CN117120606A - 导入化学修饰核酸的稳定型靶标编辑向导rna - Google Patents

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CN117120606A
CN117120606A CN202180092131.5A CN202180092131A CN117120606A CN 117120606 A CN117120606 A CN 117120606A CN 202180092131 A CN202180092131 A CN 202180092131A CN 117120606 A CN117120606 A CN 117120606A
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福田将虎
小泉诚
岩下真三
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Daiichi Sankyo Co Ltd
Fukuoka University
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Daiichi Sankyo Co Ltd
Fukuoka University
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Abstract

提供可在细胞内诱导ADAR的编辑活性、在生物体内的稳定性优异的寡聚核苷酸。寡聚核苷酸包含识别靶标RNA的第一寡聚核苷酸和与其5’侧连接的第二寡聚核苷酸。第一寡聚核苷酸由靶标对应核苷酸残基、3’侧的10‑24个残基的寡聚核苷酸和5’侧的3‑6个残基的寡聚核苷酸构成。第二寡聚核苷酸在3’末端缺失与靶标RNA对应的核苷酸残基，或者是具有不形成互补对的核苷酸残基，残基数为2～10个。靶标对应核苷酸残基的3’侧为2’‑脱氧核苷酸残基，靶标对应核苷酸残基的3’侧的寡聚核苷酸从靶标对应核苷酸起在3’方向第3位的核苷酸残基为2’‑脱氧‑2’‑氟核苷酸残基。

Description

导入化学修饰核酸的稳定型靶标编辑向导RNA
技术领域
本发明涉及导入化学修饰核酸的稳定型靶标编辑向导RNA。
背景技术
以基因组编辑技术的开发为契机，通过改变作为生物设计图的遗传信息，也就是细胞内的DNA信息来控制生命现象的方法已经开始在医疗或药物开发领域中用作疾病治疗的途径。由于DNA是细胞内恒定且不变的分子，所以DNA改变的效果永久地保留在目标细胞或目标生物中。另一方面，RNA是暂时性的遗传信息分子。因此，RNA信息的改变可给予目标生物非永久性的、暂时性的遗传信息改变的效果。
作为RNA修饰技术，例如在国际公开第2016/097212号中记载了用于靶标RNA序列中的核苷酸的位点特异性编辑的寡聚核苷酸构建体，其包含靶标指向性部分和募集部分，所述靶标指向性部分包含与靶标RNA的一部分互补的反义序列，所述募集部分存在于细胞中，可结合并募集到可进行核苷酸的编辑的RNA编辑实体上。另外，例如在国际公开第2017/010556号中记载了使双链特异性腺苷脱氨酶(ADAR)作用于靶标RNA和靶标编辑向导RNA的复合物的位点特异性RNA突变导入方法。另外，在Nature Biotechnology 37,133-138(2019)中记载了在募集ADAR的反义寡聚核苷酸中导入修饰核酸的技术。
作为具有RNA编辑活性的腺苷脱氨酶，已知ADAR1和ADAR2的同工型，认为它们在生物体内细胞种特异性地表达。例如，ADAR1在人骨骼肌细胞中几乎不表达。另一方面，ADAR2在人骨髓细胞中几乎不表达。另外，一般认为在人细胞内ADAR1表达得更多。
发明内容
发明所要解决的课题
认为若可在细胞内诱导ADAR1的编辑活性，则可进行细胞种类特异性的RNA编辑。另外，认为可在人的细胞中进行更有效的RNA编辑。因此，本发明的一个方式的目的在于提供可在细胞内诱导ADAR1的编辑活性、在生物体内的稳定性优异的寡聚核苷酸。
解决课题的手段
用于解决所述课题的具体手段如下所示，本发明包含以下方式。
(1-1)诱导针对靶标RNA的位点特异性编辑的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含识别靶标RNA的第一寡聚核苷酸和与所述第一寡聚核苷酸的5’侧连接的第二寡聚核苷酸，所述第一寡聚核苷酸由与所述靶标RNA中的腺苷残基对应的靶标对应核苷酸残基、与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的具有与所述靶标RNA互补的碱基序列的10～24个残基的寡聚核苷酸以及与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的具有与所述靶标RNA互补的碱基序列的3～6个残基的寡聚核苷酸构成，所述第二寡聚核苷酸在其3’末端缺失与所述靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基，或者是具有不与所述靶标RNA的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基，所述第二寡聚核苷酸的残基数为2～10个，至少其3’末端以外的核苷酸残基与所述靶标RNA形成互补的双链结构，选自由所述靶标对应核苷酸残基以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的计数区域的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基。
(1-2)根据(1-1)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸的残基数为4～8个。
(1-3)根据(1-1)或(1-2)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸的3’末端缺失与所述靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基。
(1-4)根据(1-1)至(1-3)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述位点特异性编辑是由腺苷脱氨酶1所致的酶反应引起的。
(1-5)根据(1-1)至(1-4)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述第一寡聚核苷酸与第二寡聚核苷酸之间包含含有亚烷基氧基单元的连接部。
(1-6)根据(1-1)至(1-5)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸包含硫代磷酸酯键。
(1-7)根据(1-1)至(1-6)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸中的至少1种修饰核苷酸残基。
(1-8)根据(1-1)至(1-7)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述计数区域包含硫代磷酸酯键。
(1-9)根据(1-1)至(1-8)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标对应核苷酸残基包含硫代磷酸酯键。
(1-10)根据(1-1)至(1-9)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述靶标对应核苷酸残基的3’侧和5’侧的各1个残基中至少1个残基为2’-O-烷基核糖核苷酸残基或脱氧核苷酸残基。
(1-11)根据(1-1)至(1-10)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
(1-12)根据(1-1)至(1-11)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(1-13)根据(1-12)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸中，从所述靶标对应核苷酸起沿3’方向计数的第3位的核苷酸残基为2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基。
(1-14)根据(1-1)至(1-11)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸具有交联型核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(1-15)根据(1-14)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸中，从所述靶标对应核苷酸起沿3’方向计数的第3位的核苷酸残基为交联型核苷酸残基。
(1-16)根据(1-1)至(1-11)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(1-17)根据(1-16)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸中，从所述靶标对应核苷酸起沿3’方向计数的第3位的核苷酸残基为2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基。
(1-18)根据(1-1)至(1-17)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述第一寡聚核苷酸中，与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基连接的碱基序列。
(1-19)根据(1-1)至(1-17)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述第一寡聚核苷酸中，与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(1-20)根据(1-1)至(1-17)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述第一寡聚核苷酸中，与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(1-21)根据(1-1)至(1-20)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基连接的碱基序列。
(1-22)根据(1-1)至(1-20)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(1-23)根据(1-1)至(1-20)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(1-24)根据(1-1)至(1-23)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标RNA在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有胞苷残基，所述第一寡聚核苷酸在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的核苷酸残基具有次黄嘌呤残基作为碱基。
(1-25)根据(1-1)至(1-24)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标对应核苷酸残基为N-烷基嘧啶核苷酸残基。
(1-26)根据(1-1)至(1-25)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸分别是核苷酸残基通过硫代磷酸酯键连接而成的。
(1-27)遗传性疾病治疗剂，其含有根据(1-1)至(1-26)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐。
(1-28)药物组合物，其含有根据(1-1)至(1-26)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐作为活性成分。
(1-29)根据(1-28)所述的药物组合物，其用于遗传性疾病的预防或治疗。
(1-30)根据(1-29)所述的药物组合物，其中所述遗传性疾病是可通过将靶标RNA中的腺苷残基转换为肌苷残基来治疗的疾病。
(1-31)根据(1-29)所述的药物组合物，其中所述遗传性疾病是以基因中的鸟苷残基向腺苷残基的突变为原因的遗传性疾病。
(1-32)根据(1-1)至(1-26)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐用于制造用于预防或治疗疾病的药物的用途。
(1-33)根据(1-1)至(1-26)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其用于预防或治疗疾病的用途。
(1-34)用于预防或治疗疾病的方法，其通过将药理学有效量的根据(1-1)至(1-26)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药理上可接受的盐对恒温动物进行给药来预防或治疗疾病。
(1-35)根据(1-34)所述的方法，其中所述疾病为遗传性疾病。
(1-36)根据(1-35)所述的方法，其中所述遗传性疾病是可通过将靶标RNA中的腺苷残基转换为肌苷残基来治疗的疾病。
(1-37)根据(1-35)所述的方法，其中所述遗传性疾病是以基因中的鸟苷残基向腺苷残基的突变为原因的遗传性疾病。
(1-38)根据(1-34)至(1-37)中任一项所述的方法，其中所述恒温动物为人。
(1-39)诱导针对所述靶标RNA的位点特异性编辑的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含识别靶标RNA的第一寡聚核苷酸、与所述第一寡聚核苷酸的5’侧连接的第二寡聚核苷酸以及将所述第一寡聚核苷酸和所述第二寡聚核苷酸连接的包含亚烷基氧基单元的连接部，所述第一寡聚核苷酸由与所述靶标RNA中的腺苷残基对应的靶标对应核苷酸残基、与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的具有与所述靶标RNA互补的碱基序列的10～24个残基的寡聚核苷酸以及与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的具有与所述靶标RNA互补的碱基序列的3～6个残基的寡聚核苷酸构成，所述第二寡聚核苷酸的残基数为2～10个，在其3’末端缺失与所述靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基，或者是具有不与所述靶标RNA的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基，至少其3’末端以外的核苷酸残基与所述靶标RNA形成互补的双链结构，或者是具有与所述靶标RNA互补的碱基序列而与所述靶标RNA形成互补的双链结构，选自由所述靶标对应核苷酸残基以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的计数区域的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基。
(2-1)诱导针对靶标RNA的位点特异性编辑的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含识别靶标RNA的第一寡聚核苷酸和与所述第一寡聚核苷酸的5’侧连接的第二寡聚核苷酸，所述第一寡聚核苷酸由与所述靶标RNA中的腺苷残基对应的靶标对应核苷酸残基、与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的具有与所述靶标RNA互补的碱基序列的10～24个残基的寡聚核苷酸以及与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的具有与所述靶标RNA互补的碱基序列的3～6个残基的寡聚核苷酸构成，所述第二寡聚核苷酸在其3’末端缺失与所述靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基，或者是具有不与所述靶标RNA的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基(以下也将第二寡聚核苷酸中不与靶标RNA的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基和靶标对应核苷酸残基合并称为“非互补核苷酸残基”)，所述第二寡聚核苷酸的残基数为2～10个，至少其3’末端以外的核苷酸残基与所述靶标RNA形成互补的双链结构，具有由所述靶标对应核苷酸残基以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的计数区域，与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的核苷酸残基为2’-脱氧核苷酸残基，在与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸中，从所述靶标对应核苷酸起沿3’方向计数的第3位的核苷酸残基为2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基。
(2-2)根据(2-1)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸的残基数为4～8个。
(2-3)根据(2-1)或(2-2)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸的3’末端缺失与所述靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基。
(2-4)根据(2-1)至(2-3)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述位点特异性编辑是由腺苷脱氨酶1所致的酶反应引起的。
(2-5)根据(2-1)至(2-4)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述第一寡聚核苷酸与第二寡聚核苷酸之间包含含有亚烷基氧基单元的连接部。
(2-6)根据(2-1)至(2-5)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸包含硫代磷酸酯键。
(2-7)根据(2-1)至(2-6)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸残基。
(2-8)根据(2-1)至(2-7)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述计数区域包含硫代磷酸酯键。
(2-9)根据(2-1)至(2-8)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标对应核苷酸残基包含硫代磷酸酯键。
(2-10)根据(2-1)至(2-9)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的核苷酸残基为2’-O-烷基核糖核苷酸残基或脱氧核苷酸残基。
(2-11)根据(2-1)至(2-10)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
(2-12)根据(2-1)至(2-11)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(2-13)根据(2-1)至(2-12)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸具有交联型核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(2-14)根据(2-1)至(2-13)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(2-15)根据(2-1)至(2-14)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述第一寡聚核苷酸中，与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基连接的碱基序列。
(2-16)根据(2-1)至(2-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述第一寡聚核苷酸中，与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(2-17)根据(2-1)至(2-16)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述第一寡聚核苷酸中，与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(2-18)根据(2-1)至(2-17)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基连接的碱基序列。
(2-19)根据(2-1)至(2-18)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(2-20)根据(2-1)至(2-19)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(2-21)根据(2-1)至(2-20)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标RNA在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有胞苷残基，所述第一寡聚核苷酸在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的核苷酸残基为2’-脱氧肌苷残基。
(2-22)根据(2-1)至(2-20)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标RNA在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有尿苷残基，所述第一寡聚核苷酸在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的核苷酸残基为2’-脱氧腺苷残基。
(2-23)根据(2-1)至(2-20)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标RNA在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有腺苷残基，所述第一寡聚核苷酸在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的核苷酸残基为胸苷残基或2’-脱氧尿苷残基。
(2-24)根据(2-1)至(2-20)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标RNA在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有鸟苷残基，所述第一寡聚核苷酸在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的核苷酸残基为2’-脱氧肌苷残基。
(2-25)根据(2-1)至(2-24)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标对应核苷酸残基为N-烷基嘧啶核苷酸残基或2’-脱氧胞苷残基。
(2-26)根据(2-1)至(2-25)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸分别是核苷酸残基通过硫代磷酸酯键连接而成的。
(2-27)根据(2-1)至(2-26)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸在从所述靶标对应核苷酸起沿3’方向计数的第10位以后的核苷酸残基中具有交联型核苷酸残基。
(2-28)根据(2-27)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸由从所述靶标对应核苷酸起沿3’方向计数的第10位以后的核苷酸残基构成的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(2-29)根据(2-1)至(2-28)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸在从其3’末端的核苷酸残基起沿5’方向计数的第2位以后的核苷酸残基中具有交联型核苷酸残基。
(2-30)根据(2-29)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸由从其3’末端的核苷酸残基起沿5’方向计数的第2位以后的核苷酸残基构成的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
(2-31)根据(2-1)至(2-30)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其用下式中的任一个表示：
U(M)^T(L)^G(M)^A(L)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(L)^U(M)^T(L)^G(M)(AD1_ASS1.39)，
A(M)^A(L)^G(M)^A(L)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^U(M)(AD1_PANK2.39)，
A(M)^T(L)^G(M)^T(L)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(L)^A(M)^C(L)^U(M)(AD1_NPHS2.39)，
G(M)^C(L)^A(M)^T(L)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^C(M)(AD1_GRIA2.39)，
U(M)^G(L)^A(M)^U(L)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(L)^G(M)^U(L)^U(M)
(AD1_ASS1.52)，
G(M)^C(E)^A(M)^T(E)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^C(M)(AD1_GRIA2.39e)，
U(M)^T(E)^G(M)^A(E)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(E)^U(M)^T(E)^G(M)(AD1_ASS1.39e)，
A(M)^A(E)^G(M)^A(E)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^U(M)(AD1_PANK2.39e)，
A(M)^T(E)^G(M)^T(E)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(E)^A(M)^C(E)^U(M)(AD1_NPHS2.39e)，
C(M)^A(E)^U(M)^C(E)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M)
(AD1_GRIA2.52e)，
U(M)^G(E)^A(M)^T(E)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(E)^G(M)^T(E)^U(M)
(AD1_ASS1.52e)，
A(M)^G(E)^A(M)^A(E)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M)
(AD1_PANK2.52e)，
U(M)^G(E)^U(M)^C(E)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^T(E)^U(M)^A(E)^C(M)
(AD1_NPHS2.52e)，
G(M)^T(L)^C(M)^C(L)^C(M)^U(F)^U(F)^C(M)^U(M)^c^i^U(M)^C(F)^G(M)^A(F)^U(M)^G(F)^G(M)^U(F)^C(M)^A(L)^G(M)^C(L)^A(M)(AD1_A1AT.39)，
在上述式中，大写字母表示核糖核苷酸残基，小写字母表示2’-脱氧核糖核苷酸残基，N(M)表示2’-O-甲基-核糖核苷酸残基，N(F)表示2’-脱氧-2’-氟-核糖核苷酸残基，N(L)表示2’-O,4’-C-亚甲基化核糖核苷酸残基，N(E)表示2’-O,4’-C-亚乙基化核糖核苷酸残基，“^”表示核苷单元间通过-P(＝S)(OH)-结合。
(2-32)根据(2-1)至(2-31)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述寡聚核苷酸及其药学上可接受的盐在5’末端或3’末端经由接头或磷酸二酯键(包含硫代磷酸酯键)结合有包含GalNAc、胆固醇和脂肪酸的递送分子。
(2-33)遗传性疾病治疗剂，其含有根据(2-1)至(2-32)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，被用于与所述靶标RNA相关的疾病的治疗。
(2-34)药物组合物，其含有根据(2-1)至(2-32)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐作为活性成分，被用于与所述靶标RNA相关的疾病的治疗。
(2-35)根据(2-34)所述的药物组合物，其用于遗传性疾病的预防或治疗。
(2-36)根据(2-35)所述的药物组合物，其所述遗传性疾病是可通过将所述靶标RNA中的腺苷残基转换为肌苷残基来治疗的疾病。
(2-37)根据(2-35)所述的药物组合物，其中所述遗传性疾病是以基因中的鸟苷残基向腺苷残基的突变为原因的遗传性疾病。
(2-38)根据(2-1)至(2-32)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐用于制造用于预防或治疗与所述靶标RNA相关的疾病的药物的用途。
(2-39)根据(2-1)至(2-32)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其用于预防或治疗与所述靶标RNA相关的疾病的用途。
(2-40)用于预防或治疗与所述靶标RNA相关的疾病的方法，其中通过将药理学有效量的根据(2-1)至(2-32)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐对恒温动物进行给药来预防或治疗与所述靶标RNA相关的疾病。
(2-41)根据(2-40)所述的方法，其中所述疾病为遗传性疾病。
(2-42)根据(2-41)所述的方法，其中所述遗传性疾病是可通过将靶标RNA中的腺苷残基转换为肌苷残基来治疗的疾病。
(2-43)根据(2-41)所述的方法，其中所述遗传性疾病是以基因中的鸟苷残基向腺苷残基的突变为原因的遗传性疾病。
(2-44)根据(2-34)至(2-37)中任一项所述的药物组合物，其中所述疾病包含选自I型瓜氨酸血症、血友病(血栓症)、ALS、泛酸相关神经退行性疾病、高胱氨酸尿症、局灶性节段性肾小球硬化症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、苯丙酮尿症、厚皮性骨膜病、亚历山大病、原发性高草酸尿症、吉尔伯特综合征、视网膜色素变性、远端型肌病和血色素沉着症的至少1种。
(2-45)根据(2-38)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐的用途，其中所述疾病包含选自I型瓜氨酸血症、血友病(血栓症)、ALS、泛酸相关神经退行性疾病、高胱氨酸尿症、局灶性节段性肾小球硬化症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、苯丙酮尿症、厚皮性骨膜病、亚历山大病、原发性高草酸尿症、吉尔伯特综合征、视网膜色素变性、远端型肌病和血色素沉着症的至少1种。
(2-46)根据(2-39)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述疾病包含选自I型瓜氨酸血症、血友病(血栓症)、ALS、泛酸相关神经退行性疾病、高胱氨酸尿症、局灶性节段性肾小球硬化症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、苯丙酮尿症、厚皮性骨膜病、亚历山大病、原发性高草酸尿症、吉尔伯特综合征、视网膜色素变性、远端型肌病和血色素沉着症的至少1种。
(2-47)根据(2-40)至(2-43)中任一项所述的方法，其中所述疾病包含选自I型瓜氨酸血症、血友病(血栓症)、ALS、泛酸相关神经退行性疾病、高胱氨酸尿症、局灶性节段性肾小球硬化症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、苯丙酮尿症、厚皮性骨膜病、亚历山大病、原发性高草酸尿症、吉尔伯特综合征、视网膜色素变性、远端型肌病和血色素沉着症的至少1种。
(3-1)寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其用下式表示，具有核苷酸残基间的键包含硫代磷酸酯键的20至40个残基，用于将靶标RNA中的作为编辑靶标的腺苷残基转换为肌苷残基的基因编辑：
5’-O1-O2-N1-N2-N3-N4-N5-O3-O4-3’；
在上式中，N1是2’-O-烷基核糖核苷酸残基、核糖核苷酸残基、2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基或2’-脱氧核糖核苷酸残基，
N2是碱基为胞嘧啶或3-甲基尿嘧啶的核糖核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基或2’-脱氧核糖核苷酸残基，
N3是2’-脱氧核糖核苷酸残基，
N4是2’-O-烷基核糖核苷酸残基或2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基，
N5是2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基，
O1不存在，或者是2～10个残基的寡聚核苷酸，至少包含1个交联型核苷酸残基，除了交联型核苷酸残基以外，为2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基或2’-O-烷基核糖核苷酸残基，
O2是2～10个残基的寡聚核苷酸，由2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基构成，
O3是5～20个残基的寡聚核苷酸，由2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基构成，
O4不存在，或者是2～10个残基的寡聚核苷酸，至少包含1个交联型核苷酸残基，除了交联型核苷酸残基以外，为2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基或2’-O-烷基核糖核苷酸残基；
所述寡聚核苷酸的N2与作为编辑靶标的腺苷残基对应，O2在从3’侧起第2～5位的区域中缺失与对应的靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基，或者是具有不与对应的靶标RNA的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基，
所述寡聚核苷酸的碱基序列的N3的碱基可以是与邻接于作为编辑靶标的腺苷残基5’侧的碱基互补或非互补的碱基，N1、N4、N5、O1、O3和O4的碱基与靶标RNA的对应的核苷酸残基的碱基完全互补，
在O2中，缺失的核苷酸残基和不与对应的靶标RNA的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基以外的O2的碱基与靶标RNA的对应的核苷酸残基的碱基完全互补。
(3-2)根据(3-1)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧的核苷酸残基和N3形成互补对的情况下，N3是2’-脱氧腺苷残基、2’-脱氧肌苷残基(但作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧的核苷酸残基为腺苷残基和尿苷残基的情况除外)、胸苷残基或2’-脱氧尿苷残基(但作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧的核苷酸残基为鸟苷残基的情况除外)，在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧的核苷酸残基和N3不形成互补对的情况下，N3是2’-脱氧肌苷残基。
(3-3)根据(3-1)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述靶标RNA中，在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有胞苷残基的情况下，N3是2’-脱氧肌苷残基，在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有尿苷残基的情况下，N3是2’-脱氧腺苷残基，在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有腺苷残基的情况下，N3是胸苷残基或2’-脱氧尿苷残基，在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有鸟苷残基的情况下，N3是2’-脱氧肌苷残基。
