WO2022124345A1 - 化学修飾核酸を導入した安定型標的編集ガイドｒｎａ - Google Patents

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将虎 福田
誠 小泉
真三 岩下
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Definitions

  • the present invention relates to a stable target editing guide RNA into which a chemically modified nucleic acid has been introduced.
  • RNA is a transient genetic information molecule. Therefore, modification of RNA information can give the target organism a temporary non-permanent genetic information modification effect.
  • RNA modification technique for example, International Publication No. 2016/097212 has a target-directed moiety containing an antisense sequence complementary to a part of the target RNA, which is present in the cell and can edit nucleotides. Oligonucleotide constructs for site-specific editing of nucleotides in a target RNA sequence are described, including recruitment moieties that can be attached to and recruited to RNA editing entities. Further, for example, International Publication No. 2017/010556 describes a site-specific RNA mutation introduction method in which double-stranded specific adenosine deaminase (ADAR) is allowed to act on a complex of a target RNA and a target editing guide RNA. .. Further, Nature Biotechnology 37, 133-138 (2019) describes that a modified nucleic acid is introduced into an antisense oligonucleotide that recruits ADAR.
  • ADAR double-stranded specific adenosine deaminase
  • ADAR1 and ADAR2 isoforms are known as adenosine deaminase having RNA editing activity, and these are considered to be cell-type-specifically expressed in vivo.
  • ADAR1 is said to be rarely expressed in human skeletal muscle cells.
  • ADAR2 is said to be hardly expressed in human bone marrow cells.
  • ADAR1 is more expressed in human cells.
  • one aspect of the present invention is to provide an oligonucleotide capable of inducing the editing activity of ADAR1 in a cell and having excellent stability in a living body.
  • a first oligonucleotide that identifies a target RNA and a second oligonucleotide linked to the 5'side of the first oligonucleotide are included, and the first oligonucleotide is adenosine in the target RNA.
  • Target-corresponding nucleotide residues corresponding to the residues 10 to 24 residue oligonucleotides linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue and having a base sequence complementary to the target RNA
  • the target-corresponding It consists of 3 to 6 residue oligonucleotides linked to the 5'side of the nucleotide residue and having a base sequence complementary to the target RNA, the second oligonucleotide being the 3'end of the target RNA.
  • the nucleotide residue corresponding to the nucleotide residue is deleted or has a nucleotide residue that does not form a complementary pair with the nucleotide residue of the target RNA, and the second oligonucleotide has 2 to 10 residues. There, at least the nucleotide residues other than the 3'end form a double-stranded structure complementary to the target RNA, and from the target-corresponding nucleotide residue and one residue on each of the 3'and 5'sides.
  • At least one residue selected from the counter region is a nucleotide residue other than the native ribonucleotide residue, which is an oligonucleotide that induces site-specific editing for the target RNA, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. ..
  • oligonucleotide according to any one of (1-1) to (1-3), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is caused by an enzymatic reaction by adenosine deaminase 1 in the site-specific editing. ..
  • a pharmaceutically acceptable salt
  • the first oligonucleotide is the oligonucleotide according to any one of (1-1) to (1-5) containing a phosphorothioate bond, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the first oligonucleotide consists of a 2'-O-alkylribonucleotide residue, a 2'-deoxy-2'-fluororibonucleotide residue, a crosslinked nucleotide residue, and a 2'-deoxyribonucleotide.
  • the oligonucleotide according to any one of (1-1) to (1-6) containing at least one modified nucleotide residue selected from the group, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • At least one of the 1 residues on the 3'side and the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue is a 2'-O-alkylribonucleotide residue or a deoxynucleotide residue.
  • the second oligonucleotide is selected from the group consisting of 2'-O-alkylribonucleotide residues, 2'-deoxy-2'-fluororibonucleotide residues, and crosslinked nucleotide residues.
  • the oligonucleotide according to any one of (1-1) to (1-10) containing at least one modified nucleotide residue, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue is alternately linked with a 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residue and a 2'-O-alkylribonucleotide residue.
  • the third nucleotide residue counting in the 3'direction from the target-corresponding nucleotide is a 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide.
  • the oligonucleotide according to (1-12) which is a residue, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue has a base sequence in which cross-linked nucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues are alternately linked (1).
  • -1 The oligonucleotide according to any one of (1-11), or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the third nucleotide residue counting in the 3'direction from the target-corresponding nucleotide is a crosslinked nucleotide residue (1-15).
  • the oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue has a base sequence in which 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residues and crosslinked nucleotide residues are alternately linked.
  • the third nucleotide residue counting in the 3'direction from the target-corresponding nucleotide is a 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide.
  • the oligonucleotide according to (1-16) which is a residue, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the oligonucleotide linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue has a base sequence to which the 2'-O-alkylribonucleotide residue is linked (1-1). )
  • the oligonucleotide according to any one of (1-17), or a pharmaceutically acceptable salt thereof is linked to the oligonucleotide according to any one of (1-17), or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the oligonucleotide linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue is alternately linked with a 2'-O-alkylribonucleotide residue and a crosslinked nucleotide residue.
  • the oligonucleotide linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue is a 2'-O-alkylribonucleotide residue and a 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide.
  • (1-21) The oligonucleotide according to any one of (1-1) to (1-20), wherein the second oligonucleotide has a base sequence to which a 2'-O-alkylribonucleotide residue is linked, or Its pharmaceutically acceptable salt.
  • the second oligonucleotide has a base sequence in which 2'-O-alkylribonucleotide residues and crosslinked nucleotide residues are alternately linked (1-1) to (1-20).
  • the oligonucleotide according to any one, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the second oligonucleotide has a base sequence in which 2'-O-alkylribonucleotide residues and 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residues are alternately linked (1-1). To (1-20), or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the target RNA has a cytidine residue linked to the 5'side of the adenosine residue that is the editing target, and the first oligonucleotide has a nucleotide residue linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • the oligonucleotide according to any one of (1-1) to (1-23), wherein the group has a hypoxanthine residue as a base, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • composition according to (1-29) wherein the hereditary disease is a disease that can be treated by converting an adenosine residue in a target RNA into an inosine residue.
  • (1-31) The pharmaceutical composition according to (1-29), wherein the hereditary disease is a hereditary disease caused by a mutation of a guanosine residue to an adenosine residue in a gene.
  • (1-32) The oligonucleotide according to any one of (1-1) to (1-26) for producing a drug for the prevention or treatment of a disease, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. use.
  • (1-34) A disease caused by administering to a warm-blooded animal a pharmacologically effective amount of the oligonucleotide according to any one of (1-1) to (1-26) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Methods for prevention or treatment.
  • hereditary disease is a disease that can be treated by converting an adenosine residue in a target RNA into an inosine residue.
  • hereditary disease is a hereditary disease caused by a mutation of a guanosine residue to an adenosine residue in a gene.
  • the first oligonucleotide that identifies the target RNA, the second oligonucleotide linked to the 5'side of the first oligonucleotide, and the first oligonucleotide and the second oligonucleotide are linked.
  • the first oligonucleotide is linked to the target-corresponding nucleotide residue corresponding to the adenosine residue in the target RNA and the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue, including a linking portion containing an alkyleneoxy unit.
  • At least one residue selected from the counter region is a nucleotide residue other than the native ribonucleotide residue, which is an oligonucleotide that induces site-specific editing on the target RNA, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a first oligonucleotide that identifies a target RNA and a second oligonucleotide linked to the 5'side of the first oligonucleotide are included, and the first oligonucleotide is adenosine in the target RNA.
  • Target-corresponding nucleotide residues corresponding to the residues 10 to 24 residue oligonucleotides linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue and having a base sequence complementary to the target RNA
  • the target-corresponding It consists of 3 to 6 residue oligonucleotides linked to the 5'side of the nucleotide residue and having a base sequence complementary to the target RNA, the second oligonucleotide being the 3'end of the target RNA.
  • a nucleotide residue corresponding to a nucleotide residue is deleted, or a nucleotide residue that does not form a complementary pair with the nucleotide residue of the target RNA (hereinafter, a complementary pair with the nucleotide residue of the target RNA in the second oligonucleotide).
  • the non-forming nucleotide residue and the target-corresponding nucleotide residue are collectively referred to as "non-complementary nucleotide residue"
  • the second oligonucleotide has 2 to 10 residues, at least 3'.
  • Nucleotide residues other than the terminal form a double-stranded structure complementary to the target RNA, and have a counter region consisting of the target-corresponding nucleotide residue and 1 residue each on the 3'side and 5'side thereof.
  • the nucleotide residue linked to the 3'side of the target-compatible nucleotide residue is a 2'-deoxynucleotide residue, and in the oligonucleotide linked to the 3'side of the target-compatible nucleotide residue, the target-compatible nucleotide
  • the third nucleotide residue counting in the 3'direction is a 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residue, which is an oligonucleotide that induces site-specific editing for the target RNA, or is pharmaceutically acceptable thereof. Salt.
  • the first oligonucleotide is the oligonucleotide according to any one of (2-1) to (2-5) containing a phosphorothioate bond, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the first oligonucleotide consists of a 2'-O-alkylribonucleotide residue, a 2'-deoxy-2'-fluororibonucleotide residue, a crosslinked nucleotide residue, and a 2'-deoxyribonucleotide.
  • the nucleotide residue linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue is a 2'-O-alkylribonucleotide residue or a deoxynucleotide residue from (2-1) to (2-).
  • the second oligonucleotide is selected from the group consisting of 2'-O-alkylribonucleotide residues, 2'-deoxy-2'-fluororibonucleotide residues, and crosslinked nucleotide residues.
  • the oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue is alternately linked with a 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residue and a 2'-O-alkylribonucleotide residue.
  • the oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue has a base sequence in which cross-linked nucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues are alternately linked (2).
  • -1) The oligonucleotide according to any one of (2-12), or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue has a base sequence in which 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residues and crosslinked nucleotide residues are alternately linked.
  • the oligonucleotide linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue has a base sequence to which the 2'-O-alkylribonucleotide residue is linked (2-1). ) To (2-14), or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the oligonucleotide linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue is alternately linked with a 2'-O-alkylribonucleotide residue and a crosslinked nucleotide residue.
  • the oligonucleotide linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue is a 2'-O-alkylribonucleotide residue and a 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide.
  • the second oligonucleotide has a base sequence in which 2'-O-alkylribonucleotide residues and crosslinked nucleotide residues are alternately linked.
  • the oligonucleotide according to any one, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the second oligonucleotide has a base sequence in which 2'-O-alkylribonucleotide residues and 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residues are alternately linked (2-1).
  • the oligonucleotide according to any one of (2-19) to (2-19), or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the target RNA has a cytidine residue linked to the 5'side of the adenosine residue that is the editing target, and the first oligonucleotide has a nucleotide residue linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • the oligonucleotide according to any one of (2-1) to (2-20), wherein the group is a 2'-deoxyinosine residue, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the target RNA has a uridine residue linked to the 5'side of the adenosine residue that is the editing target, and the first oligonucleotide has a nucleotide residue linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • the oligonucleotide according to any one of (2-1) to (2-20), wherein the group is a 2'-deoxyadenosine residue, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the adenosine residue is linked to the 5'side of the adenosine residue which is the editing target
  • the first oligonucleotide is the nucleotide residue linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • the oligonucleotide according to any one of (2-1) to (2-20), wherein the group is a thymidine residue or a 2'-deoxyuridine residue, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the guanosine residue is linked to the 5'side of the adenosine residue which is the editing target
  • the first oligonucleotide is the nucleotide residue linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • the oligonucleotide according to any one of (2-1) to (2-20), wherein the group is a 2'-deoxyinosine residue, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • oligonucleotide according to any one of (2-1) to (2-24), wherein the target-corresponding nucleotide residue is an N-alkylpyrimidine nucleotide residue or a 2'-deoxycytidine residue. Or its pharmaceutically acceptable salt.
  • each of the first oligonucleotide and the second oligonucleotide has nucleotide residues linked by a phosphorothioate bond. Or its pharmaceutically acceptable salt.
  • the first oligonucleotide has a crosslinked nucleotide residue at the 10th and subsequent nucleotide residues counted in the 3'direction from the target-corresponding nucleotide (2-1) to (2-26).
  • the oligonucleotide according to any one of the above, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • an oligonucleotide consisting of the 10th and subsequent nucleotide residues counted in the 3'direction from the target-corresponding nucleotide is a 2'-O-alkylribonucleotide residue and a crosslinked nucleotide.
  • the second oligonucleotide has a crosslinked nucleotide residue at the second and subsequent nucleotide residues counted in the 5'direction from the 3'-terminal nucleotide residue.
  • the oligonucleotide consisting of the second and subsequent nucleotide residues counted in the 5'direction from the 3'-terminal nucleotide residue is a 2'-O-alkylribonucleotide residue.
  • the oligonucleotide according to (2-29) which has a base sequence in which and a crosslinked nucleotide residue are alternately linked, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the oligonucleotide and its pharmaceutically acceptable salt have a delivery molecule containing GalNAc, cholesterol and fatty acid at the 5'end or 3'end as a linker or phosphate diester bond (including a phosphodiester bond).
  • (2-33) Contains the oligonucleotide according to any one of (2-1) to (2-32), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and is used for the treatment of a disease related to the target RNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (2-1) to (2-32), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, is contained as an active ingredient to treat a disease related to the target RNA.
  • hereditary disease is a disease that can be treated by converting an adenosine residue in a target RNA into an inosine residue.
  • hereditary disease is a hereditary disease caused by a mutation of a guanosine residue to an adenosine residue in a gene.
  • the diseases are type I citrullinemia, hemophilinemia (thrombosis), ALS, pantothenic acid-related neurodegenerative disease, homocystinuria, monosegmental glomerulosclerosis, ⁇ 1 anritrypsin deficiency. , Phenylketonuria, hypertrophic dermatoplasty, Alexander's disease, primary hypercystic urinary disease, Gilbert syndrome, retinal pigment degeneration, distal myopathy and hemochromatosis.
  • the pharmaceutical composition according to any one of (2-34) to (2-37).
  • the diseases are type I citrulinemia, hemophilinosis (thrombosis), ALS, pantothenic acid-related neurodegenerative disease, homocystinuria, monosegmental glomerulosclerosis, ⁇ 1 anritrypsin deficiency. , Phenylketonuria, hypertrophic dermatoplasty, Alexander's disease, primary hypercystic urinary disease, Gilbert syndrome, retinal pigment degeneration, distal myopathy and hemochromatosis.
  • the disease is type I citrulinemia, hemophilinosis (thrombosis), ALS, pantothenic acid-related neurodegenerative disease, homocystinuria, monosegmental glomerulosclerosis, ⁇ 1 anritrypsin deficiency. , Phenylketonuria, hypertrophic dermatoplasty, Alexander's disease, primary hypercystic urinary disease, Gilbert syndrome, retinal pigment degeneration, distal myopathy and hemochromatosis.
  • the diseases are type I citrulinemia, hemophilinosis (thrombosis), ALS, pantothenic acid-related neurodegenerative disease, homocystinuria, monosegmental glomerulosclerosis, ⁇ 1 anritrypsin deficiency. , Phenylketonuria, hypertrophic dermatoplasty, Alexander's disease, primary hypercystic urinary disease, Gilbert syndrome, retinal pigment degeneration, distal myopathy and hemochromatosis.
  • the method according to any one of (2-40) to (2-43) including.
  • (3-1) A gene represented by the following formula, in which the bond between nucleotide residues has 20 to 40 residues including a phosphorothioate bond, and the adenosine residue which is an edit target in the target RNA is converted into an inosine residue.
  • Oligonucleotides used for editing or pharmaceutically acceptable salts thereof 5'-O1-O2-N1-N2-N3-N4-N5-O3-O4-3'; [In the above formula, N1 is a 2'-O-alkylribonucleotide residue, a ribonucleotide residue, a 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue or a 2'-deoxyribonucleotide residue.
  • N2 is a ribonucleotide residue whose base is cytosine or 3-methyluracil, a 2'-O-alkylribonucleotide residue or a 2'-deoxyribonucleotide residue.
  • N3 is a 2'-deoxyribonucleotide residue
  • N4 is a 2'-O-alkylribonucleotide residue or a 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue
  • N5 is a 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue
  • O1 is an oligonucleotide that is absent or has 2 to 10 residues and contains at least one cross-linked nucleotide residue, except for the cross-linked nucleotide residue, which is a 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue.
  • O2 is a 2 to 10 residue oligonucleotide consisting of 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues.
  • O3 is a 5 to 20 residue oligonucleotide consisting of 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues.
  • O4 is an oligonucleotide that is absent or has 2 to 10 residues and contains at least one cross-linked nucleotide residue, with the exception of the cross-linked nucleotide residue, which is a 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue. Group or 2'-O-alkylribonucleotide residue];
  • the oligonucleotide corresponds to the adenosine residue whose N2 is the editing target, and the nucleotide residue corresponding to the nucleotide residue of the corresponding target RNA is deleted in the region where O2 is the 2nd to 5th from the 3'side.
  • the base sequence of the oligonucleotide may be a base in which the base of N3 is complementary or non-complementary to the base adjacent to the 5'side of the adenosine residue to be edited, and N1, N4, N5, O1, The bases of O3 and O4 are completely complementary to the bases of the corresponding nucleotide residues of the target RNA.
  • the bases of O2 other than the missing nucleotide residues and the nucleotide residues that do not form a complementary pair with the nucleotide residues of the corresponding target RNA are completely complementary to the bases of the corresponding nucleotide residues of the target RNA. Is.
  • N3 is a 2'-deoxyadenosine residue and a 2'-deoxyinosine residue (provided that it is a 2'-deoxyinosin residue.
  • the nucleotide residue on the 5'side of the adenosine residue that is the editing target is an adenosine residue and a uridine residue
  • a thymidine residue or a 2'-deoxyuridine residue is the adenosine residue that is the editing target.
  • N3 is 2 '-The oligonucleotide according to (3-1) which is a deoxyinosine residue or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • N3 is a 2'-deoxyinosin residue and the adenosine residue that is the edit target.
  • N3 When a uridine residue is linked to the 5'side, N3 is a 2'-deoxyadenosine residue, and when an adenosine residue is linked to the 5'side of the adenosine residue that is the editing target, N3 is a thymidine residue or The oligo according to (3-1), wherein N3 is a 2'-deoxyinosine residue when the guanosine residue is linked to the 5'side of the 2'-deoxyuridine residue and the adenosine residue that is the editing target. Nucleotides, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • (3-4) The oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-3), wherein N1 and N4 are 2'-O-alkylribonucleotide residues, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • At least one of O2 and O3 contains a sequence in which 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues are alternately arranged (3-5).
  • the oligonucleotide according to any one of 1) to (3-4) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • O3 consists of a sequence in which 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues are alternately arranged (3-1) to (3-).
  • (3-7) The oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-6), wherein at least one of O1 and O4 contains 1, 2 or 3 crosslinked nucleotide residues, or a pharmaceutical thereof. Acceptable salt.
  • At least one of O1 and O4 contains a sequence in which crosslinked nucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues are alternately arranged (3-1) to (3-8).
  • the oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof is a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the crosslinked nucleotide residue is a 2'-O, 4'-C-methylene crosslinked nucleotide (LNA) residue or 2'-O, 4'-C-ethylene in D-ribofuranose.
  • LNA crosslinked nucleotide
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-9) which is a crosslinked nucleotide (ENA) residue or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • N2 has a base of cytosine and is a ribonucleotide residue, a 2'-O-alkylribonucleotide residue or a 2'-deoxyribonucleotide residue (3-1) to (3-10).
  • the oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof is a base of cytosine and is a ribonucleotide residue, a 2'-O-alkylribonucleotide residue or a 2'-deoxyribonucleotide residue (3-1) to (3-10).
  • N (F) is a 2'-deoxy-2'-fluoroylated ribonucleotide residue of D-ribofuranose (2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue) Nucleonucleotide residue)
  • N (L) is 2'-O of D-ribofranose
  • N (E) is 2'-O of D-ribofranose.
  • Oligonucleotides and pharmaceutically acceptable salts thereof have a delivery molecule containing GalNAc, cholesterol and fatty acid at the 5'end or 3'end having a linker or phosphate diester bond (including a phosphodiester bond).
  • the diseases are type I citrulinemia, hemophilinosis (thrombosis), ALS, pantothenic acid-related neurodegenerative disease, homocystinuria, monosegmental glomerulosclerosis, ⁇ 1 anritrypsin deficiency. , Phenylketonuria, hypertrophic dermatoplasty, Alexander's disease, primary hypercystic urinary disease, Gilbert syndrome, retinal pigment degeneration, distal myopathy and hemochromatosis.
  • the target RNA is the mRNA of the ASS1 gene
  • the editing target is the 1524th nucleotide of the ASS1 mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is consecutively contained at the 1500th to 1540th positions of the ASS1 mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to the region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the mRNA of the F5 gene
  • the editing target is the 1696th nucleotide of the F5 mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained in the 1672th to 1712th nucleotides of the mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to the region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the mRNA of the GRIA2 gene
  • the editing target is the 2135th nucleotide of the GRIA2 mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained in the 2111 to 2151th of the GRIA2 mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to a continuous region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the mRNA of the PANK2 gene
  • the editing target is the 1728th nucleotide of the PANK2 mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained in the 1704 to 1744th of the PANK2 mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to a continuous region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the mRNA of the CBS gene
  • the editing target is the 1575th nucleotide of the CBS mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained in the 1551th to 1591th of the CBS mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to a continuous region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the mRNA of the NPHS2 gene
  • the editing target is the 497th nucleotide of the NPHS2 mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained in the 473th to 513th positions of the NPHS2 mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to a continuous region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the mRNA of the SERPINA1 gene
  • the editing target is the 1143th nucleotide of the SERPINA1 mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained in the 1119th to 1159th nucleotides of the SERPINA1 mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to a continuous region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the mRNA of the PAH gene
  • the editing target is the 896th nucleotide of the PAH mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained in the 872 to 912th PAH mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to a continuous region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the pre-mRNA of the SLCO2A1 gene
  • the editing target is the 81304th nucleotide of the SLCO2A1 pre-mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is the 81010 of the SLCO2A1 pre-mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to the continuous region of 20 to 40 bases contained in positions 81050.
  • the target RNA is the mRNA of the GFAP gene
  • the editing target is the 2168th nucleotide of the GFAP mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained in the 2144th to 2184th positions of the GFAP mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to a continuous region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the mRNA of the AGXT gene
  • the editing target is the 550th nucleotide of the AGXT mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained at the 526th to 566th positions of the AGXT mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to a continuous region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the mRNA of the UGT1A1 gene
  • the editing target is the 229th nucleotide of the UGT1A1 mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained in the 205th to 245th positions of the UGT1A1 mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to a continuous region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the mRNA of the EYS gene
  • the editing target is the 8478th nucleotide of the EYS mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained in the 8454th to 8494th of the EYS mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to a continuous region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the mRNA of the GNE gene
  • the editing target is the 924th nucleotide of the GNE mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained in the 900th to 940th of the GNE mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to a continuous region of 20 to 40 bases.
  • the target RNA is the mRNA of the HFE gene
  • the editing target is the 1005th nucleotide of the HFE mRNA
  • the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide and N3 is contained in the 981 to 1021th of the HFE mRNA.
  • the oligonucleotide according to any one of (3-1) to (3-15) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is completely complementary to a continuous region of 20 to 40 bases.
  • ADAR1 editing activity of ADAR1 in the cell
  • ADAR1 editing activity of ADAR1
  • oligonucleotide having excellent stability in the living body.
  • the term "process” is included in this term not only as an independent process but also as long as the intended purpose of the process is achieved even if it cannot be clearly distinguished from other processes. ..
  • the content of each component in the composition means the total amount of the plurality of substances present in the composition when a plurality of substances corresponding to each component are present in the composition, unless otherwise specified.
  • the upper limit and the lower limit of the numerical range described in the present specification can be arbitrarily selected and combined with the numerical values exemplified as the numerical range.
  • oligonucleotides exemplify oligonucleotides, pharmaceutical compositions and methods for the prevention or treatment of diseases for embodying the technical idea of the present invention, and the present invention is described below. It is not limited to the oligonucleotides, pharmaceutical compositions and methods for the prevention or treatment of diseases shown in.
  • Target Editing Guide RNA The oligonucleotide that induces site-specific editing for the target RNA (hereinafter, also referred to as target editing guide RNA; gRNA) is a first oligonucleotide that identifies the target RNA and a second oligonucleotide that is linked to the 5'side of the first oligonucleotide. Includes oligonucleotides and.
  • the first oligonucleotide is a 10 to 24 residue linked to the target-corresponding nucleotide residue corresponding to the adenosine residue in the target RNA and on the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue and having a base sequence complementary to the target RNA.
  • the second oligonucleotide may consist of a base oligonucleotide and an oligonucleotide of 3 to 6 residues linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue and having a base sequence complementary to the target RNA.
  • the second oligonucleotide has a nucleotide residue corresponding to the nucleotide residue of the target RNA at its 3'end, or has a nucleotide residue that does not form a complementary pair with the nucleotide residue of the target RNA. You may be.
  • the second oligonucleotide has 2 to 10 residues, and at least the nucleotide residues other than the 3'end may form a double-stranded structure complementary to the target RNA.
  • At least one residue selected from the target-corresponding nucleotide residue and the counter region consisting of one residue on each of its 3'and 5'sides may be a nucleotide residue other than the native
  • the second oligonucleotide that constitutes the target editing guide RNA one nucleotide residue of the target RNA does not form a complementary pair, and the corresponding nucleotide residue other than the nucleotide residue is complementary to the target RNA. It has a base sequence that forms a structure. That is, the second oligonucleotide has a base sequence that forms an incomplete double-stranded structure with the target RNA.
  • the target editing guide RNA having a short second oligonucleotide having such a characteristic base sequence on the 5'side of the first oligonucleotide that identifies the target RNA preferentially edits ADAR1 in the cell. Can be guided to.
  • nucleotide residues that do not form complementary pairs favors the recruitment of ADAR1.
  • a nucleotide residue other than the natural ribonucleotide residue in the counter region the stability in the living body is excellent.
  • the target editing oligonucleotide includes a first oligonucleotide that identifies the target RNA and a second oligonucleotide that is linked to the 5'side of the first oligonucleotide.
  • the first oligonucleotide is a 10 to 24 residue linked to the target-corresponding nucleotide residue corresponding to the adenosine residue in the target RNA and on the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue and having a base sequence complementary to the target RNA.
  • the second oligonucleotide may consist of a base oligonucleotide and an oligonucleotide of 3 to 6 residues linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue and having a base sequence complementary to the target RNA.
  • the second oligonucleotide has a nucleotide residue corresponding to the nucleotide residue of the target RNA at its 3'end, or has a nucleotide residue that does not form a complementary pair with the nucleotide residue of the target RNA. good.
  • the second oligonucleotide has 2 to 10 residues, and at least the nucleotide residues other than the 3'end may form a double-stranded structure complementary to the target RNA.
  • the nucleotide residue linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue may be a 2'-deoxynucleotide residue, and in the oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • the third nucleotide residue counting in the 3'direction from the target-corresponding nucleotide may be a 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residue.
  • a target-edited oligonucleotide has a 2'-deoxynucleotide residue on the 3'side of the target-compatible nucleotide residue and is linked to the 3'side of the target-compatible nucleotide residue in the 3'direction from the target-compatible nucleotide.
  • the target editing oligonucleotide is an oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof represented by the following formula (I), wherein the bond between the nucleotide residues has 20 to 40 residues including a phosphorothioate bond. It's okay.
  • the length of the target editing oligonucleotide may be preferably 20 to 30 residues, more preferably 21,22,23,24,25,26,27 or 28 residues.
  • all the bonds between nucleotide residues may preferably be phosphorothioate bonds.
  • Target-edited oligonucleotides may be used, for example, for gene editing to convert adenosine residues, which are the editing targets in the target RNA, to inosine residues. 5'-O1-O2-N1-N2-N3-N4-N5-O3-O4-3'(I)
  • N1 may be a 2'-O-alkylribonucleotide residue, a ribonucleotide residue, a 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue or a 2'-deoxyribonucleotide residue. It may preferably be a 2'-O-alkylribonucleotide residue, a ribonucleotide residue or a 2'-deoxyribonucleotide residue.
  • N2 may be a ribonucleotide residue whose base is cytosine or 3-methyluracil, a 2'-O-alkyl ribonucleotide residue or a 2'-deoxyribonucleotide residue.
  • N3 may be a 2'-deoxyribonucleotide residue.
  • N4 may be a 2'-O-alkylribonucleotide residue or a 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue.
  • N5 may be a 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue.
  • O1 may be an oligonucleotide that is absent or has 2 to 10 residues.
  • O1 contains at least one crosslinked nucleotide residue and may be a 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue or a 2'-O-alkylribonucleotide residue, except for the crosslinked nucleotide residue.
  • O2 is an oligonucleotide of 2 to 10 residues and may consist of 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues.
  • O2 is preferably an oligonucleotide with 3,4,5,6,7 or 8 residues, more preferably 3 or 4 residues, with 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residues and 2'-. It may consist of O-alkylribonucleotide residues.
  • O3 is a 5 to 20 residue oligonucleotide and may consist of 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues.
  • O3 is preferably an oligonucleotide of 5,6,7,8,9,10,11,12,13 or 14 residues, more preferably 6 or 7 residues, 2'-fluoro-2'-.
  • O4 may consist of deoxyribonucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues.
  • O4 may be absent or 2 to 10 residue oligonucleotides, preferably 2,3,4,5,6,7 or 8 residues, more preferably 4 or 5 residue oligonucleotides. May be.
  • O4 contains at least one crosslinked nucleotide residue and may be a 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue or a 2'-O-alkylribonucleotide residue, except for the crosslinked nucleotide residue.
  • At least one of O2 and O3 may contain a sequence in which 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues are alternately arranged, preferably 2 It consists of a sequence in which'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues are alternately arranged.
  • the number of repetitions of the connection between the 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue and the 2'-O-alkylribonucleotide residue may be, for example, 1 or more and 3 or less, preferably 1 or 2. It may be there.
  • the number of repetitions of the connection between the 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue and the 2'-O-alkylribonucleotide residue may be, for example, 1 or more and 10 or less, preferably 2 or more and 6 or less. It may be, more preferably 3 or 4.
  • the base sequence in which the 2'-deoxyribonucleotide residue and the 2'-O-alkylribonucleotide residue are alternately linked may be alternately linked in the 3'direction from the 2'-deoxyribonucleotide residue. It may be alternately linked in the 3'direction from the 2'-O-alkylribonucleotide residue.
  • At least one of O1 and O4 may contain 1, 2 or 3 crosslinked nucleotide residues, and in this case, the crosslinked nucleotide residues may be arranged so as not to be adjacent to each other. At least one of O1 and O4 may contain a sequence in which crosslinked nucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues are alternately arranged. In O1 and O4, the number of repetitions of the linkage between the crosslinked nucleotide residue and the 2'-O-alkylribonucleotide residue may be, for example, 1 or more and 3 or less, preferably 2.
  • the base sequence in which the 2'-O-alkylribonucleotide residue and the crosslinked nucleotide residue are alternately linked may be alternately linked in the 3'direction from the 2'-O-alkylribonucleotide residue.
  • the cross-linked nucleotide residues may be alternately linked in the 3'direction.
  • N1 and N4 may preferably be 2'-O-alkylribonucleotide residues. Further, N2 is preferably based on cytosine and may be a ribonucleotide residue, a 2'-O-alkyl ribonucleotide residue or a 2'-deoxyribonucleotide residue.
  • the nucleotide residue corresponding to the nucleotide residue of the corresponding target RNA is deleted in the region where N2 corresponds to the adenosine residue which is the editing target and O2 is the 2nd to 5th region from the 3'side. It may have a nucleotide residue that does not form a complementary pair with the nucleotide residue of the corresponding target RNA.
  • the base sequence of the target editing oligonucleotide may be a base in which the base of N3 is complementary or non-complementary to the base adjacent to the 5'side of the adenosine residue which is the editing target.
  • the bases of N1, N4, N5, O1, O3 and O4 may be completely complementary to the bases of the corresponding nucleotide residues of the target RNA.
  • the bases of O2 other than the missing nucleotide residues and the nucleotide residues that do not form a complementary pair with the nucleotide residues of the corresponding target RNA are completely complementary to the bases of the corresponding nucleotide residues of the target RNA. May be.
  • N3 is a 2'-deoxyadenosine residue.
  • 2'-deoxyadenosine residue except when the nucleotide residue on the 5'side of the adenosine residue to be edited is an adenosine residue and a uridine residue), a thymidine residue or a 2'-deoxyuridine residue. (However, this does not apply when the nucleotide residue on the 5'side of the adenosine residue that is the editing target is a guanosine residue).
  • N3 may be a 2'-deoxyinosine residue.
  • the target editing oligonucleotide has the structure represented by the formula (I), it has excellent stability in the living body and can more effectively induce the editing activity of ADAR in the cell.
  • the target editing guide RNA of the present embodiment is shorter than the conventional target editing guide RNA, so that the manufacturing cost is simply reduced.
  • chemical synthesis becomes easy, and it becomes easy to apply modified nucleotides such as existing artificial nucleic acids used in nucleic acid drug development to target editing guide RNA.
  • This makes it possible to provide a more highly functional target editing guide RNA by improving intracellular degradation resistance, cell introduction efficiency, and the like.
  • the target editing guide RNA is composed of the minimum number of residues required for editing induction, thereby suppressing off-target editing at positions other than the adenosine residue, which is the editing target, while maintaining specificity for the target RNA. be able to.
  • the target editing guide RNA induces site-specific editing for the target RNA by preferentially recruiting ADAR1 from the ADAR that catalyzes the target editing to the target RNA, for example.
  • ADAR is an enzyme that converts adenosine residues in double-stranded RNA into inosine residues by a hydrolytic deamination reaction, and is widely present in mammalian cells. Since the inosine residue is similar in structure to the guanosine residue, it is translated as a guanosine residue when translating the RNA information, and as a result, the RNA information is edited. When such RNA editing occurs in the portion encoding an amino acid, amino acid substitution or the like occurs even though there is no DNA mutation on the genome, and the function of the target gene can be controlled.
  • ADAR1 present in the cells can be preferentially recruited to the target RNA to induce site-specific editing for the target RNA.
  • the target editing guide RNA of this embodiment can induce ADAR1 preferentially editing activity in cells.
  • ADAR1 priority means, for example, that the ratio of the edit-inducing activity to ADAR1 to the edit-inducing activity to ADAR2 exceeds 1 in vitro, and is preferably 1.5 or more, 2 or more, or 5 or more. Means.
  • the intracellular edit-inducing activity for ADAR1 and ADAR2 is obtained when the ADAR1 expression plasmid and the ADAR2 expression plasmid constructed using the same expression vector are used and transfected into the cells under the same conditions for expression. , The case where ADAR1 has a higher editing induction efficiency for the same target editing site.
  • the first oligonucleotide contained in the target editing guide RNA identifies the target RNA.
  • the target RNA is not particularly limited as long as it contains an adenosine residue to be edited, and may be either cellular RNA or viral RNA, and usually contains a pre-mRNA that encodes a protein. ) Or mRNA.
  • the editing site in the target RNA may be in an untranslated region, a splice region, an exon, an intron, or any region that affects the stability, structure, or function of the RNA.
  • the target RNA may also contain mutations to be modified or altered. Alternatively, the target RNA may have its sequence mutated to encode a phenotype different from the native form.
  • the target RNA is preferably RNA encoding a protein.
  • Specific examples of the encoded protein include serotonin receptors, glutamate receptors, membrane potential-dependent potassium channels, phosphorylated proteins involved in signal transduction such as STAT3, NFkBIA, and MAPK14.
  • Target editing guide RNA can be applied, for example, to the treatment of hereditary diseases.
  • the hereditary disease may be, for example, a disease that can be treated by converting an adenosine residue in the target RNA into an inosine residue.
  • the hereditary disease may also be, for example, a hereditary disease caused by a mutation in a gene from a guanosine residue to an adenosine residue.
  • Hereditary disorders include, for example, cystic fibrosis, leukoderma, ⁇ -1 antitrypsin deficiency, Alzheimer's disease, muscular atrophic lateral sclerosis, asthma, ⁇ -salasemia, CADASIL syndrome, Charcoal Marie Tooth.
  • hereditary diseases include type I citrullinemia (ASS1), type II citrullinemia (SLC25A13), hemophilia (Factor V Leiden), primary hypercystinuria (AGXT), and distal type.
  • Myopathy Cystic fibrosis: cyclic fibrosis (CFCFTR), Homocystinuria (CBS), Huller syndrome: Mucopolysaccharidosis (IDUA (SLC26A1)), Alexander's disease (GFAP), Retinal pigment degeneration (EYS), Phenylketonuria (PAH), hemochromatosis (HFE), Gilbert syndrome (UGT1A1) and the like can be mentioned.
  • the name in parentheses is the target gene name.
  • the target editing guide RNA applied for the treatment of hereditary diseases may include, for example, any base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 49 to 55 and SEQ ID NOs: 60 to 63, preferably SEQ ID NO: It may contain any base sequence selected from the group consisting of 51, 54, 61, 62 and 63.
  • the target editing guide RNA may contain a base sequence in which U is replaced with T in the base sequence specified by the SEQ ID NO:.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide may be completely complementary to a contiguous 20-40 base region containing the 1500th to 1540th positions of the ASS1 mRNA in which the nucleotide sequence except the non-complementary nucleotide residue and N3 is contained. , Preferably, may be completely complementary to the contiguous 20 to 29 base regions contained in the 1504 to 1534 positions, and more preferably to the contiguous 20 to 25 base regions contained in the 1510 to 1534 positions. ..
  • the 1601G> A mutation is a mutation of the 1696th nucleotide of Homo sapiens coagulation factor V (F5), mRNA (GenBank Accession No: NM_000130.5) from G to A.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to a contiguous 20-40 base region containing non-complementary nucleotide residues and nucleotide sequences other than N3 at positions 1672 to 1712 of the F5 mRNA.
  • it is completely complementary to the contiguous 20 to 29 base regions contained in the 1676th to 1706th regions and more preferably to the contiguous 20 to 25 bases regions contained in the 1682th to 1706th positions. good.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to a contiguous 20-40 base region containing the non-complementary nucleotide residue and the nucleotide sequence excluding N3 at positions 2111 to 2151 of the GRIA2 mRNA.
  • it is completely complementary to the contiguous 20 to 29 base regions contained in the 2115 to 2145 positions, and more preferably to the contiguous 20 to 25 base regions contained in the 2121 to 2145 positions. good.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to a contiguous 20-40 base region containing the non-complementary nucleotide residue and the nucleotide sequence excluding N3 at positions 1704 to 1744 of the PANK2 mRNA.
