，可自核酸醫藥所使用之各種手法適當地選擇並使用。標的RNA之特異性位點編輯方法可於試管內(in-vitro)實施，亦可於體內(in-vivo)實施。
就本發明之其他態樣而言，亦包含疾病(例如，遺傳性疾病)之處置所使用之醫藥組成物之製造中之標的編輯引導RNA之用途、疾病(例如，遺傳性疾病)之處置中之標的編輯引導RNA之用途、疾病(例如，遺傳性疾病)之處置所使用之標的編輯引導RNA。
[實施例]
以下藉由實施例具體地說明本發明，但本發明不被此等實施例所限定。
(參考例1)
將具有表1所示之序列(序列編號1)且全由野生型RNA殘基構成之寡核苷酸(以下亦稱為AD1-gRNA03)使用亞磷醯胺法(參照例如，Nucleic Acids Research,12,4539(1984)、Nature Communications 6,Article number：6317(2015))進行合成。所得之化合物藉由負離子ESI質量分析鑑定(實測值：7714.8)。
表1中，底線部分為第一寡核苷酸(ASR)，作為標的之RNA係後述之Rluc_sRNA。參考例1之寡核苷酸係例如被認為可與標的RNA形成如下述般之結構。
麻煩打字室將「target part」修改成「 」
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(參考例2)
將作為模型標的RNA之下述序列所示之hGAPDH_sRNA02(序列編號3)以與後述之Rluc_sRNA相同的方式調製。針對此模型標的RNA之標的編輯引導RNA，係將下述序列所示之寡核糖核苷酸hGAPDH_AD1(序列編號4)藉由亞磷醯胺法調製。此外，表中之底線顯示編輯標的之腺苷酸殘基。
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(實施例1至32)
實施例1至16之寡核苷酸係以參考例1之寡核苷酸之序列為基準，藉由導入如表3所示之修飾核苷酸而得者。又，實施例17至32之寡核苷酸係以參考例2之寡核苷酸之序列為基準，藉由導入如表4所示之修飾核苷酸而得者。此等寡核苷酸化合物與參考例1同樣地藉由亞磷醯胺法合成。此外，序列中，合成「18」之部分時，使用DMT-六乙二醇亞磷醯胺(DMT Hexaethylene Glycol phosphoramidite，ChemGenes，商品目錄編號：CLP-9765)。合成「9」之部分時，使用DMT-三乙二醇亞磷醯胺(DMT-Triethoxy-glycol phosphoramidite，ChemGenes，商品目錄編號：CLP-1113)。合成「6」之部分時，使用之部分時，使用DMT-己二醇亞磷醯胺(DMT-hexane-Diol phosphoramidite，ChemGenes，商品目錄編號：CLP-1120)。合成「3」之部分時，使用DMT-丙二醇亞磷醯胺(DMT-propane-Diol phosphoramidite，ChemGenes，商品目錄編號：CLP-9908)。「2’-O-甲基核苷」之部分係使用Nucleic Acids Research 17,3373(1989)所述之亞磷醯胺體而合成。「DNA」之部分係使用Nucleic Acids Research 11,4539(1984)所述之亞磷醯胺體而合成。「2’-O,4’-C-亞甲基核苷」之部分係使用WO99/14226號所述之亞磷醯胺 體而合成。「2’-去氧-2’-氟核苷」之部分係使用J.Med.Chem.,36,831(1993)所述之亞磷醯胺體而合成。
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表中之「分子量」顯示以負離子ESI質量分析所得之實測值。於表中之「序列」中，大寫文字顯示RNA，小寫文字顯示DNA，N(M)顯示D-核呋喃糖之2’-O-甲基化，N(F)顯示D-核呋喃糖之2’-去氧-2’-氟化，N(L)顯示D-核呋喃糖之2’-O,4’-C-亞甲基化，N(E)顯示D-核呋喃糖之2’-O,4’-C-伸乙基化。 「3」顯示-O(CH2)3O-，「6」顯示-O(CH2)6O-，「9」顯示-O(CH2CH2O)3-，「18」顯示-O(CH2CH2O)6-所示之連結子。「^」顯示核苷單元間經-P(=S)(OH)-結合者。無特別指明時，核苷單元間、或核苷單元與連結子顯示經-P(=O)(OH)-結合者。寡核苷酸5’末端及3’末端係氫原子與圖中的氧原子鍵結而成為羥基。如以下之核苷單元之結構所示。此外，化學式中之虛線部分顯示結合部位。
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Figure 110145878-A0202-12-0070-13
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(試驗例1)
腺苷酸去胺酶之調製
將作為腺苷酸去胺酶之重組hADAR2及hADAR1p110根據文獻(Macbeth,MR.and Bass,BL.Methods Enzymol.424,319-331(2007)、Fukuda,M.et al.Sci.Rep.srep41478(2017))之記載使用酵母表現系統進行合成/純化而調製。又，藉由一般方法調製表現hADAR2、hADAR1p110及hADAR1p150之質體(pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR2、pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p110、pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p150)。
模型標的RNA之調製：Rluc_sRNA之合成
將來自psiCHECKTM-2載體(Promega)且根據一般方法進行轉錄所調製出之Rluc_WTRNA(序列編號5)以成為0.2nM之方式調製。藉由將重組hADAR2以成為最終濃度1μM之方式添加，在編輯反應緩衝液(20mM HEPES-KOH(pH7.5)、2mM MgCl2、100mM NaCl、0.5mM DTT、0.01% TritonX-100、5%甘油)中於37℃進行2小時培養，進行試管內(in-vitro)編輯反應。
將編輯反應後之Rluc_WT RNA藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化。接著，使用Primescript反轉錄酶II(TaKaRa)，藉由Rluc_WT_BamR01引子(序列編號6)合成cDNA。之後，使用Rluc_WT_EcoF01引子(序列編號7)及Rluc_WT_BamR01引子(序列編號6)、PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，藉由PCR(循環30次；變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，60秒)將cDNA增幅。接著，將所得之cDNA作為嵌入DNA，以下述方式於pUC19質體進行選殖。使用EcoRI(TaKaRa)及BamHI(TaKaRa)將嵌入DNA及pUC19質體於37℃進行1小時之限制酶切割後，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱，純化各自之DNA。將限制酶切割後之pUC19質體與嵌入DNA以莫耳比1：3之方式混合，使用DNA接合套組<Mighty Mix>(TaKaRa)進行接合反應。將所得之接合樣品轉形至DH5 α，使用LB瓊脂培養基於37℃培養一晚後，使用OIAprep Spin Miniprep套組 (QIAGEN)萃取質體。進行所得之質體DNA之鹼基序列分析，獲得Rluc_WT之A122突變成G之序列(Rluc_K41R)及選殖有Rluc_K41R之質體DNA(pUC19-Rluc_K41R)。
以pUC19-Rluc_K41R作為模板股，5’端片段使用Rluc_NheF01引子(序列編號8)與RL_W104X_RV引子(序列編號9)，3’端片段使用Rluc_XhoR01引子(序列編號10)與RL_W104X_FW引子(序列編號11)，藉由PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，進行第一PCR(循環30次；變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，40秒)。接著將各自之PCR產物稀釋100倍使用Rluc_NheF01引子及Rluc_XhoR01引子，藉由PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，進行第二次PCR(循環30次；變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，60秒)，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化，獲得具有Rluc_K41R之G311突變成A之序列之DNA(Rluc_K41R_W104X)(序列編號14)。
針對所得之DNA(Rluc_K41R_W 104X)及psiCHECKTM-2載體(Promega)，使用NheI(TaKaRa)及XhoI(TaKaRa)，於37℃進行1小時之限制酶切割後，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱，純化各自之DNA。將限制酶切割後之Rluc_K41R_W104X與psiCHECKTM-2載體以莫耳比3：1之方式混合，使用DNA接合套組<Mighty Mix>(TaKaRa)進行接合反應。將所得之接合樣品轉形至DH5 α，使用LB瓊脂培養基於37℃培養一晚。將經篩選之殖株在LB液體培養基中於37℃培養一晚，使用QIAprep Spin Miniprep套組(QIAGEN)萃取質體。之後，藉由鹼基序列分析確認所得之質體之序列。
以序列經確認之質體作為模板股，使用T7_Rluc_sRNA_F01引子(序列編號12)及Rluc_sRNA_R01引子(序列編號13)、PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，藉由PCR(循環30次(變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，20秒))，增幅試管內轉錄反應用之模板股DNA，藉由酚/氯仿萃取， 乙醇沉澱而純化。使用AmpliScribe T7套組(Epicentre Biotechnologies)進行試管內轉錄，從而獲得Rluc_sRNA(序列編號15)。針對合成後之Rluc_sRNA，使用含8M尿素之5%聚丙烯醯胺凝膠進行切出凝膠之純化，用於後續之試驗。
以下顯示Rluc_WT_RNA、Rluc_K41R_W104X及Rluc_sRNA之序列、以及上述所使用之引子之序列。此外，表中之底線表示編輯標的之腺苷酸殘基。
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Figure 110145878-A0202-12-0074-19
Figure 110145878-A0202-12-0074-21
細胞培養
將HeLa細胞以5.0×104細胞/孔之方式繼代於24孔盤，進行48小時培養。使用Lipofectamine 3000(Thermo)，將50ng之表現標的RNA之質體(psiCHECK2_Rluc_K41R_W 104X)、350ng之表現ADAR之質體(pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR2、pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p110或pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p150)、10nM之實施例1至16之寡核苷酸之gRNA進行轉染。轉染後，培養48小時後回收細胞。
編輯分析方法
自培養於24孔盤之細胞使用Sepasol RNA I Super G(Nacalai公司)萃取所有RNA，使用重組DNase I(TaKaRa)進行DNase處理後，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化。進行使用PrimeScript II反轉錄酶(TaKaRa)、所有RNA 0.5μg、0.25μM Oligo(dT)17(序列編號16)之反轉錄反應，將cDNA增幅。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、Rluc_F01引子(序列編號17)、3’-Adp引子(序列編號18)，第一PCR(循環30次(變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，60秒))。以第一PCR產物經200倍稀釋之DNA作為模板股，使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、Rluc_F01引子(序列編號17)、Rluc_R01引子(序列編號19)，進行第二PCR(循環30次(變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，60秒))，將Rluc片段增幅。使用bigdye terminator v3.1循環定序套組(Thermo)、0.165μM Rluc_sRNA_F01引子(序列編號20)進行接合反應，藉由Applied Biosystems 3500基因分析儀(Thermo)進行分析。藉由定序所得之層析圖表，自標的部位(A311)之峰高比(G/(G+A))算出編輯比率(%)。
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螢光素酶報導基因檢測方法
使用雙重螢光素酶報導基因檢測系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega)。對培養於24孔盤中之細胞使用100μL之Passive Lysis Buffer(Promega)而獲得細胞萃取液。於所得之細胞萃取液20μL添加LARII 100μL，60秒後，藉由GloMax(R)20/20 Luminometer(Promega)測定螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase，Fluc)之發光強度。之後立刻添加Stop & Glo試劑100μL，60秒後測定海腎螢光素酶(Renilla luciferase，Rluc)之發光強度。發光強度係藉由Fluc標準化。
使用實施例化合物(AD1-gRNA03_1至AD1-gRNA03_4)時之編輯比率(%)顯示於圖1A。將表現ADAR1之質體轉染時，相較於未使用gRNA時(gRNA(-))顯示30%至70%左右之編輯比率。將表現ADAR2之質體轉染時，相較於未使用gRNA時(gRNA(-))顯示40%至60%左右之編輯比率。使用實施例化合物(AD1-gRNA03_1至AD1-gRNA03_4)時之螢光素酶報導基因檢測之結果顯示於圖1B。使用實施例化合物(AD1-gRNA03_1至AD1-gRNA03_4)時，相較於未使用gRNA時(gRNA(-))確認到較高的螢光素酶活性。
使用實施例化合物(AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_9至AD1-gRNA03_16)時之編輯比率(%)顯示於圖2A。將表現ADAR之質體轉染時，AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_9至AD1-gRNA03_16相較於未使用gRNA時(gRNA(-))顯示較高的編輯比率。又，使用實施例化合物(AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_9至AD1-gRNA03_16)時，相較於未使用gRNA時(gRNA(-))確認到較高的螢光素酶活性。
(試驗例2)
內生性ADAR所致之細胞內編輯誘導能力評估
除了不使用表現ADAR之質體，只轉染報導基因質體25ng、50nM之實施例化合物之gRNA以外，以與上述相同方式評估實施例化合物(AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_9至AD1-gRNA03_16)所致之細胞內編輯誘導能力。
使用實施例化合物(AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_9至AD1-gRNA03_16)時之螢光素酶報導基因檢測之結果顯示於圖3。使用實施例化合物(AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_9至AD1-gRNA03_16)時，相較於未添加gRNA時(gRNA(-))確認到螢光素酶活性之提升。又，亦針對編輯比率進行調查，使用實施例化合物(AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_15)時，各顯示9.0±0.1%、4.1±2.3%之編輯比率(±S.D.%)，顯示高於背景值(各為1.3±1.4%、0.9±0.4%)之值。
Figure 110145878-A0202-12-0078-23
(試驗例3)
由實施例化合物之gRNA所致之對GAPDH基因序列之細胞內編輯誘導能力評估
將HEK293細胞以5.0×104細胞/孔之方式繼代於24孔盤，進行48小時培養。使用Lipofectamine 3000(Thermo)將500ng之表現ADAR之質體(pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR2、pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p110或pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p150)、50nM之實施例化合物之gRNA進行轉染。轉染後，培養48小時後，回收細胞。
編輯分析方法
以與試驗例1之編輯分析方法所述之方法同樣地將cDNA增幅。使用PrimeStar GXLDNA聚合酶(TaKaRa)、GAPDH_FW引子(序列編號21)、GAPDH_RV引子(序列編號22)進行PCR(循環30次(變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，60秒))，增幅GAPDH片段。使用bigdye terminator v3.1循環定序套組(Thermo)、0.165μM GAPDH_seqF01引子(序列編號23)進行接合反應，藉由Applied Biosystems 3500基因分析儀(Thermo)進行分析。藉由定序所得之層析圖表，標的部位之峰高比(G/(G+A))算出編輯比率(%)。
Figure 110145878-A0202-12-0079-24