(3-4)根据(3-1)至(3-3)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中N1和N4是2’-O-烷基核糖核苷酸残基。
(3-5)根据(3-1)至(3-4)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中O2和O3中的至少其一包含2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替配置的序列。
(3-6)根据(3-1)至(3-5)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中O3由2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替配置的序列构成。
(3-7)根据(3-1)至(3-6)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中O1和O4中的至少其一包含1、2或3个交联型核苷酸残基。
(3-8)根据(3-7)所记载的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其特征在于交联型核苷酸残基彼此不邻接地配置。
(3-9)根据(3-1)至(3-8)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中O1和O4中的至少其一包含交联型核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替配置的序列。
(3-10)根据(3-1)至(3-9)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述交联型核苷酸残基是在D-呋喃核糖中经2’-O,4’-C-亚甲基交联的核苷酸(LNA)残基或经2’-O,4’-C-亚乙基交联的核苷酸(ENA)残基。
(3-11)根据(3-1)至(3-10)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中N2是碱基为胞嘧啶的核糖核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基或2’-脱氧核糖核苷酸残基。
(3-12)根据(3-1)至(3-11)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中核苷酸残基间的键全部为硫代磷酸酯键。
(3-13)根据(3-1)至(3-12)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含序列号51、54、61、62或63的碱基序列(但碱基序列中的U也可置换为T)。
(3-14)根据(3-1)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其用下式中的任一个表示：
U(M)^T(L)^G(M)^A(L)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(L)^U(M)^T(L)^G(M)(AD1_ASS1.39)，
A(M)^A(L)^G(M)^A(L)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^U(M)(AD1_PANK2.39)，
A(M)^T(L)^G(M)^T(L)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(L)^A(M)^C(L)^U(M)(AD1_NPHS2.39)，
G(M)^C(L)^A(M)^T(L)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^C(M)(AD1_GRIA2.39)，
U(M)^G(L)^A(M)^U(L)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(L)^G(M)^U(L)^U(M)
(AD1_ASS1.52)，
G(M)^C(E)^A(M)^T(E)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^C(M)(AD1_GRIA2.39e)，
U(M)^T(E)^G(M)^A(E)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(E)^U(M)^T(E)^G(M)(AD1_ASS1.39e)，
A(M)^A(E)^G(M)^A(E)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^U(M)(AD1_PANK2.39e)，
A(M)^T(E)^G(M)^T(E)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(E)^A(M)^C(E)^U(M)(AD1_NPHS2.39e)，
C(M)^A(E)^U(M)^C(E)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M)
(AD1_GRIA2.52e)，
U(M)^G(E)^A(M)^T(E)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(E)^G(M)^T(E)^U(M)
(AD1_ASS1.52e)，
A(M)^G(E)^A(M)^A(E)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M)
(AD1_PANK2.52e)，
U(M)^G(E)^U(M)^C(E)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^T(E)^U(M)^A(E)^C(M)
(AD1_NPHS2.52e)，
G(M)^T(L)^C(M)^C(L)^C(M)^U(F)^U(F)^C(M)^U(M)^c^i^U(M)^C(F)^G(M)^A(F)^U(M)^G(F)^G(M)^U(F)^C(M)^A(L)^G(M)^C(L)^A(M)(AD1_A1AT.39)，
式中，大写字母表示核糖核苷酸残基(RNA)，小写字母表示2’-脱氧核苷酸残基(DNA)，N(M)表示D-呋喃核糖经2’-O-甲基化的核糖核苷酸残基(2’-O-甲基-核糖核苷酸残基)，N(F)表示经D-呋喃核糖的2’-脱氧-2’-氟化的核糖核苷酸残基(2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基)，N(L)表示经D-呋喃核糖的2’-O,4’-C-亚甲基化的核糖核苷酸残基，N(E)表示经D-呋喃核糖的2’-O,4’-C-亚乙基化的核糖核苷酸残基，“^”表示核苷单元间通过-P(＝S)(OH)-结合。
(3-15)根据(3-1)至(3-14)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中寡聚核苷酸及其药学上可接受的盐在5’末端或3’末端经由接头或磷酸二酯键(包含硫代磷酸酯键)结合有包含GalNAc、胆固醇和脂肪酸的递送分子。
(3-16)药物组合物，其含有根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐作为有效成分。
(3-17)单碱基编辑诱导剂，其以根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐作为有效成分。
(3-18)根据(3-16)所述的药物组合物，其用于预防或治疗可通过将靶标RNA中的腺苷残基转换为肌苷残基来预防或治疗的疾病。
(3-19)根据(3-18)所述的药物组合物，其中所述疾病为遗传性疾病。
(3-20)根据(3-19)所述的药物组合物，其中所述疾病包含选自I型瓜氨酸血症、血友病(血栓症)、ALS、泛酸相关神经退行性疾病、高胱氨酸尿症、局灶性节段性肾小球硬化症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、苯丙酮尿症、厚皮性骨膜病、亚历山大病、原发性高草酸尿症、吉尔伯特综合征、视网膜色素变性、远端型肌病和血色素沉着症的至少1种。
(3-21)药物组合物，其含有根据(3-13)或(3-14)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐作为有效成分。
(3-22)单碱基编辑诱导剂，其以根据(3-13)或(3-14)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐作为有效成分。
(3-23)根据(3-21)所述的药物组合物，其用于预防或治疗可通过将靶标RNA中的腺苷残基转换为肌苷残基来预防或治疗的疾病。
(3-24)根据(3-23)所述的药物组合物，其中所述疾病为遗传性疾病。
(3-21)药物组合物，其含有根据(3-13)或(3-14)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐作为有效成分。
(3-22)单碱基编辑诱导剂，其以根据(3-13)或(3-14)所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐作为有效成分。
(3-23)根据(3-21)所述的药物组合物，其用于预防或治疗可通过将靶标RNA中的腺苷残基转换为肌苷残基来预防或治疗的疾病。
(3-24)根据(3-23)所述的药物组合物，其中所述疾病为遗传性疾病。
(4-1)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为ASS1基因的mRNA，编辑靶标为ASS1 mRNA的第1524位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与ASS1 mRNA的第1500～1540位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-2)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为F5基因的mRNA，编辑靶标为F5mRNA的第1696位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与mRNA的第1672位～第1712位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-3)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为GRIA2基因的mRNA，编辑靶标为GRIA2 mRNA的第2135位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与GRIA2 mRNA的第2111位～第2151位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-4)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为PANK2基因的mRNA，编辑靶标为PANK2 mRNA的第1728位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与PANK2 mRNA的第1704位～第1744位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-5)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为CBS基因的mRNA，编辑靶标为CBS mRNA的第1575位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与CBS mRNA的第1551位～第1591位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-6)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为NPHS2基因的mRNA，编辑靶标为NPHS2 mRNA的第497位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与NPHS2 mRNA的第473位～第513位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-7)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为SERPINA1基因的mRNA，编辑靶标为SERPINA1 mRNA的第1143位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与SERPINA1 mRNA的第1119位～第1159位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-8)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为PAH基因的mRNA，编辑靶标为PAH mRNA的第896位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与PAH mRNA的第872位～第912位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-9)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为SLCO2A1基因的前体mRNA，编辑靶标为SLCO2A1前体mRNA的第81034位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与SLCO2A1前体mRNA的第81010位～第81050位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-10)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为GFAP基因的mRNA，编辑靶标为GFAP mRNA的第2168位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与GFAP mRNA的第2144位～第2184位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-11)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为AGXT基因的mRNA，编辑靶标为AGXT mRNA的第550位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与AGXT mRNA的第526位～第566位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-12)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为UGT1A1基因的mRNA，编辑靶标为UGT1A1 mRNA的第229位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与UGT1A1 mRNA的第205位～第245位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-13)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为EYS基因的mRNA，编辑靶标为EYS mRNA的第8478位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与EYS mRNA的第8454位～第8494位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-14)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为GNE基因的mRNA，编辑靶标为GNE mRNA的第924位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与GNE mRNA的第900位～第940位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
(4-15)根据(3-1)至(3-15)中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中靶标RNA为HFE基因的mRNA，编辑靶标为HFE mRNA的第1005位的核苷酸，除了非互补核苷酸和N3以外的核苷酸序列与HFE mRNA的第981位～第1021位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补。
发明的效果
根据本发明的一个方式，可提供能够在细胞内诱导ADAR1的编辑活性、在生物体内的稳定性优异的寡聚核苷酸。
附图说明
[图1A]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图1B]显示细胞内由寡聚核苷酸对RNA的编辑引起的发光强度变化的图。
[图2A]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图2B]显示细胞内由寡聚核苷酸对RNA的编辑引起的发光强度变化的图。
[图3]显示细胞内由来源于内源性ADAR的寡聚核苷酸对RNA的编辑引起的发光强度变化的图。
[图4A]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对hGAPDH的编辑比例的图。
[图4B]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对hGAPDH的编辑比例的图。
[图5]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对hGAPDH的编辑比例的图。
[图6]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对hGAPDH的编辑比例的图。
[图7A]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对hGAPDH的编辑比例的图。
[图7B]显示细胞内来源于内源性ADAR的寡聚核苷酸对hGAPDH的编辑比例的图。
[图8]显示通过寡聚核苷酸针对具有疾病来源序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图9]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有疾病来源序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图10]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对hGAPDH的编辑比例的图。
[图11]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对hGAPDH的编辑比例的图。
[图12A]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对hGAPDH的编辑比例的图。
[图12B]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对hGAPDH的编辑比例的图。
[图13A]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对hGAPDH的编辑比例的图。
[图13B]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对hGAPDH的编辑比例的图。
[图14A]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有疾病来源序列的模型靶标RNA的在ADAR1存在下的编辑比例的图。
[图14B]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有疾病来源序列的模型靶标RNA的在ADAR2存在下的编辑比例的图。
[图15A]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有疾病来源序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图15B]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的ASS1基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图15C]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的PANK2基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图15D]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的NPHS2基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图15E]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的GRIA2基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图16]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的PAH.2基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图17A]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的ASS1基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图17B]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的PANK2基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图17C]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的NPHS2基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图18A]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的ASS1基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图18B]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的PANK2基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图18C]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的NPHS2基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图18D]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的GRIA2基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图19]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对在编辑靶标的5’侧具有鸟苷残基的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图20]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对在编辑靶标的5’侧具有腺苷残基的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图21A]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对在编辑靶标的5’侧具有鸟苷残基的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图21B]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对在编辑靶标的5’侧具有腺苷残基的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图22]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对在编辑靶标的5’侧具有鸟苷残基或腺苷残基的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图23A]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的A1AT基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图23B]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的A1AT基因序列的模型靶标RNA的编辑比例的图。
[图24]显示细胞内通过寡聚核苷酸针对具有作为疾病来源序列的A1AT基因序列的模型靶标RNA的修复的图。
具体实施方式
在本说明书中，“工序”这一用语不仅是指独立的工序，即使是无法与其它工序明确地区别的情况，只要达成该工序所期望的目的，则也包含在本用语中。另外，组合物中的各成分的含量，在组合物中存在多个与各成分相应的物质的情况下，只要没有特别说明，则意指存在于组合物中的该多个物质的合计量。此外，本说明书中记载的数值范围的上限及下限可分别任意地选择作为数值范围而例示的数值进行组合。以下，详细说明本发明的实施方式。但是，以下所示的实施方式是例示用于将本发明的技术思想具体化的寡聚核苷酸、药物组合物以及用于疾病的预防或治疗的方法的实施方式，本发明不限定于以下所示的寡聚核苷酸、药物组合物以及用于疾病的预防或治疗的方法。
靶标编辑向导RNA
诱导针对靶标RNA的位点特异性编辑的寡聚核苷酸(以下也称为靶标编辑向导RNA：gRNA)包含识别靶标RNA的第一寡聚核苷酸和与第一寡聚核苷酸的5’侧连接的第二寡聚核苷酸。第一寡聚核苷酸可由与靶标RNA中的腺苷残基对应的靶标对应核苷酸残基、与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的具有与靶标RNA互补的碱基序列的10～24个残基的寡聚核苷酸以及与靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的具有与靶标RNA互补的碱基序列的3～6个残基的寡聚核苷酸构成。第二寡聚核苷酸可在其3’末端缺失与所述靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基，或者是可具有不与所述靶标RNA的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基。另外，第二寡聚核苷酸的残基数为2～10个，至少其3’末端以外的核苷酸残基可与所述靶标RNA形成互补的双链结构。选自由靶标对应核苷酸残基以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的计数区域的至少1个残基可以是天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基。
构成靶标编辑向导RNA的第二寡聚核苷酸具有靶标RNA的1个核苷酸残基不形成互补对而除了该核苷酸残基以外的对应的核苷酸残基与靶标RNA形成互补的双链结构的碱基序列。即，第二寡聚核苷酸具有与靶标RNA形成不完全双链结构的碱基序列。在识别靶标RNA的第一寡聚核苷酸的5’侧含有具有这样的特征性碱基序列的短链第二寡聚核苷酸的靶标编辑向导RNA可在细胞内优先诱导ADAR1的编辑活性。这可以认为是由于例如不形成互补对的核苷酸残基的存在针对ADAR1的募集有利地发挥作用。另外，通过在计数区域中包含天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基，在生物体内的稳定性优异。
在一个方式中，靶标编辑寡聚核苷酸包含识别靶标RNA的第一寡聚核苷酸和与第一寡聚核苷酸的5’侧连接的第二寡聚核苷酸。第一寡聚核苷酸可由与靶标RNA中的腺苷残基对应的靶标对应核苷酸残基、与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的具有与靶标RNA互补的碱基序列的10～24个残基的寡聚核苷酸以及与靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的具有与靶标RNA互补的碱基序列的3～6个残基的寡聚核苷酸构成。第二寡聚核苷酸可在其3’末端缺失与所述靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基，或者是可具有不与靶标RNA的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基。第二寡聚核苷酸的残基数为2～10个，至少其3’末端以外的核苷酸残基可与靶标RNA形成互补的双链结构。靶标编辑寡聚核苷酸与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的核苷酸残基可以是2’-脱氧核苷酸残基，在与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸中，从靶标对应核苷酸起沿3’方向计数的第3位的核苷酸残基可以是2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基。
靶标编辑寡聚核苷酸通过在靶标对应核苷酸残基的3’侧具有2’-脱氧核苷酸残基，在与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸中从靶标对应核苷酸起沿3’方向计数的第3位具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基，而在生物体内的稳定性优异，可在细胞内更有效地诱导ADAR的编辑活性。
在一个方式中，靶标编辑寡聚核苷酸用以下的式(I)表示，可以是核苷酸残基间的键包含硫代磷酸酯键的具有20～40个残基的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐。靶标编辑寡聚核苷酸的长度优选可以是20～30个残基，更优选可以是21、22、23、24、25、26、27或28个残基。另外，核苷酸残基间的键优选可以全部是硫代磷酸酯键。靶标编辑寡聚核苷酸例如可用于将靶标RNA中的作为编辑靶标的腺苷残基转换为肌苷残基的基因编辑。
5’-O1-O2-N1-N2-N3-N4-N5-O3-O4-3’(I)
在上述式(I)中，N1可以是2’-O-烷基核糖核苷酸残基、核糖核苷酸残基、2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基或2’-脱氧核糖核苷酸残基，优选可以是2’-O-烷基核糖核苷酸残基、核糖核苷酸残基或2’-脱氧核糖核苷酸残基。N2可以是碱基为胞嘧啶或3-甲基尿嘧啶的核糖核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基或2’-脱氧核糖核苷酸残基。N3可以是2’-脱氧核糖核苷酸残基。N4可以是2’-O-烷基核糖核苷酸残基或2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基。N5可以是2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基。
O1不存在，或者是可以是2～10个残基的寡聚核苷酸。O1至少包含1个交联型核苷酸残基，除了交联型核苷酸残基以外，可以是2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基或2’-O-烷基核糖核苷酸残基。O2是2～10个残基的寡聚核苷酸，可由2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基构成。O2优选为3、4、5、6、7或8个残基，更优选为3或4个残基的寡聚核苷酸，可由2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基构成。O3是5～20个残基的寡聚核苷酸，可由2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基构成。O3优选为5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个残基，更优选为6或7个残基的寡聚核苷酸，可由2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基构成。O4不存在，或者是可以是2～10个残基的寡聚核苷酸，优选为2、3、4、5、6、7或8个残基，更优选为4或5个残基的寡聚核苷酸。O4至少包含1个交联型核苷酸残基，除了交联型核苷酸残基以外，可以是2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基或2’-O-烷基核糖核苷酸残基。
O2和O3中的至少其一可包含2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替配置的序列，优选由2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替配置的序列构成。在O2中，2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基的连接重复数可以是例如1以上且3以下，优选可以是1或2。在O3中，2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基的连接重复数可以是例如1以上且10以下，优选可以是2以上且6以下，更优选可以是3或4。2’-脱氧核糖核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的碱基序列可以是从2’-脱氧核糖核苷酸残基起沿3’方向交替连接，也可以是从2’-O-烷基核糖核苷酸残基起沿3’方向交替连接。O1和O4中的至少其一可包含1、2或3个交联型核苷酸残基，在这种情况下，交联型核苷酸残基彼此可不邻接地配置。O1和O4中的至少其一可包含交联型核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替配置的序列。在O1和O4中，交联型核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基的连接重复数可以是例如1以上且3以下，优选可以是2。2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列可从2’-O-烷基核糖核苷酸残基起沿3’方向交替连接，也可从交联型核苷酸残基起沿3’方向交替连接。
N1和N4优选可以是2’-O-烷基核糖核苷酸残基。另外。N2优选可以是碱基为胞嘧啶的核糖核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基或2’-脱氧核糖核苷酸残基。
靶标编辑寡聚核苷酸的N2与作为编辑靶标的腺苷残基对应，O2在从3’侧起第2～5位的区域中缺失与对应的靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基，或者是可具有不与对应的靶标RNA的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基。
靶标编辑寡聚核苷酸的碱基序列的N3的碱基可以是邻接于与作为编辑靶标的腺苷残基5’侧的碱基互补或非互补的碱基。N1、N4、N5、O1、O3和O4的碱基可与靶标RNA对应的核苷酸残基的碱基完全互补。在O2中，缺失的核苷酸残基和不与对应的靶标RNA的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基以外的O2的碱基可与靶标RNA的对应的核苷酸残基的碱基完全互补。
用式(I)表示的靶标编辑寡聚核苷酸在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧核苷酸残基和N3形成互补对的情况下，N3可以是2’-脱氧腺苷残基、2’-脱氧肌苷残基(但作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧核苷酸残基为腺苷残基和尿苷残基的情况除外)、胸苷残基或2’-脱氧尿苷残基(但作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧核苷酸残基为鸟苷残基的情况除外)。另外，在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧核苷酸残基和N3不形成互补对的情况下，N3可以是2’-脱氧肌苷残基。