  • it is completely complementary to the contiguous 20-29 base region contained in the 1708th to 1738th positions, and more preferably the continuous 20-25 base region contained in the 1714th to 1738th positions. good.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to a contiguous 20-40 base region containing the non-complementary nucleotide residue and the nucleotide sequence excluding N3 at positions 1551 to 1591 of the CBS mRNA.
  • it is completely complementary to the contiguous 20 to 29 base regions contained in the 1555 to 1585 positions, and more preferably to the contiguous 20 to 25 base regions contained in the 1651 to 1585 positions. good.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to a contiguous 20-40 base region containing non-complementary nucleotide residues and nucleotide sequences other than N3 at positions 473 to 513 of the NPHS2 mRNA.
  • it is completely complementary to the contiguous 20-29 base regions contained in the 477th to 507th regions and more preferably the contiguous 20-25 base regions contained in the 483rd to 507th positions. good.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to the contiguous 20-40 base region contained in positions 1119 to 1159 of the SERPINA1 mRNA in which the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide residue and N3 is contained.
  • it is completely complementary to the contiguous 20-29 base region contained in the 1123th to 1153rd and more preferably the continuous 20-25 base region contained in the 1129th to 1153rd. good.
  • the 782G> A mutation is the 896th nucleotide of Homo sapiens phenylalanine hydroxyloxylase (PAH), transcription variant 1, mRNA (GenBank Accession No: NM_000277.3) mutation from G to NM_000277.3.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to a contiguous 20-40 base region containing the non-complementary nucleotide residue and the nucleotide sequence excluding N3 at positions 872 to 912 of the PAH mRNA.
  • it is completely complementary to the contiguous 20-29 base region contained in the 876th to 906th regions, and more preferably in the contiguous 20-25 base regions contained in the 882th to 906th positions. good.
  • the 940 + 1G> A mutation is from Homo sapiens solution carrier organic anion transporter family member 2A1 (SLCO2A1), mRNA (GenBank Accession A1), mRNA (GenBank Accession A1), mRNA (GenBank Accession A1), mRNA (GenBank Accession A1), mRNA (GenBank Accession A1), mRNA (GenBank Accession No. (The editing target is located on the (-) chain at position 133948892 on chromosome 3).
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to the contiguous 20-40 base region in which the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide residue and N3 is contained in positions 81010 to 81050 of the SLCO2A1 pre-mRNA. It may be, preferably, completely complementary to the contiguous 20-29 base regions contained in positions 81014 to 81444, and more preferably the contiguous 20-25 base regions contained in positions 81020 to 81444. It may be there.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to a contiguous 20-40 base region containing the non-complementary nucleotide residues and the nucleotide sequence excluding N3 at positions 2144 to 2184 of the GFAP mRNA.
  • it is completely complementary to the contiguous 20-29 base region contained in the 2148th to 2178th positions, and more preferably in the continuous 20-25 base region contained in the 2154th to 2178th positions. good.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to a contiguous 20-40 base region containing the non-complementary nucleotide residue and the nucleotide sequence excluding N3 at positions 526 to 566 of the AGXT mRNA.
  • it is completely complementary to the contiguous 20 to 29 base regions contained in the 530th to 560th positions, and more preferably to the contiguous 20 to 25 base regions contained in the 536th to 560th positions. good.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to a contiguous 20-40 base region in which the nucleotide sequence excluding the non-complementary nucleotide residue and N3 is contained in positions 205 to 245 of the UGT1A1 mRNA.
  • it is completely complementary to the contiguous 20-29 base region contained in the 209th to 239th positions, and more preferably the continuous 20-25 base region contained in the 215th to 239th positions. good.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to a contiguous 20-40 base region containing the non-complementary nucleotide residue and the nucleotide sequence excluding N3 at positions 8454 to 8494 of the EYS mRNA.
  • it is completely complementary to the contiguous 20 to 29 base regions contained in the 8458th to 8488th positions, and more preferably to the contiguous 20 to 25 bases regions contained in the 8464th to 8488th positions. good.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to a contiguous 20-40 base region containing non-complementary nucleotide residues and nucleotide sequences other than N3 at positions 900 to 940 of the GNE mRNA.
  • it is completely complementary to the contiguous 20-29 base regions contained in positions 904 to 934, and more preferably the contiguous 20-25 base regions contained in positions 910 to 934. good.
  • the oligonucleotide targets the adenosine residue.
  • the oligonucleotide is completely complementary to a contiguous 20-40 base region containing the non-complementary nucleotide residue and the nucleotide sequence excluding N3 at positions 981 to 1021 of the HFE mRNA.
  • it is completely complementary to the contiguous 20 to 29 base regions contained in the 985th to 1015th regions, and more preferably to the contiguous 20 to 25 base regions contained in the 991th to 1015th positions. good.
  • the first oligonucleotide is linked to the target-corresponding nucleotide residue corresponding to the adenosine residue to be edited in the target RNA and the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue, and is associated with the corresponding base sequence of the target RNA. It is linked to the 3'side oligonucleotide of 10 to 24 residues having a complementary base sequence and the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue, and has a base sequence complementary to the corresponding base sequence of the target RNA. It consists of 3 to 6 residues of 5'side oligonucleotides.
  • Oligonucleotides linked to the 3'side and 5'side of the target-corresponding nucleotide residue form a double-stranded structure with the target RNA to form a complementary strand (hereinafter, also referred to as the first complementary strand) as a whole.
  • This identifies the target RNA and the edit target site in the target RNA.
  • the complementary base sequence in the present specification includes, for example, a thermodynamically stable non-Watson-click type base pair such as GU base pair. It contains a base sequence that forms a wobble base pair.
  • the base pairs forming the first complementary strand may be all Watson-click type base pairs except for the target-corresponding nucleotide residue, or at least a part of them may be fluctuating base pairs. If the first complementary strand contains wobble base pairs, the number may be 1 or 2.
  • the region consisting of the target-corresponding nucleotide residue, one residue on the 5'side, and one residue on the 3'side is referred to as a counter region for convenience, and the region other than the counter region of the first oligonucleotide is referred to. Sometimes referred to as a non-counter area.
  • the 3'side oligonucleotide of 10 to 24 residues linked to the 3'side of the targeting nucleotide residue in the first oligonucleotide is the first nucleotide residue on the 3'side of the targeting nucleotide residue.
  • a chain structure may be formed.
  • the first nucleotide residue on the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue is 2'. - May be a deoxyinosine residue.
  • the target-corresponding nucleotide residue is a nucleotide residue corresponding to the adenosine residue to be edited, and is, for example, a cytidine residue, a guanosine residue, an adenosine residue, or a derivative thereof.
  • the target-corresponding nucleotide residue is preferably a base that does not form a base pair with the adenosine residue to be edited, more preferably a cytidine residue or a derivative thereof, and further preferably a cytidine residue.
  • the targeting nucleotide residue may be an N-alkylpyrimidine nucleotide residue, preferably an N-alkylcytidine residue, an N-alkyl-2'-deoxycytidine residue, an N-alkyluridine residue. Alternatively, it may be an N-alkyldeoxyuridine residue.
  • the alkyl group in the N-alkylpyrimidine nucleotide residue may be an alkyl group having 1 to 6 or 1 to 4 carbon atoms, preferably a methyl group or an ethyl group.
  • N-alkylpyrimidine nucleotide residue may be further modified with at least one of a sugar moiety and a phosphate ester binding moiety. Modification of the sugar moiety and the phosphate ester binding moiety will be described later.
  • the targeting nucleotide residue may be a 2'-deoxycytidine residue.
  • the 2'-deoxycytidine residue may be further modified with the phosphate ester binding moiety.
  • the number of residues of the oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue and having a base sequence complementary to the target RNA may be 10 or more and 24 or less, preferably 11 or more. , 12 or more or 13 or more, and preferably 22 or less, 20 or less, 18 or less, 16 or less or 15 or less.
  • the number of residues of the oligonucleotide having a base sequence complementary to the target RNA may be 12 or more and 20 or less, 12 or more and 18 or less, 12 or more and 16 or less, 14 or more and 18 or less, or 14 or more and 16 or less.
  • the number of residues of the oligonucleotide having a base sequence complementary to the target RNA may be 14. When the number of residues is in the above range, the selectivity for ADAR1 tends to be further improved.
  • the 3'side oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue may have a complementary base sequence containing no mismatched base pair with respect to the target RNA.
  • the target RNA does not have a guanosine residue linked to the 5'side of the adenosine residue to be edited. That is, when the base linked to the 5'side of the adenosine residue that is the editing target of the target RNA is an adenosine residue, a cytidine residue, or a uridine residue, the target-corresponding nucleotide residue 3 in the first oligonucleotide.
  • the oligonucleotide linked to the'side has a complementary base sequence that does not contain mismatched base pairs with respect to the target RNA.
  • the 3'side oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue may contain a base that is non-complementary to the base sequence of the target RNA, as the case may be.
  • the editing-inducing activity may decrease. Even in that case, the edit-inducing activity can be improved by having the first oligonucleotide having a base sequence containing a base non-complementary to the guanosine residue.
  • the base non-complementary to the guanosine residue may be, for example, a guanosine residue. That is, in the target editing guide RNA for which the guanosine residue is linked to the 5'side of the adenosine residue to be edited, the guanosine residue may be linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • the 3'side oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue may optionally form a non-Watson click-type wobble base pair with the nucleotide residue of the corresponding target RNA.
  • the 3'side oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue may optionally be a 2'-deoxynucleotide residue. This may improve the edit target activity.
  • the first oligonucleotide when a citidine residue is linked to the 5'side of the adenosine residue that is the edit target in the target RNA, the first oligonucleotide has a hypoxanthine residue as a base on the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • Nucleotide residues may be linked. That is, a cytidine residue linked to the 5'side of the adenosine residue that is the editing target and a nucleotide residue having a hypoxanthine residue as the base of the first oligonucleotide may form a wobble base pair.
  • the nucleotide residue having a hypoxanthine residue as a base may be an inosine residue or a 2'-deoxyinosin residue, preferably a 2'-deoxyinosin residue. Further, the nucleotide residue having a hypoxanthine residue as a base may be further modified with at least one of a sugar moiety and a phosphate ester binding moiety. Modification of the sugar moiety and the phosphate ester binding moiety will be described later.
  • the first oligonucleotide is a nucleotide residue having an adenyl group as a base on the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • the groups may be linked. That is, a uridine residue linked to the 5'side of the adenosine residue that is the editing target and a nucleotide residue having an adenyl group as the base of the first oligonucleotide may form a base pair.
  • the nucleotide residue having an adenyl group as a base may be an adenosine residue or a 2'-deoxyadenosine residue, preferably a 2'-deoxyadenosine residue. Further, the nucleotide residue having an adenyl group as a base may be further modified at least one of a sugar moiety and a phosphate ester binding moiety. Modification of the sugar moiety and the phosphate ester binding moiety will be described later.
  • the first oligonucleotide is a nucleotide residue having a pyrimidinyl group as a base on the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • the groups may be linked. That is, the adenosine residue linked to the 5'side of the adenosine residue which is the editing target and the nucleotide residue having a pyrimidinyl group as the base of the first oligonucleotide may form a base pair.
  • the nucleotide residue having a pyrimidyl group as a base may be a thymidine residue or a 2'-deoxyuridine residue. Further, the nucleotide residue having a pyrimidinyl group as a base may be further modified at least one of a sugar moiety and a phosphate ester binding moiety. Modification of the sugar moiety and the phosphate ester binding moiety will be described later.
  • the first oligonucleotide is linked to the hypoxanthine residue as a base on the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue. You can do it.
  • the hypoxanthine residue may be a 2'-deoxyinosine residue.
  • the hypoxane residue may be further modified with at least one of a sugar moiety and a phosphate ester binding moiety. Modification of the sugar moiety and the phosphate ester binding moiety will be described later.
  • the first oligonucleotide may have at least one crosslinked nucleotide residue in the 10th or later, preferably 11th or later nucleotide residue counting in the 3'direction from the target-corresponding nucleotide residue.
  • the crosslinked nucleotide residue may be crosslinked between the 2'position and the 4'position of D-ribofuranose. Specific examples of crosslinked nucleotide residues will be described later.
  • Cross-linked nucleotide residues include at least one of a 2'-O, 4'-C-methylene crosslinked nucleotide (LNA) and a 2'-O, 4'-C-ethylene crosslinked nucleotide (ENA). You can stay.
  • at least one of the base moiety and the phosphate ester binding moiety may be further modified. Modification of the base moiety and the phosphate ester bond moiety will be described later.
  • the oligonucleotide consisting of the 10th or later, preferably the 11th or later nucleotide residue counting in the 3'direction from the target-corresponding nucleotide is a 2'-O-alkylribonucleotide residue and a crosslinked nucleotide residue. It may have a base sequence in which groups are alternately linked. The number of repetitions of the connection between the 2'-O-alkylribonucleotide residue and the crosslinked nucleotide residue may be, for example, 1 or more and 3 or less, preferably 2.
  • the base sequence in which the 2'-O-alkylribonucleotide residue and the crosslinked nucleotide residue are alternately linked may be alternately linked in the 3'direction from the 2'-O-alkylribonucleotide residue.
  • the cross-linked nucleotide residues may be alternately linked in the 3'direction. Specific examples of the 2'-O-alkylribonucleotide residue and the crosslinked nucleotide residue will be described later.
  • at least one of the base moiety and the phosphate ester binding moiety may be further modified. Modification of the base moiety and the phosphate ester bond moiety will be described later.
  • the number of residues of the 5'side oligonucleotide linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue and having a base sequence complementary to the target RNA may be 3 or more and 6 or less, and is preferable. Is 3 or more and 5 or less, 3 or more and 4 or less, or 3. When the number of residues is in the above range, the selectivity for ADAR1 tends to be further improved.
  • the second oligonucleotide forms a double-stranded structure (hereinafter, also referred to as a second complementary strand) containing one or more nucleotide residues that do not form complementary base pairs as a target RNA.
  • the number of residues of the second oligonucleotide may be 2 or more and 10 or less or 4 or more and 8 or less.
  • the number of residues of the second oligonucleotide is, for example, 3 or more, preferably 4 or more or 5 or more, and for example, 10 or less, preferably 9 or less, 8 or less, or 7 or less.
  • the number of residues of the second oligonucleotide may be 6. When the number of residues is within the above range, the editing induction tends to be further enhanced.
  • the number of nucleotide residues that do not form complementary base pairs in the second complementary strand is, for example, 3 or less or 2 or less, preferably 1.
  • a nucleotide residue that does not form a complementary base pair in the second complementary strand is a base pair due to the deletion of the nucleotide residue corresponding to the other nucleotide residue in one of the target RNA or the second oligonucleotide. It may be a nucleotide residue that does not exist. Further, the nucleotide residue that does not form a complementary base pair in the second complementary strand is a mismatched base pair in which the base pair consisting of the corresponding nucleotide residues in the target RNA and the second oligonucleotide has a nucleobase that is non-complementary to each other.
  • non-complementary base pair it may be a nucleotide residue present in both the target RNA and the second oligonucleotide.
  • the non-complementary base pairing nucleotide residue may be a non-base pairing nucleotide residue present in either the target RNA or the second oligonucleotide, preferably present in the target RNA. It may be a nucleotide residue that does not form a base pair. This tends to further enhance editing guidance.
  • the mismatched base pair means that the nucleobases of the corresponding two nucleotide residues in the target RNA and the second oligonucleotide are a combination that does not form a stable base pair.
  • the position of the nucleotide residue that does not form a complementary base pair in the second complementary strand is on the target RNA, and the position of the first residue to the third residue on the 3'side from the binding position between the first complementary strand and the second complementary strand is 3 remaining. It is preferably one of the bases, and more preferably the first residue. Further, the position of the nucleotide residue that does not form a complementary base pair in the second complementary strand is on the second oligonucleotide, and one residue on the 5'side from the binding position between the first complementary strand and the second complementary strand. It is preferably one of the third residues from the eye, and more preferably the first residue.
  • the nucleotide residue that does not form a complementary base pair in the second complementary strand is the nucleotide residue corresponding to the nucleotide residue of the first residue on the 3'side from the binding position of the first complementary strand and the second complementary strand in the target RNA.
  • the group may be derived from a deletion from the second oligonucleotide.
  • the nucleotide residues that do not form complementary base pairs in the second complementary strand are the nucleotide residue of the first residue on the 3'side from the binding position of the first complementary strand and the second complementary strand in the target RNA, and the first nucleotide residue. It may be derived from a mismatched base pair formed from the nucleotide residue at the 3'end of the dioligonucleotide.
  • the second oligonucleotide if the nucleotide residue corresponding to the nucleotide residue of the target RNA is deleted, the second oligonucleotide is complementary to the target RNA except for the portion where the nucleotide residue is deleted. It may have a different base sequence. Also, if the second oligonucleotide has a nucleotide residue that does not form a complementary pair with the nucleotide residue corresponding to the nucleotide residue of the target RNA, the second oligonucleotide has a nucleotide residue that does not form a complementary pair. It may have a base sequence complementary to the target RNA.
  • the second oligonucleotide has at least one of the crosslinked nucleotide residues in the second and subsequent nucleotide residues, preferably the third and subsequent nucleotide residues counting in the 5'direction from the 3'-terminal nucleotide residue. good.
  • the crosslinked nucleotide residue may be crosslinked between the 2'position and the 4'position of D-ribofuranose. Specific examples of crosslinked nucleotide residues will be described later.
  • Cross-linked nucleotide residues include at least one of a 2'-O, 4'-C-methylene crosslinked nucleotide (LNA) and a 2'-O, 4'-C-ethylene crosslinked nucleotide (ENA). You can stay.
  • at least one of the base moiety and the phosphate ester binding moiety may be further modified. Modification of the base moiety and the phosphate ester bond moiety will be described later.
  • the second oligonucleotide is a 2'-O-alkylribonucleotide residue in which an oligonucleotide consisting of the second and subsequent nucleotide residues, preferably the third and subsequent nucleotide residues, counting in the 5'direction from the 3'-terminal nucleotide residue is used. It may have a base sequence in which and a crosslinked nucleotide residue are alternately linked. The number of repetitions of the connection between the 2'-O-alkylribonucleotide residue and the crosslinked nucleotide residue may be, for example, 1 or more and 3 or less, preferably 2.
  • the base sequence in which the 2'-O-alkylribonucleotide residue and the crosslinked nucleotide residue are alternately linked may be alternately linked in the 5'direction from the 2'-O-alkylribonucleotide residue.
  • the cross-linked nucleotide residues may be alternately linked in the 5'direction. Specific examples of the 2'-O-alkylribonucleotide residue and the crosslinked nucleotide residue will be described later.
  • at least one of the base moiety and the phosphate ester binding moiety may be further modified. Modification of the base moiety and the phosphate ester bond moiety will be described later.
  • the first oligonucleotide forming the first complementary strand with the target RNA has a citidine residue as a target-corresponding nucleotide residue and a base sequence complementary to the base sequence of the target RNA. It has a 3'-side oligonucleotide having 12 to 18 or 14 to 16 residues linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue, and a base sequence complementary to the base sequence of the target RNA, and is targeted-corresponding.
  • It contains a 5'side oligonucleotide having 3 residues linked to the 5'side of a nucleotide residue, and the second oligonucleotide is 3'side from the binding position of the first complementary strand and the second complementary strand in the target RNA.
  • the nucleotide residue corresponding to the first residue of the above is deleted, and the second and subsequent residues have a complementary base sequence and contain an oligonucleotide having 4 to 8 residues.
  • the nucleotide constituting the target editing guide RNA may be selected from any of a natural ribonucleotide (RNA), a natural deoxyribonucleotide (DNA), an RNA / DNA chimera, and a modified nucleotide which is a modified product thereof.
  • the nucleotides that make up the target editing guide RNA can be linked to each other by a phosphate diester bond that binds to the hydroxyl group of the sugar moiety of the nucleoside.
  • the phosphoric acid diester bond can be formed by utilizing the 2'-position hydroxyl group, the 3'-position hydroxyl group, or the 5'-position hydroxyl group of the sugar moiety.
  • the nucleotides that make up the target edit guide RNA can form the native 3'-5'phosphodiester bond.
  • At least one of the nucleotides constituting the target editing guide RNA may be a modified nucleotide.
  • the modified nucleotide include those modified with a sugar moiety, those modified with a phosphate diester bond, those modified with a base, and combinations thereof.
  • Modifications of the sugar moiety include, for example, 2'-O-alkylated ribonucleotides of D-ribofuranose (eg, 2'-O-methylation, 2'-O-aminoethylation, 2'-O-propylation).
  • Modifications of the phosphate diester bond moiety include phosphorothioate bonds (including optically active substances derived from asymmetric phosphorus atoms), methylphosphonate bonds, methylthiophosphonate bonds, phosphorodithioate bonds, phosphoroamidate bonds and the like. be able to.
  • Modification of the base portion includes halogenation; from 1 carbon number such as methylation, ethylation, propylation, isopropylization, cyclopropylation, butylation, isobutylation, s-butylation, t-butylation, cyclobutylation, etc. Alkylation of 6 or 1 to 4; hydroxylation; amination; deaminolation; demethylation and the like. Specifically, 5-methylation, 5-fluorolation, 5-bromoization, 5-iodolation, N4-methylation, etc. of cytosine; 5-demethylation (uracil), 5-fluorolation, 5-fluorolysis of thymine, etc. Bromylation, 5-iodolation, etc .; N6-methylation, 8-bromolation, etc. of adenine; N2-methylation, 8-bromolation, etc. of guanine;
  • At least one residue, at least two residues, or all three residues selected from the counter region may be nucleotide residues other than the native ribonucleotide (RNA) residue, preferably. , At least 1 residue, at least 2 residues, or all 3 residues are modified nucleotide residues.
  • the modified nucleotide residue in the counter region may be modified at least one of a sugar moiety and a phosphate diester bond, at least the sugar moiety may be modified, at least the phosphate diester bond may be modified, or a sugar. Substituents and phosphodiester bonds may be modified.
  • the targeting nucleotide residue may be a cytidine residue having a phosphorothioate bond.
  • each 1 residue on the 5'side or 3'side of the target-corresponding nucleotide residue may be modified with at least one of a sugar moiety and a phosphate diester bond, and at least the sugar moiety may be modified.
  • At least the phosphate diester bond may be modified, or the sugar moiety and the phosphate diester bond may be modified.
  • Modification of the sugar moiety in the counter region may be, for example, 2'-O-alkylation, 2'-deoxy-2'-fluorolation, 2'-deoxylation or the like.
  • oligonucleotide residues are modified with at least one of the sugar moiety and the phosphodiester bond. It may be, at least the sugar moiety may be modified, at least the phosphate diester bond may be modified, or the sugar moiety and the phosphodiester bond may be modified. Modification of the sugar moiety in the non-counter region is, for example, 2'-O-alkylation, 2'-deoxy-2'-fluorolation, cross-linking between the 2'and 4'positions, 2'-deoxylation (DNA). It may be such as.
  • the plurality of modified nucleotide residues may be arranged consecutively or may be separated from each other. Further, the first oligonucleotide may be composed of all nucleotide residues linked by a phosphorothioate bond.
  • the 3'side oligonucleotide linked to the 3'side of the target-corresponding nucleotide residue of the first oligonucleotide is a 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residue, a 2'-O-alkylribonucleotide residue and a crosslinked type. It may have a base sequence in which two kinds of modified nucleotide residues selected from the group consisting of nucleotide residues are alternately linked.
  • the 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residue and the 2'-O-alkylribonucleotide residue are alternately linked. It may have a base sequence, and may have a base sequence in which crosslinked nucleotide residues and 2'-O-alkylribonucleotide residues are alternately linked, and may have a base sequence of 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide. It may have a base sequence in which residues and cross-linked nucleotide residues are alternately linked.
  • the target oligonucleotide is (here, the 3'side oligonucleotide of the first oligonucleotide is applicable), 2
  • the modified nucleotide residues of the species have a base sequence partially alternately linked, or the entire target oligonucleotide has a base sequence in which two modified nucleotide residues are alternately linked. It means both of them, and is used in the same meaning in the following description of the present specification.
  • the 3'-side oligonucleotide in the first oligonucleotide may be composed of some nucleotide residues linked by a phosphorothioate bond, or may be composed of all nucleotide residues linked by a phosphorothioate bond. ..
  • the third nucleotide residue counted in the 3'direction from the target-corresponding nucleotide residue is the 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residue, 2'-O.
  • -It may be a modified nucleotide residue selected from the group consisting of an alkylribonucleotide residue and a crosslinked nucleotide residue.
  • the third nucleotide residue counting in the 3'direction from the target-corresponding nucleotide residue is the 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residue, 2'-O-alkylribonucleotide.
  • the third nucleotide residue counted in the 3'direction from the target-corresponding nucleotide residue is a nucleotide residue that does not include the target-corresponding nucleotide residue itself and is adjacent to the target-corresponding oligonucleotide residue in the 3'direction.
  • the first is the third nucleotide residue counting in the 3'direction.
  • the 5'side oligonucleotide linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue of the first oligonucleotide may have a base sequence in which 2'-O-alkylribonucleotide residues are continuous.
  • the base sequence in which the 2'-O-alkylribonucleotide residues are contiguous may be adjacent to the target-corresponding nucleotide residue.
  • the number of residues in the base sequence in which 2'-O-alkylribonucleotide residues are continuous may be, for example, 2 or 3.
  • the 5'side oligonucleotide has a base sequence in which a 2'-O-alkylribonucleotide residue is linked to a 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residue or a crosslinked nucleotide residue. May be good.
  • the 5'side oligonucleotide in the first oligonucleotide may be composed of some nucleotide residues linked by a phosphorothioate bond, or may be composed of all nucleotide residues linked by a phosphorothioate bond. ..
  • the second oligonucleotide may have at least one residue, at least three residues, or all residues modified at least one of the sugar moiety and the phosphodiester bond, and at least the sugar moiety may be modified.
  • At least the phosphate diester bond may be modified, or the sugar moiety and the phosphodiester bond may be modified.
  • Modification of the sugar moiety in the second oligonucleotide is, for example, 2'-O-alkylation, 2'-deoxy-2'-fluorolation, cross-linking between the 2'and 4'positions, 2'-deoxylation (2'-deoxylation ( It may be DNA conversion) or the like.
  • the second oligonucleotide has a plurality of modified nucleotide residues, the plurality of modified nucleotide residues may be arranged consecutively or may be separated from each other.
  • the second oligonucleotide may have a base sequence in which 2'-O-alkylribonucleotide residues are continuous.
  • the second oligonucleotide is a base in which two types selected from the group consisting of 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residues, 2'-O-alkylribonucleotide residues and cross-linked nucleotide residues are alternately linked. It may have a sequence, and may have a base sequence in which 2'-O-alkylribonucleotide residues and 2'-deoxy-2'-fluoronucleotide residues are alternately linked, and 2'-.
  • the second oligonucleotide may have a base sequence in which O-alkylribonucleotide residues and crosslinked nucleotide residues are alternately linked.
  • the second nucleotide residue counted in the 5'direction from the nucleotide residue at the 3'end of the second oligonucleotide is 2'-deoxy-2'-fluoro. It may be one selected from the group consisting of nucleotide residues, 2'-O-alkylribonucleotide residues and crosslinked nucleotide residues, and may be 2'-O-alkylribonucleotide residues.
  • the second nucleotide residue counted in the 5'direction from the 3'-terminal nucleotide residue of the second oligonucleotide does not include the 3'-terminal nucleotide residue itself, and is the 3'-terminal oligonucleotide residue.
  • the second nucleotide residue is shown by counting in the 5'direction, with the nucleotide residue adjacent to the 5'direction as the first.
  • the target editing guide RNA may contain a link containing an alkyleneoxy unit between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.
  • the connecting portion may contain an alkyleneoxy group having 1 to 8 carbon atoms, and may contain a polyalkyleneoxy group consisting of alkyleneoxy units having 1 to 8 carbon atoms.
  • the linking portion may have a phosphate diester bond or a modified phosphate diester bond on the 5'side of the first oligonucleotide and the 3'side of the second oligonucleotide, respectively.
  • the linking portion has a phosphate diester bond or a modified phosphate diester bond with the hydroxyl group of the sugar moiety at the 5'end of the first oligonucleotide and the hydroxyl group of the sugar moiety at the 3'end of the second oligonucleotide, respectively. It's okay.
  • Target editing guide RNAs can exhibit excellent target editing activity even when the linkage contains alkyleneoxy units.
  • the carbon number of the alkyleneoxy unit constituting the polyalkyleneoxy group may be, for example, 2 to 4, 2 to 3, or 2. That is, the alkyleneoxy unit may be an ethyleneoxy unit, a propyleneoxy unit, or a butyleneoxy unit, or may be an ethyleneoxy unit.
  • the number of alkyleneoxy units constituting the polyalkyleneoxy group may be, for example, 2 to 10, 2 to 8, 2 to 7, or 3 to 6.
  • Each alkyleneoxy unit constituting the polyalkyleneoxy group may be the same or different.
  • the carbon number of the alkyleneoxy group may be, for example, 2 to 8, 2 to 7, or 3 to 6.
  • the target editing guide RNA includes a first oligonucleotide that identifies the target RNA, a second oligonucleotide linked to the 5'side of the first oligonucleotide, and the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.
  • the first oligonucleotide comprises a target-corresponding nucleotide residue corresponding to an adenosine residue in the target RNA and a 3'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • a 10 to 24 residue oligonucleotide having a base sequence complementary to the target RNA and a base sequence complementary to the target RNA linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • It consists of 3 to 6 residue oligonucleotides, the second oligonucleotide having 2 to 10 residues, and the nucleotide residue corresponding to the nucleotide residue of the target RNA is deleted at the 3'end. Or have a nucleotide residue that does not form a complementary pair with the nucleotide residue of the target RNA, and at least the nucleotide residues other than the 3'end form a double-stranded structure complementary to the target RNA. Or, it has a base sequence complementary to the target RNA to form a double-stranded structure complementary to the target RNA, and the target-corresponding nucleotide residue and 1 on the 3'side and 1 on the 5'side thereof.
  • At least one residue selected from the counter region consisting of residues is a nucleotide residue other than the native ribonucleotide residue, which is an oligonucleotide that induces site-specific editing for the target RNA, or is pharmaceutically acceptable thereof. It may be the salt to be added.
  • the first oligonucleotide and the second oligonucleotide constituting the target editing guide RNA including the linking portion may be composed of the above-mentioned modified nucleotide residues.
  • the target editing guide RNA includes a first oligonucleotide that identifies the target RNA, a second oligonucleotide linked to the 5'side of the first oligonucleotide, and the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.
  • the first oligonucleotide comprises a target-corresponding nucleotide residue corresponding to an adenosine residue in the target RNA and a 3'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • a 10 to 24 residue oligonucleotide having a base sequence complementary to the target RNA and a base sequence complementary to the target RNA linked to the 5'side of the target-corresponding nucleotide residue.
  • the second oligonucleotide consists of 3 to 6 residue oligonucleotides, the second oligonucleotide has 2 to 10 residues, has a base sequence complementary to the target RNA, and is complementary to the target RNA. At least one residue that forms a chain structure and is selected from the counter region consisting of the target-corresponding nucleotide residue and one residue each on the 3'side and the 5'side thereof is a nucleotide other than the natural ribonucleotide residue. It may be a residue, an oligonucleotide that induces site-specific editing of the target RNA, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the first oligonucleotide and the second oligonucleotide constituting the target editing guide RNA including the linking portion may be composed of the above-mentioned modified nucleotide residues.
  • the target editing guide RNAs are described below (AD1_ASS1.39), (AD1_PANK2.39), (AD1_NPHS2.39), (AD1_GRIA2.39), (AD1_ASS1.52), (AD1_GRIA2.39e), (. Group consisting of AD1_ASS1.39e), (AD1_PANK2.39e), (AD1_NPHS2.39e), (AD1_GRIA2.52e), (AD1_ASS1.52e), (AD1_PANK2.52e), (AD1_NPHS2.52e) and (AD1_A1AT.39). It may be an oligonucleotide represented by any of the selected formulas or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • AD1_PANK2.52e A (M) ⁇ G (E) ⁇ A (M) ⁇ A (E) ⁇ A (F) ⁇ U (F) ⁇ U (M) ⁇ C (M) ⁇ c ⁇ a ⁇ A (M) ⁇ C (F) ⁇ A (M) ⁇ A (F) ⁇ A (M) ⁇ U (F) ⁇ A (M) ⁇ C (F) ⁇ C (E) ⁇ A (M) ⁇ C (E) ⁇ C (M)
  • RNA ribonucleotide residues
  • DNA 2'-deoxyribonucleotide residues
  • N (M) indicates a 2'-O-methylated ribonucleotide residue of D-ribofuranose.
  • N (F) indicates the 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide residue of D-ribofuranose.
  • N (L) indicates a 2'-O, 4'-C-methylene crosslinked ribonucleotide residue of D-ribofuranose.
  • N (E) indicates the 2'-O, 4'-C-ethylene crosslinked ribonucleotide residue of D-ribofuranose.
  • the target editing guide RNA can be referred to a known document (for example, Nuclear Acids Research, 12, 4539 (1984)) using a commercially available synthesizer (for example, a model 392 by the phosphoramidite method manufactured by PerkinElmer). It can be synthesized according to the method described.
  • a commercially available synthesizer for example, a model 392 by the phosphoramidite method manufactured by PerkinElmer. It can be synthesized according to the method described.
  • a commercially available reagent may be used, or a reagent appropriately synthesized according to a method described in a known document may be used.
  • a phosphorothioate bond can be introduced by reacting with a reagent such as sulfur, tetraethylthiuram disulfide (TETD, Applied Biosystems), BEAUCAGE reagent (Glen Research), xanthanhydride.
  • a reagent such as sulfur, tetraethylthiuram disulfide (TETD, Applied Biosystems), BEAUCAGE reagent (Glen Research), xanthanhydride.
  • Oligonucleotides may be used in the form of pharmaceutically acceptable salts.
  • a “pharmaceutically acceptable salt” is a salt of an oligonucleotide.
  • Such salts include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt, lithium salt, calcium salt, alkaline earth metal salt such as magnesium salt, aluminum salt, iron salt, zinc salt, copper salt, nickel salt.
  • inorganic salts such as ammonium salt, t-octylamine salt, dibenzylamine salt, morpholine salt, glucosamine salt, phenylglycine alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, guanidine Salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocine salt, prokine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt, tris (hydroxyl) Aminates such as organic salts such as methyl) aminomethane salts; hydrohydrogenates such as hydrofluoride salts, hydrochlorides, hydrobromide salts, hydroiodide salts, nitrates, perchlorates , Sulfates, inorganic salts such as ammonium salt, t
  • Organic acid salts such as aryl sulfonates, acetates, apple salts, fumarates, succinates, citrates, tartrates, oxalates, maleates; glycine salts, lysine salts, arginine salts, ornithine salts. , Glutamate, amino acid salts such as asparagate and the like.
  • the pharmaceutically acceptable salt form of the oligonucleotide is preferably an alkali metal salt of the oligonucleotide, more preferably a sodium salt. These salts can be produced by known methods.
  • oligonucleotide and the pharmaceutically acceptable salt thereof may also exist as a solvate (for example, a hydrate), and such a solvate may be used.
  • Oligonucleotides and pharmaceutically acceptable salts thereof may contain optically active substances derived from asymmetry of phosphorus atoms, and the oligonucleotides of the present invention also include such optically active substances.
  • optically active substances can be synthesized by known methods (eg, Org. Lett., 114,967 (2009), Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 8,2359 (1998), etc.).
  • Oligonucleotides and pharmaceutically acceptable salts thereof have delivery molecules such as GalNAc, cholesterol, and fatty acids attached at the 5'end or 3'end via linkers or phosphate diester bonds (including phosphorothioate bonds). May be. Examples of such delivery molecules and linkers include Bioconjugate Chem. The ones described in 2019, 30, 366 can be mentioned.
  • the oligonucleotide to which the delivery molecule is bound and the pharmaceutically acceptable salt thereof can be produced by a known production method.
  • the oligonucleotides and pharmaceutically acceptable salts thereof described herein also include the bound form of such a delivery molecule.
  • an oligonucleotide, a pharmaceutically acceptable salt or admixture thereof When used in the treatment of a disease, an oligonucleotide, a pharmaceutically acceptable salt or admixture thereof, is mixed with itself or an appropriate pharmaceutically acceptable excipient, diluent, etc., and tableted. , Capsules, granules, powders, syrups, etc., or parenterally, such as injections, suppositories, patches, or external preparations.
  • excipients eg, sugar derivatives such as lactose, sucrose, grape sugar, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, bailesho starch, alpha starch, dextrin; cellulose derivatives such as crystalline cellulose.
  • Disintegrants eg, cellulose derivatives such as low-substituted hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, internal cross-linked sodium carboxymethyl cellulose; chemically modified starches such as carboxymethyl starch, carboxymethyl starch sodium, cross-linked polyvinylpyrrolidone.
  • emulsifiers eg, colloidal clays such as bentonite, bee gum; metal hydroxides such as magnesium hydroxide, aluminum hydroxide; anionic surfactants such as sodium lauryl sulfate, calcium stearate; Cationic surfactants such as benzalkonium chloride; nonionic excipients such as polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, etc.), stabilizers (such as methylparaben, propylparaben).
  • colloidal clays such as bentonite, bee gum
  • metal hydroxides such as magnesium hydroxide, aluminum hydroxide
  • anionic surfactants such as sodium lauryl sulfate, calcium stearate
  • Cationic surfactants such as benzalkonium chloride
  • nonionic excipients such as polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sucrose fatty
  • Paraoxybenzoic acid esters include alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol, phenylethyl alcohol; benzalconium chloride; phenols such as phenol, cresol; It is produced by a well-known method using additives such as le; dehydroacetic acid; sorbic acid, etc.), flavoring agents (for example, commonly used sweeteners, acidulants, flavors, etc.), and diluents.
  • the therapeutic agent containing the oligonucleotide, a pharmaceutically acceptable salt thereof or a solvate thereof may contain an oligonucleotide of 0.1 to 250 ⁇ moles / ml, preferably 1 to 50 ⁇ moles / ml. Also, predetermined amounts of oligonucleotides, pharmaceutically acceptable salts or solvates thereof, 0.02 to 10% w / v carbohydrates or polyhydric alcohols, and 0.01 to 0.4% w / v.
  • a therapeutic agent may be composed of a pharmaceutically acceptable surfactant.
  • carbohydrate at least one of a monosaccharide and a disaccharide is particularly preferable.
  • these carbohydrates and polyhydric alcohols include glucose, galactose, mannose, lactose, maltose, mannitol and sorbitol. These may be used alone or in combination.
  • surfactant examples include polyoxyethylene sorbitan mono to tri-ester, alkylphenylpolyoxyethylene, sodium taurocholate, sodium collate, and polyhydric alcohol ester. Of these, particularly preferred are polyoxyethylene sorbitan mono to tri-esters, and here, particularly preferred esters are oleate, laurate, stearate and palmitate. These may be used alone or in combination.