使用實施例化合物(hGAPDH_AD1_4、hGAPDH_AD1_17至hGAPDH_AD1_19)時之編輯比率(%)顯示於圖4A。轉染表現ADAR1之質體時，相較於未使用gRNA時(gRNA(-))顯示15%至25%左右之高編輯比率。轉染表現ADAR2之質體時，相較於未使用gRNA時(gRNA(-))顯示稍高的編輯比率。
使用實施例化合物(hGAPDH_AD1_4、hGAPDH_AD1_20至hGAPDH_AD1_28)時之編輯比率(%)顯示於圖4B。轉染表現ADAR1之質體時，相較於未使用gRNA時(gRNA(-))顯示10%至30%左右之高編輯比率。轉染表現ADAR2之質體時，相較於未使用gRNA時顯示較高的編輯比率。
使用實施例化合物(hGAPDH_AD1_4、hGAPDH_AD1_29、hGAPDH_AD1_31及hGAPDH_AD1_32)時之編輯比率(%)顯示於圖5。轉染表現ADAR1之質體時，相較於未使用gRNA時(gRNA(-))顯示15%至30%左右之高編輯比率。轉染表現ADAR2之質體時，相較於未使用gRNA時(gRNA(-))顯示較高的編輯比率。
(實施例33至49)
實施例33至49之寡核苷酸係以參考例2之寡核苷酸之序列為基準，藉由導入如表11所示之修飾核苷酸而得者。此等寡核苷酸與參考例1同樣地以亞磷醯胺法合成。此外，序列中，合成「mU」之部分時，使用N3-甲基尿苷CED亞磷醯胺(ChemGenes，商品目錄編號：ANP-7451)，合成「d」之部分時，使用dSpacer CE亞磷醯胺(Glen Research，商品目錄編號：10-1914)，合成「mc」之部分時，使用N3-甲基去氧胞苷CED亞磷醯胺(ChemGenes，商品目錄編號：ANP-3851)。又，合成「mt」之部分時，使用N3-甲基胸苷CED亞磷醯胺(ChemGenes，商品目錄編號：ANP-6153)。關於其他修飾核苷酸之詳細情形係如上所述。
Figure 110145878-A0202-12-0080-25
於表中之「序列」中，「mU」表示N3-甲基脲苷，「d」表示1,2-二去氧核糖，「mc」表示N3-甲基-2’-去氧胞苷，「mt」表示N3-甲基胸苷。又，關於其他簡稱係如上所述。此外，寡核苷酸5’末端及3’末端係氫原子與圖中的氧原子鍵結而成為羥基。
Figure 110145878-A0202-12-0081-26
(參考例3至7)
作為標的之疾病序列之標的編輯引導RNA係具有下列所示之序列，且將全由野生型RNA殘基構成之寡核苷酸藉由亞磷醯胺法所調製。所得之化合物藉由負離子ESI質量分析鑑定。
Figure 110145878-A0202-12-0081-27
(實施例50至64)
實施例50至64之寡核苷酸係以參考例3至7之寡核苷酸之序列為基準，藉由導入如表13所示之修飾核苷酸而得者。此等寡核苷酸與參考例1同樣地以亞磷醯胺法合成。此外，關於其他修飾核苷酸之詳細情形係如上所述。
Figure 110145878-A0202-12-0082-28
表中之「序列」之簡稱係如上所述。此外，寡核苷酸5’末端及3’末端係氫原子與圖中的氧原子鍵結而成為羥基。
(試驗例4)
實施例33至49中所得之化合物係與試驗例3同樣地，將由寡核苷酸所致之對hGAPDH基因序列之細胞內編輯誘導活性進行評估。
使用實施例化合物(hGAPDH_AD1_4、hGAPDH_AD1_31、hGAPDH_AD1_33至hGAPDH_AD1_40)時之編輯比率(%)顯示於圖6。轉染表現ADAR1之質體時，相較於未使用gRNA時(圖中，gRNA(-))顯示較高的編輯比率。轉染表現ADAR2之質體時，相較於未使用gRNA時(圖中，gRNA(-))顯示較高的編輯比率。特別是，對應標的之核苷酸殘基為mU之實施例33之hGAPDH_AD1_33顯示較高的編輯比率。又，於與標的RNA之結合部位的4處或6處導入有LNA之實施例39及實施例40(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_40)，係顯示最高之編輯比率。
再者，針對不轉染表現ADAR1或ADAR2之質體，只轉染50nM之濃度之實施例化合物之gRNA時的細胞內編輯誘導進行評估時，使用實施例化合物(hGAPDH_AD1_39或hGAPDH_AD1_40)時，於HeLa細胞中各自顯示13.6±1.7%、13.9±1.6%之編輯比率(±S.D.%)，顯示明顯高於背景值(5.0±0.9%)之值。又，於HEK293細胞中，使用實施例化合物(hGAPDH_AD1_39或hGAPDH_AD1_40)時各自顯示16.1±3.9%、16.2±1.0%之編輯比率(±S.D.%)，顯示明顯高於背景值(4.4±0.7%)之值。
使用實施例化合物(hGAPDH_AD1_4、hGAPDH_AD1_31、hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_41、hGAPDH_AD1_43、hGAPDH_AD1_44、hGAPDH_AD1_46至hGAPDH_AD1_51)時之編輯比率(%)顯示於圖7A。轉染表現ADAR1之質體時，相較於未使用gRNA時(圖中，gRNA(-))顯示較高的編輯比率。轉染表現ADAR2之質體時，相較於未使用gRNA時(圖中，gRNA(-))顯示較高的編輯比率。特別是，於與標的RNA之結合部位導入有LNA之實施例39及43至49(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_44、及hGAPDH_AD1_46至hGAPDH_AD1_51)顯示較高的編輯比率。
再者，針對不轉染表現ADAR1或ADAR2之質體，只轉染50nM之濃度之實施例化合物之gRNA時所評估的細胞內編輯誘導之編輯比率(%)顯示於圖7B。使用實施例化合物(hGAPDH_AD1_31、hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_44、hGAPDH_AD1_47至hGAPDH_AD1_51)時，於HEK293細胞或HeLa細胞中顯示明顯高於背景值之編輯比率。
(試驗例5)
對具有AGXT基因序列之模型標的RNA之編輯誘導能力評估
(A)AGXT_RNA之合成
使用AGXT_FW(序列編號29)、AGXT_RV(序列編號30)之寡DNA及NEBuffer2(NEB)進行引子黏合反應(80℃加熱3分鐘，花費15分鐘冷卻至25℃)，製作嵌入DNA。對pUC19使用EcoRI(TaKaRa)及HindIII(TaKaRa)於37℃進行反應1小時後，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化。以嵌入DNA：質體為莫耳比3：1之方式添加，使用DNA接合套組<Mighty Mix>(TaKaRa)進行接合反應。將所得之接合樣品轉形至DH5 α，使用LB瓊脂培養基於37℃培養一晚。將經篩選之殖株使用LB液體培養基於37℃培養一晚，使用QIAprep Spin Miniprep套組(QIAGEN)萃取質體。所得之質體100ng使用bigdye terminator v3.1循環定序套組(Thermo)、0.165μM之pUC19_seqFW引子(序列編號31)及0.165μM之pUC19_seqRV引子(序列編號32)進行接合反應，藉由Applied Biosystems 3500基因分析儀(Thermo)進行序列分析，確認已合成pUC19_AGXT質體。以pUC19_AGXT作為模板股，使用T7_pUC19_FW(序列編號33)及M13_RV引子(序列編號34)、PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，藉由PCR(變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，20秒)製作模板股DNA，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化。使用AmpliScribe T7套組(Epicentre Biotechnologies)進行試 管內轉錄，使用含8M尿素之5%聚丙烯醯胺凝膠進行切出凝膠之純化，合成出作為模型標的RNA之AGXT_RNA。
Figure 110145878-A0202-12-0085-29
(B)引子黏合反應
將0.3μM之AGXT_RNA、0.9μM之實施例50、55(AD1_AGXT.2、AD1_AGXT.3)及參考例3(AD1_AGXT)之化合物(以下，有時僅標記為gRNA)於引子黏合緩衝液(10mM Tri-HCl(pH7.6)、150mM NaCl)中，於80℃加熱3分鐘加熱，經15分鐘冷卻至25℃。
(C)試管內編輯反應
假設藉由引子黏合反應AGXT_RNA與gRNA完全地形成複合物，計算以下AGXT_RNA-gRNA複合物濃度。使用了ADAR2之編輯反應係於編輯反應緩衝液(20mM HEPES-KOH(pH7.5)、2mM MgCl2、100mM NaCl、0.5mM DTT、0.01% TritonX-100、5%甘油)中，對5nM AGXT_RNA-gRNA複合物以重組hADAR2之最終濃度 為12.5nM之方式添加，於37℃進行30分鐘培養。使用ADAR1之編輯反應係於編輯反應緩衝液(20mM HEPES-KOH(pH7.5)、2mM MgCl2、100mM NaCl、0.5mM DTT、0.01% TritonX-100、5%甘油)中，對5nM AGXT_RNA-gRNA複合物以重組hADAR1p110之最終濃度為250nM之方式添加，於37℃進行30分鐘培養。
(D)編輯分析方法
編輯反應後之AGXT_RNA藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化，使用Primescript反轉錄酶II(TaKaRa)，藉由M13_RV引子(序列編號34)合成cDNA。之後，使用T7_pUC19_FW引子(序列編號33)及M13_RV引子(序列編號34)、以及PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，藉由PCR(變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，20秒)將cDNA增幅。所得之cDNA之序列分析係使用T7proGGG引子(序列編號35)、bigdye terminator v3.1循環定序套組進行接合反應，藉由Applied Biosystem 3500基因分析儀(Thermo)進行分析。藉由定序所得之層析圖表，標的部位之峰高比(G/(G+A))算出編輯比率(%)。
(E)編輯分析之結果
編輯比率之結果顯示於圖8。ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型RNA構成之參考例3(AD1_AGXT，圖中為AGXT之AD1g)，gRNA中，對應標的之核苷酸3’端之鳥苷酸變成2’-去氧鳥苷酸之實施例50(AD1_AGXT.2、圖中為AGXT之AD1g.2)顯示較高的編輯比率。又，對應標的之核苷酸3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例55(AD1_AGXT.3，圖中為AGXT之AD1g.3)更顯示較高的編輯比率。此表示標的RNA之編輯標的之腺苷酸殘基5’端為胞苷酸時，使用2’-去氧肌苷酸作為gRNA中之對應標的之核苷酸3’端之核苷酸殘基時，則顯示較高的編輯比率。
(試驗例6)
對具有GNE基因序列之模型標的RNA之編輯誘導能力評估
(A)GNE_RNA之合成
除了將作為寡DNA之AGXT_FW及AGXT_RV使用下列所示之GNE_FW(序列編號36)及GNE_RV(序列編號37)取代以外，以與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行，合成出表現模型標的RNA之pUC_GNE質體，使用此質體合成出作為模型標的RNA之GNE_RNA。
Figure 110145878-A0202-12-0087-30
(B)編輯誘導能力評估與其結果
使用實施例51、56(AD1_GNE.2、AD1_GNE.3)及參考例4(AD1_GNE)之化合物，使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法評估編輯誘導能力。
(C)編輯分析之結果
編輯比率之結果顯示於圖8。ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型RNA構成之參考例4(AD1_GNE，圖中為GNE之AD1g)，gRNA中，對應標的之核苷酸3’端之鳥苷酸變成2’-去氧鳥苷酸之實施例51(AD1_GNE.2，圖中為GNE之AD1g.2)顯示較高的編輯比率。又，對應標的之核苷酸位3’端之 鳥苷酸變成2‘-去氧肌苷酸之實施例56(AD1_GNE.3，圖中為GNE之AD1g.3)更顯示較高的編輯比率。此表示標的RNA之編輯標的之腺苷酸殘基5’端為胞苷酸時，使用2’-去氧肌苷酸作為gRNA中之對應標的之核苷酸3’端之核苷酸殘基時，顯示較高的編輯比率。
(試驗例7)
對具有EYS基因序列之模型標的RNA之編輯誘導能力評估
(A)EYS_RNA之合成
除了將作為寡DNA之AGXT_FW及AGXT_RV使用下列所示之EYS_FW(序列編號38)及EYS_RV(序列編號39)取代以外，以與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行，合成出表現模型標的RNA之pUC_EYS質體，使用此質體合成出作為模型標的RNA之EYS_RNA。
Figure 110145878-A0202-12-0088-31
(B)編輯誘導能力評估與其結果
使用實施例52、57(AD1_EYS.2、AD1_EYS.3)及參考例5(AD1_EYS)之化合物，與試驗例5之(B)至(D)相同之方法評估編輯誘導能力。
(C)編輯分析之結果
編輯比率之結果顯示於圖8。ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於全由天然ga型RNA構成之參考例5(AD1_EYS，圖中為EYS之AD1g)，gRNA中，對應標的之核苷酸3’端之鳥苷酸變成2’-去氧鳥苷酸之實施例52(AD1_EYS.2，圖中為EYS之AD1g.2)顯示較高的編輯比率。又，對應標的之核苷酸位3’端之鳥苷酸變成2‘-去氧肌苷酸之實施例57(AD1_EYS.3，圖中為EYS之AD1g.3)顯示更高的編輯比率。此表示標的RNA之編輯標的之腺苷酸殘基5’端為胞苷酸時，使用2’-去氧肌苷酸作為gRNA中之對應標的之核苷酸3’端之核苷酸殘基時，顯示較高的編輯比率。
(試驗例8)
對具有HFE基因序列之模型標的RNA之編輯誘導能力評估
(A)HFE_RNA之合成
除了將作為寡DNA之AGXT_FW及AGXT_RV使用下列所示之HFE_FW(序列編號40)及HFE_RV(序列編號41)取代以外，以與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行，合成出表現模型標的RNA之pUC_HFE質體，使用此質體合成出作為模型標的RNA之HFE_RNA。
Figure 110145878-A0202-12-0089-32
(B)編輯誘導能力評估與其結果
使用實施例53、58(AD1_HFE.2、AD1_HFE.3)及參考例6(AD1_HFE)之化合物，使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法評估編輯誘導能力。
(C)編輯分析之結果
編輯比率之結果顯示於圖8。ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型RNA構成之參考例6(AD1_HFE，圖中為HFE之AD1g)，gRNA中，對應標的之核苷酸3’端之鳥苷酸變成2’-去氧鳥苷酸之實施例53(AD1_HFE.2，圖中為HFE之AD1g.2)顯示較高的編輯比率。又，對應標的之核苷酸位3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例58(AD1_HFE.3，圖中為HFE之AD1g.3)顯示更高的編輯比率。此表示標的RNA之編輯標的之腺苷酸殘基5’端為胞苷酸時，使用2’-去氧肌苷酸作為gRNA中之對應標的之核苷酸3’端之核苷酸殘基時，則顯示較高的編輯比率。
(試驗例9)
對具有UGT1A1基因序列之模型標的RNA之編輯誘導能力評估
(A)UGT1A1_RNA之合成
除了將作為寡DNA之AGXT_FW及AGXT_RV使用下列所示之UGT1A1_FW(序列編號42)及UGT1A1_RV(序列編號43)取代以外，以與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行，合成出表現模型標的RNA之pUC_UGT1A1質體，使用此質體合成出作為模型標的RNA之UGT1A1_RNA。
Figure 110145878-A0202-12-0091-33
(B)編輯誘導能力評估與其結果
使用實施例54、59(AD1_UGT1A1.2、AD1_UGT1A1.3)及參考例7(AD1_UGT1A1)之化合物，使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法評估編輯誘導能力。
(C)編輯分析之結果
編輯比率之結果顯示於圖8。ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型RNA構成之參考例7(AD1_UGT1A1，圖中為UGT1A1之AD1g)，gRNA中，對應標的之核苷酸3’端之鳥苷酸變成2’-去氧鳥苷酸之實施例54(AD1_UGT1A1.2，圖中為UGT1A1之AD1g.2)顯示較高的編輯比率。又，對應標的之核苷酸位3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例59(AD1_UGT1A1.3，圖中為UGT1A1之AD1g.3)顯示更高的編輯比率。此表示標的RNA之編輯標的之腺苷酸殘基5’端為胞苷酸時，使用2’-去氧肌苷酸作為gRNA中之對應標的之核苷酸3’端之核苷酸殘基時，則顯示較高的編輯比率。
(試驗例10)
對gRNA之培養細胞內之具有AGXT基因序列之模型標的RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA表現質體之合成
以試驗例5(A)所得之pUC19_AGXT作為模板股，使用DS_disease_XhoF01引子(序列編號44)及DS_disease_KpnR01引子(序列編號45)、PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，藉由PCR(循環30次；變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，20秒)，製作嵌入DNA，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化。將嵌入DNA、pcDNA3.1(-)Hygro使用XhoI(TaKaRa)及KpnI(TaKaRa)於37℃進行反應1小時後，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化。以嵌入DNA：質體為莫耳比3：1之方式添加，使用DNA接合套組<Mighty Mix>(TaKaRa)進行接合反應。將所得之接合樣品轉形至DH5 α，使用LB瓊脂培養基於37℃培養一晚。將經篩選之殖株使用LB液體培養基於37℃培養一晚，使用QIAprep Spin Miniprep套組(QIAGEN)萃取質體。將所得之質體100ng使用bigdye terminator v3.1循環定序套組(Thermo)、0.165μM之pcDNA3_1pro_F01引子(序列編號46)及0.165μM之pcDNA31-seqR01引子(序列編號47)進行接合反應，藉由Applied Biosystems 3500基因分析儀(Thermo)進行序列分析，確認已合成pcDNA3.1(-)Hygro_AGXT。