靶标编辑寡聚核苷酸通过具有用式(I)表示的结构，在生物体内的稳定性优异，可在细胞内更有效地诱导ADAR的编辑活性。
在本实施方式的靶标编辑向导RNA中，与现有类型的靶标编辑向导RNA相比长度短，相应地可简单地削减制造成本。另外，化学合成变得容易，将核酸药品开发等中使用的现有的人工核酸等修饰核苷酸应用于靶标编辑向导RNA变得容易。由此，通过提高细胞内抗降解性、提高细胞导入效率等，可提供更高功能的靶标编辑向导RNA。此外，通过以编辑诱导所需的最小限度的残基数构成靶标编辑向导RNA，可在维持针对靶标RNA的特异性的同时，抑制在作为编辑靶标的腺苷残基以外的位置的脱靶编辑。
靶标编辑向导RNA例如通过在催化靶标编辑的ADAR中优先地将ADAR1募集至靶标RNA，来诱导针对靶标RNA的位点特异性编辑。ADAR是通过水解性脱氨基化反应将双链RNA中的腺苷残基转换为肌苷残基的酶，广泛存在于哺乳动物的细胞中。肌苷残基由于结构与鸟苷残基类似，所以在RNA信息翻译时作为鸟苷残基进行，其结果是RNA信息被编辑。若在编码氨基酸的部分发生这样的RNA编辑，则即使在基因组上没有DNA突变，也会发生氨基酸置换等，可控制靶标基因的功能。
若将靶标编辑向导RNA导入至哺乳动物细胞中，则将细胞中存在的ADAR1优先地募集至靶标RNA，诱导针对靶标RNA的位点特异性编辑。
本实施方式的靶标编辑向导RNA可在细胞内ADAR1优先地诱导编辑活性。“ADAR1优先地”意指例如在体外针对ADAR1的编辑诱导活性与针对ADAR2的编辑诱导活性的比超过1，意指优选为1.5以上、2以上或5以上。需说明的是，针对细胞内的ADAR1和ADAR2的编辑诱导活性说的是，在使用以相同表达载体构建的ADAR1表达质粒和ADAR2表达质粒来在细胞内以相同条件进行转染并表达的情况下，ADAR1针对相同的靶标编辑位点的编辑诱导效率更高的情况。
靶标编辑向导RNA所包含的第一寡聚核苷酸识别靶标RNA。靶标RNA只要包含作为编辑对象的腺苷残基则没有特别限制，可以是细胞性RNA、病毒性RNA中的任一种，通常为编码蛋白质的mRNA前体(包含前体mRNA)或mRNA。靶标RNA中的编辑位点可存在于非翻译区域，剪接区域，外显子，内含子或影响RNA的稳定性、结构或功能的任一区域中。另外，靶标RNA也可包含应修正或变更的突变。或者，靶标RNA也可以以其序列编码与天然型不同的表型的方式进行突变。
靶标RNA优选为编码蛋白质的RNA。作为所编码的蛋白质，具体而言，可列举出血清素受体、谷氨酸受体、膜电位依赖型钾通道、STAT3、NFkBIA、MAPK14等与信号传导有关的磷酸化蛋白质等。
靶标编辑向导RNA可应用于例如遗传性疾病的治疗。遗传性疾病例如可以是可通过将靶标RNA中的腺苷残基转换为肌苷残基来治疗的疾病。另外，遗传性疾病例如可以是以基因中的鸟苷残基向腺苷残基的突变为原因的遗传性疾病。作为遗传性疾病，例如可列举出囊性纤维化、白化病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、CADASIL综合征、夏科-马里-图思病(Charcot-Marie-Tooth疾病)、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端型脊髓性肌萎缩(DSMA)、Duchenne/Becker型肌营养不良、营养不良型大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病(Fabry疾病)、莱顿因子V相关障碍(factor V Leiden associated disorder)、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、戈谢病(Gaucher疾病)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、血友病、遗传性血色素沉着症、亨特氏综合征(Hunter syndrome)、亨廷顿病、Hurler综合征、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集反应综合征、先天性利伯黑蒙(amaurosis congenita of Leber)、莱施-尼汉综合征、林奇综合征、马凡综合征、粘多糖病、肌营养不良、肌紧张型营养不良I型和II型、神经纤维瘤病、尼曼-皮克病(Niemann-Pick's disease)A、B及C型、NY-eso1相关型胰腺癌、帕金森病、波伊茨-耶格综合征、苯丙酮尿症、庞贝氏症、原发性睫状体病、凝血酶原G20210A突变等凝血酶原突变相关疾病、肺动脉高压、视网膜色素变性、Sandhoff病、重症联合免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌萎缩、Stargardt病、泰萨二氏病(Tay-Sachs disease)、Usher综合征、X连锁免疫缺陷、癌的各种形式(例如BRCA1和2相关型乳腺癌、卵巢癌等)等。
作为遗传性疾病的具体实例，可列举出I型瓜氨酸血症(ASS1)、II型瓜氨酸血症(SLC25A13)、血友病(莱顿因子V)、原发性高草酸尿症(AGXT)、远端型肌病(GNE)、囊性纤维化：cystic fibrosis(CFCFTR)、高胱氨酸尿症(CBS)、Hurler综合征：粘多糖病(IDUA(SLC26A1))、亚历山大病(GFAP)、视网膜色素变性(EYS)、苯丙酮尿症(PAH)、血色素沉着症(HFE)、吉尔伯特综合征(UGT1A1)等。需说明的是，括弧内为靶标基因名。
应用于遗传性疾病的治疗的靶标编辑向导RNA例如可包含选自序列号49～55以及序列号60～63的任一碱基序列，优选可包含选自序列号51、54、61、62和63的任一碱基序列。需说明的是，靶标编辑向导RNA可包含在以序列号识别的碱基序列中U被置换为T的碱基序列。
成为I型瓜氨酸血症的原因的ASS1基因的c.1168G>A突变(rs121908641)是人精氨基琥珀酸合成酶1(ASS1)，转录本变体1，mRNA(GenBank登录号：NM_000050.4)的第1524位核苷酸的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该ASS1 mRNA的第1500～1540位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第1504位～第1534位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第1510位～第1534位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为血友病(血栓症)的原因的因子V基因的c.1601G>A突变(rs6025)是人凝血因子V(F5)，mRNA(GenBank登录号：NM_000130.5)的第1696位核苷酸的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该F5 mRNA的第1672位～第1712位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第1676位～第1706位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第1682位～第1706位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
GRIA2基因的转录后修饰的异常可成为肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的原因。人亲离子型谷氨酸受体AMPA型亚基2(GRIA2)，转录本变体1，mRNA(GenBank登录号：nm_000826.4)的第2135位腺苷的A至I RNA编辑异常可相应于该转录后修饰的异常。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该GRIA2mRNA的第2111位～第2151位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第2115位～第2145位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第2121位～第2145位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为泛酸相关神经退行性疾病的原因的PANK2基因的c.1561G>A突变(rs137852959)是人泛酸激酶2(PANK2)，转录本变体1，mRNA(GenBank登录号：NM_153638.3)上的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该PANK2 mRNA的第1704位～第1744位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第1708位～第1738位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第1714位～第1738位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为高胱氨酸尿症的原因的CBS基因的c.1330G>A突变(rs28934891)是人胱硫醚-β-合成酶(CBS)，转录本变体1，mRNA(GenBank登录号：NM_000071.2)的第1575位核苷酸的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该CBS mRNA的第1551位～第1591位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第1555位～第1585位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第1561位～第1585位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为局灶性节段性肾小球硬化症的原因的NPHS2基因的c.413G>A突变(rs74315342)是人NPHS2 stomatin家族成员，足突蛋白(podocin)(NPHS2)，转录本变体1，mRNA(GenBank登录号：NM_014625.4)的第497位核苷酸的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该NPHS2mRNA的第473位～第513位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第477位～第507位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第483位～第507位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为α1抗胰蛋白酶缺乏症的原因的SERPINA1基因的c.1096G>A突变(rs28929474)是人丝酶抑制蛋白(serpin)家族A成员1(SERPINA1)，转录本变体1，mRNA(GenBank登录号：NM_000295.5)的第1143位核苷酸的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该SERPINA1mRNA的第1119位～第1159位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第1123位～第1153位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第1129位～第1153位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为苯丙酮尿症的原因的PAH基因的c.782G>A突变(rs5030849)是人苯丙氨酸羟化酶(PAH)，转录本变体1，mRNA(GenBank登录号：NM_000277.3)的第896位核苷酸的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该PAH mRNA的第872位～第912位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第876位～第906位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第882位～第906位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为厚皮性骨膜病的原因的SLCO2A1基因的c.940+1G>A突变(rs765249238)是人溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员2A1(SLCO2A1)，mRNA(GenBank登录号：NM_005630.3)的前体mRNA上第81034位核苷酸的G向A的突变(编辑靶标位于3号染色体的第133948892位的(-)链上)。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸的除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该SLCO2A1前体mRNA的第81010位～第81050位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第81014位～第81044位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第81020位～第81044位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为亚历山大病的原因的GFAP基因的c.716G>A突变(rs59565950)是人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，转录本变体1，mRNA(GenBank登录号：NM_002055.5)的第2168位核苷酸的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该GFAP mRNA的第2144位～第2184位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第2148位～第2178位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第2154位～2178位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为原发性高草酸尿症的原因的AGXT基因的c.508G>A突变(rs121908529)是人丙氨酸-乙醛酸和丝氨酸-丙酮酸氨基转移酶(AGXT)，mRNA(GenBank登录号：NM_000030.3)的第550位核苷酸的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该AGXT mRNA的第526位～第566位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第530位～第560位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第536位～第560位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为吉尔伯特综合征的原因的UGT1A1基因的c.211G>A突变(rs4148323)是人UDP葡萄糖醛酸转移酶家族1成员A1(UGT1A1)，mRNA(GenBank登录号：NM_000463.3)的第229位核苷酸的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸的除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该UGT1A1 mRNA的第205位～第245位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第209位～第239位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第215位～第239位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为视网膜色素变性的原因的EYS基因的c.7919G>A突变(rs527236066)是人闭眼同源物(eyes shut homolog)(EYS)，转录本变体1，mRNA(GenBank登录号：NM_001142800.2)的第8478位核苷酸的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该EYS mRNA的第8454位～第8494位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第8458位～第8488位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第8464位～第8488位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为远端型肌病的原因的GNE基因的c.797G>A突变(rs121908622)是人葡糖胺(UDP-N-乙酰基)-2-差向异构酶/N-乙酰基甘露糖胺激酶(GNE)，转录本变体1，mRNA(GenBank登录号：NM_001128227.3)的第924位核苷酸的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该GNE mRNA的第900位～第940位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第904位～第934位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第910位～第934位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
成为血色素沉着症的原因的HFE基因的c.845G>A突变(rs1800562)是人稳态铁调节蛋白(homeostatic iron regulator)(HFE)，转录本变体1，mRNA(GenBank登录号：NM_000410.3)的第1005位核苷酸的G向A的突变。在一个方式中，寡聚核苷酸以该腺苷残基为靶标。例如，在一个方式中，寡聚核苷酸除了非互补核苷酸残基和N3以外的核苷酸序列可与该HFE mRNA的第981位～第1021位所包含的连续的20～40个碱基的区域完全互补，优选可与第985位～第1015位所包含的连续的20～29个碱基的区域完全互补，更优选可与第991位～第1015位所包含的连续的20～25个碱基的区域完全互补。
第一寡聚核苷酸由与靶标RNA中成为编辑靶标的腺苷残基对应的靶标对应核苷酸残基、与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的具有针对靶标RNA的对应的碱基序列互补的碱基序列的10～24个残基的3’侧寡聚核苷酸以及与靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的具有针对靶标RNA的对应的碱基序列互补的碱基序列的3～6个残基的5’侧寡聚核苷酸构成。与靶标对应核苷酸残基的3’侧和5’侧分别连接的寡聚核苷酸与靶标RNA形成双链结构，作为整体形成互补链(以下也称为第一互补链)，由此识别靶标RNA和靶标RNA中的编辑靶标位点。在此，在本说明书中在互补的碱基序列中，除了形成沃森-克里克型碱基对的碱基序列以外，还例如包含形成G-U碱基对等热力学稳定的非沃森-克里克型摆动碱基对的碱基序列。形成第一互补链的碱基对可以除了靶标对应核苷酸残基以外全部是沃森-克里克型的碱基对，也可以是至少一部分是摆动碱基对。在第一互补链包含摆动碱基对的情况下，其数量可以是1个或2个。以下，为了方便，有时将由靶标对应核苷酸残基、其5’侧的1个残基和3’侧的1个残基的3个残基构成的区域称为计数区域，将第一寡聚核苷酸的计数区域以外称为非计数区域。
在一个方式中，在与第一寡聚核苷酸中的靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的10～24个残基的3’侧寡聚核苷酸中，靶标对应核苷酸残基的3’侧的第1位核苷酸残基是不与靶标RNA的对应的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基，除此之外的核苷酸残基可与靶标RNA的对应的核苷酸残基形成互补对而与靶标RNA形成双链结构。具体而言，例如在靶标RNA的作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有鸟苷残基的情况下，靶标对应核苷酸残基的3’侧的第1位核苷酸残基可以是2’-脱氧肌苷残基。
靶标对应核苷酸残基是与成为编辑靶标的腺苷残基对应的核苷酸残基，例如为胞苷残基、鸟苷残基、腺苷残基或它们的衍生物。靶标对应核苷酸残基优选为不与成为编辑靶标的腺苷残基形成碱基对的碱基，更优选为胞苷残基或其衍生物，进一步优选为胞苷残基。在一个方式中，靶标对应核苷酸残基可以是N-烷基嘧啶核苷酸残基，优选可以是N-烷基胞苷残基、N-烷基-2’-脱氧胞苷残基、N-烷基尿苷残基或N-烷基脱氧尿苷残基。N-烷基嘧啶核苷酸残基中的烷基可以是碳原子数为1～6或1～4的烷基，优选可以是甲基或乙基。通过靶标对应核苷酸残基为N-烷基嘧啶核苷酸残基，有时编辑诱导活性提高。另外，N-烷基嘧啶核苷酸残基的糖部分和磷酸酯键部分中的至少其一可进一步被修饰。关于糖部分和磷酸酯键部分的修饰在后面叙述。
在一个方式中，靶标对应核苷酸残基可以是2’-脱氧胞苷残基。2’-脱氧胞苷残基的磷酸酯键部分可进一步被修饰。
在第一寡聚核苷酸中，与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的具有与靶标RNA互补的碱基序列的寡聚核苷酸的残基数可以是10个以上且24个以下，优选为11个以上、12个以上或13个以上，另外，优选为22个以下、20个以下、18个以下、16个以下或15个以下。在一个方式中，具有与靶标RNA互补的碱基序列的寡聚核苷酸的残基数可以是12个以上且20个以下、12个以上且18个以下、12个以上且16个以下、14个以上且18个以下或者14个以上且16个以下。另外，在一个方式中，具有与靶标RNA互补的碱基序列的寡聚核苷酸的残基数可以是14个。若残基数为所述范围，则具有进一步提高针对ADAR1的选择性的倾向。
在第一寡聚核苷酸中，与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的3’侧寡聚核苷酸相对于靶标RNA可具有不包含错配碱基对的互补碱基序列。在这种情况下，靶标RNA优选在成为编辑靶标的腺苷残基的5’侧不连接鸟苷残基。即，在与靶标RNA的作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接的碱基为腺苷残基、胞苷残基或尿苷残基的情况下，在第一寡聚核苷酸中，与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸优选针对靶标RNA具有不包含错配碱基对的互补碱基序列。
在第一寡聚核苷酸中，与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的3’侧寡聚核苷酸根据情况，可包含针对靶标RNA的碱基序列不互补的碱基。例如，在成为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有鸟苷残基的靶标RNA中，有时编辑诱导活性降低。即使在这种情况下，通过第一寡聚核苷酸具有包含针对该鸟苷残基不互补的碱基的碱基序列，也可提高编辑诱导活性。针对该鸟苷残基不互补的碱基例如可以是鸟苷残基。即，针对在成为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有鸟苷残基的靶标RNA的靶标编辑向导RNA可在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接有鸟苷残基。
在第一寡聚核苷酸中，与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的3’侧寡聚核苷酸根据情况，可与对应的靶标RNA的核苷酸残基形成非沃森-克里克型的摆动碱基对，另外，与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的3’侧寡聚核苷酸根据情况，可以是2’-脱氧核苷酸残基。由此，有时编辑靶标活性提高。
例如，在靶标RNA中在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有胞苷残基的情况下，第一寡聚核苷酸可在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接有具有次黄嘌呤残基作为碱基的核苷酸残基。即，与作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接的胞苷残基和第一寡聚核苷酸的具有次黄嘌呤残基作为碱基的核苷酸残基可形成摆动碱基对。具有次黄嘌呤残基作为碱基的核苷酸残基可以是肌苷残基或2’-脱氧肌苷残基，优选为2’-脱氧肌苷残基。此外，具有次黄嘌呤残基作为碱基的核苷酸残基的糖部分和磷酸酯键部分中的至少其一可进一步被修饰。关于糖部分和磷酸酯键部分的修饰在后面叙述。
例如，在靶标RNA中在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有尿苷残基的情况下，第一寡聚核苷酸可在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接有具有腺嘌呤基作为碱基的核苷酸残基。即，与作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接的尿苷残基和第一寡聚核苷酸的具有腺嘌呤基作为碱基的核苷酸残基可形成碱基对。具有腺嘌呤基作为碱基的核苷酸残基可以是腺苷残基或2’-脱氧腺苷残基，优选为2’-脱氧腺苷残基。此外，具有腺嘌呤基作为碱基的核苷酸残基的糖部分和磷酸酯键部分中的至少其一可进一步被修饰。关于糖部分和磷酸酯键部分的修饰在后面叙述。
例如，在靶标RNA中在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有腺苷残基的情况下，第一寡聚核苷酸可在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接有具有嘧啶基作为碱基的核苷酸残基。即，与作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接的腺苷残基和第一寡聚核苷酸的具有嘧啶基作为碱基的核苷酸残基可形成碱基对。具有嘧啶基作为碱基的核苷酸残基可以是胸苷残基或2’-脱氧尿苷残基。此外，具有嘧啶基作为碱基的核苷酸残基的糖部分和磷酸酯键部分中的至少其一可进一步被修饰。关于糖部分和磷酸酯键部分的修饰在后面叙述。
例如，在靶标RNA中在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有鸟苷残基的情况下，第一寡聚核苷酸可在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接有次黄嘌呤残基作为碱基。次黄嘌呤残基可以是2’-脱氧肌苷残基。此外，次黄嘌呤残基的糖部分和磷酸酯键部分中的至少其一可进一步被修饰。关于糖部分和磷酸酯键部分的修饰在后面叙述。
第一寡聚核苷酸在从靶标对应核苷酸残基起沿3’方向计数的第10位以后、优选为第11位以后的核苷酸残基中可具有至少1种交联型核苷酸残基。交联型核苷酸残基可在D-呋喃核糖的2’位和4’位间被交联。关于交联型核苷酸残基的具体实例在后面叙述。交联型核苷酸残基可包含经2’-O,4’-C-亚甲基交联的核苷酸(LNA)和经2’-O,4’-C-亚乙基交联的核苷酸(ENA)中的至少其一。另外，交联型核苷酸残基的碱基部分和磷酸酯键部分中的至少其一可进一步被修饰。关于碱基部分和磷酸酯键部分的修饰在后面叙述。
第一寡聚核苷酸由从靶标对应核苷酸起沿3’方向计数的第10位以后、优选第11位以后的核苷酸残基构成的寡聚核苷酸可具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的连接重复数例如可以是1以上且3以下，优选可以是2。2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列可从2’-O-烷基核糖核苷酸残基起沿3’方向交替连接，也可从交联型核苷酸残基起沿3’方向交替连接。关于2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的具体实例在后面叙述。另外，2’-O-烷基核糖核苷酸残基或交联型核苷酸残基的碱基部分和磷酸酯键部分中的至少其一可进一步被修饰。关于碱基部分和磷酸酯键部分的修饰在后面叙述。
在第一寡聚核苷酸中，与靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的具有与靶标RNA互补的碱基序列的5’侧寡聚核苷酸的残基数可以是3个以上且6个以下，优选为3个以上且5个以下、3个以上且4个以下或3个。若残基数为所述范围，则有进一步提高针对ADAR1的选择性的倾向。
第二寡聚核苷酸与靶标RNA形成包含1个以上的不形成互补碱基对的核苷酸残基的双链结构(以下也称为第二互补链)。第二寡聚核苷酸的残基数可以是2个以上且10个以下或4个以上且8个以下。第二寡聚核苷酸的残基数例如为3个以上，优选为4个以上或5个以上，另外，例如为10个以下，优选为9个以下、8个以下或7个以下。在一个方式中，第二寡聚核苷酸的残基数可以是6个。若残基数在所述范围内，则有进一步增强编辑诱导的倾向。第二互补链中不形成互补碱基对的核苷酸残基的数量例如为3个以下或2个以下，优选为1个。
第二互补链中不形成互补碱基对的核苷酸残基可以是在靶标RNA或第二寡聚核苷酸之一中通过缺失与另一个的核苷酸残基对应的核苷酸残基而不形成碱基对地存在的核苷酸残基。另外，第二互补链中不形成互补碱基对的核苷酸残基可以是在靶标RNA和第二寡聚核苷酸中通过由对应的核苷酸残基构成的碱基对是具有相互不互补的核酸碱基的错配碱基对(非互补碱基对)而在靶标RNA和第二寡聚核苷酸这两者中均存在的核苷酸残基。在1个实施方式中，不形成互补碱基对的核苷酸残基可以是不形成存在于靶标RNA或第二寡聚核苷酸之一中的碱基对的核苷酸残基，优选可以是不形成存在于靶标RNA中的碱基对的核苷酸残基。由此，有进一步增强编辑诱导的倾向。在此，错配碱基对意指在靶标RNA和第二寡聚核苷酸中对应的2个核苷酸残基所具有的核酸碱基是不形成稳定的碱基对的组合。
第二互补链中的不形成互补碱基对的核苷酸残基的位置优选为靶标RNA上从第一互补链和第二互补链的结合位置起3’侧的第1个残基～第3个残基中的任一个，更优选为第1个残基。另外，第二互补链中不形成互补碱基对的核苷酸残基的位置优选为第二寡聚核苷酸上从第一互补链和第二互补链的结合位置起5’侧的第1个残基～第3个残基中的任一个，更优选为第1个残基。
第二互补链中的不形成互补碱基对的核苷酸残基可来源于与从靶标RNA中的第一互补链和第二互补链的结合位置起3’侧的第1个残基的核苷酸残基对应的核苷酸残基从第二寡聚核苷酸中缺失。另外，第二互补链中的不形成互补碱基对的核苷酸残基可来源于由从靶标RNA中的第一互补链和第二互补链的结合位置起3’侧的第1个残基的核苷酸残基和第二寡聚核苷酸的3’末端的核苷酸残基形成的错配碱基对。
在第二寡聚核苷酸中，在缺失与靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基的情况下，第二寡聚核苷酸除了缺失核苷酸残基的部分以外，可具有与靶标RNA互补的碱基序列。另外，在第二寡聚核苷酸具有不与对应于靶标RNA的核苷酸残基的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基的情况下，第二寡聚核苷酸除了不形成互补对的核苷酸残基以外，可具有与靶标RNA互补的碱基序列。
第二寡聚核苷酸在从其3’末端的核苷酸残基起沿5’方向计数的第2位以后、优选为第3位以后的核苷酸残基中可具有至少1种交联型核苷酸残基。交联型核苷酸残基可在D-呋喃核糖的2’位和4’位间被交联。关于交联型核苷酸残基的具体实例在后面叙述。交联型核苷酸残基可包含经2’-O,4’-C-亚甲基交联的核苷酸(LNA)和经2’-O,4’-C-亚乙基交联的核苷酸(ENA)中的至少其一。另外，交联型核苷酸残基的碱基部分和磷酸酯键部分中的至少其一可进一步被修饰。关于碱基部分和磷酸酯键部分的修饰在后面叙述。
第二寡聚核苷酸由从其3’末端的核苷酸残基起沿5’方向计数的第2位以后、优选第3位以后的核苷酸残基构成的寡聚核苷酸可具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的连接重复数例如可以是1以上且3以下，优选可以是2。2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列可从2’-O-烷基核糖核苷酸残基起沿5’方向交替连接，也可从交联型核苷酸残基起沿5’方向交替连接。关于2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的具体实例在后面叙述。另外，2’-O-烷基核糖核苷酸残基或交联型核苷酸残基的碱基部分和磷酸酯键部分中的至少其一可进一步被修饰。关于碱基部分和磷酸酯键部分的修饰在后面叙述。
在靶标编辑向导RNA的一个方式中，与靶标RNA形成第一互补链的第一寡聚核苷酸包含作为靶标对应核苷酸残基的胞苷残基、具有与靶标RNA的碱基序列互补的碱基序列的与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的残基数为12个～18个或14个～16个的3’侧寡聚核苷酸以及具有与靶标RNA的碱基序列互补的碱基序列的与靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的残基数为3个的5’侧寡聚核苷酸，第二寡聚核苷酸包含缺失与从靶标RNA中的第一互补链和第二互补链的结合位置起3’侧的第1个残基对应的核苷酸残基，在第2个残基以后具有互补的碱基序列，且残基数为4～8个的寡聚核苷酸。
构成靶标编辑向导RNA的核苷酸可选自天然型核糖核苷酸(RNA)、天然型脱氧核糖核苷酸(DNA)、RNA/DNA的嵌合体、作为它们的修饰物的修饰核苷酸中的任一种。构成靶标编辑向导RNA的核苷酸可通过结合到核苷的糖部分的羟基的磷酸二酯键相互连接。所述磷酸二酯键可利用糖部分的2’位羟基、3’位羟基或5’位羟基来形成。构成靶标编辑向导RNA的核苷酸可形成作为天然型的3’-5’磷酸二酯键。构成靶标编辑向导RNA的核苷酸的至少1个可以是修饰核苷酸。作为修饰核苷酸，可例示出糖部分被修饰的修饰核苷酸、磷酸二酯键被修饰的修饰核苷酸、碱基被修饰的修饰核苷酸以及它们的组合。
作为糖部分的修饰，例如可列举出：D-呋喃核糖的2’-O-烷基化核糖核苷酸(例如2’-O-甲基化、2’-O-氨基乙基化、2’-O-丙基化、2’-O-烯丙基化、2’-O-甲氧基乙基化、2’-O-丁基化、2’-O-戊基化、2’-O-炔丙基化等)；
D-呋喃核糖的2’位和4’位间被交联的交联型核糖核苷酸(例如2’-O,4’-C-亚乙基化、2’-O,4’-C-亚甲基化、2’-O,4’-C-亚丙基化、2’-O,4’-C-四亚甲基化、2’-O,4’-C-五亚甲基化、2’-S,4’-C-亚甲基化、D-呋喃核糖的2’-脱氧-2’-C,4’-C-亚甲基氧基亚甲基化物、S-cEt(2’,4’-限制性乙基)、AmNA等)；
3’-脱氧-3’-氨基-2’-脱氧-D-呋喃核糖、3’-脱氧-3’-氨基-2’-脱氧-2’-氟-D-呋喃核糖、2’-脱氧-2’-氟-D-呋喃核糖、D-脱氧核糖等。
作为磷酸二酯键部分的修饰，可列举出硫代磷酸酯键(包含来源于磷原子的不对称的光学活性体)、甲基膦酸酯键、甲基硫代膦酸酸酯键、二硫代磷酸酯键、氨基磷酸酯键等。
作为碱基部分的修饰，可列举出卤素化，甲基化、乙基化、丙基化、异丙基化、环丙基化、丁基化、异丁基化、仲丁基化、叔丁基化、环丁基化等碳原子数为1～6或1～4的烷基化；羟化；氨基化；脱氨基化；去甲基化等。具体而言，可列举出胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化、N4-甲基化等；胸腺嘧啶的5-去甲基化(尿嘧啶)、5-氟化、5-溴化、5-碘化等；腺嘌呤的N6-甲基化、8-溴化等；鸟嘌呤的N2-甲基化、8-溴化等。
在靶标编辑向导RNA中，选自计数区域的至少1个残基、至少2个残基或3个残基全部可以是天然型核糖核苷酸(RNA)残基以外的核苷酸残基，优选至少1个残基、至少2个残基或3个残基全部为修饰核苷酸残基。计数区域中的修饰核苷酸残基的糖部分和磷酸二酯键中的至少其一可被修饰，可修饰至少糖部分，可修饰至少磷酸二酯键，或可修饰糖部分和磷酸二酯键。例如，靶标对应核苷酸残基可以是具有硫代磷酸酯键的胞苷残基。另外，例如，靶标对应核苷酸残基的5’侧或3’侧的各1个残基的糖部分和磷酸二酯键中的至少其一可被修饰，可修饰至少糖部分，可修饰至少磷酸二酯键，或可修饰糖部分和磷酸二酯键。计数区域中的糖部分的修饰例如可以是2’-O-烷基化、2’-脱氧-2’-氟化、2’-脱氧化等。