  • Therapeutic agents containing oligonucleotides, pharmaceutically acceptable salts or solvates thereof are more preferably 0.03M to 0.09M pharmaceutically acceptable neutral salts such as sodium chloride, potassium chloride and the like. / Or may contain calcium chloride.
  • Therapeutic agents containing oligonucleotides, pharmaceutically acceptable salts or solvates thereof may more preferably contain 0.002 to 0.05 M pharmaceutically acceptable buffers.
  • preferred buffers include sodium citrate, sodium glycinate, sodium phosphate, tris (hydroxymethyl) aminomethane. These buffers may be used alone or in combination.
  • the above-mentioned therapeutic agent may be supplied in a solution state.
  • It may be reconstituted with distilled water for administration, that is, in a liquid state to be administered. Therefore, the therapeutic agent of the present invention also includes those in a lyophilized state for use after reconstitution with a solution so that each component has a predetermined concentration range.
  • Amino acids such as albumin and glycine may be further contained for the purpose of promoting the solubility of the freeze-dried product. It was
  • a pharmaceutically acceptable salt or admixture thereof is administered to humans, for example, about 0.01 mg / kg to 100 mg / kg (body weight), preferably 0.1 mg / kg / day for an adult.
  • Subcutaneous injection, intravenous drip infusion, or intravenous injection may be performed at a dose of kg to 20 mg / kg (body weight) in one or several divided doses. It can be changed as appropriate depending on the age, administration method, etc.
  • the disease treatment method includes a step of administering the above-mentioned therapeutic agent to a subject.
  • the method for treating a disease may include a step of administering a pharmacologically effective amount of the above-mentioned therapeutic agent to a subject.
  • treatment may be any treatment given to the disease, for example, treatment, improvement, suppression of progression (prevention of deterioration), prevention, etc. (preferably treatment or treatment) of the disease. Prevention).
  • the subject of treatment may be a warm-blooded animal including a human, a non-human warm-blooded animal, or a human.
  • the site-specific editing method of target RNA is to combine a target RNA and a target editing guide RNA, which is an oligonucleotide that induces site-specific editing on the target RNA, in the presence of adenosine deaminase. Including the step of contacting.
  • the target editing guide RNA partially double-strands with the target RNA and recruits adenosine deaminase, so that the adenosine residue contained in the target RNA can be site-specifically converted into an inosine residue.
  • the site-specific editing method of the target RNA may further include the step of preparing the target editing guide RNA.
  • the site-specific editing method of the target RNA can be performed, for example, by introducing the above-mentioned target editing guide RNA into a eukaryotic cell having the target RNA.
  • the target editing guide RNA can be appropriately selected and applied from various methods used in nucleic acid medicine as a method for introducing RNA into eukaryotic cells.
  • the site-specific editing method for the target RNA may be performed in vitro or in vivo.
  • the invention uses a targeted edit guide RNA in the manufacture of a pharmaceutical composition used in the treatment of a disease (eg, a hereditary disease), a target edit guide RNA in the treatment of a disease (eg, a hereditary disease). Also includes targeted editing guide RNAs used in the use of, for the treatment of diseases (eg, hereditary diseases).
  • a disease eg, a hereditary disease
  • a target edit guide RNA in the treatment of a disease eg, a hereditary disease
  • targeted editing guide RNAs used in the use of, for the treatment of diseases (eg, hereditary diseases).
  • Oligonucleotides having the sequence shown in Table 1 (SEQ ID NO: 1) and consisting entirely of natural RNA residues are designated by the phosphoramidite method (for example, Nucleic Acids Research, 12, 4539). (1984), Nature Communications 6, Article number: 6317 (2015)) was used for synthesis. The obtained compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (measured value: 7714.8).
  • the underlined part corresponds to the first oligonucleotide (ASR), and the target RNA is Rluc_sRNA, which will be described later. It is considered that the oligonucleotide of Reference Example 1 can have the following structure with the target RNA, for example.
  • hGAPDH_sRNA02 As a model target RNA, hGAPDH_sRNA02 (SEQ ID NO: 3) having the sequence shown below was prepared in the same manner as Rluc_sRNA described later.
  • the oligoribonucleotide hGAPDH_AD1 As a target editing guide RNA for this model target RNA, the oligoribonucleotide hGAPDH_AD1 (SEQ ID NO: 4) shown below was prepared by the phosphoramidite method. The underline in the table indicates the adenosine residue of the editing target.
  • Examples 1 to 32 The oligonucleotides of Examples 1 to 16 were obtained by introducing a modified nucleotide as shown in Table 3 based on the sequence of the oligonucleotide of Reference Example 1.
  • the oligonucleotides of Examples 17 to 32 were obtained by introducing modified nucleotides as shown in Table 4 based on the oligonucleotide sequence of Reference Example 2.
  • These oligonucleotide compounds were synthesized by the phosphoramidite method in the same manner as in Reference Example 1. When synthesizing the portion "18" in the sequence, DMT Hexaethylene Glycol phosphoramidite (ChemGenes, catalog number: CLP-9765) was used.
  • the "DNA” moiety was synthesized using the phosphoramidite form described in Nucleic Acids Research 11, 4539 (1984). The portion of “2'-O, 4'-C-methylene nucleoside” was synthesized using the phosphoramidite compound described in International Publication No. 99/14226. The part of "2'-deoxy-2'-fluoronucleoside” is J.I. Med. Chem. , 36, 831 (1993).
  • Molecular weight in the table indicates the measured value by negative ion ESI mass spectrometry.
  • uppercase letters are RNA
  • lowercase letters are DNA
  • N (M) is 2'-O-methylation of D-ribofuranose
  • N (F) is 2'-deoxy-2'of D-ribofuranose.
  • -Fluoration N (L) is 2'-O, 4'-C-methyleneation of D-ribofuranose
  • N (E) is 2'-O, 4'-C-ethylene of D-ribofuranose. Shows the change.
  • the 5'end and 3'end of the oligonucleotide are hydroxyl groups in which a hydrogen atom is bonded to an oxygen atom in a chemical formula. The structure of the nucleoside unit is shown below. The broken line in the chemical formula indicates the binding site.
  • plasmids expressing hADAR2, hADAR1p110 and hADAR1p150 were prepared by a conventional method.
  • Rluc_sRNA Rluc_WT RNA Synthesis of Rluc_sRNA Rluc_WT RNA (SEQ ID NO: 5) prepared by transcription by a conventional method was prepared from psiCHECK TM -2 Vector (Promega) so as to be 0.2 nM.
  • An in vitro editing reaction was performed by incubating in vitro at 37 ° C. for 2 hours.
  • Rluc_WT RNA after the editing reaction was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • cDNA was synthesized with Rluc_WT_BamR01 primer (SEQ ID NO: 6) using Primescript Reverse Transcriptase II (TaKaRa).
  • PCR (30 cycles, denaturation: 98 ° C., 10 seconds, annealing: 55 ° C., 15 seconds, elongation) using Rluc_WT_EcoF01 primer (SEQ ID NO: 7), Rluc_WT_BamR01 primer (SEQ ID NO: 6), and PrimeStar GXL DNA Polymerase (TaKaRa).
  • the insert DNA and pUC19 plasmid were digested with EcoRI (TaKaRa) and BamHI (TaKaRa) at 37 ° C. for 1 hour, and then each DNA was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • the pUC19 plasmid after digestion with restriction enzymes and the insert DNA were mixed so as to have a molar ratio of 1: 3, and a ligation reaction was carried out using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (TaKaRa).
  • the obtained ligation sample was transformed into DH5 ⁇ , cultured overnight at 37 ° C. using an LB agar plate, and then a plasmid was extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Nucleotide sequence analysis of the obtained plasmid DNA was performed to obtain a sequence in which A122 of Rluc_WT was mutated to G (Rluc_K41R) and a plasmid DNA in which Rluc_K41R was cloned (pUC19-Rluc_K41R).
  • the 5'side fragment is the Rluc_NheF01 primer (SEQ ID NO: 8) and the RL_W104X_RV primer (SEQ ID NO: 9), and the 3'side fragment is the Rluc_XhoR01 primer (SEQ ID NO: 10) and the RL_W104X_FW primer (SEQ ID NO: 11).
  • TaKaRa PrimeStar GXL DNA Polymerase
  • each PCR product was diluted 100-fold, and 2nd PCR (30 cycles, denaturation: 98 ° C, 10 seconds, annealing: 55 ° C, 15 seconds) was performed by PrimeStar GXL DNA Polymerase (TaKaRa) using the Rluc_NheF01 primer and the Rluc_XhoR01 primer. , Elongation: 68 ° C., 60 seconds) and purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to obtain DNA (Rluc_K41R_W104X) (SEQ ID NO: 14) having a sequence in which G311 of Rluc_K41R was mutated to A.
  • the obtained DNA (Rluc_K41R_W104X) and psiCHECK TM -2 Vector (promega) were subjected to restriction enzyme digestion at 37 ° C. using NheI (TaKaRa) and XhoI (TaKaRa) for 1 hour, followed by phenol / chloroform extraction and ethanol. Each DNA was purified by precipitation.
  • Rluc_K41R_W104X and psiCHECK TM -2 Vector after digestion with restriction enzymes were mixed so as to have a molar ratio of 3: 1 and a ligation reaction was carried out using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (TaKaRa).
  • the obtained ligation sample was transformed into DH5 ⁇ and cultured overnight at 37 ° C. using an LB agar plate.
  • the selected colonies were cultured overnight at 37 ° C. in LB liquid medium, and plasmids were extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Then, the sequence of the plasmid obtained by the nucleotide sequence analysis was confirmed.
  • PCR 30 cycles (denaturation: 98 ° C., 10 seconds, annealing:) using T7_Rluc_sRNA_F01 primer (SEQ ID NO: 12), Rluc_sRNA_R01 primer (SEQ ID NO: 13), and PrimeStar GXL DNA Polymerase (TaKaRa):
  • the template DNA for in vitro transcription reaction was amplified by 55 ° C., 15 seconds, elongation: 68 ° C., 20 seconds), and purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • Rluc_sRNA (SEQ ID NO: 15) was obtained by in vitro transcription using AmpliScribe T7 Kit (Epicentre Biotechnology). The synthesized Rluc_sRNA was cut out and purified using a 5% polyacrylamide gel containing 8M urea, and used for the subsequent tests.
  • Rluc_WT_RNA The sequences of Rluc_WT_RNA, Rluc_K41R_W104X and Rluc_sRNA, and the sequences of the primers used above are shown below.
  • the underline in the table indicates the adenosine residue of the editing target.
  • RNA is extracted from cells cultured in 24-well Plate using Sepazole RNA I Super G (Nakarai), DNase treatment is performed using Recombinant DNase I (TaKaRa), and then phenol / chloroform extraction. , Purified by ethanol precipitation.
  • a reverse transcriptase reaction was performed using PrimeScript II Reverse Transcriptase (TaKaRa), Total RNA 0.5 ⁇ g, and 0.25 ⁇ M Oligo (dT) 17 (SEQ ID NO: 16) to amplify cDNA.
  • 1st PCR (30 cycles (denaturation: 98 ° C, 10 seconds, annealing: 55 ° C, 15 seconds) using PrimeStar GXL DNA polymerase (TaKaRa), Rluc_F01 primer (SEQ ID NO: 17), 3'-Adp primer (SEQ ID NO: 18). , Elongation: 68 ° C., 60 seconds)).
  • 2nd PCR (30 cycles (denaturation: 98 ° C.,) using PrimeStar GXL DNA polymerase (TaKaRa), Rluc_F01 primer (SEQ ID NO: 17), and Rluc_R01 primer (SEQ ID NO: 19).
  • Luciferase Reporter Assay Method A Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) was used. A cell extract was obtained using 100 ⁇ L of Passive Liquid Buffer (Promega) on cells cultured in 24-well Plate. 100 ⁇ L of LARII was added to 20 ⁇ L of the obtained cell extract, and 60 seconds later, the emission intensity of Firefly luciferase (Fluc) was measured by GloMax (R) 20/20 Luminometer (Promega). Immediately thereafter, 100 ⁇ L of Stop & Glo Reagent was added, and 60 seconds later, the emission intensity of Renilla luciferase (Rluc) was measured. The emission intensity was normalized by Fluc.
  • the editing ratio (%) when the example compounds (AD1-gRNA03_1 to AD1-gRNA03_4) were used is shown in FIG. 1A.
  • the editing rate was about 30% to 70% as compared with the case where gRNA was not used (gRNA (-)).
  • the editing rate was about 40% to 60% as compared with the case where gRNA was not used (gRNA (-)).
  • the results of the luciferase reporter assay using the example compounds (AD1-gRNA03_1 to AD1-gRNA03_4) are shown in FIG. 1B.
  • the example compounds (AD1-gRNA03_1 to AD1-gRNA03_4) were used, higher luciferase activity was observed as compared with the case where gRNA was not used (gRNA ( ⁇ )).
  • the editing ratio (%) when the example compounds (AD1-gRNA03_4, AD1-gRNA03_9 to AD1-gRNA03_16) were used is shown in FIG. 2A.
  • AD1-gRNA03_4, AD1-gRNA03_9 to AD1-gRNA03_16 showed a higher editing rate as compared with the case without gRNA (gRNA (-)).
  • gRNA ( ⁇ ) the case where gRNA was not used
  • FIG. 3 shows the results of the luciferase reporter assay when the example compounds (AD1-gRNA03_4, AD1-gRNA03_9 to AD1-gRNA03_16) were used.
  • the example compounds (AD1-gRNA03_4, AD1-gRNA03_9 to AD1-gRNA03_16) were used, an improvement in luciferase activity was observed as compared with the case where gRNA was not added (gRNA (-)).
  • the editing ratios were also investigated, when the example compounds (AD1-gRNA03_4 and AD1-gRNA03_15) were used, the editing ratios were 9.0 ⁇ 0.1% and 4.1 ⁇ 2.3%, respectively ( ⁇ ). S.D.%) was shown, and the values were higher than the background (1.3 ⁇ 1.4% and 0.9 ⁇ 0.4%, respectively).
  • Example 3 Evaluation of intracellular editing inducibility of GAPDH gene sequence by gRNA, which is an example compound HEK293 cells were subcultured to a 24-well plate at 5.0 ⁇ 10 4 cells / well and cultured for 48 hours.
  • Editing analysis method The cDNA was amplified in the same manner as in the method described in the editing analysis method of Test Example 1. PCR (30 cycles (denaturation: 98 ° C, 10 seconds, annealing: 55 ° C, 15 seconds, elongation: 68) using PrimeStar GXL DNA polymerase (TaKaRa), GAPDH_FW primer (SEQ ID NO: 21), GAPDH_RV primer (SEQ ID NO: 22). °C, 60 seconds)) was performed to amplify the GAPDH fragment.
  • PCR 30 cycles (denaturation: 98 ° C, 10 seconds, annealing: 55 ° C, 15 seconds, elongation: 68) using PrimeStar GXL DNA polymerase (TaKaRa), GAPDH_FW primer (SEQ ID NO: 21), GAPDH_RV primer (SEQ ID NO: 22). °C, 60 seconds)
  • the editing ratio (%) when the example compounds (hGAPDH_AD1_4, hGAPDH_AD1_17 to hGAPDH_AD1_19) were used is shown in FIG. 4A.
  • a high editing rate of about 15% to 25% was shown as compared with the case where gRNA was not used (gRNA (-)).
  • gRNA (-) When a plasmid expressing ADAR2 was transfected, the editing rate was slightly higher than that when gRNA was not used (gRNA (-)).
  • the editing ratio (%) when the example compounds (hGAPDH_AD1_4, hGAPDH_AD1_20 to hGAPDH_AD1_28) were used is shown in FIG. 4B.
  • a plasmid expressing ADAR1 was transfected, a high editing rate of about 10% to 30% was shown as compared with the case where gRNA was not used (gRNA (-)).
  • Transfection with a plasmid expressing ADAR2 showed a higher editing rate compared to those without gRNA.
  • the editing ratio (%) when the example compounds (hGAPDH_AD1_4, hGAPDH_AD1_29, hGAPDH_AD1_31 and hGAPDH_AD1_32) were used is shown in FIG.
  • a plasmid expressing ADAR1 was transfected, a high editing rate of about 15% to 30% was shown as compared with the case where gRNA was not used (gRNA (-)).
  • a plasmid expressing ADAR2 was transfected, a higher editing rate was shown as compared with the case where gRNA was not used (gRNA (-)).
  • Example 33 to 49 The oligonucleotides of Examples 33 to 49 were obtained by introducing a modified nucleotide as shown in Table 11 based on the sequence of the oligonucleotide of Reference Example 2. These oligonucleotides were synthesized by the phosphoramidite method in the same manner as in Reference Example 1. In the sequence, N3-MethylUridine CED phosphoramidite (ChemGenes, catalog number: ANP-7451) was used when synthesizing the "mU" portion, and dSpacer CE was used when synthesizing the "d" portion.
  • mU is N3-methyluridine
  • d is 1,2-dideoxyribose
  • mc is N3-methyl-2'-deoxycytidine
  • mt is. Shows N3-methylthymidine.
  • the other abbreviations are as described above.
  • the 5'end and 3'end of the oligonucleotide are hydroxyl groups in which a hydrogen atom is bonded to an oxygen atom in the figure.
  • RNA targeting the disease sequence As a target editing guide RNA targeting the disease sequence, an oligonucleotide having the following sequences and consisting entirely of native RNA residues was prepared by the phosphoramidite method. The resulting compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry.
  • Example 50 to 64 The oligonucleotides of Examples 50 to 64 were obtained by introducing modified nucleotides as shown in Table 13 based on the sequences of the oligonucleotides of Reference Examples 3 to 7. These oligonucleotides were synthesized by the phosphoramidite method in the same manner as in Reference Example 1. The details of the modified nucleotide are as described above.
  • the abbreviations in the "array” in the table are as described above.
  • the 5'end and 3'end of the oligonucleotide are hydroxyl groups in which a hydrogen atom is bonded to an oxygen atom in the figure.
  • Test Example 4 The compounds obtained in Examples 33 to 49 were evaluated for the intracellular editing-inducing activity of oligonucleotides on the hGAPDH gene sequence in the same manner as in Test Example 3.
  • the editing ratio (%) when the example compounds (hGAPDH_AD1_4, hGAPDH_AD1_31, hGAPDH_AD1_33 to hGAPDH_AD1_40) were used is shown in FIG.
  • a plasmid expressing ADAR1 was transfected, the editing rate was higher than that without gRNA (gRNA (-) in the figure).
  • a plasmid expressing ADAR2 was transfected, the editing rate was higher than that without gRNA (gRNA (-) in the figure).
  • hGAPDH_AD1_33 of Example 33 in which the target-corresponding nucleotide residue was mU showed a high editing rate.
  • Example 39 and Example 40 (hGAPDH_AD1_39, hGAPDH_AD1_40) in which LNA was introduced into 4 or 6 sites at the binding site with the target RNA showed the highest editing ratio.
  • the intracellular edit-induced evaluation was performed when only gRNA, which is an example compound, was transfected to a concentration of 50 nM without transfecting a plasmid expressing ADAR1 or ADAR2, the example compound (hGAPDH_AD1_39 or When hGAPDH_AD1_40) was used, the HeLa cells showed 13.6 ⁇ 1.7% and 13.9 ⁇ 1.6% editing ratios ( ⁇ SD%), respectively, and showed a background (5.0 ⁇ 0). It showed a value clearly higher than 9.9%).
  • the editing ratio (%) when the example compounds (hGAPDH_AD1_4, hGAPDH_AD1_31, hGAPDH_AD1_39, hGAPDH_AD1_41, hGAPDH_AD1_43, hGAPDH_AD1_44, hGAPDH_AD1_46 to hGAPDH_AD1_51) are used is shown in FIG.
  • a plasmid expressing ADAR1 was transfected, the editing rate was higher than that without gRNA (gRNA (-) in the figure).
  • gRNA (-) gRNA (-) in the figure).
  • Examples 39 and 43 to 49 in which LNA was introduced into the binding site with the target RNA showed a high editing rate.
  • FIG. 7B the editing ratio (%) evaluated for intracellular editing induction when transfecting only gRNA, which is an example compound, to a concentration of 50 nM without transfecting a plasmid expressing ADAR1 or ADAR2 is shown in FIG. 7B. It was shown to.
  • the example compounds hGAPDH_AD1_31, hGAPDH_AD1_39, hGAPDH_AD1_44, hGAPDH_AD1_47 to hGAPDH_AD1_51
  • Inserts The plasmids were added in a molar ratio of 3: 1 and a ligation reaction was performed using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (TaKaRa). The obtained ligation sample was transformed into DH5 ⁇ and cultured overnight at 37 ° C. using an LB agar plate. The selected colonies were cultured overnight at 37 ° C. in LB liquid medium, and plasmids were extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN).
  • the obtained plasmid 100 ng was used in a Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit (Thermo Fisher Scientific), a 0.165 ⁇ M pUC19_seqFW primer (SEQ ID NO: 31) and a 0.165 ⁇ M pUC19_sequrV primer (SEQ ID NO: 31).
  • sequence analysis was performed by Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific), and it was confirmed that the pUC19_AGXT plasmid could be synthesized.
  • PCR denaturation: 98 ° C, 10 seconds, annealing: 55 ° C, 15 seconds, elongation: 98 ° C, 10 seconds, annealing: 55 ° C, 15 seconds, extension: T7_pUC19_FW (SEQ ID NO: 33), M13_RV primer (SEQ ID NO: 34), and PrimeStar GXL DNA Polymerase (TaKaRa).
  • Template DNA was prepared at 68 ° C. for 20 seconds) and purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • the editing reaction using ADAR1 was performed in 5 nM AGXT_RNA in editing reaction buffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 2 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.01% TritonX-100, 5% glycerol).
  • Recombinant hADAR1p110 was added to the -gRNA complex to a final concentration of 250 nM and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the sequence of the obtained cDNA was subjected to a sequencing reaction using a T7proGGG primer (SEQ ID NO: 35) and Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit, and analyzed by Applied Biosystem 3500 Genetic Sensor (Thersis). From the chromatographic chart obtained by sequencing, the edit ratio (%) was calculated from the peak height ratio (G / (G + A)) of the target site.
  • Example 55 in which the guanosine on the 3'side of the target-corresponding nucleotide was changed to 2'-deoxyinosine showed a higher editing ratio.
  • Example 56 in which the guanosine on the 3'side of the target-corresponding nucleotide position was changed to 2'-deoxyinosine showed a higher editing ratio.
  • RNA editing efficiency by ADAR1p110 is 2'-guanosine on the 3'side of the target-corresponding nucleotide in the gRNA, as compared to Reference Example 5 (AD1_EYS, AD1g of EYS in the figure), which consists entirely of natural ga-type RNA.
  • Example 52 using deoxyguanosine (AD1_EYS.2, AD1g.2 of EYS in the figure) showed a high editing ratio.
  • Example 57 in which the guanosine on the 3'side of the target-corresponding nucleotide position was changed to 2'-deoxyinosine showed a higher editing ratio.
  • HFE_RNA As oligo DNA, HFE_FW (SEQ ID NO: 40) and HFE_RV (SEQ ID NO: 41) shown below were used instead of AGXT_FW and AGXT_RV. Except for this, the method described in (A) Synthesis of AGXT_RNA in Test Example 5 was carried out to synthesize a pUC_HFE plasmid expressing a model target RNA, and HFE_RNA was synthesized as a model target RNA using this plasmid.
  • Example 58 in which the guanosine on the 3'side of the target-corresponding nucleotide position was changed to 2'-deoxyinosine showed a higher editing ratio.
  • Example 59 (AD1_UGT1A1.3, AD1g.3 of UGT1A1 in the figure) in which the guanosine on the 3'side of the target-corresponding nucleotide position was changed to 2'-deoxyinosine showed a higher editing ratio.
  • Insert DNA was prepared and purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • the insert DNA, pcDNA3.1 (-) Hygro was reacted with XhoI (TaKaRa) and KpnI (TaKaRa) at 37 ° C. for 1 hour, and then purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • Inserts The plasmids were added in a molar ratio of 3: 1 and a ligation reaction was performed using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (TaKaRa). The obtained ligation sample was transformed into DH5 ⁇ and cultured overnight at 37 ° C. using an LB agar plate.
  • the selected colonies were cultured overnight at 37 ° C. in LB liquid medium, and plasmids were extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). The obtained plasmid 100 ng was used with Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit (Thermo Fisher Scientific), 0.165 ⁇ M pcDNA3_1pro_F01 primer (SEQ ID NO: 46) and 0.165 ⁇ M pcDNA31-sequR01 primer (SEQ ID NO: 46). A single reaction was performed, and sequence analysis was performed using an Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific), and it was confirmed that pcDNA3.1 (-) Hygro_AGXT could be synthesized.
  • RNA was extracted from cells cultured in 24-well Plate using Sepazole RNA I Super G (Nakarai), treated with Recombinant DNase I (TaKaRa), and then treated with phenol / Purified by chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • a reverse transcriptase reaction was performed using PrimeScript II Reverse Transcriptase (TaKaRa), Total RNA 0.5 ⁇ g, and 0.25 ⁇ M Oligo (dT) 17, and the cDNA was amplified.
  • 1st PCR was performed using PrimeStar GXL DNA polymerase (TaKaRa), T7proGGG primer (SEQ ID NO: 35), and 3'-Adp primer (SEQ ID NO: 48).
  • 2nd PCR was performed using PrimeStar GXL DNA polymerase (TaKaRa), DS_disase_XhoF01 primer (SEQ ID NO: 44), and DS_disease_KpnR01 primer (SEQ ID NO: 45), and AGX was amplified.
  • a sequencing reaction was performed using the Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit, 0.165 ⁇ M DS_disease_XhoF01 primer, and analyzed by Applied Biosystem 3500 Genetic Analyzer. From the chromatographic chart obtained by sequencing, the editing ratio was calculated from the peak height ratio (G / (G + A)) of the target site.
  • FIG. 9 shows the editing ratio (%) when the compound of Example 60 (AD1_AGXT_30) was used.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • a high editing rate of about 30% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • were transfected together with the plasmid expressing ADAR2 a high editing rate of about 60% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound, were transfected with a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150, a high editing rate of about 70% was shown.
  • Test Example 11 Evaluation of edit-inducing ability for model target RNA having GNE gene sequence in cultured cells of gRNA
  • a target RNA expression plasmid was constructed using pUC19_GNE obtained in Test Example 6 (A) as a template, and gRNA.
  • the ability to induce editing of the GNE gene sequence in cultured cells of gRNA was evaluated according to (A) to (C) of Test Example 10 except that AD1_GNE_30 of Example 61 was used as a guide.
  • the editing ratio (%) when the compound of Example 61 (AD1_GNE_30) was used is shown in FIG.
  • the editing rate was about 10%.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected together with the plasmid expressing ADAR2, a high editing rate of about 50% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected with a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150, a high editing rate of about 60% was shown.
  • Test Example 12 Evaluation of edit-inducing ability for model target RNA having EYS gene sequence in cultured cells of gRNA
  • a target RNA expression plasmid was constructed using pUC19_EYS obtained in Test Example 7 (A) as a template, and gRNA.
  • the ability to induce editing of the EYS gene sequence in cultured cells of gRNA was evaluated according to (A) to (C) of Test Example 10 except that AD1_EYS_29 of Example 62 was used as a guide.
  • the editing ratio (%) when the compound of Example 62 (AD1_EYS_29) was used is shown in FIG.
  • the editing rate was about 10%.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected together with the plasmid expressing ADAR2, a high editing rate of about 40% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected with a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150, a high editing rate of about 50% to 60% was shown.
  • Test Example 13 Evaluation of edit-inducing ability for model target RNA having HFE gene sequence in cultured cells of gRNA
  • a target RNA expression plasmid was constructed using pUC19_HFE obtained in Test Example 8 (A) as a template, and gRNA.
  • the ability to induce editing of the HFE gene sequence in cultured cells of gRNA was evaluated according to (A) to (C) of Test Example 10 except that AD1_HFE_29 of Example 63 was used.
  • the editing ratio (%) when the compound of Example 63 (AD1_HFE_29) was used is shown in FIG.
  • the editing rate was about 10%.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected together with the plasmid expressing ADAR2, a high editing rate of about 40% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected with a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150, a high editing rate of about 50% was shown.
  • Test Example 14 Evaluation of edit-inducing ability for model target RNA having UGT1A1 gene sequence in cultured cells of gRNA
  • a target RNA expression plasmid was constructed using pUC19_UGT1A1 obtained in Test Example 9 (A) as a template, and gRNA.
  • the ability to induce editing of the UGT1A1 gene sequence in cultured cells of gRNA was evaluated according to (A) to (C) of Test Example 10 except that AD1_UGT1A1_30 of Example 64 was used.
  • the editing ratio (%) when the compound of Example 64 (AD1_UGT1A1_30) was used is shown in FIG.
  • the editing rate was about 10%.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected together with the plasmid expressing ADAR2, a high editing rate of about 40% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected with a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150, a high editing rate of about 60% was shown.
  • RNA targeting the disease sequence As a target editing guide RNA targeting the disease sequence, oligonucleotides having the following sequences and all of them were synthesized from native ribonucleotide residues by the phosphoramidite method in the same manner as in Reference Example 1. "Molecular weight” in the table indicates the measured value by negative ion ESI mass spectrometry, and "-" indicates that it has not been measured.
  • Examples 65 to 136 The compounds of Examples 65 to 136 were obtained by introducing modified nucleotides as shown in Tables 21 to 24 based on the sequences of the oligonucleotides of Reference Examples 2 and 8 to 22, respectively. be. These oligonucleotides were synthesized by the phosphoramidite method in the same manner as in Reference Example 1.
  • N3-Ethyl deoxycytidine CED phosphoramidite (ChemGene, catalog number: ANP-3856) was used.
  • Ribo Thymidine CED phosphoramidite (ChemGene, catalog number: ANP-7511) was used.
  • Test Example 15 Evaluation of ability to induce editing of GAPDH gene sequence in cultured cells of gRNA, which is an Example compound (3)
  • the same method as in Test Example 3 was used.
  • the editing ratio (%) when the compounds of Examples 39, 40 and 102 to 106 (hGAPDH_AD1_39, hGAPDH_AD1_40, hGAPDH_AD1_52 to hGAPDH_AD1_56) were used is shown in FIG.
  • the editing rate was higher than that without gRNA (gRNA (-) in the figure).
  • the compounds of Examples 39, 40 and 102 (hGAPDH_AD1_39, hGAPDH_AD1_40, hGAPDH_AD1_52) in which LNA was introduced into the binding site with the target RNA showed the highest editing ratio.
  • gRNA which is an example compound
  • the intracellular edit induction evaluation was carried out, and it showed a higher editing ratio as compared with gRNA ( ⁇ ).
  • the editing ratio (%) in the case of using the compounds of Examples 39, 100, 101, 105 and 107 to 112 is shown in FIG.
  • the editing ratio (%) when the example compounds (hGAPDH_AD1_39, hGAPDH_AD1_62 to hGAPDH_AD1_75) were used is shown in FIG. 12A.
  • the editing rate was higher than that without gRNA (gRNA (-) in the figure).
  • the compounds of Examples 39, 112, 115-118, and 120 hGAPDH_AD1_39, hGAPDH_AD1_62, hGAPDH_AD1_65 to hGAPDH_AD1_68, hGAPDH_AD1_70
  • the percentage is shown.
  • gRNA which is an example compound, was transfected to a concentration of 50 nM, the intracellular edit induction evaluation was carried out, and it showed a higher editing ratio as compared with gRNA ( ⁇ ).
  • the editing ratio (%) when the example compounds (hGAPDH_AD1_39, hGAPDH_AD1_76 to hGAPDH_AD1_85) were used is shown in FIG. 12B.
  • FIGS. 13A and 13B Results of editing analysis
  • the results of the editing ratio by ADAR1p110 are shown in FIGS. 13A and 13B.
  • the RNA editing efficiency by ADAR1p110 showed a higher editing ratio for the compounds of Examples 39, 112 to 135 (hGAPDH_AD1_39, hGAPDH_AD1-62 to 85) as compared with the case where gRNA was not added.
  • those using deoxyribonucleotide residues, ribonucleotide residues, 2'-F-ribonucleotide residues or 2'-O-Me-ribonucleotide residues as target-corresponding nucleotide residues show a high editing rate. Represents.
  • FIG. 14A Results of editing analysis
  • the results of the editing ratio by ADAR1p110 are shown in FIG. 14A.
  • the RNA editing efficiency of ADAR1p110 is 3 of the targeting nucleotide residues in the gRNA as compared to the compound of Reference Example 8 (AD1_Factor V, AD1g03 of Factor V in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 65 (AD1_Factor V.3, AD1g03.3 of Factor V in the figure) in which the guanosine on the'side was 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • the result of the editing ratio by ADAR2 is shown in FIG. 14B.
  • the RNA editing efficiency by ADAR2 is 3 of the target-corresponding nucleotide residues in the gRNA as compared with the compound of Reference Example 8 (AD1_Factor V, AD1g03 of Factor V in the figure), which consists entirely of natural ribonucleotide residues.
  • Example 65 AD1_Factor V.3, AD1g03.3 of Factor V in the figure in which the guanosine on the'side was 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • FIG. 14A Results of editing analysis
  • the results of the editing ratio by ADAR1p110 are shown in FIG. 14A.
  • the efficiency of RNA editing by ADAR1p110 is 3'side of the target-corresponding nucleotide residue in the gRNA compared to the compound of Reference Example 12 (AD1_CBS, AD1g03 of CBS in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 69 (AD1_CBS.3, AD1g03.3 of CBS in the figure) in which guanosine was converted to 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • the result of the editing ratio by ADAR2 is shown in FIG. 14B.
  • the efficiency of RNA editing by ADAR2 is 3'side of the target-corresponding nucleotide residue in the gRNA compared to the compound of Reference Example 12 (AD1_CBS, AD1g03 of CBS in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 69 (AD1_CBS.3, AD1g03.3 of CBS in the figure) in which guanosine was converted to 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • FIG. 14A Results of editing analysis
  • the results of the editing ratio by ADAR1p110 are shown in FIG. 14A.
  • the RNA editing efficiency of ADAR1p110 is 3 of the targeting nucleotide residues in the gRNA compared to the compound of Reference Example 9 (AD1_PAH.1, AD1g03 of PAH in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 66 (AD1_PAH.1.3, AD1g03.3 of PAH in the figure) in which the guanosine on the'side was 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • the result of the editing ratio by ADAR2 is shown in FIG. 14B.
  • the RNA editing efficiency by ADAR2 is 3 of the target-corresponding nucleotide residues in the gRNA as compared to the compound of Reference Example 9 (AD1_PAH.1, AD1g03 of PAH in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 66 (AD1_PAH.1.3, AD1g03.3 of PAH in the figure) in which the guanosine on the'side was 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • FIG. 14A Results of editing analysis
  • the results of the editing ratio by ADAR1p110 are shown in FIG. 14A.
  • the efficiency of RNA editing by ADAR1p110 is 3'side of the target-corresponding nucleotide residue in the gRNA as compared to the compound of Reference Example 10 (AD1_ASS1, AD1g03 of ASS1 in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 67 (AD1_ASS1.3, AD1g03.3 of ASS1 in the figure) in which guanosine was converted to 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • the result of the editing ratio by ADAR2 is shown in FIG. 14B.
  • the efficiency of RNA editing by ADAR2 is 3'side of the target-corresponding nucleotide residue in the gRNA as compared to the compound of Reference Example 10 (AD1_ASS1, AD1g03 of ASS1 in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 67 (AD1_ASS1.3, AD1g03.3 of ASS1 in the figure) in which guanosine was converted to 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • FIG. 14A Results of editing analysis
  • the results of the editing ratio by ADAR1p110 are shown in FIG. 14A.
  • the RNA editing efficiency by ADAR1p110 is 3'side of the targeting nucleotide residue in the gRNA as compared to the compound of Reference Example 13 (AD1_GRIA2, AD1g03 of GRIA2 in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 70 (AD1_GRIA2.3, AD1g03.3 of GRIA2 in the figure) in which guanosine was converted to 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • the result of the editing ratio by ADAR2 is shown in FIG. 14B.
  • the efficiency of RNA editing by ADAR2 is 3'side of the target-corresponding nucleotide residue in the gRNA as compared to the compound of Reference Example 13 (AD1_GRIA2, AD1g03 of GRIA2 in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 70 (AD1_GRIA2.3, AD1g03.3 of GRIA2 in the figure) in which guanosine was converted to 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • FIG. 14A Results of editing analysis
  • the results of the editing ratio by ADAR1p110 are shown in FIG. 14A.
  • the efficiency of RNA editing by ADAR1p110 is 3'side of the target-corresponding nucleotide residue in the gRNA as compared to the compound of Reference Example 14 (AD1_SLCO2A1, AD1g03 of SLCO2A1 in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 71 (AD1_ SLCO2A1.3, AD1g03.3 of SLCO2A1 in the figure) in which guanosine was converted to 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • the result of the editing ratio by ADAR2 is shown in FIG. 14B.
  • the RNA editing efficiency by ADAR2 is 3'side of the target-corresponding nucleotide residue in the gRNA as compared to the compound of Reference Example 14 (AD1_SLCO2A1, AD1g03 of SLCO2A1 in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 71 (AD1_SLCO2A1.3, AD1g03.3 of SLCO2A1 in the figure) in which guanosine was converted to 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • FIG. 14A Results of editing analysis
  • the results of the editing ratio by ADAR1p110 are shown in FIG. 14A.
  • the efficiency of RNA editing by ADAR1p110 is 3'side of the target-corresponding nucleotide residue in the gRNA as compared to the compound of Reference Example 11 (AD1_GFAP, AD1g03 of GFAP in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 68 in which guanosine was converted to 2'-deoxyinosine (AD1_GFAP.3, AD1g03.3 of GFAP in the figure) showed a high editing ratio.
  • the result of the editing ratio by ADAR2 is shown in FIG. 14B.
  • the efficiency of RNA editing by ADAR2 is 3'side of the target-corresponding nucleotide residue in the gRNA compared to the compound of Reference Example 11 (AD1_GFAP, AD1g03 of GFAP in the figure), which consists entirely of native ribonucleotide residues.
  • the compound of Example 68 (AD1_GFAP, AD1g03.3 of GFAP in the figure) in which guanosine was converted to 2'-deoxyinosine showed a high editing ratio.
  • Test Example 24 Evaluation of edit-inducing ability for RNA having the ASS1 gene sequence
  • A The operation for synthesizing the target RNA was carried out in the same manner as in the method described in (A) Synthesis of AGXT_RNA in Test Example 5. However, the oligo DNA having the ASS1 gene sequence described in Test Example 20 was used.
  • the ASS1 gene sequence used here is described in GenBank accession no. It has the base sequences of NM_000050.4 from 1510 to 1534, and further c. It has a nucleoside mutation (rs121908641) called 1168G> A.
