EA046927B1 - Модифицированные направляющие рнк - Google Patents
Модифицированные направляющие рнк Download PDFInfo
- Publication number
- EA046927B1 EA046927B1 EA201991369 EA046927B1 EA 046927 B1 EA046927 B1 EA 046927B1 EA 201991369 EA201991369 EA 201991369 EA 046927 B1 EA046927 B1 EA 046927B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- nucleotides
- modified
- region
- sgrna
- terminal region
- Prior art date
Links
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 title claims description 221
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 1003
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 663
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 339
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 339
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 211
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 109
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 89
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 44
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 claims description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 27
- 102100039856 Histone H1.1 Human genes 0.000 claims description 14
- 101001035402 Homo sapiens Histone H1.1 Proteins 0.000 claims description 14
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 13
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 13
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 claims description 13
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 10
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 4
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 351
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 283
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 192
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 191
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 75
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 75
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 75
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 39
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 39
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 39
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 39
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 38
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 37
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 description 37
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 description 36
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 32
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 28
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 27
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 25
- 101100154776 Mus musculus Ttr gene Proteins 0.000 description 22
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 21
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 19
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 19
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 18
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 17
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 17
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 17
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 15
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 9
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 9
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 9
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- -1 14A) Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 102100039855 Histone H1.2 Human genes 0.000 description 7
- 102100027368 Histone H1.3 Human genes 0.000 description 7
- 102100027369 Histone H1.4 Human genes 0.000 description 7
- 102100022653 Histone H1.5 Human genes 0.000 description 7
- 102100033558 Histone H1.8 Human genes 0.000 description 7
- 102100023920 Histone H1t Human genes 0.000 description 7
- 101001035375 Homo sapiens Histone H1.2 Proteins 0.000 description 7
- 101001009450 Homo sapiens Histone H1.3 Proteins 0.000 description 7
- 101001009443 Homo sapiens Histone H1.4 Proteins 0.000 description 7
- 101000899879 Homo sapiens Histone H1.5 Proteins 0.000 description 7
- 101000872218 Homo sapiens Histone H1.8 Proteins 0.000 description 7
- 101000905044 Homo sapiens Histone H1t Proteins 0.000 description 7
- 101000897979 Homo sapiens Putative spermatid-specific linker histone H1-like protein Proteins 0.000 description 7
- 101000843236 Homo sapiens Testis-specific H1 histone Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 102100021861 Putative spermatid-specific linker histone H1-like protein Human genes 0.000 description 7
- 102100031010 Testis-specific H1 histone Human genes 0.000 description 7
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 102100023917 Histone H1.10 Human genes 0.000 description 6
- 101000905024 Homo sapiens Histone H1.10 Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 101150091380 TTR gene Proteins 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000028550 monocyte chemotaxis Effects 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 3
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 101000772176 Mus musculus Transthyretin Proteins 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 101150010534 moeA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150021137 moeA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000180579 Arca Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100504320 Caenorhabditis elegans mcp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- BQENDLAVTKRQMS-SBBGFIFASA-L Carbenoxolone sodium Chemical compound [Na+].[Na+].C([C@H]1C2=CC(=O)[C@H]34)[C@@](C)(C([O-])=O)CC[C@]1(C)CC[C@@]2(C)[C@]4(C)CC[C@@H]1[C@]3(C)CC[C@H](OC(=O)CCC([O-])=O)C1(C)C BQENDLAVTKRQMS-SBBGFIFASA-L 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010015719 Exsanguination Diseases 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 101100091360 Homo sapiens RNPC3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000910035 Streptococcus pyogenes serotype M1 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- CHTXXFZHKGGQGX-UHFFFAOYSA-N [2-[3-(diethylamino)propoxycarbonyloxymethyl]-3-(4,4-dioctoxybutanoyloxy)propyl] (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound C(CCCCCCCC=C/CC=C/CCCCC)(=O)OCC(COC(CCC(OCCCCCCCC)OCCCCCCCC)=O)COC(=O)OCCCN(CC)CC CHTXXFZHKGGQGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUJRVFIICFDLGR-UHFFFAOYSA-N acetylacetonate Chemical compound CC(=O)[CH-]C(C)=O CUJRVFIICFDLGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000012623 in vivo measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-UHFFFAOYSA-M octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC([O-])=O OYHQOLUKZRVURQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- AJAMRCUNWLZBDF-UHFFFAOYSA-N propyl octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCCC AJAMRCUNWLZBDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Description
Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, представленный в электронном виде в формате ASCII и полностью включенный в настоящий документ посредством ссылки. Имя указанной ASCn-копии, созданной 7 декабря 2017 г., -01155-0004-00PCT_SeqList.txt, а ее размер составляет 118 877 байт.
Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США № 62/431756, поданной 8 декабря 2016 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Настоящее изобретение относится к области редактирования генов с использованием системы CRISPR/Cas, входящей в состав иммунной системы прокариот, распознающей и разрезающей экзогенные генетические элементы. Система CRISPR/Cas основана на единственной нуклеазе, называемой CRISPR-ассоциированным белком 9 (Cas9), индуцирующей сайт-специфические разрывы в ДНК. Cas9 оказывает воздействие на специфические ДНК-последовательности за счет малых молекул РНК, называемых направляющими РНК (gPHK). Направляющая РНК содержит trPHK (также известные как tracrPHK) и crisprPHK (crPHK). trPHK и crPHK могут содержаться в одиночной направляющей РНК (sgPHK) или в двух различных молекулах РНК двойной направляющей РНК (dgPHK). Cas9 в комбинации с trPHK и crPHK или sgPHK называют рибонуклеопротеиновым (РНП) комплексом Cas9.
Олигонуклеотиды и, в частности РНК, иногда разрушаются в клетках и сыворотке за счет эндонуклеазного или экзонуклеазного гидролиза. Усовершенствованные способы и композиции для предотвращения такого разрушения, повышения стабильности gPHK и эффективности редактирования генов являются желательными, особенно для терапевтического применения.
Раскрытие изобретения
В некоторых вариантах воплощения предложены терапевтические инструменты для редактирования генома, включающие модифицированные направляющие РНК. Модифицированные направляющие РНК, описанные в настоящем документе, могут улучшить стабильность направляющей РНК и комплекса направляющая РНК/Cas9, а также активность Cas9 (например, SpyCas9 и ее эквивалентов) при расщеплении ДНК-мишени. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК является sgPHK. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК является dgPHK. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК является tracrPHK. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК является crPHK.
Направляющие РНК, описанные в настоящем документе, содержат по меньшей мере один модифицированный нуклеотид. Модификации могут включать 2'-O-метил (2'-O-Me), 2'-O-(2-метоксиэтил) (2'-Omoe), 2'-фтор (2'-F), фосфоротиоатную (PS) связь между нуклеотидами, заместители G-C и инвертированные связи, не содержащие оснований, между нуклеотидами и их эквиваленты.
Варианты воплощения настоящего изобретения включают: некоторые варианты воплощения включают одиночную направляющую РНК (sgPHK), содержащую модификацию по 5'-концу и одну или более из модификаций в одной или более из: области верхнего стебля; области шпильки 1; и области шпильки 2, причем модификация по 5'-концу включает по меньшей мере две фосфоротиоатных связи в пределах первых семи нуклеотидов на 5'-конце 5'-концевой области. В некоторых случаях указанная модификация является 2'-O-метил (2'-O-Me)-модифицированным нуклеотидом. В некоторых вариантах воплощения указанная модификация является 2'-фтор (2'-Е)-модифицированным нуклеотидом.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в положениях US1-US12 и/или модификацию в положении H1-1 и/или модификацию в положении H2-1. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в положениях H1-1-H1-12 и/или H2-1-H2-15. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит одну или более модификации в каждой из области верхнего стебля, области шпильки 1 и области шпильки 2. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модифицированный нуклеотид между областями шпильки 1 и шпильки 2. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификацию в области нижнего стебля.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификацию в 5'-концевой области и/или 3'концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит 3 '-концевую модификацию в 3'концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в по меньшей мере двух из последних четырех нуклеотидов на 3'-конце 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит 5'-концевую модификацию в 5'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в по меньшей мере двух из первых четырех нуклеотидов на 5'-конце 5'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит 3'-концевую модификацию в 3'-концевой области и 5'-концевую модификацию в 5-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в по меньшей мере двух из последних четырех нуклеотидов на 3'-конце 3'-концевой области и в по меньшей мере двух из первых четырех нуклеотидов на 5'конце 5'-концевой области. В некоторых случаях эти модификации являются 2'-O-Me, 2'-F, 2'-O-moe или фосфоротиоатными (PS) связями, соединяющими нуклеотиды. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит PS-связи между по меньшей мере двумя из последних четырех нуклеотидов на 3'-конце 3'-концевой области и/или по меньшей мере двумя из первых четырех нуклеотидов на 5'-конце 5'концевой области. В некоторых случаях sgPHK содержит 5'-концевую область и 3'-концевую область с
- 1 046927 более чем одной модификацией, описанной в настоящем документе, например, с PS-связями и 2'-O-Me модификациями.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификацию в области расширения. В некоторых вариантах воплощения 50% нуклеотидов в области расширения являются модифицированными, причем модификация является 2'-O-Me или 2'-F.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификацию в области связки. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в положениях N15, N16, N17 и/или N18 в области связи, причем указанные модификации являются 2'-O-Me или 2'-F. В некоторых случаях N16, N17 и N18 связаны PS-связями.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит по меньшей мере первые три нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и последние три нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области, которые являются модифицированными.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в 3'-концевой области и/или 5'концевой области. В некоторых случаях первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области связаны фосфоротиоатными (PS) связями. В некоторых вариантах воплощения 5'- и 3'-модификации содержат 2'-О-Me или 2'-O-moe. В некоторых вариантах воплощения 5'- и 3'-модификации содержат 2'-F. В некоторых вариантах воплощения 5'- и/или 3'-модификации содержат PS связи между нуклеотидами. В некоторых вариантах воплощения 5'- и/или 3'-модификации содержат один или более из 2'-O-Me, 2'-O-moe, 2'-F и PS связей между нуклеотидами.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в первых четырех нуклеотидах на 5'-конце 5'-концевой области и последних четырех нуклеотидах на 3'-конце 3'-концевой области. В некоторых случаях эти модификации являются соединяющими PS-связями (т.е. PS-связи, соединяющие первые четыре и последние четыре нуклеотида). В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит 2'-O-Me модификации в первых трех нуклеотидах на 5'-конце 5'-концевой области и последних трех нуклеотидах на 3'-конце 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в первых четырех нуклеотидах на 5'-конце 5'-концевой области и последних четырех нуклеотидах на 3'-конце 3'-концевой области, причем указанные модификации являются по меньшей мере PS-связями, соединяющими указанные четыре нуклеотида, и, кроме того, первые три нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и последние три нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области содержат 2'-O-Me, 2'-O-moe или 2'-F модификации.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12, причем указанная модификация является 2'-O-Me или 2'-F.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в каждом из нуклеотидов области расширения, причем указанная модификация является 2'-O-Me или 2'-F.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в каждом из нуклеотидов в области верхнего стебля, причем указанная модификация является 2'-O-Me или 2'-F.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в каждом из нуклеотидов в области шпильки 1, причем указанная модификация является 2'-O-Me или 2'-F.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в каждом из нуклеотидов в области шпильки 2, причем указанная модификация является 2'-O-Me или 2'-F.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую 2'-O-Me-модифицированные нуклеотиды в следующих положениях:
первых трех нуклеотидах на 5'-конце 5'-концевой области;
LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и/или LS12 в области нижнего стебля;
B1 и/или B2 в области расширения;
каждом нуклеотиде в области верхнего стебля;
N16, N17 и/или N18 в области связки;
каждом нуклеотиде в области шпильки 1;
каждом нуклеотиде в области шпильки 2; и последних четырех нуклеотидах на 3'-конце 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения B3-B6 модифицированы 2'-O-Me. В некоторых случаях sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит 2'-F модификации в положениях LS9 и LS10. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит 2F модификации в положениях N15, N16, N17 и N18. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит 2'F модификации в положениях H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 и H2-15. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит 2'F модификации в положениях со второго по последний, с третьего по последний и с четвертого по последний нуклеотид на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую 2'-F модифицированные нуклеотиды в следующих положениях:
LS9 и LS10 в области нижнего стебля;
- 2 046927
N15, N16, N17 и N18 в области связки; и
H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 и H2-15 в области шпильки 2.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях со второго по последний, с третьего по последний и с четвертого по последний нуклеотиды 3'концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах на 5'конце 5'-концевой области и 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в трех из последних четырех нуклеотидов на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах на 5'-конце 5'-концевой области;
необязательные 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1 и/или LS6;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
необязательный 2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах на 3'-конце 3'-концевой области; и необязательно дополнительно содержащую три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах на 5'-конце 5'-концевой области;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS1-LS6;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах на 3'-конце 3'-концевой области; и необязательно дополнительно содержащую три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS2-LS5;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1 и LS6;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области и необязательно дополнительно содержащую три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS7, LS8, LS11 и LS12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области; и необязательно дополнительно содержащую три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS7, LS8, LS11 и LS12;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS9 и LS10;
- 3 046927
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области, и необязательно дополнительно содержащую три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS8, LS10 и LS12;
2'-O-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS7, LS9 и LS11;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области, и необязательно дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области, и необязательно дополнительно содержащую три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS9 и LS10;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области, и необязательно дополнительно содержащую три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах на 5'-конце 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-8;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях H2-9-H2-15;
2'-F модифицированные нуклеотиды во втором от последнего, в третьем от последнего и в четвертом от последнего нуклеотиде 3'-концевой области; и
2'-O-Me модифицированный нуклеотид в последнем нуклеотиде 3'-концевой области, и необязательно дополнительно содержащую три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах на 5'-конце 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10 и H1-12;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9 и H1-11;
- 4 046927
2'-F модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12; и H2-14;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11; H2-13 и H2-15;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях во втором от последнего и в четвертом от последнего нуклеотиде 3'-концевой области; и
2'-O-Me модифицированный нуклеотид в третьем от последнего и последнем нуклеотиде на 3'конце 3'-концевой области, и необязательно дополнительно содержащую три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13 и H2-15; и
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12 и H2-14 и необязательно дополнительно содержащую три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области; и необязательно дополнительно содержащую:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последнем и с третьего по последний нуклеотиде на 3'конце 3'-концевой области; и/или
2'-F модифицированные нуклеотиды со второго по последний, с четвертого по последний и/или в последнем нуклеотиде на 3'-конце 3'-концевой области.
Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую нуклеиновые кислоты в соответствии с любой из SEQ ID No: 228-353, включая модификации, перечисленные в табл. 4. Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую любую из SEQ ID No: 22 8-332, включая модификации, перечисленные в табл. 4. Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую любую из SEQ ID No: 235-240, 265-285 и 309-329, включая модификации, перечисленные в табл. 4. Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую SEQ ID No: 240. Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую SEQ ID No. 240, включая модификации, перечисленные в табл. 4. Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую SEQ ID No: 242. Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую SEQ ID No: 358. В дополнительных вариантах воплощения sgPHK содержит нуклеиновые кислоты, обладающие по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% идентичностью по отношению к нуклеиновым кислотам согласно любой из SEQ ID No: 235-240, 265-285 и 309-329, причем модификация каждого нуклеотида sgPHK, соответствующего нуклеотиду идентификатора эталонной последовательности в табл. 4, идентична или эквивалентна модификации, показанной в идентификаторе эталонной последовательности в табл. 4, и необязательно дополнительно содержащие три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит по меньшей мере три PS связи, связывающие нуклеотиды в области шпильки 1. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит по меньшей мере три PS связи, связывающие нуклеотиды в области шпильки 2. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит по меньшей мере три PS связи, связывающие нуклеотиды в области верхнего стебля. В некоторых вариантах воплощения sgPHK образует рибонуклеопротеиновый комплекс с Cas9 S. pyogenes.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показано процентное редактирование гена транстиретина (TTR) мыши после трансфекции клеток Neuro2A за счет модифицированных crPHK совместно с мРНК Cas9 и немодифицированной trPHK (TR000002), измеренное с помощью секвенирования нового поколения (NGS).
На фиг. 2 показано процентное редактирование гена TTR мыши после трансфекции клеток Neuro2A за счет модифицированных trPHK совместно с немодифицированной crPHK (CR000686) и мРНК Cas9, измеренное с помощью NGS.
На фиг. 3 показано процентное редактирование гена TTR мыши после трансфекции клеток Neuro2A за счет мРНК Cas9 и crPHK и trPHK с парами G-C, не встречающимися в исходных последовательностях, измеренное с помощью NGS.
На фиг. 4 показано процентное редактирование гена TTR мыши после трансфекции клеток Neuro2A за счет модифицированных crPHK и trPHK совместно с мРНК Cas9, измеренное с помощью NGS. После значения приведены стандартные отклонения.
На фиг. 5 показано процентное редактирование гена TTR мыши после трансфекции клеток Neuro2A модифицированными sgPHK совместно с мРНК Cas9, измеренное с помощью NGS.
На фиг. 6 показано процентное редактирование гена TTR мыши после трансфекции клеток Neuro2A модифицированными crPHK и немодифицированной trPHK (TR000002) совместно с мРНК Cas9, измеренное с помощью NGS. Звездочкой обозначена двойная направляющая РНК, которая по техническим
- 5 046927 причинам не демонстрировала активности в данном эксперименте. Эту двойную направляющую РНК повторно протестировали в эксперименте, представленном на фиг. 9, в котором она демонстрировала редактирующую активность.
На фиг. 7 показано процентное редактирование гена TTR мыши после трансфекции клеток Neuro2A немодифицированной crPHK (CR000686) и модифицированными trPHK совместно с мРНК Cas9, измеренное с помощью NGS.
На фиг. 8 показано процентное редактирование гена TTR мыши после трансфекции клеток Neuro2A мРНК Cas9 и crPHK и trPHK с парами G-C или несовпадениями G-U, не встречающимися в исходных последовательностях, измеренное с помощью NGS.
На фиг. 9 показано процентное редактирование гена TTR мыши после трансфекции клеток Neuro2A модифицированными crPHK и модифицированными trPHK совместно с мРНК Cas9, измеренное с помощью NGS. После значения приведены стандартные отклонения.
На фиг. 10 показано процентное редактирование гена TTR мыши после трансфекции клеток Neuro2A модифицированными sgPHK совместно с мРНК Cas9, измеренное с помощью NGS.
На фиг. 11 показано процентное редактирование гена фактора VII (FVII) мыши после трансфекции клеток Neuro2A модифицированными sgPHK совместно с мРНК Cas9, измеренное с помощью NGS.
На фиг. 12A и 12B показано процентное редактирование гена TTR мыши (фиг. 12A) или FVII (фиг. 12B) после трансфекции клеток Neuro2A модифицированными crPHK и немодифицированной trPHK совместно с мРНК Cas9, измеренное с помощью NGS.
На фиг. 13A и 13B показано процентное редактирование гена TTR мыши (фиг. 13A) или FVII (фиг. 13B) после трансфекции клеток Neuro2A модифицированными trPHK и немодифицированной crPHK совместно с мРНК Cas9, измеренное с помощью NGS.
На фиг. 14A, 14B, 14C и 14D показаны уровни интерферона-альфа (ИФН-альфа, 14A), интерлейкина-6 (ИЛ-6, 14B), белка 1 хемотаксиса моноцитов (MCP-1, 14C) и фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа, 14D) в сыворотке после введения in vivo LNP, содержащих мРНК Cas9 и sgPHK.
На фиг. 15A, 15B и 15C показаны результаты, полученные in vivo после введения LNP, содержащих мРНК Cas9 и sgPHK. На фиг. 15A показан процент общего редактирования в печени. На фиг. 15B показан уровень TTR в сыворотке. На фиг. 15C показано среднее значение и стандартное отклонение для результатов, показанных на фиг. 15A. На фиг. 15D приведена сводная информация по модификациям sgPHK G000209 (SEQ ID NO: 228). На фиг. 15E приведена сводная информация по модификациям sgPHK G000267 (SEQ ID NO: 234). На фиг. 15D и 15E нуклеотиды, выделенные полужирным шрифтом, являются 2'-О-Ме модифицированными.
На фиг. 16A, 16B, 16C и 16D показаны уровни интерферона-альфа (ИФН-альфа, 16A), фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа, 16B), интерлейкина-6 (ИЛ-6, 16C) и белка 1 хемотаксиса моноцитов (MCP-1, 16D) в сыворотке после введения in vivo LNP, содержащих мРНК Cas9 и sgPHK.
На фиг. 17A, 17B, 17C и 17D показаны результаты, полученные in vivo после введения LNP, содержащих мРНК Cas9 и sgPHK. На фиг. 17A показан процент общего редактирования в печени. На фиг. 17B показано среднее значение и стандартное отклонение для результатов, показанных на фиг. 17A. На фиг. 17C показан уровень TTR в сыворотке. На фиг. 17D показано среднее значение и стандартное отклонение для результатов, показанных на фиг. 17B.
На фиг. 18A, 18B и 18C показаны результаты, полученные in vivo после введения LNP, содержащих мРНК Cas9 и sgPHK. На фиг. 18A показан процент общего редактирования в печени. На фиг. 18B приведены сводные данные по редактированию в печени. На фиг. 18C показан уровень TTR в сыворотке. MPK=миллиграммов на килограмм; BLOD=ниже уровня обнаружения.
На фиг. 19A, 19B, 19C и 19D показаны уровни интерферона-альфа (ИФН-альфа, 19A), белка-1 хемотаксиса моноцитов (MCP-1, 19B), интерлейкина-6 (ИЛ-6, 19C) и фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа, 19D) в сыворотке после введения in vivo LNP, содержащих мРНК Cas9 и sgPHK.
На фиг. 20A и 20B показано редактирование локуса FVII (фиг. 20A) и локуса TTR (фиг. 20B) в печени после введения in vivo LNP, содержащих мРНК Cas9 и sgPHK.
На фиг. 21A, 21B и 21C показаны схемы аннотированной sgPHK (SEQ ID NO: 341) (фиг. 21A), неаннотированной dgPHK CR000686 (SEQ ID NO: 1) и TR000002 (SEQ ID NO: 188) (фиг. 21B) и аннотированной dgPHK CR000686 (SEQ ID NO: 1) и TR000002 (SEQ ID NO: 188) (фиг. 21C).
На фиг. 22A, 22B и 22C показаны результаты, полученные in vivo после введения LNP, содержащих мРНК Cas9 и sgPHK. На фиг. 22A показан процент общего редактирования локуса TTR в печени. На фиг. 22B приведены сводные данные по редактированию в печени. На фиг. 22C показан уровень TTR в сыворотке.
На фиг. 23A, 23B и 23C показаны результаты, полученные in vivo после введения LNP, содержащих мРНК Cas9 и sgPHK. На фиг. 23A показан процент общего редактирования локуса TTR в печени. На фиг. 23B приведены сводные данные по редактированию в печени. На фиг. 23C показан уровень TTR в сыворотке.
На фиг. 24A, 24B и 24C показано редактирование в первичных гепатоцитах мыши после введения LNP, содержащих мРНК Cas9 и sgPHK. На фиг. 24A показан процент общего редактирования локуса
- 6 046927
TTR в печени. На фиг. 24B показаны нормированные преобразования процента редактирования в зависимости от дозы иРНК, использованные для расчета EC50. На фиг. 24C показаны значения EC50 для протестированных LNP.
Подробное описание изобретения
В настоящем документе предложены модифицированные направляющие РНК, в том числе двойные и одиночные направляющие РНК для применения в способах редактирования генов. Модифицированные направляющие РНК более стабильны и демонстрируют эффективность in vitro и in vivo, сопоставимую с их немодифицированными аналогами. Последовательности сконструированных и протестированных направляющих РНК показаны в табл. 4.