Figure 110145878-A0202-12-0092-34
(B)細胞培養
將HEK293細胞以5.0×104細胞/孔之方式種於24孔盤，進行48小時培養。使用Lipofectamine 3000(Thermo)將10ng之pcDNA3.1(-)Hygro_AGXT、500ng之表現ADAR之質體(pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR2、pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p110、或pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p150)、與50nM之gRNA(實施例60：AD1_AGXT.30)進行轉染，進行48小時培養。
(C)編輯分析
使用Sepasol RNA I Super G(Nacalai公司)，自培養於24孔盤之細胞萃取所有RNA，使用重組DNaseI(TaKaRa)進行DNase處理後，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化。進行經使用PrimeScript II反轉錄酶(TaKaRa)、所有RNA 0.5μg、0.25μM Oligo(dT)17之反轉錄反應，將cDNA增幅。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、T7proGGG引子(序列編號35)、3’-Adp引子(序列編號48)進行第一PCR。將第一PCR產物經200倍稀釋之DNA作為模板股，使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、DS_disease_XhoF01引子(序列編號44)、DS_disease_KpnR01引子(序列編號45)進行第二PCR，增幅AGXT片段。使用bigdye terminator v3.1循環定序套組、0.165μM DS_disease_XhoF01引子進行接合反應，藉由Applied Biosystem 3500基因分析儀進行分析。藉由定序所得之層析圖表，自標的部位之峰高比(G/(G+A))算出編輯比率。
(D)編輯分析之結果
使用實施例60之化合物(AD1_AGXT_30)時之編輯比率(%)顯示於圖9。轉染標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA時，顯示30%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示60%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA 與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示70%左右之高編輯比率。
(試驗例11)
對gRNA之培養細胞內之具有GNE基因序列之模型標的RNA之編輯誘導能力評估
除了將試驗例6(A)所得之pUC19_GNE取代pUC19_AGXT作為模板股建構標的RNA表現質體、與使用實施例61之AD1_GNE_30作為gRNA以外，依據試驗例10之(A)至(C)，評估gRNA之培養細胞內之GNE基因序列之編輯誘導能力。
使用實施例61之化合物(AD1_GNE_30)時之編輯比率(%)顯示於圖9。轉染標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA時，顯示10%左右之編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示50%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示60%左右之高編輯比率。
(試驗例12)
對gRNA之培養細胞內之具有EYS基因序列之模型標的RNA之編輯誘導能力評估
除了將試驗例7(A)所得之pUC19_EYS取代pUC19_AGXT作為模板股建構標的RNA表現質體、與使用實施例62之AD1_EYS_29作為gRNA以外，依據試驗例10之(A)至(C)，評估gRNA之培養細胞內之EYS基因序列之編輯誘導能力。
使用實施例62之化合物(AD1_EYS_29)時之編輯比率(%)顯示於圖9。轉染標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA時，顯示10%左右之編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示40%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示50%至60%左右之高編輯比率。
(試驗例13)
對gRNA之培養細胞內之具有HFE基因序列之模型標的RNA之編輯誘導能力評估
除了將試驗例8(A)所得之pUC19_HFE取代pUC19_AGXT作為模板股建構標的RNA表現質體、與使用實施例63之AD1_HFE_29作為gRNA以外，依據試驗例10之(A)至(C)，評估gRNA之培養細胞內之HFE基因序列之編輯誘導能力。
使用實施例63之化合物(AD1_HFE_29)時之編輯比率(%)顯示於圖9。轉染標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA時，顯示10%左右之編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示40%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示50%左右之高編輯比率。
(試驗例14)
對gRNA之培養細胞內之具有UGT1A1基因序列之模型標的RNA之編輯誘導能力評估
除了將試驗例9(A)所得之pUC19_UGT1A1取代pUC19_AGXT作為模板股建構標的RNA表現質體、與使用實施例64之AD1_UGT1A1_30作為gRNA以外，依據試驗例10之(A)至(C)，評估gRNA之培養細胞內之UGT1A1基因序列之編輯誘導能力。
使用實施例64之化合物(AD1_UGT1A1_30)時之編輯比率(%)顯示於圖9。轉染標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA時，顯示10%左右之編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示40%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示60%左右之高編輯比率。
(參考例8至22)
作為標的之疾病序列之標的編輯引導RNA係具有下列所示之序列，且全由野生型核糖核苷酸殘基構成之寡核苷酸係與參考例1同樣地藉由亞磷醯胺法所合成。表中之「分子量」表示經負離子ESI質量分析之實測值，「-」表示未測定。
Figure 110145878-A0202-12-0097-35
於表中之「序列」中，大寫文字表示RNA。參考例8至22之寡核苷酸5’末端及3’末端係氫原子與氧原子鍵結而成為羥基。
(實施例65至136)
實施例65至136之化合物係各自以參考例2、參考例8至22之寡核苷酸之序列為基準，藉由導入如表21至表24所示之修飾核苷酸所得者。此等寡核苷酸係與參考例1同樣地以亞磷醯胺法合成。此外，序列中，合成「ec」之部分時，使用N3-乙基去氧胞苷CED亞磷醯胺(ChemGene，商品目錄編號：ANP-3856)。合成「T」之部分時，使用核糖胸苷CED亞磷醯胺(ChemGene，商品目錄編號：ANP_7511)。
Figure 110145878-A0202-12-0098-36
Figure 110145878-A0202-12-0099-37
Figure 110145878-A0202-12-0100-38
Figure 110145878-A0202-12-0101-39
表中之「分子量」表示經負離子ESI質量分析之實測值。於表中之「序列」中，「T」表示核糖胸苷，「ec」表示N3-乙基-2’-去氧胞苷。又，關於其他簡稱係如上所述。此外，寡核苷酸5’末端及3’末端係氫原子與氧原子鍵結而成為羥基。
Figure 110145878-A0202-12-0102-40
(試驗例15)實施例化合物之gRNA之培養細胞內之GAPDH基因序列之編輯誘導能力評估(3)
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例3相同之方法。使用實施例39、40及102至106之化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_40、hGAPDH_AD1_52至hGAPDH_AD1_56)時之編輯比率(%)顯示於圖10。
轉染表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體時，相較於未使用gRNA時(圖中，gRNA(-))顯示較高的編輯比率。特別是，於與標的RNA之結合部位導入有LNA之實施例39、40及102之化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_40、hGAPDH_AD1_52)係顯示最高之編輯比率。再者，對只轉染50nM之濃度之實施例化合物之gRNA時的細胞內編輯誘導進行評估，相較於gRNA(-)顯示較高的編輯比率。
使用實施例39、100、101、105及107至112之化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_42、hGAPDH_AD1_45、hGAPDH_AD1_55、hGAPDH_AD1_57至hGAPDH_AD1_62)時之編輯比率(%)顯示於圖11。
轉染表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體時，相較於未使用gRNA時(圖中，gRNA(-))顯示較高的編輯比率。特別是，於與標的RNA之結合部位導入有LNA之實施例39、105及112之化合物(hGAPDH_AD1_39、 hGAPDH_AD1_55、hGAPDH_AD1_62)係顯示最高之編輯比率。再者，對只轉染50nM之濃度之實施例化合物之gRNA時的細胞內編輯誘導進行評估，相較於gRNA(-)顯示較高的編輯比率。
使用實施例化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_62至hGAPDH_AD1_75)時之編輯比率(%)顯示於圖12A。
轉染表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體時，相較於未使用gRNA時(圖中，gRNA(-))顯示較高的編輯比率。特別是，導入有去氧核苷酸殘基或核糖核苷酸殘基作為對應標的之核苷酸殘基之實施例39、112、115至118、及120之化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_62、hGAPDH_AD1_65至hGAPDH_AD1_68、hGAPDH_AD1_70)係顯示特別高之編輯比率。再者，對只轉染50nM之濃度之實施例化合物之gRNA時的細胞內編輯誘導進行評估，相較於gRNA(-)顯示較高的編輯比率。
使用實施例化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_76至hGAPDH_AD1_85)時之編輯比率(%)顯示於圖12B。
轉染表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體時，相較於未使用gRNA時(圖中，gRNA(-))顯示較高的編輯比率。特別是，導入有2’-O-Me-核糖核苷酸殘基作為對應標的之核苷酸殘基之實施例131至133、135之化合物(hGAPDH_AD1_81至hGAPDH_AD1_83、hGAPDH_AD1_85)係顯示特別高之編輯比率。
(試驗例16)對具有hGAPDH基因序列之RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA之合成
操作係與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行。惟，寡DNA係使用下述之GAPDH_FW(序列編號64)及GAPDH_RV(序列編號65)。
Figure 110145878-A0202-12-0104-41
(B)編輯誘導能力評估及其結果
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法。
(C)編輯分析之結果
由ADAR1p110所致之編輯比率之結果顯示於圖13A及圖13B。ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於未添加gRNA時，實施例39、112至135之化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_62至85)顯示較高的編輯比率。特別是，於對應標的之核苷酸殘基使用了去氧核糖核苷酸殘基、核糖核苷酸殘基、2’-F-核糖核苷酸殘基或2’-O-Me-核糖核苷酸殘基者，表示了顯示較高的編輯比率。
(試驗例17)對具有Factor V基因序列之RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA之合成
操作係與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行。惟，寡DNA係使用以下所述之具有Factor V基因序列者。此處所使用之Factor V基因序列係具有GenBank accession no.NM_000130.45之第1682至1706個鹼基之序列，更具有被稱為c.1601G>A之核苷酸之突變(rs6025)。
Figure 110145878-A0202-12-0105-42
(B)編輯誘導能力評估與其結果
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法。
(C)編輯分析之結果
ADAR1p110所致之編輯比率之結果顯示於圖14A。由ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例8之化合物(AD1_Factor V，圖中為Factor V之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例65之化合物(AD1_Factor V.3，圖中為Factor V之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷時，則顯示較高的編輯比率。
由ADAR2所致之編輯比率之結果顯示於圖14B。由ADAR2所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例8之化合物(AD1_Factor V，圖中為Factor V之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例65(AD1_Factor V.3，圖中為Factor V之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷酸為胞苷酸 時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷酸時，則顯示較高的編輯比率。
(試驗例18)對具有CBS基因序列之RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA之合成
操作係與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行。惟，寡DNA係使用以下所述之具有CBS基因序列者。此處所使用之CBS基因序列具有GenBank accession no.NM_000071.2之第1561至1585個鹼基之序列，更具有被稱為c.1330G>A之核苷酸之突變(rs28934891)。
Figure 110145878-A0202-12-0106-43
(B)編輯誘導能力評估及其結果
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法。
(C)編輯分析之結果
ADAR1p110所致之編輯比率之結果顯示於圖14A。ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例12之化合物(AD1_CBS，圖中為CBS之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之 鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例69之化合物(AD1_CBS.3，圖中為CBS之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷酸為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷時，顯示較高的編輯比率。
由ADAR2所致之編輯比率之結果顯示於圖14B。由ADAR2所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例12之化合物(AD1_CBS，圖中為CBS之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例69之化合物(AD1_CBS.3，圖中為CBS之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷酸為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷酸時，顯示較高的編輯比率。
(試驗例19)對具有PAH基因序列之RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA之合成
操作係與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行。惟，寡DNA係使用以下所述之具有PAH基因序列者。此處所使用之PAH基因序列具有GenBank accession no.NM_000277.3之第882至906個鹼基之序列，更具有被稱為c.782G>A之核苷酸之突變(rs5030849)。