  • Example 76 Results of editing analysis The results of the editing ratio using Example 76 (AD1_ASS1.39) are shown in FIG. 15A.
  • the RNA editing efficiency of the compound (AD1_ASS1.39) of Example 76 chemically modified by ADAR1p110 showed a high editing rate as compared with the one without gRNA added.
  • the compounds of this example have been shown to be able to repair the mutated ASS1 gene sequence.
  • the result of the editing ratio using the compound of Example 81 (AD1_ASS1.39e) and the compound of Example 85 (AD1_ASS1.52e) is shown in FIG. 15B.
  • the RNA editing efficiency of the chemically modified compound of Example 81 (AD1_ASS1.39e) and the compound of Example 85 (AD1_ASS1.52e) by ADAR1p110 was higher than that without gRNA. Indicated.
  • the compounds of this example have been shown to be able to repair the mutated ASS1 gene sequence.
  • Example 82 AD1_PANK2.39e
  • Example 86 AD1_PANK2.52e
  • FIG. 15C The RNA editing efficiency of the compound of Example 76 chemically modified (AD1_PANK2.39) by ADAR1p110 showed a high editing rate as compared with the one without gRNA added.
  • the compounds of this example have been shown to be able to repair the mutated PANK2 gene sequence.
  • Example 77 Results of editing analysis
  • the results of the editing ratio using Example 77 (AD1_NPHS2.39) are shown in FIG. 15A.
  • the RNA editing efficiency of the chemically modified Example 77 compound (AD1_NPHS2.39) by ADAR1p110 showed a higher editing rate as compared to the one without gRNA added.
  • the compounds of this example have been shown to be able to repair the mutated NPHS2 gene sequence.
  • Example 83 the compound of Example 83
  • Example 87 the compound of Example 87
  • FIG. 15D The RNA editing efficiency of the chemically modified Example 77 compound (AD1_NPHS2.39) by ADAR1p110 showed a higher editing rate as compared to the one without gRNA added.
  • the compounds of this example have been shown to be able to repair the mutated NPHS2 gene sequence.
  • Test Example 27 Evaluation of edit-inducing ability for RNA having a GRIA2 gene sequence
  • A The operation for synthesizing the target RNA was carried out in the same manner as in the method described in (A) Synthesis of AGXT_RNA in Test Example 5. However, the oligo DNA having the GRIA2 gene sequence described in Test Example 21 was used.
  • the GRIA2 gene sequence used here is described in GenBank accession no. It has the base sequences 2121 to 2145 of NM_000826.4, and the 2135th adenosine is a site where the editing efficiency to inosine decreases when the expression of ADAR2 decreases in the disease of ALS.
  • Test Example 28 Evaluation of ability to induce editing of PAH gene sequence in cultured cells of gRNA as an example compound A target RNA expression plasmid expressing the following PAH gene was constructed, and the compounds of Examples 72 to 74 were used as gRNA. The same method as in (A) to (C) of Test Example 10 was used except that the primer corresponding to the PAH gene was used.
  • the PAH gene sequence used here is described in GenBank accession no. NM_0013543304.2 has a base sequence of 114638 to 114662, and further c. It has a nucleoside mutation (rs5030855) called 1066-11G> A.
  • the editing ratio (%) when the compounds of Examples 72 to 74 (AD1_PAH.2.29, AD1_PAH.2.41, AD1_PAH.2.43) were used is shown in FIG.
  • the editing rate was about 5%.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound, were transfected together with the plasmid expressing ADAR2, a high editing rate of about 10% to 40% was shown.
  • RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • ADAR1p110 or ADAR1p150 an even higher editing rate of about 40% to 60% was shown.
  • the compounds of this example have been shown to be able to repair mutated PAH gene sequences.
  • Test Example 29 Evaluation of ability to induce editing of ASS1 gene sequence in cultured cells of gRNA as an example compound Construction of a target RNA expression plasmid expressing the following ASS1 gene, Examples 75, 79, 81 and as gRNA The same method as in (A) and (B) of Test Example 10 was used except that 85 compounds were used and the primer corresponding to ASS1 was used.
  • the ASS1 gene sequence used here is described in GenBank accession no. It has the base sequences of NM_000050.4 from 1510 to 1534, and further c. It has a nucleoside mutation (rs121908641) called 1168G> A.
  • a reverse transcriptase reaction was performed using PrimeScript II Reverse Transcriptase (TaKaRa), Total RNA 0.5 ⁇ g, and 0.25 ⁇ M Oligo (dT) 17, and the cDNA was amplified.
  • 1st PCR was performed using PrimeStar GXL DNA polymerase (TaKaRa), T7proGGG primer (SEQ ID NO: 35), and 3'-Adp primer (SEQ ID NO: 48).
  • 2nd PCR was performed using PrimeStar GXL DNA polymerase (TaKaRa), DS_disase_XhoF01 primer (SEQ ID NO: 44), and DS_disease_KpnR01 primer (SEQ ID NO: 45), and ASS1 was amplified.
  • a sequencing reaction was performed using a Big Dye Column v3.1 Cycle Sequence Kit, 0.165 ⁇ M DS_disease_XhoF01 primer, and analyzed by Applied Biosystem 3500 Genetic Analyzer. From the chromatographic chart obtained by sequencing, the editing ratio was calculated from the peak height ratio (G / (G + A)) of the target site.
  • the editing ratio (%) when the compounds of Examples 75 and 79 (AD1_ASS1.39, AD1_ASS1.52) were used is shown in FIG. 17A.
  • the editing ratio was about 5% to 10%.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected together with the plasmid expressing ADAR2, a high editing rate of about 20% to 50% was shown.
  • RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • ADAR1p110 or ADAR1p150 an even higher editing rate of about 40% to 80% was shown.
  • the compounds of this example have been shown to be able to repair the mutated ASS1 gene sequence.
  • the editing ratio (%) when the compounds of Examples 81 and 85 (AD1_ASS1.39e, AD1_ASS1.52e) were used is shown in FIG. 18A.
  • the editing rate was about 5%.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected together with the plasmid expressing ADAR2, a high editing rate of about 20% to 40% was shown.
  • RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • ADAR1p110 or ADAR1p150 an even higher editing rate of about 40% to 80% was shown.
  • the compounds of this example have been shown to be able to repair the mutated ASS1 gene sequence.
  • Test Example 30 Evaluation of ability to induce editing of PANK2 gene sequence in cultured cells of gRNA as an Example compound Construction of a target RNA expression plasmid expressing the following PANK2 gene was carried out as gRNA of Examples 76, 82 and 86. The same method as in (A) and (B) of Test Example 10 was used except that the compound was used and the primer corresponding to the PANK2 gene was used, and the edit analysis described in Test Example 29 was performed. The same method as that of the above method was used.
  • the PANK2 gene sequence used here is described in GenBank accession no. It has the base sequences of NM_153638.3 from 1714 to 1738, and further c. It has a nucleoside mutation (rs137852959) called 1561G> A.
  • the editing ratio (%) when the compound of Example 76 (AD1_PINK 2.39) was used is shown in FIG. 17B.
  • the editing rate was about 5%.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected together with the plasmid expressing ADAR2, a high editing rate of about 20% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected with a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150, a high editing rate of about 40% to 50% was shown.
  • the compounds of this example have been shown to be able to repair the mutated PANK2 gene sequence.
  • the editing ratio (%) when the compound of Example 82 (AD1_PINK 2.39e) and the compound of Example 85 (AD1_PINK 2.52e) were used is shown in FIG. 18B.
  • the editing rate was about 5%.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected together with the plasmid expressing ADAR2, a high editing rate of about 10% to 20% was shown.
  • RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • gRNA a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150
  • a high editing rate of about 30% to 50% was shown.
  • the compounds of this example have been shown to be able to repair the mutated PANK2 gene sequence.
  • Test Example 31 Evaluation of ability to induce editing of NPHS2 gene sequence in cultured cells of gRNA as an Example compound Construction of a target RNA expression plasmid expressing the following NPHS2 gene was carried out as gRNA of Examples 77, 83 and 87. The same method as in (A) and (B) of Test Example 10 was used except that the compound was used and the primer corresponding to the NPHS2 gene was used, and the edit analysis described in Test Example 29 was performed. The same method as that of the above method was used.
  • the NPHS2 gene sequence used here is described in GenBank accession no. It has the base sequences of NM_014625.4 from 483 to 501, and further c. It has a nucleoside mutation (rs74315342) called 413G> A.
  • the editing ratio (%) when the compound of Example 77 (AD1_NPHS2.39) is used is shown in FIG. 17C.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • a high editing rate of about 10% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • were transfected with a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150 a high editing rate of about 20% was shown.
  • the compounds of this example have been shown to be able to repair the mutated NPHS2 gene sequence.
  • the editing ratio (%) when the compound of Example 83 (AD1_NPHS2.39e) and the compound of Example 87 (AD1_NPHS.52e) are used is shown in FIG. 18C.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • gRNA which is an example compound
  • a high editing rate of about 10% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • were transfected with a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150 a high editing rate of about 20% was shown.
  • the compounds of this example have been shown to be able to repair the mutated NPHS2 gene sequence.
  • Test Example 32 Evaluation of ability to induce editing of GRIA2 gene sequence in cultured cells of gRNA as an Example compound Construction of a target RNA expression plasmid expressing the following GRIA2 gene was carried out, and Examples 78, 80 and 84 were constructed as gRNA. The same method as in (A) and (B) of Test Example 10 was used except that the compound was used and the primer corresponding to the GRIA2 gene was used, and the editorial analysis described in Test Example 29 was performed. The same method as that of the above method was used.
  • the GRIA2 gene sequence used here is described in GenBank accession no. It has the base sequences 2265 to 2289 of NM_000826.3, and the 2279th adenosine is a site where the editing efficiency to inosine decreases when the expression of ADAR2 is decreased in the disease of ALS.
  • the editing ratio (%) when the compound of Example 78 (AD1_GRIA 2.39), the compound of Example 80 (AD1_GRIA 2.39e) and the compound of Example 84 (AD1_GRIA2.52e) are used is shown in FIG. 18D.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • a high editing rate of about 40% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound, were transfected with a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150, a high editing rate of about 40% to 60% was shown. It is shown that the compound of this example can improve the efficiency of editing the adenosine site at position 2279 of the mutated GRIA2 gene sequence to inosine.
  • SEQ ID NO: 65 1st PCR (30 cycles, denaturation: 98 ° C., 10 seconds) by PrimeStar GXL DNA Polymerase (TaKaRa) using Rluc_G286A_F01 primer (SEQ ID NO: 66) and RL_s01_G286A_HinR1 primer (SEQ ID NO: 67) on the 3'side fragment. , Annie ring: 55 ° C., 15 seconds, elongation: 68 ° C., 20 seconds).
  • Each PCR product is then diluted 100-fold and used with the RL_s01_G286A_EcoF1 primer (SEQ ID NO: 64) and RL_s01_G286A_HinR1 primer (SEQ ID NO: 67) with PrimeStar GXL DNA Polymerase (TaKaRa) for 2nd PCR (30 cycles, denaturation: 98). 10 seconds, annealing: 55 ° C, 15 seconds, elongation: 68 ° C, 20 seconds), purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, and DNA having a sequence in which G286 of Rluc_K41R_W104X was denatured to A and a restriction enzyme site.
  • Rluc_K41R_W104X_G286A_Eco / Hid (SEQ ID NO: 72) was obtained. After pUC19 and the obtained DNA were digested with restriction enzymes at 37 ° C. for 1 hour using EcoRI (TaKaRa) and HindIII (TaKaRa), each DNA was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. Rluc_K41R_W104X_G286A and pUC19 after digestion with restriction enzymes were mixed so as to have a molar ratio of 1: 3, and a ligation reaction was carried out using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (TaKaRa).
  • the obtained ligation sample was transformed into DH5 ⁇ and cultured overnight at 37 ° C. using an LB agar plate.
  • the selected colonies were cultured overnight at 37 ° C. in LB liquid medium, and plasmids were extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Then, the sequence of the plasmid obtained by the nucleotide sequence analysis was confirmed.
  • PCR (30 cycles (denaturation: 98 ° C., 10 seconds, annealing: 55 ° C.) using T7_Rluc_sRNA_F01 (SEQ ID NO: 68), Rluc_sRNA_R01 primer (SEQ ID NO: 69), and PrimeStar GXL DNA Polymerase (TaKaRa) using the sequenced plasmid as a template.
  • the template DNA for in vitro transcription reaction was amplified by 15 seconds, elongation: 68 ° C., 20 seconds)), and purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • Rluc_sRNA_G286A (SEQ ID NO: 73) was obtained by in vitro transcription using AmpliScribe T7 Kit (Epicentre Biotechnologies). After synthesis, Rluc_sRNA_G286A was excised and purified using a 5% polyacrylamide gel containing 8M urea, and used for the subsequent tests.
  • the compounds of Examples 88 to 96 were evaluated, the compounds of Examples 89 and 90 were 2'-deoxyguanosine or 2'-deoxyinosine with respect to G of the nucleoside adjacent to the 5'side of the editing site. However, it showed higher editing activity than the compound of Reference Example 16. In particular, the compound of Example 90 having 2'-deoxyinosine with respect to G of the nucleoside next to the 5'side of the editing site showed the highest activity.
  • the editing activity for Rluc_sRNA in which the nucleoside next to the 5'side of the editing site is A was evaluated for the compounds of Examples 88 to 96.
  • the result is shown in FIG.
  • the compounds of Examples 88 to 96 were evaluated, the compounds of Examples 91 and 93 with thymidine or 2'-deoxyuridine showed high editing activity with respect to A of the nucleoside adjacent to the 5'side of the editing site.
  • rice field In particular, the compound of Example 93 having 2'-deoxyuridine with respect to A of the nucleoside adjacent to the 5'side of the editing site showed the highest activity.
  • the editing activity for Rluc_sRNA in which the nucleoside next to the 5'side of the editing site is G was evaluated for the compounds of Examples 90 and 97. The result is shown in FIG. 21A.
  • RNA target RNA
  • GAN_RNA RNA expression plasmid in which the base sequence next to the 5'side of the editing site is G
  • PCDNA3.1 -
  • Hygro_Rluc_sRNA RNA
  • Hygro_Rluc_sRNA_G286A RNA plasmid whose base sequence next to the 5'side of the editing site is A.
  • the psiCHECK TM -2_Rluc_W104X prepared by the method was used as a template, and the pUC19_Rluc_K41R_W104X_G286A prepared by the conventional method was used as a template for the construction of the AAN_RNA expression plasmid.
  • PCR (30 cycles, denaturation: 98 ° C., 10 seconds, annealing: 55 ° C., 15 seconds) using Rluc_s01_BamF1 primer (SEQ ID NO: 74), RL_s01_G286A_HinR1 primer (SEQ ID NO: 75), and PrimeStar GXL DNA Polymerase (TaKaRa) on the template.
  • Insert DNA was prepared by seconds, elongation: 68 ° C., 20 seconds), and purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • the insert DNA, pcDNA3.1 (-) Hygro was reacted with BamHI (TaKaRa) and HindIII (TaKaRa) at 37 ° C. for 1 hour, and then purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • Inserts The plasmids were added in a molar ratio of 3: 1 and a ligation reaction was performed using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (TaKaRa). The obtained ligation sample was transformed into DH5 ⁇ and cultured overnight at 37 ° C.
  • RNA was extracted from cells cultured in 24-well Plate using RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Reverse transcription reaction was performed using RiverTra Ace (R) qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (TOYOBO), Total RNA 0.5 ⁇ g, and cDNA was amplified. PCR was performed using PrimeStar GXL DNA polymerase (TaKaRa), Rluc_sRNA_F01 primer (SEQ ID NO: 78), and Rluc_sRNA_R01 primer (SEQ ID NO: 79) to amplify the fragment.
  • R qPCR RT Master Mix with gDNA Remover
  • SEQ ID NO: 78 Rluc_sRNA_R01 primer
  • SEQ ID NO: 79 Rluc_sRNA_R01 primer
  • a sequencing reaction was performed using the Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit, 0.165 ⁇ M Rluc_sRNA_F01 primer, and analyzed by the Applied Biosystem 3500 Genetic Analyzer. From the chromatographic chart obtained by sequencing, the editing ratio was calculated from the peak height ratio (G / (G + A)) of the target site.
  • FIG. 22 shows the editing ratio (%) when the compound of Example 97 was used for Rluc_sRNA in which the nucleoside adjacent to the 5'side of the editing site was G.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • a high editing rate of about 5% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • were transfected with a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150 a high editing rate of about 10% to 20% was shown.
  • FIG. 22 shows the editing ratio (%) when the compounds of Examples 98 and 99 were used for Rluc_sRNA in which the nucleoside next to the 5'side of the editing site was A.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • a high editing rate of about 5% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • were transfected with a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150 a high editing rate of about 25% to 35% was shown.
  • Test Example 35 Evaluation of ability to induce editing of A1AT gene sequence in cultured cells of gRNA as an example compound A target RNA expression plasmid expressing the following A1AT gene was constructed, and the compounds of Examples 72 to 74 were used as gRNA. The same method as in (A) and (B) of Test Example 10 was used except that the primer corresponding to the A1AT gene was used, and the method of editing analysis described in Test Example 29 was used for editing analysis. The same method as above was used.
  • the A1AT (also referred to as SERPINA1) gene sequence used here is described in GenBank accession no. It has the base sequences 1129 to 1153 of NM_000295.5, and further c. It has a nucleoside mutation (rs28929474) called 1096G> A.
  • the editing ratio (%) when the compound of Example 136 (AD1_A1AT.39) was used is shown in FIG. 23A.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • a high editing rate of about 20% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound
  • were transfected with a plasmid expressing ADAR1p110 or ADAR1p150 a high editing rate of about 40% to 50% was shown.
  • the compounds of this example have been shown to be capable of repairing mutated A1AT gene sequences.
  • Test Example 36 Evaluation of ability to induce editing of A1AT gene sequence in cultured cells of gRNA, which is an example compound
  • the A1AT (also referred to as SERPINA1) gene sequence used here is GenBank accession no. It has a base sequence of NM_000295.5, and Z-A1AT is further described as c. It has a nucleoside mutation (rs28929474) called 1096G> A.
  • RNA was extracted from HepG2 cells using Sepazole RNA I Super G (Nakarai), treated with Recombinant DNase I (TaKaRa), and then treated with phenol. / Purified by chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • a reverse transcriptase reaction was performed using PrimeScript II Reverse Transcriptase (TaKaRa), Total RNA 0.5 ⁇ g, and 0.25 ⁇ M Oligo (dT) 17, and the cDNA was amplified.
  • PCR (30 cycles, denaturation: 98 ° C., 10 seconds, annealing: 55 ° C., 15 seconds, elongation: 68) using PrimeStar GXL DNA polymerase (TaKaRa), SERPINA1_CDS_XbaF1 primer (SEQ ID NO: 80), SERPINA1_CDS_HinR1 primer (SEQ ID NO: 81).
  • the temperature was 1 minute and 30 seconds), and purification was performed by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to obtain DNA having the CDS sequence of SERPINA1 (SERPINA1_CDS) (SEQ ID NO: 88).
  • pUC19 and the obtained DNA were reacted with XbaI (TaKaRa) and HindIII (TaKaRa) at 37 ° C. for 1 hour, and then purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. Inserts: The plasmids were added in a molar ratio of 3: 1 and a ligation reaction was performed using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (TaKaRa). The obtained ligation sample was transformed into DH5 ⁇ and cultured overnight at 37 ° C. using an LB agar plate. The selected colonies were cultured overnight at 37 ° C.
  • plasmids were extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN).
  • QIAGEN QIAprep Spin Miniprep Kit
  • the obtained plasmid 100 ng was used in a Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit (Thermo Fisher Scientific), a 0.165 ⁇ M pUC19-seqF01 primer (SEQ ID NO: 82) and a 0.165 ⁇ M pUC19_sequR01 primer.
  • a singing reaction was performed, and sequence analysis was performed using an Applied Biosystems 3500 Generic Analyzer (Thermo Fisher Scientific), and it was confirmed that pUC19_SERPINA1 could be synthesized.
  • the 5'side fragment is the SERPINA1_CDS_XbaF1 primer (SEQ ID NO: 80) and the SERPINA1_G1096A_R1 primer (SEQ ID NO: 84), and the 3'side fragment is the SERPINA1_G1096A_F1 primer (SEQ ID NO: 85) and the SERPINA1_CDS_Hin1 primer.
  • 1st PCR was performed by GXL DNA Primerase (TaKaRa).
  • each PCR product is diluted 100-fold and 2nd PCR (30 cycles, denaturation: 98 ° C.) with PrimeStar GXL DNA Polymerase (TaKaRa) using SERPINA1_CDS_XbaF1 primer (SEQ ID NO: 80) and SERPINA1_CDS_HinR1 primer (SEQ ID NO: 81). 10 seconds, annealing: 55 ° C., 15 seconds, elongation: 68 ° C., 1 minute 30 seconds), purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, and DNA having a sequence in which G1096 of SERPINA1 was denatured to A (SERPINA1_G1096A).
  • the obtained DNA and pcDNA3.1 (-) Hygro were reacted with XbaI (TaKaRa) and HindIII (TaKaRa) at 37 ° C. for 1 hour, and then purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • the insert: plasmid was added so as to have a molar ratio of 3: 1, and a ligation reaction was carried out using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (TaKaRa).
  • the obtained ligation sample was transformed into DH5 ⁇ and cultured overnight at 37 ° C. using an LB agar plate. The selected colonies were cultured overnight at 37 ° C.
  • 2nd PCR was performed using PrimeStar GXL DNA polymerase (TaKaRa), SERPINA1-2ndF01 primer (SEQ ID NO: 92), and SERPINA1-2ndR01 primer (SEQ ID NO: 93) to amplify the SERPINA1 fragment.
  • Sequencing reactions were performed using the Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit, 0.165 ⁇ M SERPINA1_editF01 primer (SEQ ID NO: 94), and analyzed by Applied Biosystem 3500 Genetic Analyzer. From the chromatographic chart obtained by sequencing, the editing ratio was calculated from the peak height ratio (G / (G + A)) of the target site.
  • the editing ratio (%) when the compound of Example 136 (AD1_A1AT.39) was used is shown in FIG. 23B.
  • the target RNA (Z-A1AT) expression plasmid and gRNA, which is an example compound were transfected, a high editing rate of about 5% was shown.
  • the target RNA expression plasmid and gRNA which is an example compound were transfected together with the plasmid expressing ADAR1p110, a high editing ratio of about 60% was shown.
  • a high editing rate of about 80% was shown.
  • the compounds of this example have been shown to be capable of repairing mutated A1AT gene sequences.
  • the amount of A1AT secreted in the medium when the compound of Example 136 (AD1_A1AT.39) was used is shown in FIG. 24.
  • a target RNA (Z-A1AT) expression plasmid is transfected with a plasmid expressing ADAR1p110
  • the amount of A1AT secreted into the medium is the amount of A1AT secreted into the medium when a plasmid expressing normal A1AT is transfected. It was about 30% of the amount.
  • the target RNA (Z-A1AT) expression plasmid and the compound of Example 136 were simultaneously transfected together with the plasmid expressing ADAR1p110, the amount of A1AT secreted into the medium was transfected with the plasmid expressing normal A1AT. The amount recovered to the same level as the amount of A1AT secreted into the medium.
  • the amount of A1AT secreted into the medium is the amount of A1AT secreted into the medium when the plasmid expressing normal A1AT is transfected. It was about 30% of the amount of A1AT secreted.
  • the target RNA (Z-A1AT) expression plasmid and the compound of Example 136 are simultaneously transfected together with the plasmid expressing ADAR1p110 and ADAR1p150, the amount of A1AT secreted into the medium transfects the plasmid expressing normal A1AT. When it was infected, it recovered to the same level as the amount of A1AT secreted into the medium.
  • the compound of Example 136 has a mutation of Z-A1AT mRNA in cells, which is normal A1AT mRNA. It is considered that the normal A1AT protein could be secreted from the cells to the level of the normal amount.

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Abstract

細胞内でＡＤＡＲの編集活性を誘導することができ、生体内における安定性に優れるオリゴヌクレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、その５'側に連結する第二オリゴヌクレオチドとを含む。第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基と、３'側の１０－２４残基のオリゴヌクレオチドと、５'側の３－６残基のオリゴヌクレオチドとからなる。第二オリゴヌクレオチドは、３'末端において標的ＲＮＡに対応するヌクレオチド残基が欠失しているか、相補対を形成しないヌクレオチド残基を有し、残基数が２から１０である。標的対応ヌクレオチド残基の３'側は２'－デオキシヌクレオチド残基であり、標的対応ヌクレオチド残基の３'側のオリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチドから３'方向に３番目のヌクレオチド残基が２'－デオキシ－２'－フルオロヌクレオチド残基である。

Description

化学修飾核酸を導入した安定型標的編集ガイドＲＮＡ
　本発明は、化学修飾核酸を導入した安定型標的編集ガイドＲＮＡに関する。
　ゲノム編集技術の開発をきっかけに、生物の設計図である遺伝情報、つまりは細胞内のＤＮＡ情報を改変することで生命現象をコントロールする方法が、疾患治療アプローチとして医療や創薬分野で用いられ始めている。ＤＮＡは細胞内で恒常的且つ不変的な分子であるため、ＤＮＡ改変効果は対象細胞又は対象生物に永続的に残り続ける。一方、ＲＮＡは一過的な遺伝情報分子である。従ってＲＮＡ情報の改変は対象生物に永続的ではない一時的な遺伝情報改変効果を与えることができる。
　ＲＮＡ改変技術として、例えば、国際公開第２０１６／０９７２１２号には、標的ＲＮＡの一部に相補的なアンチセンス配列を含む標的指向性部分と、細胞に存在し、ヌクレオチドの編集を行うことができるＲＮＡ編集実体に結合してリクルートすることができるリクルート部分とを含む、標的ＲＮＡ配列中のヌクレオチドの部位特異的編集のためのオリゴヌクレオチド構築物が記載されている。また例えば、国際公開第２０１７／０１０５５６号には、標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとの複合体に二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を作用させる部位特異的ＲＮＡ変異導入方法が記載されている。またＮａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３７，１３３-１３８（２０１９）には、ＡＤＡＲをリクルートするアンチセンスオリゴヌクレオチドに修飾核酸を導入することが記載されている。
　ＲＮＡ編集活性を有するアデノシンデアミナーゼとして、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２のアイソフォームが知られており、これらは生体内において細胞種特異的に発現していると考えられている。例えば、ＡＤＡＲ１は、ヒトの骨格筋細胞においてほとんど発現していないとされている。一方、ＡＤＡＲ２は、ヒトの骨髄細胞においてほとんど発現していないとされている。また、一般にヒト細胞内ではＡＤＡＲ１の方がより多く発現していると考えられている。
　細胞内でＡＤＡＲ１の編集活性を誘導することができれば、細胞種特異的なＲＮＡ編集が可能になると考えられる。また、ヒトの細胞においてより効率的なＲＮＡ編集が可能になると考えられる。したがって、本発明の一態様は、細胞内でＡＤＡＲ１の編集活性を誘導することができ、生体内における安定性に優れるオリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。
　前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。
（１－１）標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、を含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドは、その３’末端において前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失しているか、前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基を有し、前記第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、少なくともその３’末端以外のヌクレオチド残基が前記標的ＲＮＡと相補的な２本鎖構造を形成し、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－２）前記第二オリゴヌクレオチドの残基数が４から８である（１－１）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－３）前記第二オリゴヌクレオチドの３’末端は、前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失している（１－１）又は（１－２）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－４）前記部位特異的編集は、アデノシンデアミナーゼ１による酵素反応に起因する（１－１）から（１－３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－５）前記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間に、アルキレンオキシ単位を含む連結部を含む（１－１）から（１－４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－６）前記第一オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む（１－１）から（１－５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－７）前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基を含む（１－１）から（１－６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－８）前記カウンタ領域は、ホスホロチオエート結合を含む（１－１）から（１－７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－９）前記標的対応ヌクレオチド残基が、ホスホロチオエート結合を含む（１－１）から（１－８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－１０）前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側及び５’側の各１残基のうち少なくとも１残基は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、又はデオキシヌクレオチド残基である（１－１）から（１－９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－１１）前記第二オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基を含む（１－１）から（１－１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－１２）前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（１－１）から（１－１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－１３）前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチドから３’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基である（１－１２）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－１４）前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、架橋型ヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（１－１）から（１－１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－１５）前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチドから３’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が架橋型ヌクレオチド残基である（１－１４）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－１６）前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（１－１）から（１－１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－１７）前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチドから３’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基である（１－１６）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－１８）前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有する（１－１）から（１－１７）のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－１９）前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（１－１）から（１－１７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－２０）前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（１－１）から（１－１７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－２１）前記第二オリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有する（１－１）から（１－２０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－２２）前記第二オリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（１－１）から（１－２０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－２３）前記第二オリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（１－１）から（１－２０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－２４）前記標的ＲＮＡは、編集標的であるアデノシン残基の５’側にシチジン残基が連結し、前記第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するヌクレオチド残基が塩基としてヒポキサンチン残基を有する（１－１）から（１－２３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－２５）前記標的対応ヌクレオチド残基が、Ｎ－アルキルピリミジンヌクレオチド残基である（１－１）から（１－２４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－２６）前記第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドのそれぞれは、ヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されてなる（１－１）から（１－２５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－２７）（１－１）から（１－２６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有する遺伝性疾患治療剤。
（１－２８）（１－１）から（１－２６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含有する医薬組成物。
（１－２９）遺伝性疾患の予防、又は治療のための（１－２８）に記載の医薬組成物。
（１－３０）前記遺伝性疾患が、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である（１－２９）に記載の医薬組成物。
（１－３１）前記遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である（１－２９）に記載の医薬組成物。
（１－３２）疾患の予防、又は治療のための医薬を製造するための（１－１）から（１－２６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の使用。
（１－３３）疾患の予防、又は治療における使用のための（１－１）から（１－２６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－３４）（１－１）から（１－２６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬理上許容される塩の薬理学的有効量を温血動物に投与することによる疾患の予防、又は治療のための方法。
（１－３５）前記疾患が遺伝性疾患である（１－３４）に記載の方法。
（１－３６）前記遺伝性疾患が、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である（１－３５）に記載の方法。
（１－３７）前記遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である（１－３５）に記載の方法。
（１－３８）前記温血動物がヒトである（１－３４）から（１－３７）のいずれかに記載の方法。