Таблица 4
| SEQ ID NO | Название | Аль тернативное название | Описание | Последовательность |
| сгРНК | ||||
| 1 | CR000686 | немодифицированна я | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 2 | CR003393 | CR686-1 | верхний стебель | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUm UmUmG |
| 3 | CR003394 | CR686-2 | частичная модификация верхний стебель | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAmUmGmCmUmGmUmUmUmUm G |
| 4 | CR003395 | CR686-3 | частичная модификация верхний стебель | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAUGCmUmGmUmUmUmUmG |
| 5 | CR003396 | CR686-4 | частичная модификация верхний стебель | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAUGCUGUmUmUmUmG |
| 6 | CR003397 | CR686-5 | нижний стебель | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGmUmUmUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 7 | CR003398 | CR686-6 | прогулка по нижнему стеблю | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 8 | CR003399 | CR686-7 | прогулка по нижнему стеблю | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGmUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 9 | CR003400 | CR686-8 | прогулка по нижнему стеблю | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUmUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 10 | CR003401 | CR686-9 | прогулка по | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUmUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 11 CR003402 CR686-10 12 CR003403 CR686-11 13 CR003404 CR686-12 14 CR003405 CR686-13 15 CR003406 CR686-GC1 16 CR003407 CR686-GC3 17 CR003408 CR686-GC5 18 CR003409 CR686 все ОМе CR003393 - только 19 модифицирован ные | нижнему стеблю прогулка по нижнему стеблю прогулка по нижнему стеблю частичная модификация нижний стебель частичная модификация нижний стебель нижний стебель GC верхний стебель GC нижний стебель и верхний стебель GC верхний стебель | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUmUAGAGCUAUGCUGUUUUG CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGmUmUmUmUAGAGCUAUGCUGUUUUG CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUmUmUUAGAGCUAUGCUGUUUUG CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGGCGCAGAGCUAUGCUGUUUUG CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAUGCUGGCGCG CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGGCGCAGAGCUAUGCUGGCGCG mCmCmAmGmUmCmCmAmGmCmGmAmGmGmCmAmAmAmGmGmGmUmUmUmUm AmGmAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG GUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
- 7 046927
| CR003394 - только 20 модифицирован ные CR003395 - только 21 модифицирован ные CR003396 - только 22 модифицирован ные CR003397 - только 23 модифицирован ные CR003398 - только 24 модифицирован ные CR003399 - 25 только модифицирован | частичный верхний частичная модификация верхний стебель частичный верхний нижний прогулка по нижнему стержню прогулка по нижнему стеблю | GUUUUAGAGCUAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG GUUUUAGAGCUAUGCmUmGmUmUmUmUmG GUUUUAGAGCUAUGCUGUmUmUmUmG mGmUmUmUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG mGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG GmUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG | ||
| ные | ||||
| 26 | CR003400 - только модифицирован ные | прогулка по нижнему стеблю | GUmUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 27 | CR003401 - только модифицирован ные | прогулка по нижнему стеблю | GUUmUUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 28 | CR003402 - только модифицирован ные | прогулка по нижнему стеблю | GUUUmUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 29 | CR003403 - только модифицирован ные | прогулка по нижнему стеблю | GUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 30 | CR003404 - только модифицирован ные | частичная модификация нижний стебель | GmUmUmUmUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 31 | CR003405 - только | частичная модификация | GUmUmUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| модифицирован ные | нижний стебель | |||
| 32 | CR003721 | CR686-14 | верхний стебель и нижний стебель | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGUUUmUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmU mUmUmUmG |
| 33 | CR003722 | CR686-15 | нижний стебель комбинированная модификация | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGUUUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 34 | CR003723 | CR686-16 | верхний стебель, нижний стебель комбинированная модификация | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGUUUUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUm UmUmUmG |
| 35 | CR003724 | CR686-17 | нижний стебель комбинированная модификация | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 36 | CR003725 | CR686-18 | верхний стебель, нижний стебель комбинированная модификация | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 37 | CR003726 | CR686-19 | прогулка по связке | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAmGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 38 | CR003727 | CR686-20 | прогулка по связке | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGmAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 39 | CR003728 | CR686-21 | прогулка по | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAfGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU |
| связке | mUmUmG | |||
| 40 | CR003729 | CR686-22 | прогулка по связке | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGfAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 41 | CR003730 | CR686-23 | 2' F прогулка по нижнему стеблю | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGfUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 42 | CR003731 | CR686-24 | 2' F прогулка по нижнему стеблю | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUfUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 43 | CR003732 | CR686-25 | 2' F прогулка по нижнему стеблю | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUfUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 44 | CR003733 | CR686-26 | 2' F прогулка по нижнему стеблю | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUfUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 45 | CR003734 | CR686-27 | 2' F нижний стебель комбинированная модификация | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGG fG fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmUmGmCmUm GmUmUmUmUmG |
| 46 | CR003735 | CR686-28 | нижний стебель альтернативная модификация | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGG fGmUfUmU fUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUm GmUmUmUmUmG |
| 47 | CR003736 | CR686-29 | нижний стебель альтернативная модификация | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGfUmUfUmUfAGAmGmCmUmAmUmGmCmUm GmUmUmUmUmG |
| 48 | CR003737 | CR686-GC6 | нижний стебель GC | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUCUCAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUm UmUmG |
- 9 046927
| 49 CR003738 CR686-GC7 50 CR003739 CR686-GC8 51 CR003740 CR686-GC9 52 CR003741 CR686-GC10 CR003721- только СЙ686-14-только 53 модифицирован модифицированные ные CR003722- только СЙ686-15-только 54 модифицирован модифицированные ные CR003723- только Сй686-16-только 55 модифицирован модифицированные ные CR003724- CR686-17-только 56 только модифицированные модифицирован | С прогулка по нижнему стеблю С прогулка по нижнему стеблю С прогулка по нижнему стеблю С прогулка по нижнему стеблю верхний стебель и нижний стебель нижний стебель комбинированная модификация верхний стебель, нижний стебель комбинированная модификация нижний стебель комбинированная модификация | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGCUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUm UmUmG CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUCUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUm UmUmG CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUCUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUm UmUmG CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUCAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUm UmUmG mGUUUmUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG mGUUUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG mGUUUUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG mGUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG | ||
| ные | ||||
| 57 | CR003725- только модифицирован ные | CR686-18-только модифицированные | верхний стебель, нижний стебель комбинированная модификация | mGUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 58 | CR003726- только модифицирован ные | CR686-19-только модифицированные | прогулка по связке | GUUUUAmGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 59 | CR003727- только модифицирован ные | CR686-20-только модифицированные | прогулка по связке | GUUUUAGmAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 60 | CR003728- только модифицирован ные | CR686-21-только модифицированные | прогулка по связке | GUUUUAfGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 61 | CR003729- только модифицирован ные | CR686-22-только модифицированные | прогулка по связке | GUUUUAGfAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 62 | CR003730- только | CR686-23-только модифицированные | 2' F прогулка по нижнему стеблю | GfUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
- 10 046927
| модифицирован ные | ||||
| 63 | CR003731- только модифицирован ные | CR686-24-только модифицированные | 2' F прогулка по нижнему стеблю | GUfUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 64 | CR003732- только модифицирован ные | CR686-25-только модифицированные | 2' F прогулка по нижнему стеблю | GUUfUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 65 | CR003733- только модифицирован ные | CR686-26-только модифицированные | 2' F прогулка по нижнему стеблю | GUUUfUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 66 | CR003734- только модифицирован ные | CR686-27-только модифицированные | 2 ' F нижний стебель комбинированная модификация | fG fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 67 | CR003735- только модифицирован ные | CR686-28-только модифицированные | нижний стебель альтернативная модификация | fGmU fUmU fUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 68 69 70 71 72 73 | CR003736- только модифицирован ные CR003737- только модифицирован ные CR003738- только модифицирован ные CR003739- только модифицирован ные CR003740- только модифицирован ные CR003741- только модифицирован ные | CR686-29-только модифицированные CR68 6-СС6-только модифицированные CR686-СС7-только модифицированные CR68 6-СС8-только модифицированные CR68 6-СС9-только модифицированные CR686-GC10только модифицированные | нижний стебель альтернативная модификация нижний стебель GC С прогулка по нижнему стеблю С прогулка по нижнему стеблю С прогулка по нижнему стеблю С прогулка по нижнему стеблю | mG fUmU fUmU fAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG GUCUCAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG GCUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG GUCUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG GUUCUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG GUUUCAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
- 11 046927
| 74 | CR000705 | немодифицированна я | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 75 | CR004188 | CR705-1 | верхний стебель | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUm UmUmG |
| 76 | CR004189 | CR705-2 | частичная модификация верхний стебель | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAmUmGmCmUmGmUmUmUmUm G |
| 77 | CR004190 | CR705-3 | частичная модификация верхний стебель | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAUGCmUmGmUmUmUmUmG |
| 78 | CR004191 | CR705-4 | частичная модификация верхний стебель | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAUGCUGUmUmUmUmG |
| 79 | CR004192 | CR705-5 | нижний стебель | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGmUmUmUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 80 | CR004193 | CR705-6 | прогулка по нижнему стеблю | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 81 | CR004194 | CR705-7 | прогулка по нижнему стеблю | UUACAGCCACGUCUACAGCAGmUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 82 | CR004195 | CR705-8 | прогулка по нижнему стеблю | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUmUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 83 | CR004196 | CR705-9 | прогулка по нижнему стеблю | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUmUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 84 | CR004197 | CR705-10 | прогулка по | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUmUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| нижнему стеблю | ||||
| 85 | CR004198 | CR705-11 | прогулка по нижнему стеблю | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 86 | CR004199 | CR705-14 | верхний стебель и нижний стебель | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGUUUmUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmU mUmUmUmG |
| 87 | CR004200 | CR705-15 | нижний стебель комбинированная модификация | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGUUUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 88 | CR004201 | CR705-16 | верхний стебель, нижний стебель комбинированная модификация | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUm UmUmUmG |
| 89 | CR004202 | CR705-17 | нижний стебель комбинированная модификация | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 90 | CR004203 | CR705-18 | верхний стебель, нижний стебель комбинированная модификация | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 91 | CR004204 | CR705-19 | прогулка по связке | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAmGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 92 | CR004205 | CR705-20 | прогулка по связке | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGmAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
- 12 046927
| 93 | CR004206 | CR705-21 | прогулка связке | ПО | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAfGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 94 | CR004207 | CR705-22 | прогулка связке | по | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGfAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 95 | CR004208 | CR705-23 | 2'F прогулка нижнему стеблю | по | UUACAGCCACGUCUACAGCAGfUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 96 | CR004209 | CR705-24 | 2 ' F прогулка нижнему стеблю | по | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUfUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 97 | CR004210 | CR705-25 | 2 ' F прогулка нижнему стеблю | по | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUfUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 98 | CR004211 | CR705-26 | 2 ' F прогулка нижнему стеблю | по | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUfUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 2 ' F нижний | |||||
| 99 | CR004212 | CR705-27 | стебель комбинированная модификация | UUACAGCCACGUCUACAGCAfG fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmUmGmCmUm GmUmUmUmUmG | |
| 100 | CR004213 | CR705-28 | нижний стебель альтернативная модификация | UUACAGCCACGUCUACAGCAfGmUfUmUfUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUm GmUmUmUmUmG | |
| 101 | CR004214 | CR705-29 | нижний стебель альтернативная модификация | UUACAGCCACGUCUACAGCArnGfUmU fUmU fAGAmGmCmUmAmUmGmCmUm GmUmUmUmUmG | |
| 102 | CR004215 | CR705-GC1 | нижний стебель ( | GC | UUACAGCCACGUCUACAGCAGGCGCAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 103 | CR004216 | CR705-GC3 | верхний стебель GC | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAUGCUGGCGCG | |
| CR004188- | |||||
| 104 | только модифицирован | CR7 05-1-только модифицированные | верхний стебель | GUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG | |
| ные | |||||
| 105 | CR004189- только модифицирован ные | CR7 05-2-только модифицированные | частичная модификация верхний стебель | GUUUUAGAGCUAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG | |
| 106 | CR004190- только модифицирован ные | CR7 05-3-только модифицированные | частичная модификация верхний стебель | GUUUUAGAGCUAUGCmUmGmUmUmUmUmG | |
| 107 | CR004191- только модифицирован ные | CR7 05-4-только модифицированные | частичная модификация верхний стебель | GUUUUAGAGCUAUGCUGUmUmUmUmG | |
| CR004192- | |||||
| 108 | только модифицирован | CR705-5-только модифицированные | нижний стебель | mGmUmUmUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| ные | |||||
| 109 | CR004193- | CR7 05-6-только | прогулка | по | mGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
- 13 046927
| ТОЛЬКО модифицирован ные | модифицированные | нижнему стеблю | ||
| CR004194- | ||||
| 110 | только модифицирован | CR7 05-7-только модифицированные | прогулка по нижнему стеблю | GmUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| ные | ||||
| CR004195- | ||||
| ТОЛЬКО | ||||
| 111 | модифицирован ные-только модифицирован | CR7 05-8-только модифицированные | прогулка по нижнему стеблю | GUmUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| ные | ||||
| CR004196- | ||||
| 112 | ТОЛЬКО модифицирован | CR7 05-9-только модифицированные | прогулка по нижнему стеблю | GUUmUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| ные | ||||
| CR004197- | ||||
| 113 | ТОЛЬКО модифицирован | CR705-10-только модифицированные | прогулка по нижнему стеблю | GUUUmUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| ные | ||||
| 114 | CR004198- только модифицирован ные CR004199- | CR705-11-только модифицированные | прогулка по нижнему стеблю | GUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 115 | только модифицирован | CR705-14-только модифицированные | верхний стебель и нижний стебель | mGUUUmUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| ные | ||||
| 116 | CR004200- только модифицирован ные | CR705-15-только модифицированные | нижний стебель комбинированная модификация | mGUUUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| CR004201- | верхний стебель, | |||
| 117 | только модифицирован | CR705-16-только модифицированные | нижний стебель комбинированная | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| ные | модификация | |||
| 118 | CR004202- только модифицирован ные | CR705-17-только модифицированные | нижний стебель комбинированная модификация | mGUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| CR004203- | верхний стебель, | |||
| 119 | ТОЛЬКО модифицирован | CR705-18-только модифицированные | нижний стебель комбинированная | mGUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| ные | модификация | |||
| 120 | CR004204- | CR705-19-только | прогулка по | GUUUUAmGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
- 14 046927
| ТОЛЬКО модифицирован ные | модифицированные | связке | ||
| 121 | CR004205- только модифицирован ные | CR705-20-только модифицированные | прогулка по связке | GUUUUAGmAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 122 | CR004206- только модифицирован ные | CR705-21-только модифицированные | прогулка по связке | GAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 123 | CR004207- только модифицирован ные | CR705-22-только модифицированные | прогулка по связке | G f AmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 124 | CR004208- только модифицирован ные | CR705-23-только модифицированные | 2' F прогулка по нижнему стеблю | GfUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 125 126 127 128 129 130 | CR004209- только модифицирован ные CR004210- только модифицирован ные CR004211- только модифицирован ные CR004212- только модифицирован ные CR004213- только модифицирован ные CR004214- только модифицирован ные | CR705-24-только модифицированные CR705-25-только модифицированные CR7 05-2 6-только модифицированные CR705-27-только модифицированные CR705-28-только модифицированные CR7 05-2 9-только модифицированные | 2' F прогулка по нижнему стеблю 2' F прогулка по нижнему стеблю 2' F прогулка по нижнему стеблю 2 ' F нижний стебель комбинированная модификация нижний стебель альтернативная модификация нижний стебель альтернативная модификация | GUfUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG GUUf UUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG GUUUfUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG fG fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG fGmU fUmU fUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG mG fUmU fUmU fAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 131 | CR000657 | немодифицированна я | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 132 | CR004218 | CR657-1 | верхний стебель | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUm |
- 15 046927
| UmUmG | ||||
| 133 | CR004219 | CR657-2 | частичная модификация | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAmUmGmCmUmGmUmUmUmUm гд |
| верхний стебель | ||||
| частичная | ||||
| 134 | CR004220 | CR657-3 | модификация | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAUGCmUmGmUmUmUmUmG |
| верхний стебель | ||||
| частичная | ||||
| 135 | CR004221 | CR657-4 | модификация | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAUGCUGUmUmUmUmG |
| верхний стебель | ||||
| 136 | CR004222 | CR657-5 | нижний стебель | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGmUmUmUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 137 | CR004223 | CR657-6 | прогулка по нижнему стеблю | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 138 | CR004224 | CR657-7 | прогулка по нижнему стеблю | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGmUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 139 | CR004225 | CR657-8 | прогулка по нижнему стеблю | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUmUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 140 | CR004226 | CR657-9 | прогулка по нижнему стеблю | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUmUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 141 | CR004227 | CR657-10 | прогулка по нижнему стеблю | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUmUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 142 | CR004228 | CR657-11 | прогулка по нижнему стеблю | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 143 | CR004229 | CR657-14 | верхний стебель и нижний стебель | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUmUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmU mUmUmUmG |
| нижний стебель | ||||
| 144 | CR004230 | CR657-15 | комбинированная | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| модификация | ||||
| верхний стебель, | ||||
| 145 | CR004231 | CR657-16 | нижний стебель комбинированная модификация | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUm UmUmUmG |
| нижний стебель | ||||
| 146 | CR004232 | CR657-17 | комбинированная | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| модификация | ||||
| верхний стебель, | ||||
| 147 | CR004233 | CR657-18 | нижний стебель комбинированная модификация | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 148 | CR004234 | CR657-19 | прогулка по связке | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAmGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 149 | CR004235 | CR657-20 | прогулка по связке | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGmAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 150 | CR004236 | CR657-21 | прогулка по связке | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAfGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 151 | CR004237 | CR657-22 | прогулка по | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGfAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU |
- 16 046927
| связке | mUmUmG | |||
| 152 | CR004238 | CR657-23 | 2' F прогулка по нижнему стеблю | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGfUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 153 | CR004239 | CR657-24 | 2' F прогулка по нижнему стеблю | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUfUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 154 | CR004240 | CR657-25 | 2' F прогулка по нижнему стеблю | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUfUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 155 | CR004241 | CR657-26 | 2' F прогулка по нижнему стеблю | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUfUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 156 | CR004242 | CR657-27 | 2 ' F нижний стебель комбинированная модификация | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCC fG fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmUmGmCmUm GmUmUmUmUmG |
| 157 | CR004243 | CR657-28 | нижний стебель альтернативная модификация | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCfGmUfUmUfUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUm GmUmUmUmUmG |
| 158 | CR004244 | CR657-29 | нижний стебель альтернативная модификация | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGfUmUfUmUfAGAmGmCmUmAmUmGmCmUm GmUmUmUmUmG |
| 159 | CR004245 | CR657-GC1 | нижний стебель GC | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGGCGCAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 160 | CR004246 | CR657-GC3 | верхний стебель GC | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAUGCUGGCGCG |
| 161 | CR004218- | СЙ657-1-только | верхний стебель | GUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| ТОЛЬКО модифицирован ные | модифицированные | |||
| 162 | CR004219- только модифицирован ные | CR657-2-только модифицированные | частичная модификация верхний стебель | GUUUUAGAGCUAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 163 | CR004220- только модифицирован ные | CR657-3-только модифицированные | частичная модификация верхний стебель | GUUUUAGAGCUAUGCmUmGmUmUmUmUmG |
| 164 | CR004221- только модифицирован ные | СЙ657-4-только модифицированные | частичная модификация верхний стебель | GUUUUAGAGCUAUGCUGUmUmUmUmG |
| 165 | CR004222- только модифицирован ные | CR657-5-только модифицированные | нижний стебель | mGmUmUmUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 166 | CR004223- только модифицирован ные | Сй657-6-только модифицированные | прогулка по нижнему стеблю | mGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
- 17 046927
| 167 | CR004224- только модифицирован ные CR004225- | CR657-7-только модифицированные | прогулка нижнему стеблю | по | GmUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 168 | только модифицирован | СЙ657-8-только модифицированные | прогулка нижнему стеблю | по | GUmUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| ные | |||||
| CR004226- | |||||
| 169 | только модифицирован | СЙ657-9-только модифицированные | прогулка нижнему стеблю | по | GUUmUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| ные | |||||
| CR004227- | |||||
| 170 | ТОЛЬКО модифицирован | CR657-10-только модифицированные | прогулка нижнему стеблю | ПО | GUUUmUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| ные | |||||
| CR004228- | |||||
| 171 | ТОЛЬКО модифицирован | CR657-11-только модифицированные | прогулка нижнему стеблю | по | GUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| ные | |||||
| 172 | CR004229- только модифицирован ные | CR657-14-только модифицированные | верхний стебель нижний стебель | и | mGUUUmUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 173 | CR004230- только модифицирован ные | СЙ657-15-только модифицированные | нижний стебель комбинированная модификация | mGUUUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| CR004231- | верхний стебель, | ||||
| 174 | ТОЛЬКО модифицирован | Сй657-16-только модифицированные | нижний стебель комбинированная | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG | |
| ные | модификация | ||||
| 175 | CR004232- только модифицирован ные | CR657-17-только модифицированные | нижний стебель комбинированная модификация | mGUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| CR004233- | верхний стебель, | ||||
| 176 | ТОЛЬКО модифицирован | CR657-18-только модифицированные | нижний стебель комбинированная | mGUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG | |
| ные | модификация | ||||
| CR004234- | |||||
| 177 | ТОЛЬКО модифицирован | CR657-19-только модифицированные | прогулка связке | по | GUUUUAmGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| ные | |||||
| 178 | CR004235только | CR657-20-только модифицированные | прогулка связке | по | GUUUUAGmAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
- 18 046927
| модифицирован ные | ||||
| 179 | CR004236- только модифицирован ные | CR657-21-только модифицированные | прогулка по связке | GUUUUAfGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 180 | CR004237- только модифицирован ные | CR657-22-только модифицированные | прогулка по связке | GUUUUAGfAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 181 | CR004238- только модифицирован ные | CR657-23-только модифицированные | 2' F прогулка по нижнему стеблю | GfUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 182 | CR004239- только модифицирован ные | CR657-24-только модифицированные | 2' F прогулка по нижнему стеблю | GUfUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 183 | CR004240- только модифицирован ные | CR657-25-только модифицированные | 2' F прогулка по нижнему стеблю | GUUfUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 184 185 186 187 188 189 | CR004241- ТОЛЬКО модифицирован ные CR004242- только модифицирован ные CR004243- только модифицирован ные CR004244- только модифицирован ные trPHK TR000002 TR000110 | CR657-2 6-только модифицированные CR657-27-только модифицированные CR657-28-только модифицированные CR657-2 9-только модифицированные TR2-V2-1 | 2' F прогулка по нижнему стеблю 2 ' F нижний стебель комбинированная модификация нижний стебель альтернативная модификация нижний стебель альтернативная модификация немодифицированна я укороченный хвост | GUUUfUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG fG fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG fGmU fUmU fUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG mG fUmU fUmU fAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 190 | TR000111 | TR2-V2-2 | верхний стебель, шпильки | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAm AmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmU mGmCmUmUmUmU |
- 19 046927
| 191 | TR000112 | TR2-v2-3 | только верхний стебель | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA CUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 192 | TR000113 | TR2-V2-4 | шпилька 1 | AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 193 | TR000114 | TR2-V2-5 | шпилька 2 | AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU |
| 194 | TR000115 | TR2-v2-6 | верхний стебель, шпилька 2 | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA CUUGAAAAAGUGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU |
| 195 | TR000116 | TR2-V2-7 | обе шпильки | AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmUmUm. U |
| 196 | TR000117 | TR2-v2-8 | прогулка по нижнему стеблю | AACAGCAUAGCAAGUmUmAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAA GUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 197 | TR000118 | TR2-V2-9 | прогулка по нижнему стеблю | AACAGCAUAGCAAGUUAmAmAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAA GUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 198 | TR000119 | TR2-V2-10 | прогулка по нижнему стеблю | AACAGCAUAGCAAGUUAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAA GUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 199 | TR000120 | TR2-V2-11 | частичная модификация связка | AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGmUmUmAUCAACUUGAAAA AGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 200 | TR000121 | TR2-V2-12 | частичная модификация связка | AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmAACUUGAAAA AGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 201 | TR000122 | TR2-GC1 | нижний стебель GC | AACAGCAUAGCAAGUUGCGCUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 202 | TR000123 | TR2-GC3 | верхний стебель GC | GCCAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 203 | TR000124 | TR2-GC5 | нижний стебель и верхний стебель GC | GCCAGCAUAGCAAGUUGCGCUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 204 | TR000125 | TR2 все OMe | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCmAmAmGmUmUmAmAmAmAmUmAmAmGmGm CmUmAmGmUmCmCmGmUmUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmU mGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmUmUmUmU | |
| 205 | TR000126 | TR2-V2-13 | нижний стебель | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUmUmAmAmAmAmUAAGGCUAGUCCGU UAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmC mGmGmU mGmCmU mU mU mU |
| 206 | TR000127 | TR2-V2-14 | нижний стебель | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUA UCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmU mGmCmU mU mU mU |
| 207 | TR000128 | TR2-V2-15 | нижний стебель | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGU UAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmC mGmGmUmGmCmUmUmUmU |
| 208 | TR000129 | TR2-V2-16 | нижний стебель альтернативная модификация | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUmUfAmAfAmAfUAAGGCUAGUCCGU UAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmC mGmGmUmGmCmUmUmUmU |
| 209 | TR000130 | TR2-V2-17 | нижний стебель | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGU |
- 20 046927
| альтернативная модификация | UAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmC mGmGmUmGmCmUmUmUmU | ||||
| 210 | TR000131 | TR2-V2-18 | прогулка связке | по | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCmA mAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGm UmGmCmUmUmUmU |
| 211 | TR000132 | TR2-V2-19 | прогулка связке | по | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUmCA mAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGm UmGmCmUmUmUmU |
| 212 | TR000133 | TR2-V2-20 | прогулка связке | по | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAmUCA mAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGm UmGmCmUmUmUmU |
| 213 | TR000134 | TR2-V2-21 | прогулка связке | по | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUmAUCA mAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGm UmGmCmUmUmUmU |
| 214 | TR000135 | TR2-V2-22 | прогулка связке | по | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUmUAUCA mAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGm UmGmCmUmUmUmU |