在第一寡聚核苷酸的计数区域以外的寡聚核苷酸残基(非计数区域)中，在至少1个残基、至少3个残基或全部残基中，糖部分和磷酸二酯键中的至少其一可被修饰，可修饰至少糖部分，可修饰至少磷酸二酯键，或可修饰糖部分和磷酸二酯键。非计数区域中的糖部分的修饰例如可以是2’-O-烷基化、2’-脱氧-2’-氟化、2’位和4’位间的交联化、2’-脱氧化(DNA化)等。在第一寡聚核苷酸具有多个修饰核苷酸残基的情况下，多个修饰核苷酸残基可连续配置，也可分隔配置。另外，第一寡聚核苷酸可以是通过硫代磷酸酯键连接全部核苷酸残基而构成的。
第一寡聚核苷酸的与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的3’侧寡聚核苷酸可具有选自2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的2种修饰核苷酸残基交替连接的碱基序列。即，与靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的3’侧寡聚核苷酸可具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的碱基序列，可具有交联型核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的碱基序列，可具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。这里所使用的具有2种修饰核苷酸残基交替连接的碱基序列是指作为目标的寡聚核苷酸(在此相当于第一寡聚核苷酸的3’侧寡聚核苷酸)具有2种修饰核苷酸残基部分交替连接的碱基序列，以及作为目标的寡聚核苷酸整体具有2种修饰核苷酸残基交替连接的碱基序列这两种含义，在本说明书的以下说明中也以相同的含义使用。
第一寡聚核苷酸中的3’侧寡聚核苷酸可以是通过硫代磷酸酯键连接一部分核苷酸残基而构成的，也可以是通过硫代磷酸酯键连接全部核苷酸残基而构成的。
在第一寡聚核苷酸的3’侧寡聚核苷酸中，从靶标对应核苷酸残基起沿3’方向计数的第3位核苷酸残基可以是选自2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的修饰核苷酸残基。此外，在3’侧寡聚核苷酸中，从靶标对应核苷酸残基起沿3’方向计数的第3位核苷酸残基可以是选自2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的修饰核苷酸残基，第4位核苷酸残基可以是与第3位核苷酸残基不同的修饰核苷酸残基。在此，从靶标对应核苷酸残基起沿3’方向计数的第3位核苷酸残基是表示不包含靶标对应核苷酸残基自身，以邻接于靶标对应寡聚核苷酸残基的3’方向的核苷酸残基作为第1位而沿3’方向计数的第3位核苷酸残基。
第一寡聚核苷酸的与靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的5’侧寡聚核苷酸可具有连续的2’-O-烷基核糖核苷酸残基的碱基序列。连续的2’-O-烷基核糖核苷酸残基的碱基序列可邻接于靶标对应核苷酸残基。连续的2’-O-烷基核糖核苷酸残基的碱基序列中的残基数例如可以是2个或3个。另外，5’侧寡聚核苷酸也可具有连续的2’-O-烷基核糖核苷酸残基与2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基或交联型核苷酸残基的碱基序列。
第一寡聚核苷酸中的5’侧寡聚核苷酸可以是通过硫代磷酸酯键连接一部分核苷酸残基而构成的，也可以是通过硫代磷酸酯键连接全部核苷酸残基而构成的。
第二寡聚核苷酸分别可在至少1个残基、至少3个残基或全部残基中修饰糖部分和磷酸二酯键中的至少其一，可修饰至少糖部分，可修饰至少磷酸二酯键，或可修饰糖部分和磷酸二酯键。第二寡聚核苷酸中的糖部分的修饰例如可以是2’-O-烷基化、2’-脱氧-2’-氟化、2’位和4’位间的交联化、2’-脱氧化(DNA化)等。在第二寡聚核苷酸具有多个修饰核苷酸残基的情况下，多个修饰核苷酸残基可连续配置，也可分隔配置。
第二寡聚核苷酸可具有连续的2’-O-烷基核糖核苷酸残基的碱基序列。第二寡聚核苷酸可具有选自2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的2种交替连接的碱基序列，可具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基交替连接的碱基序列，可具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。此外，第二寡聚核苷酸从ADAR1选择性的观点出发，从第二寡聚核苷酸的3’末端的核苷酸残基起沿5’方向计数的第2位核苷酸残基可以是选自2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的1种，可以是2’-O-烷基核糖核苷酸残基。在此，从第二寡聚核苷酸的3’末端的核苷酸残基起沿5’方向计数的第2位核苷酸残基是表示不包含3’末端的核苷酸残基自身，以邻接于3’末端的寡聚核苷酸残基的5’方向的核苷酸残基作为第1位而沿5’方向计数的第2位核苷酸残基。
靶标编辑向导RNA在第一寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸之间可包含含有亚烷基氧基单元的连接部。连接部可包含碳原子数为1～8的亚烷基氧基，也可包含由碳原子数为1～8的亚烷基氧基单元构成的聚亚烷基氧基。连接部可在第一寡聚核苷酸的5’侧和第二寡聚核苷酸的3’侧分别进行磷酸二酯键合或经修饰的磷酸二酯键合。即，连接部可与第一寡聚核苷酸的5’末端的糖部分的羟基和第二寡聚核苷酸的3’末端的糖部分的羟基分别进行磷酸二酯键合或经修饰的磷酸二酯键合。靶标编辑向导RNA即使在连接部包含亚烷基氧基单元的情况下也可显示优异的靶标编辑活性。
在连接部包含聚亚烷基氧基的情况下，构成聚亚烷基氧基的亚烷基氧基单元的碳原子数例如可以是2～4、2～3或2。即，亚烷基氧基单元可以是亚乙基氧基单元、亚丙基氧基单元或亚丁基氧基单元，可以是亚乙基氧基单元。构成聚亚烷基氧基的亚烷基氧基单元的数量例如可以是2～10个、2～8个、2～7个或3～6个。构成聚亚烷基氧基的各亚烷基氧基单元可以相同或不同。
在连接部包含亚烷基氧基的情况下，亚烷基氧基的碳原子数例如可以是2～8、2～7或3～6。
在一个方式中，靶标编辑向导RNA可以包含识别靶标RNA的第一寡聚核苷酸、与所述第一寡聚核苷酸的5’侧连接的第二寡聚核苷酸以及将所述第一寡聚核苷酸和所述第二寡聚核苷酸连接的包含亚烷基氧基单元的连接部，所述第一寡聚核苷酸由与所述靶标RNA中的腺苷残基对应的靶标对应核苷酸残基、与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的具有与所述靶标RNA互补的碱基序列的10～24个残基的寡聚核苷酸以及与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的具有与所述靶标RNA互补的碱基序列的3～6个残基的寡聚核苷酸构成，所述第二寡聚核苷酸的残基数为2～10个，在其3’末端缺失与所述靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基，或者是具有不与所述靶标RNA的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基，至少其3’末端以外的核苷酸残基与所述靶标RNA形成互补的双链结构，或者是具有与所述靶标RNA互补的碱基序列而与所述靶标RNA形成互补的双链结构，选自由所述靶标对应核苷酸残基以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的计数区域的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基，诱导针对所述靶标RNA的位点特异性编辑；或为其药学上可接受的盐。构成包含连接部的靶标编辑向导RNA的第一寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸可由上述的修饰核苷酸残基构成。
在一个方式中，靶标编辑向导RNA可以包含识别靶标RNA的第一寡聚核苷酸、与所述第一寡聚核苷酸的5’侧连接的第二寡聚核苷酸以及将所述第一寡聚核苷酸和所述第二寡聚核苷酸连接的包含亚烷基氧基单元的连接部，所述第一寡聚核苷酸由与所述靶标RNA中的腺苷残基对应的靶标对应核苷酸残基、与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的具有与所述靶标RNA互补的碱基序列的10～24个残基的寡聚核苷酸以及与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的具有与所述靶标RNA互补的碱基序列的3～6个残基的寡聚核苷酸构成，所述第二寡聚核苷酸的残基数为2～10个，具有与所述靶标RNA互补的碱基序列而与所述靶标RNA形成互补的双链结构，选自由所述靶标对应核苷酸残基以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的计数区域的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基，诱导针对所述靶标RNA的位点特异性编辑；或为其药学上可接受的盐。构成包含连接部的靶标编辑向导RNA的第一寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸可由上述的修饰核苷酸残基构成。
在一个方式中，靶标编辑向导RNA可以是用选自以下记载的(AD1_ASS1.39)、(AD1_PANK2.39)、(AD1_NPHS2.39)、
(AD1_GRIA2.39)、(AD1_ASS1.52)、(AD1_GRIA2.39e)、
(AD1_ASS1.39e)、(AD1_PANK2.39e)、(AD1_NPHS2.39e)、
(AD1_GRIA2.52e)、(AD1_ASS1.52e)、(AD1_PANK2.52e)、
(AD1_NPHS2.52e)和(AD1_A1AT.39)的式中的任一个表示的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐。
(AD1_ASS1.39)
U(M)^T(L)^G(M)^A(L)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(L)^U(M)^T(L)^G(M)
(AD1_PANK2.39)
A(M)^A(L)^G(M)^A(L)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^U(M)
(AD1_NPHS2.39)
A(M)^T(L)^G(M)^T(L)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(L)^A(M)^C(L)^U(M)
(AD1_GRIA2.39)
G(M)^C(L)^A(M)^T(L)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^C(M)
(AD1_ASS1.52)
U(M)^G(L)^A(M)^U(L)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(L)^G(M)^U(L)^U(M)
(AD1_GRIA2.39e)
G(M)^C(E)^A(M)^T(E)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^C(M)
(AD1_ASS1.39e)
U(M)^T(E)^G(M)^A(E)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(E)^U(M)^T(E)^G(M)
(AD1_PANK2.39e)
A(M)^A(E)^G(M)^A(E)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^U(M)
(AD1_NPHS2.39e)
A(M)^T(E)^G(M)^T(E)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(E)^A(M)^C(E)^U(M)
(AD1_GRIA2.52e)
C(M)^A(E)^U(M)^C(E)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M)
(AD1_ASS1.52e)
U(M)^G(E)^A(M)^T(E)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(E)^G(M)^T(E)^U(M)
(AD1_PANK2.52e)
A(M)^G(E)^A(M)^A(E)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M)
(AD1_NPHS2.52e)
U(M)^G(E)^U(M)^C(E)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^T(E)^U(M)^A(E)^C(M)
(AD1_A1AT.39)
G(M)^T(L)^C(M)^C(L)^C(M)^U(F)^U(F)^C(M)^U(M)^c^i^U(M)^C(F)^G(M)^A(F)^U(M)^G(F)^G(M)^U(F)^C(M)^A(L)^G(M)^C(L)^A(M)
式中，大写字母表示核糖核苷酸残基(RNA)。小写字母表示2’-脱氧核糖核苷酸残基(DNA)。N(M)表示D-呋喃核糖的2’-O-甲基化核糖核苷酸残基。N(F)表示D-呋喃核糖的2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基。N(L)表示D-呋喃核糖的2’-O,4’-C-亚甲基交联化核糖核苷酸残基。N(E)表示D-呋喃核糖的2’-O,4’-C-亚乙基交联化核糖核苷酸残基。“^”表示核苷单元间通过-P(＝S)(OH)-结合，即进行硫代磷酸酯键合。
靶标编辑向导RNA可使用市售的合成机(例如珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司的基于亚磷酰胺法的392型)等，依据公知的文献(例如参照Nucleic Acids Reserch，12，4539(1984))中记载的方法来合成。所使用的亚磷酰胺试剂可使用市售的试剂，也可使用依据公知的文献中记载的方法适当合成的试剂。通过将亚磷酰胺试剂偶联后，使其与硫、二硫化四乙基秋兰姆(TETD，Applied Biosystems公司)、Beaucage试剂(Glen Research公司)、氢化黄原素(Xanthane Hydride)等试剂反应，可导入硫代磷酸酯键(例如参照TetrahedronLetters,32,3005(1991)、J.Am.Chem.Soc.,112,1253(1990)、PCT/WO98/54198)。
寡聚核苷酸(靶标编辑向导RNA)可以药学上可接受的盐的形式使用。“药学上可接受的盐”是寡聚核苷酸的盐。作为这样的盐，可列举出如钠盐、钾盐、锂盐那样的碱金属盐；如钙盐、镁盐那样的碱土金属盐；如铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐那样的金属盐；如铵盐那样的无机盐；如叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N,N’-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐那样的有机盐等氨盐；如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐那样的氢卤酸盐，硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐那样的低级烷烃磺酸盐，如苯磺酸盐、对甲基苯磺酸盐那样的芳基磺酸盐，乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐那样的氨基酸盐等。寡聚核苷酸的药学上可接受的盐的形式优选为寡聚核苷酸的碱金属盐，更优选为钠盐。这些盐可通过公知的方法制造。
另外，寡聚核苷酸及其药学上可接受的盐有时也作为溶剂化物(例如水合物)存在，可以是这样的溶剂化物。
寡聚核苷酸及其药学上可接受的盐中有时存在来源于磷原子的不对称的光学活性体，本发明的寡聚核苷酸中也包含这样的光学活性体。这样的光学活性体可通过公知的方法合成(例如Org.Lett.,114,967(2009)、Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,8,2359(1998)等)。
寡聚核苷酸及其药学上可接受的盐可在5’末端或3’末端经由接头或磷酸二酯键(包含硫代磷酸酯键)等结合有GalNAc、胆固醇、脂肪酸等递送分子。作为这样的递送分子和接头的实例，可列举出Bioconjugate Chem.2019,30,366中记载的物质。结合有递送分子的寡聚核苷酸及其药学上可接受的盐可通过公知的制造方法制造。本说明书中记载的寡聚核苷酸及其药学上可接受的盐也包含结合有这样的递送分子的形式。
在将寡聚核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物用于疾病的治疗的情况下，可将其自身或与适当的药学上可接受的赋形剂、稀释剂等混合，通过片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或糖浆剂等经口给药，或者通过注射剂、栓剂、贴剂或外用剂等非经口给药。
这些制剂可使用赋形剂(例如，如乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇那样的糖衍生物；如玉米淀粉、马铃薯淀粉、α淀粉、糊精那样的淀粉衍生物；如结晶纤维素那样的纤维素衍生物；阿拉伯胶；葡聚糖，如普鲁兰多糖那样的有机系赋形剂；轻质硅酸酐、合成硅酸铝、硅酸钙、偏硅酸铝镁那样的硅酸盐衍生物；如磷酸氢钙那样的磷酸盐；如碳酸钙那样的碳酸盐；如硫酸钙那样的硫酸盐等无机系赋形剂等)、润滑剂(例如硬脂酸；如硬脂酸钙、硬脂酸镁那样的硬脂酸金属盐；滑石；胶体二氧化硅；如蜂蜡、鲸蜡那样的蜡类；硼酸；己二酸；如硫酸钠那样的硫酸盐；乙二醇；富马酸；苯甲酸钠；DL亮氨酸；如月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁那样的月桂基硫酸盐；如硅酸酐、硅酸水合物那样的硅酸类；上述淀粉衍生物等)、粘合剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯比咯烷酮、聚乙二醇(Macrogol)、与所述赋形剂相同的化合物等)、崩解剂(例如，如低取代度羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、内部交联羧甲基纤维素钠那样的纤维素衍生物；如羧甲基淀粉、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮那样的经化学修饰的淀粉/纤维素类等)、乳化剂(例如，如膨润土、VEEGUM那样的胶体性粘土；如氢氧化镁、氢氧化铝那样的金属氢氧化物，如月桂基硫酸钠、硬脂酸钙那样的阴离子表面活性剂；如苯扎氯铵那样的阳离子表面活性剂；如聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯那样的非离子表面活性剂等)、稳定剂(如尼泊金甲酯、尼泊金丙酯那样的对羟基苯甲酸酯类；如氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇那样的醇类；苯扎氯铵；如苯酚、甲酚那样的酚类；硫柳汞；脱氢乙酸；山梨酸等)、矫味矫臭剂(例如通常使用的甜味剂、酸味剂、香料等)、稀释剂等添加剂，通过公知的方法制造。
包含寡聚核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物的治疗剂可含有0.1～250微摩尔/ml的寡聚核苷酸，优选可含有1～50微摩尔/ml。另外，也可含有规定量的寡聚核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物、0.02～10％w/v的碳水化合物或多元醇以及0.01～0.4％w/v的药学上可接受的表面活性剂而构成治疗剂。
作为上述碳水化合物，特别优选单糖类和二糖类中的至少1种。作为这些碳水化合物和多元醇的实例，可列举出葡萄糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和山梨醇。它们可单独使用，也可并用。
另外，作为表面活性剂的优选实例，可列举出聚氧乙烯脱水山梨醇单至三酯、烷基苯基聚氧乙烯、牛磺胆酸钠、胆酸钠和多元醇酯。其中特别优选为聚氧乙烯脱水山梨醇单至三酯，在此，作为酯，特别优选油酸酯、月桂酸酯、硬脂酸酯和棕榈酸酯。它们可单独使用，也可并用。
包含寡聚核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物的治疗剂可进一步优选含有0.03M～0.09M的药学上可接受的中性盐，例如氯化钠、氯化钾和/或氯化钙。
包含寡聚核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物的治疗剂可进一步优选含有0.002～0.05M的药学上可接受的缓冲剂。作为优选的缓冲剂的实例，可列举出柠檬酸钠、甘氨酸钠、磷酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷。这些缓冲剂可单独使用，也可并用。
此外，上述治疗药可以溶液状态供给。但是，由于需要保存一定时间的情况等，为了稳定寡聚核苷酸以防止治疗效果的降低，通常优选预先进行冷冻干燥，在这种情况下，只要在使用时用溶解液(注射用蒸馏水等)进行重构(reconstruction)，即制成给药的液体状态使用即可。因此，本发明的治疗药也包含用于以各成分达到规定的浓度范围的方式用溶解液进行重构来使用的冷冻干燥状态的治疗药。为了促进冷冻干燥物的溶解性，可进一步预先含有白蛋白、甘氨酸等氨基酸。
在将寡聚核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物对人进行给药的情况下，例如可以成人每1天为约0.01mg/kg～100mg/kg(体重)、优选0.1mg/kg～20mg/kg(体重)的给药量，分成1次或多次进行皮下注射、点滴静脉注射或静脉注射，但其给药量或给药次数可根据疾病的种类、症状、年龄、给药方法等适当变更。
疾病的处置方法
疾病的处置方法包括将上述治疗剂对目标进行给药的工序。疾病的处置方法可包括将药理学有效量的上述治疗剂对目标进行给药的工序。在本说明书中使用的“处置”只要是对疾病实施的任何处置即可，例如可列举出疾病的治疗、改善、进展的抑制(恶化的防止)、预防等(优选为治疗或预防)。处置的目标可以是包含人在内的恒温动物，可以是非人恒温动物，也可以是人。
靶标RNA的位点特异性编辑方法
靶标RNA的位点特异性编辑方法包括在腺苷脱氨酶的存在下使靶标RNA与靶标编辑向导RNA接触的工序，所述靶标编辑向导RNA是诱导针对靶标RNA的位点特异性编辑的寡聚核苷酸。靶标编辑向导RNA与靶标RNA部分地形成双链，募集腺苷脱氨酶，由此可将靶标RNA所包含的腺苷残基位点特异性地转换为肌苷残基。靶标RNA的位点特异性编辑方法可进一步包括准备靶标编辑向导RNA的工序。
靶标RNA的位点特异性编辑方法例如可通过将上述靶标编辑向导RNA导入到具有靶标RNA的真核细胞中来进行。靶标编辑向导RNA向真核细胞的导入方法可从核酸药物中使用的各种方法中适当选择而应用。靶标RNA的位点特异性编辑方法可在体外实施，也可在体内实施。
作为其它方式，本发明还包含靶标编辑向导RNA在制造用于疾病(例如遗传性疾病)的处置的药物组合物中的用途、靶标编辑向导RNA在疾病(例如遗传性疾病)的处置中的用途、用于疾病(例如遗传性疾病)的处置的靶标编辑向导RNA。
实施例
以下，通过实施例具体地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
(参考例1)
采用亚磷酰胺法(例如参照Nucleic Acids Research,12,4539(1984),NatureCommunications 6,文章编号:6317(2015))进行具有表1所示的序列(序列号1)的全部由天然型RNA残基构成的寡聚核苷酸(以下也称为AD1-gRNA03)的合成。所得的化合物通过负离子ESI质谱进行鉴定(实测值：7714.8)。
在表1中，下划线部分相当于第一寡聚核苷酸(ASR)，成为靶标的RNA为后面叙述的Rluc_sRNA。认为参考例1的寡聚核苷酸可例如与靶标RNA形成如以下的结构。
[表1]
[化学式1]
(参考例2)
与后面叙述的Rluc_sRNA相同地调制作为模型靶标RNA的在下文显示序列的hGAPDH_sRNA02(序列号3)。作为针对该模型靶标RNA的靶标编辑向导RNA，通过亚磷酰胺法调制在下文显示序列的寡聚核糖核苷酸hGAPDH_AD1(序列号4)。需说明的是，表中的下划线表示编辑靶标的腺苷残基。
[表2]
(实施例1～32)
实施例1～16的寡聚核苷酸是以参考例1的寡聚核苷酸的序列为基础，如表3所示地导入修饰核苷酸而得的。另外，实施例17～32的寡聚核苷酸是以参考例2的寡聚核苷酸的序列为基础，如表4所示地导入修饰核苷酸而得的。这些寡聚核苷酸化合物与参考例1相同地通过亚磷酰胺法合成。需说明的是，在序列中，在合成“18”的部分时，使用DMT六甘醇亚磷酰胺(ChemGenes，目录编号：CLP-9765)。在合成“9”的部分时，使用DMT-三乙氧基乙二醇亚磷酰胺(ChemGenes，目录编号：CLP-1113)。在合成“6”的部分时，使用DMT-己二醇亚磷酰胺(ChemGenes，目录编号：CLP-1120)。在合成“3”的部分时，使用DMT-丙二醇亚磷酰胺(ChemGenes，目录编号：CLP-9908)。“2’-O-甲基核苷”的部分使用Nucleic Acids Research17,3373(1989)中记载的亚磷酰胺体来合成。“DNA”的部分使用Nucleic Acids Research11,4539(1984)中记载的亚磷酰胺体来合成。“2’-O,4’-C-亚甲基核苷”的部分使用国际公开第99/14226号中记载的亚磷酰胺体来合成。“2’-脱氧-2’-氟核苷”的部分使用J.Med.Chem.,36,831(1993)中记载的亚磷酰胺体来合成。
[表3]
[表4]
表中的“分子量”表示通过负离子ESI质谱得到的实测值。在表中的“序列”中大写字母表示RNA，小写字母表示DNA，N(M)表示D-呋喃核糖的2’-O-甲基化，N(F)表示D-呋喃核糖的2’-脱氧-2’-氟化，N(L)表示D-呋喃核糖的2’-O,4’-C-亚甲基化，N(E)表示D-呋喃核糖的2’-O,4’-C-亚乙基化。“3”表示用-O(CH2)3O-表示的接头，“6”表示用-O(CH2)6O-表示的接头，“9”表示用-O(CH2CH2O)3-表示的接头，“18”表示用-O(CH2CH2O)6-表示的接头。“^”表示核苷单元间通过-P(＝S)(OH)-结合。在没有特别说明的情况下，表示核苷单元间或核苷单元与接头通过-P(＝O)(OH)-结合的序列。寡聚核苷酸的5’末端和3’末端的氢原子与化学式中的氧原子结合而成为羟基。以下示出核苷单元的结构。需说明的是，化学式中的虚线部表示结合位点。
[化学式2]
[化学式3]
[化学式4]
[化学式5]
[化学式6]
/>
[化学式7]
[化学式8]
(试验例1)
腺苷脱氨酶的调制
作为腺苷脱氨酶，依据文献(Macbeth,MR.和Bass,BL.Methods Enzymol.424,319-331(2007)、Fukuda,M.等人，Sci.Rep.srep41478(2017))的记载，使用酵母表达系统进行合成、纯化来调制重组hADAR2和hADAR1p110。另外，通过常规方法调制表达hADAR2、hADAR1p110和hADAR1p150的质粒(pcDNA3.1(-
)Hygro_ADAR2、pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p110、pcDNA3.1(-
)Hygro_ADAR1p150)。
模型靶标RNA的调制：Rluc_sRNA的合成
将由psiCHECKTM-2载体(Promega公司)通过常规方法转录而调制的Rluc_WT RNA(序列号5)调制成0.2nM。加入重组hADAR2使得终浓度达到1μM，在编辑反应缓冲液(20mMHEPES-KOH(pH 7.5)、2mM MgCl2、100mM NaCl、0.5mM DTT、0.01％ TritonX-100、5％甘油)中于37℃下孵育2小时，由此进行体外编辑反应。
将编辑反应后的Rluc_WT RNA通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀来纯化。接着，使用Primescript逆转录酶II(TaKaRa)，通过Rluc_WT_BamR01引物(序列号6)合成cDNA。之后，使用Rluc_WT_EcoF01引物(序列号7)和Rluc_WT_BamR01引物(序列号6)、PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR(30个循环，变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、60秒)来扩增cDNA。接着，将所得的cDNA作为插入DNA，如下克隆到pUC19质粒中。将插入DNA和pUC19质粒使用EcoRI(TaKaRa)和BamHI(TaKaRa)在37℃下进行1小时的限制性酶消化后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀，纯化各自的DNA。将限制性酶消化后的pUC19质粒和插入DNA以1:3的摩尔比混合，使用DNA连接试剂盒<Mighty Mix>(TaKaRa)进行连接反应。将所得的连接样品转化至DH5α，使用LB琼脂平板在37℃下培养过夜后，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取质粒。对所得的质粒DNA进行碱基序列分析，得到Rluc_WT的A122突变为G的序列(Rluc_K41R)和克隆了Rluc_K41R的质粒DNA(pUC19-Rluc_K41R)。
以pUC19-Rluc_K41R为模板，5’侧片段使用Rluc_NheF01引物(序列号8)和RL_W104X_RV引物(序列号9)，3’侧片段使用Rluc_XhoR01引物(序列号10)和RL_W104X_FW引物(序列号11)，通过PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)进行第一PCR(30个循环，变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、40秒)。接着，将各自的PCR产物稀释100倍，使用Rluc_NheF01引物和Rluc_XhoR01引物，通过PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)进行第二PCR(30个循环，变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、60秒)，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化，得到具有Rluc_K41R的G311突变为A的序列的DNA(Rluc_K41R_W104X)(序列号14)。
对于所得的DNA(Rluc_K41R_W104X)和psiCHECKTM-2载体(promega)，使用NheI(TaKaRa)和XhoI(TaKaRa)在37℃下进行1小时的限制性酶消化后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀，纯化各自的DNA。将限制性酶消化后的Rluc_K41R_W104X和psiCHECKTM-2载体以3:1的摩尔比混合，使用DNA连接试剂盒<Mighty Mix>(TaKaRa)进行连接反应。将所得的连接样品转化至DH5α，使用LB琼脂平板在37℃下培养过夜。将选出的菌落在LB液体培养基中于37℃下培养过夜，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取质粒。然后，通过碱基序列分析确认所得的质粒的序列。
以确认了序列的质粒为模板，使用T7_Rluc_sRNA_F01引物(序列号12)和Rluc_sRNA_R01引物(序列号13)、PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR(30个循环(变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、20秒))，扩增体外转录反应用模板DNA，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。使用AmpliScribe T7试剂盒(Epicentre Biotechnologies)进行体外转录以得到Rluc_sRNA(序列号15)。对于合成后的Rluc_sRNA，使用含有8M尿素的5％聚丙烯酰胺凝胶进行切下纯化，用于以后的试验。
以下示出Rluc_WT_RNA、Rluc_K41R_W104X和Rluc_sRNA的序列，以及上述中使用的引物的序列。需说明的是，表中的下划线表示编辑靶标的腺苷残基。
[表5]
[表6]
[表7]
细胞培养
将HeLa细胞在24孔板中传代至5.0×104个细胞/孔，培养48小时。使用Lipofectamine 3000(Thermo)转染50ng的表达靶标RNA的质粒(psiCHECK2_Rluc_K41R_W104X)、350ng的表达ADAR的质粒(pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR2、pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p110或pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p150)、10nM的作为实施例1～16的寡聚核苷酸的gRNA。转染后，培养48小时，然后回收细胞。
编辑分析方法
使用Sepasol RNA I Super G(Nacalai)从在24孔板中培养的细胞中提取总RNA，使用重组DNA酶I(TaKaRa)进行DNA酶处理后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。使用PrimeScript II逆转录酶(TaKaRa)、0.5μg的总RNA、0.25μM Oligo(dT)17(序列号16)进行逆转录反应，扩增cDNA。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、Rluc_F01引物(序列号17)、3’-Adp引物(序列号18)进行第一PCR(30个循环(变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、60秒))。以将第一PCR产物稀释200倍而得的cDNA为模板，使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、Rluc_F01引物(序列号17)、Rluc_R01引物(序列号19)进行第二PCR(30个循环(变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、60秒))，扩增Rluc片段。使用Big DyeTerminator v3.1循环测序试剂盒(Thermo Fisher Scientific)、0.165μM Rluc_sRNA_F01引物(序列号20)进行测序反应，通过Applied Biosystems 3500基因分析仪(ThermoFisher Scientific)进行分析。根据通过测序得到的色谱图，由靶标位点(A311)的峰高比(G/(G+A))算出编辑比例(％)。
[表8]
荧光素酶报告基因分析方法
使用双荧光素酶报告基因分析系统(Promega)。对在24孔板中培养的细胞使用100μL的被动裂解缓冲液(Promega)得到细胞提取液。向20μL所得的细胞提取液中添加100μL的LARII，60秒后，通过GloMax(R)20/20光度计(Promega)测定萤火虫荧光素酶(Fluc)的发光强度。然后立即添加100μL的Stop&Glo试剂，60秒后测定海肾荧光素酶(Rluc)的发光强度。发光强度通过Fluc归一化。
将使用实施例化合物(AD1-gRNA03_1至AD1-gRNA03_4)的情况下的编辑比例(％)在图1A中示出。在转染表达ADAR1的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(gRNA(-))相比，显示出30％～70％左右的编辑比例。在转染表达ADAR2的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(gRNA(-))相比，显示出40％～60％左右的编辑比例。将使用实施例化合物(AD1-gRNA03_1至AD1-gRNA03_4)的情况下的荧光素酶报告基因分析的结果在图1B中示出。在使用实施例化合物(AD1-gRNA03_1至AD1-gRNA03_4)的情况下，与不使用gRNA的情况(gRNA(-))相比，观察到高荧光素酶活性。
将使用实施例化合物(AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_9至AD1-gRNA03_16)的情况下的编辑比例(％)在图2A中示出。在转染表达ADAR的质粒的情况下，AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_9至AD1-gRNA03_16与不使用gRNA的情况(gRNA(-))相比，显示出高编辑比例。另外，在使用实施例化合物(AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_9至AD1-gRNA03_16)的情况下，与不使用gRNA的情况(gRNA(-))相比，观察到较高的荧光素酶活性。