（１－３９）標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドとを連結し、アルキレンオキシ単位を含む連結部とを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、その３’末端において前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失しているか、もしくは前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基を有し、少なくともその３’末端以外のヌクレオチド残基が前記標的ＲＮＡと相補的な２本鎖構造を形成しているか、又は前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有して前記標的ＲＮＡと相補的な２本鎖構造を形成し、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－１）標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、を含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドは、その３’末端において前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失しているか、前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基（以下、第二オリゴヌクレオチドにおける標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基と標的対応ヌクレオチド残基とを併せて「非相補ヌクレオチド残基」ともいう。）を有し、前記第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、少なくともその３’末端以外のヌクレオチド残基が前記標的ＲＮＡと相補的な２本鎖構造を形成し、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域を有し、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するヌクレオチド残基が、２’－デオキシヌクレオチド残基であり、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチドから３’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－２）前記第二オリゴヌクレオチドの残基数が４から８である（２－１）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－３）前記第二オリゴヌクレオチドの３’末端は、前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失している（２－１）又は（２－２）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－４）前記部位特異的編集は、アデノシンデアミナーゼ１による酵素反応に起因する（２－１）から（２－３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－５）前記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間に、アルキレンオキシ単位を含む連結部を含む（２－１）から（２－４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－６）前記第一オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む（２－１）から（２－５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－７）前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基を含む（２－１）から（２－６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－８）前記カウンタ領域は、ホスホロチオエート結合を含む（２－１）から（２－７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－９）前記標的対応ヌクレオチド残基が、ホスホロチオエート結合を含む（２－１）から（２－８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－１０）前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するヌクレオチド残基が、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、又はデオキシヌクレオチド残基である（２－１）から（２－９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－１１）前記第二オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基を含む（２－１）から（２－１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－１２）前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（２－１）から（２－１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－１３）前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、架橋型ヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（２－１）から（２－１２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－１４）前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（２－１）から（２－１３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－１５）前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有する（２－１）から（２－１４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－１６）前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（２－１）から（２－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－１７）前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（２－１）から（２－１６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－１８）前記第二オリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有する（２－１）から（２－１７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－１９）前記第二オリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（２－１）から（２－１８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－２０）前記第二オリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（２－１）から（２－１９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学に許容される塩。
（２－２１）前記標的ＲＮＡは、編集標的であるアデノシン残基の５’側にシチジン残基が連結し、前記第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するヌクレオチド残基が２’－デオキシイノシン残基である（２－１）から（２－２０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－２２）前記標的ＲＮＡは、編集標的であるアデノシン残基の５’側にウリジン残基が連結し、前記第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するヌクレオチド残基が２’－デオキシアデノシン残基である（２－１）から（２－２０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－２３）前記標的ＲＮＡは、編集標的であるアデノシン残基の５’側にアデノシン残基が連結し、前記第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するヌクレオチド残基がチミジン残基又は２’－デオキシウリジン残基である（２－１）から（２－２０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－２４）前記標的ＲＮＡは、編集標的であるアデノシン残基の５’側にグアノシン残基が連結し、前記第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するヌクレオチド残基が２’－デオキシイノシン残基である（２－１）から（２－２０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－２５）前記標的対応ヌクレオチド残基が、Ｎ－アルキルピリミジンヌクレオチド残基又は２’－デオキシシチジン残基である（２－１）から（２－２４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－２６）前記第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドのそれぞれは、ヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されてなる（２－１）から（２－２５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－２７）前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的対応ヌクレオチドから３’方向に数えて１０番目以降のヌクレオチド残基に、架橋型ヌクレオチド残基を有する（２－１）から（２－２６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－２８）前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的対応ヌクレオチドから３’方向に数えて１０番目以降のヌクレオチド残基からなるオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（２－２７）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－２９）前記第二オリゴヌクレオチドは、その３’末端のヌクレオチド残基から５’方向に数えて２番目以降のヌクレオチド残基に、架橋型ヌクレオチド残基を有する（２－１）から（２－２８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－３０）前記第二オリゴヌクレオチドは、その３’末端のヌクレオチド残基から５’方向に数えて２番目以降のヌクレオチド残基からなるオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（２－２９）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－３１）以下の式のいずれかで表される（２－１）から（２－３０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
　Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｇ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９）
　Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ａ＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９）
　Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９）
　Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９）
　Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｌ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．５２）
　Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９ｅ）
　Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９ｅ）
　Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ａ＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９ｅ）
　Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９ｅ）
　Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ））　（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．５２ｅ
　Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．５２ｅ）
　Ａ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ａ＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．５２ｅ）
　Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．５２ｅ）
　Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）　（ＡＤ１＿Ａ１ＡＴ．３９）
　上記式中、大文字はリボヌクレオチド残基、小文字は２’－デオキシリボヌクレオチド残基、Ｎ（Ｍ）は２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチド残基、Ｎ（Ｆ）は２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボヌクレオチド残基、Ｎ（Ｌ）は、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン化リボヌクレオチド残基、Ｎ（Ｅ）は、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン化リボヌクレオチド残基を示し、「＾」はヌクレオシドユニット間が－Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）－で結合していることを示す。
（２－３２）前記オリゴヌクレオチド及びその薬学的に許容される塩は、５’末端又は３’末端において、ＧａｌＮＡｃ、コレステロール及び脂肪酸を含むデリバリー分子がリンカー又はリン酸ジエステル結合（ホスホロチオエート結合を含む）を介して結合している（２－１）から（２－３１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－３３）（２－１）から（２－３２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有し、前記標的ＲＮＡに関連する疾患の治療に用いられる遺伝性疾患治療剤。
（２－３４）（２－１）から（２－３２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含有し、前記標的ＲＮＡに関連する疾患の治療に用いられる医薬組成物。
（２－３５）遺伝性疾患の予防、又は治療のための（２－３４）に記載の医薬組成物。
（２－３６）前記遺伝性疾患が、前記標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である（２－３５）に記載の医薬組成物。
（２－３７）前記遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である（２－３５）に記載の医薬組成物。
（２－３８）前記標的ＲＮＡに関連する疾患の予防、又は治療のための医薬を製造するための（２－１）から（２－３２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の使用。
（２－３９）前記標的ＲＮＡに関連する疾患の予防、又は治療における使用のための（２－１）から（２－３２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－４０）（２－１）から（２－３２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の薬理学的有効量を温血動物に投与することによる前記標的ＲＮＡに関連する疾患の予防、又は治療のための方法。
（２－４１）前記疾患が遺伝性疾患である（２－４０）に記載の方法。
（２－４２）前記遺伝性疾患が、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である（２－４１）に記載の方法。
（２－４３）前記遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である（２－４１）に記載の方法。
（２－４４）前記疾患が、Ｉ型シトルリン血症、血友病（血栓症）、ＡＬＳ、パントテン酸関連神経変性疾患、ホモシスチン尿症、単状分節性糸球体硬化症、α１アンリトリプシン欠損症、フェニルケトン尿症、肥厚性皮膚骨膜症、アレキサンダー病、原発性高シュウ酸尿症、Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群、網膜色素変性症、遠位型ミオパチー及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される少なくとも１つを含む（２－３４）から（２－３７）のいずれかに記載の医薬組成物。
（２－４５）前記疾患が、Ｉ型シトルリン血症、血友病（血栓症）、ＡＬＳ、パントテン酸関連神経変性疾患、ホモシスチン尿症、単状分節性糸球体硬化症、α１アンリトリプシン欠損症、フェニルケトン尿症、肥厚性皮膚骨膜症、アレキサンダー病、原発性高シュウ酸尿症、Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群、網膜色素変性症、遠位型ミオパチー及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される少なくとも１つを含む（２－３８）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の使用。
（２－４６）前記疾患が、Ｉ型シトルリン血症、血友病（血栓症）、ＡＬＳ、パントテン酸関連神経変性疾患、ホモシスチン尿症、単状分節性糸球体硬化症、α１アンリトリプシン欠損症、フェニルケトン尿症、肥厚性皮膚骨膜症、アレキサンダー病、原発性高シュウ酸尿症、Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群、網膜色素変性症、遠位型ミオパチー及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される少なくとも１つを含む（２－３９）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（２－４７）前記疾患が、Ｉ型シトルリン血症、血友病（血栓症）、ＡＬＳ、パントテン酸関連神経変性疾患、ホモシスチン尿症、単状分節性糸球体硬化症、α１アンリトリプシン欠損症、フェニルケトン尿症、肥厚性皮膚骨膜症、アレキサンダー病、原発性高シュウ酸尿症、Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群、網膜色素変性症、遠位型ミオパチー及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される少なくとも１つを含む（２－４０）から（２－４３）のいずれかに記載の方法。
（３－１）以下の式で表され、ヌクレオチド残基間の結合がホスホロチオエート結合を含む２０から４０残基を有し、標的ＲＮＡにおける編集標的であるアデノシン残基をイノシン残基に変換する遺伝子編集に使用されるオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩；
　５’－Ｏ１－Ｏ２－Ｎ１－Ｎ２－Ｎ３－Ｎ４－Ｎ５－Ｏ３－Ｏ４－３’；
[上記式において、Ｎ１は２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、リボヌクレオチド残基、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基又は２’－デオキシリボヌクレオチド残基であり、
　Ｎ２は塩基がシトシン若しくは３-メチルウラシルであるリボヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基又は２’－デオキシリボヌクレオチド残基であり、
　Ｎ３は２’－デオキシリボヌクレオチド残基であり、
　Ｎ４は２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基又は２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基であり、
　Ｎ５は２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基であり、
　Ｏ１は、存在しないか、又は２から１０残基のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つの架橋型ヌクレオチド残基を含み、架橋型ヌクレオチド残基以外は、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基又は２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基であり、
　Ｏ２は、２から１０残基のオリゴヌクレオチドであって、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基及び２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基からなり、
　Ｏ３は、５から２０残基のオリゴヌクレオチドであって、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基及び２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基からなり、
　Ｏ４は、存在しないか、又は２から１０残基のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つの架橋型ヌクレオチド残基を含み、架橋型ヌクレオチド残基以外は、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基又は２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基である］；
　前記オリゴヌクレオチドは、Ｎ２が編集標的であるアデノシン残基に対応し、Ｏ２が３’側から２から５番目の領域において、対応する標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失しているか、対応する標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基を有し、
　前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、Ｎ３の塩基が、編集標的であるアデノシン残基の５’側に隣接する塩基と相補的又は非相補的な塩基であってよく、Ｎ１、Ｎ４、Ｎ５、Ｏ１、Ｏ３及びＯ４の塩基が、標的ＲＮＡの対応するヌクレオチド残基の塩基と完全に相補的であり、
　Ｏ２において、欠失しているヌクレオチド残基及び対応する標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基以外のＯ２の塩基が標的ＲＮＡの対応するヌクレオチド残基の塩基と完全に相補的である。
（３－２）編集標的であるアデノシン残基の５’側のヌクレオチド残基とＮ３とが相補対を形成する場合、Ｎ３は２’－デオキシアデノシン残基、２’－デオキシイノシン残基（但し、編集標的であるアデノシン残基の５’側のヌクレオチド残基がアデノシン残基及びウリジン残基の場合を除く）、チミジン残基又は２’－デオキシウリジン残基（但し、編集標的であるアデノシン残基の５’側のヌクレオチド残基がグアノシン残基の場合を除く）であり、編集標的であるアデノシン残基の５’側のヌクレオチド残基とＮ３が相補対を形成しない場合、Ｎ３は、２’－デオキシイノシン残基である（３－１）に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（３－３）前記標的ＲＮＡにおいて、編集標的であるアデノシン残基の５’側にシチジン残基が連結する場合、Ｎ３は２’－デオキシイノシン残基であり、編集標的であるアデノシン残基の５’側にウリジン残基が連結する場合、Ｎ３は２’－デオキシアデノシン残基であり、編集標的であるアデノシン残基の５’側にアデノシン残基が連結する場合、Ｎ３はチミジン残基又は２’－デオキシウリジン残基であり、編集標的であるアデノシン残基の５’側にグアノシン残基が連結する場合、Ｎ３は２’－デオキシイノシン残基である（３－１）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（３－４）Ｎ１及びＮ４が、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基である（３－１）から（３－３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（３－５）Ｏ２及びＯ３の少なくとも一方が、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に配置されている配列を含む（３－１）から（３－４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（３－６）Ｏ３が２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に配置されている配列からなる（３－１）から（３－５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（３－７）Ｏ１及びＯ４の少なくとも一方は、１、２又は３個の架橋型ヌクレオチド残基を含む（３－１）から（３－６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（３－８）架橋型ヌクレオチド残基同士が隣接しないように配置されていることを特徴とする（３－７）に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（３－９）Ｏ１及びＯ４の少なくとも一方は、架橋型ヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に配置されている配列を含む（３－１）から（３－８）に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（３－１０）前記架橋型ヌクレオチド残基が、Ｄ－リボフラノースにおいて２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋されたヌクレオチド（ＬＮＡ）残基又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋されたヌクレオチド（ＥＮＡ）残基である（３－１）から（３－９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（３－１１）Ｎ２は、塩基がシトシンであって、リボヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基又は２’－デオキシリボヌクレオチド残基である（３－１）から（３－１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（３－１２）ヌクレオチド残基間の結合が全てホスホロチオエート結合である（３－１）から（３－１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（３－１３）配列番号５１、５４、６１、６２又は６３の塩基配列（但し、塩基配列中のＵはＴに置換されてもよい）を含む（３－１）から（３－１２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（３－１４）以下に記載の式のいずれかで表される（３－１）に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
　Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｇ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９）　
　Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ａ＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９）
　Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９）
　Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９）
　Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｌ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．５２）
　Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９ｅ）
　Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９ｅ）
　Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ａ＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９ｅ）
　Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９ｅ）
　Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．５２ｅ）
　Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．５２ｅ）
　Ａ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ａ＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．５２ｅ）
　Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．５２ｅ）
　Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）　（ＡＤ１＿Ａ１ＡＴ．３９）
［式中、大文字はリボヌクレオチド残基（ＲＮＡ）、小文字は２’－デオキシヌクレオチド残基（ＤＮＡ）、Ｎ（Ｍ）はＤ－リボフラノースが２’－Ｏ－メチル化されたリボヌクレオチド残基（２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチド残基）、Ｎ（Ｆ）はＤ－リボフラノースの２’－デオキシ－２’－フルオロ化されたリボヌクレオチド残基（２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基）、Ｎ（Ｌ）は、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン化されたリボヌクレオチド残基、Ｎ（Ｅ）は、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン化されたリボヌクレオチド残基を示し、「＾」はヌクレオシドユニット間が－Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）－で結合していることを示す。］
（３－１５）オリゴヌクレオチド及びその薬学的に許容される塩は、５’末端又は３’末端において、ＧａｌＮＡｃ、コレステロール及び脂肪酸を含むデリバリー分子がリンカー又はリン酸ジエステル結合（ホスホロチオエート結合を含む）を介して結合している（３－１）から（３－１４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（３－１６）（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
（３－１７）（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩を有効成分とする１塩基編集誘導剤。
（３－１８）標的ＲＮＡ中のアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより予防又は治療され得る疾患を予防、又は治療するための（３－１６）に記載の医薬組成物。
（３－１９）前記疾患が遺伝性疾患である（３－１８）に記載の医薬組成物
（３－２０）前記疾患が、Ｉ型シトルリン血症、血友病（血栓症）、ＡＬＳ、パントテン酸関連神経変性疾患、ホモシスチン尿症、単状分節性糸球体硬化症、α１アンリトリプシン欠損症、フェニルケトン尿症、肥厚性皮膚骨膜症、アレキサンダー病、原発性高シュウ酸尿症、Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群、網膜色素変性症、遠位型ミオパチー及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される少なくとも１つを含む（３－１９）に記載の医薬組成物。
（３－２１）（３－１３）又は（３－１４）に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
（３－２２）（３－１３）又は（３－１４）に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩を有効成分とする１塩基編集誘導剤。
（３－２３）標的ＲＮＡ中のアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより予防又は治療され得る疾患を予防、又は治療するための（３－２１）に記載の医薬組成物。
（３－２４）前記疾患が遺伝性疾患である（３－２３）に記載の医薬組成物

（３－２１）（３－１３）又は（３－１４）に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
（３－２２）（３－１３）又は（３－１４）に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩を有効成分とする１塩基編集誘導剤。
（３－２３）標的ＲＮＡ中のアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより予防又は治療され得る疾患を予防、又は治療するための（３－２１）に記載の医薬組成物。
（３－２４）前記疾患が遺伝性疾患である（３－２３）に記載の医薬組成物
（４－１）標的ＲＮＡが、ＡＳＳ１遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＡＳＳ１　ｍＲＮＡの１５２４番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＡＳＳ１　ｍＲＮＡの１５００から１５４０番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－２）標的ＲＮＡが、Ｆ５遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＦ５　ｍＲＮＡの１６９６番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がｍＲＮＡの１６７２番から１７１２番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－３）標的ＲＮＡが、ＧＲＩＡ２遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＧＲＩＡ２　ｍＲＮＡの２１３５番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＧＲＩＡ２　ｍＲＮＡの２１１１番から２１５１番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
　（４－４）標的ＲＮＡが、ＰＡＮＫ２遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＰＡＮＫ２　ｍＲＮＡの１７２８番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＰＡＮＫ２　ｍＲＮＡの１７０４番から１７４４番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－５）標的ＲＮＡが、ＣＢＳ遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＣＢＳ　ｍＲＮＡの１５７５番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＣＢＳ　ｍＲＮＡの１５５１番から１５９１番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－６）標的ＲＮＡが、ＮＰＨＳ２遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＮＰＨＳ２　ｍＲＮＡの４９７番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＮＰＨＳ２　ｍＲＮＡの４７３番から５１３番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－７）標的ＲＮＡが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＳＥＲＰＩＮＡ１　ｍＲＮＡの１１４３番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＳＥＲＰＩＮＡ１　ｍＲＮＡの１１１９番から１１５９番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－８）標的ＲＮＡが、ＰＡＨ遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＰＡＨ　ｍＲＮＡの８９６番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＰＡＨ　ｍＲＮＡの８７２番から９１２番目に含まれる連続する２０～４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－９）標的ＲＮＡが、ＳＬＣＯ２Ａ１遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡであり、編集標的はＳＬＣＯ２Ａ１　ｐｒｅ－ｍＲＮＡの８１０３４番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＳＬＣＯ２Ａ１　ｐｒｅ－ｍＲＮＡの８１０１０番から８１０５０番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－１０）標的ＲＮＡが、ＧＦＡＰ遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＧＦＡＰ　ｍＲＮＡの２１６８番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＧＦＡＰ　ｍＲＮＡの２１４４番から２１８４番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－１１）標的ＲＮＡが、ＡＧＸＴ遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＡＧＸＴ　ｍＲＮＡの５５０番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＡＧＸＴ　ｍＲＮＡの５２６番から５６６番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－１２）標的ＲＮＡが、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＵＧＴ１Ａ１　ｍＲＮＡの２２９番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＵＧＴ１Ａ１　ｍＲＮＡの２０５番から２４５番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－１３）標的ＲＮＡが、ＥＹＳ遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＥＹＳ　ｍＲＮＡの８４７８番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＥＹＳ　ｍＲＮＡの８４５４番から８４９４番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－１４）標的ＲＮＡが、ＧＮＥ遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＧＮＥ　ｍＲＮＡの９２４番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＧＮＥ　ｍＲＮＡの９００番から９４０番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（４－１５）標的ＲＮＡが、ＨＦＥ遺伝子のｍＲＮＡであり、編集標的はＨＦＥ　ｍＲＮＡの１００５番目のヌクレオチドであり、非相補ヌクレオチド及びＮ３を除くヌクレオチド配列がＨＦＥ　ｍＲＮＡの９８１番から１０２１番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的である、（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
　本発明の一態様によれば、細胞内でＡＤＡＲ１の編集活性を誘導することができ、生体内における安定性に優れるオリゴヌクレオチドを提供することができる。
細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ編集による発光強度変化を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ編集による発光強度変化を示すグラフである。 細胞内における内在性ＡＤＡＲに由来するオリゴヌクレオチドのＲＮＡ編集による発光強度変化を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるｈＧＡＰＤＨに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるｈＧＡＰＤＨに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるｈＧＡＰＤＨに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるｈＧＡＰＤＨに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるｈＧＡＰＤＨに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内における内在性ＡＤＡＲに由来するオリゴヌクレオチドのｈＧＡＰＤＨに対する編集割合を示すグラフである。 オリゴヌクレオチドによる疾患由来配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるｈＧＡＰＤＨに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるｈＧＡＰＤＨに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるｈＧＡＰＤＨに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるｈＧＡＰＤＨに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるｈＧＡＰＤＨに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによるｈＧＡＰＤＨに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列を有するモデル標的ＲＮＡに対するＡＤＡＲ１存在下での編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列を有するモデル標的ＲＮＡに対するＡＤＡＲ２存在下での編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＡＳＳ１遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＰＡＮＫ２遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＮＰＨＳ２遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＧＲＩＡ２遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＰＡＨ．２遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＡＳＳ１遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＰＡＮＫ２遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＮＰＨＳ２遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＡＳＳ１遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＰＡＮＫ２遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＮＰＨＳ２遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＧＲＩＡ２遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる編集標的の５’側にグアノシン残基を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる編集標的の５’側にアデノシン残基を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる編集標的の５’側にグアノシン残基を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる編集標的の５’側にアデノシン残基を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる編集標的の５’側にグアノシン残基又はアデノシン残基を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＡ１ＡＴ遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＡ１ＡＴ遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。 細胞内におけるオリゴヌクレオチドによる疾患由来配列であるＡ１ＡＴ遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する修復を示すグラフである。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。さらに本明細書に記載される数値範囲の上限及び下限は、数値範囲として例示された数値をそれぞれ任意に選択して組み合わせることが可能である。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、オリゴヌクレオチド、医薬組成物及び疾患の予防又は治療のための方法を例示するものであって、本発明は、以下に示すオリゴヌクレオチド、医薬組成物及び疾患の予防又は治療のための方法に限定されない。
標的編集ガイドＲＮＡ
　標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド（以下、標的編集ガイドＲＮＡ；ｇＲＮＡともいう）は、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、を含む。第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなっていてよい。第二オリゴヌクレオチドは、その３’末端において前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失しているか、前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基を有していてよい。また第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、少なくともその３’末端以外のヌクレオチド残基が前記標的ＲＮＡと相補的な２本鎖構造を形成してよい。標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であってよい。
　標的編集ガイドＲＮＡを構成する第二オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの１つのヌクレオチド残基が相補対を形成せず、そのヌクレオチド残基以外に対応するヌクレオチド残基が標的ＲＮＡと相補的な２本鎖構造を形成する塩基配列を有する。すなわち、第二オリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡと不完全な２本鎖構造を形成する塩基配列を有する。このような特徴的な塩基配列を有する短鎖の第二オリゴヌクレオチドを、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドの５’側に有する標的編集ガイドＲＮＡは、細胞内でＡＤＡＲ１の編集活性を優先的に誘導することができる。これは例えば、相補対を形成しないヌクレオチド残基の存在が、ＡＤＡＲ１のリクルートに対しては有利に働くためと考えることができる。また、カウンタ領域に天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基を含むことで生体内における安定性に優れる。
　一態様において、標的編集オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、を含む。第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなっていてよい。第二オリゴヌクレオチドは、その３’末端において前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失しているか、標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基を有してよい。第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、少なくともその３’末端以外のヌクレオチド残基が標的ＲＮＡと相補的な２本鎖構造を形成してよい。標的編集オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するヌクレオチド残基が、２’－デオキシヌクレオチド残基であってよく、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチドから３’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基であってよい。
　標的編集オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に２’－デオキシヌクレオチド残基を有し、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチドから３’方向に数えて３番目に２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基を有することで、生体内における安定性に優れ、細胞内でＡＤＡＲの編集活性をより効果的に誘導することができる。
　一態様において、標的編集オリゴヌクレオチドは、以下の式（Ｉ）で表され、ヌクレオチド残基間の結合がホスホロチオエート結合を含む２０から４０残基を有するオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩であってよい。標的編集オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは２０から３０残基、より好ましくは２１，２２，２３，２４，２５，２６、２７又は２８残基であってよい。また、ヌクレオチド残基間の結合は、好ましくはすべてホスホロチオエート結合であってよい。標的編集オリゴヌクレオチドは、例えば、標的ＲＮＡにおける編集標的であるアデノシン残基をイノシン残基に変換する遺伝子編集に使用されてよい。
　５’－Ｏ１－Ｏ２－Ｎ１－Ｎ２－Ｎ３－Ｎ４－Ｎ５－Ｏ３－Ｏ４－３’　　（Ｉ）
　上記式（Ｉ）において、Ｎ１は２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、リボヌクレオチド残基、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基又は２’－デオキシリボヌクレオチド残基であってよく、好ましくは２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、リボヌクレオチド残基又は２’－デオキシリボヌクレオチド残基であってよい。Ｎ２は塩基がシトシン若しくは３-メチルウラシルであるリボヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基又は２’－デオキシリボヌクレオチド残基であってよい。Ｎ３は２’－デオキシリボヌクレオチド残基であってよい。Ｎ４は２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基又は２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基であってよい。Ｎ５は２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基であってよい。
　Ｏ１は、存在しないか、又は２から１０残基のオリゴヌクレオチドであってよい。Ｏ１は、少なくとも１つの架橋型ヌクレオチド残基を含み、架橋型ヌクレオチド残基以外は、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基又は２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基であってよい。Ｏ２は、２から１０残基のオリゴヌクレオチドであって、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基及び２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基からなっていてよい。Ｏ２は、好ましくは３，４，５，６，７又は８残基、より好ましくは３又は４残基のオリゴヌクレオチドであって、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基及び２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基からなっていてよい。Ｏ３は、５から２０残基のオリゴヌクレオチドであって、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基及び２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基からなっていてよい。Ｏ３は、好ましくは５，６，７，８，９、１０、１１，１２，１３又は１４残基、より好ましくは６又は７残基のオリゴヌクレオチドであって、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基及び２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基からなっていてよい。Ｏ４は、存在しないか、又は２から１０残基のオリゴヌクレオチドであってよく、好ましくは２，３，４，５，６、７又は８残基、より好ましくは４又は５残基のオリゴヌクレオチドであってよい。Ｏ４は、少なくとも１つの架橋型ヌクレオチド残基を含み、架橋型ヌクレオチド残基以外は、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基又は２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基であってよい。
　Ｏ２及びＯ３の少なくとも一方は、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に配置されている配列を含んでいてよく、好ましくは、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に配置されている配列からなる。Ｏ２において、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基との連結の繰り返し数は、例えば１以上３以下であってよく、好ましくは１又は２であってよい。Ｏ３において、２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基との連結の繰り返し数は、例えば１以上１０以下であってよく、好ましくは２以上６以下であってよく、より好ましくは３又は４であってよい。２’－デオキシリボヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列は、２’－デオキシリボヌクレオチド残基から３’方向に交互に連結していてもよいし、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基から３’方向に交互に連結していてもよい。Ｏ１及びＯ４の少なくとも一方は、１、２又は３個の架橋型ヌクレオチド残基を含んでいてよく、この場合、架橋型ヌクレオチド残基同士が隣接しないように配置されていてよい。Ｏ１及びＯ４の少なくとも一方は、架橋型ヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に配置されている配列を含んでいてよい。Ｏ１及びＯ４において、架橋型ヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基との連結の繰り返し数は、例えば１以上３以下であってよく、好ましくは２であってよい。２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基から３’方向に交互に連結していてもよいし、架橋型ヌクレオチド残基から３’方向に交互に連結していてもよい。
　Ｎ１及びＮ４は、好ましくは２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基であってよい。また、Ｎ２は、好ましくは塩基がシトシンであって、リボヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基又は２’－デオキシリボヌクレオチド残基であってよい。
　標的編集オリゴヌクレオチドは、Ｎ２が編集標的であるアデノシン残基に対応し、Ｏ２が３’側から２から５番目の領域において、対応する標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失しているか、対応する標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基を有していてよい。
　標的編集オリゴヌクレオチドの塩基配列は、Ｎ３の塩基が、編集標的であるアデノシン残基の５’側に隣接する塩基と相補的又は非相補的な塩基であってよい。Ｎ１、Ｎ４、Ｎ５、Ｏ１、Ｏ３及びＯ４の塩基は、標的ＲＮＡの対応するヌクレオチド残基の塩基と完全に相補的であってよい。Ｏ２において、欠失しているヌクレオチド残基及び対応する標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基以外のＯ２の塩基が標的ＲＮＡの対応するヌクレオチド残基の塩基と完全に相補的であってよい。
　式（Ｉ）で表される標的編集オリゴヌクレオチドは、編集標的であるアデノシン残基の５’側のヌクレオチド残基とＮ３とが相補対を形成する場合、Ｎ３は２’－デオキシアデノシン残基、２’－デオキシイノシン残基（但し、編集標的であるアデノシン残基の５’側のヌクレオチド残基がアデノシン残基及びウリジン残基の場合を除く）、チミジン残基又は２’－デオキシウリジン残基（但し、編集標的であるアデノシン残基の５’側のヌクレオチド残基がグアノシン残基の場合を除く）であってよい。また、編集標的であるアデノシン残基の５’側のヌクレオチド残基とＮ３が相補対を形成しない場合、Ｎ３は、２’－デオキシイノシン残基であってよい。
　標的編集オリゴヌクレオチドは、式（Ｉ）で表される構造を有していることで、生体内における安定性に優れ、細胞内でＡＤＡＲの編集活性をより効果的に誘導することができる。
　本実施形態の標的編集ガイドＲＮＡにおいては、従来型の標的編集ガイドＲＮＡと比較して長さが短い分、単純に製造コストが削減される。また、化学合成が容易になり、核酸医薬品開発等で用いられる既存の人工核酸等の修飾ヌクレオチドを標的編集ガイドＲＮＡに適用することが容易になる。これにより、細胞内分解耐性の向上、細胞導入効率の向上等により、更なる高機能な標的編集ガイドＲＮＡを提供することが可能になる。さらに標的編集ガイドＲＮＡが編集誘導に必要な最小限残基数で構成されることで、標的ＲＮＡに対する特異性を維持しつつ、編集標的であるアデノシン残基以外の位置におけるオフターゲット編集を抑制することができる。
　標的編集ガイドＲＮＡは、例えば、標的編集を触媒するＡＤＡＲのうちＡＤＡＲ１を優先的に標的ＲＮＡにリクルートすることで、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導する。ＡＤＡＲは二本鎖ＲＮＡ中のアデノシン残基を加水分解的脱アミノ化反応によりイノシン残基に変換する酵素であり、哺乳動物の細胞に広く存在する。イノシン残基は構造がグアノシン残基と類似しているため、ＲＮＡ情報の翻訳時にはグアノシン残基として翻訳され、その結果としてＲＮＡ情報が編集される。アミノ酸をコードしている部分にこのようなＲＮＡ編集が生じると、ゲノム上にＤＮＡ変異がないにも関わらずアミノ酸置換等が生じ、標的遺伝子の機能を制御できる。
　標的編集ガイドＲＮＡは、哺乳動物の細胞に導入されると、細胞中に存在するＡＤＡＲ１を優先的に標的ＲＮＡにリクルートして、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導することができる。
　本実施形態の標的編集ガイドＲＮＡは、細胞内でＡＤＡＲ１優先的に編集活性を誘導することができる。ＡＤＡＲ１優先的とは、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいては、ＡＤＡＲ１に対する編集誘導活性のＡＤＡＲ２に対する編集誘導活性に対する比が１を超えることを意味し、好ましくは１．５以上、２以上又は５以上であることを意味する。なお、細胞内におけるＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２に対する編集誘導活性は、同一の発現ベクターを用いて構築したＡＤＡＲ１発現プラスミドとＡＤＡＲ２発現プラスミドとを用いて、細胞内に同一条件でトランスフェクションして発現させた場合に、同一の標的編集部位に対する編集誘導効率がＡＤＡＲ１の方が高い場合を言う。
　標的編集ガイドＲＮＡが含む第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを特定する。標的ＲＮＡは、編集対象となるアデノシン残基を含むものであれば、特に制限はなく、細胞性ＲＮＡ、ウイルス性ＲＮＡのいずれもよく、通常はタンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む）又はｍＲＮＡである。標的ＲＮＡにおける編集部位は、非翻訳領域、スプライス領域、エクソン、イントロン、又はＲＮＡの安定性、構造もしくは機能に影響するいずれの領域に存在してもよい。また標的ＲＮＡは、修正又は変更すべき変異を含むものであってもよい。あるいは標的ＲＮＡはその配列が、天然型とは異なる表現型をコードするように変異されたものであってもよい。
　標的ＲＮＡは、タンパク質をコードするＲＮＡであることが好ましい。コードされるタンパク質として具体的には、セロトニン受容体、グルタミン酸受容体、膜電位依存型カリウムチャネル、ＳＴＡＴ３、ＮＦｋＢＩＡ、ＭＡＰＫ１４等のシグナル伝達に関わるリン酸化タンパク質などを挙げることができる。
　標的編集ガイドＲＮＡは、例えば遺伝性疾患の治療に適用することができる。遺伝性疾患は、例えば、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患であってよい。また遺伝性疾患は、例えば、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患であってよい。遺伝性疾患としては、例えば、嚢胞性線維症、白皮症、α－１アンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、ジストロフィー表皮水疱症、Ｅｐｉｄｅｒｍｙｌｏｓｉｓ水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連する障害、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、血友病、遺伝性ヘマクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュニャン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張型ジストロフィー型Ｉ及びＩＩ、神経線維腫症、ニーマン－ピック病Ａ、Ｂ及びＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連膵臓癌、パーキンソン病、ポイツ－ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性毛様体病、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異のようなプロトロンビン変異関連疾患、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホッフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、癌の様々な形態（例えばＢＲＣＡ１及び２関連乳癌、卵巣癌等）などが挙げられる。
　遺伝性疾患の具体例としては、Ｉ型シトルリン血症（ＡＳＳ１）、ＩＩ型シトルリン血症（ＳＬＣ２５Ａ１３）、血友病（Ｆａｃｔｏｒ　Ｖ　Ｌｅｉｄｅｎ）、原発性高シュウ酸尿症（ＡＧＸＴ）、遠位型ミオパチー（ＧＮＥ）、嚢胞性線維症：ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ（ＣＦＣＦＴＲ）、ホモシスチン尿症（ＣＢＳ）、Ｈｕｒｌｅｒ症候群：ムコ多糖症（ＩＤＵＡ（ＳＬＣ２６Ａ１））、アレキサンダー病（ＧＦＡＰ）、網膜色素変性症（ＥＹＳ）、フェニルケトン尿症（ＰＡＨ）、ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）、ギルバート症候群（ＵＧＴ１Ａ１）などを挙げることができる。なお、括弧内は標的遺伝子名である。
　遺伝性疾患の治療に適用される標的編集ガイドＲＮＡは、例えば、配列番号４９から５５及び配列番号６０から６３からなる群から選択されるいずれかの塩基配列を含んでいてよく、好ましくは配列番号５１、５４、６１、６２及び６３からなる群から選択されるいずれかの塩基配列を含んでいてよい。なお、標的編集ガイドＲＮＡは、配列番号で特定される塩基配列中、ＵがＴに置換された塩基配列を含んでいてもよい。