| 215 | TR000136 | TR2-V2-23 | прогулка связке | по | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGmUUAUCA mAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGm UmGmCmUmUmUmU |
| 216 | TR000137 | TR2-V2-24 | прогулка связке | по | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUf Cf AmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG mUmGmCmUmUmUmU |
| 217 | TR000138 | TR2-V2-25 | прогулка no связке | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUfAfUC AmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG mUmGmCmUmUmUmU |
| 218 | TR000139 | TR2-V2-26 | прогулка по связке | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CG fU fUAUC AmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG mUmGmCmUmUmUmU |
| 219 | TR000140 | TR2-v2-27 | прогулка по связке | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAmGmGmCUAGUCCGUUAU CAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmUmUmUmU |
| 220 | TR000141 | TR2-V2-28 | прогулка по связке | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUmCmCmGUUAU CAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmUmUmUmU |
| 221 | TR000142 | TR2-V2-29 | прогулка по расширению | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCmAmAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC AmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG mUmGmCmUmUmUmU |
| 222 | TR000143 | TR2-V2-30 | прогулка по расширению | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAmGmUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC AmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG mUmGmCmUmUmUmU |
| 223 | TR000144 | TR2-GC6 | нижний стебель GC | AACAGCAUAGCAAGUUGAGAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 224 | TR000145 | TR2-GC7 | GC прогулка по нижнему стеблю | AACAGCAUAGCAAGUUAAAGUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 225 | TR000146 | TR2-GC8 | GC прогулка по | AACAGCAUAGCAAGUUAAGAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU |
| нижнему | стеблю | GGCACCGAGUCGGUGCUUUU | |||
| 226 | TR000147 | TR2-GC9 | GC прогулка по нижнему стеблю | AACAGCAUAGCAAGUUAGAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU | |
| 227 | TR000148 | TR2-GC10 | GC прогулка по нижнему стеблю | AACAGCAUAGCAAGUUGAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU | |
| sgPHK | |||||
| 228 | G000209 | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUU AAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC mU*mU*mU*U | |||
| 229 | G000262 | G209-1 | шпилька | 2 | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUU AAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUmGmGmCmAmCmCmGmA mGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| 230 | G000263 | G209-2 | ШПИЛЬКИ | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUU AAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmG mCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU | |
| 231 | G000264 | G209-3 | петля из четырех нуклеотидов | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAmGmAmAmAUAGCA AGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCG GUGCmU*mU*mU*U | |
| 232 | G000265 | G209-4 | верхний | стебель | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAmGmCmUmAGAAAmUmAm GmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGA GUCGGUGCmU*mU*mU*U |
| 233 234 235 236 237 238 239 | G000266 G000267 G000262- только модифицирован ные G000263- только модифицирован ные G000264- только модифицирован ные G000265- только модифицирован ные G000266- только модифицирован | G209-5 G209-6 С209-1-только модифицированные G20 9-2-только модифицированные С209-3-только модифицированные С209-4-только модифицированные С209-5-только модифицированные | верхний стебель и петля верхний стебель, петля, шпильки шпилька 2 шпильки петля из четырех нуклеотидов верхний стебель верхний стебель и петля | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm. UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCA CCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACU U GAAAAAGUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*m U GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAm CmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmG mCmU*mU*mU*mU GUUUUAGAGCUAmGmAmAmAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC AACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U GUUUUAGAmGmCmUmAGAAAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGU UAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU CCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U |
| 240 | ные G000267- только модифицирован ные | С209-6-только модифицированные | верхний стебель, | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU CCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmG mUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU | ||
| петля, | шпильки | |||||
| 241 242 243 244 245 246 | G000211 G000282 G000201 G000331 G000332 G000333 | G211-7 G211-8 G211-9 | концевая модификация мод. 6 немод. нижний стебель нижний стебель нижний стебель | сг | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUU AAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC mU*mU*mU*U mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUA AGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAm AmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU* mU mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAfGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGm AmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU *mU*mU mU *mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAmGfU fU fU fUmAGAmGmCmUmAmGm AmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU *mU*mU | |
| 247 | G000334 | G211-10 | НИЖНИЙ | стебель | tr | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*m U*mU |
| 248 | G000335 | G211-11 | нижний | стебель | tr | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAiiiAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU *mU*mU |
| 249 | G000336 | G211-12 | нижний | стебель | tr | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU *mU*mU |
| 250 | G000337 | G211-13 | нижний все | стебель | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAm AmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU *mU*mU | |
| 251 | G000338 | G211-14 | нижний все | стебель | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAm AmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmU mGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU* mU*mU*mU | |
| 252 | G000339 | G211-15 | нижний | стебель | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAm |
- 23 046927
| все | AmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmU mGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU* mU*mU*mU | |||
| 253 | G000340 | G211-16 | нижний стебель все | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAfGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGm AmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmU mUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCm U*mU*mU*mU |
| 254 | G000341 | G211-17 | нижний стебель все | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAfGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGm AmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmC mUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGm CmU*mU*mU*mU |
| 255 | G000342 | G211-18 | нижний стебель все | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAfGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGm AmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmC mU mU mGmAmAmAmAmAmGmU mGmGmCmAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmU mGm CmU*mU*mU*mU |
| 256 | G000343 | G211-19 | Расширение сг | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAmGmAmGmCmUmAmGmAmAm AmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU* mU |
| 257 | G000344 | G211-20 | Расширение tr | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCmAmAmGmUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*m U*mU |
| 258 | G000345 | G211-21 | связка | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUfAfUfCfAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*m U*mU |
| 259 | G000346 | G211-22 | связка | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAm AmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU * mU *mU *mU |
| 260 | G000347 | G211-23 | нижний стебель все | mU*mU*mA*CAGCOACGUCUACAGCAfGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAm GmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGmUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAm UmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmC mGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| 261 | G000348 | G211-24 | без PS | mUmUmACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmA mGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAm AmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU |
| 262 | G000349 | G211-25 | 2 ОМе PS | mU*mU*ACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUm AmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmU*mU*mU |
| 263 | G000350 | G211-26 | 2'F шпилька | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGfUfCfGfGfUfGfCfU*fU*fU*mU |
| 264 | G000351 | G211-27 | Альтернативная модификация | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAfAmCfUmUfGmAfAmA |
- 24 046927
| шпилька | fArnAfGmUfGmGfCmAfCmCfGmAfGmUfCmGfGmUfGmCfU*mU*fU*mU | |||
| G000331- | ||||
| только | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUA | |||
| модифицирован | С211-7-только | GUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmA | ||
| 265 | ные | модифицированные | нижний стебель сг | mGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| G000332- | ||||
| ТОЛЬКО | f G f U f U f U f U fAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAG | |||
| модифицирован | С211-8-только | GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmC | ||
| 266 | ные | модифицированные | нижний стебель сг | mGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| G000333- | ||||
| ТОЛЬКО | mG f U f U f U fUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAG | |||
| модифицирован | С211-9-только | GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmC | ||
| 267 | ные | модифицированные | нижний стебель сг | mGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| G000334- | ||||
| ТОЛЬКО | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGC | |||
| модифицирован | С211-10-только | UAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG | ||
| 268 | ные | модифицированные | нижний стебель tr | mAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| G000335- | ||||
| ТОЛЬКО | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAG | |||
| модифицирован | С211-11-только | GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmC | ||
| 269 | ные | модифицированные | нижний стебель tr | mGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| G000336- | G211-12-только | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfArnAfArnUAAG | ||
| 270 | только | модифицированные | нижний стебель tr | GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmC |
| модифицирован | mGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU | |||
| ные | ||||
| G000337- | ||||
| только | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAG | |||
| модифицирован | G211-13-только | нижний стебель | GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmC | |
| 271 | ные | модифицированные | все | mGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| G000338- | ||||
| только | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmArnUA | |||
| модифицирован | G211-14-только | нижний стебель | AGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmC | |
| 272 | ные | модифицированные | все | mCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| G000339- | ||||
| только | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfArnAfArnUA | |||
| модифицирован | С211-15-только | нижний стебель | AGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmC | |
| 273 | ные | модифицированные | все | mCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| G000340- | ||||
| только | f G fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAm | |||
| модифицирован | С211-16-только | нижний стебель | UAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmA | |
| 274 | ные | модифицированные | все | mCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| G000341- | ||||
| только | fG fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAm | |||
| модифицирован | С211-17-только | нижний стебель | AmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmC | |
| 275 | ные | модифицированные | все | mAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| 276 | G000342- | G211-18-только | нижний стебель | fG fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGU fUmAfArnAf |
- 25 046927
| только модифицирован ные | модифицированные | все | AmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmC mAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU *mU *mU | |
| G000343- | ||||
| ТОЛЬКО | GUUUUAmGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUA | |||
| модифицирован | С211-19-только | GUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmA | ||
| 277 | ные | модифицированные | Расширение сг | mGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| G000344- | ||||
| только | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGmUUAAAAUAAGGC | |||
| модифицирован | С211-20-только | UAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG | ||
| 278 | ные | модифицированные | Расширение tr | mAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| G000345- | ||||
| только | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU | |||
| модифицирован | С211-21-только | CCGUUf Af U f Cf AmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG | ||
| 279 | ные | модифицированные | связка | mAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| G000346- | ||||
| ТОЛЬКО | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU | |||
| модифицирован | С211-22-только | CCGUUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm | ||
| 280 | ные | модифицированные | связка | AmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| G000347- | ||||
| только | f G fU fU fU fU f AmGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGmUmUm | |||
| модифицирован | С211-23-только | нижний стебель | AfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm | |
| 281 | ные | модифицированные | все | GmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU * mU *mU * mU |
| G000348- | ||||
| только | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU | |||
| модифицирован | С211-24-только | CCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmG | ||
| 282 | ные | модифицированные | без PS | mU mCmGmGmU mGmCmU mU mU mU |
| G000349- | ||||
| только | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU | |||
| модифицирован | С211-25-только | CCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmG | ||
| 283 | ные | модифицированные | 2 ОМе PS | mUmCmGmGmUmGmCmUmU *mU*mU |
| G000350- | ||||
| только | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU | |||
| модифицирован | G211-2 6-только | CCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmG | ||
| 284 | ные | модифицированные | 2'F шпилька | fUfCfGfGfUfGfCfU*fU*fU*mU |
| G000351- | ||||
| только | Альтернативная | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU | ||
| модифицирован | G211-27-только | модификация | CC GUUAUCAfAmC fUmU f GmAfAmAfAmAf GmU f GmG f CmAf CmC f GmAf G | |
| 285 | ные | модифицированные | шпилька | mUfCmGfGmUfGmCfU*mU*fU*mU |
| me*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUU | ||||
| концевая | AAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC | |||
| 286 | G000208 | модификация | mU*mU*mU*U | |
| mC *mA*mG* GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm | ||||
| UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA | ||||
| 287 | G000373 | мод. 6 | mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | |
| 288 | G000352 | G208-7 | нижний стебель сг | mC *mA*mG* GGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAm |
- 26 046927
| 289 290 291 292 293 | G000353 G000354 G000355 G000356 G000357 | G208-8 G208-9 G208-10 G208-11 G208-12 | нижний нижний НИЖНИЙ нижний нижний | стебель стебель стебель стебель стебель | сг сг tr tr tr | AmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU* mU mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCfGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGm AmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU *mU*mU mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCmGfUfUfUfUmAGAmGmCmUmAmGm AmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU *mU*mU mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*m U*mU mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU *mU*mU mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU *mU*mU |
| 294 | G000358 | G208-13 | нижний все | стебель | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAm AmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU *mU*mU | |
| 295 | G000359 | G208-14 | нижний все | стебель | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAm AmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmU mGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU* mU*mU*mU | |
| 296 | G000360 | G208-15 | нижний все | стебель | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAm AmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmU mGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU* mU*mU*mU | |
| 297 | G000361 | G208-16 | нижний все | стебель | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCfGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGm AmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmU mUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCm U*mU*mU*mU | |
| 298 | G000362 | G208-17 | нижний все | стебель | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCfGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGm AmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmC mUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGm CmU*mU*mU*mU | |
| 299 | G000363 | G208-18 | НИЖНИЙ все | стебель | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCfGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGm AmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmC mU mU mGmAmAmAmAmAmGmU mGmGmC mAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmU mGm |
- 27 046927
| 300 301 302 303 304 305 | G000364 G000365 G000366 G000367 G000368 G000369 | G208-19 G208-20 G208-21 G208-22 G208-23 G208-24 | Расширение сг Расширение tr связка связка нижний стебель все без PS | CmU*mU*mU*mU mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAmGmAmGmCmUmAmGmAmAm AmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU* mU mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCmAmAmGmUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*m U*mU mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUfAfUfCfAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*m U*mU mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAm AmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU * mU *mU *mU mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCfGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAm GmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGmUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAm UmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmC mGmGmUmGmCmU *mU *mU *mU mCmAmGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmA mGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAm AmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU | |
| 306 | G000370 | G208-25 | 2 ОМе PS | mC*mAG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUm AmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmU *mU* mU | |
| 307 | G000371 | G208-26 | 2'F шпилька | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGfUfCfGfGfUfGfCfU*fU*fU*mU | |
| 308 | G000372 | G208-27 | Альтернативная модификация шпилька | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAfAmCfUmUfGmAfAmA fAmAfGmUfGmGfCmAfCmCfGmAfGmUfCmGfGmUfGmCfU*mU*fU*mU | |
| 309 | G000352- только модифицирован ные | G208-7-только модифицированные | нижний стебель | сг | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUA GUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmZYmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmA mGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| 310 | G000353- только модифицирован ные | С208-8-только модифицированные | нижний стебель сг | fG fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmC mGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU | |
| 311 | G000354- только модифицирован ные | С208-9-только модифицированные | нижний стебель | сг | mG fU fU fU f UmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmC mGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU |
| 312 | G000355- | С208-10-только | нижний стебель | tr | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGC |
- 28 046927
| 313 314 315 316 317 | только модифицирован ные G000356- только модифицирован ные G000357- только модифицирован ные G000358- только модифицирован ные G000359- только модифицирован ные G000360- только модифицирован ные | модифицированные С208-11-только модифицированные С208-12-только модифицированные С208-13-только модифицированные С208-14-только модифицированные С208-15-только модифицированные | нижний нижний НИЖНИЙ все нижний все нижний все | стебель tr стебель tr стебель стебель стебель | UAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG mAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU *mU*mU GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAf Af AmAmUAAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmC mGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfArnUAAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmC mGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmC mGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfArnAmUA AGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmC mCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfArnUA AGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmC mCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU | |
| 318 | G000361- только модифицирован ные | G208-16-только модифицированные | НИЖНИЙ все | стебель | fG fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAm UAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmA mCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU | |
| 319 | G000362- только модифицирован ные | G208-17-только модифицированные | нижний все | стебель | fG fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAm AmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmC mAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU | |
| 320 | G000363- только модифицирован ные | С208-18-только модифицированные | нижний все | стебель | fG fU fU fU fU fAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGU fUmAfAmAf AmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmC mAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU | |
| 321 | G000364- только модифицирован ные | С208-19-только модифицированные | Расширение сг | GUUUUAmGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUA GUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmA mGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU | ||
| 322 | G000365- только модифицирован ные | G208-20-только модифицированные | Расширение | tr | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGmUUAAAAUAAGGC UAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG mAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU | |
| 323 | G000366только модифицирован | G208-21-только модифицированные | связка | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU CCGUUfAfUfC fAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG mAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU *mU |
- 29 046927
| 324 325 326 327 328 329 | ные G000367- только модифицирован ные G000368- только модифицирован ные G000369- только модифицирован ные G000370- только модифицирован ные G000371- только модифицирован ные G000372- только модифицирован ные | G208-22-только модифицированные С208-23-только модифицированные С208-24-только модифицированные G208-25-только модифицированные G20 8-2 6-только модифицированные С208-27-только модифицированные | связка нижний стебель все без PS 2 ОМе PS 2'F шпилька Альтернативная модификация шпилька | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU CCGUUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU * mU * mU * mU f G fU fU fU fU fAmGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGmUmUm AfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm GmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU * mU *mU * mU GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU CCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmG mUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU CCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmG mUmCmGmGmUmGmCmUmU *mU*mU GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU CCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmG fUfCfGfGfUfGfCfU*fU*fU*mU GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU CC GUUAUCAfAmC fUmU f GmAfAmAfAmAf GmU f GmG f CmAf CmC f GmAf G mUfCmGfGmUfGmCfU*mU*fU*mU |
| 330 | G000269 | концевая модификация | mC*mC*mC*AUACUCCUACAGCACCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUU AAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC mU*mU*mU*U | |
| 331 | G000283 | мод. 6 | mC *mC*mC*AUACUCCUACAGCACCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAm UmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | |
| 332 | G000285 | немод. | CCCAUACUCCUACAGCACCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUA AGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | |
| 342 | G000537 | G211-33 | 5'-конец ЗхОМеРЗ | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmA mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU |
| 343 | G000538 | G211-34 | 3'-конец ЗхОМеРЗ | mUmUmACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUm AmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 344 | G000539 | G211-35 | 5xOMePS | mU*mU*mA*mC*mA*GCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmA mAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmG*mC*mU *mU*mU*mU |
| 345 | G000541 | G211-37 | 3xOMePS+2PS | mU*mU*mA*C*A*GCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAm AmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmG*mC*mU*mU*m |
- 30 046927
| U*mU | ||||
| 346 | G000542 | G211-38 | 3xOMePS+7PS | mU *mU*mA*С *A* G * C * C *A* C *GUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAm GmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUm UmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmU *mC *mG *mG*mU * mG*mC*mU*mU*mU*mU |
| 347 | G000543 | G211-39 | инв. с удаленными основаниями | (invd)UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmA mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU (инв.) |
| 348 | G000544 | G211-40 | инв. с удаленными основаниями+ЗхОМ ePS | (инв.)mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmG mAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmU mGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU *mU*mU*mU(инв.) |
| 349 | G000564 | G211-42 | ЗхМОЕ-PS | moeU*moeU*moeA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmG mAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmU mGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmo eU*moeU*moeU*mU |
| 350 351 352 353 354 355 356 | G000545 G000546 G000547 G000548 | G211-43 G211-44 G211-45 G211-46 | US петля PS Hl петля PS Н2 петля PS все петли PS Мод.6 (с модификациями, не показанными в списке последовательное тей) Только невариабельная область Паттерн мод.б; только невариабельная область | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmA*mG*mA*m A*mA*mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUm GmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU* mU*mU*mU mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmA mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmU*mG*mA *mA*mA*mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU* mU*mU*mU mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmA mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG * mA *mG * mU * mCmGmGmUmGmCmU * m U*mU*mU mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmA*mG*mA*m A*mA*mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmU* mG*mA*mA*mA*mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG*mA*mG*mU*mCmGmG mUmGmCmU *mU *mU * mU mN * mN *mN *NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmA mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU * mU *mU *mU и=любой нуклеотид GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC UUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAG UCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmA mGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU *mU*mU |
| 357 | Вариабельная и невариабельная область | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | ||
| 358 | Мод.6 с модификациями, показанными в списке последовательное тей | mN *mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmA mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU * mU *mU *mU и=любой нуклеотид |
Термины направляющая РНК и gPHK используются в настоящем документе на равных основаниях и совместно относятся к sgPHK, trPHK (также известной как tracrPHK) или crPHK (также известной как CRISPR РНК). crPHK и trPHK могут быть ассоциированы на одной молекуле РНК (одиночная направляющая РНК [sgPHK]) или в двух раздельных молекулах РНК (двойная направляющая РНК [dgPHK]). Термины направляющая РНК или gPHK относятся к каждому из этих типов.
Последовательности trPHK могут быть природными или последовательность trPHK может содер
- 31 046927 жать модификации или изменения по сравнению с природными последовательностями.
Эффективность редактирования или процентная доля редактирования или процент редактирования в настоящем документе является общим количеством считанных фрагментов последовательности с инсерциями или делециями нуклеотидов в исследуемой области-мишени по отношению к общему количеству считанных фрагментов последовательности после расщепления РНП Cas.
Шпилька в настоящем документе обозначает петлю нуклеиновой кислоты, образованную при складывании нуклеотидной цепи и образовании пар оснований с другим фрагментом той же цепи. Шпилька может образовывать структуру, содержащую петлю или U-образную структуру.
В некоторых вариантах воплощения шпилька может содержать петлю РНК. Шпильки могут быть образованы двумя комплементарными последовательностями одиночной молекулы нуклеиновой кислоты, связывающимися друг с другом при складывании или сморщивании молекулы.
В некоторых вариантах воплощения шпильки образуют структуры типа стебель или стебельпетля.
В настоящем документе термин области обозначает консервативные группы нуклеиновых кислот. Области также можно называть модулями или доменами. Области gPHK могут выполнять конкретные функции, например, при определении специфичности эндонуклеазной активности РНП, например, как описано в статье Briner AE et al., Molecular Cell 56:333-339 (2014). Области gPHK описаны в табл. 13.
В настоящем документе термин рибонуклеопротеин (РНП) или РНП-комплекс описывает gPHK, например, вместе с нуклеазой, например, белком Cas. В некоторых вариантах воплощения РНП содержит Cas9 и gPHK.
Термин стебель-петля в настоящем документе описывает вторичную структуру нуклеотидов, образующих стебель из пар оснований, заканчивающийся петлей из неспаренных нуклеотидов. Стебель может быть образован при по меньшей мере частичной комплементарности двух областей одной и той же цепи нуклеиновой кислоты в последовательности при чтении в противоположных направлениях. Термин петля в настоящем документе описывает область из нуклеотидов, не образующих пар оснований (т.е. не комплементарных друг другу), которые могут находиться над стеблем. Термин тетра-петля описывает петлю из 4 нуклеотидов. В настоящем документе верхний стебель sgPHK может содержать петлю из 4 нуклеотидов.
В некоторых вариантах воплощения, включающих dgPHK, область стебля в настоящем документе означает вторичную структуру из нуклеотидов, образующих область спаренных оснований между некоторыми областями crPHK и trPHK (например, области нижнего и верхнего стебля каждой РНК). Область стебля в dgPHK в данной области техники также можно называть областью флагштока.
Лечение в настоящем документе охватывает любое введение или нанесение терапевтического средства для лечения заболевания у субъекта и включает ингибирование заболевания, остановку его развития, облегчения одного или более из симптомов заболевания, излечивание заболевания или профилактику повторного возникновения одного или более из симптомов заболевания.
1. Типы модификаций.
2'-О-метил-модификации.
Считается, что модифицированные углеводы управляют сморщиванием углеводных колец нуклеотидов - физическим свойством, влияющим на сродство связывания олигонуклеотидов с комплементарными цепями, образование двуцепочечных структур и взаимодействие с нуклеазами. Поэтому заместитель углеводных колец может влиять на подтверждение и сморщивание этих углеводов. Например, 2'-Oметил (2'-O-Me) модификации могут повышать сродство связывания и нуклеазную стабильность олигонуклеотидов, хотя, как показано в примерах, влияние любой модификации в данном положении олигонуклеотида следует определять эмпирически.
Термины mA, mC, mU или mG можно использовать для обозначения нуклеотида, модифицированного 2'-O-Me.
Модификацию рибонуклеотида как 2'-O-метилрибонуклеотида можно обозначить следующим образом
РНК 2'-О-Ме.
2'-O-(2-метоксиэтил) модификации.
- 32 046927
В некоторых вариантах воплощения модификация может быть 2'-О-(2-метоксиэтил) (2'-O-moe). Модификацию рибонуклеотида как a 2'-O-moe-рибонуклеотида можно обозначить следующим образом i
О-ι В
МОЕ
Термины moeA, moeC, moeU или moeG можно использовать для обозначения нуклеотида, модифицированного 2'-O-moe.
2'-фтор-модификации.
Показано, что еще одна химическая модификация, влияющая на углеводные кольца нуклеотидов, является заместителем галогена. Например, 2'-фтор- (2'-F) заместитель в углеводных кольцах нуклеотида может увеличить сродство связывания и нуклеазную стабильность олигонуклеотида.
В настоящей заявке термины fA, fC, fU или fG можно использовать для обозначения нуклеотида, замещенного 2'-F.
Замену 2'-F можно обозначить следующим образом
Ч Aw
Основание · X Основание о ан of * I
РНК 2'F-PHK.