Figure 110145878-A0202-12-0107-44
(B)編輯誘導能力評估及其結果
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法。
(C)編輯分析之結果
由ADAR1p110所致之編輯比率之結果顯示於圖14A。由ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例9之化合物(AD1_PAH.1，圖中為PAH之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例66之化合物(AD1_PAH.1.3，圖中為PAH之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷酸時，顯示較高的編輯比率。
由ADAR2所致之編輯比率之結果顯示於圖14B。由ADAR2所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例9之化合物(AD1_PAH.1，圖中為PAH之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例66之化合物(AD1_PAH.1.3，圖中為PAH之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷酸為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷酸時，顯示較高的編輯比率。
(試驗例20)對具有ASS1基因序列之RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA之合成
操作係與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行。惟，寡DNA係使用以下所述之具有ASS1基因序列者。此處所使用之ASS1基因序列具有GenBank accession no.NM_000050.4之第1510至1534個鹼基之序列，更具有被稱為c.1168G>A之核苷酸之突變(rs121908641)。
Figure 110145878-A0202-12-0109-45
(B)編輯誘導能力評估及其結果
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法。
(C)編輯分析之結果
由ADAR1p110所致之編輯比率之結果顯示於圖14A。由ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例10之化合物(AD1_ASS1，圖中為ASS1之之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例67之化合物(AD1_ASS1.3，圖中為ASS1之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷酸時，顯示較高的編輯比率。
由ADAR2所致之編輯比率之結果顯示於圖14B。由ADAR2所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例10之化合物(AD1_ASS1，圖中為ASS1之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例67之化合物(AD1_ASS1.3，圖中為ASS1之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷酸為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷酸時，顯示較高的編輯比率。
(試驗例21)對具有GRIA2基因序列之RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA之合成
操作係與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行。惟，寡DNA係使用以下所述之具有GRIA2基因序列者。此處所使用之GRIA2基因序列具有GenBank accession no.NM_000826.4之第2121至2145個鹼基之序列，再者，第2135個腺苷酸係ALS之疾病中ADAR2之表現降低時，變成肌苷酸之編輯效率降低之部位。
Figure 110145878-A0202-12-0110-46
(B)編輯誘導能力評估及其結果
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法。
(C)編輯分析之結果
由ADAR1p110所致之編輯比率之結果顯示於圖14A。由ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例13之化合物(AD1_GRIA2，圖中為GRIA2之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例70之化合物(AD1_GRIA2.3，圖中為GRIA2之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷酸為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷酸時，顯示較高的編輯比率。
由ADAR2所致之編輯比率之結果顯示於圖14B。由ADAR2所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例13之化合物(AD1_GRIA2，圖中為GRIA2之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例70之化合物(AD1_GRIA2.3，圖中為GRIA2之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷酸為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷酸時，顯示較高的編輯比率。
(試驗例22)對具有SLCO2A1基因序列之RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA之合成
操作係與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行。惟，寡DNA係使用以下所述之具有SLCO2A1基因序列者。此處所使用之SLCO2A1基 因序列具有GenBank accession no.NM_005630.3之第81020至81044個鹼基之序列，更具有被稱為c.940+1G>A之核苷酸之突變(rs765249238)。
Figure 110145878-A0202-12-0112-47
(B)編輯誘導能力評估及其結果
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法。
(C)編輯分析之結果
由ADAR1p110所致之編輯比率之結果顯示於圖14A。由ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例14之化合物(AD1_SLCO2A1，圖中為SLCO2A1之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例71之化合物(AD1_SLCO2A1.3，圖中為SLCO2A1之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷酸為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷酸時，顯示較高的編輯比率。
由ADAR2所致之編輯比率之結果顯示於圖14B。由ADAR2所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例14之化合物(AD1_SLCO2A1，圖中為SLCO2A1之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸 殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例71之化合物(AD1_SLCO2A1.3，圖中為SLCO2A1之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷酸為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷酸時，顯示較高的編輯比率。
(試驗例23)對具有GFAP基因序列之RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA之合成
操作係與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行。惟，寡DNA係使用以下所述之具有GFAP基因序列者。此處所使用之GFAP基因序列具有GenBank accession no.NM_002055.5之第2154至2178個鹼基之序列，更具有被稱為c.716G>A之核苷酸之突變(rs59565950)。
Figure 110145878-A0202-12-0113-48
(B)編輯誘導能力評估及其結果
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法。
(C)編輯分析之結果
由ADAR1p110所致之編輯比率之結果顯示於圖14A。由ADAR1p110所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例11之化合物(AD1_GFAP，圖中為GFAP之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例68之化合物(AD1_GFAP.3，圖中為GFAP之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷酸為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷酸時，顯示較高的編輯比率。
由ADAR2所致之編輯比率之結果顯示於圖14B。由ADAR2所致之RNA編輯效率，相較於全由野生型核糖核苷酸殘基構成之參考例11之化合物(AD1_GFAP，圖中為GFAP之AD1g03)，gRNA中，對應標的之核苷酸殘基3’端之鳥苷酸變成2’-去氧肌苷酸之實施例68之化合物(AD1_GFAP，圖中為GFAP之AD1g03.3)顯示較高的編輯比率。此表示編輯部位5’端之核苷酸為胞苷酸時，gRNA中，使用2’-去氧肌苷酸作為對應標的之核苷酸殘基3’端之核苷酸時，顯示較高的編輯比率。
(試驗例24)對具有ASS1基因序列之RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA之合成
操作係與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行。惟，寡DNA係使用試驗例20所述之具有ASS1基因序列者。此處所使用之ASS1基因序列具有GenBank accession no.NM_000050.4之第1510至1534個鹼基之序列，更具有被稱為c.1168G>A之核苷酸之突變(rs121908641)。
(B)編輯誘導能力評估及其結果
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法。
(C)編輯分析之結果
使用實施例76(AD1_ASS1.39)之編輯比率之結果顯示於圖15A。經ADAR1p110所致之化學修飾之實施例76之化合物(AD1_ASS1.39)之RNA編輯效率，相較於未添加gRNA者，顯示較高的編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之ASS1基因序列。
使用實施例81之化合物(AD1_ASS1.39e)及實施例85之化合物(AD1_ASS1.52e)之編輯比率之結果顯示於圖15B。經ADAR1p110所致之化學修飾之實施例81之化合物(AD1_ASS1.39e)及實施例85之化合物(AD1_ASS1.52e)之RNA編輯效率，相較於未添加gRNA者，顯示較高的編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之ASS1基因序列。
(試驗例25)對具有PANK2基因序列之RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA之合成
操作係與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行。惟，寡DNA係使用以下所述之具有PANK2基因序列者。此處所使用之PANK2基因序列具有GenBank accession no.NM_153638.3之第1714至1738個鹼基之序列，更具有被稱為c.1561G>A之核苷酸之突變(rs137852959)。
Figure 110145878-A0202-12-0116-49
(B)編輯誘導能力評估及其結果
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法。
(C)編輯分析之結果
使用實施例76之化合物(AD1_PANK2.39)之編輯比率之結果顯示於圖15A。經ADAR1p110所致之化學修飾之實施例76之化合物(AD1_PANK2.39)之RNA編輯效率，相較於未添加gRNA者，顯示較高的編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之PANK2基因序列。
又，使用實施例82之化合物(AD1_PANK2.39e)及實施例86之化合物(AD1_PANK2.52e)編輯比率之結果顯示於圖15C。經ADAR1p110所致之化學修飾之實施例76之化合物(AD1_PANK2.39)之RNA編輯效率，相較於未添加gRNA者，顯示較高的編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之PANK2基因序列。
(試驗例26)對具有NPHS2基因序列之RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA之合成
操作係與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行。惟，寡DNA係使用以下所述之具有NPHS2基因序列者。此處所使用之NPHS2基因序列具有GenBank accession no.NM_014625.4之第483至501個鹼基之序列，更具有被稱為c.413G>A之核苷酸之突變(rs74315342)。
Figure 110145878-A0202-12-0117-50
(B)編輯誘導能力評估及其結果
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法。
(C)編輯分析之結果
使用實施例77(AD1_NPHS2.39)之編輯比率之結果顯示於圖15A。經ADAR1p110所致之化學修飾之實施例77之化合物(AD1_NPHS2.39)之RNA編輯效率，相較於未添加gRNA者，顯示較高的編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之NPHS2基因序列。
又，使用實施例83之化合物(AD1_NPHS2.39e)及實施例87之化合物(AD1_NPHS2.52e)之編輯比率之結果顯示於圖15D。經ADAR1p110所致之化學修飾之實施例77之化合物(AD1_NPHS2.39)之RNA編輯效率，相較於未添加 gRNA者，顯示較高的編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之NPHS2基因序列。
(試驗例27)對具有GRIA2基因序列之RNA之編輯誘導能力評估
(A)標的RNA之合成
操作係與試驗例5之(A)AGXT_RNA之合成所述之方法同樣地進行。惟，寡DNA係使用試驗例21所述之具有GRIA2基因序列者。此處所使用之GRIA2基因序列具有GenBank accession no.NM_000826.4之第2121至2145個鹼基之序列，再者，第2135個腺苷酸係ALS之疾病中ADAR2之表現降低時，變成肌苷酸之編輯效率降低之部位。
(B)編輯誘導能力評估及其結果
實施例化合物之編輯誘導能力評估之方法係使用與試驗例5之(B)至(D)相同之方法。
(C)編輯分析之結果
使用實施例78之化合物(AD1_GRIA2.39)、實施例80之化合物(AD1_GRIA2.39e)及實施例84之化合物(AD1_GRIA2.52e)之編輯比率之結果顯示於圖15E。經ADAR1p110所致之化學修飾之實施例78之化合物(AD1_GRIA2.39)、實施例80之化合物(AD1_GRIA2.39e)及實施例84之化合物(AD1_GRIA2.52e)之RNA編輯效率，相較於未添加gRNA者，顯示較高的編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之GRIA2基因序列。本實施例之化合物顯示可提升經突變之GRIA2基因序列之第2279個腺苷酸部位變成肌苷酸之編輯效率。
(試驗例28)實施例化合物之gRNA之培養細胞內之PAH基因序列之編輯誘導能力評估
除了建構以下之表現PAH基因標的之RNA表現質體、使用實施例72至74之化合物作為gRNA、及使用對應PAH基因之引子以外，使用與試驗例10之(A)至(C)相同之方法。此處所使用之PAH基因序列具有GenBank accession no.NM_001354304.2之第114638至114662個鹼基之序列，更具有被稱為c.1066-11G>A之核苷酸之突變(rs5030855)。
使用實施例72至74之化合物(AD1_PAH.2.29、AD1_PAH.2.41、AD1_PAH.2.43)時之編輯比率(%)顯示於圖16。轉染標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA時，顯示5%左右之編輯比率。再者，將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示10%至40%左右之高編輯比率。另一方面，將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示40%至60%左右之更高編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之PAH基因序列。
(試驗例29)實施例化合物之gRNA之培養細胞內之ASS1基因序列之編輯誘導能力評估