　Ｉ型シトルリン血症の原因となるＡＳＳ１遺伝子のｃ．１１６８Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ１２１９０８６４１）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　１（ＡＳＳ１），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１，ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：　　ＮＭ＿００００５０．４）の１５２４番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＡＳＳ１　ｍＲＮＡの１５００から１５４０番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、１５０４番から１５３４番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは１５１０番から１５３４番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　血友病(血栓症）の原因となるＦａｃｔｏｒ　Ｖ遺伝子のｃ．１６０１Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ６０２５）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　Ｖ　（Ｆ５），ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿０００１３０．５）の１６９６番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該Ｆ５　ｍＲＮＡの１６７２番から１７１２番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、１６７６番から１７０６番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは１６８２番から１７０６番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　ＧＲＩＡ２遺伝子の転写後修飾の異常は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の原因となりうる。Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ＡＭＰＡ　ｔｙｐｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　２　（ＧＲＩＡ２），　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１，ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ｎｍ＿０００８２６．４）の２１３５番目のアデノシンにおけるＡ－ｔｏ－Ｉ　ＲＮＡ編集の異常が当該転写後修飾の異常に該当しうる。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＧＲＩＡ２　ｍＲＮＡの２１１１番から２１５１番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、２１１５番から２１４５番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは２１２１番から２１４５番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　パントテン酸関連神経変性疾患の原因となるＰＡＮＫ２遺伝子のｃ．１５６１Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ１３７８５２９５９）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ　２　（ＰＡＮＫ２），　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１，　ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿１５３６３８．３）上のＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＰＡＮＫ２　ｍＲＮＡの１７０４番から１７４４番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、１７０８番から１７３８番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは１７１４番から１７３８番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　ホモシスチン尿症の原因となるＣＢＳ遺伝子のｃ．１３３０Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ２８９３４８９１）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ　（ＣＢＳ），　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１，　ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿００００７１．２）の１５７５番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＣＢＳ　ｍＲＮＡの１５５１番から１５９１番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、１５５５番から１５８５番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは１５６１番から１５８５番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　単状分節性糸球体硬化症の原因となるＮＰＨＳ２遺伝子のｃ．４１３Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ７４３１５３４２）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＮＰＨＳ２　ｓｔｏｍａｔｉｎ　ｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒ，　ｐｏｄｏｃｉｎ　（ＮＰＨＳ２），　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１，　ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿０１４６２５．４）の４９７番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＮＰＨＳ２　ｍＲＮＡの４７３番から５１３番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、４７７番から５０７番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは４８３番から５０７番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　α１アンリトリプシン欠損症の原因となるＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のｃ．１０９６Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ２８９２９４７４）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｓｅｒｐｉｎ　ｆａｍｉｌｙ　Ａ　ｍｅｍｂｅｒ　１　（ＳＥＲＰＩＮＡ１），　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１，　ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿０００２９５．５）の１１４３番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＳＥＲＰＩＮＡ１　ｍＲＮＡの１１１９番から１１５９番目に含まれる連続する２０～４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、１１２３番から１１５３番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは１１２９番から１１５３番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　フェニルケトン尿症の原因となるＰＡＨ遺伝子のｃ．７８２Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ５０３０８４９）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　（ＰＡＨ），　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１，　ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿０００２７７．３）の８９６番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＰＡＨ　ｍＲＮＡの８７２番から９１２番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、８７６番から９０６番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは８８２番から９０６番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　肥厚性皮膚骨膜症の原因となるＳＬＣＯ２Ａ１遺伝子のｃ．９４０＋１Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ７６５２４９２３８）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｓｏｌｕｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒ　２Ａ１　（ＳＬＣＯ２Ａ１），ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿００５６３０．３）のｐｒｅ－ｍＲＮＡ上の８１０３４番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である（編集標的は、３番染色体の１３３９４８８９２番目の（－）鎖上に位置する）。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＳＬＣＯ２Ａ１　ｐｒｅ－ｍＲＮＡの８１０１０番から８１０５０番目に含まれる連続する２０～４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、８１０１４番から８１０４４番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは８１０２０番から８１０４４番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　アレキサンダー病の原因となるＧＦＡＰ遺伝子のｃ．７１６Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ５９５６５９５０）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＧＦＡＰ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１，ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿００２０５５．５）の２１６８番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＧＦＡＰ　ｍＲＮＡの２１４４番から２１８４番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、２１４８番から２１７８番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは２１５４番から２１７８番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　原発性高シュウ酸尿症の原因となるＡＧＸＴ遺伝子のｃ．５０８Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ１２１９０８５２９）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ａｌａｎｉｎｅ――ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ　ａｎｄ　ｓｅｒｉｎｅ――ｐｙｒｕｖａｔｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　（ＡＧＸＴ），ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿００００３０．３）の５５０番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＡＧＸＴ　ｍＲＮＡの５２６番から５６６番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、５３０番から５６０番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは５３６番から５６０番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群の原因となるＵＧＴ１Ａ１遺伝子のｃ．２１１Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ４１４８３２３）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＵＤＰ　ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　１　ｍｅｍｂｅｒ　Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１），ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿０００４６３．３）の２２９番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＵＧＴ１Ａ１　ｍＲＮＡの２０５番から２４５番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、２０９番から２３９番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは２１５番から２３９番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　網膜色素変性症の原因となるＥＹＳ遺伝子のｃ．７９１９Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ５２７２３６０６６）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｅｙｅｓ　ｓｈｕｔ　ｈｏｍｏｌｏｇ　（ＥＹＳ），　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１，ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿００１１４２８００．２）の８４７８番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＥＹＳ　ｍＲＮＡの８４５４番から８４９４番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、８４５８番から８４８８番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは８４６４番から８４８８番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　遠位型ミオパチーの原因となるＧＮＥ遺伝子のｃ．７９７Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ１２１９０８６２２）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ　（ＵＤＰ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ）－２－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ／Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　（ＧＮＥ），　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１，ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿００１１２８２２７．３）の９２４番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＧＮＥ　ｍＲＮＡの９００番から９４０番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、９０４番から９３４番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは９１０番から９３４番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　ヘモクロマトーシスの原因となるＨＦＥ遺伝子のｃ．８４５Ｇ＞Ａ変異（ｒｓ１８００５６２）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ　ｉｒｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　（ＨＦＥ），　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　１，　ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：ＮＭ＿０００４１０．３）の１００５番目のヌクレオチドのＧからＡへの変異である。一態様において、オリゴヌクレオチドは、当該アデノシン残基を標的とする。例えば、一態様において、オリゴヌクレオチドは、非相補ヌクレオチド残基およびＮ３を除くヌクレオチド配列が当該ＨＦＥ　ｍＲＮＡの９８１番から１０２１番目に含まれる連続する２０から４０塩基の領域と完全に相補的であってよく、好ましくは、９８５番から１０１５番目に含まれる連続する２０から２９塩基の領域と、より好ましくは９９１番から１０１５番目に含まれる連続する２０から２５塩基の領域と完全に相補的であってよい。
　第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中の編集標的となるアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する１０から２４残基の３’側オリゴヌクレオチドと、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する３から６残基の５’側オリゴヌクレオチドとからなる。標的対応ヌクレオチド残基の３’側と５’側にそれぞれ連結するオリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡと二本鎖構造を形成して、全体として相補鎖（以下、第一相補鎖ともいう）を形成することで、標的ＲＮＡ及び標的ＲＮＡにおける編集標的部位が特定される。ここで、本明細書において相補的な塩基配列には、ワトソン－クリック型の塩基対を形成する塩基配列に加えて、例えば、Ｇ－Ｕ塩基対等の熱力学的に安定な非ワトソン－クリック型のゆらぎ塩基対を形成する塩基配列が含まれる。第一相補鎖を形成する塩基対は、標的対応ヌクレオチド残基を除いたすべてがワトソン－クリック型の塩基対であってもよく、少なくとも一部がゆらぎ塩基対であってもよい。第一相補鎖がゆらぎ塩基対を含む場合、その数は１又は２であってよい。以下、標的対応ヌクレオチド残基と、その５’側の１残基と、３’側の１残基の３残基からなる領域を便宜上、カウンタ領域と称し、第一オリゴヌクレオチドのカウンタ領域以外を非カウンタ領域と称することがある。
　一態様において、第一オリゴヌクレオチドにおける標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結する１０から２４残基の３’側オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側の１番目のヌクレオチド残基が、標的ＲＮＡの対応するヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基であり、それ以外のヌクレオチド残基が標的ＲＮＡの対応するヌクレオチド残基と相補対を形成して、標的ＲＮＡと二本鎖構造を形成してよい。具体的には、例えば標的ＲＮＡの編集標的であるアデノシン残基の５’側にグアノシン残基が連結している場合、標的対応ヌクレオチド残基の３’側の１番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシイノシン残基であってよい。
　標的対応ヌクレオチド残基は、編集標的となるアデノシン残基に対応するヌクレオチド残基であり、例えばシチジン残基、グアノシン残基、アデノシン残基又はそれらの誘導体である。標的対応ヌクレオチド残基は、好ましくは編集標的となるアデノシン残基と塩基対を形成しない塩基であり、より好ましくはシチジン残基又はその誘導体であり、さらに好ましくはシチジン残基である。一態様において、標的対応ヌクレオチド残基は、Ｎ－アルキルピリミジンヌクレオチド残基であってよく、好ましくはＮ－アルキルシチジン残基、Ｎ－アルキル－２’－デオキシシチジン残基、Ｎ－アルキルウリジン残基又はＮ－アルキルデオキシウリジン残基であってよい。Ｎ－アルキルピリミジンヌクレオチド残基におけるアルキル基は、炭素数が１から６又は１から４のアルキル基であってよく、好ましくはメチル基又はエチル基であってよい。標的対応ヌクレオチド残基が、Ｎ－アルキルピリミジンヌクレオチド残基であることで、編集誘導活性が向上する場合がある。また、Ｎ－アルキルピリミジンヌクレオチド残基は、糖部分及びリン酸エステル結合部分の少なくとも一方が更に修飾されていてもよい。糖部分及びリン酸エステル結合部分の修飾については後述する。
　一態様において、標的対応ヌクレオチド残基は、２’－デオキシシチジン残基であってよい。２’－デオキシシチジン残基は、リン酸エステル結合部分が更に修飾されていてもよい。
　第一オリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの残基数は、１０以上２４以下であってよく、好ましくは１１以上、１２以上又は１３以上であり、また好ましくは２２以下、２０以下、１８以下、１６以下又は１５以下である。一態様において標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの残基数は１２以上２０以下、１２以上１８以下、１２以上１６以下、１４以上１８以下、又は１４以上１６以下であってよい。また、一態様において標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの残基数は１４であってよい。残基数が前記範囲であると、ＡＤＡＲ１に対する選択性がより向上する傾向がある。
　第一オリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結する３’側オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに対してミスマッチ塩基対を含まない相補的な塩基配列を有していてよい。その場合、標的ＲＮＡは編集標的となるアデノシン残基の５’側にグアノシン残基が連結していないことが好ましい。すなわち、標的ＲＮＡの編集標的であるアデノシン残基の５’側に連結する塩基が、アデノシン残基、シチジン残基又はウリジン残基である場合、第一オリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに対してミスマッチ塩基対を含まない相補的な塩基配列を有することが好ましい。
　第一オリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結する３’側オリゴヌクレオチドは、場合により、標的ＲＮＡの塩基配列に対して非相補的な塩基を含んでいてもよい。例えば、編集標的となるアデノシン残基の５’側にグアノシン残基が連結する標的ＲＮＡでは、編集誘導活性が低下する場合がある。その場合であっても、第一オリゴヌクレオチドが、そのグアノシン残基に対して非相補的な塩基を含む塩基配列を有することで編集誘導活性を向上させることができる。そのグアノシン残基に対して非相補的な塩基は、例えばグアノシン残基であってよい。すなわち、編集標的となるアデノシン残基の５’側にグアノシン残基が連結する標的ＲＮＡに対する標的編集ガイドＲＮＡは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側にグアノシン残基が連結していてよい。
　第一オリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結する３’側オリゴヌクレオチドは、場合により、対応する標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と非ワトソンクリック型のゆらぎ塩基対を形成してもよく、また、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結する３’側オリゴヌクレオチドは、場合により、２’－デオキシヌクレオチド残基であってよい。これにより、編集標的活性が向上する場合がある。
　例えば、標的ＲＮＡにおいて編集標的であるアデノシン残基の５’側にシチジン残基が連結している場合、第一オリゴヌクレオチドは標的対応ヌクレオチド残基の３’側に塩基としてヒポキサンチン残基を有するヌクレオチド残基が連結していてよい。すなわち、編集標的であるアデノシン残基の５’側に連結するシチジン残基と、第一オリゴヌクレオチドの塩基としてヒポキサンチン残基を有するヌクレオチド残基とが、ゆらぎ塩基対を形成してもよい。塩基としてヒポキサンチン残基を有するヌクレオチド残基は、イノシン残基又は２’－デオキシイノシン残基であってよく、好ましくは２’－デオキシイノシン残基である。更に、塩基としてヒポキサンチン残基を有するヌクレオチド残基は、糖部分及びリン酸エステル結合部分の少なくとも一方が更に修飾されていてもよい。糖部分及びリン酸エステル結合部分の修飾については後述する。
　例えば、標的ＲＮＡにおいて編集標的であるアデノシン残基の５’側にウリジン残基が連結している場合、第一オリゴヌクレオチドは標的対応ヌクレオチド残基の３’側に塩基としてアデニル基を有するヌクレオチド残基が連結していてよい。すなわち、編集標的であるアデノシン残基の５’側に連結するウリジン残基と、第一オリゴヌクレオチドの塩基としてアデニル基を有するヌクレオチド残基とが塩基対を形成してもよい。塩基としてアデニル基を有するヌクレオチド残基は、アデノシン残基又は２’－デオキシアデノシン残基であってよく、好ましくは２’－デオキシアデノシン残基である。更に、塩基としてアデニル基を有するヌクレオチド残基は、糖部分及びリン酸エステル結合部分の少なくとも一方が更に修飾されていてもよい。糖部分及びリン酸エステル結合部分の修飾については後述する。
　例えば、標的ＲＮＡにおいて編集標的であるアデノシン残基の５’側にアデノシン残基が連結している場合、第一オリゴヌクレオチドは標的対応ヌクレオチド残基の３’側に塩基としてピリミジニル基を有するヌクレオチド残基が連結していてよい。すなわち、編集標的であるアデノシン残基の５’側に連結するアデノシン残基と、第一オリゴヌクレオチドの塩基としてピリミジニル基を有するヌクレオチド残基とが塩基対を形成してもよい。塩基としてピリミジル基を有するヌクレオチド残基は、チミジン残基又は２’－デオキシウリジン残基であってよい。更に、塩基としてピリミジニル基を有するヌクレオチド残基は、糖部分及びリン酸エステル結合部分の少なくとも一方が更に修飾されていてもよい。糖部分及びリン酸エステル結合部分の修飾については後述する。
　例えば、標的ＲＮＡにおいて編集標的であるアデノシン残基の５’側にグアノシン残基が連結している場合、第一オリゴヌクレオチドは標的対応ヌクレオチド残基の３’側に塩基としてヒポキサンチン残基が連結していてよい。ヒポキサンチン残基は、２’－デオキシイノシン残基であってよい。更に、ヒポキサン残基は、糖部分及びリン酸エステル結合部分の少なくとも一方が更に修飾されていてもよい。糖部分及びリン酸エステル結合部分の修飾については後述する。
　第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基から３’方向に数えて１０番目以降、好ましくは１１番目以降のヌクレオチド残基に、架橋型ヌクレオチド残基の少なくとも１種を有していてよい。架橋型ヌクレオチド残基は、Ｄ－リボフラノースの２’位と４’位間が架橋されていてよい。架橋型ヌクレオチド残基の具体例については後述する。架橋型ヌクレオチド残基は、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋されたヌクレオチド（ＬＮＡ）及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋されたヌクレオチド（ＥＮＡ）の少なくとも一方を含んでいてよい。また、架橋型ヌクレオチド残基は、塩基部分及びリン酸エステル結合部分の少なくとも一方が更に修飾されていてもよい。塩基部分及びリン酸エステル結合部分の修飾については後述する。
　第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチドから３’方向に数えて１０番目以降、好ましくは１１番目以降のヌクレオチド残基からなるオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有していてよい。２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基との連結の繰り返し数は、例えば１以上３以下であってよく、好ましくは２であってよい。２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基から３’方向に交互に連結していてもよいし、架橋型ヌクレオチド残基から３’方向に交互に連結していてもよい。２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基の具体例については後述する。また、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基又は架橋型ヌクレオチド残基は、塩基部分及びリン酸エステル結合部分の少なくとも一方が更に修飾されていてもよい。塩基部分及びリン酸エステル結合部分の修飾については後述する。
　第一オリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する５’側オリゴヌクレオチドの残基数は、３以上６以下であってよく、好ましくは３以上５以下、３以上４以下又は３である。残基数が前記範囲であると、ＡＤＡＲ１に対する選択性がより向上する傾向がある。
　第二オリゴヌクレオチドは、相補的塩基対を形成しないヌクレオチド残基を１個以上含む２本鎖構造（以下、第二相補鎖ともいう）を標的ＲＮＡと形成する。第二オリゴヌクレオチドの残基数は、２以上１０以下又は４以上８以下であってよい。第二オリゴヌクレオチドの残基数は、例えば３以上であり、好ましくは４以上又は５以上であり、また例えば１０以下であり、好ましくは９以下、８以下又は７以下である。一態様において第二オリゴヌクレオチドの残基数は６であってよい。残基数が前記範囲内であると、編集誘導がより増進する傾向がある。第二相補鎖における相補的塩基対を形成しないヌクレオチド残基の数は、例えば３個以下又は２個以下であり、好ましくは１個である。
　第二相補鎖において相補的塩基対を形成しないヌクレオチド残基は、標的ＲＮＡ又は第二オリゴヌクレオチドの一方において、他方のヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失していることで、塩基対とならずに存在するヌクレオチド残基であってよい。また、第二相補鎖において相補的塩基対を形成しないヌクレオチド残基は、標的ＲＮＡ及び第二オリゴヌクレオチドにおいて、対応するヌクレオチド残基からなる塩基対が互いに非相補的な核酸塩基を有するミスマッチ塩基対（非相補的塩基対）であることで、標的ＲＮＡ及び第二オリゴヌクレオチドの双方に存在するヌクレオチド残基であってもよい。１つの実施形態において、相補的塩基対を形成しないヌクレオチド残基は、標的ＲＮＡ又は第二オリゴヌクレオチドの一方に存在する塩基対を形成しないヌクレオチド残基であってよく、好ましくは標的ＲＮＡに存在する塩基対を形成しないヌクレオチド残基であってよい。これにより編集誘導がより増進される傾向がある。ここでミスマッチ塩基対とは、標的ＲＮＡ及び第二オリゴヌクレオチドにおいて、対応する２つのヌクレオチド残基が有する核酸塩基が、安定な塩基対を形成しない組み合わせであることを意味する。
　第二相補鎖における相補的塩基対を形成しないヌクレオチド残基の位置は、標的ＲＮＡ上であって、第一相補鎖と第二相補鎖の結合位置から３’側の１残基目から３残基目のいずれかであることが好ましく、１残基目であることがより好ましい。また、第二相補鎖における相補的塩基対を形成しないヌクレオチド残基の位置は、第二オリゴヌクレオチド上であって、第一相補鎖と第二相補鎖の結合位置から５’側の１残基目から３残基目のいずれかであることが好ましく、１残基目であることがより好ましい。
　第二相補鎖における相補的塩基対を形成しないヌクレオチド残基は、標的ＲＮＡにおける第一相補鎖と第二相補鎖の結合位置から３’側の１残基目のヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が、第二オリゴヌクレオチドから欠失していることに由来するものであってよい。また、第二相補鎖における相補的塩基対を形成しないヌクレオチド残基は、標的ＲＮＡにおける第一相補鎖と第二相補鎖の結合位置から３’側の１残基目のヌクレオチド残基と、第二オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチド残基とから形成されるミスマッチ塩基対に由来するものであってもよい。
　第二オリゴヌクレオチドにおいて、標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失している場合、第二オリゴヌクレオチドはヌクレオチド残基が欠失している部分を除いて、標的ＲＮＡと相補的な塩基配列を有していてよい。また、第二オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基を有する場合、第二オリゴヌクレオチドは相補対を形成しないヌクレオチド残基を除いて、標的ＲＮＡと相補的な塩基配列を有していてよい。
　第二オリゴヌクレオチドは、その３’末端のヌクレオチド残基から５’方向に数えて２番目以降、好ましくは３番目以降のヌクレオチド残基に、架橋型ヌクレオチド残基の少なくとも１種を有していてよい。架橋型ヌクレオチド残基は、Ｄ－リボフラノースの２’位と４’位間が架橋されていてよい。架橋型ヌクレオチド残基の具体例については後述する。架橋型ヌクレオチド残基は、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋されたヌクレオチド（ＬＮＡ）及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋されたヌクレオチド（ＥＮＡ）の少なくとも一方を含んでいてよい。また、架橋型ヌクレオチド残基は、塩基部分及びリン酸エステル結合部分の少なくとも一方が更に修飾されていてもよい。塩基部分及びリン酸エステル結合部分の修飾については後述する。
　第二オリゴヌクレオチドは、その３’末端のヌクレオチド残基から５’方向に数えて２番目以降、好ましくは３番目以降のヌクレオチド残基からなるオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有していてよい。２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基との連結の繰り返し数は、例えば１以上３以下であってよく、好ましくは２であってよい。２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基から５’方向に交互に連結していてもよいし、架橋型ヌクレオチド残基から５’方向に交互に連結していてもよい。２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基の具体例については後述する。また、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基又は架橋型ヌクレオチド残基は、塩基部分及びリン酸エステル結合部分の少なくとも一方が更に修飾されていてもよい。塩基部分及びリン酸エステル結合部分の修飾については後述する。
　標的編集ガイドＲＮＡの一態様は、標的ＲＮＡと第一相補鎖を形成する第一オリゴヌクレオチドが、標的対応ヌクレオチド残基としてのシチジン残基と、標的ＲＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有し、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結する残基数が１２から１８又は１４から１６の３’側オリゴヌクレオチドと、標的ＲＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有し、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結する残基数が３の５’側オリゴヌクレオチドとを含み、第二オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡにおける第一相補鎖と第二相補鎖の結合位置から３’側の１残基目に対応するヌクレオチド残基を欠失し、２残基目以降に相補的な塩基配列を有し、残基数が４から８のオリゴヌクレオチドを含む。
　標的編集ガイドＲＮＡを構成するヌクレオチドは、天然型リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、天然型デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、ＲＮＡ／ＤＮＡのキメラ、これらの修飾体である修飾ヌクレオチドのいずれから選択されていてもよい。標的編集ガイドＲＮＡを構成するヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分の水酸基に結合するリン酸ジエステル結合によって互いに連結されうる。前記リン酸ジエステル結合は糖部分の２’位水酸基、３’位水酸基、又は５’位水酸基を利用して形成されうる。標的編集ガイドＲＮＡを構成するヌクレオチドは、天然型である３’－５’リン酸ジエステル結合を形成しうる。標的編集ガイドＲＮＡを構成するヌクレオチドの少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであってよい。修飾ヌクレオチドとしては、糖部分が修飾されたもの、リン酸ジエステル結合が修飾されたもの、塩基が修飾されたもの、及びこれらの組合せが例示できる。
　糖部分の修飾としては、例えば、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ－アルキル化リボヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｏ－アミノエチル化、２’－Ｏ－プロピル化、２’－Ｏ－アリル化、２’－Ｏ－メトキシエチル化、２’－Ｏ－ブチル化、２’－Ｏ－ペンチル化、２’－Ｏ－プロパルギル化等）；
Ｄ－リボフラノースの２’位と４’位間が架橋された架橋型リボヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－プロピレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－テトラメチレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－ペンタメチレン化、２’－Ｓ，４’－Ｃ－メチレン化、Ｄ－リボフラノースの２’－デオキシ－２’－Ｃ，４’－Ｃ－メチレンオキシメチレン化体、Ｓ－ｃＥｔ（２’，４’－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　エチル）、ＡｍＮＡ等）；
３’－デオキシ－３’－アミノ－２’－デオキシ－Ｄ－リボフラノース；３’－デオキシ－３’－アミノ－２’－デオキシ－２’－フルオロ－Ｄ－リボフラノース；２’－デオキシ－２’－フルオロ－Ｄ－リボフラノース；Ｄ－デオキシリボースなどを挙げることができる。
　リン酸ジエステル結合部分の修飾としては、ホスホロチオエート結合（リン原子の不斉に由来する光学活性体を含む）、メチルホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロアミデート結合などを挙げることができる。
　塩基部分の修飾としては、ハロゲン化；メチル化、エチル化、プロピル化、イソプロピル化、シクロプロピル化、ブチル化、イソブチル化、ｓ－ブチル化、ｔ－ブチル化、シクロブチル化等の炭素数１から６又は１から４のアルキル化；水酸化；アミノ化；脱アミノ化；デメチル化などが挙げられる。具体的には、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化等；チミンの５－デメチル化（ウラシル）、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化等；アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化等；グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化等；を挙げることができる。
　標的編集ガイドＲＮＡでは、カウンタ領域から選択される少なくとも１残基、少なくとも２残基、又は３残基すべてが、天然型リボヌクレオチド（ＲＮＡ）残基以外のヌクレオチド残基であってよく、好ましくは、少なくとも１残基、少なくとも２残基、又は３残基すべてが修飾ヌクレオチド残基である。カウンタ領域における修飾ヌクレオチド残基は、糖部分及びリン酸ジエステル結合の少なくとも一方が修飾されていてよく、少なくとも糖部分が修飾されていてよく、少なくともリン酸ジエステル結合が修飾されていてよく、又は糖部分及びリン酸ジエステル結合が修飾されていてよい。例えば、標的対応ヌクレオチド残基は、ホスホロチオエート結合を有するシチジン残基であってよい。また例えば、標的対応ヌクレオチド残基の５’側又は３’側の各１残基は、糖部分及びリン酸ジエステル結合の少なくとも一方が修飾されていてよく、少なくとも糖部分が修飾されていてよく、少なくともリン酸ジエステル結合が修飾されていてよく、又は糖部分及びリン酸ジエステル結合が修飾されていてもよい。カウンタ領域における糖部分の修飾は、例えば、２’－Ｏ－アルキル化、２’－デオキシ－２’－フルオロ化、２’－デオキシ化等であってよい。
　第一オリゴヌクレオチドのカウンタ領域以外のオリゴヌクレオチド残基（非カウンタ領域）の内、少なくとも１残基、少なくとも３残基、又は全残基において、糖部分及びリン酸ジエステル結合の少なくとも一方が修飾されていてよく、少なくとも糖部分が修飾されていてよく、少なくともリン酸ジエステル結合が修飾されていてよく、又は糖部分及びリン酸ジエステル結合が修飾されていてもよい。非カウンタ領域における糖部分の修飾は、例えば、２’－Ｏ－アルキル化、２’－デオキシ－２’－フルオロ化、２’位と４’位間の架橋化、２’－デオキシ化（ＤＮＡ化）等であってよい。第一オリゴヌクレオチドが複数の修飾ヌクレオチド残基を有する場合、複数の修飾ヌクレオチド残基は連続して配置されてよく、離隔されて配置されていてもよい。また、第一オリゴヌクレオチドは、すべてのヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されて構成されていてもよい。
　第一オリゴヌクレオチドの標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結する３’側オリゴヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される２種の修飾ヌクレオチド残基が交互に連結する塩基配列を有していてもよい。すなわち、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結する３’側オリゴヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有していてよく、架橋型ヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有していてよく、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有していてよい。ここで使用される２種の修飾ヌクレオチド残基が交互に連結する塩基配列を有するとは、対象となるオリゴヌクレオチドが（ここでは、第一オリゴヌクレオチドの３’側オリゴヌクレオチドが該当する）、２種の修飾ヌクレオチド残基が部分的に交互に連結した塩基配列を有していること、又は対象となるオリゴヌクレオチドの全体が２種の修飾ヌクレオチド残基が交互に連結した塩基配列を有していることの両方を意味し、本明細書の以下の説明でも同様の意味で使用される。
　第一オリゴヌクレオチドにおける３’側オリゴヌクレオチドは、一部のヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されて構成されていてもよく、すべてのヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されて構成されていてもよい。
　第一オリゴヌクレオチドの３’側オリゴヌクレオチドにおいては、標的対応ヌクレオチド残基から３’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される修飾ヌクレオチド残基であってもよい。さらに３’側オリゴヌクレオチドにおいては、標的対応ヌクレオチド残基から３’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される修飾ヌクレオチド残基であって、４番目のヌクレオチド残基が３番目のヌクレオチド残基とは異なる修飾ヌクレオチド残基であってもよい。ここで標的対応ヌクレオチド残基から３’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基とは、標的対応ヌクレオチド残基自身を含まず、標的対応オリゴヌクレオチド残基の３’方向に隣接するヌクレオチド残基を１番目として３’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基を示す。
　第一オリゴヌクレオチドの標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結する５’側オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連続する塩基配列を有していてもよい。２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連続する塩基配列は、標的対応ヌクレオチド残基に隣接していてよい。２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連続する塩基配列における残基数は、例えば２又は３であってよい。また、５’側オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基又は架橋型ヌクレオチド残基とが連結する塩基配列を有していてもよい。
　第一オリゴヌクレオチドにおける５’側オリゴヌクレオチドは、一部のヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されて構成されていてもよく、すべてのヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されて構成されていてもよい。
　第二オリゴヌクレオチドは、それぞれ、少なくとも１残基、少なくとも３残基、又は全残基において、糖部分及びリン酸ジエステル結合の少なくとも一方が修飾されていてよく、少なくとも糖部分が修飾されていてよく、少なくともリン酸ジエステル結合が修飾されていてよく、又は糖部分及びリン酸ジエステル結合が修飾されていてもよい。第二オリゴヌクレオチドにおける糖部分の修飾は、例えば、２’－Ｏ－アルキル化、２’－デオキシ－２’－フルオロ化、２’位と４’位間の架橋化、２’－デオキシ化（ＤＮＡ化）等であってよい。第二オリゴヌクレオチドが複数の修飾ヌクレオチド残基を有する場合、複数の修飾ヌクレオチド残基は連続して配置されてよく、離隔されて配置されていてもよい。
　第二オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連続する塩基配列を有していてもよい。第二オリゴヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される２種が交互に連結する塩基配列を有していてもよく、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有していてよく、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有していてよい。さらに、第二オリゴヌクレオチドは、ＡＤＡＲ１選択性の観点から、第二オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチド残基から５’方向に数えて２番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される１種であってよく、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基であってよい。ここで第二オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチド残基から５’方向に数えて２番目のヌクレオチド残基とは３’末端のヌクレオチド残基自身を含まず、３’末端のオリゴヌクレオチド残基の５’方向に隣接するヌクレオチド残基を１番目として５’方向に数えて２番目のヌクレオチド残基を示す。
　標的編集ガイドＲＮＡは、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間に、アルキレンオキシ単位を含む連結部を含んでいてもよい。連結部は、炭素数が１から８のアルキレンオキシ基を含んでいてよく、炭素数が１から８のアルキレンオキシ単位からなるポリアルキレンオキシ基を含んでいてもよい。連結部は、第一オリゴヌクレオチドの５’側、及び第二オリゴヌクレオチドの３’側にそれぞれリン酸ジエステル結合、又は修飾されたリン酸ジエステル結合してよい。すなわち、連結部は、第一オリゴヌクレオチドの５’末端の糖部分の水酸基と、第二オリゴヌクレオチドの３’末端の糖部分の水酸基とそれぞれリン酸ジエステル結合、又は修飾されたリン酸ジエステル結合してよい。標的編集ガイドＲＮＡは、連結部がアルキレンオキシ単位を含んでいる場合であっても、優れた標的編集活性を示すことができる。
　連結部がポリアルキレンオキシ基を含む場合、ポリアルキレンオキシ基を構成するアルキレンオキシ単位の炭素数は、例えば、２から４、２から３、又は２であってよい。すなわち、アルキレンオキシ単位は、エチレンオキシ単位、プロピレンオキシ単位、又はブチレンオキシ単位であってよく、エチレンオキシ単位であってよい。ポリアルキレンオキシ基を構成するアルキレンオキシ単位の数は、例えば、２から１０、２から８、２から７、又は３から６であってよい。ポリアルキレンオキシ基を構成する各アルキレンオキシ単位は同一であっても、又は異なっていてもよい。
　連結部がアルキレンオキシ基を含む場合、アルキレンオキシ基の炭素数は、例えば２から８、２から７、又は３から６であってよい。
　一態様において標的編集ガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドとを連結し、アルキレンオキシ単位を含む連結部とを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、その３’末端において前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失しているか、もしくは前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基を有し、少なくともその３’末端以外のヌクレオチド残基が前記標的ＲＮＡと相補的な２本鎖構造を形成しているか、又は前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有して前記標的ＲＮＡと相補的な２本鎖構造を形成し、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩であってよい。連結部を含む標的編集ガイドＲＮＡを構成する第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドは、既述の修飾ヌクレオチド残基から構成されていてもよい。
　一態様において標的編集ガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドとを連結し、アルキレンオキシ単位を含む連結部とを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有して前記標的ＲＮＡと相補的な２本鎖構造を形成し、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩であってよい。連結部を含む標的編集ガイドＲＮＡを構成する第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドは、既述の修飾ヌクレオチド残基から構成されていてもよい。
　一態様において標的編集ガイドＲＮＡは、以下に記載の（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９）、（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９）、（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９）、（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９）、（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．５２）、（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９ｅ）、（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９ｅ）、（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９ｅ）、（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９ｅ）、（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．５２ｅ）、（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．５２ｅ）、（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．５２ｅ）、（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．５２ｅ）及び（ＡＤ１＿Ａ１ＡＴ．３９）からなる群から選択される式のいずれかで表されるオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩であってもよい。
（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９）
　Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｇ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９）
　Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ａ＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９）
　Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９）
　Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．５２）
　Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｌ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９ｅ）
　Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９ｅ）
　Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９ｅ）
　Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ａ＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９ｅ）
　Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．５２ｅ）
　Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．５２ｅ）
　Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．５２ｅ）
　Ａ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ａ＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．５２ｅ）
　Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　
（ＡＤ１＿Ａ１ＡＴ．３９）
　Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）
　式中、大文字はリボヌクレオチド残基（ＲＮＡ）を示す。小文字は２’－デオキシリボヌクレオチド残基（ＤＮＡ）を示す。Ｎ（Ｍ）はＤ－リボフラノースの２’－Ｏ－メチル化リボヌクレオチド残基を示す。Ｎ（Ｆ）はＤ－リボフラノースの２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基を示す。Ｎ（Ｌ）は、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋化リボヌクレオチド残基を示す。Ｎ（Ｅ）は、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋化リボヌクレオチド残基を示す。「＾」はヌクレオシドユニット間が－Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）－で結合していること、すなわちホスホロチオエート結合していることを示す。
　標的編集ガイドＲＮＡは、市販の合成機（例えば、パーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２）などを用いて、公知の文献（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅｒｃｈ，１２，４５３９（１９８４））参照）に記載の方法に準じて合成することができる。用いられるホスホロアミダイト試薬は、市販の試薬を用いてもよく、公知の文献に記載の方法に準じて適宜合成した試薬を用いてもよい。ホスホロアミダイト試薬をカップリング後、イオウ、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ、アプライドバイオシステム社）、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、キサンタンヒドリドなどの試薬を反応させることにより、ホスホロチオエート結合を導入することができる（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，３２，３００５（１９９１），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１２，１２５３（１９９０）、ＰＣＴ／ＷＯ９８／５４１９８参照）。
　オリゴヌクレオチド（標的編集ガイドＲＮＡ）は、薬学的に許容できる塩の形態で用いてもよい。「薬学的に許容される塩」とは、オリゴヌクレオチドの塩である。そのような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩などのアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、りんご酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などを挙げることができる。オリゴヌクレオチドの薬学的に許容できる塩の形態は、好ましくは、オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩、より好ましくは、ナトリウム塩である。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。
　また、オリゴヌクレオチド及びその薬学的に許容される塩は、溶媒和物（例えば、水和物）としても存在することがあり、そのような溶媒和物であってもよい。
　オリゴヌクレオチド及びその薬学的に許容される塩には、リン原子の不斉に由来する光学活性体が存在することがあり、本発明のオリゴヌクレオチドには、そのような光学活性体も含まれる。そのような光学活性体は、公知の方法で合成することができる（例えば、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ.,１１４,９６７（２００９）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，８，２３５９（１９９８）など）。
　オリゴヌクレオチド及びその薬学的に許容される塩は、５’末端又は３’末端において、ＧａｌＮＡｃ、コレステロール、脂肪酸などのデリバリー分子がリンカー又はリン酸ジエステル結合（ホスホロチオエート結合を含む）などを介して結合していてもよい。そのようなデリバリー分子及びリンカーの例としては、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．　２０１９，３０，３６６に記載のものを挙げることができる。デリバリー分子が結合したオリゴヌクレオチド及びその薬学的に許容される塩は、公知の製造方法によって製造することができる。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド及びその薬学的に許容される塩は、そのようなデリバリー分子が結合した形態も包含する。
　オリゴヌクレオチド、その薬学的に許容される塩又は溶媒和物を、疾患の治療に使用する場合には、それ自体あるいは適宜の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤などと混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤などにより経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、貼付剤若しくは外用剤などにより非経口的に投与することができる。
　これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バイレショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩などの無機系賦形剤など）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩：無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；上記澱粉誘導体など）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、前記賦形剤と同様の化合物など）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類など）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤など）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；ソルビン酸など）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される甘味料、酸味料、香料など）、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。
　オリゴヌクレオチド、その薬学的に許容される塩又は溶媒和物を含む治療剤は、０．１から２５０μｍｏｌｅｓ／ｍｌのオリゴヌクレオチドを含有するとよく、好ましくは、１から５０μｍｏｌｅｓ／ｍｌ含有するとよい。また、所定量のオリゴヌクレオチド、その薬学的に許容される塩又は溶媒和物、０．０２から１０％ｗ／ｖの炭水化物又は多価アルコール、及び０．０１から０．４％ｗ／ｖの薬学的に許容できる界面活性剤を含有させて治療剤を構成してもよい。
　上記炭水化物としては、単糖類及び２糖類の少なくとも１種が特に好ましい。これら炭水化物及び多価アルコールの例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、マルトース、マンニトール及びソルビトールが挙げられる。これらは、単独で用いても、併用してもよい。 
　また、界面活性剤の好ましい例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノからトリ－エステル、アルキルフェニルポリオキシエチレン、ナトリウムタウロコラート、ナトリウムコラート、及び多価アルコールエステルが挙げられる。このうち特に好ましいのは、ポリオキシエチレンソルビタンモノからトリ－エステルであり、ここにおいてエステルとして特に好ましいのは、オレエート、ラウレート、ステアレート及びパルミテートである。これらは単独で用いても、併用してもよい。
　オリゴヌクレオチド、その薬学的に許容される塩又は溶媒和物を含む治療剤は、更に好ましくは、０．０３Ｍから０．０９Ｍの薬学的に許容できる中性塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び／又は塩化カルシウムを含有させておいてもよい。
　オリゴヌクレオチド、その薬学的に許容される塩又は溶媒和物を含む治療剤は、更に好ましくは、０．００２から０．０５Ｍの薬学的に許容できる緩衝剤を含有することができる。好ましい緩衝剤の例としては、クエン酸ナトリウム、ナトリウムグリシネート、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが挙げられる。これらの緩衝剤は、単独で用いても、併用してもよい。
　さらに、上記の治療薬は、溶液状態で供給してもよい。しかし、ある期間保存する必要がある場合等のために、オリゴヌクレオチドを安定化して治療効果の低下を防止する目的で通常は凍結乾燥しておくことが好ましく、その場合は用時に溶解液（注射用蒸留水など）で再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）して、即ち投与される液体状態にして用いればよい。従って、本発明の治療薬は、各成分が所定の濃度範囲になるよう溶解液で再構成して使用するための、凍結乾燥された状態のものも包含する。凍結乾燥物の溶解性を促進する目的で、アルブミン、グリシン等のアミノ酸を更に含有させておいてもよい。　
　オリゴヌクレオチド、その薬学的に許容される塩又は溶媒和物をヒトに投与する場合には、例えば、成人１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、１回又は数回に分けて皮下注射、点滴静脈注射、又は、静脈注射するとよいが、その投与量や投与回数は、疾患の種類、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。
疾患の処置方法
　疾患の処置方法は、上記治療剤を対象に投与する工程を含む。疾患の処置方法は、上記治療剤の薬理学的有効量を対象に投与する工程を含んでいてよい。本明細書において用いられる「処置」とは、疾患について施される何らかの処置であればよく、例えば、疾患の治療、改善、進行の抑制（悪化の防止）、予防等（好適には、治療又は予防）が挙げられる。処置の対象は、ヒトを含む温血動物であってよく、非ヒト温血動物であってもよく、ヒトであってもよい。
標的ＲＮＡの部位特異的編集方法
　標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、標的ＲＮＡと、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドである標的編集ガイドＲＮＡとを、アデノシンデアミナーゼの存在下に、接触させる工程を含む。標的編集ガイドＲＮＡが標的ＲＮＡと部分的に二本鎖を形成し、アデノシンデアミナーゼをリクルートすることで、標的ＲＮＡが含むアデノシン残基を部位特異的にイノシン残基に変換することができる。標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、標的編集ガイドＲＮＡを準備する工程を更に含んでいてもよい。
　標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、例えば、標的ＲＮＡを有する真核細胞に、上述した標的編集ガイドＲＮＡを導入することで行うことができる。標的編集ガイドＲＮＡの真核細胞への導入方法には、核酸医薬で用いられる種々の手法から適宜選択して適用することができる。標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、インビトロで実施されてよく、インビボで実施されてもよい。
　本発明は、別の態様として、疾患（例えば、遺伝性疾患）の処置に用いられる医薬組成物の製造における標的編集ガイドＲＮＡの使用、疾患（例えば、遺伝性疾患）の処置における標的編集ガイドＲＮＡの使用、疾患（例えば、遺伝性疾患）の処置に使用される標的編集ガイドＲＮＡをも包含する。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（参考例１）
　表１に示す配列（配列番号１）を有し、すべてが天然型ＲＮＡ残基からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３ともいう）を、ホスホロアミダイト法（例えば、Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)、Nature Communications 6, Article number: 6317 (2015)参照）を用いて合成を行った。得られた化合物は、負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（実測値：７７１４．８）。
　表１中、下線部は第一オリゴヌクレオチド（ＡＳＲ）に該当し、標的となるＲＮＡは後述するＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡである。参考例１のオリゴヌクレオチドは、例えば、標的ＲＮＡと以下のような構造を取り得ると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（参考例２）
　モデル標的ＲＮＡとして以下に配列を示すｈＧＡＰＤＨ＿ｓＲＮＡ０２（配列番号３）を、後述するＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡと同様にして調製した。このモデル標的ＲＮＡに対する標的編集ガイドＲＮＡとして、以下に配列を示すオリゴリボヌクレオチドｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１（配列番号４）をホスホロアミダイト法により調製した。なお、表中の下線は、編集標的のアデノシン残基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例１から３２）
　実施例１から１６のオリゴヌクレオチドは参考例１のオリゴヌクレオチドの配列を元にして、表３に示すように修飾ヌクレオチドを導入して得られたものである。また実施例１７から３２のオリゴヌクレオチドは参考例２のオリゴヌクレオチドの配列を元にして、表４に示すように修飾ヌクレオチドを導入して得られたものである。これらのオリゴヌクレオチド化合物は参考例１と同様にホスホロアミダイト法で合成した。なお、配列中、「１８」の部分を合成する際には、ＤＭＴ　Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、カタログ番号：ＣＬＰ－９７６５）を用いた。「９」の部分を合成する際には、ＤＭＴ－Ｔｒｉｅｔｈｏｘｙ－ｇｌｙｃｏｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、カタログ番号：ＣＬＰ－１１１３）を用いた。「６」の部分を合成する際には、ＤＭＴ－ｈｅｘａｎｅ－Ｄｉｏｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、カタログ番号：ＣＬＰ－１１２０）を用いた。「３」の部分を合成する際には、ＤＭＴ－ｐｒｏｐａｎｅ－Ｄｉｏｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、カタログ番号：ＣＬＰ－９９０８）を用いた。「２’－Ｏ－メチルヌクレオシド」の部分は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１７，　３３７３　（１９８９）に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「ＤＮＡ」の部分は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１１，　４５３９　（１９８４）に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンヌクレオシド」の部分は、国際公開第９９／１４２２６号に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド」の部分は、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６，８３１（１９９３）に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表中の「分子量」は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。表中の「配列」において大文字はＲＮＡ、小文字はＤＮＡ、Ｎ（Ｍ）はＤ－リボフラノースの２’－Ｏ－メチル化、Ｎ（Ｆ）はＤ－リボフラノースの２’－デオキシ－２’－フルオロ化、Ｎ（Ｌ）は、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン化、Ｎ（Ｅ）は、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン化を示す。「３」は－Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ－、「６」は－Ｏ（ＣＨ２）６Ｏ－、「９」は－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３－、「１８」は－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６－で表されるリンカーを示す。「＾」はヌクレオシドユニット間が－Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）－で結合したものを示す。特に記載のない場合は、ヌクレオシドユニット間、又はヌクレオシドユニットとリンカーが－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－で結合したものを示す。オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端は、水素原子が化学式中の酸素原子と結合した水酸基となっている。以下にヌクレオシドユニットの構造を示す。なお、化学式中の破線部は結合部位を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（試験例１）
アデノシンデアミナーゼの調製
　アデノシンデアミナーゼとして、組換えｈＡＤＡＲ２及びｈＡＤＡＲ１ｐ１１０を、文献（Macbeth, MR. and Bass, BL. Methods Enzymol. 424, 319-331 (2007)、 Fukuda, M. et al. Sci. Rep. srep41478 (2017)）の記載に準じて、酵母発現系を用いて合成・精製して調製した。また、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ１ｐ１１０及びｈＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ２、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ｐ１５０）を常法により調製した。
モデル標的ＲＮＡの調製：Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡの合成
　ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２　Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）から、常法により転写して調製したＲｌｕｃ＿ＷＴ　ＲＮＡ（配列番号５）を０．２ｎＭになるように調製した。組み換えｈＡＤＡＲ２を終濃度１μＭとなるように加え、ｅｄｉｔｉｎｇ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．５ｍＭ　ＤＴＴ，０．０１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中において３７℃で２時間インキュベートすることにより、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ編集反応を行なった。
　編集反応後のＲｌｕｃ＿ＷＴ　ＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。次いで、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて、Ｒｌｕｃ＿ＷＴ＿ＢａｍＲ０１プライマー（配列番号６）によりｃＤＮＡを合成した。その後、Ｒｌｕｃ＿ＷＴ＿ＥｃｏＦ０１プライマー（配列番号７）及びＲｌｕｃ＿ＷＴ＿ＢａｍＲ０１プライマー（配列番号６）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，６０秒）によりｃＤＮＡを増幅した。次いで、得られたｃＤＮＡをインサートＤＮＡとして、以下のようにしてｐＵＣ１９プラスミドにクローニングした。インサートＤＮＡ及びｐＵＣ１９プラスミドをＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ）及びＢａｍＨＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間の制限酵素消化を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により、それぞれのＤＮＡを精製した。制限酵素消化後のｐＵＣ１９プラスミドとインサートＤＮＡが１：３のモル比となるように混合し、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列解析を行い、Ｒｌｕｃ＿ＷＴのＡ１２２がＧに変異した配列（Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ）及びＲｌｕｃ＿Ｋ４１ＲがクローニングされたプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１９－Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ）を得た。
　ｐＵＣ１９－Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒを鋳型にして、５’側断片をＲｌｕｃ＿ＮｈｅＦ０１プライマー（配列番号８）とＲＬ＿Ｗ１０４Ｘ＿ＲＶプライマー（配列番号９）、３’側断片をＲｌｕｃ＿ＸｈｏＲ０１プライマー（配列番号１０）と　ＲＬ＿Ｗ１０４Ｘ＿ＦＷプライマー（配列番号１１）を用いてＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により１ｓｔ　ＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，４０秒）を行なった。次に、それぞれのＰＣＲ産物を１００倍希釈し、Ｒｌｕｃ＿ＮｈｅＦ０１プライマー及びＲｌｕｃ＿ＸｈｏＲ０１プライマーを用いてＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により２ｎｄ　ＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，６０秒）を行ない、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１ＲのＧ３１１をＡに変異させた配列を有するＤＮＡ（Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ）（配列番号１４）を得た。