Натуральная структура РНК 2'F замещение.
Фосфоротиоатные модификации.
Фосфоротиоатная (PS) связь относится к связи, где немостиковый атом кислорода в составе фосфата, образующего фосфодиэфирную связь, например, в связях между основаниями нуклеотидов, замещен атомом серы. При использовании фосфоротиоатов для образования олигонуклеотидов модифицированные олигонуклеотиды также можно называть S-олигонуклеотидами.
Знак * можно использовать для обозначения PS-модификации. Например, термины A*, C*, U* или G* можно использовать для обозначения нуклеотида, соединенного со следующим (например, 3'-) нуклеотидом PS-связью.
В настоящей заявке термины mA*, mC*, mU* или mG* можно использовать для обозначения нуклеотида, замещенного 2'-O-Me и соединенного со следующим (например, 3'-) нуклеотидом PSсвязью. Аналогичным образом, термины fA*, fC*, fU* или fG* можно использовать для обозначения нуклеотида, замещенного 2'-F и соединенного со следующим (например, 3'-) нуклеотидом PSсвязью. Эквиваленты PS-соединения или связи входят в варианты воплощения, описанные в настоящем документе.
На приведенной ниже диаграмме показаны S-замены немостиковых атомов кислорода в составе фосфата с образованием PS-связи вместо фосфодиэфирной связи
Природная фосфодиэфирная Модифицированная связь РНК фосфоротиоатная (PS) связь
G-C-заместители.
В некоторых вариантах воплощения gPHK модифицированы заместителями в составе последовательности, не содержащими химических модификаций. В некоторых вариантах воплощения сконструированы модифицированные gPHK с G-C парами (например, в областях нижнего и/или верхнего стебля), не встречающиеся в исходной последовательности gPHK. В некоторых вариантах воплощения сконструированы модифицированные gPHK с G-U-несовпадениями (прецессией GU или образованием несо- 33 046927 ответствующих пар), не встречающиеся в исходной последовательности gPHK.
Инвертированные модификации без оснований.
Нуклеотиды без оснований относятся к нуклеотидам, не содержащим азотистых оснований. Ниже на фигуре изображен олигонуклеотид с сайтом без основания (также называемым апуриновым сайтом), не содержащим азотистого основания.
Инвертированные основания относятся к основаниям со связями, инвертированными по сравнению с обычной 5'-3'-связью (т.е. 5'-5'-связью или 3'-3'-связью).
Например.
Основание
Ь к
Q. Основание . Основание ? .‘И :
РН
Т-У ft У
-оНормальная
Инвертированная
3' инвертированный олигонуклеотидная олигонуклеотидная абазический связь связь
Нуклеотид без основания можно присоединить инвертированной связью. Например, нуклеотид без основания можно присоединить к концевому 5'-нуклеотиду 5'-5'-связью, либо нуклеотид без основания можно присоединить к концевому 3'-нуклеотиду 3'-3'-связью. Инвертированный нуклеотид без основания в положении концевого 5'- или 3'-нуклеотида также можно называть инвертированным концевым кэпом без основания. В настоящей заявке термин инв. означает инвертированную нуклеотидную связь без оснований.
Вышеприведенные модификации и их эквиваленты входят в рамки вариантов воплощения, описан ных в настоящем документе.
2. Композиции направляющих РНК.
Настоящее изобретение включает композиции, содержащие направляющую РНК. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК содержит trPHK. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК содержит crPHK. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК содержит crPHK и trPHK. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК содержит crPHK и trPHK в одной молекуле РНК, например, sgPHK. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК содержит crPHK и trPHK в двух молекулах РНК, например, dgPHK. В dgPHK две молекулы РНК могут связываться посредством образования пар оснований.
В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК содержит 5'-концевую область. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК не содержит 5'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения 5'-концевая область содержит спейсерную область, описанную в статье Briner AE et al., Molecular Cell 56:333-339 (2014) для sgPHK (однако в настоящем документе применимую ко всем направляющим РНК). В некоторых вариантах воплощения 5'-концевая область содержит 5'-концевую модификацию. 5'-концевая область со спейсерной областью или без нее может связываться с crPHK, trPHK, sgPHK и/или dgPHK. Спейсерную область в настоящем и других документах иногда называют направляющей областью, направляющим доменом или доменом, обеспечивающим адресное воздействие. Термин последовательность-мишень в настоящем документе относится к нуклеотидной последовательности, по отношению к которой направляющая область/домен обеспечивает адресное воздействие нуклеазного гидролиза. В некоторых вариантах воплощения направляющая область/домен может обес
- 34 046927 печивать специфичность белка spyCas9 по отношению к последовательности-мишени молекулы нуклеиновой кислоты-мишени за счет нуклеотидов, присутствующих в спейсерной области. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК не содержит спейсерной области.
В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК, описанная в настоящем документе, содержит или состоит из любой из последовательностей, показанных в табл. 4. В то же время следует учитывать, что если последовательность содержит направляющую/спейсерную область, композиция может содержать или не содержать эту область. Кроме того, настоящее изобретение включает направляющие РНК, содержащие модификации любой из последовательностей, показанных в табл. 4 и приведенных в настоящем документе под идентификаторами SEQ ID No. Т.е. нуклеотиды могут быть такими же или другими, но показанный шаблон модификации может быть таким же, как шаблон модификации направляющей последовательности, приведенной в табл. 4, или аналогичным ему. Шаблон модификации включает относительное положение и идентификатор модификации gPHK или области gPHK (например, 5'концевой области, области нижнего стебля, области расширения, области верхнего стебля, области связки, области шпильки 1, области шпильки 2, 3'-концевой области). В некоторых вариантах воплощения шаблон модификации содержит по меньшей мере 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 и 99% модификаций любой из последовательностей, показанных в столбце последовательностей табл. 4, или в одной или более из областей последовательности. В некоторых вариантах воплощения шаблон модификации по меньшей мере на 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 и 99% идентичен шаблону модификации любой из последовательностей, показанных в столбце последовательностей табл. 4. В некоторых вариантах воплощения шаблон модификации по меньшей мере на 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 и 99% идентичен в одной или более из областей последовательности, представленной в табл. 4, например, 5'концевой области, области нижнего стебля, области расширения, области верхнего стебля, области связки, области шпильки 1, области шпильки 2 и/или 3'-концевой области. Например, некоторые варианты воплощения включают направляющую РНК, в которой шаблон модификации по меньшей мере на 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 и 99% идентичен шаблону модификации последовательности в 5'концевой области. Некоторые варианты воплощения включают направляющую РНК, в которой шаблон модификации по меньшей мере на 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 и 99% идентичен шаблону в области нижнего стебля. Некоторые варианты воплощения включают направляющую РНК, в которой шаблон модификации по меньшей мере на 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 9%, 98 и 99% идентичен шаблону в области расширения. Некоторые варианты воплощения включают направляющую РНК, в которой шаблон модификации по меньшей мере на 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 и 99% идентичен шаблону в области верхнего стебля. Некоторые варианты воплощения включают направляющую РНК, в которой шаблон модификации по меньшей мере на 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 и 99% идентичен шаблону в области связки. Некоторые варианты воплощения включают направляющую РНК, в которой шаблон модификации по меньшей мере на 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 и 99% идентичен шаблону в области шпильки 1. Некоторые варианты воплощения включают направляющую РНК, в которой шаблон модификации по меньшей мере на 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 и 99% идентичен шаблону в области шпильки 2. Некоторые варианты воплощения включают направляющую РНК, причем шаблон модификации по меньшей мере на 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 и 99% идентичен шаблону в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения шаблон модификации отличается от шаблона модификации последовательности, приведенной в табл. 4, или области (например, 5'-концевой области, нижнего стебля, расширения, верхнего стебля, связки, шпильки 1, шпильки 2, 3'-концевой области) такой последовательности на 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения gPHK содержит модификации, отличающиеся от модификаций последовательности, приведенной в табл. 4, на 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения gPHK содержит модификации, отличающиеся от модификаций области (например, 5'-концевой области, нижнего стебля, расширения, верхнего стебля, связки, шпильки 1, шпильки 2, 3'-концевой области) последовательности, приведенной в табл. 4, на 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидов.
В некоторых вариантах воплощения gPHK содержит 2'-O-метил (2'-O-Me) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения gPHK содержит 2'-O-(2-метоксиэтил) (2'-O-moe) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения gPHK содержит 2'-фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения gPHK содержит фосфоротиоатную (PS) связь между нуклеотидами.
В некоторых вариантах воплощения gPHK содержит a 5'-концевую модификацию, 3'-концевую модификацию или 5'- и 3'-концевые модификации. В некоторых вариантах воплощения 5'-концевая модификация содержит фосфоротиоатную (PS) связь между нуклеотидами. В некоторых вариантах воплощения 5'-концевая модификация содержит a 2'-O-метил (2'-O-Me), 2'-O-(2-метоксиэтил) (2'-O-moe) и/или 2'фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения 5'-концевая модификация содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную (PS) связь и один или более из 2'-O-метил (2'-OMe), 2'-O-(2-метоксиэтил) (2'-O-moe) и/или 2'-фтор (2'-F) модифицированных нуклеотидов. Концевая модификация может включать фосфоротиоатную (PS), 2'-O-метил (2'-O-Me), 2'-O-(2-метоксиэтил) (2'-Omoe) и/или 2'-фтор (2'-F) модификацию. Эквивалентные концевые модификации также входят в вариан
- 35 046927 ты воплощения, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах воплощения gPHK содержит концевую модификацию в комбинации с модификацией одной или более областей gPHK.
Композиции sgPHK.
В некоторых вариантах воплощения композиции и способы согласно настоящему изобретению включают gPHK, содержащую crPHK и trPHK, обеспечивающие специфичность нуклеазы, например, Cas9, по отношению к последовательности ДНК-мишени. В некоторых вариантах воплощения gPHK, описанные в настоящем документе, могут быть ассоциированы на одной молекуле РНК (одиночной направляющей РНК или sgPHK).
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает sgPHK, содержащую или состоящую из любой из последовательностей, описанных в SEQ ID No: 228-332.
В некоторых вариантах воплощения предложена sgPHK, содержащая любую одну из модифицированных последовательностей SEQ ID Nos: 235-240, 265-285 и 309-329. Некоторые варианты воплощения включают sgPHK, содержащую любую одну из модифицированных последовательностей SEQ ID No: 235-240, 265-285 и 309-329, причем sgPHK дополнительно содержит 5'-спейсерную последовательность (направляющую последовательность), комплементарную последовательности-мишени и обеспечивающую специфичность Cas9 по отношению к гидролизуемой мишени. В некоторых случаях настоящее изобретение включает sgPHK, содержащую нуклеиновые кислоты, характеризующиеся по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% идентичностью по отношению к нуклеиновым кислотам любой из SEQ ID No: 235-240, 265-285 и 309-329, в которой шаблон модификации идентичен шаблону модификации, представленному в эталонном идентификаторе последовательности.
1. Домены sgPHK.
В статье Briner AE et al., Molecular Cell 56:333-339 (2 014) описаны функциональные домены sgPHK, в настоящем документе называемые доменами, включая спейсерный домен, отвечающий за адресное воздействие, домены нижний стебель, расширение, верхний стебель (который может содержать петлю из 4 нуклеотидов), связка и шпилька 1 и шпилька 2. См. Briner et al. на странице 334, фиг. 1A.
В табл. 1 и на фиг. 21A представлено описание доменов sgPHK, используемое в настоящем документе. В табл. 1, n между областями является переменной количества нуклеотидов, например, от 0 до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более. В некоторых вариантах воплощения n равно 0. В некоторых вариантах воплощения n равно 1.
Таблица 1 __________________________Области sgPHK (линейный вид, от 5' к 3')__________________________
| LS1-6 | В1-2 | US1-12 | ВЗ-6 | |||||
| 5'-концевая область | Нижний стебель | η | Расширение | η | Верхний стебель | η | Расширение | п |
| LS7-12 | Ν1-18 | Н1-1 по Н1-12 | Н2-1 по Н2-12 | |||||
| Нижний стебель | η | Связь | η | Шпилька 1 | η | Шпилька 2 | 3'-концевая область |
5'-концевая область.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит нуклеотиды в 5'-концевой области, показанные в табл. 1. В некоторых вариантах воплощения 5'-концевая область sgPHK содержит спейсерную или направляющую область, обеспечивающую специфичность белка Cas по отношению к нуклеотидной последовательности-мишени. В некоторых вариантах воплощения 5'-концевая область не содержит спейсерной или направляющей области. В некоторых вариантах воплощения 5'-концевая область содержит спейсер и дополнительные нуклеотиды, не обеспечивающие специфичности белка Cas по отношению к нуклеотидной области-мишени.
В некоторых вариантах воплощения направляющая область содержит первые 1-10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов на 5'-конце sgPHK. В некоторых вариантах воплощения направляющая область содержит 20 нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения направляющая область может содержать 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения направляющая область может содержать 17 нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения направляющая область может содержать 18 нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения направляющая область может содержать 19 нуклеотидов.
В некоторых вариантах воплощения выбор направляющей области определяется последовательностями-мишенями в пределах генов, подлежащих редактированию. Например, в некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит направляющую область, комплементарную последовательностям-мишеням исследуемого гена.
В некоторых вариантах воплощения последовательность-мишень исследуемого гена может быть комплементарна направляющей области sgPHK. В некоторых вариантах воплощения степень комплементарности или идентичности между направляющей областью sgPHK и соответствующей последовательностью-мишенью исследуемого гена может составлять приблизительно 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,
- 36 046927
90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%. В некоторых вариантах воплощения направляющая область sgPHK и область-мишень исследуемого гена могут быть на 100% комплементарны или идентичны. В других вариантах воплощения направляющая область sgPHK и последовательность-мишень исследуемого гена могут содержать по меньшей мере одно несовпадение. Например, направляющая область sgPHK и последовательность-мишень исследуемого гена могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 несовпадений, причем общая длина последовательности-мишени составляет по меньшей мере приблизительно 17, 18, 19, 20 или более пар оснований. В других вариантах воплощения направляющая область sgPHK и последовательность-мишень исследуемого гена могут содержать 1-6 несовпадений, причем направляющая последовательность содержит по меньшей мере 17, 18, 19, 20 или более нуклеотидов. В других вариантах воплощения направляющая область sgPHK и последовательность-мишень исследуемого гена могут содержать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 несовпадений, причем направляющая последовательность содержит приблизительно 20 нуклеотидов. 5'-концевая область может содержать нуклеотиды, не считающиеся направляющими областями (например, не обеспечивающие специфичности белка cas9 по отношению к нуклеиновой кислотемишени).
Нижний стебель.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит область нижнего стебля (LS), которая при просмотре в линейном виде разделена областями расширения и верхнего стебля. См. табл. 1.
В некоторых вариантах воплощения области нижнего стебля содержат 1-12 нуклеотидов, например, в одном варианте воплощения область нижнего стебля содержит LS1-LS12. В некоторых вариантах воплощения область нижнего стебля содержит меньшее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 1 и на фиг. 21A. В некоторых вариантах воплощения область нижнего стебля содержит большее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 1 и на фиг. 21A. Если область нижнего стебля содержит меньшее или большее количество нуклеотидов, чем показано на схеме в табл. 1 и на фиг. 21A, шаблон модификации, как очевидно для специалиста, должен соблюдаться.
В некоторых вариантах воплощения область нижнего стебля содержит нуклеотидные последовательности, комплементарные друг другу при просмотре в противоположных направлениях. В некоторых вариантах воплощения комплементарность нуклеотидной последовательности нижнего стебля приводит к образованию вторичной структуры типа стебель в sgPHK (например, области могут образовывать пары оснований друг с другом). В некоторых вариантах воплощения области нижнего стебля могут быть не полностью комплементарны друг другу при просмотре в противоположных направлениях.
Расширение.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит область расширения, содержащую шесть нуклеотидов - B1-B6. При просмотре в линейном виде область расширения разделена на две области. См. табл. 1. В некоторых вариантах воплощения область расширения содержит шесть нуклеотидов, причем после первых двух нуклеотидов располагается область верхнего стебля, после которой располагаются последние четыре нуклеотида расширения. В некоторых вариантах воплощения область расширения содержит меньшее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 1 и на фиг. 21A. В некоторых вариантах воплощения область расширения содержит большее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 1 и на фиг. 21A. Если область расширения содержит меньшее или большее количество нуклеотидов, чем показано на схеме в табл. 1 и на фиг. 21A, шаблон модификации, как очевидно для специалиста, должен соблюдаться.
В некоторых вариантах воплощения наличие расширения приводит к направленной связи между модулями верхнего и нижнего стебля в sgPHK.
Верхний стебель.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит область верхнего стебля, содержащую 12 нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения область верхнего стебля содержит последовательность петли. В некоторых случаях указанная петля является петлей, состоящей из четырех нуклеотидов.
В некоторых вариантах воплощения область верхнего стебля содержит меньшее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 1 и на фиг. 21A. В некоторых вариантах воплощения область верхнего стебля содержит большее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 1 и на фиг. 21A. Если область верхнего стебля содержит меньшее или большее количество нуклеотидов, чем показано на схеме в табл. 1 и на фиг. 21A, шаблон модификации, как очевидно для специалиста, должен соблюдаться.
В некоторых вариантах воплощения область верхнего стебля содержит нуклеотидные последовательности, комплементарные друг другу при просмотре в противоположных направлениях. В некоторых вариантах воплощения комплементарность нуклеотидной последовательности верхнего стебля приводит к образованию вторичной структуры типа стебель в sgPHK (например, области могут образовывать пары оснований друг с другом). В некоторых вариантах воплощения области верхнего стебля могут быть не полностью комплементарны друг другу при просмотре в противоположных направлениях.
Связка.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит область связки, расположенную между областью нижнего стебля и областью шпильки 1. В некоторых вариантах воплощения связка содержит 18 нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения область связки содержит нуклеотиды N1-N18, пока
- 37 046927 занные в табл. 1 и на фиг. 21A.
В некоторых вариантах воплощения область связки содержит меньшее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 1 и на фиг. 21A. В некоторых вариантах воплощения область связки содержит большее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 1 и на фиг. 21A. Если область связки содержит меньшее или большее количество нуклеотидов, чем показано на схеме в табл. 1 и на фиг. 21A, шаблон модификации, как очевидно для специалиста, должен соблюдаться.
В некоторых вариантах воплощения область связки содержит нуклеотидные последовательности, комплементарные друг другу при просмотре в противоположных направлениях. В некоторых вариантах воплощения комплементарность нуклеотидной последовательности приводит к образованию вторичной структуры типа стебель и/или стебель-петля в sgPHK (например, некоторые нуклеотиды в области связки могут образовывать пары оснований друг с другом). В некоторых вариантах воплощения области связки могут быть не полностью комплементарны друг другу при просмотре в противоположных направлениях.
Шпилька.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит одну или более из областей шпильки. В некоторых вариантах воплощения область шпильки находится ниже (например, в 3'-направлении от) области связки. В некоторых вариантах воплощения область нуклеотидов непосредственно ниже области связки называют шпилькой 1 или H1. В некоторых вариантах воплощения область нуклеотидов в 3'направлении от шпильки 1 называют шпилькой 2 или H2. В некоторых вариантах воплощения область шпильки содержит шпильку 1 и шпильку 2. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит только шпильку 1 или шпильку 2.
В некоторых вариантах воплощения область шпильки 1 содержит 12 нуклеотидов непосредственно ниже области связки. В некоторых вариантах воплощения область шпильки 1 содержит нуклеотиды с H1-1 по H1-12, показанные в табл. 1 и на фиг. 21A.
В некоторых вариантах воплощения область шпильки 2 содержит 15 нуклеотидов непосредственно ниже области шпильки 1. В некоторых вариантах воплощения область шпильки 2 содержит нуклеотиды с H2-1 по H2-15, показанные в табл. 1 и на фиг. 21A.
В некоторых вариантах воплощения между областями шпильки 1 и шпильки 2 присутствует один или более из нуклеотидов. Один или более из нуклеотидов между областями шпильки 1 и шпильки 2 могут быть модифицированными или немодифицированными. В некоторых вариантах воплощения шпилька 1 и шпилька 2 разделены одним нуклеотидом. В некоторых вариантах воплощения области шпилек содержат меньшее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 1 и на фиг. 21A. В некоторых вариантах воплощения области шпилек содержат большее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 1 и на фиг. 21A. Если область шпильки содержит меньшее или большее количество нуклеотидов, чем показано на схеме в табл. 1 и на фиг. 21A, шаблон модификации, как очевидно для специалиста, должен соблюдаться.
В некоторых вариантах воплощения область шпильки содержит нуклеотидные последовательности, комплементарные друг другу при просмотре в противоположных направлениях. В некоторых вариантах воплощения области шпильки могут быть не полностью комплементарны друг другу при просмотре в противоположных направлениях (например, верхняя область или петля шпильки содержит неспаренные нуклеотиды).
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит заместитель шпильки 1 n нуклеотидами, причем n является целым числом между 1 и 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 и 2. В некоторых вариантах воплощения область шпильки 1 sgPHK замещена 2 нуклеотидами.
3'-концевая область.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит нуклеотиды после области(ей) шпильки. В некоторых вариантах воплощения 3'-концевая область содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 или более нуклеотидов, например, не ассоциированных со вторичной структурой шпильки. В некоторых вариантах воплощения 3'-концевая область содержит 1, 2, 3 или 4 нуклеотида, не ассоциированных со вторичной структурой шпильки. В некоторых вариантах воплощения 3'-концевая область содержит 4 нуклеотида, не ассоциированных со вторичной структурой шпильки. В некоторых вариантах воплощения 3'концевая область содержит 1, 2 или 3 нуклеотида, не ассоциированных со вторичной структурой шпильки.
2. Модификации sgPHK.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает sgPHK, содержащую одну или более из модификаций в пределах одной или более из следующих областей: нуклеотидов в 5'концевой области; области нижнего стебля; области расширения; области верхнего стебля; области связки; области шпильки 1; области шпильки 2; и нуклеотидов в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения модификация содержит 2'-O-метил (2'-O-Me) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения модификация содержит a 2'-O-(2-метоксиэтил) (2'O-moe) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения модификация содержит a 2'фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения модификация содержит
- 38 046927 фосфоротиоатную (PS) связь между нуклеотидами.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в 1, 2, 3 или 4 из первых 4 нуклеотидов на 5'-конце. В некоторых вариантах воплощения первые три или четыре нуклеотида в 5'концевой области и последние три или четыре нуклеотида в 3'-концевой области являются модифицированными. В некоторых вариантах воплощения первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены фосфоротиоатными (PS) связями. В некоторых вариантах воплощения модификация содержит 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения модификация содержит 2'-F. В некоторых вариантах воплощения модификация содержит 2'-O-moe.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в 1, 2, 3 или 4 из первых 4 нуклеотидов на 5'-конце. В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит модификации в 1, 2, 3 или 4 из первых 4 нуклеотидов на 3'-конце. В некоторых вариантах воплощения первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены PS связью, а первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'-концевой области содержат 2'-O-Me или 2'-O-moe модификации.
В некоторых вариантах воплощения первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены PS связью, а первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'-концевой области содержат 2'-F модификации.
В некоторых вариантах воплощения предложена sgPHK, в которой LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12 модифицированы 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения каждый из нуклеотидов в области расширения sgPHK модифицирован 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения каждый из нуклеотидов в области верхнего стебля sgPHK модифицирован 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения N16, N17 и N18 в области связки sgPHK модифицированы 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения каждый из нуклеотидов в области шпильки 1 sgPHK модифицирован 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения каждый из нуклеотидов в области шпильки 2 sgPHK модифицирован 2'-O-Me.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит следующие 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды: первые три нуклеотида в 5'-концевой области; LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12; B1 и B2 в области расширения; каждый из нуклеотидов в области верхнего стебля sgPHK; N16, N17 и N18 в области связки; каждый из нуклеотидов в области шпильки 1; каждый из нуклеотидов в области шпильки 2; и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах в 5'концевой области и 2'-G-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения LS9 и LS10 модифицированы 2'-F. В некоторых вариантах воплощения N15, N16, N17 и N18 модифицированы 2'-F. В некоторых вариантах воплощения H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, HS-14 и H2-15 модифицированы 2'-F. В некоторых вариантах воплощения со второго по последний, с третьего по последний и с четвертого по последний нуклеотиды в 3'-концевой области модифицированы 2'-F.