(试验例2)
基于内源性ADAR的细胞内编辑诱导能力评价
除了不使用表达ADAR的质粒而只转染25ng的报告质粒、50nM的作为实施例化合物的gRNA以外，与上述相同地评价了由实施例化合物(AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_9至AD1-gRNA03_16)所致的细胞内编辑诱导能力。
将使用实施例化合物(AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_9至AD1-gRNA03_16)的情况下的荧光素酶报告基因分析的结果在图3中示出。在使用实施例化合物(AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_9至AD1-gRNA03_16)的情况下，与不加入gRNA的情况(gRNA(-))相比，观察到荧光素酶活性提高。另外，对编辑比例也进行了调查，结果显示，在使用实施例化合物(AD1-gRNA03_4、AD1-gRNA03_15)的情况下，分别显示出9.0±0.1％、4.1±2.3％的编辑比例(±S.D.％)，显示出比背景(分别为1.3±1.4％、0.9±0.4％)更高的值。
[表9]
(试验例3)
由作为实施例化合物的gRNA所致的针对GAPDH基因序列的细胞内编辑诱导能力评价
将HEK293细胞在24孔板中传代至5.0×104个细胞/孔，培养48小时。使用Lipofectamine 3000(Thermo)转染500ng的表达ADAR的质粒(pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR2、pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p110或pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p150)、50nM的作为实施例化合物的gRNA。转染后，培养48小时，然后回收细胞。
编辑分析方法
与试验例1的编辑分析方法中记载的方法相同地扩增cDNA。使用PrimeStar GXLDNA聚合酶(TaKaRa)、GAPDH_FW引物(序列号21)、GAPDH_RV引物(序列号22)进行PCR(30个循环(变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、60秒))，扩增GAPDH片段。使用Big DyeTerminator v3.1循环测序试剂盒(Thermo Fisher Scientific)、0.165μM GAPDH_seqF01引物(序列号23)进行测序反应，通过Applied Biosystems 3500基因分析仪(ThermoFisher Scientific)进行分析。根据通过测序得到的色谱图，由靶标位点的峰高比(G/(G+A))算出编辑比例(％)。
[表10]
将使用实施例化合物(hGAPDH_AD1_4、hGAPDH_AD1_17至hGAPDH_AD1_19)的情况下的编辑比例(％)在图4A中示出。在转染表达ADAR1的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(gRNA(-))相比，显示出15％～25％左右的高编辑比例。在转染表达ADAR2的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(gRNA(-))相比，显示出稍高的编辑比例。
将使用实施例化合物(hGAPDH_AD1_4、hGAPDH_AD1_20至hGAPDH_AD1_28)的情况下的编辑比例(％)在图4B中示出。在转染表达ADAR1的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(gRNA(-))相比，显示出10％至30％左右的高编辑比例。在转染表达ADAR2的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况相比，显示出高编辑比例。
将使用实施例化合物(hGAPDH_AD1_4、hGAPDH_AD1_29、hGAPDH_AD1_31和hGAPDH_AD1_32)的情况下的编辑比例(％)在图5中示出。在转染表达ADAR1的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(gRNA(-))相比，显示出15％至30％左右的高编辑比例。在转染表达ADAR2的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(gRNA(-))相比，显示出较高的编辑比例。
(实施例33～49)
实施例33～49的寡聚核苷酸是以参考例2的寡聚核苷酸序列为基础，通过如表11所示地导入修饰核苷酸而得的。这些寡聚核苷酸与参考例1相同地通过亚磷酰胺法合成。需说明的是，在序列中，在合成“mU”的部分时，使用N3-甲基尿苷CED亚磷酰胺(ChemGenes，目录编号：ANP-7451)，在合成“d”的部分时，使用无碱基间隔物(dSpacer)CE亚磷酰胺(GlenResearch，目录编号：10-1914)，在使用“mc”的部分时，使用N3-甲基脱氧胞苷CED亚磷酰胺(ChemGenes，目录编号：ANP-3851)。另外，在合成“mt”的部分时，使用N3-甲基胸苷CED亚磷酰胺(ChemGenes，目录编号：ANP-6153)。关于其它的修饰核苷酸的详细情况如上所述。
[表11]
在表中的“序列”中，“mU”表示N3-甲基尿苷，“d”表示1,2-二脱氧核糖，“mc”表示N3-甲基-2’-脱氧胞苷，“mt”表示N3-甲基胸苷。另外，关于其它的缩写如上所述。需说明的是，寡聚核苷酸的5’末端和3’末端的氢原子与图中的氧原子结合而成为羟基。
[化学式9]
(参考例3～7)
作为以疾病序列为靶标的靶标编辑向导RNA，通过亚磷酰胺法调制具有以下所示的序列的全部由天然型RNA残基构成的寡聚核苷酸。所得的化合物通过负离子ESI质谱进行鉴定。
[表12]
参考例 序列名称 序列(5′-3′) 分子量 序列号
3 AD1_AGXT CAGAGUCCCCGAAGCCAUCAAGGG 7707.99 24
4 AD1_GNE GCCCUUUUCCGCAUCACUCGAACC 7478.55 25
5 AD1_EYS UGAUCCUUCCACCCAGUGGUACAA 7568.23 26
6 AD1_HFE CUCCACUGGCACGUAUAUCUCUGC 7522.82 27
7 AD1_UGT1A1 UAAAAUCUCCGUCUCUGAUGUACA 7557.97 28
(实施例50～64)
实施例50～64的寡聚核苷酸是以参考例3～7的寡聚核苷酸序列为基础，通过如表13所示地导入修饰核苷酸而得的。这些寡聚核苷酸与参考例1相同地通过亚磷酰胺法合成。需说明的是，关于修饰核苷酸的详细情况如上所述。
[表13]
关于表中的“序列”中的缩写如上所述。需说明的是，寡聚核苷酸的5’末端和3’末端的氢原子与图中的氧原子结合而成为羟基。
(试验例4)
对于实施例33～49中得到的化合物，与试验例3相同地评价由寡聚核苷酸所致的针对hGAPDH基因序列的细胞内编辑诱导活性。
将使用实施例化合物(hGAPDH_AD1_4、hGAPDH_AD1_31、hGAPDH_AD1_33至hGAPDH_AD1_40)的情况下的编辑比例(％)在图6中示出。在转染表达ADAR1的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(图中gRNA(-))相比，显示出高编辑比例。在转染表达ADAR2的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(图中gRNA(-))相比，显示出高编辑比例。特别是，使靶标对应核苷酸残基为mU的实施例33的hGAPDH_AD1_33显示出高编辑比例。另外，在与靶标RNA的结合位点处将LNA导入4个或6个位置处的实施例39和实施例40(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_40)显示出最高的编辑比例。
进一步地，进行了未转染表达ADAR1或ADAR2的质粒而只以50nM的浓度转染作为实施例化合物的gRNA的情况下的细胞内编辑诱导评价，结果显示，在使用实施例化合物(hGAPDH_AD1_39或hGAPDH_AD1_40)的情况下，在HeLa细胞中分别显示出13.6±1.7％、13.9±1.6％的编辑比例(±S.D.％)，显示出明显比背景(5.0±0.9％)高的值。另外，在HEK293细胞中，在使用实施例化合物(hGAPDH_AD1_39或hGAPDH_AD1_40)的情况下，分别显示出16.1±3.9％、16.2±1.0％的编辑比例(±S.D.％)，显示出明显比背景(4.4±0.7％)高的值。
将使用实施例化合物(hGAPDH_AD1_4、hGAPDH_AD1_31、hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_41、hGAPDH_AD1_43、hGAPDH_AD1_44、hGAPDH_AD1_46至hGAPDH_AD1_51)的情况下的编辑比例(％)在图7A中示出。在转染表达ADAR1的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(图中gRNA(-))相比，显示出高编辑比例。在转染表达ADAR2的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(图中gRNA(-))相比，显示出高编辑比例。特别是，在与靶标RNA的结合位点处导入LNA的实施例39和43～49(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_44和hGAPDH_AD1_46至hGAPDH_AD1_51)显示出高编辑比例。
进一步地，将未转染表达ADAR1或ADAR2的质粒而只以50nM的浓度转染作为实施例化合物的gRNA的情况下的细胞内编辑诱导评价的编辑比例(％)在图7B中示出。在使用实施例化合物(hGAPDH_AD1_31、hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_44、hGAPDH_AD1_47至hGAPDH_AD1_51)的情况下，在HEK293细胞或HeLa细胞中显示出明显比背景高的编辑比例。
(试验例5)
针对具有AGXT基因序列的模型靶标RNA的编辑诱导能力评价
(A)AGXT_RNA的合成
使用AGXT_FW(序列号29)、AGXT_RV(序列号30)的寡聚DNA和NEBuffer2(NEB)进行退火反应(在80℃下加热3min，用15min冷却至25℃)，制作插入物。使用EcoRI(TaKaRa)和HindIII(TaKaRa)在37℃下针对pUC19进行1小时的反应后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。以插入物:质粒为3:1的摩尔比加入，使用DNA连接试剂盒<Mighty Mix>(TaKaRa)进行连接反应。将所得的连接样品转化至DH5α，使用LB琼脂平板在37℃下培养过夜。将选出的菌落用LB液体培养基在37℃下培养过夜，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取质粒。使用Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Thermo Fisher Scientific)、0.165μM的pUC19_seqFW引物(序列号31)和0.165μM的pUC19_seqRV引物(序列号32)对100ng的所得质粒进行测序反应，通过Applied Biosystems 3500基因分析仪(Thermo FisherScientific)进行序列分析，确认已合成了pUC19_AGXT质粒。以pUC19_AGXT为模板，使用T7_pUC19_FW(序列号33)和M13_RV引物(序列号34)、PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR(变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、20秒)，制作模板DNA，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。使用AmpliScribe T7试剂盒(Epicentre Biotechnologies)进行体外转录，使用含有8M尿素的5％聚丙烯酰胺凝胶进行切下纯化，作为模型靶标RNA合成AGXT_RNA。
[表14]
(B)退火反应
在退火缓冲液(10mM Tri-HCl(pH 7.6)，150mM NaCl)中将0.3μM的AGXT_RNA和0.9μM的实施例50、55(AD1_AGXT.2、AD1_AGXT.3)以及参考例3(AD1_AGXT)的化合物(以下有时简写为gRNA)80℃加热3min，用15min冷却至25℃。
(C)体外编辑反应
假设AGXT_RNA通过退火反应与gRNA完全形成复合物，计算以下AGXT_RNA-gRNA复合物浓度。使用ADAR2的编辑反应通过以下来进行：在编辑反应缓冲液(20mM HEPES-KOH(pH7.5)、2mM MgCl2、100mM NaCl、0.5mM DTT、0.01％ TritonX-100、5％甘油)中针对5nMAGXT_RNA-gRNA复合物加入重组hADAR2以使得终浓度达到12.5nM，并在37℃下孵育30分钟。使用ADAR1的编辑反应通过以下来进行：在编辑反应缓冲液(20mM HEPES-KOH(pH 7.5)、2mMMgCl2、100mM NaCl、0.5mM DTT、0.01％TritonX-100、5％甘油)中针对5nM AGXT_RNA-gRNA复合物加入重组hADAR1p110以使得终浓度达到250nM，并在37℃下孵育30分钟。
(D)编辑分析方法
将编辑反应后的AGXT_RNA通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化，使用Primescript逆转录酶II(TaKaRa)，通过M13_RV引物(序列号34)合成cDNA。然后，使用T7_pUC19_FW引物(序列号33)和M13_RV引物(序列号34)以及PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR(变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、20秒)扩增cDNA。所得的cDNA的序列分析使用T7proGGG引物(序列号35)、Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒进行测序反应，通过Applied Biosystem 3500基因分析仪(Thermo Fisher Scientific)进行分析。根据通过测序得到的色谱图，由靶标位点的峰高比(G/(G+A))算出编辑比例(％)。
(E)编辑分析的结果
将编辑比例的结果在图8中示出。由ADAR1p110所致的RNA编辑效率，与全部由天然型RNA构成的参考例3(AD1_AGXT，在图中为AGXT的AD1g)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸的3’侧鸟苷变为2’-脱氧鸟苷的实施例50(AD1_AGXT.2，在图中为AGXT的AD1g.2)显示出高编辑比例。另外，使靶标对应核苷酸的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例55(AD1_AGXT.3，在图中为AGXT的AD1g.3)显示出更高的编辑比例。这表明，在靶标RNA中作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧为胞苷的情况下，作为gRNA中的靶标对应核苷酸的3’侧核苷酸残基，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
(试验例6)
针对具有GNE基因序列的模型靶标RNA的编辑诱导能力评价
(A)GNE_RNA的合成
除了使用以下所示的GNE_FW(序列号36)和GNE_RV(序列号37)代替AGXT_FW和AGXT_RV作为寡聚DNA以外，与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行，合成表达模型靶标RNA的pUC_GNE质粒，使用该质粒合成GNE_RNA作为模型靶标RNA。
[表15]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
使用实施例51、56(AD1_GNE.2、AD1_GNE.3)和参考例4(AD1_GNE)的化合物，采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法评价编辑诱导能力。
(C)编辑分析的结果
将编辑比例的结果在图8中示出。由ADAR1p110所致的RNA编辑效率，与全部由天然型RNA构成的参考例4(AD1_GNE，在图中为GNE的AD1g)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸的3’侧鸟苷变为2’-脱氧鸟苷的实施例51(AD1_GNE.2，在图中为GNE的AD1g.2)显示出高编辑比例。另外，使靶标对应核苷酸位的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例56(AD1_GNE.3，在图中为GNE的AD1g.3)显示出更高的编辑比例。这表明，在靶标RNA中作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧为胞苷的情况下，作为gRNA中的靶标对应核苷酸的3’侧核苷酸残基，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
(试验例7)
针对具有EYS基因序列的模型靶标RNA的编辑诱导能力评价
(A)EYS_RNA的合成
除了使用以下所示的EYS_FW(序列号38)和EYS_RV(序列号39)代替AGXT_FW和AGXT_RV作为寡聚DNA以外，与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行，合成表达模型靶标RNA的pUC_EYS质粒，使用该质粒合成EYS_RNA作为模型靶标RNA。
[表16]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
使用实施例52、57(AD1_EYS.2、AD1_EYS.3)和参考例5(AD1_EYS)的化合物，采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法评价编辑诱导能力。
(C)编辑分析的结果
将编辑比例的结果在图8中示出。由ADAR1p110所致的RNA编辑效率，与全部由天然ga型RNA构成的参考例5(AD1_EYS，在图中为EYS的AD1g)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸的3’侧鸟苷变为2’-脱氧鸟苷的实施例52(AD1_EYS.2，在图中为EYS的AD1g.2)显示出高编辑比例。另外，使靶标对应核苷酸位的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例57(AD1_EYS.3，在图中为EYS的AD1g.3)显示出更高的编辑比例。这表明，在靶标RNA中作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧为胞苷的情况下，作为gRNA中的靶标对应核苷酸的3’侧核苷酸残基，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
(试验例8)
针对具有HFE基因序列的模型靶标RNA的编辑诱导能力评价
(A)HFE_RNA的合成
除了使用以下所示的HFE_FW(序列号40)和HFE_RV(序列号41)代替AGXT_FW和AGXT_RV作为寡聚DNA以外，与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行，合成表达模型靶标RNA的pUC_HFE质粒，使用该质粒合成HFE_RNA作为模型靶标RNA。
[表17]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
使用实施例53、58(AD1_HFE.2、AD1_HFE.3)和参考例6(AD1_HFE)的化合物，采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法评价编辑诱导能力。
(C)编辑分析的结果
将编辑比例的结果在图8中示出。由ADAR1p110所致的RNA编辑效率，与全部由天然型RNA构成的参考例6(AD1_HFE，在图中为HFE的AD1g)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸的3’侧鸟苷变为2’-脱氧鸟苷的实施例53(AD1_HFE.2，在图中为HFE的AD1g.2)显示出高编辑比例。另外，使靶标对应核苷酸位的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例58(AD1_HFE.3，在图中为HFE的AD1g.3)显示出更高的编辑比例。这表明，在靶标RNA中作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧为胞苷的情况下，作为gRNA中的靶标对应核苷酸的3’侧核苷酸残基，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
(试验例9)
针对具有UGT1A1基因序列的模型靶标RNA的编辑诱导能力评价
(A)UGT1A1_RNA的合成
除了使用以下所示的UGT1A1_FW(序列号42)和UGT1A1_RV(序列号43)代替AGXT_FW和AGXT_RV作为寡聚DNA以外，与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行，合成表达模型靶标RNA的pUC_UGT1A1质粒，使用该质粒合成UGT1A1_RNA作为模型靶标RNA。
[表18]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
使用实施例54、59(AD1_UGT1A1.2、AD1_UGT1A1.3)和参考例7(AD1_UGT1A1)的化合物，采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法评价编辑诱导能力。
(C)编辑分析的结果
将编辑比例的结果在图8中示出。由ADAR1p110所致的RNA编辑效率，与全部由天然型RNA构成的参考例7(AD1_UGT1A1，在图中为UGT1A1的AD1g)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸的3’侧鸟苷变为2’-脱氧鸟苷的实施例54(AD1_UGT1A1.2，在图中为UGT1A1的AD1g.2)显示出高编辑比例。另外，使靶标对应核苷酸位的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例59(AD1_UGT1A1.3，在图中为UGT1A1的AD1g.3)显示出更高的编辑比例。这表明，在靶标RNA中作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧为胞苷的情况下，作为gRNA中的靶标对应核苷酸的3’侧核苷酸残基，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
(试验例10)
gRNA针对培养细胞内具有AGXT基因序列的模型靶标RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA表达质粒的合成
以试验例5(A)中得到的pUC19_AGXT为模板，使用DS_疾病_XhoF01引物(序列号44)和DS_疾病_KpnR01引物(序列号45)、PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR(30个循环，变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、20秒)制作插入DNA，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。使用XhoI(TaKaRa)和KpnI(TaKaRa)在37℃下针对插入DNA、pcDNA3.1(-)Hygro进行1小时的反应后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。以插入物:质粒为3:1的摩尔比加入，使用DNA连接试剂盒<Mighty Mix>(TaKaRa)进行连接反应。将所得的连接样品转化至DH5α，使用LB琼脂平板在37℃下培养过夜。将选出的菌落用LB液体培养基在37℃下培养过夜，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取质粒。使用Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Thermo Fisher Scientific)、0.165μM的pcDNA3_1pro_F01引物(序列号46)和0.165μM的pcDNA31-seqR01引物(序列号47)对100ng的所得质粒进行测序反应，通过Applied Biosystems 3500基因分析仪(Thermo FisherScientific)进行序列分析，确认已合成了pcDNA3.1(-)Hygro_AGXT。
[表19]
(B)细胞培养
将HEK293细胞以5.0×104个细胞/孔接种到24孔板中，培养48小时。使用Lipofectamine 3000(Thermo)转染10ng的pcDNA3.1(-)Hygro_AGXT、500ng的表达ADAR的质粒(pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR2、pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p110或pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p150)和50nM的gRNA(实施例60，AD1_AGXT.30)，培养48小时。
(C)编辑分析
使用Sepasol RNA I Super G(Nacalai)从在24孔板中培养的细胞中提取总RNA，使用重组DNA酶I(TaKaRa)进行DNA酶处理后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。使用PrimeScript II逆转录酶(TaKaRa)、0.5μg的总RNA、0.25μM Oligo(dT)17进行逆转录反应，扩增cDNA。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、T7proGGG引物(序列号35)、3’-Adp引物(序列号48)进行第一PCR。以将第一PCR产物稀释200倍而得的cDNA为模板，使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、DS_疾病_XhoF01引物(序列号44)、DS_疾病_KpnR01引物(序列号45)进行第二PCR，扩增AGXT片段。使用Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒、0.165μM DS_疾病_XhoF01引物进行测序反应，通过Applied Biosystem 3500基因分析仪进行分析。根据通过测序得到的色谱图，由靶标位点的峰高比(G/(G+A))算出编辑比例。
(D)编辑分析的结果
将使用实施例60的化合物(AD1_AGXT_30)的情况下的编辑比例(％)在图9中示出。在转染靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA的情况下，显示出30％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出60％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出70％左右的高编辑比例。
(试验例11)
gRNA针对培养细胞内具有GNE基因序列的模型靶标RNA的编辑诱导能力评价
除了以试验例6(A)中得到的pUC19_GNE代替pUC19_AGXT成为模板来构建靶标RNA表达质粒以及使用实施例61的AD1_GNE_30作为gRNA以外，依据试验例10的(A)～(C)，评价gRNA对培养细胞内GNE基因序列的编辑诱导能力。
将使用实施例61的化合物(AD1_GNE_30)的情况下的编辑比例(％)在图9中示出。在转染靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA的情况下，显示出10％左右的编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出50％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出60％左右的高编辑比例。
(试验例12)
gRNA针对培养细胞内具有EYS基因序列的模型靶标RNA的编辑诱导能力评价
除了以试验例7(A)中得到的pUC19_EYS代替pUC19_AGXT成为模板来构建靶标RNA表达质粒以及使用实施例62的AD1_EYS_29作为gRNA以外，依据试验例10的(A)～(C)，评价gRNA对培养细胞内EYS基因序列的编辑诱导能力。
将使用实施例62的化合物(AD1_EYS_29)的情况下的编辑比例(％)在图9中示出。在转染靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA的情况下，显示出10％左右的编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出40％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出50％～60％左右的高编辑比例。
(试验例13)
gRNA针对培养细胞内具有HFE基因序列的模型靶标RNA的编辑诱导能力评价
除了以试验例8(A)中得到的pUC19_HFE代替pUC19_AGXT成为模板来构建靶标RNA表达质粒以及使用实施例63的AD1_HFE_29作为gRNA以外，依据试验例10的(A)～(C)，评价gRNA对培养细胞内HFE基因序列的编辑诱导能力。
将使用实施例63的化合物(AD1_HFE_29)的情况下的编辑比例(％)在图9中示出。在转染靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA的情况下，显示出10％左右的编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出40％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出50％左右的高编辑比例。
(试验例14)
gRNA针对培养细胞内具有UGT1A1基因序列的模型靶标RNA的编辑诱导能力评价
除了以试验例9(A)中得到的pUC19_UGT1A1代替pUC19_AGXT成为模板来构建靶标RNA表达质粒以及使用实施例64的AD1_UGT1A1_30作为gRNA以外，依据试验例10的(A)～(C)，评价gRNA对培养细胞内UGT1A1基因序列的编辑诱导能力。
将使用实施例64的化合物(AD1_UGT1A1_30)的情况下的编辑比例(％)在图9中示出。在转染靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA的情况下，显示出10％左右的编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出40％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出60％左右的高编辑比例。
(参考例8～22)
作为以疾病序列为靶标的靶标编辑向导RNA，与参考例1相同地通过亚磷酰胺法合成具有以下所示的序列的全部由天然型核糖核苷酸残基构成的寡聚核苷酸。表中的“分子量”表示通过负离子ESI质谱得到的实测值，“-”表示未测定。
[表20]
在表中的“序列”中大写字母表示RNA。参考例8～22的寡聚核苷酸的5’末端和3’末端的氢原子与氧原子结合而成为羟基。
(实施例65～136)
实施例65～136的化合物是分别以参考例2、参考例8～22的寡聚核苷酸的序列为基础，通过如表21～表24所示地导入修饰核苷酸而得的。这些寡聚核苷酸与参考例1相同地通过亚磷酰胺法合成。需说明的是，在序列中，在合成“ec”的部分时，使用N3-乙基脱氧胞苷CED亚磷酰胺(ChemGene，目录编号：ANP-3856)。在合成“T”的部分时，使用核糖胸苷CED亚磷酰胺(ChemGene，目录编号：ANP-7511)。
[表21]
[表22]
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[表23]
[表24]
表中的“分子量”表示通过负离子ESI质谱得到的实测值。在表中的“序列”中“T”表示核糖胸苷，“ec”表示N3-乙基-2’-脱氧胞苷。另外，其它的缩写如上所述。需说明的是，寡聚核苷酸的5’末端和3’末端的氢原子与氧原子结合而成为羟基。
[化学式10]
(试验例15)作为实施例化合物的gRNA对培养细胞内GAPDH基因序列的编辑诱导能力评价(3)
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例3相同的方法。将使用实施例39、40和102～106的化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_40、hGAPDH_AD1_52至hGAPDH_AD1_56)的情况下的编辑比例(％)在图10中示出。
在转染表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(图中gRNA(-))相比，显示出高编辑比例。特别是，在与靶标RNA的结合位点处导入LNA的实施例39、40和102的化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_40、hGAPDH_AD1_52)显示出最高的编辑比例。进一步地，进行了只以50nM的浓度转染作为实施例化合物的gRNA的情况下的细胞内编辑诱导评价，结果显示，与gRNA(-)相比，显示出较高的编辑比例。
将使用实施例39、100、101、105和107～112的化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_42、hGAPDH_AD1_45、hGAPDH_AD1_55、hGAPDH_AD1_57至hGAPDH_AD1_62)的情况下的编辑比例(％)在图11中示出。
在转染表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(图中gRNA(-))相比，显示出较高的编辑比例。特别是在与靶标RNA的结合位点处导入LNA的实施例39、105和112的化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_55、hGAPDH_AD1_62)显示出最高的编辑比例。此外，进行了只以50nM的浓度转染作为实施例化合物的gRNA的情况下的细胞内编辑诱导评价，结果显示，与gRNA(-)相比，显示出高编辑比例。
将使用实施例化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_62至hGAPDH_AD1_75)的情况下的编辑比例(％)在图12A中示出。
在转染表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(图中gRNA(-))相比，显示出高编辑比例。特别是，导入脱氧核苷酸残基或核糖核苷酸残基作为靶标对应核苷酸残基的实施例39、112、115～118和120的化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_62、hGAPDH_AD1_65至hGAPDH_AD1_68、hGAPDH_AD1_70)显示出特别高的编辑比例。进一步地，进行只以50nM的浓度转染作为实施例化合物的gRNA的情况下的细胞内编辑诱导评价，结果显示，与gRNA(-)相比，显示出高编辑比例。
将使用实施例化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_76至hGAPDH_AD1_85)的情况下的编辑比例(％)在图12B中示出。
在转染表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒的情况下，与不使用gRNA的情况(图中gRNA(-))相比，显示出高编辑比例。特别是，导入2’-O-Me-核糖核苷酸残基作为靶标对应核苷酸残基的实施例131～133、135的化合物(hGAPDH_AD1_81至hGAPDH_AD1_83、hGAPDH_AD1_85)显示出特别高的编辑比例。
(试验例16)针对具有hGAPDH基因序列的RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA的合成