　得られたＤＮＡ（Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ）及びｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２　Ｖｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｍｅｇａ）について、ＮｈｅＩ（ＴａＫａＲａ）及びＸｈｏＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間の制限酵素消化を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により、それぞれのＤＮＡを精製した。制限酵素消化後のＲｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４ＸとｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２　Ｖｅｃｔｏｒを３：１のモル比となるように混合し、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した。選別したコロニーをＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。その後、塩基配列解析により得られたプラスミドの配列を確認した。
　配列を確認したプラスミドを鋳型に、Ｔ７＿Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１２）及びＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号１３）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，２０秒））により、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応用の鋳型ＤＮＡを増幅し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ　Ｔ７　Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写を行なってＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ（配列番号１５）を得た。合成後のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡについて、８Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用いて切り出し精製を行ない、以降の試験に用いた。
　以下に、Ｒｌｕｃ＿ＷＴ＿ＲＮＡ、Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ及びＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡの配列、並びに上記で用いたプライマーの配列を示す。なお、表中の下線は、編集標的のアデノシン残基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
細胞培養
　ＨｅＬａ細胞を２４－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅに５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように継代し、４８時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて５０ｎｇの標的ＲＮＡを発現するプラスミド（ｐｓｉＣＨＥＣＫ２＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ）、３５０ｎｇのＡＤＡＲを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ２、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ｐ１５０）、１０ｎＭの実施例１から１６のオリゴヌクレオチドであるｇＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクション後、４８時間培養した後、細胞を回収した。
編集解析方法
　２４－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅで培養した細胞から、セパゾール　ＲＮＡ　Ｉ　Ｓｕｐｅｒ　Ｇ（ナカライ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（ＴａＫａＲａ）を用いてＤＮａｓｅ処理を行った後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　０．５μｇ、０．２５μＭ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１７（配列番号１６）を用いた逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを増幅した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｒｌｕｃ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１７）、３’－Ａｄｐプライマー（配列番号１８）を用いて１ｓｔ　ＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，６０秒））を行った。１ｓｔ　ＰＣＲ産物を２００倍希釈したｃＤＮＡを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（ＴａＫａＲａ）、Ｒｌｕｃ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１７）、Ｒｌｕｃ＿Ｒ０１プライマー（配列番号１９）を用いて２ｎｄ　ＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，６０秒））を行い、Ｒｌｕｃフラグメントを増幅した。Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１６５μＭ　Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号２０）を用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３５００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位（Ａ３１１）のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合（％）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
ルシフェラーゼレポーターアッセイ方法
　Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。２４－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅで培養した細胞に１００μＬのＰａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液２０μＬにＬＡＲＩＩ　１００μＬを添加し、６０秒後、ＧｌｏＭａｘ（Ｒ）２０／２０　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＦｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｆｌｕｃ）の発光強度を測定した。その後すぐに、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ　Ｒｅａｇｅｎｔを１００μＬ添加し、６０秒後にＲｅｎｉｌｌａ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｒｌｕｃ）の発光強度を測定した。発光強度は、Ｆｌｕｃによりノーマライズした。
　実施例化合物（ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿１からＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿４）を用いた場合の編集割合（％）を図１Ａに示した。ＡＤＡＲ１を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかった場合（ｇＲＮＡ（－））と比較して３０％から７０％程度の編集割合を示した。ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかった場合（ｇＲＮＡ（－））と比較して４０％から６０％程度の編集割合を示した。実施例化合物（ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿１からＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿４）を用いた場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を図１Ｂに示した。実施例化合物（ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿１からＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿４）を用いた場合、ｇＲＮＡを用いなかった場合（ｇＲＮＡ（－））と比較して高いルシフェラーゼ活性が認められた。
　実施例化合物（ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿４、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿９からＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿１６）を用いた場合の編集割合（％）を図２Ａに示した。ＡＤＡＲを発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿４、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿９からＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿１６は、ｇＲＮＡを用いなかった場合（ｇＲＮＡ（－））と比較して高い編集割合を示した。また、実施例化合物（ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿４、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿９からＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿１６）を用いた場合、ｇＲＮＡを用いなかった場合（ｇＲＮＡ（－））と比較して高いルシフェラーゼ活性が認められた。
（試験例２）
内在性ＡＤＡＲによる細胞内編集誘導能評価
　ＡＤＡＲを発現するプラスミドを用いずに、レポータープラスミド２５ｎｇ、５０ｎＭの実施例化合物であるｇＲＮＡのみをトランスフェクションしたこと以外は、上記と同様にして、実施例化合物（ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿４、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿９からＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿１６）による細胞内編集誘導能を評価した。
　実施例化合物（ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿４、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿９からＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿１６）を用いた場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を図３に示す。実施例化合物（ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿４、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿９からＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿１６）を用いた場合、ｇＲＮＡを加えなかった場合（ｇＲＮＡ（－））に比べ、ルシフェラーゼ活性の向上が認められた。また、編集割合についても調べたところ、実施例化合物（ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿４、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３＿１５）を用いた場合、それぞれ９．０±０．１％、４．１±２．３％の編集割合（±Ｓ．Ｄ．％）を示し、バックグラウンド（それぞれ１．３±１．４％、０．９±０．４％）より高い値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
（試験例３）
実施例化合物であるｇＲＮＡによるＧＡＰＤＨ遺伝子配列に対する細胞内編集誘導能評価
　ＨＥＫ２９３細胞を２４－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅに５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように継代し、４８時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて５００ｎｇのＡＤＡＲを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ２、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ｐ１５０）、５０ｎＭの実施例化合物であるｇＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクション後、４８時間培養した後、細胞を回収した。
編集解析方法
　試験例１の編集解析方法に記載した方法と同様にｃＤＮＡを増幅した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（ＴａＫａＲａ）、ＧＡＰＤＨ＿ＦＷプライマー（配列番号２１）、ＧＡＰＤＨ＿ＲＶプライマー（配列番号２２）を用いてＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，６０秒））を行ない、ＧＡＰＤＨフラグメントを増幅した。Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１６５μＭ　ＧＡＰＤＨ＿ｓｅｑＦ０１プライマー（配列番号２３）を用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３５００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合（％）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　実施例化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿１７からｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿１９）を用いた場合の編集割合（％）を図４Ａに示した。ＡＤＡＲ１を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかった場合（ｇＲＮＡ（－））と比較して１５％から２５％程度の高い編集割合を示した。ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかった場合（ｇＲＮＡ（－））と比較してやや高い編集割合を示した。
　実施例化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿２０からｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿２８）を用いた場合の編集割合（％）を図４Ｂに示した。ＡＤＡＲ１を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかった場合（ｇＲＮＡ（－））と比較して１０％から３０％程度の高い編集割合を示した。ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかったものと比較して高い編集割合を示した。
　実施例化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿２９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３１及びｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３２）を用いた場合の編集割合（％）を図５に示した。ＡＤＡＲ１を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかった場合（ｇＲＮＡ（－））と比較して１５％から３０％程度の高い編集割合を示した。ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかった場合（ｇＲＮＡ（－））と比較して高い編集割合を示した。
（実施例３３から４９）
　実施例３３から４９のオリゴヌクレオチドは、参考例２のオリゴヌクレオチドの配列を元にして、表１１に示すように修飾ヌクレオチドを導入することで得られたものである。これらのオリゴヌクレオチドは、参考例１と同様にホスホロアミダイト法で合成した。なお、配列中、「ｍＵ」の部分を合成する際には、Ｎ３－Ｍｅｔｈｙｌ　Ｕｒｉｄｉｎｅ　ＣＥＤ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、カタログ番号：ＡＮＰ－７４５１）を用い、「ｄ」の部分を合成する際には、ｄＳｐａｃｅｒ　ＣＥ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０－１９１４）を用い、「ｍｃ」の部分を合成する際には、Ｎ３－Ｍｅｔｈｙｌ　ｄｅｏｘｙ　Ｃｙｔｉｄｉｎｅ　ＣＥＤ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、カタログ番号：ＡＮＰ－３８５１）を用いた。また、「ｍｔ」の部分を合成する際には、Ｎ３－Ｍｅｔｈｙｌ　Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ＣＥＤ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、カタログ番号：ＡＮＰ－６１５３）を用いた。その他の修飾ヌクレオチドの詳細については既述の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表中の「配列」において、「ｍＵ」は、Ｎ３－メチルウリジン、「ｄ」は、１，２－ジデオキシリボース、「ｍｃ」は、Ｎ３－メチル－２’－デオキシシチジン、「ｍｔ」は、Ｎ３－メチルチミジンを示す。また、その他の略号については既述の通りである。なお、オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端は、水素原子が図中の酸素原子と結合した水酸基となっている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（参考例３から７）
　疾患配列を標的とした標的編集ガイドＲＮＡとして、以下に示す配列を有し、すべてが天然型ＲＮＡ残基からなるオリゴヌクレオチドをホスホロアミダイト法により調製した。得られた化合物は、負イオンＥＳＩ質量分析により同定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
（実施例５０から６４）
　実施例５０から６４のオリゴヌクレオチドは、参考例３から７のオリゴヌクレオチドの配列を元にして、表１３に示すように修飾ヌクレオチドを導入することで得られたものである。これらのオリゴヌクレオチドは、参考例１と同様にホスホロアミダイト法で合成した。なお、修飾ヌクレオチドの詳細については既述の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　表中の「配列」における略号については既述の通りである。なお、オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端は、水素原子が図中の酸素原子と結合した水酸基となっている。
（試験例４）
　実施例３３から４９で得られた化合物について、試験例３と同様にして、オリゴヌクレオチドによるｈＧＡＰＤＨ遺伝子配列に対する細胞内編集誘導活性を評価した。
　実施例化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３１、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３３からｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４０）を用いた場合の編集割合（％）を図６に示した。ＡＤＡＲ１を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかったもの（図中、ｇＲＮＡ（－））と比較して高い編集割合を示した。ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかったもの（図中、ｇＲＮＡ（－））と比較して高い編集割合を示した。特に、標的対応ヌクレオチド残基をｍＵとした実施例３３のｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３３は、高い編集割合を示した。また、標的ＲＮＡとの結合部位にＬＮＡを４か所又は６か所に導入した実施例３９及び実施例４０（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４０）は、最も高い編集割合を示した。
　さらに、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２を発現するプラスミドをトランスフェクトせずに、実施例化合物であるｇＲＮＡのみを５０ｎＭの濃度になるようにトランスフェクトした場合の細胞内編集誘導評価したところ、実施例化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９又はｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４０）を用いた場合、ＨｅＬａ細胞においてそれぞれ１３．６±１．７％、１３．９±１．６％の編集割合（±Ｓ．Ｄ．％）を示し、バックグラウンド（５．０±０．９％）より明らかに高い値を示した。また、ＨＥＫ２９３細胞においては、実施例化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９又はｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４０）を用いた場合、それぞれ１６．１±３．９％、１６．２±１．０％の編集割合（±Ｓ．Ｄ．％）を示し、バックグラウンド（４．４±０．７％）より明らかに高い値を示した。
　実施例化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３１、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４１、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４３、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４４、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４６からｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿５１）を用いた場合の編集割合（％）を図７Ａに示した。ＡＤＡＲ１を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかったもの（図中、ｇＲＮＡ（－））と比較して高い編集割合を示した。ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかったもの（図中、ｇＲＮＡ（－））と比較して高い編集割合を示した。特に、標的ＲＮＡとの結合部位にＬＮＡを導入した実施例３９及び４３から４９（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４４、及びｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４６からｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿５１）は、高い編集割合を示した。
　さらに、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２を発現するプラスミドをトランスフェクトせずに、実施例化合物であるｇＲＮＡのみを５０ｎＭの濃度になるようにトランスフェクトした場合の細胞内編集誘導評価した編集割合（％）を図７Ｂに示した。実施例化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３１、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４４、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４７からｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿５１）を用いた場合、ＨＥＫ２９３細胞又はＨｅＬａ細胞においてバックグラウンドより明らかに高い編集割合を示した。
（試験例５）
ＡＧＸＴ遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成
　ＡＧＸＴ＿ＦＷ（配列番号２９）、ＡＧＸＴ＿ＲＶ（配列番号３０）のオリゴＤＮＡ及びＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ）を用いてアニーリング反応（８０℃で３ｍｉｎ加熱し、１５ｍｉｎかけて２５℃まで冷却）を行ない、インサートを作製した。ｐＵＣ１９に対してＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間反応を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。インサート：プラスミドが３：１のモル比となるように加え、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した。選別したコロニーを、ＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミド１００ｎｇをＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１６５μＭのｐＵＣ１９＿ｓｅｑＦＷプライマー（配列番号３１）及び０．１６５μＭのｐＵＣ１９＿ｓｅｑＲＶプライマー（配列番号３２）を用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３５００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により配列解析を行ない、ｐＵＣ１９＿ＡＧＸＴプラスミドを合成できたことを確認した。ｐＵＣ１９＿ＡＧＸＴを鋳型に、Ｔ７＿ｐＵＣ１９＿ＦＷ（配列番号３３）及びＭ１３＿ＲＶプライマー（配列番号３４）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，２０秒）により、鋳型ＤＮＡを作製し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ　Ｔ７　Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写を行ない、８Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用いて切り出し精製を行なって、モデル標的ＲＮＡとしてＡＧＸＴ＿ＲＮＡを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
（Ｂ）アニーリング反応
　０．３μＭのＡＧＸＴ_ＲＮＡと、０．９μＭの実施例５０、５５（ＡＤ１＿ＡＧＸＴ．２、ＡＤ１＿ＡＧＸＴ．３）及び参考例３（ＡＤ１＿ＡＧＸＴ）の化合物（以下、単にｇＲＮＡと表記することがある）とをアニーリングｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）中で、８０℃，３ｍｉｎ加熱し、１５ｍｉｎかけて２５℃まで冷却した。
（Ｃ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ編集反応
　アニーリング反応によりＡＧＸＴ_ＲＮＡがｇＲＮＡと完全に複合体を形成したと仮定し、以下のＡＧＸＴ＿ＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体濃度を計算した。ＡＤＡＲ２を用いた編集反応は、ｅｄｉｔｉｎｇ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．５ｍＭ　ＤＴＴ，０．０１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中、５ｎＭ　ＡＧＸＴ＿ＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ２を終濃度１２．５ｎＭとなるように加え、３７℃で３０分間インキュベートすることで行なった。ＡＤＡＲ１を用いた編集反応は、ｅｄｉｔｉｎｇ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．５ｍＭ　ＤＴＴ，０．０１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中、５ｎＭ　ＡＧＸＴ＿ＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ１ｐ１１０を終濃度２５０ｎＭとなるように加え、３７℃で３０分間インキュベートすることで行なった。
（Ｄ）編集解析方法
　編集反応後のＡＧＸＴ＿ＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて、Ｍ１３＿ＲＶプライマー（配列番号３４）によりｃＤＮＡを合成した。その後、Ｔ７＿ｐＵＣ１９＿ＦＷプライマー（配列番号３３）及びＭ１３＿ＲＶプライマー（配列番号３４）、並びにＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，２０秒）により、ｃＤＮＡを増幅した。得られたｃＤＮＡの配列解析はＴ７ｐｒｏＧＧＧプライマー（配列番号３５）、Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔを用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　３５００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合（％）を算出した。
（Ｅ）編集解析の結果
　編集割合の結果を図８に示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型ＲＮＡからなる参考例３（ＡＤ１＿ＡＧＸＴ、図中では、ＡＧＸＴのＡＤ１ｇ）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチドの３’側のグアノシンを２’－デオキシグアノシンにした実施例５０（ＡＤ１＿ＡＧＸＴ．２、図中では、ＡＧＸＴのＡＤ１ｇ．２）は、高い編集割合を示した。また、標的対応ヌクレオチドの３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例５５（ＡＤ１＿ＡＧＸＴ．３、図中では、ＡＧＸＴのＡＤ１ｇ．３）は、さらに高い編集割合を示した。このことは、標的ＲＮＡにおいて編集標的であるアデノシン残基の５’側がシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中の標的対応ヌクレオチドの３’側のヌクレオチド残基として、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
（試験例６）
ＧＮＥ遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）ＧＮＥ＿ＲＮＡの合成
　オリゴＤＮＡとして、ＡＧＸＴ＿ＦＷ及びＡＧＸＴ＿ＲＶの代わりに、以下に示すＧＮＥ＿ＦＷ（配列番号３６）及びＧＮＥ＿ＲＶ（配列番号３７）を用いたこと以外は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行って、モデル標的ＲＮＡを発現するｐＵＣ＿ＧＮＥプラスミドを合成し、これを用いてモデル標的ＲＮＡとしてＧＮＥ＿ＲＮＡを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例５１、５６（ＡＤ１＿ＧＮＥ．２、ＡＤ１＿ＧＮＥ．３）及び参考例４（ＡＤ１＿ＧＮＥ）の化合物を用いて、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いて編集誘導能を評価した。
（Ｃ）編集解析の結果
　編集割合の結果を図８に示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型ＲＮＡからなる参考例４（ＡＤ１＿ＧＮＥ、図中では、ＧＮＥのＡＤ１ｇ）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチドの３’側のグアノシンを２’－デオキシグアノシンにした実施例５１（ＡＤ１＿ＧＮＥ．２、図中では、ＧＮＥのＡＤ１ｇ．２）は、高い編集割合を示した。また、標的対応ヌクレオチド位の３’側のグアノシンを２‘－デオキシイノシンにした実施例５６（ＡＤ１＿ＧＮＥ．３、図中では、ＧＮＥのＡＤ１ｇ．３）は、さらに高い編集割合を示した。このことは、標的ＲＮＡにおいて編集標的であるアデノシン残基の５’側がシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中の標的対応ヌクレオチドの３’側のヌクレオチド残基として、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
（試験例７）
ＥＹＳ遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）ＥＹＳ＿ＲＮＡの合成
　オリゴＤＮＡとして、ＡＧＸＴ＿ＦＷ及びＡＧＸＴ＿ＲＶの代わりに、以下に示すＥＹＳ＿ＦＷ（配列番号３８）及びＥＹＳ＿ＲＶ（配列番号３９）を用いたこと以外は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行って、モデル標的ＲＮＡを発現するｐＵＣ＿ＥＹＳプラスミドを合成し、これを用いてモデル標的ＲＮＡとしてＥＹＳ＿ＲＮＡを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例５２、５７（ＡＤ１＿ＥＹＳ．２、ＡＤ１＿ＥＹＳ．３）及び参考例５（ＡＤ１＿ＥＹＳ）の化合物を用いて、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いて編集誘導能を評価した。
（Ｃ）編集解析の結果
　編集割合の結果を図８に示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然ｇａ型ＲＮＡからなる参考例５（ＡＤ１＿ＥＹＳ、図中では、ＥＹＳのＡＤ１ｇ）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチドの３’側のグアノシンを２’－デオキシグアノシンにした実施例５２（ＡＤ１＿ＥＹＳ．２、図中では、ＥＹＳのＡＤ１ｇ．２）は、高い編集割合を示した。また、標的対応ヌクレオチド位の３’側のグアノシンを２‘－デオキシイノシンにした実施例５７（ＡＤ１＿ＥＹＳ．３、図中では、ＥＹＳのＡＤ１ｇ．３）は、さらに高い編集割合を示した。このことは、標的ＲＮＡにおいて編集標的であるアデノシン残基の５’側がシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中の標的対応ヌクレオチドの３’側のヌクレオチド残基として、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
（試験例８）
ＨＦＥ遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）ＨＦＥ＿ＲＮＡの合成
　オリゴＤＮＡとして、ＡＧＸＴ＿ＦＷ及びＡＧＸＴ＿ＲＶの代わりに、以下に示すＨＦＥ＿ＦＷ（配列番号４０）及びＨＦＥ＿ＲＶ（配列番号４１）を用いたこと以外は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行って、モデル標的ＲＮＡを発現するｐＵＣ＿ＨＦＥプラスミドを合成し、これを用いてモデル標的ＲＮＡとしてＨＦＥ＿ＲＮＡを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例５３、５８（ＡＤ１＿ＨＦＥ．２、ＡＤ１＿ＨＦＥ．３）及び参考例６（ＡＤ１＿ＨＦＥ）の化合物を用いて、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いて編集誘導能を評価した。
（Ｃ）編集解析の結果
　編集割合の結果を図８に示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型ＲＮＡからなる参考例６（ＡＤ１＿ＨＦＥ、図中では、ＨＦＥのＡＤ１ｇ）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチドの３’側のグアノシンを２’－デオキシグアノシンにした実施例５３（ＡＤ１＿ＨＦＥ．２、図中では、ＨＦＥのＡＤ１ｇ．２）は、高い編集割合を示した。また、標的対応ヌクレオチド位の３’側のグアノシンを２‘－デオキシイノシンにした実施例５８（ＡＤ１＿ＨＦＥ．３、図中では、ＨＦＥのＡＤ１ｇ．３）は、さらに高い編集割合を示した。このことは、標的ＲＮＡにおいて編集標的であるアデノシン残基の５’側がシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中の標的対応ヌクレオチドの３’側のヌクレオチド残基として、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
（試験例９）
ＵＧＴ１Ａ１遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）ＵＧＴ１Ａ１＿ＲＮＡの合成
　オリゴＤＮＡとして、ＡＧＸＴ＿ＦＷ及びＡＧＸＴ＿ＲＶの代わりに、以下に示すＵＧＴ１Ａ１＿ＦＷ（配列番号４２）及びＵＧＴ１Ａ１＿ＲＶ（配列番号４３）を用いたこと以外は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行って、モデル標的ＲＮＡを発現するｐＵＣ＿ＵＧＴ１Ａ１プラスミドを合成し、これを用いてモデル標的ＲＮＡとしてＵＧＴ１Ａ１＿ＲＮＡを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例５４、５９（ＡＤ１＿ＵＧＴ１Ａ１．２、ＡＤ１＿ＵＧＴ１Ａ１．３）及び参考例７（ＡＤ１＿ＵＧＴ１Ａ１）の化合物を用いて、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いて編集誘導能を評価した。
（Ｃ）編集解析の結果
　編集割合の結果を図８に示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型ＲＮＡからなる参考例７（ＡＤ１＿ＵＧＴ１Ａ１、図中では、ＵＧＴ１Ａ１のＡＤ１ｇ）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチドの３’側のグアノシンを２’－デオキシグアノシンにした実施例５４（ＡＤ１＿ＵＧＴ１Ａ１．２、図中では、ＵＧＴ１Ａ１のＡＤ１ｇ．２）は、高い編集割合を示した。また、標的対応ヌクレオチド位の３’側のグアノシンを２'－デオキシイノシンにした実施例５９（ＡＤ１＿ＵＧＴ１Ａ１．３、図中では、ＵＧＴ１Ａ１のＡＤ１ｇ．３）は、さらに高い編集割合を示した。このことは、標的ＲＮＡにおいて編集標的であるアデノシン残基の５’側がシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中の標的対応ヌクレオチドの３’側のヌクレオチド残基として、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
（試験例１０）
ｇＲＮＡの培養細胞内におけるＡＧＸＴ遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡ発現プラスミドの合成
　試験例５（Ａ）で得られたｐＵＣ１９＿ＡＧＸＴを鋳型にして、ＤＳ＿ｄｉｓｅａｓｅ＿ＸｈｏＦ０１プライマー（配列番号４４）及びＤＳ＿ｄｉｓｅａｓｅ＿ＫｐｎＲ０１プライマー（配列番号４５）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，２０秒）により、インサートＤＮＡを作製し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。インサートＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ３．１（－）ＨｙｇｒｏをＸｈｏＩ（ＴａＫａＲａ）及びＫｐｎＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間反応を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。インサート：プラスミドが３：１のモル比となるように加え、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した。選別したコロニーを、ＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミド１００ｎｇをＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１６５μＭのｐｃＤＮＡ３＿１ｐｒｏ＿Ｆ０１プライマー（配列番号４６）及び０．１６５μＭのｐｃＤＮＡ３１－ｓｅｑＲ０１プライマー（配列番号４７）を用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３５００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により配列解析を行ない、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＧＸＴを合成できたことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
（Ｂ）細胞培養
　ＨＥＫ２９３細胞を２４－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅに５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、４８時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて１０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＧＸＴ、５００ｎｇのＡＤＡＲを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ２、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ｐ１１０、又はｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ｐ１５０）と、５０ｎＭのｇＲＮＡ（実施例６０；ＡＤ１＿ＡＧＸＴ．３０）をトランスフェクトし、４８時間培養した。
（Ｃ）編集解析
　２４－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅで培養した細胞から、セパゾール　ＲＮＡ　Ｉ　Ｓｕｐｅｒ　Ｇ（ナカライ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（ＴａＫａＲａ）を用いてＤＮａｓｅ処理を行った後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　０．５μｇ、０．２５μＭ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１７を用いた逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを増幅した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｔ７ｐｒｏＧＧＧプライマー（配列番号３５）、３’－Ａｄｐプライマー（配列番号４８）を用いて１ｓｔ　ＰＣＲを行った。１ｓｔ　ＰＣＲ産物を２００倍希釈したｃＤＮＡを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、ＤＳ＿ｄｉｓｅａｓｅ＿ＸｈｏＦ０１プライマー（配列番号４４）、ＤＳ＿ｄｉｓｅａｓｅ＿ＫｐｎＲ０１プライマー（配列番号４５）を用いて２ｎｄ　ＰＣＲを行い、ＡＧＸＴフラグメントを増幅した。Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ、０．１６５μＭ　ＤＳ＿ｄｉｓｅａｓｅ＿ＸｈｏＦ０１プライマーを用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　３５００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒにより解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合を算出した。
（Ｄ）編集解析の結果
　実施例６０の化合物（ＡＤ１＿ＡＧＸＴ＿３０）を用いた場合の編集割合（％）を図９に示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡをトランスフェクトした場合、３０％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、６０％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、７０％程度の高い編集割合を示した。
（試験例１１）
ｇＲＮＡの培養細胞内におけるＧＮＥ遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集誘導能評価
　ｐＵＣ１９＿ＡＧＸＴの代わりに、試験例６（Ａ）で得られたｐＵＣ１９＿ＧＮＥを鋳型にして標的ＲＮＡ発現プラスミドを構築したことと、ｇＲＮＡとして実施例６１のＡＤ１＿ＧＮＥ＿３０を用いたこと以外は、試験例１０の（Ａ）から（Ｃ）に準じて、ｇＲＮＡの培養細胞内におけるＧＮＥ遺伝子配列の編集誘導能を評価した。
　実施例６１の化合物（ＡＤ１＿ＧＮＥ＿３０）を用いた場合の編集割合（％）を図９に示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡをトランスフェクトした場合、１０％程度の編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、５０％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、６０％程度の高い編集割合を示した。
（試験例１２）
ｇＲＮＡの培養細胞内におけるＥＹＳ遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集誘導能評価
　ｐＵＣ１９＿ＡＧＸＴの代わりに、試験例７（Ａ）で得られたｐＵＣ１９＿ＥＹＳを鋳型にして標的ＲＮＡ発現プラスミドを構築したことと、ｇＲＮＡとして実施例６２のＡＤ１＿ＥＹＳ＿２９を用いたこと以外は、試験例１０の（Ａ）から（Ｃ）に準じて、ｇＲＮＡの培養細胞内におけるＥＹＳ遺伝子配列の編集誘導能を評価した。
　実施例６２の化合物（ＡＤ１＿ＥＹＳ＿２９）を用いた場合の編集割合（％）を図９に示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡをトランスフェクトした場合、１０％程度の編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、４０％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、５０％から６０％程度の高い編集割合を示した。
（試験例１３）
ｇＲＮＡの培養細胞内におけるＨＦＥ遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集誘導能評価
　ｐＵＣ１９＿ＡＧＸＴの代わりに、試験例８（Ａ）で得られたｐＵＣ１９＿ＨＦＥを鋳型にして標的ＲＮＡ発現プラスミドを構築したことと、ｇＲＮＡとして実施例６３のＡＤ１＿ＨＦＥ＿２９を用いたこと以外は、試験例１０の（Ａ）から（Ｃ）に準じて、ｇＲＮＡの培養細胞内におけるＨＦＥ遺伝子配列の編集誘導能を評価した。
　実施例６３の化合物（ＡＤ１＿ＨＦＥ＿２９）を用いた場合の編集割合（％）を図９に示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡをトランスフェクトした場合、１０％程度の編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、４０％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、５０％程度の高い編集割合を示した。
（試験例１４）
ｇＲＮＡの培養細胞内におけるＵＧＴ１Ａ１遺伝子配列を有するモデル標的ＲＮＡに対する編集誘導能評価
　ｐＵＣ１９＿ＡＧＸＴの代わりに、試験例９（Ａ）で得られたｐＵＣ１９＿ＵＧＴ１Ａ１を鋳型にして標的ＲＮＡ発現プラスミドを構築したことと、ｇＲＮＡとして実施例６４のＡＤ１＿ＵＧＴ１Ａ１＿３０を用いたこと以外は、試験例１０の（Ａ）から（Ｃ）に準じて、ｇＲＮＡの培養細胞内におけるＵＧＴ１Ａ１遺伝子配列の編集誘導能を評価した。
　実施例６４の化合物（ＡＤ１＿　ＵＧＴ１Ａ１＿３０）を用いた場合の編集割合（％）を図９に示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡをトランスフェクトした場合、１０％程度の編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、４０％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、６０％程度の高い編集割合を示した。
（参考例８から２２）
　疾患配列を標的とした標的編集ガイドＲＮＡとして、以下に示す配列を有し、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からからオリゴヌクレオチドを、参考例１と同様にホスホロアミダイト法により合成した。表中の「分子量」は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示し、「－」は未測定であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　表中の「配列」において大文字はＲＮＡを示す。参考例８から２２のオリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端は、水素原子が酸素原子に結合して水酸基となっている。
（実施例６５から１３６）
　実施例６５から１３６の化合物は、それぞれ参考例２、参考例８から２２のオリゴヌクレオチドの配列を元にして、表２１から表２４に示すように修飾ヌクレオチドを導入することで得られたものである。これらのオリゴヌクレオチドは、参考例１と同様にホスホロアミダイト法で合成した。なお、配列中、「ｅｃ」の部分を合成する際には、Ｎ３－Ｅｔｈｙｌ　ｄｅｏｘｙ　Ｃｙｔｉｄｉｎｅ　ＣＥＤ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　（ＣｈｅｍＧｅｎｅ、カタログ番号：ＡＮＰ－３８５６）を用いた。「Ｔ」の部分を合成する際には、Ｒｉｂｏ　Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ＣＥＤ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　（ＣｈｅｍＧｅｎｅ、カタログ番号：ＡＮＰ－７５１１）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　表中の「分子量」は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。表中の「配列」において「Ｔ」は、リボチミジン、「ｅｃ」は、Ｎ３－エチル－２’－デオキシシチジンを示す。また、その他の略号については、既述の通りである。なお、オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端は、水素原子が酸素原子と結合して水酸基となっている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
（試験例１５）実施例化合物であるｇＲＮＡの培養細胞内におけるＧＡＰＤＨ遺伝子配列の編集誘導能評価（３）
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例３と同様の方法を用いた。実施例３９、４０及び１０２から１０６の化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４０、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿５２からｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿５６）を用いた場合の編集割合（％）を図１０に示した。
　ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかったもの（図中、ｇＲＮＡ（－））と比較して高い編集割合を示した。特に、標的ＲＮＡとの結合部位にＬＮＡを導入した実施例３９、４０及び１０２の化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４０、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿５２）は、最も高い編集割合を示した。さらに、実施例化合物であるｇＲＮＡのみを５０ｎＭの濃度になるようにトランスフェクトした場合の細胞内編集誘導評価したところ、ｇＲＮＡ（－）と比較して高い編集割合を示した。
　実施例３９、１００、１０１、１０５及び１０７から１１２の化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４２、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿４５、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿５５、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿５７からｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿６２）を用いた場合の編集割合（％）を図１１に示した。
　ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかったもの（図中、ｇＲＮＡ（－））と比較して高い編集割合を示した。特に、標的ＲＮＡとの結合部位にＬＮＡを導入した実施例３９、１０５及び１１２の化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿５５、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿６２）は、最も高い編集割合を示した。さらに、実施例化合物であるｇＲＮＡのみを５０ｎＭの濃度になるようにトランスフェクトした場合の細胞内編集誘導評価したところ、ｇＲＮＡ（－）と比較して高い編集割合を示した。
　実施例化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿６２からｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿７５）を用いた場合の編集割合（％）を図１２Ａに示した。
　ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかったもの（図中、ｇＲＮＡ（－））と比較して高い編集割合を示した。特に、標的対応ヌクレオチド残基としてデオキシヌクレオチド残基又はリボヌクレオチド残基を導入した実施例３９、１１２、１１５から１１８、及び１２０の化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿６２、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿６５からｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿６８、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿７０）は、特に高い編集割合を示した。さらに、実施例化合物であるｇＲＮＡのみを５０ｎＭの濃度になるようにトランスフェクトした場合の細胞内編集誘導評価したところ、ｇＲＮＡ（－）と比較して高い編集割合を示した。
　実施例化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿７６からｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿８５）を用いた場合の編集割合（％）を図１２Ｂに示した。
　ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合、ｇＲＮＡを用いなかったもの（図中、ｇＲＮＡ（－））と比較して高い編集割合を示した。特に、標的対応ヌクレオチド残基として２’－Ｏ－Ｍｅ－リボヌクレオチド残基を導入した実施例１３１から１３３、１３５の化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿８１からｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿８３、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿８５）は、特に高い編集割合を示した。
（試験例１６）ｈＧＡＰＤＨ遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
　操作は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下のＧＡＰＤＨ＿ＦＷ（配列番号６４）及びＧＡＰＤＨ＿ＲＶ（配列番号６５）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析の結果
　ＡＤＡＲ１ｐ１１０による編集割合の結果を図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、ｇＲＮＡを添加していない場合と比較して、実施例３９、１１２から１３５の化合物（ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿３９、ｈＧＡＰＤＨ＿ＡＤ１＿６２から８５）は、高い編集割合を示した。特に標的対応ヌクレオチド残基にデオキシリボヌクレオチド残基、リボヌクレオチド残基、２’－Ｆ－リボヌクレオチド残基又は２’－Ｏ－Ｍｅ－リボヌクレオチド残基を用いたものは、高い編集割合を示すことを表している。
（試験例１７）Ｆａｃｔｏｒ　Ｖ遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
　操作は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したＦａｃｔｏｒ　Ｖ遺伝子配列を有するものを用いた。ここで用いるＦａｃｔｏｒ　Ｖ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿０００１３０．４５の１６８２番から１７０６番の塩基配列を有し、さらにｃ．１６０１Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ６０２５）を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例５の（Ｂ）及び（Ｄ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析の結果
　ＡＤＡＲ１ｐ１１０による編集割合の結果を図１４Ａに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例８の化合物（ＡＤ１＿Ｆａｃｔｏｒ　Ｖ、図中では、Ｆａｃｔｏｒ　ＶのＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例６５の化合物（ＡＤ１＿Ｆａｃｔｏｒ　Ｖ．３、図中では、Ｆａｃｔｏｒ　ＶのＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
　ＡＤＡＲ２による編集割合の結果を図１４Ｂに示す。ＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例８の化合物（ＡＤ１＿Ｆａｃｔｏｒ　Ｖ、図中では、Ｆａｃｔｏｒ　ＶのＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例６５（ＡＤ１＿Ｆａｃｔｏｒ　Ｖ．３、図中では、Ｆａｃｔｏｒ　ＶのＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
（試験例１８）ＣＢＳ遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
　操作は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したＣＢＳ遺伝子配列を有するものを用いた。ここで用いるＣＢＳ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿００００７１．２の１５６１番から１５８５番の塩基配列を有し、さらにｃ．１３３０Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ２８９３４８９１）を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析の結果
　ＡＤＡＲ１ｐ１１０による編集割合の結果を図１４Ａに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例１２の化合物（ＡＤ１＿ＣＢＳ、図中では、ＣＢＳのＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例６９の化合物（ＡＤ１＿ＣＢＳ．３、図中では、ＣＢＳのＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
　ＡＤＡＲ２による編集割合の結果を図１４Ｂに示す。ＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例１２の化合物（ＡＤ１＿ＣＢＳ、図中では、ＣＢＳのＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例６９の化合物（ＡＤ１＿ＣＢＳ．３、図中では、ＣＢＳのＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
（試験例１９）ＰＡＨ遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
　操作は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したＰＡＨ遺伝子配列を有するものを用いた。ここで用いるＰＡＨ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿０００２７７．３の８８２番から９０６番の塩基配列を有し、さらにｃ．７８２Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ５０３０８４９）を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析の結果
　ＡＤＡＲ１ｐ１１０による編集割合の結果を図１４Ａに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例９の化合物（ＡＤ１＿ＰＡＨ．１、図中では、ＰＡＨのＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例６６の化合物（ＡＤ１＿ＰＡＨ．１．３、図中では、ＰＡＨのＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
　ＡＤＡＲ２による編集割合の結果を図１４Ｂに示す。ＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例９の化合物（ＡＤ１＿ＰＡＨ．１、図中では、ＰＡＨのＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例６６の化合物（ＡＤ１＿ＰＡＨ．１．３、図中では、ＰＡＨのＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
（試験例２０）ＡＳＳ１遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
　操作は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したＡＳＳ１遺伝子配列を有するものを用いた。ここで用いるＡＳＳ１遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿００００５０．４の１５１０番から１５３４番の塩基配列を有し、さらにｃ．１１６８Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ１２１９０８６４１）を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析の結果
　ＡＤＡＲ１ｐ１１０による編集割合の結果を図１４Ａに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例１０の化合物（ＡＤ１＿ＡＳＳ１、図中では、ＡＳＳ１のＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例６７の化合物（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３、図中では、ＡＳＳ１のＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側がシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
　ＡＤＡＲ２による編集割合の結果を図１４Ｂに示す。ＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例１０の化合物（ＡＤ１＿ＡＳＳ１、図中では、ＡＳＳ１のＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例６７の化合物（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３、図中では、ＡＳＳ１のＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
（試験例２１）ＧＲＩＡ２遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
　操作は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したＧＲＩＡ２遺伝子配列を有するものを用いた。ここで用いるＧＲＩＡ２遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿０００８２６．４の２１２１番から２１４５番の塩基配列を有し、さらに２１３５番目のアデノシンが、ＡＬＳの疾患においてＡＤＡＲ２の発現が低下した場合、イノシンへの編集効率が低下する部位となっている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析の結果
　ＡＤＡＲ１ｐ１１０による編集割合の結果を図１４Ａに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例１３の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２、図中では、ＧＲＩＡ２のＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例７０の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３、図中では、ＧＲＩＡ２のＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
　ＡＤＡＲ２による編集割合の結果を図１４Ｂに示す。ＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例１３の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２、図中では、ＧＲＩＡ２のＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例７０の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３、図中では、ＧＲＩＡ２のＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
（試験例２２）ＳＬＣＯ２Ａ１遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
　操作は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したＳＬＣＯ２Ａ１遺伝子配列を有するものを用いた。ここで用いるＳＬＣＯ２Ａ１遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿００５６３０．３の８１０２０番から８１０４４番の塩基配列を有し、さらにｃ．９４０＋１Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ７６５２４９２３８）を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析の結果
　ＡＤＡＲ１ｐ１１０による編集割合の結果を図１４Ａに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例１４の化合物（ＡＤ１＿ＳＬＣＯ２Ａ１、図中では、ＳＬＣＯ２Ａ１のＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例７１の化合物（ＡＤ１＿　ＳＬＣＯ２Ａ１．３、図中では、ＳＬＣＯ２Ａ１のＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
　ＡＤＡＲ２による編集割合の結果を図１４Ｂに示す。ＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例１４の化合物（ＡＤ１＿ＳＬＣＯ２Ａ１、図中では、ＳＬＣＯ２Ａ１のＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例７１の化合物（ＡＤ１＿ＳＬＣＯ２Ａ１．３、図中では、ＳＬＣＯ２Ａ１のＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
（試験例２３）ＧＦＡＰ遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
　操作は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したＧＦＡＰ遺伝子配列を有するものを用いた。ここで用いるＧＦＡＰ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿００２０５５．５の２１５４番から２１７８番の塩基配列を有し、さらにｃ．７１６Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ５９５６５９５０）を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析の結果