В некоторых вариантах воплощения предложена одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая следующие 2'-F модифицированные нуклеотиды: LS9 и LS10 в области нижнего стебля; N15, N16, N17 и N18 в области связки; и H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, HS-14 и H2-15 в области шпильки 2. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит 2'-F модифицированные нуклеотиды со второго по последнее, с третьего по последнее и с четвертого по последнее положение в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит 2'-О-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'концевой области и 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в трех из последних четырех нуклеотидов в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена одиночная направляющая PHE (sgPHK), содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1 и LS6; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12; 2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена одиночная направляющая PHE (sgPHK), содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области; 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS1-LS6; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в поло
- 39 046927 жениях US1-US12; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12; 2'-O-Me модифицированный нуклеотид в положении n между шпилькой 1 и шпилькой 2; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена одиночная направляющая PHE (sgPHK), содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области; 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS2-LS5; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1 и LS6; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12; 2'-O-Me модифицированный нуклеотид в положении n между шпилькой 1 и шпилькой 2; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H215; и 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена одиночная направляющая PHE (sgPHK), содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS7, LS8, LS11 и LS12; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12; 2'-O-Me модифицированный нуклеотид в положении n между шпилькой 1 и шпилькой 2; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1 - H2-15; и 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена одиночная направляющая PHE (sgPHK), содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS8, LS10 и LS12; 2'-O-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS7, LS9 и LS11; 2'O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12; 2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H215; и 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена одиночная направляющая PHE (sgPHK), содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H11-H1-12; 2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и 2'-О-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена одиночная направляющая PHE (sgPHK), содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12; 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS9 и LS10; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1US12; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12; 2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H21-H2-15; и 2'-О-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена одиночная направляющая PHE (sgPHK), содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1 и H1-12; 2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2; 2'O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1 - H2-8; 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях H2-9-H2-15; 2'-F модифицированные нуклеотиды во втором с последнего, третьем с последнего и четвертом с последнего положениях в 3'-концевой области и 2'-O-Me модифицированный нуклеотид в последнем положении в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополни
- 40 046927 тельно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена одиночная направляющая PHE (sgPHK), содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12; 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10 и H1-12; 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9 и H1-11; 2'-F модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2; 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12 и H2-14; 2'-OMe модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1, H2-3, H2-5, H2-8, H2-9, H2-11, H2-13 и H2-15; 2'-F модифицированные нуклеотиды во втором с последнего и четвертом с последнего положениях в 3'концевой области; и 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в третьем с последнего и последнем положении в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В настоящем документе в некоторых вариантах воплощения описана одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая 2'-O-Me модификации в положениях LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13 и H2-15; и 2'-F модификации в положениях LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12 и H214. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последнем и с третьего по последнее положениях в 3'-концевой области; и 2'-F модифицированные нуклеотиды со второго по последнее и с третьего по последнего положениях в 3'-концевой области.
В настоящем документе в некоторых вариантах воплощения описана sgPHK, содержащая нуклеиновые кислоты согласно любой из SEQ ID No: 228-232. В настоящем документе в некоторых вариантах воплощения описана sgPHK, содержащая нуклеиновые кислоты согласно любой одной из SEQ ID No: 235-240, 265-285 и 309-329. В настоящем документе в некоторых вариантах воплощения описана sgPHK, содержащая нуклеиновые кислоты, обладающие по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% идентичностью по отношению к нуклеиновым кислотам согласно любой одной из SEQ ID No: 235-240, 265-285 и 309-329, в которой шаблон модификации идентичен шаблону модификации, представленному в эталонном идентификаторе последовательности. В некоторых вариантах воплощения sgPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена sgPHK, содержащая 5'-концевую модификацию и одну или более из модификаций в одной или более из: области верхнего стебля; области шпильки 1; и области шпильки 2, причем 5'-концевая модификация включает по меньшей мере две фосфоротиоатных связи в пределах первых семи нуклеотидов 5'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена sgPHK, содержащая 5'-концевую модификацию и одну или более из модификаций в одной или более из: области верхнего стебля; области шпильки 1; и области шпильки 2, причем 5'-концевая модификация включает одну или более из фосфоротиоатных связей в 5'-концевой области РНК. В некоторых вариантах воплощения одна или более из фосфоротиоатных связей соединяет 5' концевые нуклеотиды.
В некоторых вариантах воплощения предложена sgPHK, содержащая 5'-концевую модификацию и одну или более из модификаций в одной или более из: области верхнего стебля; области шпильки 1; и области шпильки 2, причем 5'-концевая модификация включает одну или более из фосфоротиоатных связей в пределах первых семи нуклеотидов 5'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена sgPHK, содержащая любую одну из модифицированных последовательностей sgPHK согласно SEQ ID No: 228-332.
В некоторых вариантах воплощения предложена sgPHK, содержащая или состоящая из любой одной из модифицированных последовательностей sgPHK согласно SEQ ID No: 235-240, 265-285 и 309-329.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает sgPHK, содержащую любую одну из модифицированных последовательностей согласно SEQ ID No: 235-240, 265-285 и 309-329, причем sgPHK дополнительно содержит 5'-спейсерную последовательность, по меньшей мере частично комплементарную последовательности-мишени, обеспечивающую специфичность Cas9 по отношению к гидролизуемой мишени.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает sgPHK, содержащую нуклеотиды, обладающие по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% идентичностью по отношению к нуклеотидам согласно любой из SEQ ID No: 235-240, 265-285 и 309-329, в которой шаблон модификации идентичен шаблону модификации, представленному в эталонном идентификаторе последовательности. Т.е. нуклеотиды A, U, C и G могут различаться на 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91,
- 41 046927
90, 85, 80, 75 или 70% по сравнению с нуклеотидами, показанными в последовательностях, однако модификации остаются неизменными.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает sgPHK, содержащую одну или более из модификаций в пределах одной или более из следующих областей: нуклеотидов в 5'концевой области; области нижнего стебля; области расширения; области верхнего стебля; области связки; области шпильки 1; области шпильки 2; и нуклеотидов в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-O-метил (2'-O-Me) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения модификация включает фосфоротиоатную (PS) связь между нуклеотидами. В некоторых вариантах воплощения модификация включает инвертированный нуклеотид без основания.
В некоторых вариантах воплощения предложена sgPHK, содержащая следующие 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды: первые три нуклеотида в 5'-концевой области; LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12 в нижнем стебле; B1 и B2 в области расширения; каждый из нуклеотидов в области верхнего стебля; N16, N17 и N18 в области связки; каждый из нуклеотидов в области шпильки 1; один нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2; каждый из нуклеотидов в области шпильки 2; и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области. В одном варианте воплощения sgPHK дополнительно содержит три PS связи между первыми четырьмя нуклеотидами в 5'-концевой области и три PS связи между последними четырьмя нуклеотидами в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена sgPHK, содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в: первых трех положениях в 5'-концевой области; LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12 в нижнем стебле; B1-B6 в области расширения; каждый из нуклеотидов в области верхнего стебля; N16, N17 и N18 в области связки; каждый из нуклеотидов в области шпильки 1; один нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2; каждый из нуклеотидов в области шпильки 2; и последние четыре нуклеотида в 3'концевой области. В одном варианте воплощения sgPHK дополнительно содержит три PS связи между первыми четырьмя нуклеотидами в 5'-концевой области и три PS связи между последними четырьмя нуклеотидами в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена sgPHK, содержащая 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях: LS9 и LS10 в нижнем стебле; 15-N18 в области связки; H2-9-HS-15 в области шпильки 2; во втором от последнего, в третьем от последнего и в четвертом от последнего нуклеотидах в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена sgPHK, содержащая 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях: каждом положении в нижнем стебле; 15-N18 в области связки; H2-9-HS-15 в области шпильки 2; и во втором от последнего, в третьем от последнего и в четвертом от последнего нуклеотидах в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H110, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13, H2-15 и в последнем и в третьем от последнего нуклеотидах в 3'-концевой области; и 2'-F модификации в положениях LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12, H2-14 и во втором от последнего и в четвертом от последнего нуклеотидах в 3'-концевой области.
Настоящее изобретение включает каждый из следующих вариантов воплощения.
Вариант воплощения 01. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая одну или более из модификаций в одной или более из следующих областей:
5'-концевой области;
области нижнего стебля;
области расширения;
области верхнего стебля;
области связки;
области шпильки 1;
области шпильки 2; и
3'-концевой области.
Вариант воплощения 02. sgPHK согласно варианту воплощения 1, в которой указанная модификация включает 2'-O-метил (2'-O-Me) модифицированный нуклеотид.
Вариант воплощения 03. sgPHK согласно варианту воплощения 1, в которой указанная модификация включает 2'-фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид.
Вариант воплощения 04. sgPHK согласно варианту воплощения 1, в которой указанная модификация включает фосфоротиоатную (PS) связь между нуклеотидами.
Вариант воплощения 05. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-3, в которой первые три или четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние три или четыре нуклеотида в 3'-концевой области являются модифицированными.
Вариант воплощения 06. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-5, в которой первые
- 42 046927 четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в З'-концевой области соединены фосфоротиоатными (PS) связями.
Вариант воплощения 07. sgPHK согласно варианту воплощения 5, в которой указанная модификация включает 2'-O-Me.
Вариант воплощения 08. sgPHK согласно варианту воплощения 5, в которой указанная модификация включает 2'-F.
Вариант воплощения 09. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-7, в которой первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены PS связью, а первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'концевой области содержат 2'-O-Me модификации.
Вариант воплощения 10. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-8, в которой первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены PS связью, а первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'концевой области содержат 2'-F модификации.
Вариант воплощения 11. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-10, в которой LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12 модифицированы 2'-O-Me.
Вариант воплощения 12. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-11, в которой каждый из нуклеотидов в области расширения модифицирован 2'-O-Me.
Вариант воплощения 13. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-12, в которой каждый из нуклеотидов в области верхнего стебля модифицирован 2'-O-Me.
Вариант воплощения 14. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-13, в которой N16, N17 и N18 в области связки модифицированы 2'-O-Me.
Вариант воплощения 15. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-14, в которой каждый из нуклеотидов в области шпильки 1 модифицирован 2'-O-Me.
Вариант воплощения 16. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-15, в которой каждый из нуклеотидов в области шпильки 2 модифицирован 2'-O-Me.
Вариант воплощения 17. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая 2'-O-Meмодифицированные нуклеотиды в следующих положениях:
первых трех нуклеотидах в 5'-концевой области;
LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12 в области нижнего стебля;
B1 и B2 в области расширения;
каждом нуклеотиде в области верхнего стебля;
N16, N17 и N18 в области связки;
каждом нуклеотиде в области шпильки 1;
каждом нуклеотиде в области шпильки 2; и последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 18. sgPHK согласно варианту воплощения 17, в которой B3-B6 модифицированы 2'-O-Me.
Вариант воплощения 19. sgPHK согласно варианту воплощения 17, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 20. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-10, в которой LS9 и LS10 модифицированы 2'-F.
Вариант воплощения 21. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-10 и 20, в которой N15, N16, N17 и N18 модифицированы 2'-F.
Вариант воплощения 22. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-10 и 20-21, в которой H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 и H2-15 модифицированы 2'-F.
Вариант воплощения 23. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 1-10 и 21-22, в которой второй от последнего, третий от последнего и четвертый от последнего нуклеотиды 3'-концевой области модифицированы 2'-F.
Вариант воплощения 24. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая 2'-Fмодифицированные нуклеотиды в следующих положениях:
LS9 и LS10 в области нижнего стебля;
N15, N16, N17 и N18 в области связки; и
H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 и H2-15 в области шпильки 2.
Вариант воплощения 25. sgPHK согласно варианту воплощения 24, дополнительно содержащая 2'-F модифицированные нуклеотиды во втором от последнего, в третьем от последнего и в четвертом от последнего нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 26. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 24 или 25, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 27. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 24-26, дополнительно
- 43 046927 содержащую 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области и 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в трех из последних четырех нуклеотидов в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 28. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1 и LS6;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 29. sgPHK согласно варианту воплощения 28, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 30. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS1-LS6;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 31. sgPHK согласно варианту воплощения 30, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 32. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS2-LS5;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1 и LS6;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 33. sgPHK согласно варианту воплощения 32, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 34. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS7, LS8, LS11 и LS12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 35. sgPHK согласно варианту воплощения 34, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 36. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS7, LS8, LS11 и LS12;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS9 и LS10;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 37. sgPHK согласно варианту воплощения 36, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 38. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
- 44 046927
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS8, LS10 и LS12;
2'-O-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS7, LS9 и LS11;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 39. sgPHK согласно варианту воплощения 32, содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3 '-концевой области.
Вариант воплощения 40. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 41. sgPHK согласно варианту воплощения 40, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 42. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и LS12;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS9 и LS10;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-15; и
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 43. sgPHK согласно варианту воплощения 43, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 44. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1-H1-12;
2'-O-Me модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1-H2-8;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях H2-9-H2-15;
2'-F модифицированные нуклеотиды во втором от последнего, в третьем от последнего и в четвертом от последнего нуклеотиде 3'-концевой области; и
2'-O-Me модифицированный нуклеотид в последнем нуклеотиде 3'-концевой области.
Вариант воплощения 45. sgPHK согласно варианту воплощения 44, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 46. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах 5'-концевой области;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях US1-US12;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10 и H1-12;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9 и H1-11;
2'-F модифицированный нуклеотид между шпилькой 1 и шпилькой 2;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12; и H2-14;
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11; H2-13 и H2-15;
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях во втором от последнего и в четвертом от последнего нуклеотиде 3'-концевой области; и
2'-O-Me модифицированный нуклеотид в третьем от последнего и последнем нуклеотиде в 3'концевой области.
Вариант воплощения 47. sgPHK согласно варианту воплощения 46, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
- 45 046927
Вариант воплощения 48. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13 и H2-15; и
2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12 и H2-14.
Вариант воплощения 49. sgPHK согласно варианту воплощения 48, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 50. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 48-49, дополнительно содержащая:
2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последнем и в третьем от последнего положении в 3'концевой области; и
2'-F модифицированные нуклеотиды во втором от последнего и в третьем от последнего нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 51. sgPHK, содержащая нуклеиновые кислоты согласно любой одной из SEQ ID No: 228-332.
Вариант воплощения 52. sgPHK, содержащая нуклеиновые кислоты согласно любой одной из SEQ ID No: 235-240, 265-285 и 309-329.
Вариант воплощения 53. sgPHK, содержащая нуклеиновые кислоты, обладающие по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% идентичностью по отношению к нуклеиновым кислотам согласно любой из SEQ ID No: 235-240, 265-285 и 309-329, в которой шаблон модификации идентичен шаблону модификации, представленному в эталонном идентификаторе последовательности.
Вариант воплощения 54. sgPHK согласно любому из вариантов воплощения 51-53, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Композиции dgPHK.
В некоторых вариантах воплощения композиции и способы согласно настоящему изобретению включают gPHK, содержащую crPHK и trPHK, обеспечивающие специфичность нуклеазы, например, Cas9, по отношению к последовательности ДНК-мишени. В некоторых вариантах воплощения gPHK ассоциированы, но находятся на двух отдельных молекулах РНК (двойная направляющая РНК или dgPHK).
В табл. 2 и на фиг. 21C представлено описание доменов crPHK, используемое в настоящем документе. 5'-концевая область может содержать спейсерную область в 5'-концевой области сРНК или вблизи от нее, обеспечивающую специфичность Cas9 по отношению к области ДНК-мишени, например, описанной в настоящем документе. В табл. 2 n между областями является переменной количества нуклеотидов, например, от 0 до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более. В некоторых вариантах воплощения n равно 0. Любая из dgPHK, описанных в настоящем документе, может содержать n между любыми доменами.
В табл. 3 и на фиг. 21C представлено описание доменов trPHK, используемое в настоящем документе. В табл. 3 n между областями является переменной количества нуклеотидов, например, от 0 до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более. В некоторых вариантах воплощения n равно 0. Любая из dgPHK, описанных в настоящем документе, может содержать n между любыми доменами.
3. Домены dgPHK.
Как описано в статье Briner 2014, dgPHK можно разработать на основе специфических функциональных доменов, в настоящем документе называемых доменами, в том числе спейсера, отвечающего за адресное воздействие, доменов нижнего стебля, расширения, верхнего стебля, связки и шпильки. В dgPHK crPHK содержит некоторые компоненты gPHK и trPHK содержит некоторые компоненты gPHK.
Области crPHK представлены в табл. 2 и на фиг. 21C. Области trPHK представлены в табл. 3 и на фиг. 21C. На фиг. 21C показана схема типичной dgPHK.
Таблица 2
Области crPHK (линейный вид, от 5' к 3')
| LS1-6 | В1-2 | US1-14 | ||||
| 5'-концевая область | Нижний стебель | η | Расширение | η | Верхний стебель | 3'-концевая область |
- 46 046927
Таблица 3
Области trPHK (линейный вид, от 5' к 3')
| US1-11 | В1-4 | LS1-6 | Ν1- 18 | Н1-1 по Н1-12 | Н2-1 по Н2-15 | |||||||
| 5'- | Верхни | η | Васширени | η | Нижний | η | Связ | η | Шпилька 1 | η | Шпилька 2 | 3' - |
| концев | й | е | стебел | ь | концевая | |||||||
| ая | стебел | ь | область | |||||||||
| облает | ь | |||||||||||
| ь |
5'-концевая область.
В некоторых вариантах воплощения dgPHK содержит нуклеотиды в 5'-концевой области crPHK и trPHK, показанные в табл. 2-3 и на фиг. 21C.
В некоторых вариантах воплощения 5'-концевая crPHK содержит спейсерную или направляющую область, обеспечивающую специфичность белка Cas по отношению к нуклеотидной последовательностимишени. В некоторых вариантах воплощения 5'-концевая область не содержит спейсерной или направляющей области. В некоторых вариантах воплощения 5'-концевая область содержит спейсер и дополнительные нуклеотиды, не обеспечивающие специфичности белка Cas по отношению к нуклеотидной области-мишени.
В некоторых вариантах воплощения направляющая область содержит первые 1-10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов в 5'-конце crPHK. В некоторых вариантах воплощения направляющая область содержит 20 нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения направляющая область может содержать 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения направляющая область может содержать 17 нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения направляющая область может содержать 18 нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения направляющая область может содержать 19 нуклеотидов.
В некоторых вариантах воплощения выбор направляющей области определяется последовательностями-мишенями в пределах генов, подлежащих редактированию. В некоторых вариантах воплощения crPHK содержит направляющую область, комплементарную последовательностям-мишеням исследуемого гена.
В некоторых вариантах воплощения последовательность-мишень исследуемого гена может быть комплементарна направляющей области crPHK. В некоторых вариантах воплощения степень комплементарности или идентичности между направляющей областью crPHK и соответствующей последовательностью-мишенью исследуемого гена может составлять приблизительно 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%. В некоторых вариантах воплощения направляющая область crPHK и областьмишень исследуемого гена могут быть на 100% комплементарны или идентичны. В других вариантах воплощения направляющая область crPHK и последовательность-мишень исследуемого гена могут содержать по меньшей мере одно несовпадение. Например, направляющая область crPHK и последовательность-мишень исследуемого гена могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 несовпадений, причем общая длина последовательности-мишени составляет по меньшей мере приблизительно 17, 18, 19, 20 или более пар оснований. В некоторых вариантах воплощения направляющая область crPHK и последовательность-мишень исследуемого гена могут содержать 1-6 несовпадений, причем направляющая последовательность содержит по меньшей мере приблизительно 17, 18, 19, 20 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения направляющая область crPHK и область-мишень исследуемого гена может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 несовпадений, причем направляющая последовательность содержит приблизительно 20 нуклеотидов.
В некоторых вариантах воплощения trPHK содержит 5'-концевую область. В некоторых вариантах воплощения trPHK содержит 5'-концевую область, которая образует, в частности, верхний стебель dgPHK. 5'-концевая область trPHK не комплементарна области гена-мишени.
Нижний стебель.
В некоторых вариантах воплощения dgPHK содержит область нижнего стебля (LS). Область нижнего стебля содержит область нижнего стебля crPHK и область нижнего стебля trPHK, ассоциированные согласно изображению на фиг. 21C. В некоторых вариантах воплощения область нижнего стебля crPHK по меньшей мере частично комплементарна области нижнего стебля trPHK. В некоторых вариантах воплощения область нижнего стебля crPHK полностью комплементарна области нижнего стебля trPHK.
В некоторых вариантах воплощения каждая из областей нижнего стебля crPHK и trPHK содержит по 6 нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения каждая из областей нижнего стебля crPHK и trPHK содержит меньшее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 2 и 3 и на фиг. 21C. В некоторых вариантах воплощения область нижнего стебля содержит большее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 2 и 3 и на фиг. 21C. Если область нижнего стебля содержит меньшее или большее количество нуклеотидов, чем показано на схемах в табл. 2 и 3 и на фиг. 21C, шаблоны модификации, как очевидно для специалиста, соблюдаются. В некоторых вариантах воплощения количество нуклеотидов в нижнем
- 47 046927 стебле crPHK отличается от количества нуклеотидов в нижнем стебле trPHK.
Расширение.
В некоторых вариантах воплощения dgPHK содержит область расширения (B). В некоторых вариантах воплощения crPHK содержит одну область расширения и trPHK содержит одну область расширения. В некоторых вариантах воплощения каждая область расширения содержит 1-4 нуклеотида. В некоторых вариантах воплощения область расширения crPHK содержит два нуклеотида, а область расширения trPHK содержит четыре нуклеотида.
В некоторых вариантах воплощения область расширения crPHK расположена между областью нижнего стебля и областью верхнего стебля crPHK. В некоторых вариантах воплощения область расширения crPHK содержит два нуклеотида. В некоторых вариантах воплощения область расширения crPHK содержит нуклеотиды B1 и B2, показанные в табл. 2 и на фиг. 21C.
В некоторых вариантах воплощения область расширения trPHK расположена между областью верхнего стебля и областью нижнего стебля trPHK. В некоторых вариантах воплощения область расширения trPHK содержит четыре нуклеотида. В некоторых вариантах воплощения область расширения trPHK содержит нуклеотиды B1-B4, показанные в табл. 3 и на фиг. 21C.
В некоторых вариантах воплощения наличие расширения приводит к образованию направленного изгиба между модулями верхнего и нижнего стебля в dgPHK. Расширение crPHK и расширение trPHK могут быть частично комплементарны. Расширение crPHK и расширение trPHK могут не обладать комплементарностью.
В некоторых вариантах воплощения области расширения crPHK и trPHK содержат большее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 2 и 3 и на фиг. 21C. Если область расширения содержит меньшее или большее количество нуклеотидов, чем показано на схеме в табл. 2 и 3 и на фиг. 21C, шаблоны модификации, как очевидно для специалиста, соблюдаются. В некоторых вариантах воплощения количество нуклеотидов в расширении crPHK отличается от количества нуклеотидов в расширении trPHK.
Верхний стебель.
В некоторых вариантах воплощения dgPHK содержит область верхнего стебля (US). Область верхнего стебля содержит область верхнего стебля crPHK и область верхнего стебля trPHK, ассоциированные согласно изображению на фиг. 21C. В некоторых вариантах воплощения область верхнего стебля crPHK по меньшей мере частично комплементарна области верхнего стебля trPHK. В некоторых вариантах воплощения область верхнего стебля crPHK полностью комплементарна области верхнего стебля trPHK.
В некоторых вариантах воплощения область верхнего стебля crPHK содержит четырнадцать нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения область верхнего стебля trPHK содержит одиннадцать нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения каждая из областей верхнего стебля crPHK и trPHK содержит меньшее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 2 и 3 и на фиг. 21C. В некоторых вариантах воплощения области верхнего стебля crPHK и trPHK содержат большее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 2 и 3 и на фиг. 21C. Если область верхнего стебля содержит меньшее или большее количество нуклеотидов, чем показано на схемах в табл. 2 и 3 и на фиг. 21C, шаблоны модификации, как очевидно для специалиста, соблюдаются.
В некоторых вариантах воплощения верхний стебель crPHK содержит нуклеотиды US1 - US14, показанные в табл. 2 и на фиг. 21C.
В некоторых вариантах воплощения верхний стебель trPHK содержит нуклеотиды US1 - US11, показанные в табл. 3 и на фиг. 21C.
Связка.
В некоторых вариантах воплощения sgPHK содержит trPHK, содержащую область связки. В некоторых вариантах воплощения область связки располагается между областью нижнего стебля и областью шпильки 1 trPHK. В некоторых вариантах воплощения связка располагается непосредственно ниже нижнего стебля trPHK. В некоторых вариантах воплощения связка содержит восемнадцать нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения область связки trPHK содержит нуклеотиды N1-N18, показанные в табл. 3 и на фиг. 21C. В некоторых вариантах воплощения область связки содержит меньшее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 3 и на фиг 21C. В некоторых вариантах воплощения область связки trPHK содержит большее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 3 и на фиг. 21C. Если область связки содержит меньшее или большее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 3 и на фиг. 21C, шаблоны модификации, как очевидно для специалиста, соблюдаются.