除了建構以下之表現ASS1基因之標的RNA表現質體、使用實施例75、79、81及85之化合物作為gRNA、及使用對應於ASS1之引子以外，使用與試驗例10之(A)及(B)相同之方法。此處所使用之ASS1基因序列具有GenBank accession no.NM_000050.4之第1510至1534個鹼基之序列，更具有被稱為c.1168G>A之核苷酸之突變(rs121908641)。
編輯分析如以下進行。使用RNeasy Plus Mini套組(QIAGEN)自培養於24孔盤之細胞萃取所有RNA。進行經使用PrimeScript II反轉錄酶(TaKaRa)、 所有RNA 0.5μg、0.25μM Oligo(dT)17之反轉錄反應，將cDNA增幅。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、T7proGGG引子(序列編號35)、3’-Adp引子(序列編號48)進行第一PCR。將第一PCR產物經200倍稀釋之DNA作為模板股，使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、DS_disease_XhoF01引子(序列編號44)、DS_disease_KpnR01引子(序列編號45)進行第二PCR，增幅ASS1片段。使用bigdye terminator v3.1循環定序套組、0.165μM DS_disease_XhoF01引子進行接合反應，藉由Applied Biosystem 3500基因分析儀進行分析。藉由定序所得之層析圖表，自標的部位之峰高比(G/(G+A))算出編輯比率。
使用實施例75及實施例79之化合物(AD1_ASS1.39、AD1_ASS1.52)時之編輯比率(%)顯示於圖17A。轉染標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA時，顯示5%至10%左右之編輯比率。再者，將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示20%至50%左右之高編輯比率。另一方面，將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，再顯示40%至80%左右之更高編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之ASS1基因序列。
又，使用實施例81及實施例85之化合物(AD1_ASS1.39e、AD1_ASS1.52e)時之編輯比率(%)顯示於圖18A。轉染標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA時，顯示5%左右之編輯比率。再者，將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示20%至40%左右之高編輯比率。另一方面，將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，再顯示40%至80%左右之更高編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之ASS1基因序列。
(試驗例30)實施例化合物之gRNA之培養細胞內之PANK2基因序列之編輯誘導能力評估
除了建構以下表現PANK2基因之標的RNA表現質體、使用實施例76、82及86之化合物作為gRNA、及使用對應於PANK2基因之引子以外，使用與試驗例10之(A)及(B)相同之方法，編輯分析中係使用與試驗例29所述之編輯分析相同之方法。此處所使用之PANK2基因序列具有GenBank accession no.NM_153638.3之第1714至1738個鹼基之序列，更具有被稱為c.1561G>A之核苷酸之突變(rs137852959)。
使用實施例76之化合物(AD1_PINK2.39)時之編輯比率(%)顯示於圖17B。轉染標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA時，顯示5%左右之編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示20%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示40%至50%左右之高編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之PANK2基因序列。
又，使用實施例82之化合物(AD1_PINK2.39e)及實施例85之化合物(AD1_PINK2.52e)時之編輯比率(%)顯示於圖18B。轉染標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA時，顯示5%左右之編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示10%至20%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示30%至50%左右之高編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之PANK2基因序列。
(試驗例31)實施例化合物之gRNA之培養細胞內之NPHS2基因序列之編輯誘導能力評估
除了建構表現以下之NPHS2基因之標的RNA表現質體、使用實施例77、83及87之化合物作為gRNA、及使用對應NPHS2基因之引子以外，使用與試驗例10之(A)及(B)相同之方法，編輯分析中係使用與試驗例29所述之編輯分析相同之方法。此處所使用之NPHS2基因序列具有GenBank accession no.NM_014625.4之第483至501個鹼基之序列，更具有被稱為c.413G>A之核苷酸之突變(rs74315342)。
使用實施例77之化合物(AD1_NPHS2.39)時之編輯比率(%)顯示於圖17C。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示10%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示20%左右之高編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之NPHS2基因序列。
又，使用實施例83之化合物(AD1_NPHS2.39e)及實施例87之化合物(AD1_NPHS.52e)時之編輯比率(%)顯示於圖18C。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示10%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示20%左右之高編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之NPHS2基因序列。
(試驗例32)實施例化合物之gRNA之培養細胞內之GRIA2基因序列之編輯誘導能力評估
除了建構以下之表現GRIA2基因之標的RNA表現質體、使用實施例78、80及84之化合物作為gRNA、及使用對應GRIA2基因之引子以外，使用與試驗例10之(A)及(B)相同之方法，編輯分析中係使用與試驗例29所述之編輯分析相同之方法。此處所使用之GRIA2基因序列具有GenBank accession no.NM_000826.3 之第2265至2289個鹼基之序列，再者，第2279個腺苷酸係ALS之疾病中ADAR2之表現降低時，變成肌苷酸之編輯效率降低之部位。
使用實施例78之化合物(AD1_GRIA2.39)、實施例80之化合物(AD1_GRIA2.39e)及實施例84之化合物(AD1_GRIA2.52e)時之編輯比率(%)顯示於圖18D。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示40%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示40%至60%左右之高編輯比率。本實施例之化合物顯示可提升經突變之GRIA2基因序列之第2279個腺苷酸部位變成肌苷酸之編輯效率
(試驗例33)對實施例化合物之gRNA之模型標的RNA(Rluc_sRNA)之編輯誘導能力評估
(A)編輯部位5’端旁之鹼基序列為G之RNA之合成
編輯部位5’端旁之鹼基序列為G者係使用WO2021/060527之實施例10所述之Rluc_sRNA。又，編輯部位5’端旁之鹼基序列為A者係使用以下所述之寡DNA所調製。
(B)編輯部位5’端旁之鹼基序列為A之RNA之合成
將藉由一般方法所調製之psiCHECKTM-2_Rluc_W104X作為模板股，5’端片段使用RL_s01_G286A_EcoF1引子(序列編號64)與Rluc_G286A_R01引子(序列編號65)，3’端片段使用Rluc_G286A_F01引子(序列編號66)與RL_s01_G286A_HinR1引子(序列編號67)，藉由PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)進行第一PCR(循環30次；變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，20秒)。接著，各自之PCR產物稀釋100倍，使用RL_s01_G286A_EcoF1引子(序列編號64)及 RL_s01_G286A_HinR1引子(序列編號67)藉由PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)進行第二PCR(循環30次；變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，20秒)，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化，獲得Rluc_K41R_W104X之G286突變成A之序列與具有限制酶切位之DNA(Rluc_K41R_W 104X_G286A_Eco/Hid)(序列編號72)。將pUC19及所得之DNA使用EcoRI(TaKaRa)及HindIII(TaKaRa)於37℃進行1小時之限制酶切割後，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱，純化各自之DNA。將限制酶切割後之Rluc_K41R_W104X_G286A與pUC19以1：3之莫耳比之方式混合，使用DNA接合套組<Mighty Mix>(TaKaRa)進行接合反應。將所得之接合樣品轉形至DH5 α，使用LB瓊脂培養基於37℃培養一晚。將經篩選之殖株在LB液體培養基中於37℃培養一晚，使用QIAprep Spin Miniprep套組(QIAGEN)萃取質體。之後，藉由鹼基序列分析確認所得之質體之序列。以序列經確認之質體作為模板股，使用T7_Rluc_sRNA_F01(序列編號68)及Rluc_sRNA_R01引子(序列編號69)、PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，藉由PCR(循環30次(變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，20秒))，增幅試管內轉錄反應用之模板股DNA，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化。使用AmpliScribe T7套組(Epicentre Biotechnologies)，進行試管內轉錄而獲得Rluc_sRNA_G286A(序列編號73)。關於合成後之Rluc_sRNA_G286A，使用含8M尿素之5%聚丙烯醯胺凝膠進行切出凝膠之純化，用於後續之試驗。
Figure 110145878-A0202-12-0125-51
Figure 110145878-A0202-12-0125-53
(C)編輯誘導能力評估
按照WO2021/060527之實施例10所述之方法，評估編輯誘導能力。
(D)編輯分析之結果
針對實施例88至96之化合物評估對編輯部位5’端旁之核苷酸為G之Rluc_sRNA之編輯活性。其結果顯示於圖19。將WO2021/060527之實施例10所述之AD1g_03_RL_A287及AD1g_03_RL_A287_GG各自作為參考例15及16進行比較。參考例15之化合物於圖19中記載為AD1g_RL_A287_GC，參考例16之化合物於圖19中記載為ADlg_RL_A287_GG。參考例16之化合物顯示高於參考例15之化合物之編輯活性，與WO2021/060527之實施例10之記載一致。再者，經評估實施例88至96之化合物，針對編輯部位5’端旁之核苷酸之G，變成2’-去氧鳥苷酸、或2’-去氧肌苷酸之實施例89及90之化合物顯示高於參考例16之化合物之編輯活性。特別是針對編輯部位5’端旁之核苷酸之G，變成2’-去氧肌苷酸之實施例90之化合物顯示最高之活性。
針對實施例88至96之化合物評估對編輯部位5’端旁之核苷酸為A之Rluc_sRNA之編輯活性。其結果顯示於圖20。經評估實施例88至96之化合物，針對編輯部位5’端旁之核苷酸之A，變成胸苷酸或2’-去氧脲苷酸之實施例91及93之化合物顯示高編輯活性。特別是針對編輯部位5’端旁之核苷酸之A，變成2’-去氧脲苷酸之實施例93之化合物顯示最高之活性。
針對實施例90及97之化合物評估對編輯部位5’端旁之核苷酸為G之Rluc_sRNA之編輯活性。其結果顯示於圖21A。針對編輯部位5’端旁之核苷酸之G，所有核苷酸經化學修飾之實施例97之化合物顯示與變成2’-去氧肌苷酸之實施例90之化合物相同程度之效率的高活性。
針對實施例91、93、98及99之化合物評估對編輯部位5’端旁之核苷酸為A之Rluc_sRNA之編輯活性。其結果顯示於圖21B。針對編輯部位5’端旁之核苷酸之A，所有核苷酸經化學修飾之實施例98及99之化合物顯示與變 成胸苷酸或2’-去氧脲苷酸之實施例91及93之化合物相同程度以上之效率的高活性。
(試驗例34)實施例化合物之gRNA之培養細胞內之標的RNA(Rluc_sRNA)之編輯誘導能力評估
(A)編輯部位5’端旁之鹼基序列為G之RNA(GAN_RNA)表現質體(pcDNA3.1(-)Hygro-Rluc_sRNA)及編輯部位5’端旁之鹼基序列為A之RNA(AAN_RNA)表現質體(pcDNA3.1(-)Hygro_Rluc_sRNA_G286A)之合成
GAN_RNA表現質體之建構係以根據一般方法所調製之psiCHECKTM-2_Rluc_W104X為模板股，AAN_RNA表現質體之建構係以根據一般方法所調製之pUC19_Rluc_K41R_W104X_G286A為模板股。針對模板股，使用Rluc_s01_BamF1引子(序列編號74)及RL_s01_G286A_HinR1引子(序列編號75)、PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，藉由PCR(循環30次；變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，20秒)，製作嵌入DNA，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化。將嵌入DNA、pcDNA3.1(-)Hygro使用BamHI(TaKaRa)及HindIII(TaKaRa)於37℃進行反應1小時後，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化。以嵌入DNA：質體為莫耳比3：1之方式添加，使用DNA接合套組<Mighty Mix>(TaKaRa)進行接合反應。將所得之接合樣品轉形至DH5 α，使用LB瓊脂培養基於37℃培養一晚。將經篩選之殖株使用LB液體培養基於37℃培養一晚，使用QIAprep Spin Miniprep套組(QIAGEN)萃取質體。將所得之質體100ng使用bigdye terminator v3.1循環定序套組(Thermo)、0.165μM之pcDNA3_1pro_F01引子(序列編號76)及0.165μM之pcDNA31-seqR01引子(序列編號77)進行接合反應，藉由Applied Biosystems 3500基因分析儀(Thermo)進行序列分析，確認已合成pcDNA3.1(-)Hygro_Rluc_sRNA及pcDNA3.1(-)Hygro_Rluc_sRNA_G286A。
Figure 110145878-A0202-12-0128-54
(B)細胞培養
除了使用cDNA3.1(-)Hygro_Rluc_sRNA及pcDNA3.1(-)Hygro_Rluc_sRNA_G286A取代pcDNA3.1(-)Hygro_AGXT、使用實施例97至99之化合物作為gRNA以外，使用與試驗例10之(B)相同之方法。
(C)編輯分析
使用RNeasy Plus Mini套組(QIAGEN)，自培養於24孔盤之細胞萃取所有RNA。進行經使用ReverTra Ace(註冊商標)qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO)、所有RNA 0.5μg之反轉錄反應，將cDNA增幅。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、Rluc_sRNA_F01引子(序列編號78)、Rluc_sRNA_R01引子(序列編號79)進行PCR，增幅片段。使用bigdye terminator v3.1循環定序套組、0.165μM Rluc_sRNA_F01引子進行接合反應，藉由Applied Biosystem 3500基因分析儀進行分析。藉由定序所得之層析圖表，自標的部位之峰高比(G/(G+A))算出編輯比率。
Figure 110145878-A0202-12-0129-55
(D)編輯分析之結果
針對編輯部位5’端旁之核苷酸為G之Rluc_sRNA，使用實施例97之化合物時之編輯比率(%)顯示於圖22。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示5%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示10%至20%左右之高編輯比率。
針對編輯部位5’端旁之核苷酸為A之Rluc_sRNA，使用實施例98及99之化合物時之編輯比率(%)顯示於圖22。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示5%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示25%至35%左右之高編輯比率。
(試驗例35)實施例化合物之gRNA之培養細胞內之A1AT基因序列之編輯誘導能力評估
除了建構以下表現A1AT基因之標的RNA表現質體、使用實施例72至74之化合物作為gRNA、及使用對應於A1AT基因之引子以外，使用與試驗例10之(A)及(B)相同之方法，編輯分析中係使用與試驗例29所述之編輯分析相同之方法。此處所使用之A1AT(亦稱為SERPINA1)基因序列具有GenBank accession no. NM_000295.5之第1129至1153個鹼基之序列，更具有被稱為c.1096G>A之核苷酸之突變(rs28929474)。