与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行操作。但是，寡聚DNA使用以下的GAPDH_FW(序列号64)和GAPDH_RV(序列号65)。
[表25]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法。
(C)编辑分析的结果
将由ADAR1p110所致的编辑比例的结果在图13A和图13B中示出。由ADAR1p110所致的RNA编辑效率，与不添加gRNA的情况相比，实施例39、112～135的化合物(hGAPDH_AD1_39、hGAPDH_AD1_62至85)显示出高编辑比例。特别是，表明了将脱氧核糖核苷酸残基、核糖核苷酸残基、2’-F-核糖核苷酸残基或2’-O-Me-核糖核苷酸残基用于靶标对应核苷酸残基的情况显示出高编辑比例。
(试验例17)针对具有因子V基因序列的RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA的合成
与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行操作。但是，寡聚DNA使用具有以下记载的因子V基因序列的寡聚DNA。这里所使用的因子V基因序列具有GenBank登录号NM_000130.45的1682位～1706位的碱基序列，而进一步具有被称为c.1601G>A的核苷的突变(rs6025)。
[表26]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例5的(B)和(D)相同的方法。
(C)编辑分析的结果
将由ADAR1p110所致的编辑比例的结果在图14A中示出。由ADAR1p110所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例8的化合物(AD1_因子V，在图中为因子V的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例65的化合物(AD1_因子V.3，在图中为因子V的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
将由ADAR2所致的编辑比例的结果在图14B中示出。关于由ADAR2所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例8的化合物(AD1_因子V，在图中为因子V的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例65(AD1_因子V.3，在图中为因子V的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
(试验例18)针对具有CBS基因序列的RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA的合成
与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行操作。但是，寡聚DNA使用具有以下记载的CBS基因序列的寡聚DNA。这里所使用的CBS基因序列具有GenBank登录号NM_000071.2的1561位～1585位的碱基序列，进一步具有被称为c.1330G>A的核苷的突变(rs28934891)。
[表27]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法。
(C)编辑分析的结果
将由ADAR1p110所致的编辑比例的结果在图14A中示出。由ADAR1p110所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例12的化合物(AD1_CBS，在图中为CBS的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例69的化合物(AD1_CBS.3，在图中为CBS的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
将由ADAR2所致的编辑比例的结果在图14B中示出。由ADAR2所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例12的化合物(AD1_CBS，在图中为CBS的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例69的化合物(AD1_CBS.3，在图中为CBS的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
(试验例19)针对具有PAH基因序列的RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA的合成
与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行操作。但是，寡聚DNA使用具有以下记载的PAH基因序列的寡聚DNA。这里所使用的PAH基因序列具有GenBank登录号NM_000277.3的882位～906位的碱基序列，进一步具有被称为c.782G>A的核苷的突变(rs5030849)。
[表28]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法。
(C)编辑分析的结果
将由ADAR1p110所致的编辑比例的结果在图14A中示出。由ADAR1p110所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例9的化合物(AD1_PAH.1，在图中为PAH的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例66的化合物(AD1_PAH.1.3，在图中为PAH的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
将由ADAR2所致的编辑比例的结果在图14B中示出。由ADAR2所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例9的化合物(AD1_PAH.1，在图中为PAH的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例66的化合物(AD1_PAH.1.3，在图中为PAH的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
(试验例20)针对具有ASS1基因序列的RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA的合成
与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行操作。但是，寡聚DNA使用具有以下记载的ASS1基因序列的寡聚DNA。这里所使用的ASS1基因序列具有GenBank登录号NM_000050.4的1510位～1534位的碱基序列，进一步具有被称为c.1168G>A的核苷的突变(rs121908641)。
[表29]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法。
(C)编辑分析的结果
将由ADAR1p110所致的编辑比例的结果在图14A中示出。由ADAR1p110所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例10的化合物(AD1_ASS1，在图中为ASS1的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例67的化合物(AD1_ASS1.3，在图中为ASS1的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
将由ADAR2所致的编辑比例的结果在图14B中示出。由ADAR2所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例10的化合物(AD1_ASS1，在图中为ASS1的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例67的化合物(AD1_ASS1.3，在图中为ASS1的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
(试验例21)针对具有GRIA2基因序列的RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA的合成
与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行操作。但是，寡聚DNA使用具有以下记载的GRIA2基因序列的寡聚DNA。这里所使用的GRIA2基因序列具有GenBank登录号NM_000826.4的2121号～2145号的碱基序列，进一步地，第2135位的腺苷是在ALS疾病中ADAR2的表达降低的情况下，向肌苷的编辑效率降低的位点。
[表30]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法。
(C)编辑分析的结果
将由ADAR1p110所致的编辑比例的结果在图14A中示出。由ADAR1p110所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例13的化合物(AD1_GRIA2，在图中为GRIA2的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例70的化合物(AD1_GRIA2.3，在图中为GRIA2的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
将由ADAR2所致的编辑比例的结果在图14B中示出。由ADAR2所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例13的化合物(AD1_GRIA2，在图中为GRIA2的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例70的化合物(AD1_GRIA2.3，在图中为GRIA2的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
(试验例22)针对具有SLCO2A1基因序列的RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA的合成
与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行操作。但是，寡聚DNA使用具有以下记载的SLCO2A1基因序列的寡聚DNA。这里所使用的SLCO2A1基因序列具有GenBank登录号NM_005630.3的81020位～81044位的碱基序列，进一步具有被称为c.940+1G>A的核苷的突变(rs765249238)。
[表31]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法。
(C)编辑分析的结果
将由ADAR1p110所致的编辑比例的结果在图14A中示出。由ADAR1p110所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例14的化合物(AD1_SLCO2A1，在图中为SLCO2A1的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例71的化合物(AD1_SLCO2A1.3，在图中为SLCO2A1的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
将由ADAR2所致的编辑比例的结果在图14B中示出。由ADAR2所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例14的化合物(AD1_SLCO2A1，在图中为SLCO2A1的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例71的化合物(AD1_SLCO2A1.3，在图中为SLCO2A1的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
(试验例23)针对具有GFAP基因序列的RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA的合成
与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行操作。但是，寡聚DNA使用具有以下记载的GFAP基因序列的寡聚DNA。这里所使用的GFAP基因序列具有GenBank登录号NM_002055.5的2154位～2178位的碱基序列，进一步具有被称为c.716G>A的核苷的突变(rs59565950)。
[表32]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法。
(C)编辑分析的结果
将由ADAR1p110所致的编辑比例的结果在图14A中示出。由ADAR1p110示出的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例11的化合物(AD1_GFAP，在图中为GFAP的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例68的化合物(AD1_GFAP.3，在图中为GFAP的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
将由ADAR2所致的编辑比例的结果在图14B中示出。由ADAR2所致的RNA编辑效率，与全部由天然型核糖核苷酸残基构成的参考例11的化合物(AD1_GFAP，在图中为GFAP的AD1g03)相比，在gRNA中，使靶标对应核苷酸残基的3’侧鸟苷变为2’-脱氧肌苷的实施例68的化合物(AD1_GFAP，在图中为GFAP的AD1g03.3)显示出高编辑比例。这表明，在编辑位点的5’侧核苷为胞苷的情况下，在gRNA中，作为靶标对应核苷酸残基的3’侧核苷，若使用2’-脱氧肌苷，则显示出高编辑比例。
(试验例24)针对具有ASS1基因序列的RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA的合成
与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行操作。但是，寡聚DNA使用具有试验例20中记载的ASS1基因序列的寡聚DNA。这里所使用的ASS1基因序列具有GenBank登录号NM_000050.4的1510位～1534位的碱基序列，进一步具有被称为c.1168G>A的核苷的突变(rs121908641)。
(B)编辑诱导能力评价及其结果
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法。
(C)编辑分析的结果
将使用实施例76(AD1_ASS1.39)的编辑比例的结果在图15A中示出。基于ADAR1p110的经化学修饰的实施例76的化合物(AD1_ASS1.39)的RNA编辑效率与不添加gRNA的情况相比，显示出高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的ASS1基因序列。
将使用实施例81的化合物(AD1_ASS1.39e)和实施例85的化合物(AD1_ASS1.52e)的编辑比例的结果在图15B中示出。基于ADAR1p110的经化学修饰的实施例81的化合物(AD1_ASS1.39e)和实施例85的化合物(AD1_ASS1.52e)的RNA编辑效率与不添加gRNA的情况相比，显示出高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的ASS1基因序列。
(试验例25)针对具有PANK2基因序列的RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA的合成
与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行操作。但是，寡聚DNA使用具有以下记载的PANK2基因序列的寡聚DNA。这里所使用的PANK2基因序列具有GenBank登录号NM_153638.3的1714位～1738位的碱基序列，进一步具有被称为c.1561G>A的核苷的突变(rs137852959)。
[表33]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法。
(C)编辑分析的结果
将使用实施例76的化合物(AD1_PANK2.39)的编辑比例的结果在图15A中示出。基于ADAR1p110的经化学修饰的实施例76的化合物(AD1_PANK2.39)的RNA编辑效率与不添加gRNA的情况相比，显示出高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的PANK2基因序列。
另外，将使用实施例82的化合物(AD1_PANK2.39e)和实施例86的化合物(AD1_PANK2.52e)的编辑比例的结果在图15C中示出。基于ADAR1p110的经化学修饰的实施例76的化合物(AD1_PANK2.39)的RNA编辑效率与不添加gRNA的情况相比，显示出高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的PANK2基因序列。
(试验例26)针对具有NPHS2基因序列的RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA的合成
与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行操作。但是，寡聚DNA使用具有以下记载的NPHS2基因序列的寡聚DNA。这里所使用的NPHS2基因序列具有GenBank登录号NM_014625.4的483位～501位的碱基序列，进一步具有被称为c.413G>A的核苷的突变(rs74315342)。
[表34]
(B)编辑诱导能力评价及其结果
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法。
(C)编辑分析的结果
将使用实施例77(AD1_NPHS2.39)的编辑比例的结果在图15A中示出。基于ADAR1p110的经化学修饰的实施例77的化合物(AD1_NPHS2.39)的RNA编辑效率与不添加gRNA的情况相比，显示出高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的NPHS2基因序列。
另外，将使用实施例83的化合物(AD1_NPHS2.39e)和实施例87的化合物(AD1_NPHS2.52e)的编辑比例的结果在图15D中示出。基于ADAR1p110的经化学修饰的实施例77的化合物(AD1_NPHS2.39)的RNA编辑效率与不添加gRNA的情况相比，显示出高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的NPHS2基因序列。
(试验例27)针对具有GRIA2基因序列的RNA的编辑诱导能力评价
(A)靶标RNA的合成
与试验例5的(A)AGXT_RNA的合成中记载的方法相同地进行操作。但是，寡聚DNA使用具有试验例21中记载的GRIA2基因序列的寡聚DNA。这里所使用的GRIA2基因序列具有GenBank登录号NM_000826.4的2121位～2145位的碱基序列，进一步地，第2135位的腺苷是在ALS疾病中ADAR2的表达降低的情况下，向肌苷的编辑效率降低的位点。
(B)编辑诱导能力评价及其结果
实施例化合物的编辑诱导能力评价的方法采用与试验例5的(B)～(D)相同的方法。
(C)编辑分析的结果
将使用实施例78的化合物(AD1_GRIA2.39)、实施例80的化合物(AD1_GRIA2.39e)和实施例84的化合物(AD1_GRIA2.52e)的编辑比例的结果在图15E中示出。基于ADAR1p110的经化学修饰的实施例78的化合物(AD1_GRIA2.39)、实施例80的化合物(AD1_GRIA2.39e)和实施例84的化合物(AD1_GRIA2.52e)的RNA编辑效率与不添加gRNA的情况相比，显示出高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的GRIA2基因序列。表明了本实施例的化合物可提高突变的GRIA2基因序列的第2279位的腺苷位点向肌苷的编辑效率。
(试验例28)作为实施例化合物的gRNA对培养细胞内PAH基因序列的编辑诱导能力评价
除了构建以下表达PAH基因的靶标RNA表达质粒，使用实施例72～74的化合物作为gRNA，以及使用与PAH基因对应的引物以外，采用与试验例10的(A)～(C)相同的方法。这里所使用的PAH基因序列具有GenBank登录号NM_001354304.2的114638位～114662位的碱基序列，进一步具有被称为c.1066-11G>A的核苷的突变(rs5030855)。
将使用实施例72～74的化合物(AD1_PAH.2.29、AD1_PAH.2.41、AD1_PAH.2.43)的情况下的编辑比例(％)在图16中示出。在转染靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA的情况下，显示出5％左右的编辑比例。进一步地，在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出10％～40％左右的高编辑比例。另一方面，在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出40％～60％左右的更高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的PAH基因序列。
(试验例29)作为实施例化合物的gRNA对培养细胞内ASS1基因序列的编辑诱导能力评价
除了构建以下表达ASS1基因的靶标RNA表达质粒，使用实施例75、79、81和85的化合物作为gRNA，以及使用与ASS1对应的引物以外，采用与试验例10的(A)和(B)相同的方法。这里所使用的ASS1基因序列具有GenBank登录号NM_000050.4的1510位～1534位的碱基序列，进一步具有被称为c.1168G>A的核苷的突变(rs121908641)。
编辑分析如下进行。使用RNeasy Plus Mini试剂盒(QIAGEN)从在24孔板中培养的细胞中提取总RNA。使用PrimeScript II逆转录酶(TaKaRa)、0.5μg的总RNA、0.25μM Oligo(dT)17进行逆转录反应，扩增cDNA。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、T7proGGG引物(序列号35)、3’-Adp引物(序列号48)进行第一PCR。以将第一PCR产物稀释200倍而得的cDNA为模板，使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、DS_疾病_XhoF01引物(序列号44)、DS_疾病_KpnR01引物(序列号45)进行第二PCR，扩增ASS1片段。使用Big Dye Terminatorv3.1循环测序试剂盒、0.165μM DS_疾病_XhoF01引物进行测序反应，通过AppliedBiosystem 3500基因分析仪进行分析。根据通过测序得到的色谱图，由靶标位点的峰高比(G/(G+A))算出编辑比例。
将使用实施例75和实施例79的化合物(AD1_ASS1.39、AD1_ASS1.52)的情况下的编辑比例(％)在图17A中示出。在转染靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA的情况下，显示出5％～10％左右的编辑比例。进一步地，在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出20％～50％左右的高编辑比例。另一方面，在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，进一步显示出40％～80％左右的更高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的ASS1基因序列。
另外，将使用实施例81和实施例85的化合物(AD1_ASS1.39e、AD1_ASS1.52e)的情况下的编辑比例(％)在图18A中示出。在转染靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA的情况下，显示出5％左右的编辑比例。进一步地，在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出20％～40％左右的高编辑比例。另一方面，在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，进一步显示出40％～80％左右的更高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的ASS1基因序列。
(试验例30)作为实施例化合物的gRNA对培养细胞内PANK2基因序列的编辑诱导能力评价
除了构建以下表达PANK2基因的靶标RNA表达质粒，使用实施例76、82和86的化合物作为gRNA，以及使用与PANK2基因对应的引物以外，采用与试验例10的(A)和(B)相同的方法，在编辑分析中采用与试验例29中记载的编辑分析的方法相同的方法。这里所使用的PANK2基因序列具有GenBank登录号NM_153638.3的1714位～1738位的碱基序列，进一步具有被称为c.1561G>A的核苷的突变(rs137852959)。
将使用实施例76的化合物(AD1_PINK2.39)的情况下的编辑比例(％)在图17B中示出。在转染靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA的情况下，显示出5％左右的编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出20％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出40％～50％左右的高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的PANK2基因序列。
另外，将使用实施例82的化合物(AD1_PINK2.39e)和实施例85的化合物(AD1_PINK2.52e)的情况下的编辑比例(％)在图18B中示出。在转染靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA的情况下，显示出5％左右的编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出10％～20％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出30％～50％左右的高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的PANK2基因序列。
(试验例31)作为实施例化合物的gRNA对培养细胞内NPHS2基因序列的编辑诱导能力评价
除了构建以下表达NPHS2基因的靶标RNA表达质粒，使用实施例77、83和87的化合物作为gRNA，以及使用与NPHS2基因对应的引物以外，采用与试验例10的(A)和(B)相同的方法，在编辑分析中采用与试验例29中记载的编辑分析的方法相同的方法。这里所使用的NPHS2基因序列具有GenBank登录号NM_014625.4的483位～501位的碱基序列，进一步具有被称为c.413G>A的核苷的突变(rs74315342)。
将使用实施例77的化合物(AD1_NPHS2.39)的情况下的编辑比例(％)在图17C中示出。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出10％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出20％左右的高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的NPHS2基因序列。
另外，将使用实施例83的化合物(AD1_NPHS2.39e)和实施例87的化合物(AD1_NPHS.52e)的情况下的编辑比例(％)在图18C中示出。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出10％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出20％左右的高编辑比例。表明本实施例的化合物可修复突变的NPHS2基因序列。
(试验例32)作为实施例化合物的gRNA对培养细胞内GRIA2基因序列的编辑诱导能力评价
除了构建以下表达GRIA2基因的靶标RNA表达质粒，使用实施例78、80和84的化合物作为gRNA，以及使用与GRIA2基因对应的引物以外，采用与试验例10的(A)和(B)相同的方法，在编辑分析中采用与试验例29中记载的编辑分析的方法相同的方法。这里所使用的GRIA2基因序列具有GenBank登录号NM_000826.3的2265位～2289位的碱基序列，进一步地，第2279位的腺苷是在ALS疾病中ADAR2的表达降低的情况下，向肌苷的编辑效率降低的位点。
将使用实施例78的化合物(AD1_GRIA2.39)、实施例80的化合物(AD1_GRIA2.39e)和实施例84的化合物(AD1_GRIA2.52e)的情况下的编辑比例(％)在图18D中示出。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出40％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出40％～60％左右的高编辑比例。表明了本实施例的化合物可提高突变的GRIA2基因序列的第2279位的腺苷位点向肌苷的编辑效率。
(试验例33)作为实施例化合物的gRNA对模型靶标RNA(Rluc_sRNA)的编辑诱导能力评价
(A)编辑位点5’侧的相邻的碱基序列为G的RNA的合成
编辑位点5’侧的相邻的碱基序列为G的RNA使用国际公开第2021/060527号的实施例10中记载的Rluc_sRNA。另外，编辑位点5’侧的相邻的碱基序列为A的RNA使用以下记载的寡聚DNA来调制。
(B)编辑位点5’侧的相邻的碱基序列为A的RNA的合成
以通过常规方法调制的psiCHECKTM-2_Rluc_W104X为模板，将5’侧片段使用RL_s01_G286A_EcoF1引物(序列号64)和Rluc_G286A_R01引物(序列号65)、将3’侧片段使用Rluc_G286A_F01引物(序列号66)和RL_s01_G286A_HinR1引物(序列号67)通过PrimeStarGXL DNA聚合酶(TaKaRa)进行第一PCR(30个循环，变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、20秒)。接着，将各自的PCR产物稀释100倍，使用RL_s01_G286A_EcoF1引物(序列号64)和RL_s01_G286A_HinR1引物(序列号67)通过PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)进行第二PCR(30个循环，变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、20秒)，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化，得到具有Rluc_K41R_W104X的G286突变为A的序列和限制性酶位点的DNA(Rluc_K41R_W104X_G286A_Eco/Hid)(序列号72)。将pUC19和所得的DNA使用EcoRI(TaKaRa)和HindIII(TaKaRa)在37℃下进行1小时的限制性酶消化后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀纯化各自的DNA。将限制性酶消化后的Rluc_K41R_W104X_G286A和pUC19以1:3的摩尔比混合，使用DNA连接试剂盒<Mighty Mix>(TaKaRa)进行连接反应。将所得的连接样品转化至DH5α，使用LB琼脂平板在37℃下培养过夜。将选出的菌落用LB液体培养基在37℃下培养过夜，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取质粒。然后，通过碱基序列分析来确认所得的质粒的序列。以确认了序列的质粒为模板，使用T7_Rluc_sRNA_F01(序列号68)和Rluc_sRNA_R01引物(序列号69)、PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR(30个循环(变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、20秒))，扩增体外转录反应用模板DNA，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。使用AmpliScribe T7试剂盒(EpicentreBiotechnologies)进行体外转录而得到Rluc_sRNA_G286A(序列号73)。合成后的Rluc_sRNA_G286A使用含有8M尿素的5％聚丙烯酰胺凝胶进行切下纯化，用于以后的试验。
[表35]
[表36]
(C)编辑诱导能力评价
依据国际公开第2021/060527号的实施例10中记载的方法，评价编辑诱导能力。
(D)编辑分析的结果
对于实施例88～96的化合物，评价了针对编辑位点5’侧相邻的核苷为G的Rluc_sRNA的编辑活性。将其结果在图19中示出。将国际公开第2021/060527号的实施例10中记载的AD1g_03_RL_A287和AD1g_03_RL_A287_GG分别作为参考例15和16进行了比较。参考例15的化合物在图19中记载为AD1g_RL_A287_GC，参考例16的化合物在图19中记载为AD1g_RL_A287_GG。参考例16的化合物显示出比参考例15的化合物还要更高的编辑活性，与国际公开第2021/060527号的实施例10中记载的一致。进一步地，评价了实施例88～96的化合物，结果显示，对于编辑位点5’侧相邻的核苷的G为2’-脱氧鸟苷或2’-脱氧肌苷的实施例89和90的化合物显示出比参考例16的化合物还要更高的编辑活性。特别是，对于编辑位点5’侧相邻的核苷的G为2’-脱氧肌苷的实施例90的化合物显示出最高的活性。
对于实施例88～96的化合物，评价了针对编辑位点5’侧相邻的核苷为A的Rluc_sRNA的编辑活性。将其结果在图20中示出。评价了实施例88～96的化合物，结果显示，对于编辑位点5’侧相邻的核苷的A为胸苷或2’-脱氧尿苷的实施例91和93的化合物显示出高编辑活性。特别是，对于编辑位点5’侧相邻的核苷的A为2’-脱氧尿苷的实施例93的化合物显示出最高的活性。
对于实施例90和97的化合物，评价了针对编辑位点5’侧相邻的核苷为G的Rluc_sRNA的编辑活性。将其结果在图21A中示出。全部进行了化学修饰的实施例97的化合物以与对于编辑位点5’侧相邻的核苷的G为2’-脱氧肌苷的实施例90的化合物相同程度的效率显示出高活性。
对于实施例91、93、98和99的化合物，评价了针对编辑位点5’侧相邻的核苷为A的Rluc_sRNA的编辑活性。将其结果在图21B中示出。全部进行了化学修饰的实施例98和99的化合物以与对于编辑位点5’侧相邻的核苷的A为胸苷或2’-脱氧尿苷的实施例91和93的化合物相同程度以上的效率显示出高活性。
(试验例34)作为实施例化合物的gRNA对培养细胞内靶标RNA(Rluc_sRNA)的编辑诱导能力评价
(A)编辑位点5’侧的相邻的碱基序列为G的RNA(GAN_RNA)表达质粒(pcDNA3.1(-)Hygro_Rluc_sRNA)和编辑位点的5’侧的相邻的碱基序列为A的RNA(AAN_RNA)表达质粒(pcDNA3.1(-)Hygro_Rluc_sRNA_G286A)的合成
GAN_RNA表达质粒的构建以通过常规方法调制的psiCHECKTM-2_Rluc_W104X为模板，AAN_RNA表达质粒的构建以通过常规方法调制的pUC19_Rluc_K41R_W104X_G286A为模板。对于模板，使用Rluc_s01_BamF1引物(序列号74)和RL_s01_G286A_HinR1引物(序列号75)、PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR(30个循环，变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、20秒)，制作插入DNA，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。将插入DNA、pcDNA3.1(-)Hygro使用BamHI(TaKaRa)和HindIII(TaKaRa)在37℃下进行1小时的反应后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。以插入物：质粒为3：1的摩尔比加入，使用DNA连接试剂盒<Mighty Mix>(TaKaRa)进行连接反应。将所得的连接样品转化至DH5α，使用LB琼脂平板在37℃下培养过夜。将选出的菌落用LB液体培养基在37℃下培养过夜，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取质粒。使用Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Thermo Fisher Scientific)、0.165μM的pcDNA3_1pro_F01引物(序列号76)和0.165μM的pcDNA31-seqR01引物(序列号77)对100ng的所得的质粒进行测序反应，通过Applied Biosystems 3500基因分析仪(Thermo Fisher Scientific)进行序列分析，确认已合成了pcDNA3.1(-)Hygro_Rluc_SRNA和pcDNA3.1(-)Hygro_Rluc_sRNA_G286A。