В некоторых вариантах воплощения область связки содержит нуклеотидные последовательности, комплементарные друг другу при просмотре в противоположных направлениях. В некоторых вариантах воплощения комплементарность нуклеотидной последовательности приводит к образованию вторичной структуры типа стебель и/или стебель-петля в sgPHK (например, некоторые нуклеотиды в области связки могут образовывать пары оснований друг с другом). В некоторых вариантах воплощения области связки могут быть не полностью комплементарны друг другу при просмотре в противоположных направлениях.
Шпилька.
В некоторых вариантах воплощения область шпильки trPHK располагается ниже области связки. В
- 48 046927 некоторых вариантах воплощения область нуклеотидов непосредственно ниже области связки называют шпилькой 1. В некоторых вариантах воплощения область нуклеотидов непосредственно ниже области шпильки 1 называют шпилькой 2. В некоторых вариантах воплощения область шпильки содержит шпильку 1 и шпильку 2. В некоторых вариантах воплощения шпилька 1 и шпилька 2 разделены одним или более нуклеотидом n. В некоторых вариантах воплощения n=1. В некоторых вариантах воплощения trPHK содержит только шпильку 1 или шпильку 2.
Показано, что замещение области шпильки 1 trPHK 2 нуклеотидами обеспечивает редактирующую активность РНП Cas (см. US20150376586, фиг. 16). В некоторых вариантах воплощения trPHK содержит заместитель шпильки 1 нуклеотидами n, причем n является целым числом между 1 и 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 и 2. В некоторых вариантах воплощения область шпильки 1 trPHK замещена 2 нуклеотидами.
В некоторых вариантах воплощения шпилька 1 trPHK содержит двенадцать нуклеотидов непосредственно ниже области связки. В некоторых вариантах воплощения область шпильки 1 trPHK содержит нуклеотиды H1-1-H1-12, показанные в табл. 3 и на фиг. 21C.
В некоторых вариантах воплощения между областями шпильки 1 и шпильки 2 trPHK присутствуют нуклеотиды, не относящиеся к шпильке. В некоторых вариантах воплощения между шпилькой 1 и шпилькой 2 находятся от одного до двух нуклеотидов, не относящихся к шпильке.
В некоторых вариантах воплощения шпилька 2 trPHK содержит пятнадцать нуклеотидов после (в направлении 3') шпильки 1. В некоторых вариантах воплощения область шпильки 2 trPHK содержит нуклеотиды H2-1-H2-15, показанные в табл. 3 и на фиг. 21C. В некоторых вариантах воплощения область шпильки 2 trPHK содержит нуклеотиды H2-1-H2-15, показанные в табл. 3, и n между шпилькой 1 и шпилькой 2 составляет 1 или 2.
В некоторых вариантах воплощения область шпильки trPHK содержит большее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 3 и на фиг. 21C. Если область шпильки содержит меньшее или большее количество нуклеотидов, чем показано в табл. 3 и на фиг. 21C, шаблоны модификации, как очевидно для специалиста, соблюдаются.
В некоторых вариантах воплощения область шпильки содержит нуклеотидные последовательности, комплементарные друг другу при просмотре в противоположных направлениях. В некоторых вариантах воплощения области шпильки могут быть не полностью комплементарны друг другу при просмотре в противоположных направлениях (например, верхняя область или петля шпильки содержит неспаренные нуклеотиды).
В некоторых вариантах воплощения trPHK содержит заместитель шпильки 1 нуклеотидами n, причем n является целым числом между 1 и 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 и 2. В некоторых вариантах воплощения область шпильки 1 trPHK замещена 2 нуклеотидами.
3'-концевая область.
В некоторых вариантах воплощения dgPHK содержит trPHK, содержащую 3'-концевую область, содержащую дополнительные нуклеотиды после (в направлении 3') области(ей) шпильки. В некоторых вариантах воплощения 3'-концевая область содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 или более нуклеотидов, не ассоциированных со вторичной структурой шпильки. В некоторых вариантах воплощения 3'-концевая область содержит 1, 2, 3 или 4 нуклеотида, не ассоциированных со вторичной структурой шпильки. В некоторых вариантах воплощения 3'-концевая область содержит 4 нуклеотида, не ассоциированных со вторичной структурой шпильки. В некоторых вариантах воплощения 3'-концевая область содержит 1, 2 или 3 нуклеотида, не ассоциированных со вторичной структурой шпильки.
4. Модификации dgPHK.
В некоторых вариантах воплощения dgPHK содержит модифицированную crPHK и немодифицированную trPHK. В некоторых вариантах воплощения dgPHK содержит немодифицированную crPHK и модифицированную trPHK. В некоторых вариантах воплощения как crPHK, так и trPHK dgPHK содержат модификации.
В некоторых вариантах воплощения gPHK, описанные в настоящем документе, находятся на двух различных молекулах РНК (двойная направляющая или dgPHK). См. табл. 2, 3 и фиг. 21C.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает dgPHK, содержащую или состоящую из a) любой из последовательностей crPHK согласно SEQ ID No: 1-187; и b) любой из последовательностей trPHK, описанных в SEQ ID No: 188-227.
В некоторых вариантах воплощения предложена dgPHK, содержащая любую одну из модифицированных последовательностей crPHK 1-187.
В некоторых вариантах воплощения предложена dgPHK, содержащая любую одну из модифицированных последовательностей trPHK 188-227.
В некоторых вариантах воплощения предложена dgPHK, содержащая любую одну из модифицированных последовательностей crPHK согласно SEQ ID No: 19-31, 53-73 и 104-130. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает dgPHK, содержащую любую одну из модифицированных последовательностей согласно SEQ ID No: 19-31, 53-73 и 104-130, причем crPHK дополнительно содержит 5'-спейсерную последовательность, по меньшей мере частично комплементарную последовательно
- 49 046927 сти-мишени, обеспечивающую специфичность Cas9 по отношению к гидролизуемой мишени.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает crPHK, содержащую любую одну из последовательностей, описанных в SEQ ID No: 1-187. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает crPHK, содержащую или состоящую из любой одной из последовательностей, описанных в SEQ ID No: 19-31, 53-73 и 104-130. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает crPHK, содержащую любую одну из последовательностей, описанных в SEQ ID No: 19-31, 53-73 и 104-130, и спейсерную область.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает trPHK, содержащую или состоящую из любой одной из последовательностей, описанных в SEQ ID No: 188-277.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает crPHK, содержащую нуклеотиды, обладающие по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% идентичностью по отношению к нуклеотидам любой из SEQ ID No: 1-187, в которой шаблон модификации идентичен шаблону модификации, представленному в эталонном идентификаторе последовательности. Т.е. нуклеотиды A, U, C и G могут различаться на 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% по сравнению с нуклеотидами, показанными в последовательностях, однако модификации остаются неизменными.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает trPHK, содержащую нуклеотиды, обладающие по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% идентичностью по отношению к нуклеотидам согласно любой одной из SEQ ID No: 188-277, в которой шаблон модификации идентичен шаблону модификации, представленному в эталонном идентификаторе последовательности. Т.е. нуклеотиды A, U, C и G могут различаться на 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% по сравнению с нуклеотидами, показанными в последовательностях, однако модификации каждого нуклеотида остаются неизменными.
5. crPHK, trPHK и dgPHK с модификациями.
В некоторых вариантах воплощения crPHK содержит один или более из модифицированных нуклеотидов в пределах одного или более из доменов 5'-концевой области, нижнего стебля, расширения, верхнего стебля и 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-O-Me.
В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-F.
В некоторых вариантах воплощения модификация включает фосфоротиоатную (PS) связь, соединяющую один или более из нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения модификация является тремя PS связями соединяющими первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и тремя PS связями, соединяющими последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения модификация включает инвертированный нуклеотид без основания.
В некоторых вариантах воплощения предложена crPHK, содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в каждом нуклеотиде в верхнем стебле. В некоторых вариантах воплощения каждый из нуклеотидов US-1-US-14 crPHK модифицирован 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения LS1 и LS6 crPHK модифицированы 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения LS5 crPHK модифицирован 2'-OMe.
В некоторых вариантах воплощения предложена crPHK, содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в каждом нуклеотиде в верхнем стебле и LS1 и LS6 в нижнем стебле. В некоторых вариантах воплощения crPHK дополнительно содержит один или более из 2'-O-Me или 2'-O-moe модифицированных нуклеотидов в 5'- и/или 3'-концевой области, например, в виде 5'- и/или 3'-концевой модификации.
В некоторых вариантах воплощения предложена crPHK, содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в каждом нуклеотиде в верхнем стебле, LS1, LS5 и LS6 в нижнем стебле. В некоторых вариантах воплощения crPHK дополнительно содержит один или более из 2'-O-Me или 2'-O-moe модифицированных нуклеотидов в 5'- и/или 3'-концевой области, например, в виде 5'- и/или 3'-концевой модификации.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает crPHK, содержащую 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS1, LS2 и LS6 в нижнем стебле. В некоторых вариантах воплощения crPHK дополнительно содержит 2'-F модифицированные нуклеотиды в каждом из положений B1 и B2 в области расширения. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает crPHK, содержащую 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS1, LS2 и LS6 в нижнем стебле и каждом из положений B1 и B2 в области расширения. В некоторых вариантах воплощения crPHK дополнительно содержит один или более из 2'-O-Me или 2'-O-moe модифицированных нуклеотидов в 5'- и/или 3'-концевой области, например, в виде 5'- и/или 3'-концевой модификации.
В некоторых вариантах воплощения crPHK содержит 2'-О-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS1 и LS6 в области нижнего стебля; каждом из нуклеотидов в области расширения; и каждом из нуклеотидов в области верхнего стебля. В некоторых вариантах воплощения нуклеотид LS5 crPHK также модифицирован 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения LS2, LS3 и LS4 crPHK не являются модифицированными. В некоторых вариантах воплощения crPHK дополнительно содержит
- 50 046927 один или более из 2'-O-Me или 2'-O-moe модифицированных нуклеотидов в 5'- и/или З'-концевой области, например, в виде 5'- и/или 3'-концевой модификации.
В некоторых вариантах воплощения crPHK содержит 2'-фтор (2'-F) модифицированные нуклеотиды в положениях LS1, LS2, и LS6 в области нижнего стебля и каждом из нуклеотидов в области расширения. В некоторых вариантах воплощения crPHK содержит 2'-фтор (2'-F) модифицированные нуклеотиды в положениях LS1, LS2 и LS6 в области нижнего стебля и положениях B2 и B2 в области расширения. В некоторых вариантах воплощения crPHK содержит 2'-фтор (2'-F) модифицированные нуклеотиды в положениях LS1- LS6 в области нижнего стебля и каждом из нуклеотидов в области расширения. В некоторых вариантах воплощения crPHK дополнительно содержит один или более из 2'-O-Me или 2'-O-moe модифицированных нуклеотидов в 5'- и/или 3'-концевой области, например, в виде 5'- и/или 3'-концевой модификации.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает trPHK, содержащую один или более из модифицированных нуклеотидов в одной или более из следующих областей: 5'-концевой области, области верхнего стебля; области расширения; области нижнего стебля; области связки; области шпильки 1; промежуточной области между областями шпильки 1 и шпильки 2; области шпильки 2; и 3'концевой области.
В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-O-Me.
В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-F.
В некоторых вариантах воплощения модификация включает a фосфоротиоатную (PS) связь, соединяющую один или более из нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения модификация является тремя PS связями, соединяющими первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и тремя PS связями, соединяющими последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения модификация включает инвертированный нуклеотид без основания.
В некоторых вариантах воплощения trPHK содержит 2'-О-Me модифицированные нуклеотиды в каждом положении в верхнем стебле; в положениях B1 и B2 в области расширения; в положениях LS1 и LS2 в области нижнего стебля; в положениях N3, N4, N5, N15, N16, N17 и N18 в области связки; в каждом положении в области шпильки 1; в одном нуклеотиде между областями шпильки 1 и шпильки 2; и в каждом положении в области шпильки 2. В некоторых вариантах воплощения trPHK дополнительно содержит один или более из 2'-O-Me или 2'-O-moe модифицированных нуклеотидов в 5'- и/или 3'-концевой области, например, в виде 5'- и/или 3'-концевой модификации.
В некоторых вариантах воплощения trPHK содержит 2'-О-Me модифицированные нуклеотиды в каждом положении в верхнем стебле; в каждом положении в области расширения; в положениях LS1, LS2, LS5 и LS6 в области нижнего стебля; в положениях N3-N5, N10-N18 в области связки; в каждом положении в области шпильки 1; в одном нуклеотиде между областями шпильки 1 и шпильки 2; и в каждом положении в области шпильки 2. В некоторых вариантах воплощения crPHK дополнительно содержит один или более из 2'-O-Me или 2'-O-moe модифицированных нуклеотидов в 5'- и/или 3'-концевой области, например, в виде 5'- и/или 3'-концевой модификации.
В некоторых вариантах воплощения trPHK содержит 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях N15 - N18 в области связки. В некоторых вариантах воплощения trPHK дополнительно содержит один или более из 2'-F модифицированных нуклеотидов в 5'- и/или 3'-концевой области, например, в виде 5'- и/или 3'-концевой модификации.
В некоторых вариантах воплощения trPHK содержит 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS4 и LS5 в области нижнего стебля и положениях N13-N18 в области связки. В некоторых вариантах воплощения trPHK дополнительно содержит один или более из 2'-F модифицированных нуклеотидов в 5'- и/или 3'-концевой области, например, в виде 5'- и/или 3'-концевой модификации.
В некоторых вариантах воплощения trPHK содержит 2'-F модифицированные нуклеотиды в положениях LS1, LS3 и LS5 в нижнем стебле и 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях LS2, LS4 и LS6 в нижнем стебле.
В настоящем документе в некоторых вариантах воплощения описана crispr РНК (crPHK), содержащая одну или более из модификаций в пределах одной или более из следующих областей: первых пяти нуклеотидов в 5'-концевой области; области нижнего стебля; области расширения; области верхнего стебля; и последних пяти нуклеотидов в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-O-метил (2'-O-Me) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения модификация включает фосфоротиоатную (PS) связь между нуклеотидами. В некоторых вариантах воплощения первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'концевой области являются модифицированными. В некоторых вариантах воплощения первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены фосфоротиоатными (PS) связями. В некоторых вариантах воплощения модификация содержит 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-F. В некоторых вариантах воплощения первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области со
- 51 046927 единены PS связью, причем первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в З'-концевой области содержат 2'-O-Me модификации. В некоторых вариантах воплощения первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены PS связью, причем первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'-концевой области содержат 2'-F модификации. В некоторых вариантах воплощения LS1 и LS6 модифицированы 2'O-Me. В некоторых вариантах воплощения каждый из нуклеотидов в области верхнего стебля модифицирован 2'-O-Me.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает crispr РНК (crPHK), содержащую следующие 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды: LS1 и LS6 в области нижнего стебля; и каждый нуклеотид в области верхнего стебля. В некоторых вариантах воплощения crPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения crPHK дополнительно содержит 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области и 2'-O-Me или 2'-Е-модифицированные нуклеотиды в последних трех положениях в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения LS1, LS2 и LS6 модифицированы 2'-F. В некоторых вариантах воплощения каждый из нуклеотидов в области расширения модифицирован 2'-F.
В настоящем документе в некоторых вариантах воплощения описана crispr РНК (crPHK), содержащая 2'-F модифицированные нуклеотиды в следующих положениях: LS1, LS2, и LS6 в области нижнего стебля; и каждом положении в области расширения. В некоторых вариантах воплощения crPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения crPHK дополнительно содержит 2'-О-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области и 2'-O-Me или 2'-Е-модифицированные нуклеотиды в последних трех положениях в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена crPHK, содержащая нуклеиновые кислоты согласно любой одной из SEQ ID No: 1-187. В некоторых вариантах воплощения предложена crPHK, содержащая нуклеиновые кислоты согласно любой из SEQ ID No: 19-31, 53-73, 104-130 и 161-187. В некоторых вариантах воплощения предложена crPHK, содержащая нуклеиновые кислоты, обладающие по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% идентичностью по отношению к нуклеиновым кислотам согласно любой из SEQ ID No: 19-31, 53-73, 104-130 и 161-187, в которой шаблон модификации идентичен шаблону модификации, представленному в эталонном идентификаторе последовательности. В некоторых вариантах воплощения crPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Кроме того, настоящее изобретение включает tracr РНК (trPHK), содержащую одну или более из модификаций в одной или более из следующих областей: первых пяти нуклеотидах в 5'-концевой области; области верхнего стебля; области расширения; области нижнего стебля; области связки; области шпильки 1; области шпильки 2; и последних пяти нуклеотидов в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-O-метил (2'-O-Me) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах воплощения модификация включает фосфоротиоатную (PS) связь между нуклеотидами. В некоторых вариантах воплощения первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены фосфоротиоатными (PS) связями. В некоторых вариантах воплощения первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'концевой области являются модифицированными. В некоторых вариантах воплощения модификация содержит 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-F. В некоторых вариантах воплощения первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'концевой области соединены PS связью, причем первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'-концевой области содержат 2'-O-Me модификации. В некоторых вариантах воплощения первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'концевой области соединены PS связью, причем первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'-концевой области содержат 2'-F модификации. В некоторых вариантах воплощения каждый нуклеотид в области верхнего стебля модифицирован 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения B1 и B2 в области расширения модифицированы 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения N3, N4, N5, N15, N16, N17 и N18 в области связки модифицированы 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения каждый нуклеотид в области шпильки 1 модифицирован 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения каждый нуклеотид в области шпильки 2 модифицирован 2'-O-Me.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает tracr РНК (trPHK), содержащую 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в следующих положениях: каждом положении в верхнем стебле; положениях B1 и B2 в области расширения; положениях N3, N4, N5, N15, N16, N17 и N18 в области связки; каждом положении в области шпильки 1; и каждом положении в области шпильки 2. В не
- 52 046927 которых вариантах воплощения trPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения trPHK дополнительно содержит 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области и 2'-О-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в последних трех положениях в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения N15, N16, N17 и N18 модифицированы 2'-F. В некоторых вариантах воплощения LS1, LS3 и LS5 модифицированы 2'-F, a LS2, LS4 и LS6 модифицированы 2'-O-Me. В некоторых вариантах воплощения trPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения trPHK дополнительно содержит 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области и 2'-О-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в последних трех положениях в 3'-концевой области.
В некоторых вариантах воплощения предложена trPHK, содержащая нуклеиновые кислоты согласно любой из SEQ ID No: 188-227. В некоторых вариантах воплощения предложена trPHK, содержащая нуклеиновые кислоты, обладающие по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% идентичностью по отношению к нуклеиновым кислотам согласно любой из SEQ ID No: 188-227, в которой шаблон модификации идентичен шаблону модификации, представленному в эталонном идентификаторе последовательности. В некоторых вариантах воплощения trPHK дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
В некоторых случаях предложена двойная направляющая РНК, содержащая crPHK и trPHK, в которой crPHK содержит нуклеиновые кислоты согласно любой из SEQ ID No: 1-187, a trPHK содержит нуклеиновые кислоты согласно любой из SEQ ID No: 188-227.
Настоящее изобретение включает двойную направляющую РНК, содержащую crPHK, описанную в настоящем документе, и trRNA, описанную в настоящем документе, как и двойная направляющая РНК, содержащая crPHK, описанную в настоящем документе, и немодифицированную trPHK. В некоторых вариантах воплощения предложена двойная направляющая РНК, содержащая немодифицированную crPHK и модифицированную trPHK, описанную в настоящем документе.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает все следующие компоненты.
Вариант воплощения 55. Crispr РНК (crPHK), содержащая одну или более из модификаций в одной или более из следующих областей:
первых пяти нуклеотидах в 5'-концевой области;
области нижнего стебля;
области расширения;
области верхнего стебля; и последних пяти нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 56. crPHK согласно варианту воплощения 55, в которой модификация включает 2'-O-метил (2'-O-Me) модифицированный нуклеотид.
Вариант воплощения 57. crPHK согласно варианту воплощения 55, в которой модификация включает 2'-фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид.
Вариант воплощения 58. crPHK согласно варианту воплощения 55, в которой модификация включает фосфоротиоатную (PS) связь между нуклеотидами.
Вариант воплощения 59. crPHK согласно любому из вариантов воплощения 55-58, в которой первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'-концевой области являются модифицированными.
Вариант воплощения 60. crPHK согласно любому из вариантов воплощения 55-58, в которой первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены фосфоротиоатными (PS) связями.
Вариант воплощения 61. crPHK согласно варианту воплощения 59, в которой модификация включает 2'-O-Me.
Вариант воплощения 62. crPHK согласно варианту воплощения 59, в которой модификация включает 2'-F.
Вариант воплощения 63. crPHK согласно любому из вариантов воплощения 55-62, в которой первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены PS связью, и в которой первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'-концевой области содержат 2'-O-Me модификации.
Вариант воплощения 64. crPHK согласно любому из вариантов воплощения 55-62, в которой первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены PS связью, и в которой первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'-концевой области содержат 2'-F модификации.
Вариант воплощения 65. crPHK согласно любому из вариантов воплощения 55-60, в которой LS1 и
- 53 046927
LS6 модифицированы 2'-O-Me.
Вариант воплощения 66. crPHK согласно любому из вариантов воплощения 55-60 и 65, в которой каждый из нуклеотидов в области верхнего стебля модифицирован 2'-O-Me.
Вариант воплощения 67. Crispr РНК (crPHK), содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях:
LS1 и LS6 в области нижнего стебля; и каждом нуклеотиде в области верхнего стебля.
Вариант воплощения 68. crPHK согласно варианту воплощения 67, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 69. crPHK согласно варианту воплощения 67 или 68, дополнительно содержащая 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах в 5'-концевой области, и 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в последних трех нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 70. crPHK согласно любому из вариантов воплощения 55-60, в которой LS1, LS2 и LS6 модифицированы 2'-F.
Вариант воплощения 71. crPHK согласно любому из вариантов воплощения 55-60 и 70, в которой каждый нуклеотид в области расширения модифицирован 2'-F.
Вариант воплощения 72. Crispr РНК (crPHK), содержащая 2'-F модифицированные нуклеотиды в:
положениях LS1, LS2 и LS6 в области нижнего стебля; и каждом нуклеотиде в области расширения.
Вариант воплощения 73. crPHK согласно любому из вариантов воплощения 70-72, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 74. crPHK согласно варианту воплощения 72 или 73, дополнительно содержащая 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах в 5'-концевой области, и 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в последних трех нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 75. crPHK, содержащая нуклеиновые кислоты согласно любой из SEQ ID No: 1-187.
Вариант воплощения 76. crPHK, содержащая нуклеиновые кислоты согласно любой из SEQ ID No: 19-31, 53-73, 104-130, и 161-187.
Вариант воплощения 77. crPHK, содержащая нуклеиновые кислоты, обладающие по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% идентичностью по отношению к нуклеиновым кислотам согласно любой одной из SEQ ID No: 19-31, 53-73, 104-130 и 161-187, в которой шаблон модификации идентичен шаблону модификации, представленному в эталонном идентификаторе последовательности.
Вариант воплощения 78. crPHK согласно любому из вариантов воплощения 75-77, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 79. Tracr РНК (trPHK), содержащая одну или более из модификаций в одной или более из следующих областей:
первых пяти нуклеотидах в 5'-концевой области;
области верхнего стебля;
области расширения;
области нижнего стебля;
области связки;
области шпильки 1;
области шпильки 2; и последних пяти нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 80. trPHK согласно варианту воплощения 79, в которой модификация включает 2'-O-метил (2'-O-Me) модифицированный нуклеотид.
Вариант воплощения 81. trPHK согласно варианту воплощения 79, в которой модификация включает 2'-фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид.
Вариант воплощения 82. trPHK согласно варианту воплощения 79, в которой модификация включает фосфоротиоатную (PS) связь между нуклеотидами.
Вариант воплощения 83. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-82, в которой первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены фосфоротиоатными (PS) связями.
Вариант воплощения 84. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-82, в которой первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'-концевой области являются модифицированными.
- 54 046927
Вариант воплощения 85. trPHK согласно варианту воплощения 84, в которой модификация включает 2'-O-Me.
Вариант воплощения 86. trPHK согласно варианту воплощения 84, в которой модификация включает 2'-F.
Вариант воплощения 87. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-86, в которой первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены PS связью, и первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'концевой области содержат 2'-O-Me модификации.
Вариант воплощения 88. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-86, в которой первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены PS связью, и первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'концевой области содержат 2'-F модификации.
Вариант воплощения 89. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-84, в которой каждый нуклеотид в области верхнего стебля модифицирован 2'-O-Me.