使用實施例136之化合物(AD1_A1AT.39)時之編輯比率(%)顯示於圖23A。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR2之質體一起轉染時，顯示20%左右之高編輯比率。將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110或ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示40%至50%左右之高編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之A1AT基因序列。
(試驗例36)實施例化合物之gRNA之培養細胞內之A1AT基因序列之編輯誘導能力評估
此處所使用之A1AT(亦稱為SERPINA1)基因序列具有GenBank accession no.NM_000295.5之鹼基序列，再者，Z-A1AT具有被稱為c.1096G>A之核苷酸之突變(rs28929474)。
(A)A1AT及Z-A1AT表現質體之合成
使用Sepasol RNA I SuperG(Nacalai公司)，自HepG2細胞萃取所有RNA，使用重組DNase I(TaKaRa)進行DNase處理後，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化。進行經使用PrimeScript II反轉錄酶(TaKaRa)、所有RNA 0.5μg、0.25μM Oligo(dT)17之轉錄反應，將cDNA增幅使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、SERPINA1_CDS_XbaF1引子(序列編號80)、SERPINA1_CDS_HinR1引子(序列編號81)進行PCR(循環30次；變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，1分30秒)，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化，獲得具有SERPINA1之CDS序列(SERPINA1_CDS)(序列編號88)之DNA。將pUC19及所得之DNA使用XbaI(TaKaRa)及HindIII(TaKaRa)於37℃進行反應1小時後，藉由酚/氯仿萃取，乙 醇沉澱而純化。以嵌入DNA：質體為莫耳比3：1之方式添加，使用DNA接合套組<Mighty Mix>(TaKaRa)進行接合反應。將所得之接合樣品轉形至DH5 α，使用LB瓊脂培養基於37℃培養一晚。將經篩選之殖株使用LB液體培養基於37℃培養一晚，使用QIAprep Spin Miniprep套組(QIAGEN)萃取質體。將所得之質體100ng使用bigdye terminator v3.1循環定序套組(Thermo)、0.165μM之pUC19-seqF01引子(序列編號82)及0.165μM之pUC19_seqR01引子(序列編號83)進行接合反應，藉由Applied Biosystems 3500基因分析儀(Thermo)進行序列分析，確認已合成pUC19_SERPINA1。
以pUC19_SERPINA1作為模板股，5’端片段使用SERPINA1_CDS_XbaF1引子(序列編號80)與SERPINA1_G1096A_R1引子(序列編號84)，3’端片段使用SERPINA1_G1096A_F1引子(序列編號85)與SERPINA1_CDS_HinR1引子(序列編號81)，藉由PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)進行第一PCR。接著，各自之PCR產物稀釋100倍，使用SERPINA1_CDS_XbaF1引子(序列編號80)及SERPINA1_CDS_HinR1引子(序列編號81)，藉由PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)進行第二PCR(循環30次；變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，1分30秒)，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化，獲得具有SERPINA1之G1096突變成A之序列之DNA(SERPINA1_G1096A)(序列編號89)。又，以pUC19_SERPINA1作為模板股，使用SERPINA1_CDS_XbaF1引子(序列編號80)及SERPINA1_CDS_HinR1引子(序列編號81)，藉由PrimeSta GXL DNA聚合酶(TaKaRa)進營PCR(循環30次；變性：98℃，10秒；引子黏合：55℃，15秒；延長：68℃，1分30秒)，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化，獲得SERPINA1之CDS序列(SERPINA1_CDS)(序列編號88)。將該等所得之DNA及pcDNA3.1(-)Hygro使用XbaI(TaKaRa)及HindIII(TaKaRa)於37℃進行反應1小時後，藉由酚/氯仿萃取，乙醇沉澱而純化。以嵌入DNA： 質體為莫耳比3：1之方式添加，使用DNA接合套組<Mighty Mix>(TaKaRa)進行接合反應。將所得之接合樣品轉形至DH5 α，使用LB瓊脂培養基於37℃培養一晚。將經篩選之殖株使用LB液體培養基於37℃培養一晚，使用QIAprep Spin Miniprep套組(QIAGEN)萃取質體。將所得之質體100ng使用bigdye terminator v3.1循環定序套組(Thermo)、0.165μM之pcDNA3_1pro_F01引子(序列編號86)及0.165μM之pcDNA31-seqR01引子(序列編號87)進行接合反應，藉由Applied Biosystems 3500基因分析儀(Thermo)進行序列分析，確認已合成pcDNA3.1(-)Hygro_SERPINA1_G1096A及pcDNA3.1(-)Hygro_SERPINA1。
Figure 110145878-A0202-12-0132-57
Figure 110145878-A0202-12-0133-58
(B)細胞培養將HeLa細胞以5.0×104細胞/孔之方式繼代於24孔盤
使用含10%FBS之DMEM(SIGMA)將HEK293細胞以1.0×105細胞/孔之方式繼代於24孔盤，進行48小時培養。使用PBS(-)(Nacalai公司)清洗一次，將培養基交換成含0.2%FBS之DMEM(SIGMA)。使用Lipofectamine 3000(Thermo)將50ng之表現標的RNA之質體(pcDNA3.1(-)Hygro_SERPINA1_G1096A、或pcDNA3.1(-)Hygro_SERPINA1)、500ng之表現ADAR之質體(pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p110或pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p150)、50nM之實施例化合物之gRNA進行轉染，進行48小時培養。
(C)編輯分析及其結果
使用RNeasy Plus Mini套組(QIAGEN)，自培養於24孔盤之細胞萃取所有RNA。進行經使用ReverTra Ace(註冊商標)qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO)、所有RNA 0.5μg之反轉錄反應，將cDNA增幅。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、SERPINA1_1stF01引子(序列編號90)、SERPINA1_CDS_HinR1引子(序列編號91)進行第一PCR。以第一PCR產物經稀釋400倍之cDNA作為模板股，使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、SERPINA1_2ndF01引子(序列編號92)、SERPINA1_2ndR01引子(序列編號93)進行第二PCR，增幅SERPINA1片段。使用bigdye terminator v3.1循環定序套組、0.165μM SERPINA1_editF01引子(序列編號94)進行接合反應，藉由Applied Biosystem 3500基因分析儀進行分析。藉由定序所得之層析圖表，自標的部位之峰高比(G/(G+A))算出編輯比率。
使用實施例136之化合物(AD1_A1AT.39)時之編輯比率(%)顯示於圖23B。轉染標的RNA(Z-A1AT)表現質體及實施例化合物之gRNA時，顯示5%左右之高編輯比率。又，將標的RNA表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p110之質體一起轉染時，顯示60%左右之高編輯比率。再者，將標的RNA 表現質體及實施例化合物之gRNA與表現ADAR1p150之質體一起轉染時，顯示80%左右之高編輯比率。本實施例之化合物顯示可修復經突變之A1AT基因序列。
Figure 110145878-A0202-12-0135-60
(D)經ELISA之A1AT分泌量之分析及其結果
轉染後，進行48小時培養，回收培養基，於4℃以3000×g進行離心10分鐘。使用培養基50μL及人類α 1抗胰蛋白酶(SERPINA1)ELISA套組(abcam)，根據附錄之公司實驗方案，測定A1AT分泌量。吸光度測定中係使用Nivo多功能微量盤檢測儀(PerkinElmer)。
使用實施例136之化合物(AD1_A1AT.39)時之培養基中之A1AT分泌量顯示於圖24。將表現ADAR1p110之質體與標的RNA(Z-A1AT)表現質體一起轉染時，培養基中所分泌之A1AT量係轉染表現正常A1AT之質體時之培養基所分泌之A1AT量的30%左右。又，將表現ADAR1p110之質體、與標的RNA(Z-A1AT)表現質體及實施例136之化合物同時轉染時，培養基中所分泌之A1AT量回復至與轉染表現正常A1AT之質體時之培養基所分泌之A1AT量相同程度。
再者，將表現ADAR1p110及ADAR1p150之質體與標的RNA(Z-A1AT)表現質體一起轉染時，培養基中所分泌之A1AT量係轉染表現正常A1AT 之質體時之培養基所分泌之A1AT量之30%左右。又，將表現ADAR1p110及ADAR1p150之質體、與標的RNA(Z-A1AT)表現質體及實施例136之化合物同時轉染時，培養基中所分泌之A1AT量回復至與轉染表現正常A1AT之質體時之培養基所分泌之A1AT量相同程度。
由(C)所示之RNA編輯活性之結果及(D)所示之A1AT分泌量之分析結果考慮，實施例136之化合物被認為可將細胞內Z-A1AT之mRNA之突變修復成正常之A1AT mRNA，還可自細胞分泌出正常量之正常A1AT蛋白質。
日本專利申請第2020-203658號(申請日：2020年12月8日)、日本專利申請第2021-157151號(申請日：2021年9月27日)之記載係藉由參照其全文而併入本說明書。本說明書所述之所有文獻、專利申請、及技術規格，與藉由參照各別文獻、專利申請、及技術規格所併入者具體且各別記載時之相同程度地藉由參照而併入本說明書。
<110> 學校法人福岡大學(FUKUOKA UNIVERSITY) 日商第一三共股份有限公司(DAIICHI SANKYO COMPANY,LIMITED)
<120> 經導入化學修飾核酸之穩定型標的編輯引導RNA(Stable target editing guide RNA with chemically modified nucleic acid)
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<160> 112
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 1
Figure 110145878-A0202-12-0137-61
<210> 2
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 標的
<400> 2
Figure 110145878-A0202-12-0137-63
<210> 3
<211> 200
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 標的hGAPDH
<400> 3
Figure 110145878-A0202-12-0137-64
Figure 110145878-A0202-12-0138-67
<210> 4
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 4
Figure 110145878-A0202-12-0138-66
<210> 5
<211> 910
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 標的Rluc WT
<400> 5
Figure 110145878-A0202-12-0138-65
Figure 110145878-A0202-12-0139-68
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 6
Figure 110145878-A0202-12-0139-69
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 7
Figure 110145878-A0202-12-0139-70
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 8
Figure 110145878-A0202-12-0139-71
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 9
Figure 110145878-A0202-12-0139-73
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 10
Figure 110145878-A0202-12-0140-78
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 11
Figure 110145878-A0202-12-0140-77
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 12
Figure 110145878-A0202-12-0140-76
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 13
Figure 110145878-A0202-12-0140-75
<210> 14
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 標的Rluc mt
<400> 14
Figure 110145878-A0202-12-0140-74
Figure 110145878-A0202-12-0141-79
<210> 15
<211> 279
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 標的s
<400> 15
Figure 110145878-A0202-12-0141-80
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 16
Figure 110145878-A0202-12-0142-81
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 17
Figure 110145878-A0202-12-0142-82
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 18
Figure 110145878-A0202-12-0142-83
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 19
Figure 110145878-A0202-12-0142-84
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 20
Figure 110145878-A0202-12-0142-85
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 21
Figure 110145878-A0202-12-0143-86
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 22
Figure 110145878-A0202-12-0143-87
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 23
Figure 110145878-A0202-12-0143-88
<210> 24
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 24
Figure 110145878-A0202-12-0143-89
<210> 25
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 25
Figure 110145878-A0202-12-0143-90
<210> 26
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 26
Figure 110145878-A0202-12-0144-141
<210> 27
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 27
Figure 110145878-A0202-12-0144-142
<210> 28
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 28
Figure 110145878-A0202-12-0144-143
<210> 29
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 29
Figure 110145878-A0202-12-0144-92
<210> 30
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 30
Figure 110145878-A0202-12-0144-91
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 31
Figure 110145878-A0202-12-0145-144
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 32
Figure 110145878-A0202-12-0145-145