[表37]
引物 序列 序列号
Rluc_s01_BamF1 GCAGGATCCGGGCTGGACTCCTTCATCAAC 74
RL_s01_G286A_HinR1 CGTAAGCTTCCAGTCGTGGCCCACAAAG 75
pcDNA3_1pro_F01 TGGCACCAAAATCAACGGG 76
pcDNA31-seqR01 GCTATTGTCTTCCCAATCCTCC 77
(B)细胞培养
除了使用cDNA3.1(-)Hygro_Rluc_sRNA和pcDNA3.1(-)Hygro_Rluc_sRNA_G286A代替pcDNA3.1(-)Hygro_AGXT以及使用实施例97～99的化合物作为gRNA以外，采用与试验例10的(B)相同的方法。
(C)编辑分析
使用RNeasy Plus Mini试剂盒(QIAGEN)从在24孔板中培养的细胞中提取总RNA。使用ReverTra Ace(R)qPCR RT Master Mix与gDNA清除剂(TOYOBO)、0.5μg的总RNA进行逆转录反应，扩增cDNA。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、Rluc_sRNA_F01引物(序列号78)、Rluc_sRNA_R01引物(序列号79)进行PCR，扩增片段。使用Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒、0.165μM Rluc_sRNA_F01引物进行测序反应，通过Applied Biosystem 3500基因分析仪进行分析。根据通过测序得到的色谱图，由靶标位点的峰高比(G/(G+A))算出编辑比例。
[表38]
引物 序列 序列号
Rluc_sRNA_F01 GCTGGACTCCTTCATCAAC 78
Rluc_sRNA_R01 CCAGTCGTGGCCCACAAAG 79
(D)编辑分析的结果
对于编辑位点5’侧相邻的核苷为G的Rluc_sRNA，将使用实施例97的化合物的情况下的编辑比例(％)在图22中示出。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出5％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出10％～20％左右的高编辑比例。
对于编辑位点5’侧相邻的核苷为A的Rluc_sRNA，将使用实施例98和99的化合物的情况下的编辑比例(％)在图22中示出。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出5％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出25％～35％左右的高编辑比例。
(试验例35)作为实施例化合物的gRNA对培养细胞内A1AT基因序列的编辑诱导能力评价
除了构建以下表达A1AT基因的靶标RNA表达质粒，使用实施例72～74的化合物作为gRNA，以及使用与A1AT基因对应的引物以外，采用与试验例10的(A)和(B)相同的方法，在编辑分析中采用与试验例29中记载的编辑分析的方法相同的方法。这里所使用的A1AT(也称为SERPINA1)基因序列具有GenBank登录号NM_000295.5的1129位～1153位的碱基序列，进一步具有被称为c.1096G>A的核苷的突变(rs28929474)。
将使用实施例136的化合物(AD1_A1AT.39)的情况下的编辑比例(％)在图23A中示出。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR2的质粒一起转染的情况下，显示出20％左右的高编辑比例。在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110或ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出40％～50％左右的高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的A1AT基因序列。
(试验例36)作为实施例化合物的gRNA对培养细胞内A1AT基因序列的编辑诱导能力评价
这里所使用的A1AT(也称为SERPINA1)基因序列具有GenBank登录号NM_000295.5的碱基序列，进一步地，Z-A1AT具有被称为c.1096G>A的核苷的突变(rs28929474)。
(A)A1AT和Z-A1AT表达质粒的合成
使用Sepasol RNA I Super G(Nacalai)从HepG2细胞中提取总RNA，使用重组DNA酶I(TaKaRa)进行DNA酶处理后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。使用PrimeScriptII逆转录酶(TaKaRa)、0.5μg的总RNA、0.25μM Oligo(dT)17进行逆转录反应，扩增cDNA。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、SERPINA1_CDS_XbaF1引物(序列号80)、SERPINA1_CDS_HinR1引物(序列号81)进行PCR(30个循环，变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、1分30秒)，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化，得到具有SERPINA1的CDS序列(SERPINA1_CDS)(序列号88)的DNA。将pUC19和所得的DNA使用XbaI(TaKaRa)和HindIII(TaKaRa)在37℃下进行1小时的反应后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。以插入物:质粒为3:1的摩尔比加入，使用DNA连接试剂盒<Mighty Mix>(TaKaRa)进行连接反应。将所得的连接样品转化至DH5α，使用LB琼脂平板在37℃下培养过夜。将选出的菌落用LB液体培养基在37℃下培养过夜，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取质粒。使用Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Thermo Fisher Scientific)、0.165μM的pUC19-seqF01引物(序列号82)和0.165μM的pUC19_seqR01引物(序列号83)对100ng的所得的质粒进行测序反应，通过Applied Biosystems 3500基因分析仪(Thermo FisherScientific)进行序列分析，确认已合成了pUC19_SERPINA1。
以pUC19_SERPINA1为模板，将5’侧片段使用SERPINA1_CDS_XbaF1引物(序列号80)和SERPINA1_G1096A_R1引物(序列号84)、将3’侧片段使用SERPINA1_G1096A_F1引物(序列号85)和SERPINA1_CDS_HinR1引物(序列号81)通过PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)进行第一PCR。接着，将各自的PCR产物稀释100倍，使用SERPINA1_CDS_XbaF1引物(序列号80)和SERPINA1_CDS_HinR1引物(序列号81)通过PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)进行第二PCR(30个循环，变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、1分30秒)，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化，得到具有SERPINA1的G1096突变为A的序列的DNA(SERPINA1_G1096A)(序列号89)。另外，以pUC19_SERPINA1为模板，使用SERPINA1_CDS_XbaF1引物(序列号80)和SERPINA1_CDS_HinR1引物(序列号81)，通过PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR(30个循环，变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、1分30秒)，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化，得到SERPINA1的CDS序列(SERPINA1_CDS)(序列号88)。将这些所得的DNA和pcDNA3.1(-)Hygro使用XbaI(TaKaRa)和HindIII(TaKaRa)在37℃下进行1小时的反应后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。以插入物：质粒为3：1的摩尔比加入，使用DNA连接试剂盒<Mighty Mix>(TaKaRa)进行连接反应。将所得的连接样品转化至DH5α，使用LB琼脂平板在37℃下培养过夜。将选出的菌落用LB液体培养基在37℃下培养过夜，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取质粒。使用Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Thermo Fisher Scientific)、0.165μM的pcDNA3_1pro_F01引物(序列号86)和0.165μM的pcDNA31-seqR01引物(序列号87)对100ng的所得的质粒进行测序反应，通过Applied Biosystems 3500基因分析仪(Thermo Fisher Scientific)进行序列分析，确认已合成了pcDNA3.1(-)Hygro_SERPINA1_G1096A和pcDNA3.1(-)Hygro_SERPINA1。
[表39]
引物 序列 序列号
SERPINA1_CDS_XbaF1 CGATCTAGAATGCCGTCTTCTGTCTCGTG 80
SERPINA1_CDS_HinR1 GCAAAGCTTTTATTTTTGGGTGGGATTCACC 81
pUC19-seqF01 CAACTGTTGGGAAGGGCGATC 82
pUC19_seqR01 CGACAGGTTTCCCGACTGGAAAG 83
SERPINA1_G1096A_R1 GTCCCTTTCTTGTCGATGGTC 84
SERPINA1_G1096A_F1 GACCATCGACAAGAAAGGGAC 85
pcDNA3_1pro_F01 TGGCACCAAAATCAACGGG 86
pcDNA3.1-seqR01 GCTATTGTCTTCCCAATCCTCC 87
[表40]
(B)细胞培养
使用含有10％FBS的DMEM(SIGMA)将HEK293细胞在24孔板中传代至1.0×105个细胞/孔，培养48小时。使用PBS(-)(Nacalai)清洗一次，将培养基更换为含有0.2％FBS的DMEM(SIGMA)。使用Lipofectamine 3000(Thermo)转染50ng的表达靶标RNA的质粒(pcDNA3.1(-)Hygro_SERPINA1_G1096A或pcDNA3.1(-
)Hygro_SERPINA1)、500ng的表达ADAR的质粒(pcDNA3.1(-
)Hygro_ADAR1p110或pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p150)、50nM的作为实施例化合物的gRNA，培养48小时。
(C)编辑分析及其结果
使用RNeasy Plus Mini试剂盒(QIAGEN)从在24孔板中培养的细胞中提取总RNA。使用ReverTra Ace(R)qPCR RT Master Mix与gDNA清除剂(TOYOBO)、0.5μg的总RNA进行逆转录反应，扩增cDNA。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、SERPINA1_1stF01引物(序列号90)、SERPINA1_CDS_HinR1引物(序列号91)进行第一PCR。以将第一PCR产物稀释400倍而得的cDNA为模板，使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、SERPINA1_2ndF01引物(序列号92)、SERPINA1_2ndR01引物(序列号93)进行第二PCR，扩增SERPINA1片段。使用Big DyeTerminator v3.1循环测序试剂盒、0.165μM SERPINA1_编辑F01引物(序列号94)进行测序反应，通过Applied Biosystem 3500基因分析仪进行分析。根据通过测序得到的色谱图，由靶标位点的峰高比(G/(G+A))算出编辑比例。
将使用实施例136的化合物(AD1_A1AT.39)的情况下的编辑比例(％)在图23B中示出。在转染靶标RNA(Z-A1AT)表达质粒和作为实施例化合物的gRNA的情况下，显示出5％左右的高编辑比例。另外，在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p110的质粒一起转染的情况下，显示出60％左右的高编辑比例。进一步地，在将靶标RNA表达质粒和作为实施例化合物的gRNA与表达ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，显示出80％左右的高编辑比例。表明了本实施例的化合物可修复突变的A1AT基因序列。
[表41]
引物 序列 序列号
SERPINA1_1stF01 GGCATGTTTAACATCCAGCACTG 90
SERPINA1_CDS_HinR1 GCAAAGCTTTTATTTTTGGGTGGGATTCACC 91
SERPINA1_2ndF01 CCATCTTCTTCCTGCCTGATG 92
SERPINA1_2ndR01 CATGAAGAGGGGAGACTTGG 93
SERPINA1_编辑F01 GAACTCACCCACGATATCATCAC 94
(D)基于ELISA的A1AT分泌量的分析及其结果
在转染后，回收培养48小时的培养基，在4℃、3000×g下离心分离10分钟。使用50μL的培养基和人α1抗胰蛋白酶(SERPINA1)ELISA试剂盒(abcam)，依据附带的公司方案，测定A1AT分泌量。吸光度测定使用Nivo多模式微孔板读取器(PerkinElmer)。
将使用实施例136的化合物(AD1_A1AT.39)的情况下的培养基中的A1AT分泌量示出于图24中。在将靶标RNA(Z-A1AT)表达质粒与表达ADAR1p110的质粒一起转染的情况下，分泌到培养基中的A1AT量为在转染表达正常A1AT的质粒的情况下分泌到培养基中的A1AT量的30％左右。另外，在将靶标RNA(Z-A1AT)表达质粒和实施例136的化合物与表达ADAR1p110的质粒一起同时转染的情况下，分泌到培养基中的A1AT量恢复至与在转染表达正常A1AT的质粒的情况下分泌到培养基中的A1AT量相同的程度。
进一步地，在将靶标RNA(Z-A1AT)表达质粒与表达ADAR1p110和ADAR1p150的质粒一起转染的情况下，分泌到培养基中的A1AT量为在转染表达正常A1AT的质粒的情况下分泌到培养基中的A1AT量的30％左右。另外，在将靶标RNA(Z-A1AT)表达质粒和实施例136的化合物与表达ADAR1p110和ADAR1p150的质粒一起同时转染的情况下，分泌到培养基中的A1AT量恢复至与在转染表达正常A1AT的质粒的情况下分泌到培养基中的A1AT量相同的程度。
若从(C)中所示的RNA编辑活性的结果和(D)中所示的A1AT分泌量的分析结果来看，则可认为实施例136的化合物可在细胞内将Z-A1AT的mRNA突变修复为正常的A1ATmRNA，进而使得从细胞中分泌正常的A1AT蛋白至正常量的水平。
日本专利申请2020-203658号(申请日：2020年12月8日)、日本专利申请2021-157151号(申请日：2021年9月27日)的公开内容通过引用将其整体并入本说明书中。本说明书中记载的全部文献、专利申请和技术标准均通过引用并入本说明书中，其程度与具体且个别地描述通过引用并入各个文献、专利申请和技术标准的情况相同。
序列表
<110> 学校法人福冈大学
第一三共株式会社
<120> 具有化学修饰核酸的稳定型靶标编辑向导RNA
<130> 676576
<160> 112
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 1
cagcucaacc aagcggugag guac 24
<210> 2
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶标
<400> 2
guaccucacc gcuuaguucg agcug 25
<210> 3
<211> 200
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶标hGAPDH
<400> 3
gggccucuuc gcuauuacgc cagcuggcga aagggggaug ugcugcaagg cgauuaaguu 60
ggguaacgcc aggguuuucc cagucacgac guuguaaaac gacggccagu gaauucucuc 120
cccuccucac aguugccaug uagaccccuu gaagagggga ggggccuaag cuuggcguaa 180
ucauggucau agcuguuucc 200
<210> 4
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 4
ucaagggucc acauggcaac ugug 24
<210> 5
<211> 910
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶标Rluc WT
<400> 5
accauggcuu ccaaggugua cgaccccgag caacgcaaac gcaugaucac ugggccucag 60
uggugggcuc gcugcaagca aaugaacgug cuggacuccu ucaucaacua cuaugauucc 120
gagaagcacg ccgagaacgc cgugauuuuu cugcauggua acgcugccuc cagcuaccug 180
uggaggcacg ucgugccuca caucgagccc guggcuagau gcaucauccc ugaucugauc 240
ggaaugggua aguccggcaa gagcgggaau ggcucauauc gccuccugga ucacuacaag 300
uaccucaccg cuugguucga gcugcugaac cuuccaaaga aaaucaucuu ugugggccac 360
gacugggggg cuugucuggc cuuucacuac uccuacgagc accaagacaa gaucaaggcc 420
aucguccaug cugagagugu cguggacgug aucgaguccu gggacgagug gccugacauc 480
gaggaggaua ucgcccugau caagagcgaa gagggcgaga aaauggugcu ugagaauaac 540
uucuucgucg agaccaugcu cccaagcaag aucaugcgga aacuggagcc ugaggaguuc 600
gcugccuacc uggagccauu caaggagaag ggcgagguua gacggccuac ccucuccugg 660
ccucgcgaga ucccucucgu uaagggaggc aagcccgacg ucguccagau uguccgcaac 720
uacaacgccu accuucgggc cagcgacgau cugccuaaga uguucaucga guccgacccu 780
ggguucuuuu ccaacgcuau ugucgaggga gcuaagaagu ucccuaacac cgaguucgug 840
aaggugaagg gccuccacuu cagccaggag gacgcuccag augaaauggg uaaguacauc 900
aagagcuucg 910
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 6
gaaggatcct tacaggtcct cctctgagat cagcttctgc tc 42
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 7
gcagaattca ccatggcttc caaggtgtac gac 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 8
gacgctagca ccatggcttc caaggtgtac gac 33
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 9
cagctcgaac taagcggtga g 21
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 10
gaactcgagt tacaggtcct cctctgagat cagcttctgc tc 42
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 11
ctcaccgctt agttcgagct g 21
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 12
ctaatacgac tcactatagg gctggactcc ttcatcaac 39
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 13
ccagtcgtgg cccacaaag 19
<210> 14
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶标Rluc mt
<400> 14
atggcttcca aggtgtacga ccccgagcaa cgcaaacgca tgatcactgg gcctcagtgg 60
tgggctcgct gcaagcaaat gaacgtgctg gactccttca tcaactacta tgattccgag 120
aggcacgccg agaacgccgt gatttttctg catggtaacg ctgcctccag ctacctgtgg 180
aggcacgtcg tgcctcacat cgagcccgtg gctagatgca tcatccctga tctgatcgga 240
atgggtaagt ccggcaagag cgggaatggc tcatatcgcc tcctggatca ctacaagtac 300
ctcaccgctt agttcgagct gctgaacctt ccaaagaaaa tcatctttgt gggccacgac 360
tggggggctt gtctggcctt tcactactcc tacgagcacc aagacaagat caaggccatc 420
gtccatgctg agagtgtcgt ggacgtgatc gagtcctggg acgagtggcc tgacatcgag 480
gaggatatcg ccctgatcaa gagcgaagag ggcgagaaaa tggtgcttga gaataacttc 540
ttcgtcgaga ccatgctccc aagcaagatc atgcggaaac tggagcctga ggagttcgct 600
gcctacctgg agccattcaa ggagaagggc gaggttagac ggcctaccct ctcctggcct 660
cgcgagatcc ctctcgttaa gggaggcaag cccgacgtcg tccagattgt ccgcaactac 720
aacgcctacc ttcgggccag cgacgatctg cctaagatgt tcatcgagtc cgaccctggg 780
ttcttttcca acgctattgt cgagggagct aagaagttcc ctaacaccga gttcgtgaag 840
gtgaagggcc tccacttcag ccaggaggac gctccagatg aaatgggtaa gtacatcaag 900
agcttcgtgg agcgcgtgct gaagaacgag cagtaa 936
<210> 15
<211> 279
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶标s
<400> 15
gggcuggacu ccuucaucaa cuacuaugau uccgagaggc acgccgagaa cgccgugauu 60
uuucugcaug guaacgcugc cuccagcuac cuguggaggc acgucgugcc ucacaucgag 120
cccguggcua gaugcaucau cccugaucug aucggaaugg guaaguccgg caagagcggg 180
aauggcucau aucgccuccu ggaucacuac aaguaccuca ccgcuuaguu cgagcugcug 240
aaccuuccaa agaaaaucau cuuugugggc cacgacugg 279
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt 37
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
ctaatacgac tcactatagg gaccatggct tccaaggtgt ac 42
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
ggccacgcgt cgactagtac 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
ttactgctcg ttcttcagca cg 22
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
gctggactcc ttcatcaac 19
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
ctcaagatca tcagcaatgc ctcctgc 27
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
gagcacaggg tactttattg atggtacatg acaagg 36
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
gtatgacaac gaatttggct ac 22
<210> 24
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 24
cagagucccc gaagccauca aggg 24
<210> 25
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 25
gcccuuuucc gcaucacucg aacc 24
<210> 26
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 26
ugauccuucc acccaguggu acaa 24
<210> 27
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 27
cuccacuggc acguauaucu cugc 24
<210> 28
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 28
uaaaaucucc gucucugaug uaca 24
<210> 29
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 29
aattccgtgc tgcagcccct tgatggcttc agggaactct gccacaggtg agcctga 57
<210> 30
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 30
agcttcaggc tcacctgtgg cagagttccc tgaagccatc aaggggctgc agcacgg 57
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 31
caactgttgg gaagggcgat c 21
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 32
cgacaggttt cccgactgga aag 23
<210> 33
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 33
ctaatacgac tcactatagg gcctcttcgc tattacgcca g 41
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 34
ggaaacagct atgaccatga ttac 24
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
ctaatacgac tcactatagg g 21
<210> 36
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 36
aattcagcaa agagatggtt cgagtgatgc agaagaaggg cattgagcat catccca 57
<210> 37
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 37
agcttgggat gatgctcaat gcccttcttc tgcatcactc gaaccatctc tttgctg 57
<210> 38
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 38
aattccacag ctgcaattgt accactgggt agaaaggatc attctgcaca gagcaca 57
<210> 39
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 39
agcttgtgct ctgtgcagaa tgatcctttc tacccagtgg tacaattgca gctgtgg 57
<210> 40
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 40
aattccctgg ggaagagcag agatatacgt accaggtgga gcacccaggc ctggata 57
<210> 41
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 41
agcttatcca ggcctgggtg ctccacctgg tacgtatatc tctgctcttc cccaggg 57
<210> 42
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 42
aattctgacg cctcgttgta catcagagac agagcatttt acaccttgaa gacgtaa 57
<210> 43
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 43
agctttacgt cttcaaggtg taaaatgctc tgtctctgat gtacaacgag gcgtcag 57
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 44
gtactcgagg ggcctcttcg ctattacgcc ag 32
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 45
gatggtaccg gaaacagcta tgaccatg 28
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 46
tggcaccaaa atcaacggg 19
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R引物
<400> 47
gctattgtct tcccaatcct cc 22
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
ggccacgcgt cgactagtac 20
<210> 49
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于因子V的gRNA
<400> 49
cuguauccuc gccuguccag ggau 24
<210> 50
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PAH.1的gRNA
<400> 50
guggaaacuc ggaaggccag gcca 24
<210> 51
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于ASS1的gRNA
<400> 51
uugaugaccc gguggcauca guug 24
<210> 52
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于GFAP的gRNA
<400> 52
auacuggugc ggaucucuuu cagg 24
<210> 53
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于CBS的gRNA
<400> 53
ggcgccgguc gaagcccuuc uccc 24
<210> 54
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于GRIA2的gRNA
<400> 54
gcauccugcc gcauaaaggc accc 24
<210> 55
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于SLCO2A1的gRNA
<400> 55
gggucauuac guuuaaugaa aucc 24
<210> 56
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RL_A287_GC的gRNA
<400> 56
cuuguaugac ccaggaggcg auau 24
<210> 57
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RL_A287_GG的gRNA
<400> 57
cuuguaugac gcaggaggcg auau 24
<210> 58
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RL_A287_U的gRNA
<400> 58
cuuguaugac ucaggaggcg auau 24
<210> 59
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RL_A287_A的rRNA
<400> 59
cuuguaugac acaggaggcg auau 24
<210> 60
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PAH.2的gRNA
<400> 60
cuguagcccc aagugaaaag uuau 24
<210> 61
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PANK2的gRNA
<400> 61
aagaaauucc aacaaauacc accu 24
<210> 62
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于NPHS2的gRNA
<400> 62
auguccaguc ggaauauaau uacu 24
<210> 63
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于A1AT的gRNA
<400> 63
gucccuucuc gucgaugguc agca 24
<210> 64
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F引物