Вариант воплощения 90. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-84 и 89, в которой B1 и B2 в области расширения модифицированы 2'-O-Me.
Вариант воплощения 91. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-84 и 89-90, в которой N3, N4, N5, N15, N16, N17 и N18 в области связки модифицированы 2'-O-Me.
Вариант воплощения 92. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-84 и 89-91, в которой каждый нуклеотид в области шпильки 1 модифицирован 2'-O-Me.
Вариант воплощения 93. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-84 и 89-92, в которой каждый нуклеотид в области шпильки 2 модифицирован 2'-O-Me.
Вариант воплощения 94. Tracr РНК (trPHK), содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в:
каждом нуклеотиде в верхнем стебле;
B1 и B2 в области расширения;
N3, N4, N5, N15, N16, N17 и N18 в области связки;
каждом нуклеотиде в области шпильки 1; и каждом нуклеотиде в области шпильки 2.
Вариант воплощения 95. trPHK согласно варианту воплощения 94, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 96. crPHK согласно варианту воплощения 94 или 95, дополнительно содержащая 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области, и 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в последних трех положениях в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 97. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-84, в которой N15, N16, N17 и N18 модифицированы 2'-F.
Вариант воплощения 98. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-84 и 97, в которой LS1, LS3 и LS5 модифицированы 2'-F, a LS2, LS4 и LS6 модифицированы 2'-O-Me.
Вариант воплощения 99. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 87-98, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 100. trPHK согласно варианту воплощения 98 или 99, дополнительно содержащая 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в первых трех положениях в 5'-концевой области, и 2'-O-Me или 2'-F модифицированные нуклеотиды в последних трех нуклеотидах в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 101. trPHK, содержащая нуклеиновые кислоты согласно любой одной из SEQ ID No: 188-227.
Вариант воплощения 102. trPHK, содержащая нуклеиновые кислоты, обладающие по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 или 70% идентичностью по отношению к нуклеиновым кислотам согласно любой одной из SEQ ID No: 188-227, в которой шаблон модификации идентичен шаблону модификации, представленному в эталонном идентификаторе последовательности.
Вариант воплощения 103. trPHK согласно любому из вариантов воплощения 101-102, дополнительно содержащая три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области, и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области.
Вариант воплощения 104. Двойная направляющая РНК, содержащая crPHK и trPHK, в которой crPHK содержит нуклеотиды согласно любой одной из SEQ ID No: 1-187, a trPHK содержит нуклеиновые кислоты согласно любой одной из SEQ ID No: 188-227.
Вариант воплощения 105. Двойная направляющая РНК, содержащая crPHK согласно любому из вариантов воплощения 55-7 8 и trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-103.
Вариант воплощения 106. Двойная направляющая РНК, содержащая crPHK согласно любому из ва
- 55 046927 риантов воплощения 55-7 8 и немодифицированную trPHK.
Вариант воплощения 107. Двойная направляющая РНК, содержащая немодифицированную crPHK и trPHK согласно любому из вариантов воплощения 79-103.
Модификации концевых нуклеотидов.
В некоторых вариантах воплощения 5' или 3'-концевые нуклеотиды любой из направляющих РНК, описанных в настоящем документе, являются модифицированными.
В некоторых вариантах воплощения концевые (т.е. последние) 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеотидов в 3'концевой области направляющей РНК, включая, например, sgPHK, dgPHK, crPHK, trPHK, или как crPHK, так и trPHK, являются модифицированными.
В некоторых вариантах воплощения концевые (т.е. последние) 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеотидов в 3'концевой области направляющей РНК содержат более одной модификации.
В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере один из концевых (т.е. последних) 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеотидов в 3'-концевой области является модифицированным.
В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере два из концевых (т.е. последних) 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеотидов в 3'-концевой области являются модифицированными.
В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере три из концевых (т.е. последних) 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеотидов в 3'-концевой области являются модифицированными.
В некоторых вариантах воплощения модификация включает PS соединение.
В некоторых вариантах воплощения 5'-конец 5'-концевой области является модифицированным, например, первые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеотидов sgPHK, dgPHK, crPHK, trPHK или как crPHK, так и trPHK являются модифицированными.
В некоторых вариантах воплощения первые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеотидов в 3'-концевой области направляющей РНК содержат более одной модификации. В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере один из концевых (т.е. первых) 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеотидов на 5'-конце являются модифицированными.
В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере два из концевых 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеотидов на 5'-конце являются модифицированными. В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере три из концевых 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеотидов на 5'-конце являются модифицированными.
В некоторых вариантах воплощения модификация включает PS соединение.
В некоторых вариантах воплощения как 5'-, так и 3'-концевые области (например, концы) направляющей РНК, например, sgPHK, dgPHK, crPHK, trPHK или как crPHK, так и trPHK являются модифицированными. В некоторых вариантах воплощения только 5'-концевая область направляющей РНК, например, sgPHK, dgPHK, crPHK, trPHK или как crPHK, так и trPHK является модифицированной.
В некоторых вариантах воплощения только 3'-концевая область направляющей РНК, например, sgPHK, dgPHK, crPHK, trPHK или как crPHK, так и trPHK является модифицированной.
В некоторых вариантах воплощения gPHK содержит модификации в 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 из первых 7 нуклеотидов на 5'-конце gPHK. В некоторых вариантах воплощения gPHK содержит модификации в 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 из 7 концевых нуклеотидов на 3'-конце.
В некоторых вариантах воплощения 2, 3 или 4 из первых 4 нуклеотидов на 5'-конце и/или 2, 3 или 4 из концевых 4 нуклеотидов на 3'-конце являются модифицированными.
В некоторых вариантах воплощения 2, 3 или 4 из первых 4 нуклеотидов на 5'-конце соединены фосфоротиоатными (PS) связями.
В некоторых вариантах воплощения модификация в 5'-концевой области и/или 3'-концевой области содержит 2'-O-метил (2'-O-Me) или 2'-O-(2-метоксиэтил) (2'-O-moe) модификацию нуклеотида. В некоторых вариантах воплощения модификация включает 2'-фтор (2'-F) модификацию нуклеотида. В некоторых вариантах воплощения модификация включает фосфоротиоатное (PS) соединение между нуклеотидами. В некоторых вариантах воплощения модификация включает инвертированный нуклеотид без основания. В некоторых вариантах воплощения модификация включает более чем одну модификацию, выбранную из 2'-O-Me, 2'-O-moe, 2'-фтор (2'-F), фосфоротиоатной (PS) связи между нуклеотидами и инвертированного нуклеотида без основания. Некоторые варианты воплощения включают эквивалентную модификацию.
В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК, например, sgPHK, dgPHK, crPHK, trPHK или как crPHK, так и trPHK содержит одно или более из фосфоротиоатных (PS) соединений между первыми одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или семью нуклеотидами в 5'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК, например, sgPHK, dgPHK, crPHK, trPHK или как crPHK, так и trPHK содержит одно или более из PS соединений между последними одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или семью нуклеотидами в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК, например, sgPHK, dgPHK, crPHK, trPHK или как crPHK, так и trPHK содержит одно или более из PS соединений между последними одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или семью нуклеотидами как в 5'-концевой, так и в 3'-концевой области. В некоторых вариантах воплощения в дополнение к PS связям 5'- и 3'-концевые нуклеотиды могут содержать 2'-O-Me, 2'-O-moe или 2'-F модифицированные нуклеотиды.
- 56 046927
В некоторых вариантах воплощения направляющая РНК, например, sgPHK, dgPHK, crPHK, trPHK или как crPHK, так и trPHK содержит модифицированные нуклеотиды в 5'- и 3'-концевой области и модифицированные нуклеотиды в одной или более из других областей, описанных в табл. 1-3 и на фиг. 21A или 21C.
В некоторых вариантах воплощения crPHK, trPHK или как crPHK, так и trPHK содержит модифицированные нуклеотиды, не находящиеся на 5'- или 3'-концах. Конкретные шаблоны модификации описаны ниже и в табл. 4.
3. Доставка gPHK и белка Cas.
В некоторых вариантах воплощения в дополнение к по меньшей мере одной gPHK в настоящем документе предложены композиции, дополнительно содержащие нуклеазу. В некоторых вариантах воплощения нуклеаза является белком Cas. В некоторых вариантах воплощения gPHK совместно с белком Cas называют РНП Cas. В некоторых вариантах воплощения белок Cas получен из системы CRISPR/Cas II типа. В некоторых вариантах воплощения белок Cas является Cas9. В некоторых вариантах воплощения белок Cas9 является Cas9 дикого типа. В некоторых вариантах воплощения белок Cas9 получен из белка Cas9 Streptococcus pyogenes, например, Cas9 S. pyogenes. В некоторых вариантах воплощения белок Cas9 получен не из S. pyogenes, однако функционирует аналогично Cas9 S. pyogenes, например, gPHK, специфичная по отношению к Cas9 S. pyogenes, может обеспечивать специфичность Cas9, полученного не из S. pyogenes, по отношению к ее сайту-мишени. В некоторых вариантах воплощения Cas индуцирует двуцепочечный разрыв в ДНК-мишени. Варианты воплощения, описанные в настоящем документе, включают эквиваленты белка Cas9 S. pyogenes.
Cas9 охватывает его модифицированные формы и варианты. Модифицированные версии Cas9, содержащие один неактивный каталитический домен (RuvC или HNH), называют никазами. Никазы разрезают только одну цепь ДНК-мишени, таким образом создавая одноцепочечный разрыв. Одноцепочечный разрыв также может быть известен под названием ник. В некоторых вариантах воплощения композиции и способы включают никазы. В некоторых вариантах воплощения композиции и способы включают никазу Cas9, индуцирующую ник, а не двуцепочечный разрыв в ДНК-мишени.
В некоторых вариантах воплощения белок Cas может быть модифицирован и содержать только один функциональный нуклеазный домен. Например, белок Cas можно модифицировать так, что один из нуклеазных доменов мутируют или полностью или частично удаляют с целью снижения его активности по гидролизу нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах воплощения применяют никазу Cas, содержащую домен RuvC с пониженной активностью. В некоторых вариантах воплощения применяют никазу Cas, содержащую неактивный домен RuvC. В некоторых вариантах воплощения применяют никазу Cas, содержащую домен HNH с пониженной активностью. В некоторых вариантах воплощения применяют никазу Cas, содержащую неактивный домен HNH.
В некоторых вариантах воплощения консервативную аминокислоту в нуклеазном домене белка Cas заменяют с целью снижения или модификации нуклеазной активности. В некоторых вариантах воплощения белок Cas может содержать аминокислотный заместитель в RuvC или RuvC-подобном нуклеазном домене. Типичные аминокислотные заместители в RuvC или RuvC-подобном нуклеазном домене включают D10A (на основе белка Cas9 S. pyogenes). В некоторых вариантах воплощения белок Cas может содержать аминокислотный заместитель в HNH или HNH-подобном нуклеазном домене. Типичные аминокислотные заместители в HNH или HNH-подобном нуклеазном домене включают E762A, H840A, N863A, H983A и D986A (на основе белка Cas9 S. pyogenes).
В некоторых вариантах воплощения комплекс РНК, описанный в настоящем документе, содержит никазу и пару направляющих РНК, комплементарных смысловой и антисмысловой цепям последовательности-мишени, соответственно. В данном варианте воплощения направляющие РНК обеспечивают специфичность никазы по отношению к последовательности-мишени и внедрение двуцепочечного разрыва (DSB) путем получения ника на противоположных цепях последовательности-мишени (т.е. получения двойного ника). В некоторых вариантах воплощения использование двойного ника может улучшить специфичность и снизить неспецифические эффекты. В некоторых вариантах воплощения никазу Cas применяют совместно с двумя отдельными направляющими РНК, оказывающими адресное воздействие на противоположные цепи ДНК с получением двойного ника в ДНК-мишени. В некоторых вариантах воплощения никазу Cas применяют совместно с двумя отдельными направляющими РНК, выбранными на основании их близкого расположения, позволяющего получить двойной ник в ДНК-мишени.
В некоторых вариантах воплощения применяют химерные белки Cas, в которых один домен или область белка замещают фрагментом другого белка. В некоторых вариантах воплощения нуклеазный домен Cas можно заместить доменом другой нуклеазы, например, Fok1. В некоторых вариантах воплощения белок Cas может быть модифицированной нуклеазой.
В некоторых вариантах воплощения белок Cas содержит гибридный белок, содержащий каталитически неактивный Cas9, присоединенный к гетерологичному функциональному домену (см., например, WO2014152432). В некоторых вариантах воплощения каталитически неактивный Cas9 получают из S. pyogenes. В некоторых вариантах воплощения каталитически неактивный Cas9 содержит мутации, инактивирующие Cas9. В некоторых вариантах воплощения гетерологичный функциональный домен являет
- 57 046927 ся доменом, модифицирующим экспрессию гена, гистоны или ДНК. В некоторых вариантах воплощения гетерологичный функциональный домен является доменом активации транскрипции или доменом репрессии транскрипции.
PAM.
В некоторых вариантах воплощения последовательность-мишень может располагаться рядом с PAM. В некоторых вариантах воплощения PAM может располагаться рядом с последовательностьюмишенью или в пределах 1, 2, 3 или 4 нуклеотидов от ее 3'-конца. Длина и последовательность PAM может зависеть от используемого белка Cas. Например, PAM можно выбрать из консенсусной или частной последовательности PAM конкретного белка Cas9 или ортолога Cas9, в том числе последовательностей, описанных на фиг. 1 статьи Ran et al., Nature 520:186-191 (2015), включенной в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах воплощения длина PAM может составлять 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов. Неограничивающие типичные последовательности PAM включают NGG, NAG, NGA, NGAG, NGCG, NNGRRT, TTN, NGGNG, NG, NAAAAN, NNAAAAW, NNNNACA, GNNNCNNA и NNNNGATT (где N обозначает любой нуклеотид, W обозначает A или T, a R обозначает A или G). В некоторых вариантах воплощения последовательность PAM может быть NGG. В некоторых вариантах воплощения последовательность PAM может быть NGGNG. В некоторых вариантах воплощения последовательность PAM может быть NNAAAAW.
Доставка модифицированной gPHK.
Липидные наночастицы (LNP) являются хорошо известными средствами доставки груза нуклеотидов и белка, которые можно применять для доставки gPHK, мРНК, Cas9 и РНП, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах воплощения LNP используют для доставки нуклеиновой кислоты, белка или нуклеиновой кислоты вместе с белком.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает способ доставки любой из gPHK, описанных в настоящем документе, в организм субъекта, причем gPHK ассоциирована с LNP. В некоторых вариантах воплощения gPHK/LNP также ассоциирован с Cas9 или мРНК, кодирующей Cas9.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает композицию, содержащую любую одну из описанных gPHK и LNP. В некоторых вариантах воплощения композиция дополнительно содержит Cas9 или мРНК, кодирующую Cas9.
В некоторых вариантах воплощения LNP содержат катионные липиды. В некоторых вариантах воплощения LNP содержат (92122)-3-((4,4-бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси)метил)пропилоктадека-9,12-диеноат, также называемый 3-(4,4бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3-(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси)метил)пропил-(92,122)октадека-9,12-диеноатом). В некоторых вариантах воплощения LNP содержат молярные соотношения амина катионного липида и фосфата РНК (N:P), составляющие приблизительно 4,5.
В некоторых вариантах воплощения LNP, ассоциированные с gPHK, описанной в настоящем документе, предназначены для применения при получении медикамента для лечения заболевания или расстройства.
Электропорация является хорошо известным средством доставки груза, и любую методологию электропорации можно применять для доставки любой из gPHK, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах воплощения электропорацию можно применять для доставки любой одной из gPHK, описанных в настоящем документе, и Cas9 или мРНК, кодирующей Cas9.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает способ доставки любой одной из gPHK, описанных в настоящем документе, в клетку ex vivo, причем gPHK ассоциирована с LNP или не ассоциирована с LNP. В некоторых вариантах воплощения gPHK/LNP или gPHK также ассоциирована с Cas9 или мРНК, кодирующей Cas9.
4. Способы модуляции генов.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает фармацевтический состав, содержащий любую из gPHK, описанных в настоящем документе, вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает фармацевтический состав, содержащий любую одну из gPHK, описанных в настоящем документе, и LNP вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает фармацевтический состав, содержащий любую одну из gPHK, описанных в настоящем документе, белок Cas9 или мРНК, кодирующую белок Cas9, и LNP вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых вариантах воплощения фармацевтический состав предназначен для применения при получении медикамента для лечения заболевания или расстройства. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает способ лечения пациента-человека, включающий введение любой из gPHK или фармацевтических составов, описанных в настоящем документе.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает способ или применение, модифицирующие ДНК-мишень, включающие введение или доставку белка Cas или мРНК Cas и одной или более gPHK, описанных в настоящем документе.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает способ или применение для модуляции гена-мишени, включающие введение или доставку белка Cas или мРНК Cas и любой одной
- 58 046927 или более из gPHK, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах воплощения модуляция является редактированием гена-мишени. В некоторых вариантах воплощения модуляция является изменением экспрессии белка, кодируемого геном-мишенью.
В некоторых вариантах воплощения способ или применение приводят к редактированию гена. В некоторых вариантах воплощения способ или применение приводят к образованию двуцепочечного разрыва в гене-мишени. В некоторых вариантах воплощения способ или применения приводит к образованию инсерционно-делеционной мутации во время негомологичного соединения концов DSB. В некоторых вариантах воплощения способ или применение приводят к инсерции или делеции нуклеотидов в гене-мишени. В некоторых вариантах воплощения инсерция или делеция нуклеотидов в гене-мишени приводит к мутации сдвига рамки считывания или появлению преждевременного стоп-кодона, что приводит к получению нефункционального белка. В некоторых вариантах воплощения инсерция или делеция нуклеотидов в гене-мишени приводит к нокдауну или устранению экспрессии гена-мишени. В некоторых вариантах воплощения способ или применение включает гомологичную специфическую репарацию DSB. В некоторых вариантах воплощения способ или применение дополнительно включает доставку матрицы в клетку, причем по меньшей мере часть матрицы включается в ДНК-мишень в сайте двуцепочечного разрыва, индуцируемого белком Cas, или рядом с ним.
В некоторых вариантах воплощения способ или применение приводит к модуляции гена. В некоторых вариантах воплощения модуляция гена является усилением или ослаблением экспрессии гена, изменением состояния метилирования ДНК или модификацией субъединицы гистона. В некоторых вариантах воплощения способ или применение приводит к усилению или ослаблению экспрессии белка, кодируемого геном-мишенью.
В некоторых вариантах воплощения любую из gPHK, описанных в настоящем документе, можно применять при получении медикамента для лечения заболевания или расстройства.
Меры модуляции гена.
Эффективность модифицированных gPHK можно тестировать in vitro и in vivo. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает одну или более из gPHK, описанных в настоящем документе, причем gPHK приводит к модуляции гена при ее попадании в клетку вместе с Cas9. В некоторых вариантах воплощения эффективность gPHK можно измерить в ходе анализов in vitro или in vivo.
1. Измерение эффективности Cas in vitro.
В некоторых вариантах воплощения активность РНП Cas, содержащего модифицированную sgPHK, сравнивают с активностью РНП Cas, содержащего немодифицированную sgPHK.
В некоторых вариантах воплощения активность РНП Cas, содержащего dgPHK, содержащую модифицированную trPHK, сравнивают с активностью РНП Cas, содержащего dgPHK, содержащую немодифицированную trPHK.
В некоторых вариантах воплощения активность РНП Cas, содержащего dgPHK, содержащую модифицированную crPHK, сравнивают с активностью РНП Cas, содержащего dgPHK, содержащую немодифицированную crPHK.
В некоторых вариантах воплощения активность РНП Cas, содержащего dgPHK, содержащую модифицированную crPHK и модифицированную trPHK, сравнивают с активностью РНП Cas, содержащего немодифицированную crPHK и немодифицированную trPHK.
В некоторых вариантах воплощения эффективность gPHK при увеличении или ослаблении экспрессии белка-мишени определяют путем измерения количества белка-мишени. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает любую одну из gPHK, описанных в настоящем документе, причем gPHK увеличивает или уменьшает количество белка, продуцированного с гена-мишени. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает способ модулирования экспрессии белка, включающий введение любой одной из gPHK, описанных в настоящем документе, субъекту, причем gPHK обеспечивает специфичность Cas9 по отношению к гену, кодирующему белок-мишень, и экспрессия гена-мишени усиливается или ослабляется по сравнению с контрольной gPHK, не обеспечивающей адресное воздействие Cas9 на указанный ген.
В некоторых вариантах воплощения эффективность редактирования с помощью специфических gPHK определяют путем редактирования, присутствующего в местоположении мишени в геноме после доставки Cas9 и gPHK (sgPHK или dgPHK, содержащей crPHK и trPHK). В некоторых вариантах воплощения эффективность редактирования с помощью специфических gPHK измеряют с помощью секвенирования нового поколения. В некоторых вариантах воплощения определяют процент редактирования исследуемой области-мишени. В некоторых вариантах воплощения измеряют общее количество считанных фрагментов с инсерциями или делециями нуклеотидов в исследуемой области-мишени по сравнению с общим количеством считанных фрагментов последовательности после доставки gPHK и Cas9. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает способ увеличения эффективности редактирования генов, включающий введение или доставку любой одной из модифицированных gPHK, описанных в настоящем документе, в клетку, причем процент редактирования гена увеличивается по сравнению с контрольной gPHK, не модифицированной аналогичным образом.
В некоторых вариантах воплощения эффективность редактирования с использованием конкретных
- 59 046927 gPHK измеряют по наличию инсерций или делеций нуклеотидов, внедренных при успешном редактировании гена. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает способ создания инсерций или делеций нуклеотидов в генах, включающий введение или доставку любой одной из модифицированных gPHK, описанных в настоящем документе, в клетку, причем нуклеотиды вставляют или удаляют по сравнению с контрольной gPHK, не модифицированной аналогичным образом. В некоторых вариантах воплощения активность Cas9 и gPHK тестируют в ходе биохимических анализов. В некоторых вариантах воплощения активность Cas9 и gPHK тестируют в ходе бесклеточного анализа расщепления. В некоторых вариантах воплощения активность Cas9 и gPHK тестируют в клетках Neuro2A.
В некоторых вариантах воплощения Cas9 и sgPHK или dgPHK, содержащие модифицированную crPHK и/или trPHK, демонстрируют аналогичную, более высокую или пониженную активность по сравнению с немодифицированной sgPHK или dgPHK, содержащей немодифицированную crPHK и trPHK. В некоторых вариантах воплощения Cas9 и модифицированная sgPHK или dgPHK, содержащие модифицированные crPHK и/или trPHK, демонстрируют усиленную активность по сравнению с немодифицированной sgPHK или dgPHK, содержащей немодифицированные crPHK и trPHK.
2. Измерение эффективности Cas in vivo.
В некоторых вариантах воплощения измеряют активность модифицированных gPHK после введения in vivo LNP, содержащего модифицированные gPHK и белок Cas или мРНК кодирующую белок Cas.
В некоторых вариантах воплощения эффективность in vivo gPHK или композиции, предложенных в настоящем документе, определяют по эффективности редактирования, измеренной в ДНК, выделенной из ткани (например, ткани печени) после введения gPHK и Cas9.
3. Измерения активации иммунной системы in vivo.
Модификации gPHK, описанные в настоящем документе, могут ослаблять иммунный ответ субъекта на введение gPHK in vivo. В некоторых вариантах воплощения активацию иммунного ответа субъекта измеряют по концентрации цитокина(ов) в сыворотке после введения sgPHK или dgPHK, содержащей trPHK и crPHK, вместе с мРНК или белком Cas9 (например, в составе с LNP) in vivo. В некоторых вариантах воплощения цитокин является интерфероном-альфа (ИФН-альфа), интерлейкином-6 (ИЛ-6), белком 1 хемотаксиса моноцитов (MCP-1) и/или фактором некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа). В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает способ снижения иммунного ответа субъекта для доставки gPHK, включающий введение любой одной из gPHK, описанных в настоящем документе, причем gPHK продуцирует ослабленный ответ иммунной системы субъекта после введения. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает способ ослабления активации иммунной системы субъекта после введения по сравнению с контрольной gPHK, не модифицированной аналогичным образом.
В некоторых вариантах воплощения введение РНП Cas или мРНК Cas9 вместе с модифицированной gPHK (например, sgPHK или dgPHK) вызывает более низкую концентрацию(и) цитокинов иммунного ответа в сыворотке по сравнению с введением немодифицированной sgPHK. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение включает способ снижения концентрации цитокинов иммунного ответа в сыворотке субъекта, включающий введение любой из gPHK, описанных в настоящем документе, причем gPHK вызывает более низкую концентрацию цитокинов иммунного ответа в сыворотке субъекта по сравнению с контрольной gPHK, не модифицированной аналогичным образом.