<210> 33
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 33
Figure 110145878-A0202-12-0145-93
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 34
Figure 110145878-A0202-12-0145-146
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 35
Figure 110145878-A0202-12-0146-147
<210> 36
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 36
Figure 110145878-A0202-12-0146-94
<210> 37
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 37
Figure 110145878-A0202-12-0146-95
<210> 38
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 38
Figure 110145878-A0202-12-0146-96
<210> 39
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 39
Figure 110145878-A0202-12-0146-97
<210> 40
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 40
Figure 110145878-A0202-12-0147-148
<210> 41
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 41
Figure 110145878-A0202-12-0147-149
<210> 42
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 42
Figure 110145878-A0202-12-0147-150
<210> 43
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 43
Figure 110145878-A0202-12-0147-151
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 44
Figure 110145878-A0202-12-0147-152
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 45
Figure 110145878-A0202-12-0148-153
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 46
Figure 110145878-A0202-12-0148-154
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 47
Figure 110145878-A0202-12-0148-155
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 48
Figure 110145878-A0202-12-0148-157
<210> 49
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子(factor)V的gRNA
<400> 49
Figure 110145878-A0202-12-0148-158
<210> 50
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAH.1的gRNA
<400> 50
Figure 110145878-A0202-12-0149-159
<210> 51
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASS1的gRNA
<400> 51
Figure 110145878-A0202-12-0149-160
<210> 52
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFAP的gRNA
<400> 52
Figure 110145878-A0202-12-0149-161
<210> 53
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CBS的gRNA
<400> 53
Figure 110145878-A0202-12-0149-162
<210> 54
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GRIA2的gRNA
<400> 54
Figure 110145878-A0202-12-0150-163
<210> 55
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLCO2A1的gRNA
<400> 55
Figure 110145878-A0202-12-0150-164
<210> 56
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RL_A287_GC的gRNA
<400> 56
Figure 110145878-A0202-12-0150-165
<210> 57
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RL_A287_GG的gRNA
<400> 57
Figure 110145878-A0202-12-0150-166
<210> 58
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RL_A287_U的gRNA
<400> 58
Figure 110145878-A0202-12-0150-167
<210> 59
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RL_A287_A的rRNA
<400> 59
Figure 110145878-A0202-12-0151-168
<210> 60
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAH.2的gRNA
<400> 60
Figure 110145878-A0202-12-0151-169
<210> 61
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PANK2的gRNA
<400> 61
Figure 110145878-A0202-12-0151-170
<210> 62
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NPHS2的gRNA
<400> 62
Figure 110145878-A0202-12-0151-171
<210> 63
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A1AT的gRNA
<400> 63
Figure 110145878-A0202-12-0151-172
<210> 64
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 64
Figure 110145878-A0202-12-0152-173
<210> 65
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RV引子
<400> 65
Figure 110145878-A0202-12-0152-174
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 66
Figure 110145878-A0202-12-0152-175
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 67
Figure 110145878-A0202-12-0152-176
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 68
Figure 110145878-A0202-12-0152-177
<210> 69
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 69
Figure 110145878-A0202-12-0153-178
<210> 70
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 70
Figure 110145878-A0202-12-0153-179
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 71
Figure 110145878-A0202-12-0153-180
<210> 72
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rluc_sRNA_G286A_Eco/Hind
<400> 72
Figure 110145878-A0202-12-0153-182
<210> 73
<211> 279
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rluc_sRNA_G286A
<400> 73
Figure 110145878-A0202-12-0154-183
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 74
Figure 110145878-A0202-12-0154-184
<210> 75
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 75
Figure 110145878-A0202-12-0154-185
<210> 76
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 76
Figure 110145878-A0202-12-0154-186
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 77
Figure 110145878-A0202-12-0155-187
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 78
Figure 110145878-A0202-12-0155-188
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 79
Figure 110145878-A0202-12-0155-189
<210> 80
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 80
Figure 110145878-A0202-12-0155-190
<210> 81
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 81
Figure 110145878-A0202-12-0155-192
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 82
Figure 110145878-A0202-12-0156-193
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 83
Figure 110145878-A0202-12-0156-194
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 84
Figure 110145878-A0202-12-0156-195
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 85
Figure 110145878-A0202-12-0156-196
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 86
Figure 110145878-A0202-12-0157-197
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 87
Figure 110145878-A0202-12-0157-198
<210> 88
<211> 1275
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERPINA1_CDS
<400> 88
Figure 110145878-A0202-12-0157-199
Figure 110145878-A0202-12-0158-200
<210> 89
<211> 1275
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERPINA1_G1096A
<400> 89
Figure 110145878-A0202-12-0158-201
Figure 110145878-A0202-12-0159-202
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 90
Figure 110145878-A0202-12-0159-203
<210> 91
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 91
Figure 110145878-A0202-12-0159-204
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 92
Figure 110145878-A0202-12-0159-205
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 93
Figure 110145878-A0202-12-0159-206
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 94
Figure 110145878-A0202-12-0160-207
<210> 95
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 95
Figure 110145878-A0202-12-0160-208
<210> 96
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 96
Figure 110145878-A0202-12-0160-209
<210> 97
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 97
Figure 110145878-A0202-12-0160-210
<210> 98
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 98
Figure 110145878-A0202-12-0161-211
<210> 99
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 99
Figure 110145878-A0202-12-0161-212
<210> 100
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 100
Figure 110145878-A0202-12-0161-213
<210> 101
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 101
Figure 110145878-A0202-12-0161-214
<210> 102
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 102
Figure 110145878-A0202-12-0161-215
<210> 103
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 103
Figure 110145878-A0202-12-0162-216
<210> 104
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 104
Figure 110145878-A0202-12-0162-217
<210> 105
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 105
Figure 110145878-A0202-12-0162-218
<210> 106
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 106
Figure 110145878-A0202-12-0162-219
<210> 107
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 107
Figure 110145878-A0202-12-0162-220
<210> 108
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 108
Figure 110145878-A0202-12-0163-221
<210> 109
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 109
Figure 110145878-A0202-12-0163-222
<210> 110
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 110
Figure 110145878-A0202-12-0163-223
<210> 111
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 111
Figure 110145878-A0202-12-0163-224
<210> 112
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 112
Figure 110145878-A0202-12-0163-225

Claims (47)