　ＡＤＡＲ１ｐ１１０による編集割合の結果を図１４Ａに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例１１の化合物（ＡＤ１＿ＧＦＡＰ、図中では、ＧＦＡＰのＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例６８の化合物（ＡＤ１＿ＧＦＡＰ．３、図中では、ＧＦＡＰのＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
　ＡＤＡＲ２による編集割合の結果を図１４Ｂに示す。ＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集効率は、すべてが天然型リボヌクレオチド残基からなる参考例１１の化合物（ＡＤ１＿ＧＦＡＰ、図中では、ＧＦＡＰのＡＤ１ｇ０３）と比較して、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のグアノシンを２’－デオキシイノシンにした実施例６８の化合物（ＡＤ１＿ＧＦＡＰ、図中では、ＧＦＡＰのＡＤ１ｇ０３．３）は、高い編集割合を示した。このことは、編集部位の５’側のヌクレオシドがシチジンの場合は、ｇＲＮＡ中、標的対応ヌクレオチド残基の３’側のヌクレオシドとして、２’－デオキシイノシンを用いると高い編集割合を示すことを表している。
（試験例２４）ＡＳＳ１遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
　操作は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、試験例２０に記載したＡＳＳ１遺伝子配列を有するものを用いた。ここで用いるＡＳＳ１遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿００００５０．４の１５１０番から１５３４番の塩基配列を有し、さらにｃ．１１６８Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ１２１９０８６４１）を有している。
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析の結果
　実施例７６（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９）を用いた編集割合の結果を図１５Ａに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０による、化学修飾された実施例７６の化合物（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９）のＲＮＡ編集効率は、ｇＲＮＡを添加していないものと比較して、高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＡＳＳ１遺伝子配列を修復できることを示している。
　実施例８１の化合物（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９ｅ）及び実施例８５の化合物（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．５２ｅ）を用いた編集割合の結果を図１５Ｂに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０による、化学修飾された実施例８１の化合物（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９ｅ）及び実施例８５の化合物（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．５２ｅ）のＲＮＡ編集効率は、ｇＲＮＡを添加していないものと比較して、高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＡＳＳ１遺伝子配列を修復できることを示している。
（試験例２５）ＰＡＮＫ２遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
　操作は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したＰＡＮＫ２遺伝子配列を有するものを用いた。ここで用いるＰＡＮＫ２遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿１５３６３８．３の１７１４番から１７３８番の塩基配列を有し、さらにｃ．１５６１Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ１３７８５２９５９）を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析の結果
　実施例７６の化合物（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９）を用いた編集割合の結果を図１５Ａに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０による、化学修飾された実施例７６の化合物（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９）のＲＮＡ編集効率は、ｇＲＮＡを添加していないものと比較して、高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＰＡＮＫ２遺伝子配列を修復できることを示している。
　また、実施例８２の化合物（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９ｅ）及び実施例８６の化合物（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．５２ｅ）を用いた編集割合の結果を図１５Ｃに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０による、化学修飾された実施例７６の化合物（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９）のＲＮＡ編集効率は、ｇＲＮＡを添加していないものと比較して、高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＰＡＮＫ２遺伝子配列を修復できることを示している。
（試験例２６）ＮＰＨＳ２遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
　操作は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したＮＰＨＳ２遺伝子配列を有するものを用いた。ここで用いるＮＰＨＳ２遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿０１４６２５．４の４８３番から５０１番の塩基配列を有し、さらにｃ．４１３Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ７４３１５３４２）を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析の結果
　実施例７７（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９）を用いた編集割合の結果を図１５Ａに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０による、化学修飾された実施例７７の化合物（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９）のＲＮＡ編集効率は、ｇＲＮＡを添加していないものと比較して、高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＮＰＨＳ２遺伝子配列を修復できることを示している。
　また、実施例８３の化合物（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９ｅ）及び実施例８７の化合物（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．５２ｅ）を用いた編集割合の結果を図１５Ｄに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０による、化学修飾された実施例７７の化合物（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９）のＲＮＡ編集効率は、ｇＲＮＡを添加していないものと比較して、高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＮＰＨＳ２遺伝子配列を修復できることを示している。
（試験例２７）ＧＲＩＡ２遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
　操作は、試験例５の（Ａ）ＡＧＸＴ＿ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、試験例２１に記載したＧＲＩＡ２遺伝子配列を有するものを用いた。ここで用いるＧＲＩＡ２遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿０００８２６．４の２１２１番から２１４５番の塩基配列を有し、さらに２１３５番目のアデノシンが、ＡＬＳの疾患においてＡＤＡＲ２の発現が低下した場合、イノシンへの編集効率が低下する部位となっている。
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
　実施例化合物の編集誘導能評価の方法は、試験例５の（Ｂ）から（Ｄ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析の結果
　実施例７８の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９）、実施例８０の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９ｅ）及び実施例８４の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．５２ｅ）を用いた編集割合の結果を図１５Ｅに示す。ＡＤＡＲ１ｐ１１０による、化学修飾された実施例７８の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９）、実施例８０の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９ｅ）及び実施例８４の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．５２ｅ）のＲＮＡ編集効率は、ｇＲＮＡを添加していないものと比較して、高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＧＲＩＡ２遺伝子配列を修復できることを示している。本実施例の化合物は、変異したＧＲＩＡ２遺伝子配列の２２７９番目のアデノシン部位をイノシンへの編集効率を向上できることを示している。
（試験例２８）実施例化合物であるｇＲＮＡの培養細胞内におけるＰＡＨ遺伝子配列の編集誘導能評価
　以下のＰＡＨ遺伝子を発現する標的ＲＮＡ発現プラスミドを構築したこと、ｇＲＮＡとして実施例７２から７４の化合物を用いたこと、及びＰＡＨ遺伝子に対応するプライマーを用いたこと以外は、試験例１０の（Ａ）から（Ｃ）と同様の方法を用いた。ここで用いるＰＡＨ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．　ＮＭ＿００１３５４３０４．２の１１４６３８番から１１４６６２番の塩基配列を有し、さらにｃ．１０６６－１１Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ５０３０８５５）を有している。
　実施例７２から７４の化合物（ＡＤ１＿ＰＡＨ．２．２９、ＡＤ１＿ＰＡＨ．２．４１、ＡＤ１＿ＰＡＨ．２．４３）を用いた場合の編集割合（％）を図１６に示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡをトランスフェクトした場合、５％程度の編集割合を示した。さらに標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、１０％から４０％程度の高い編集割合を示した。一方、標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、４０％から６０％程度のさらに高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＰＡＨ遺伝子配列を修復できることを示している。
（試験例２９）実施例化合物であるｇＲＮＡの培養細胞内におけるＡＳＳ１遺伝子配列の編集誘導能評価
　以下のＡＳＳ１遺伝子を発現する標的ＲＮＡ発現プラスミドを構築したこと、ｇＲＮＡとして実施例７５、７９、８１及び８５の化合物を用いたこと、及びＡＳＳ１に対応するプライマーを用いたこと以外は、試験例１０の（Ａ）及び（Ｂ）と同様の方法を用いた。ここで用いるＡＳＳ１遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿００００５０．４の１５１０番から１５３４番の塩基配列を有し、さらにｃ．１１６８Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ１２１９０８６４１）を有している。
　編集解析は、以下のように行った。２４－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅで培養した細胞から、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　０．５μｇ、０．２５μＭ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１７を用いた逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを増幅した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｔ７ｐｒｏＧＧＧプライマー（配列番号３５）、３’－Ａｄｐプライマー（配列番号４８）を用いて１ｓｔ　ＰＣＲを行った。１ｓｔ　ＰＣＲ産物を２００倍希釈したｃＤＮＡを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、ＤＳ＿ｄｉｓｅａｓｅ＿ＸｈｏＦ０１プライマー（配列番号４４）、ＤＳ＿ｄｉｓｅａｓｅ＿ＫｐｎＲ０１プライマー（配列番号４５）を用いて２ｎｄ　ＰＣＲを行い、ＡＳＳ１フラグメントを増幅した。Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ、０．１６５μＭ　ＤＳ＿ｄｉｓｅａｓｅ＿ＸｈｏＦ０１プライマーを用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　３５００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒにより解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合を算出した。
　実施例７５及び実施例７９の化合物（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９、ＡＤ１＿ＡＳＳ１．５２）を用いた場合の編集割合（％）を図１７Ａに示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡをトランスフェクトした場合、５％から１０％程度の編集割合を示した。さらに標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、２０％から５０％程度の高い編集割合を示した。一方、標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、さらに４０％から８０％程度のさらに高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＡＳＳ１遺伝子配列を修復できることを示している。
　また、実施例８１及び実施例８５の化合物（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９ｅ、ＡＤ１＿ＡＳＳ１．５２ｅ）を用いた場合の編集割合（％）を図１８Ａに示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡをトランスフェクトした場合、５％程度の編集割合を示した。さらに標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、２０％から４０％程度の高い編集割合を示した。一方、標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、さらに４０％から８０％程度のさらに高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＡＳＳ１遺伝子配列を修復できることを示している。
（試験例３０）実施例化合物であるｇＲＮＡの培養細胞内におけるＰＡＮＫ２遺伝子配列の編集誘導能評価
　以下のＰＡＮＫ２遺伝子を発現する標的ＲＮＡ発現プラスミドを構築したこと、ｇＲＮＡとして実施例７６、８２及び８６の化合物を用いたこと、及びＰＡＮＫ２遺伝子に対応するプライマーを用いたこと以外は、試験例１０の（Ａ）及び（Ｂ）と同様の方法を用い、編集解析には試験例２９に記載の編集解析の方法と同様の方法を用いた。ここで用いるＰＡＮＫ２遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿１５３６３８．３の１７１４番から１７３８番の塩基配列を有し、さらにｃ．１５６１Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ１３７８５２９５９）を有している。
　実施例７６の化合物（ＡＤ１＿ＰＩＮＫ２．３９）を用いた場合の編集割合（％）を図１７Ｂに示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡをトランスフェクトした場合、５％程度の編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、２０％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、４０％から５０％程度の高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＰＡＮＫ２遺伝子配列を修復できることを示している。
　また、実施例８２の化合物（ＡＤ１＿ＰＩＮＫ２．３９ｅ）及び実施例８５の化合物（ＡＤ１＿ＰＩＮＫ２．５２ｅ）を用いた場合の編集割合（％）を図１８Ｂに示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡをトランスフェクトした場合、５％程度の編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、１０％から２０％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、３０％から５０％程度の高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＰＡＮＫ２遺伝子配列を修復できることを示している。
（試験例３１）実施例化合物であるｇＲＮＡの培養細胞内におけるＮＰＨＳ２遺伝子配列の編集誘導能評価
　以下のＮＰＨＳ２遺伝子を発現する標的ＲＮＡ発現プラスミドを構築したこと、ｇＲＮＡとして実施例７７、８３及び８７の化合物を用いたこと、及びＮＰＨＳ２遺伝子に対応するプライマーを用いたこと以外は、試験例１０の（Ａ）及び（Ｂ）と同様の方法を用い、編集解析には試験例２９に記載の編集解析の方法と同様の方法を用いた。ここで用いるＮＰＨＳ２遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿０１４６２５．４の４８３番から５０１番の塩基配列を有し、さらにｃ．４１３Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ７４３１５３４２）を有している。
　実施例７７の化合物（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９）を用いた場合の編集割合（％）を図１７Ｃに示す。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、１０％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、２０％程度の高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＮＰＨＳ２遺伝子配列を修復できることを示している。
　また、実施例８３の化合物（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．３９ｅ）及び実施例８７の化合物（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ．５２ｅ）を用いた場合の編集割合（％）を図１８Ｃに示す。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、１０％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、２０％程度の高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＮＰＨＳ２遺伝子配列を修復できることを示している。
（試験例３２）実施例化合物であるｇＲＮＡの培養細胞内におけるＧＲＩＡ２遺伝子配列の編集誘導能評価
　以下のＧＲＩＡ２遺伝子を発現する標的ＲＮＡ発現プラスミドを構築したこと、ｇＲＮＡとして実施例７８、８０及び８４の化合物を用いたこと、及びＧＲＩＡ２遺伝子に対応するプライマーを用いたこと以外は、試験例１０の（Ａ）及び（Ｂ）と同様の方法を用い、編集解析には試験例２９に記載の編集解析の方法と同様の方法を用いた。ここで用いるＧＲＩＡ２遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿０００８２６．３の２２６５番から２２８９番の塩基配列を有し、さらに２２７９番目のアデノシンが、ＡＬＳの疾患においてＡＤＡＲ２の発現が低下した場合、イノシンへの編集効率が低下する部位となっている。
　実施例７８の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９）、実施例８０の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９ｅ）及び実施例８４の化合物（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．５２ｅ）を用いた場合の編集割合（％）を図１８Ｄに示す。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、４０％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、４０％から６０％程度の高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＧＲＩＡ２遺伝子配列の２２７９番目のアデノシン部位をイノシンへの編集効率を向上できることを示している。
（試験例３３）実施例化合物であるｇＲＮＡのモデル標的ＲＮＡ（Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ）に対する編集誘導能評価
（Ａ）編集部位の５’側の隣の塩基配列がＧであるＲＮＡの合成
　編集部位の５’側の隣の塩基配列がＧであるものは、国際公開第２０２１／０６０５２７号の実施例１０に記載のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡを用いた。また、編集部位の５’側の隣の塩基配列がＡであるものは、以下に記載したオリゴＤＮＡを用いて調製した。
（Ｂ）編集部位の５’側の隣の塩基配列がＡであるＲＮＡの合成
　常法により調製したｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２＿Ｒｌｕｃ＿Ｗ１０４Ｘを鋳型にして、５’側断片をＲＬ＿ｓ０１＿Ｇ２８６Ａ＿ＥｃｏＦ１プライマー（配列番号６４）とＲｌｕｃ＿Ｇ２８６Ａ＿Ｒ０１プライマー（配列番号６５）、３’側断片をＲｌｕｃ＿Ｇ２８６Ａ＿Ｆ０１プライマー（配列番号６６）とＲＬ＿ｓ０１＿Ｇ２８６Ａ＿ＨｉｎＲ１プライマー（配列番号６７）を用いてＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により１ｓｔ　ＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃、１０秒、アニーリング：５５℃、１５秒、伸長：６８℃、２０秒）を行なった。次に、それぞれのＰＣＲ産物を１００倍希釈し、ＲＬ＿ｓ０１＿Ｇ２８６Ａ＿ＥｃｏＦ１プライマー（配列番号６４）及びＲＬ＿ｓ０１＿Ｇ２８６Ａ＿ＨｉｎＲ１プライマー（配列番号６７）を用いてＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により２ｎｄ　ＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃、１０秒、アニーリング：５５℃、１５秒、伸長：６８℃、２０秒）を行ない、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４ＸのＧ２８６をＡに変異させた配列と制限酵素サイトを有するＤＮＡ（Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ＿Ｇ２８６Ａ＿Ｅｃｏ／Ｈｉｄ）（配列番号７２）を得た。ｐＵＣ１９及び得られたＤＮＡをＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間の制限酵素消化を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿によりそれぞれのＤＮＡを精製した。制限酵素消化後のＲｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ＿Ｇ２８６ＡとｐＵＣ１９を１：３のモル比となるように混合し、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した。選別したコロニーをＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。その後、塩基配列解析により得られたプラスミドの配列を確認した。配列を確認したプラスミドを鋳型に、Ｔ７＿Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１（配列番号６８）及びＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号６９）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃　１０秒、アニーリング：５５℃　１５秒、伸長：６８℃　２０秒））により、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応用の鋳型ＤＮＡを増幅し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ　Ｔ７　Ｋｉｔ　（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写を行なってＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｇ２８６Ａ（配列番号７３）を得た。合成後のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｇ２８６Ａは、８Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用いて切り出し精製を行ない、以降の試験に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
（Ｃ）編集誘導能評価
　国際公開第２０２１／０６０５２７号の実施例１０に記載の方法に従って、編集誘導能を評価した。
（Ｄ）編集解析の結果
　編集部位の５’側隣のヌクレオシドがＧであるＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡに対する編集活性を、実施例８８から９６の化合物について評価した。その結果を図１９に示す。国際公開第２０２１／０６０５２７号の実施例１０に記載されているＡＤ１ｇ＿０３＿ＲＬ＿Ａ２８７及びＡＤ１ｇ＿０３＿ＲＬ＿Ａ２８７＿ＧＧを、それぞれ参考例１５及び１６として比較した。参考例１５の化合物は、図１９の中でＡＤ１ｇ＿ＲＬ＿Ａ２８７＿ＧＣと記載し、参考例１６の化合物は、図１９の中でＡＤ１ｇ＿ＲＬ＿Ａ２８７＿ＧＧと記載している。参考例１６の化合物は、参考例１５の化合物よりも高い編集活性を示し、国際公開第２０２１／０６０５２７号の実施例１０に記載に一致した。さらに、実施例８８から９６の化合物を評価したところ、編集部位の５’側隣のヌクレオシドのＧに対して、２’－デオキシグアノシン、又は２’－デオキシイノシンとした実施例８９及び９０の化合物が、参考例１６の化合物よりも高い編集活性を示した。特に、編集部位の５’側隣のヌクレオシドのＧに対して２’－デオキシイノシンとした実施例９０の化合物が最も高い活性を示した。
　編集部位の５’側隣のヌクレオシドがＡであるＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡに対する編集活性を、実施例８８から９６の化合物について評価した。その結果を図２０に示す。実施例８８から９６の化合物を評価したところ、編集部位の５’側隣のヌクレオシドのＡに対して、チミジン又は２’－デオキシウリジンとした実施例９１及び９３の化合物が、高い編集活性を示した。特に編集部位の５’側隣のヌクレオシドのＡに対して２’－デオキシウリジンとした実施例９３の化合物が最も高い活性を示した。
　編集部位の５’側隣のヌクレオシドがＧであるＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡに対する編集活性を、実施例９０及び９７の化合物について評価した。その結果を図２１Ａに示す。編集部位の５’側隣のヌクレオシドのＧに対して２’－デオキシイノシンとした実施例９０の化合物と同程度の効率で、すべてを化学修飾した実施例９７の化合物が高い活性を示した。
　編集部位の５’側隣のヌクレオシドがＡであるＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡに対する編集活性を、実施例９１、９３、９８及び９９の化合物について評価した。その結果を図２１Ｂに示す。編集部位の５’側隣のヌクレオシドのＡに対して、チミジン又は２’－デオキシウリジンとした実施例９１及び９３の化合物と同程度以上の効率で、すべてを化学修飾した実施例９８及び，９９の化合物が高い活性を示した。
（試験例３４）実施例化合物であるｇＲＮＡの培養細胞内における標的ＲＮＡ（Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ）の編集誘導能評価
（Ａ）編集部位の５’側の隣の塩基配列がＧであるＲＮＡ（ＧＡＮ＿ＲＮＡ）発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ）及び編集部位の５’側の隣の塩基配列がＡであるＲＮＡ（ＡＡＮ＿ＲＮＡ）発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｇ２８６Ａ）の合成
　ＧＡＮ＿ＲＮＡ発現プラスミドの構築は、常法により調製したｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２＿Ｒｌｕｃ＿Ｗ１０４Ｘを鋳型とし、ＡＡＮ＿ＲＮＡ発現プラスミドの構築は、常法により調製したｐＵＣ１９＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ＿Ｇ２８６Ａを鋳型にした。鋳型に対して、Ｒｌｕｃ＿ｓ０１＿ＢａｍＦ１プライマー（配列番号７４）及びＲＬ＿ｓ０１＿Ｇ２８６Ａ＿ＨｉｎＲ１プライマー（配列番号７５）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃、１０秒、アニーリング：５５℃、１５秒、伸長：６８℃、２０秒）により、インサートＤＮＡを作製し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。インサートＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ３．１（－）ＨｙｇｒｏをＢａｍＨＩ（ＴａＫａＲａ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間反応を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。インサート：プラスミドが３：１のモル比となるように加え、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した。選別したコロニーを、ＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミド１００ｎｇをＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１６５μＭのｐｃＤＮＡ３＿１ｐｒｏ＿Ｆ０１プライマー（配列番号７６）及び０．１６５μＭのｐｃＤＮＡ３１－ｓｅｑＲ０１プライマー（配列番号７７）を用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３５００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により配列解析を行ない、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ及びｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｇ２８６Ａが合成できたことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
（Ｂ）細胞培養
　ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＧＸＴの代わりに、ｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ及びｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｇ２８６Ａを用いたこと、ｇＲＮＡとして実施例９７から９９の化合物を用いたこと以外は、試験例１０の（Ｂ）と同様の方法を用いた。
（Ｃ）編集解析
　２４－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅで培養した細胞から、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（Ｒ）　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　０．５μｇを用いた逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを増幅した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（ＴａＫａＲａ）、Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号７８）、Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号７９）を用いてＰＣＲを行い、フラグメントを増幅した。Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ、０．１６５　μＭ　Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマーを用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　３５００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒにより解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
（Ｄ）編集解析の結果
　編集部位の５’側隣のヌクレオシドがＧであるＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡに対して、実施例９７の化合物を用いた場合の編集割合（％）を図２２に示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、５％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、１０％から２０％程度の高い編集割合を示した。
　編集部位の５’側隣のヌクレオシドがＡであるＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡに対して、実施例９８及び９９の化合物を用いた場合の編集割合（％）を図２２に示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、５％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、２５％から３５％程度の高い編集割合を示した。
（試験例３５）実施例化合物であるｇＲＮＡの培養細胞内におけるＡ１ＡＴ遺伝子配列の編集誘導能評価
　以下のＡ１ＡＴ遺伝子を発現する標的ＲＮＡ発現プラスミドを構築したこと、ｇＲＮＡとして実施例７２から７４の化合物を用いたこと、及びＡ１ＡＴ遺伝子に対応するプライマーを用いたこと以外は、試験例１０の（Ａ）及び（Ｂ）と同様の方法を用い、編集解析には試験例２９に記載の編集解析の方法と同様の方法を用いた。ここで用いるＡ１ＡＴ（ＳＥＲＰＩＮＡ１ともいう）遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿０００２９５．５の１１２９番から１１５３番の塩基配列を有し、さらにｃ．１０９６Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ２８９２９４７４）を有している。
　実施例１３６の化合物（ＡＤ１＿Ａ１ＡＴ．３９）を用いた場合の編集割合（％）を図２３Ａに示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、２０％程度の高い編集割合を示した。標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、４０％から５０％程度の高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＡ１ＡＴ遺伝子配列を修復できることを示している。
（試験例３６）実施例化合物であるｇＲＮＡの培養細胞内におけるＡ１ＡＴ遺伝子配列の編集誘導能評価
　ここで用いるＡ１ＡＴ（ＳＥＲＰＩＮＡ１ともいう）遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＮＭ＿０００２９５．５の塩基配列を有し、さらにＺ－Ａ１ＡＴは、ｃ．１０９６Ｇ＞Ａと呼ばれるヌクレオシドの変異（ｒｓ２８９２９４７４）を有している。
（Ａ）Ａ１ＡＴ及びＺ－Ａ１ＡＴ発現プラスミドの合成
ＨｅｐＧ２細胞から、セパゾール　ＲＮＡ　Ｉ　Ｓｕｐｅｒ　Ｇ（ナカライ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（ＴａＫａＲａ）を用いてＤＮａｓｅ処理を行った後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　０．５μｇ、０．２５μＭ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１７を用いた逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを増幅した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、ＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＤＳ＿ＸｂａＦ１プライマー（配列番号８０）、ＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＤＳ＿ＨｉｎＲ１プライマー（配列番号８１）を用いてＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃、１０秒、アニーリング：５５℃、１５秒、伸長：６８℃、１分３０秒）を行ない、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、ＳＥＲＰＩＮＡ１のＣＤＳ配列（ＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＤＳ）（配列番号８８）を有するＤＮＡを得た。ｐＵＣ１９及び得られたＤＮＡをＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間反応を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。インサート：プラスミドが３：１のモル比となるように加え、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した。選別したコロニーを、ＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミド１００ｎｇをＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１６５μＭのｐＵＣ１９－ｓｅｑＦ０１プライマー（配列番号８２）及び０．１６５μＭのｐＵＣ１９＿ｓｅｑＲ０１プライマー（配列番号８３）を用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３５００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により配列解析を行ない、ｐＵＣ１９＿ＳＥＲＰＩＮＡ１を合成できたことを確認した。
　ｐＵＣ１９＿ＳＥＲＰＩＮＡ１を鋳型とし、５’側断片をＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＤＳ＿ＸｂａＦ１プライマー（配列番号８０）とＳＥＲＰＩＮＡ１＿Ｇ１０９６Ａ＿Ｒ１プライマー（配列番号８４）、３’側断片をＳＥＲＰＩＮＡ１＿Ｇ１０９６Ａ＿Ｆ１プライマー（配列番号８５）とＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＤＳ＿ＨｉｎＲ１プライマー（配列番号８１）を用いてＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により１ｓｔ　ＰＣＲを行なった。次に、それぞれのＰＣＲ産物を１００倍希釈し、ＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＤＳ＿ＸｂａＦ１プライマー（配列番号８０）及びＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＤＳ＿ＨｉｎＲ１プライマー（配列番号８１）を用いてＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により２ｎｄ　ＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃、１０秒、アニーリング：５５℃、１５秒、伸長：６８℃、１分３０秒）を行ない、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、ＳＥＲＰＩＮＡ１のＧ１０９６をＡに変異させた配列を有するＤＮＡ（ＳＥＲＰＩＮＡ１＿Ｇ１０９６Ａ）（配列番号８９）を得た。また、ｐＵＣ１９＿ＳＥＲＰＩＮＡ１を鋳型にして、ＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＤＳ＿ＸｂａＦ１プライマー（配列番号８０）及びＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＤＳ＿ＨｉｎＲ１プライマー（配列番号８１）を用いてＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）によりＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃、１０秒、アニーリング：５５℃、１５秒、伸長：６８℃、１分３０秒）を行ない、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、ＳＥＲＰＩＮＡ１のＣＤＳ配列（ＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＤＳ）（配列番号８８）を得た。それら得られたＤＮＡ及びｐｃＤＮＡ３．１（－）ＨｙｇｒｏをＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間反応を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。インサート：プラスミドが３：１のモル比となるように加え、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した。選別したコロニーを、ＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミド１００ｎｇをＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１６５μＭのｐｃＤＮＡ３＿１ｐｒｏ＿Ｆ０１プライマー（配列番号８６）及び０．１６５μＭのｐｃＤＮＡ３１－ｓｅｑＲ０１プライマー（配列番号８７）を用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３５００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により配列解析を行ない、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＳＥＲＰＩＮＡ１＿Ｇ１０９６Ａ及びｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＳＥＲＰＩＮＡ１を合成できたことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
（Ｂ）細胞培養
　ＨＥＫ２９３細胞を２４－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）を用いて１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように継代し、４８時間培養した。ＰＢＳ（－）（ナカライ）を用いて一度洗浄し、０．２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）に培地を交換した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて５０ｎｇの標的ＲＮＡを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＳＥＲＰＩＮＡ１＿Ｇ１０９６Ａ、又はｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＳＥＲＰＩＮＡ１）、５００ｎｇのＡＤＡＲを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ｐ１５０）、５０ｎＭの実施例化合物であるｇＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、４８時間培養した。
（Ｃ）編集解析とその結果
　２４－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅで培養した細胞から、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（Ｒ）ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　０．５μｇを用いた逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを増幅した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、ＳＥＲＰＩＮＡ１＿１ｓｔＦ０１プライマー（配列番号９０）、ＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＤＳ＿ＨｉｎＲ１プライマー（配列番号９１）を用いて１ｓｔ　ＰＣＲを行った。１ｓｔ　ＰＣＲ産物を４００倍希釈したｃＤＮＡを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、ＳＥＲＰＩＮＡ１＿２ｎｄＦ０１プライマー（配列番号９２）、ＳＥＲＰＩＮＡ１＿２ｎｄＲ０１プライマー（配列番号９３）を用いて２ｎｄ　ＰＣＲを行い、ＳＥＲＰＩＮＡ１フラグメントを増幅した。Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ、０．１６５μＭ　ＳＥＲＰＩＮＡ１＿ｅｄｉｔＦ０１プライマー（配列番号９４）を用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　３５００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒにより解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合を算出した。
　実施例１３６の化合物（ＡＤ１＿Ａ１ＡＴ．３９）を用いた場合の編集割合（％）を図２３Ｂに示した。標的ＲＮＡ（Ｚ－Ａ１ＡＴ）発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡをトランスフェクトした場合、５％程度の高い編集割合を示した。また、標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１１０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、６０％程度の高い編集割合を示した。さらに、標的ＲＮＡ発現プラスミド及び実施例化合物であるｇＲＮＡを、ＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともにトランスフェクトした場合、８０％程度の高い編集割合を示した。本実施例の化合物は、変異したＡ１ＡＴ遺伝子配列を修復できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
（Ｄ）ＥＬＩＳＡによるＡ１ＡＴ分泌量の解析とその結果
　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、４８時間培養した培地を回収し、４℃、３０００×ｇで１０分間遠心分離した。培地５０μＬ及びＨｕｍａｎ　ａｌｐｈａ　１　Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ（ＳＥＲＰＩＮＡ１）　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ）を用いて、添付されているカンパニープロトコルに準じて、Ａ１ＡＴ分泌量を測定した。吸光度測定には、Ｎｉｖｏ　マルチモード　マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いた。
　実施例１３６の化合物（ＡＤ１＿Ａ１ＡＴ．３９）を用いた場合の培地中のＡ１ＡＴ分泌量を図２４に示した。ＡＤＡＲ１ｐ１１０を発現するプラスミドとともに、標的ＲＮＡ（Ｚ－Ａ１ＡＴ）発現プラスミドをトランスフェクトした場合、培地中に分泌されたＡ１ＡＴ量は、正常Ａ１ＡＴを発現するプラスミドをトランスフェクトした場合に培地に分泌されたＡ１ＡＴ量の３０％程度であった。また、ＡＤＡＲ１ｐ１１０を発現するプラスミドとともに、標的ＲＮＡ（Ｚ－Ａ１ＡＴ）発現プラスミド及び実施例１３６の化合物を同時にトランスフェクトした場合、培地に分泌されたＡ１ＡＴ量は、正常Ａ１ＡＴを発現するプラスミドをトランスフェクトした場合の培地に分泌されたＡ１ＡＴ量と同程度まで回復した。
　さらに、ＡＤＡＲ１ｐ１１０及びＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともに、標的ＲＮＡ（Ｚ－Ａ１ＡＴ）発現プラスミドをトランスフェクトした場合、培地中に分泌されたＡ１ＡＴ量は、正常Ａ１ＡＴを発現するプラスミドをトランスフェクトした場合に培地に分泌されたＡ１ＡＴ量の３０％程度であった。また、ＡＤＡＲ１ｐ１１０及びＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミドとともに、標的ＲＮＡ（Ｚ－Ａ１ＡＴ）発現プラスミド及び実施例１３６の化合物を同時にトランスフェクトした場合、培地に分泌されたＡ１ＡＴ量は、正常Ａ１ＡＴを発現するプラスミドをトランスフェクトした場合に培地に分泌されたるＡ１ＡＴ量と同程度まで回復した。
　（Ｃ）に示したＲＮＡ編集活性の結果及び（Ｄ）に示したＡ１ＡＴ分泌量の解析結果から考えると、実施例１３６の化合物は、細胞内でＺ－Ａ１ＡＴのｍＲＮＡの変異を正常なＡ１ＡＴ　ｍＲＮＡに修復し、さらに、正常なＡ１ＡＴタンパク質を、正常な量のレベルまで細胞から分泌させることができたと考えられる。
　日本国特許出願２０２０－２０３６５８号（出願日：２０２０年１２月８日）、日本国特許出願２０２１－１５７１５１号（出願日：２０２１年９月２７日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (47)

  1. 　標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、
    　前記第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、を含み、
    　前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、
    　前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、
    　前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、
    　前記第二オリゴヌクレオチドは、その３’末端において前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失しているか、前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基と相補対を形成しないヌクレオチド残基を有し、
    　前記第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、少なくともその３’末端以外のヌクレオチド残基が前記標的ＲＮＡと相補的な２本鎖構造を形成し、
    　前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域を有し、
    　前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するヌクレオチド残基が、２’－デオキシヌクレオチド残基であり、
    　前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチドから３’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基であり、
    　前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  2. 　前記第二オリゴヌクレオチドの残基数が４から８である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  3. 　前記第二オリゴヌクレオチドの３’末端は、前記標的ＲＮＡのヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基が欠失している請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  4. 　前記部位特異的編集は、アデノシンデアミナーゼ１による酵素反応に起因する請求項１から３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  5. 　前記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間に、アルキレンオキシ単位を含む連結部を含む請求項１から４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  6. 　前記第一オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む請求項１から５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  7. 　前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基を含む請求項１から６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  8. 　前記カウンタ領域は、ホスホロチオエート結合を含む請求項１から７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  9. 　前記標的対応ヌクレオチド残基が、ホスホロチオエート結合を含む請求項１から８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  10. 　前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するヌクレオチド残基が、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、又はデオキシヌクレオチド残基である請求項１から９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  11. 　前記第二オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基を含む請求項１から１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  12. 　前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項１から１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  13. 　前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、架橋型ヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項１から１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  14. 　前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項１から１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  15. 　前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有する請求項１から１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  16. 　前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項１から１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  17. 　前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項１から１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  18. 　前記第二オリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有する請求項１から１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  19. 　前記第二オリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項１から１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  20. 　前記第二オリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項１から１９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  21. 　前記標的ＲＮＡは、編集標的であるアデノシン残基の５’側にシチジン残基が連結し、
    　前記第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するヌクレオチド残基が２’－デオキシイノシン残基である請求項１から２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  22. 　前記標的ＲＮＡは、編集標的であるアデノシン残基の５’側にウリジン残基が連結し、
    　前記第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するヌクレオチド残基が２’－デオキシアデノシン残基である請求項１から２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  23. 　前記標的ＲＮＡは、編集標的であるアデノシン残基の５’側にアデノシン残基が連結し、
    　前記第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するヌクレオチド残基がチミジン残基又は２’－デオキシウリジン残基である請求項１から２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  24. 　前記標的ＲＮＡは、編集標的であるアデノシン残基の５’側にグアノシン残基が連結し、
    　前記第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するヌクレオチド残基が２’－デオキシイノシン残基である請求項１から２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  25. 　前記標的対応ヌクレオチド残基が、Ｎ－アルキルピリミジンヌクレオチド残基又は２’－デオキシシチジン残基である請求項１から２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  26. 　前記第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドのそれぞれは、ヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されてなる請求項１から２５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  27. 　前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的対応ヌクレオチドから３’方向に数えて１０番目以降のヌクレオチド残基に、架橋型ヌクレオチド残基を有する請求項１から２６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  28. 　前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的対応ヌクレオチドから３’方向に数えて１０番目以降のヌクレオチド残基からなるオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  29. 　前記第二オリゴヌクレオチドは、その３’末端のヌクレオチド残基から５’方向に数えて２番目以降のヌクレオチド残基に、架橋型ヌクレオチド残基を有する請求項１から２８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  30. 　前記第二オリゴヌクレオチドは、その３’末端のヌクレオチド残基から５’方向に数えて２番目以降のヌクレオチド残基からなるオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  31. 　以下の式のいずれかで表される請求項１から３０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
    　Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｇ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＡＳＳ１．３９）
    　Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ａ＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｕ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．３９）
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    　Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．３９ｅ）
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    　Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ））　（ＡＤ１＿ＧＲＩＡ２．５２ｅ
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    　Ａ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾ｃ＾ａ＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＰＡＮＫ２．５２ｅ）
    　Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｅ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ａ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｔ（Ｅ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ａ（Ｅ）＾Ｃ（Ｍ）　（ＡＤ１＿ＮＰＨＳ２．５２ｅ）
    　Ｇ（Ｍ）＾Ｔ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）＾ｃ＾ｉ＾Ｕ（Ｍ）＾Ｃ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｆ）＾Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｆ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｕ（Ｆ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ａ（Ｌ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ａ（Ｍ）　（ＡＤ１＿Ａ１ＡＴ．３９）
    ［式中、大文字はリボヌクレオチド残基、小文字は２’－デオキシリボヌクレオチド残基、Ｎ（Ｍ）は２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチド残基、Ｎ（Ｆ）は２’－フルオロ－２’－デオキシリボヌクレオチド残基、Ｎ（Ｌ）は、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン化リボヌクレオチド残基、Ｎ（Ｅ）は、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン化リボヌクレオチド残基を示し、「＾」はヌクレオシドユニット間が－Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）－で結合していることを示す。］
  32. 　前記オリゴヌクレオチド及びその薬学的に許容される塩は、５’末端又は３’末端において、ＧａｌＮＡｃ、コレステロール及び脂肪酸を含むデリバリー分子がリンカー又はリン酸ジエステル結合（ホスホロチオエート結合を含む）を介して結合している請求項１から３１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  33. 　請求項１から３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有し、前記標的ＲＮＡに関連する疾患の治療に用いられる遺伝性疾患治療剤。
  34. 　請求項１から３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含有し、前記標的ＲＮＡに関連する疾患の治療に用いられる医薬組成物。
  35. 　遺伝性疾患の予防、又は治療のための請求項３４に記載の医薬組成物。
  36. 　前記遺伝性疾患が、前記標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. 　前記遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である請求項３５に記載の医薬組成物。
  38. 　前記標的ＲＮＡに関連する疾患の予防、又は治療のための医薬を製造するための請求項１から３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の使用。
  39. 　前記標的ＲＮＡに関連する疾患の予防、又は治療における使用のための請求項１から３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  40. 　請求項１から３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の薬理学的有効量を温血動物に投与することによる前記標的ＲＮＡに関連する疾患の予防、又は治療のための方法。
  41. 　前記疾患が遺伝性疾患である請求項４０に記載の方法。
  42. 　前記遺伝性疾患が、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である請求項４１に記載の方法。
  43. 　前記遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である請求項４１に記載の方法。
  44. 　前記疾患が、Ｉ型シトルリン血症、血友病（血栓症）、ＡＬＳ、パントテン酸関連神経変性疾患、ホモシスチン尿症、単状分節性糸球体硬化症、α１アンリトリプシン欠損症、フェニルケトン尿症、肥厚性皮膚骨膜症、アレキサンダー病、原発性高シュウ酸尿症、Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群、網膜色素変性症、遠位型ミオパチー及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される少なくとも１つを含む請求項３４から３７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  45. 　前記疾患が、Ｉ型シトルリン血症、血友病（血栓症）、ＡＬＳ、パントテン酸関連神経変性疾患、ホモシスチン尿症、単状分節性糸球体硬化症、α１アンリトリプシン欠損症、フェニルケトン尿症、肥厚性皮膚骨膜症、アレキサンダー病、原発性高シュウ酸尿症、Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群、網膜色素変性症、遠位型ミオパチー及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される少なくとも１つを含む請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の使用。
  46. 　前記疾患が、Ｉ型シトルリン血症、血友病（血栓症）、ＡＬＳ、パントテン酸関連神経変性疾患、ホモシスチン尿症、単状分節性糸球体硬化症、α１アンリトリプシン欠損症、フェニルケトン尿症、肥厚性皮膚骨膜症、アレキサンダー病、原発性高シュウ酸尿症、Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群、網膜色素変性症、遠位型ミオパチー及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される少なくとも１つを含む請求項３９に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
  47. 　前記疾患が、Ｉ型シトルリン血症、血友病（血栓症）、ＡＬＳ、パントテン酸関連神経変性疾患、ホモシスチン尿症、単状分節性糸球体硬化症、α１アンリトリプシン欠損症、フェニルケトン尿症、肥厚性皮膚骨膜症、アレキサンダー病、原発性高シュウ酸尿症、Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群、網膜色素変性症、遠位型ミオパチー及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される少なくとも１つを含む請求項４０から４３のいずれか１項に記載の方法。
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