<400> 64
aattctctcc cctcctcaca gttgccatgt agaccccttg aagaggggag gggccta 57
<210> 65
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RV引物
<400> 65
agcttaggcc cctcccctct tcaaggggtc tacatggcaa ctgtgaggag gggagag 57
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
gcagaattcg ggctggactc cttcatcaac 30
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
cttgtagtga ttcaggaggc gatatg 26
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
catatcgcct cctgaatcac tacaag 26
<210> 69
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
cgtaagcttc cagtcgtggc ccacaaag 28
<210> 70
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
ctaatacgac tcactatagg gctggactcc ttcatcaac 39
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
ccagtcgtgg cccacaaag 19
<210> 72
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rluc_sRNA_G286A_Eco/Hind
<400> 72
gcaggatccg ggctggactc cttcatcaac tactatgatt ccgagaggca cgccgagaac 60
gccgtgattt ttctgcatgg taacgctgcc tccagctacc tgtggaggca cgtcgtgcct 120
cacatcgagc ccgtggctag atgcatcatc cctgatctga tcggaatggg taagtccggc 180
aagagcggga atggctcata tcgcctcctg aatcactaca agtacctcac cgcttagttc 240
gagctgctga accttccaaa gaaaatcatc tttgtgggcc acgactggaa gcttacg 297
<210> 73
<211> 279
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rluc_sRNA_G286A
<400> 73
gggcuggacu ccuucaucaa cuacuaugau uccgagaggc acgccgagaa cgccgugauu 60
uuucugcaug guaacgcugc cuccagcuac cuguggaggc acgucgugcc ucacaucgag 120
cccguggcua gaugcaucau cccugaucug aucggaaugg guaaguccgg caagagcggg 180
aauggcucau aucgccuccu gaaucacuac aaguaccuca ccgcuuaguu cgagcugcug 240
aaccuuccaa agaaaaucau cuuugugggc cacgacugg 279
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
gcaggatccg ggctggactc cttcatcaac 30
<210> 75
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
cgtaagcttc cagtcgtggc ccacaaag 28
<210> 76
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
tggcaccaaa atcaacggg 19
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
gctattgtct tcccaatcct cc 22
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
gctggactcc ttcatcaac 19
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
ccagtcgtgg cccacaaag 19
<210> 80
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
cgatctagaa tgccgtcttc tgtctcgtg 29
<210> 81
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 81
gcaaagcttt tatttttggg tgggattcac c 31
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 82
caactgttgg gaagggcgat c 21
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
cgacaggttt cccgactgga aag 23
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
gtccctttct tgtcgatggt c 21
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
gaccatcgac aagaaaggga c 21
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
tggcaccaaa atcaacggg 19
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
gctattgtct tcccaatcct cc 22
<210> 88
<211> 1275
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERPINA1_CDS
<400> 88
cgatctagaa tgccgtcttc tgtctcgtgg ggcatcctcc tgctggcagg cctgtgctgc 60
ctggtccctg tctccctggc tgaggatccc cagggagatg ctgcccagaa gacagataca 120
tcccaccatg atcaggatca cccaaccttc aacaagatca cccccaacct ggctgagttc 180
gccttcagcc tataccgcca gctggcacac cagtccaaca gcaccaatat cttcttctcc 240
ccagtgagca tcgctacagc ctttgcaatg ctctccctgg ggaccaaggc tgacactcac 300
gatgaaatcc tggagggcct gaatttcaac ctcacggaga ttccggaggc tcagatccat 360
gaaggcttcc aggaactcct ccgtaccctc aaccagccag acagccagct ccagctgacc 420
accggcaatg gcctgttcct cagcgagggc ctgaagctag tggataagtt tttggaggat 480
gttaaaaagt tgtaccactc agaagccttc actgtcaact tcggggacac cgaagaggcc 540
aagaaacaga tcaacgatta cgtggagaag ggtactcaag ggaaaattgt ggatttggtc 600
aaggagcttg acagagacac agtttttgct ctggtgaatt acatcttctt taaaggcaaa 660
tgggagagac cctttgaagt caaggacacc gaggaagagg acttccacgt ggaccaggtg 720
accaccgtga aggtgcctat gatgaagcgt ttaggcatgt ttaacatcca gcactgtaag 780
aagctgtcca gctgggtgct gctgatgaaa tacctgggca atgccaccgc catcttcttc 840
ctgcctgatg aggggaaact acagcacctg gaaaatgaac tcacccacga tatcatcacc 900
aagttcctgg aaaatgaaga cagaaggtct gccagcttac atttacccaa actgtccatt 960
actggaacct atgatctgaa gagcgtcctg ggtcaactgg gcatcactaa ggtcttcagc 1020
aatggggctg acctctccgg ggtcacagag gaggcacccc tgaagctctc caaggccgtg 1080
cataaggctg tgctgaccat cgacgagaaa gggactgaag ctgctggggc catgttttta 1140
gaggccatac ccatgtctat cccccccgag gtcaagttca acaaaccctt tgtcttctta 1200
atgattgaac aaaataccaa gtctcccctc ttcatgggaa aagtggtgaa tcccacccaa 1260
aaataaaagc tttgc 1275
<210> 89
<211> 1275
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERPINA1_G1096A
<400> 89
cgatctagaa tgccgtcttc tgtctcgtgg ggcatcctcc tgctggcagg cctgtgctgc 60
ctggtccctg tctccctggc tgaggatccc cagggagatg ctgcccagaa gacagataca 120
tcccaccatg atcaggatca cccaaccttc aacaagatca cccccaacct ggctgagttc 180
gccttcagcc tataccgcca gctggcacac cagtccaaca gcaccaatat cttcttctcc 240
ccagtgagca tcgctacagc ctttgcaatg ctctccctgg ggaccaaggc tgacactcac 300
gatgaaatcc tggagggcct gaatttcaac ctcacggaga ttccggaggc tcagatccat 360
gaaggcttcc aggaactcct ccgtaccctc aaccagccag acagccagct ccagctgacc 420
accggcaatg gcctgttcct cagcgagggc ctgaagctag tggataagtt tttggaggat 480
gttaaaaagt tgtaccactc agaagccttc actgtcaact tcggggacac cgaagaggcc 540
aagaaacaga tcaacgatta cgtggagaag ggtactcaag ggaaaattgt ggatttggtc 600
aaggagcttg acagagacac agtttttgct ctggtgaatt acatcttctt taaaggcaaa 660
tgggagagac cctttgaagt caaggacacc gaggaagagg acttccacgt ggaccaggtg 720
accaccgtga aggtgcctat gatgaagcgt ttaggcatgt ttaacatcca gcactgtaag 780
aagctgtcca gctgggtgct gctgatgaaa tacctgggca atgccaccgc catcttcttc 840
ctgcctgatg aggggaaact acagcacctg gaaaatgaac tcacccacga tatcatcacc 900
aagttcctgg aaaatgaaga cagaaggtct gccagcttac atttacccaa actgtccatt 960
actggaacct atgatctgaa gagcgtcctg ggtcaactgg gcatcactaa ggtcttcagc 1020
aatggggctg acctctccgg ggtcacagag gaggcacccc tgaagctctc caaggccgtg 1080
cataaggctg tgctgaccat cgacaagaaa gggactgaag ctgctggggc catgttttta 1140
gaggccatac ccatgtctat cccccccgag gtcaagttca acaaaccctt tgtcttctta 1200
atgattgaac aaaataccaa gtctcccctc ttcatgggaa aagtggtgaa tcccacccaa 1260
aaataaaagc tttgc 1275
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 90
ggcatgttta acatccagca ctg 23
<210> 91
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 91
gcaaagcttt tatttttggg tgggattcac c 31
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 92
ccatcttctt cctgcctgat g 21
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 93
catgaagagg ggagacttgg 20
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 94
gaactcaccc acgatatcat cac 23
<210> 95
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 95
aattctgtaa gagcagatcc ctggacaggc aaggaataca ggtattttgt ccttgaa 57
<210> 96
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 96
agctttcaag gacaaaatac ctgtattcct tgcctgtcca gggatctgct cttacag 57
<210> 97
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 97
aattccgaga tcctccggga gaagggcttc aaccaggcgc ccgtggtgga tgaggca 57
<210> 98
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 98
agcttgcctc atccaccacg ggcgcctggt tgaagccctt ctcccggagg atctcgg 57
<210> 99
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 99
aattctaaca gtgataataa cttttcactt agggcctaca gtactgctta tcagaga 57
<210> 100
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 100
agcttctctg ataagcagta ctgtaggccc taagtgaaaa gttattatca ctgttag 57
<210> 101
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 101
aattctgatt atgagccaac tgatgccacc aggttcatca acatcaattc cctcaga 57
<210> 102
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 102
agcttctgag ggaattgatg ttgatgaacc tggtggcatc agttggctca taatcag 57
<210> 103
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 103
aattctggtt ttccttgggt gcctttatgc agcaaggatg cgatatttcg ccaagaa 57
<210> 104
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 104
agctttcttg gcgaaatatc gcatccttgc tgcataaagg cacccaagga aaaccag 57
<210> 105
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 105
aattcggctc cctggtggat ttcattaaac ataactgacc ctacagccct gggtgga 57
<210> 106
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 106
agcttccacc cagggctgta gggtcagtta tgtttaatga aatccaccag ggagccg 57
<210> 107
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 107
aattcctcac cgcagccctg aaagagatcc acacgcagta tgaggcaatg gcgtcca 57
<210> 108
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 108
agcttggacg ccattgcctc atactgcgtg tggatctctt tcagggctgc ggtgagg 57
<210> 109
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 109
aattcaaaca ttaaccaggt ggtatttgtt agaaatttct tgagaattaa tacgata 57
<210> 110
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 110
agcttatcgt attaattctc aagaaatttc taacaaatac cacctggtta atgtttg 57
<210> 111
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 111
aattcgagta tgaaagagta attatattcc aactgggaca tctgcttcct ggaagaa 57
<210> 112
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 112
agctttcttc caggaagcag atgtcccagt tggaatataa ttactctttc atactcg 57

Claims (47)

1.诱导针对靶标RNA的位点特异性编辑的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，
其包含识别所述靶标RNA的第一寡聚核苷酸和
与所述第一寡聚核苷酸的5’侧连接的第二寡聚核苷酸，
所述第一寡聚核苷酸由与所述靶标RNA中的腺苷残基对应的靶标对应核苷酸残基、
与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的具有与所述靶标RNA互补的碱基序列的10～24个残基的寡聚核苷酸以及
与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的具有与所述靶标RNA互补的碱基序列的3～6个残基的寡聚核苷酸构成，
所述第二寡聚核苷酸在其3’末端缺失与所述靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基，或者是具有不与所述靶标RNA的核苷酸残基形成互补对的核苷酸残基，
所述第二寡聚核苷酸的残基数为2～10个，至少其3’末端以外的核苷酸残基与所述靶标RNA形成互补的双链结构，
具有由所述靶标对应核苷酸残基以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的计数区域，
与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的核苷酸残基为2’-脱氧核苷酸残基，
在与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸中，从所述靶标对应核苷酸起沿3’方向计数的第3位的核苷酸残基为2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基。
2.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸的残基数为4～8个。
3.根据权利要求1或2所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸的3’末端缺失与所述靶标RNA的核苷酸残基对应的核苷酸残基。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述位点特异性编辑是由腺苷脱氨酶1所致的酶反应引起的。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述第一寡聚核苷酸与第二寡聚核苷酸之间包含含有亚烷基氧基单元的连接部。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸包含硫代磷酸酯键。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸残基。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述计数区域包含硫代磷酸酯键。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标对应核苷酸残基包含硫代磷酸酯键。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的核苷酸残基为2’-O-烷基核糖核苷酸残基或脱氧核苷酸残基。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的碱基序列。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸具有交联型核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的碱基序列。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中与所述靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述第一寡聚核苷酸中，与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基连接的碱基序列。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述第一寡聚核苷酸中，与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在所述第一寡聚核苷酸中，与所述靶标对应核苷酸残基的5’侧连接的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基交替连接的碱基序列。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基连接的碱基序列。
19.根据权利要求1～18中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
20.根据权利要求1～19中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基交替连接的碱基序列。
21.根据权利要求1～20中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标RNA在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有胞苷残基，
所述第一寡聚核苷酸在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的核苷酸残基为2’-脱氧肌苷残基。
22.根据权利要求1～20中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标RNA在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有尿苷残基，
所述第一寡聚核苷酸在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的核苷酸残基为2’-脱氧腺苷残基。
23.根据权利要求1～20中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标RNA在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有腺苷残基，
所述第一寡聚核苷酸在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的核苷酸残基为胸苷残基或2’-脱氧尿苷残基。
24.根据权利要求1～20中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标RNA在作为编辑靶标的腺苷残基的5’侧连接有鸟苷残基，
所述第一寡聚核苷酸在靶标对应核苷酸残基的3’侧连接的核苷酸残基为2’-脱氧肌苷残基。
25.根据权利要求1～24中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标对应核苷酸残基为N-烷基嘧啶核苷酸残基或2’-脱氧胞苷残基。
26.根据权利要求1～25中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸分别是核苷酸残基通过硫代磷酸酯键连接而成的。
27.根据权利要求1～26中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸在从所述靶标对应核苷酸起沿3’方向计数的第10位以后的核苷酸残基中具有交联型核苷酸残基。
28.根据权利要求27所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第一寡聚核苷酸由从所述靶标对应核苷酸起沿3’方向计数的第10位以后的核苷酸残基构成的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
29.根据权利要求1～28中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸在从其3’末端的核苷酸残基起沿5’方向计数的第2位以后的核苷酸残基中具有交联型核苷酸残基。
30.根据权利要求29所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述第二寡聚核苷酸由从其3’末端的核苷酸残基起沿5’方向计数的第2位以后的核苷酸残基构成的寡聚核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的碱基序列。
31.根据权利要求1～30中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其用下式中的任一个表示：
U(M)^T(L)^G(M)^A(L)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(L)^U(M)^T(L)^G(M)(AD1_ASS1.39)，
A(M)^A(L)^G(M)^A(L)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^U(M)(AD1_PANK2.39)，
A(M)^T(L)^G(M)^T(L)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(L)^A(M)^C(L)^U(M)(AD1_NPHS2.39)，
G(M)^C(L)^A(M)^T(L)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(L)^C(M)^C(L)^C(M)(AD1_GRIA2.39)，
U(M)^G(L)^A(M)^U(L)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(L)^G(M)^U(L)^U(M)(AD1_ASS1.52)，
G(M)^C(E)^A(M)^T(E)^C(M)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^C(M)(AD1_GRIA2.39e)，
U(M)^T(E)^G(M)^A(E)^U(M)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(M)^G(E)^U(M)^T(E)^G(M)(AD1_ASS1.39e)，
A(M)^A(E)^G(M)^A(E)^A(M)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(M)^A(E)^C(M)^C(E)^U(M)(AD1_PANK2.39e)，
A(M)^T(E)^G(M)^T(E)^C(M)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^U(M)^T(E)^A(M)^C(E)^U(M)(AD1_NPHS2.39e)，
C(M)^A(E)^U(M)^C(E)^C(F)^U(F)^G(M)^C(M)^c^i^C(M)^A(F)^U(M)^A(F)^A(M)^A(F)^G(M)^G(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M)
(AD1_GRIA2.52e)，
U(M)^G(E)^A(M)^T(E)^G(F)^A(F)^C(M)^C(M)^c^i^G(M)^U(F)^G(M)^G(F)^C(M)^A(F)^U(M)^C(F)^A(E)^G(M)^T(E)^U(M)
(AD1_ASS1.52e)，
A(M)^G(E)^A(M)^A(E)^A(F)^U(F)^U(M)^C(M)^c^a^A(M)^C(F)^A(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^C(F)^C(E)^A(M)^C(E)^C(M)
(AD1_PANK2.52e)，
U(M)^G(E)^U(M)^C(E)^C(F)^A(F)^G(M)^U(M)^c^i^G(M)^A(F)^A(M)^U(F)^A(M)^U(F)^A(M)^A(F)^T(E)^U(M)^A(E)^C(M)
(AD1_NPHS2.52e)，
G(M)^T(L)^C(M)^C(L)^C(M)^U(F)^U(F)^C(M)^U(M)^c^i^U(M)^C(F)^G(M)^A(F)^U(M)^G(F)^G(M)^U(F)^C(M)^A(L)^G(M)^C(L)^A(M)(AD1_A1AT.39)，
式中，大写字母表示核糖核苷酸残基，小写字母表示2’-脱氧核糖核苷酸残基，N(M)表示2’-O-甲基-核糖核苷酸残基，N(F)表示2’-氟-2’-脱氧核糖核苷酸残基，N(L)表示2’-O,4’-C-亚甲基化核糖核苷酸残基，N(E)表示2’-O,4’-C-亚乙基化核糖核苷酸残基，“^”表示核苷单元间通过-P(＝S)(OH)-结合。
32.根据权利要求1～31中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述寡聚核苷酸及其药学上可接受的盐在5’末端或3’末端经由接头或磷酸二酯键(包含硫代磷酸酯键)结合有包含GalNAc、胆固醇和脂肪酸的递送分子。
33.遗传性疾病治疗剂，其含有根据权利要求1～32中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，用于治疗与所述靶标RNA相关的疾病。
34.药物组合物，其含有根据权利要求1～32中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐作为活性成分，用于治疗与所述靶标RNA相关的疾病。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其用于遗传性疾病的预防或治疗。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述遗传性疾病是可通过将所述靶标RNA中的腺苷残基转换为肌苷残基来治疗的疾病。
37.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述遗传性疾病是以基因中的鸟苷残基向腺苷残基的突变为原因的遗传性疾病。
38.根据权利要求1～32中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐的用途，其用于制造用于预防或治疗与所述靶标RNA相关的疾病的药物。
39.根据权利要求1～32中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其用于预防或治疗与所述靶标RNA相关的疾病的用途。
40.用于预防或治疗与所述靶标RNA相关的疾病的方法，其通过将药理学有效量的根据权利要求1～32中任一项所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐对恒温动物进行给药来预防或治疗与所述靶标RNA相关的疾病。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述疾病为遗传性疾病。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述遗传性疾病是可通过将靶标RNA中的腺苷残基转换为肌苷残基来治疗的疾病。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述遗传性疾病是以基因中的鸟苷残基向腺苷残基的突变为原因的遗传性疾病。
44.根据权利要求34～37中任一项所述的药物组合物，其中所述疾病包含选自I型瓜氨酸血症、血友病(血栓症)、ALS、泛酸相关神经退行性疾病、高胱氨酸尿症、局灶性节段性肾小球硬化症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、苯丙酮尿症、厚皮性骨膜病、亚历山大病、原发性高草酸尿症、吉尔伯特综合征、视网膜色素变性、远端型肌病和血色素沉着症的至少1种。
45.根据权利要求38所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐的用途，其中所述疾病包含选自I型瓜氨酸血症、血友病(血栓症)、ALS、泛酸相关神经退行性疾病、高胱氨酸尿症、局灶性节段性肾小球硬化症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、苯丙酮尿症、厚皮性骨膜病、亚历山大病、原发性高草酸尿症、吉尔伯特综合征、视网膜色素变性、远端型肌病和血色素沉着症的至少1种。
46.根据权利要求39所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述疾病包含选自I型瓜氨酸血症、血友病(血栓症)、ALS、泛酸相关神经退行性疾病、高胱氨酸尿症、局灶性节段性肾小球硬化症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、苯丙酮尿症、厚皮性骨膜病、亚历山大病、原发性高草酸尿症、吉尔伯特综合征、视网膜色素变性、远端型肌病和血色素沉着症的至少1种。
47.根据权利要求40～43中任一项所述的方法，其中所述疾病包含选自I型瓜氨酸血症、血友病(血栓症)、ALS、泛酸相关神经退行性疾病、高胱氨酸尿症、局灶性节段性肾小球硬化症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、苯丙酮尿症、厚皮性骨膜病、亚历山大病、原发性高草酸尿症、吉尔伯特综合征、视网膜色素变性、远端型肌病和血色素沉着症的至少1种。
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