  1. 一種寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其包含識別標的RNA之第一寡核苷酸、及與前述第一寡核苷酸5’端連結之第二寡核苷酸，其中，
    前述第一寡核苷酸包含對應前述標的RNA中之腺苷酸殘基之對應標的之核苷酸殘基、與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結並具有與前述標的RNA互補之鹼基序列的10至24個殘基之寡核苷酸、以及與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結並具有與前述標的RNA互補之鹼基序列的3至6個殘基之寡核苷酸，
    前述第二寡核苷酸係於其3’末端缺失對應前述標的RNA之核苷酸殘基的核苷酸殘基、或是具有不與前述標的RNA之核苷酸殘基形成互補對的核苷酸殘基，
    前述第二寡核苷酸之殘基數為2至10，至少其3’末端以外之核苷酸殘基與前述標的RNA形成互補之雙股結構，
    該寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽具有包含前述對應標的之核苷酸殘基、以及其3’端及5’端之各1個殘基之計數區域，
    與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之核苷酸殘基為2’-去氧核苷酸殘基，
    在與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸中，自前述對應標的之核苷酸朝3’方向算起之第3個核苷酸殘基為2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基，
    該寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽係誘導針對前述標的RNA之特異性位點編輯(Site-specific editing)。
  2. 如請求項1所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸之殘基數為4至8。
  3. 如請求項1或2所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸之3’末端缺失對應前述標的RNA之核苷酸殘基的核苷酸殘基。
  4. 如請求項1至3中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述特異性位點編輯係起因於腺苷酸去胺酶1所致之酵素反應。
  5. 如請求項1至4中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係於前述第一寡核苷酸與第二寡核苷酸之間包含含烯氧基單元之連結部。
  6. 如請求項1至5中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸包含硫代磷酸酯鍵。
  7. 如請求項1至6中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸包含選自由2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、2’-去氧-2’-氟核糖核苷酸殘基、交聯型核苷酸殘基、及2’-去氧核糖核苷酸所成群組中之至少1種修飾核苷酸殘基。
  8. 如請求項1至7中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述計數區域包含硫代磷酸酯鍵。
  9. 如請求項1至8中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述對應標的之核苷酸殘基包含硫代磷酸酯鍵。
  10. 如請求項1至9中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結之核苷酸殘基為2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、或去氧核苷酸殘基。
  11. 如請求項1至10中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸包含選自由2’-O-烷基核糖核苷酸殘基、2’-去氧-2’-氟核糖核苷酸殘基、及交聯型核苷酸殘基所成群組中之至少1種修飾核苷酸殘基。
  12. 如請求項1至11中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸係具有2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
  13. 如請求項1至12中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸係具有交聯型核苷酸殘基與2’-O-烷基核糖核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
  14. 如請求項1至13中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，與前述對應標的之核苷酸殘基的3’端連結之寡核苷酸係具有2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
  15. 如請求項1至14中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，於前述第一寡核苷酸中，與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結之寡核苷酸，係具有連結2’-O-烷基核糖核苷酸殘基之鹼基序列。
  16. 如請求項1至15中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，於前述第一寡核苷酸中，與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結之寡核苷酸，係具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
  17. 如請求項1至16中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，於前述第一寡核苷酸中，與前述對應標的之核苷酸殘基的5’端連結之寡核苷酸，係具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
  18. 如請求項1至17中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸係具有連結2’-O-烷基核糖核苷酸殘基之鹼基序列。
  19. 如請求項1至18中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸係具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
  20. 如請求項1至19中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸係具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與2’-去氧-2’-氟核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
  21. 如請求項1至20中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述標的RNA中胞苷酸殘基與作為編輯標的之腺苷酸殘基的5’端連結，
    前述第一寡核苷酸中與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之核苷酸殘基為2’-去氧肌苷酸殘基。
  22. 如請求項1至20中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述標的RNA中，脲苷酸殘基與作為編輯標的之腺苷腺苷酸殘基5’端連結，
    前述第一寡核苷酸中與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之核苷酸殘基為2’-去氧腺苷酸殘基。
  23. 如請求項1至20中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述標的RNA中，腺苷酸殘基與作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端連結，
    前述第一寡核苷酸中與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之核苷酸殘基為胸苷酸殘基或2’-去氧脲苷酸殘基。
  24. 如請求項1至20中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述標的RNA中，鳥苷酸殘基與作為編輯標的之腺苷酸殘基5’端連結，
    前述第一寡核苷酸中與對應標的之核苷酸殘基3’端連結之核苷酸殘基為2’-去氧肌苷酸殘基。
  25. 如請求項1至24中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述對應標的之核苷酸殘基為N-烷基嘧啶核苷酸殘基或2’-去氧胞苷酸殘基。
  26. 如請求項1至25中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸及第二寡核苷酸分別係核苷酸殘基以硫代磷酸酯鍵連結而成者。
  27. 如請求項1至26中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸中，於從前述對應標的之核苷酸朝3’方向數第10個以後之核苷酸殘基係具有交聯型核苷酸殘基。
  28. 如請求項27所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第一寡核苷酸中，包含從前述對應標的之核苷酸朝3’方向數第10個以後之核苷酸殘基之寡核苷酸，係具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
  29. 如請求項1至28中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸中，於從其3’末端之核苷酸殘基朝5’方向數第2個以後之核苷酸殘基係具有交聯型核苷酸殘基。
  30. 如請求項29所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述第二寡核苷酸中，包含從其3’末端之核苷酸殘基朝5’方向數第2個以後核苷酸殘基之寡核苷酸，係具有2’-O-烷基核糖核苷酸殘基與交聯型核苷酸殘基相互連結之鹼基序列。
  31. 如請求項1至30中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係下列式之任一者所示者：
    U(M)^T(L)^G(M)^A(L)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(L)^U(M)^T(L)^G(M) (AD1_ASS1.39)、
    A(M)^A(L)^G(M)^A(L)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^U(M) (AD1_PANK2.39)、
    A(M)^T(L)^G(M)^T(L)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(L)^A(M)^C(L)^U(M) (AD1_NPHS2.39)、
    G(M)^C(L)^A(M)^T(L)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^C(M) (AD1_GRIA2.39)、
    U(M)^G(L)^A(M)^U(L)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(L)^G(M)^U(L)^U(M) (AD1_ASS1.52)、
    G(M)^C(E)^A(M)^T(E)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^C(M) (AD1_GRIA2.39e)、
    U(M)^T(E)^G(M)^A(E)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(E)^U(M)^T(E)^G(M) (AD1_ASS1.39e)、
    A(M)^A(E)^G(M)^A(E)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^U(M) (AD1_PANK2.39e)、
    A(M)^T(E)^G(M)^T(E)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(E)^A(M)^C(E)^U(M) (AD1_NPHS2.39e)、
    C(M)^(E)^U(M)^C(E)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M) (AD1_GRIA2.52e)、
    U(M)^G(E)^A(M)^T(E)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(E)^G(M)^T(E)^U(M) (AD1_ASS1.52e)、
    A(M)^G(E)^A(M)^A(E)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M) (AD1_PANK2.52e)、
    U(M)^G(E)^U(M)^C(E)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^T(E)^U(M)^A(E)^C(M) (AD1_NPHS2.52e)、
    G(M)^T(L)^C(M)^C(L)^C(M)^U(F)^U(F)^C(M)^U(M)^c^i^U(M)^C(F)^G(M)^A(F)^U(M)^G(F)^G(M)^U(F)^C(M)^A(L)^G(M)^C(L)^A(M) (AD1_A1AT.39)；
    式中，大寫文字表示核糖核苷酸殘基，小寫文字表示2’-去氧核糖核苷酸殘基，N(M)表示2’-O-甲基-核糖核苷酸殘基，N(F)表示2’-氟-2’-去氧核糖核苷酸殘基，N(L)表示2’-O,4’-C-亞甲基化核糖核苷酸殘基，N(E)表示2’-O,4’-C-伸乙基化核糖核苷酸殘基，「^」表示核苷單元間以-P(=S)(OH)鍵結。
  32. 如請求項1至31中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述寡核苷酸及其醫藥上可接受之鹽係於5’末端或3’末端中，包含GalNAc、膽固醇及脂肪酸之傳遞分子係藉由連結子或磷酸二酯鍵(包含硫代磷酸酯鍵)鍵結。
  33. 一種用於治療與前述標的RNA關聯之疾病之遺傳性疾病治療劑，係含有請求項1至32中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
  34. 一種用於治療與前述標的RNA關聯之疾病之醫藥組成物，係含有作為活性成分之請求項1至32中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
  35. 如請求項34所述之醫藥組成物，係用於遺傳性疾病之預防、或治療。
  36. 如請求項35所述之醫藥組成物，其中，前述遺傳性疾病為可藉由將前述標的RNA之腺苷酸殘基轉變成肌苷酸殘基而治療之疾病。
  37. 如請求項35所述之醫藥組成物，其中，前述遺傳性疾病係原因為基因中鳥苷酸殘基突變成腺苷酸殘基的遺傳性疾病。
  38. 一種請求項1至32中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽之用途，係用於製造與前述標的RNA關聯之疾病之預防用、或治療用醫藥。
  39. 如請求項1至32中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，係用於與前述標的RNA關聯之疾病之預防或治療之用途。
  40. 一種用於與前述標的RNA關聯之疾病之預防或治療方法，係將請求項1至32中之任一項所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽之藥理學上之有效量投予至溫血動物。
  41. 如請求項40所述之方法，其中，前述疾病為遺傳性疾病。
  42. 如請求項41所述之方法，其中，前述遺傳性疾病為可藉由將標的RNA之腺苷酸殘基轉變成肌苷酸殘基而治療之疾病。
  43. 如請求項41所述之方法，其中，前述遺傳性疾病係原因為基因中鳥苷酸殘基突變成腺苷酸殘基的遺傳性疾病。
  44. 如請求項34至37中之任一項所述之醫藥組成物，其中，前述疾病包含選自由I型瓜胺酸血症、血友病(血栓症)、ALS、與泛酸鹽激酶關聯之神經退化性疾病、高胱胺酸尿症、局部節段型腎絲球硬化症、α 1抗胰蛋白酶缺乏症、苯酮尿症、厚皮性骨膜病、亞歷山大氏病、原發性高草酸尿症、吉伯特氏(Gilbert)症候群、視網膜色素病變、遠端肌病變及血色沉著病所成群組中之至少1種疾病。
  45. 如請求項38所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽之用途，其中，前述疾病包含選自由I型瓜胺酸血症、血友病(血栓症)、ALS、與泛酸鹽激酶關聯之神經退化性疾病、高胱胺酸尿症、局部節段型腎絲球硬化症、α 1抗胰蛋白酶缺乏症、苯酮尿症、厚皮性骨膜病、亞歷山大氏病、原發性高草酸尿症、吉伯特氏症候群、視網膜色素病變、遠端肌病變及血色沉著病所成群組中之至少1種疾病。
  46. 如請求項39所述之寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，其中，前述疾病包含選自由I型瓜胺酸血症、血友病(血栓症)、ALS、與泛酸鹽激酶關聯之神經退化性疾病、高胱胺酸尿症、局部節段型腎絲球硬化症、α 1抗胰蛋白酶缺乏症、苯酮尿症、厚皮性骨膜病、亞歷山大氏病、原發性高草酸尿症、吉伯特氏症候群、視網膜色素病變、遠端肌病變及血色沉著病所成群組中之至少1種疾病。
  47. 如請求項40至43中之任一項所述之方法，其中，前述疾病包含選自由I型瓜胺酸血症、血友病(血栓症)、ALS、與泛酸鹽激酶關聯之神經退化性疾病、高胱胺酸尿症、局部節段型腎絲球硬化症、α 1抗胰蛋白酶缺乏症、苯酮尿症、厚皮性骨膜病、亞歷山大氏病、原發性高草酸尿症、吉伯特氏症候群、視網膜色素病變、遠端肌病變及血色沉著病所成群組中之至少1種疾病。
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