Данное описание типичных вариантов воплощения не следует воспринимать как ограничивающее. Для целей настоящего патентного описания и прилагаемой формулы изобретения, если не указано иное, все числа, выражающие количественные показатели, процентные доли, пропорции и другие численные значения, использованные в описании и формуле изобретения, во всех случаях следует понимать как модифицированные термином приблизительно в тех случаях, когда они не модифицированы таким образом. Соответственно, если не указано противоположное, численные параметры, заданные в следующем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приближенными значениями, которые могут изменяться в зависимости от желательных свойств, которые следует получить. По меньшей мере и не в качестве попытки ограничить применение доктрины эквивалентов к сущности формулы изобретения, каждый численный параметр следует истолковывать по меньшей мере в свете количества приведенных значащих цифр и с применением обычных способов округления.
Следует отметить, что в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа любого слова включают определяемые объекты во множественном числе, если явно и недвусмысленно не указано, что они ограничиваются одним определяемым объектом. В настоящем документе термин включать и его грамматические варианты считаются неограничивающими, так что упоминание элементов в списке не является исключением других подобных элементов, которые могут замещать или добавляться к перечисленным элементам.
Примеры
Следующие примеры приведены с целью иллюстрирования некоторых описанных вариантов воплощения и не должны рассматриваться как ограничивающие сущность описания каким-либо образом.
Пример 1. Материалы и способы.
Синтетическая направляющая РНК (gPHK).
- 60 046927 gPHK как в двойном (dgPHK, т.е. crPHK и trPHK), так и в одиночном направляющем (sgPHK) формате, химически синтезированные коммерческими поставщиками с использованием модифицированных нуклеотидов и связей представлены в табл. 4.
Транскрипция мРНК Cas9 in vitro (IVT).
Копированную и полиаденилированную мРНК Cas9, содержащую Ю-метил псевдо-U, получали транскрипцией in vitro с использованием матрицы линеаризованной плазмидной ДНК и РНК-полимеразы T7. Плазмидную ДНК, содержащую промотор T7 и поли(А/Е) область размером 100 нуклеотидов (nt), линеаризовали XbaI и получали от коммерческого производителя. Реакционную смесь для IVT с целью получения модифицированной мРНК Cas9 инкубировали при 37°C в течение 4 ч в следующих условиях: 50 нг/мкл линеаризованной плазмиды; по 2 мМ GTP, ATP, CTP и Ю-метил псевдо-UTP (Trilink); 10 мМ ARCA (Trilink); 5 ед/мкл РНК-полимеразы T7 (NEB); 1 ед/мкл ингибитора РНКазы мыши (NEB); 0,004 ед/мкл неорганической пирофосфатазы E. coli (NEB); и 1x реакционный буфер. После 4-ч инкубирования добавляли ДНКазу TURBO (ThermoFisher) в конечной концентрации 0,01 ед/мкл и инкубировали реакционную смесь в течение еще 30 мин для удаления ДНК-матрицы. мРНК Cas9 очищали от ферментов и нуклеотидов с использованием стандартных протоколов, включая колонки для связывания с диоксидом кремния, например, набор для очистки продуктов транскрипции MegaClear Transcription Clean-up (ThermoFisher) или поэтапного осаждения с использованием LiCl, a затем EtOH с NaOAc. Концентрацию транскрипта определяли путем измерения поглощения света при 260 нм (Nanodrop), транскрипт анализировали капиллярным электрофорезом на Bioanlayzer (Agilent).
Трансфекция мРНК Cas9 и gPHK в клетки Neuro2A.
Клетки линии Neuro2A мыши культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и высевали из расчета плотности 15000 клеток/лунку в 96-луночный планшет за 24 ч до трансфекции. В день трансфекции среду аспирировали от клеток и заменяли свежей средой. Липофектамин-2000 (Invitrogen) разбавляли в соотношении 1:50 (об/об) Opti-MEM (Invitrogen). мРНК Cas9 и одиночную направляющую РНК разбавляли Opti-MEM по отдельности. Для двойного направляющего формата crPHK и trPHK разбавляли совместно в молярном соотношении 1: 1 Opti-MEM. Как мРНК Cas9, так и gPHK раздельно смешивали в соотношении 1:1 (об/об) с разбавленным липофектамином-2000, получая два липоплекса. Через 5 мин инкубирования липоплексы последовательно добавляли к клеткам до конечной концентрации 100 нг мРНК Cas9/лунку и в общей сложности 0,4 мкл реагента для липофекции. Направляющие РНК тестировали на двух уровнях дозы для каждого эксперимента, включая 25 нМ и 2,5 нМ, 16,7 нМ и 1,67 нМ, 10 нМ и 1 нМ, 8,3 нМ и 0,83 нМ, и 3 нМ и 0,3 нМ. Для двойной направляющей РНК данная концентрация включала эквимолярные количества crPHK и trPHK, например, 25 нМ crPHK и 25 нМ trPHK давали общую концентрацию двойной направляющей РНК 25 нМ. Клетки лизировали через 24 ч после трансфекции, а лизаты использовали непосредственно для ПЦР, продукты которой анализировали на предмет редактирования посредством NGS.
- 61 046927 мРНК Cas9 с IxNLS (SEQ ID NO: 359):
GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCU
UAUUCGGAUCCAUGGAUAAGAAGUACUCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAACUAAUUCCGUGGGUUG GGCAGUGAUCACGGAUGAAUACAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGGAACACCGAU AGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGGAGCCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAG CGACCCGGCUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCGGAAGAAUCGCAUCUGCUAUCU GCAAGAGAUCUUUUCGAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUGGAAGAA UCUUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAACAUCGUCGACG AAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCUACCAUCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAAC UGACAAGGCCGACCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAUCAAAUUCCGCGGACAC UUCCUGAUCGAAGGCGAUCUGAACCCUGAUAACUCCGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUCAACUGG UGCAGACCUACAACCAACUGUUCGAAGAAAACCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCCAAGGC CAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGA GAGAAAAAGAACGGACUUUUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACUCCCAAUUUCA AGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGCGAAGCUGCAACUCUCAAAGGACACCUACGACGACGA CUUGGACAAUUUGCUGGCACAAAUUGGCGAUCAGUACGCGGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAAC CUUUCGGACGCAAUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAACACCGAAAUAACCAAAGCGCCGC UUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCGGUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAGCGCU CGUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAAUGGGUAC GCAGGGUACAUCGAUGGAGGCGCUAGCCAGGAAGAGUUCUAUAAGUUCAUCAAGCCAAUCCUGG AAAAGAUGGACGGAACCGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAGGAUCUGCUCCGGAAACA GAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCCCCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUG CGGCGCCAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAACCGGGAAAAGAUCGAGAAAAUUCUGA CGUUCCGCAUCCCGUAUUACGUGGGCCCACUGGCGCGCGGCAAUUCGCGCUUCGCGUGGAUGAC UAGAAAAUCAGAGGAAACCAUCACUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGAUAAGGGAGCUUCG GCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACUUCGACAAGAAUCUCСCAAACGAGAAGGUGCUUC CUAAGCACAGCCUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAACUGACUAAAGUGAAAUACGU
- 62 046927
UACUGAAGGAAUGAGGAAGCCGGCCUUUCUGUCCGGAGAACAGAAGAAAGCAAUUGUCGAUCUG CUGUUCAAGACCAACCGCAAGGUGACCGUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGAAGAUCG AGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGACAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUA UCAUGAUCUCCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGAGGAGAACGAGGACAUC CUGGAAGAUAUCGUCCUGACCUUGACCCUUUUCGAGGAUCGCGAGAUGAUCGAGGAGAGGCUUA AGACCUACGCUCAUCUCUUCGACGAUAAGGUCAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUGG UUGGGGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGAUAAACAGAGCGGUAAAACUAUC CUGGAUUUCCUCAAAUCGGAUGGCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGAUCCACGACGACA GCCUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAAAAAGCACAAGUGUCCGGACAGGGAGACUCACUCCAUGA ACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCGCCGGCGAUUAAGAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUG GUCGACGAGCUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUAUCGUGAUUGAAAUGGCCC GAGAAAACCAGACUACCCAGAAGGGCCAGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGGAUCGAAGA AGGAAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAAGAGCACCCGGUGGAAAACACGCAGCUGCAG AACGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAAAAUGGACGGGACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGG ACAUCAAUCGGUUGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCCUUUCUGAAGGAUGA CUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGACUCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGUGCCA UCGGAGGAGGUCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGCGAAGCUGAUUA CCCAGAGAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCGAGCGCGGCGGACUCUCAGAGCUGGAUAAGGC UGGAUUCAUCAAACGGCAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGGCGCAGAUCUUG GACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGACGAGAACGAUAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUA CCCUGAAAAGCAAACUUGUGUCGGACUUUCGGAAGGACUUUCAGUUUUACAAAGUGAGAGAAAU CAACAACUACCAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACGCUGUGGUCGGUACCGCCCUGAUCAAA AAGUACCCUAAACUUGAAUCGGAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUGAGGAAGA UGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAAAGCAACUGCGAAAUACUUCUUUUACUCAAACAU CAUGAACUUUUUCAAGACUGAAAUUACGCUGGCCAAUGGAGAAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUC GAAACUAACGGAGAAACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCAGGGACUUCGCAACUGUUCGCA AAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGUCAAUAUUGUGAAGAAAACCGAAGUGCAAACCGGCGGAUUUUC AAAGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGACAAGCUCAUUGCACGCAAGAAAGACUGGGAC CCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGAUUCGCCGACUGUCGCAUACUCCGUCCUCGUGGUGGCCAAGG UGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGGGGAUUACCAUCAUGGA ACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAUUGAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAG AAGGAUCUGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGUUCGAACUGGAAAAUGGUCGGAAGCGCA UGCUGGCUUCGGCCGGAGAACUCCAAAAAGGAAAUGAGCUGGCCUUGCCUAGCAAGUACGUCAA CUUCCUCUAUCUUGCUUCGCACUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUAACGAACAGAAG CAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUCUGGAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUU CAAAGCGCGUGAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCCUGUCGGCCUACAAUAAGCAUAG AGAUAAGCCGAUCAGAGAACAGGCCGAGAACAUUAUCCACUUGUUCACCCUGACUAACCUGGGA GCCCCAGCCGCCUUCAAGUACUUCGAUACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACCAAGG AAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCACUGGACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCU GUCGCAGCUGGGUGGCGAUGGCGGUGGAUCUCCGAAAAAGAAGAGAAAGGUGUAAUGAGCUAGC CAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGC UUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUU CUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGAA
- 63 046927 мРНК Cas9 с 2xNLS и маркером HA (SEQ ID NO: 360):
GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCU
UAUUCGGAUCCAUGGAUAAGAAGUACUCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAACUAAUUCCGUGGGUUG GGCAGUGAUCACGGAUGAAUACAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGGAACACCGAU AGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGGAGCCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAG CGACCCGGCUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCGGAAGAAUCGCAUCUGCUAUCU GCAAGAGAUCUUUUCGAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUGGAAGAA UCUUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAACAUCGUCGACG AAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCUACCAUCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAAC UGACAAGGCCGACCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAUCAAAUUCCGCGGACAC UUCCUGAUCGAAGGCGAUCUGAACCCUGAUAACUCCGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUCAACUGG UGCAGACCUACAACCAACUGUUCGAAGAAAACCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCCAAGGC CAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGA GAGAAAAAGAACGGACUUUUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACUCCCAAUUUCA AGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGCGAAGCUGCAACUCUCAAAGGACACCUACGACGACGA CUUGGACAAUUUGCUGGCACAAAUUGGCGAUCAGUACGCGGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAAC CUUUCGGACGCAAUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAACACCGAAAUAACCAAAGCGCCGC UUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCGGUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAGCGCU CGUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAAUGGGUAC GCAGGGUACAUCGAUGGAGGCGCUAGCCAGGAAGAGUUCUAUAAGUUCAUCAAGCCAAUCCUGG AAAAGAUGGACGGAACCGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAGGAUCUGCUCCGGAAACA GAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCCCCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUG CGGCGCCAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAACCGGGAAAAGAUCGAGAAAAUUCUGA CGUUCCGCAUCCCGUAUUACGUGGGCCCACUGGCGCGCGGCAAUUCGCGCUUCGCGUGGAUGAC UAGAAAAUCAGAGGAAACCAUCACUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGAUAAGGGAGCUUCG GCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACUUCGACAAGAAUCUCСCAAACGAGAAGGUGCUUC CUAAGCACAGCCUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAACUGACUAAAGUGAAAUACGU UACUGAAGGAAUGAGGAAGCCGGCCUUUCUGUCCGGAGAACAGAAGAAAGCAAUUGUCGAUCUG CUGUUCAAGACCAACCGCAAGGUGACCGUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGAAGAUCG AGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGACAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUA UCAUGAUCUCCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGAGGAGAACGAGGACAUC CUGGAAGAUAUCGUCCUGACCUUGACCCUUUUCGAGGAUCGCGAGAUGAUCGAGGAGAGGCUUA AGACCUACGCUCAUCUCUUCGACGAUAAGGUCAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUGG UUGGGGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGAUAAACAGAGCGGUAAAACUAUC CUGGAUUUCCUCAAAUCGGAUGGCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGAUCCACGACGACA
- 64 046927
GCCUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAAAAAGCACAAGUGUCCGGACAGGGAGACUCACUCCAUGA ACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCGCCGGCGAUUAAGAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUG GUCGACGAGCUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUAUCGUGAUUGAAAUGGCCC GAGAAAACCAGACUACCCAGAAGGGCCAGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGGAUCGAAGA AGGAAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAAGAGCACCCGGUGGAAAACACGCAGCUGCAG AACGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAAAAUGGACGGGACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGG ACAUCAAUCGGUUGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCCUUUCUGAAGGAUGA CUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGACUCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGUGCCA UCGGAGGAGGUCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGCGAAGCUGAUUA CCCAGAGAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCGAGCGCGGCGGACUCUCAGAGCUGGAUAAGGC UGGAUUCAUCAAACGGCAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGGCGCAGAUCUUG GACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGACGAGAACGAUAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUA CCCUGAAAAGCAAACUUGUGUCGGACUUUCGGAAGGACUUUCAGUUUUACAAAGUGAGAGAAAU CAACAACUACCAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACGCUGUGGUCGGUACCGCCCUGAUCAAA AAGUACCCUAAACUUGAAUCGGAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGAGGUGAGGAAGA UGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAAAGCAACUGCGAAAUACUUCUUUUACUCAAACAU CAUGAACUUUUUCAAGACUGAAAUUACGCUGGCCAAUGGAGAAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUC GAAACUAACGGAGAAACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCAGGGACUUCGCAACUGUUCGCA AAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGUCAAUAUUGUGAAGAAAACCGAAGUGCAAACCGGCGGAUUUUC AAAGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGACAAGCUCAUUGCACGCAAGAAAGACUGGGAC CCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGAUUCGCCGACUGUCGCAUACUCCGUCCUCGUGGUGGCCAAGG UGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGGGGAUUACCAUCAUGGA ACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAUUGAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAG AAGGAUCUGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGUUCGAACUGGAAAAUGGUCGGAAGCGCA UGCUGGCUUCGGCCGGAGAACUCCAAAAAGGAAAUGAGCUGGCCUUGCCUAGCAAGUACGUCAA CUUCCUCUAUCUUGCUUCGCACUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUAACGAACAGAAG CAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUCUGGAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUU CAAAGCGCGUGAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCCUGUCGGCCUACAAUAAGCAUAG AGAUAAGCCGAUCAGAGAACAGGCCGAGAACAUUAUCCACUUGUUCACCCUGACUAACCUGGGA GCCCCAGCCGCCUUCAAGUACUUCGAUACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACCAAGG AAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCACUGGACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCU GUCGCAGCUGGGUGGCGAUGGCUCGGCUUACCCAUACGACGUGCCUGACUACGCCUCGCUCGGA UCGGGCUCCCCCAAAAAGAAACGGAAGGUGGACGGAUCCCCGAAAAAGAAGAGAAAGGUGGACU CCGGAUGAGAAUUAUGCAGUCUAGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAA GAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAA CACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAA
Первичные гепатоциты печени.
Первичные гепатоциты печени мыши (PMH) (Gibco) культивировали в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen, протокол 11.28.2012). Вкратце, клетки размораживали и ресуспендировали в среде для размораживания гепатоцитов с добавками (Gibco, № по каталогу CM7000) с последующим центрифугированием при 100 g в течение 10 мин. Супернатант удаляли, а осажденные клетки ресуспендировали в среде для посева гепатоцитов с добавками (Invitrogen, № по каталогу A1217601 и CM3000). Клетки подсчитывали и высевали на 96-луночные планшеты, покрытые коллагеном I Bio-coat (ThermoFisher, № по каталогу 877272) из расчета плотности 15000 клеток/лунку и инкубировали в течение 5 ч при 37°C и в атмосфере 5% CO2 для образования монослоя. Через 5 ч среду для посева удаляли и заменяли средой для культивирования гепатоцитов с добавками (Invitrogen, № по каталогу A1217601 и CM4000), содержащей мРНК Cas9 и направляющую РНК в составе с LNP и 3% сыворотки мыши. LNP разбавляли с исходного уровня дозы 100 нг мРНК Cas9 и приблизительно 30 нМ направляющей РНК на
- 65 046927 лунку, выполняя последовательные разведения до концентрации 0,1 нг мРНК и 0,03 нМ направляющей РНК на лунку. Клетки инкубировали в течение приблизительно 48 ч при 37°C и в атмосфере 5% CO2, после чего выполняли лизис клеток и NGS-анализ, как описано в настоящем документе.
Состав липидных наночастиц (LNP).
LNP составляли при молярном соотношении амина катионного липида и фосфата РНК (N:P) приблизительно 4,5. Компоненты липидных наночастиц растворяли в 100% этаноле при следующих молярных соотношениях: 45 мол.% (12,7 мМ) катионного липида (например, (9Z,12Z)-3-((4,4бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3-(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси)метил)пропилоктадека9,12-диеноата, также называемого 3-((4,4-бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3(диэтилaмино)пропокси)кaрбонил)окси)метил)пропил(9Z,12Z)-октаgекa-9,12-диеноaтом); 44 мол.% (12,4 мМ) вспомогательного липида (например, холестерина); 9 мол.% (2,53 мМ) нейтрального липида (например, DSPC); и 2 мол.% (0,563 мМ) ПЭГ (например, ПЭГ2k-DMG). Нагрузку РНК получали в 25 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 4,5, что приводило к получению концентрации нагрузки РНК приблизительно 0,45 мг/мл.
LNP образовывали путем микрожидкостного смешивания растворов липидов и РНК с использованием прибора Precision Nanosystems NanoAssemblr™ Benchtop Instrument согласно протоколу производителя. Во время смешивания поддерживали соотношение водного и органического растворителя 2:1 с помощью дифференциальной скорости потока.
Составление LNP, процедура A: после смешивания LNP собирали, разбавляли физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS, приблизительно 1:1), а оставшийся буфер обменивали на PBS (100-кратный избыток объема образца) в течение ночи при 4°C и аккуратном перемешивании с использованием кассеты для диализа 10 кДа Slide-a-LyzerTM G2 (ThermoFisher Scientific). LNP концентрировали с использованием центрифужного фильтра 10 кДа Amicon (центрифугированием при 4000 g и 4°C) для получения желательной концентрации. Затем полученную смесь фильтровали с использованием 0.2 мкм стерильного фильтра. Полученный фильтрат хранили при 2-8°C.
Составление LNP, процедура B: после смешивания LNP собирали, разбавляли 50 мМ трис, pH 7,5 (приблизительно 1:1), а затем LNP обменивали в 50 мМ трис, pH 7,5 (100-кратный избыток объема образца) в течение ночи при 4°C и аккуратном перемешивании с использованием кассеты для диализа 10 кДа Slide-a-LyzerTM G2 (ThermoFisher Scientific). LNP концентрировали с использованием центрифужного фильтра 10 кДа Amicon (центрифугированием при 4000 g и 4°C) для получения двукратной желательной концентрации. Концентрированные LNP смешивали в соотношении 1:1 с 50 мМ трис, 90 мМ NaCl, 10% сахарозой при pH 7,5 (2X TSS). Затем полученную смесь фильтровали с использованием 0,2 мкм стерильного фильтра. Полученный фильтрат хранили при -80°C.
Составление LNP, процедура C: нагрузку РНК получали в 25 мМ цитрате натрия, 100 мМ хлориде натрия при pH 5, что приводило к образованию нагрузки РНК в концентрации приблизительно 0,45 мг/мл. После перемешивания LNP собирали в воде в соотношении 3:1. LNPs инкубировали в течение ч при комнатной температуре и смешивали с водой в соотношении 1:1. Затем обменивали буфер на 1X TSS (50 мМ трис, 45 мМ NaCl, 5% сахароза при pH 7,5) на колонках PD-10 (GE Healthcare) с использованием протокола производителя. LNP концентрировали с использованием центрифужного фильтра 10 кДа Amicon (центрифугированием при 4000 g и 4°C) для получения желательной концентрации. Затем полученную смесь фильтровали с использованием 0,2 мкм стерильного фильтра. Полученный фильтрат хранили при -80°C.
Секвенирование нового поколения (NGS) и анализ эффективности специфического гидролиза.
Для количественного определения эффективности редактирования по положению-мишени в составе генома использовали углубленное секвенирование с целью выявления наличия инсерций и делеций, внедренных при редактировании гена.
Сконструировали праймеры для ПЦР вокруг сайта-мишени (например, TTR, FVII), и амплифицировали исследуемую область генома. Последовательности праймеров представлены ниже в табл. 5.
- 66 046927
Таблица 5
| Направляющая РНК | Ген | Прямой праймер (5'-3' ) | SEQ ID | Обратный праймер (5'-3') | SEQ ID |
| Для экспериментов с направляющими РНК на основе доменов адресного воздействия CR000686/G00020 9 | TTR | AGTCAATAATCAGA ATCAGCAGGT | 333 | AGAAGGCACTTCTTC TTTATCTAAGGT | 337 |
| Для экспериментов с направляющими РНК на основе доменов адресного воздействия CR000705/G00021 1 | TTR | GTTTTGTTCCAGAG TCTATCACCG | 334 | ACACGAATAAGAGCA AATGGGAAC | 338 |
| Для экспериментов с | TTR | ATTACCAGCTTAGC ATCCTGTGAA | 335 | ACACGGTTTATAGAG CAAGAACAC | 339 |
| направляющими РНК на основе доменов адресного воздействия G000269/G000285 Для экспериментов с направляющими РНК на основе доменов адресного воздействия CR000657/G00020 8 | FVII | AGCACATGAGACCT TCTGTTTCTC | 336 | GACATAGGTGTGACC СТСАСААТС | 340 |
Дополнительную ПЦР выполняли согласно протоколам производителя (Illumina) с добавлением необходимых реагентов для секвенирования. Ампликоны секвенировали на приборе Illumina MiSeq. Считанные фрагменты выравнивали с эталонным геномом человека (например, hg38) после удаления низкокачественных фрагментов. Полученные файлы, содержащие считанные фрагменты, картировали на эталонном геноме (BAM-файлы), где отбирали считанные фрагменты, перекрывавшие исследуемую область-мишень и рассчитывали количество считанных фрагментов дикого типа по сравнению с количеством считанных фрагментов, содержавших инсерцию, замещение или делецию.
Процентную долю редактирования (например, эффективность редактирования или процент редактирования) определяли как общее количество считанных фрагментов последовательности с инсерциями или делециями по отношению к общему количеству считанных фрагментов последовательности, в том числе дикого типа.
Доставка LNP in vivo.
Самок мышей CD-1 в возрастном диапазоне 6-10 недель использовали в каждом исследовании. Жи
- 67 046927 вотных взвешивали и группировали в соответствии с массой тела для получения растворов для введения на основании средней массы тела в группе. LNP вводили в латеральную хвостовую вену в объеме 0,2 мл на животное (приблизительно 10 мл на килограмм массы тела). За животными наблюдали на предмет нежелательных эффектов в течение приблизительно 6 ч после введения. Массу тела изменяли через 24 ч после введения, после чего животных умерщвляли в различные моменты времени путем обескровливания посредством пункции сердца под анестезией с применением изофлурана. Кровь собирали в пробирки для отделения сыворотки или в пробирки с забуференным цитратом натрия для получения плазмы, как описано в настоящем документе. Для исследований с вовлечением редактирования in vivo собирали ткань средней доли печени каждого животного для выделения и анализа ДНК.
Анализ индукции цитокинов.
Для этого анализа выполняли отбор приблизительно 50-100 мкл крови путем надреза хвостовой вены для измерения цитокинов в сыворотке. Крови позволяли свернуться при комнатной температуре в течение приблизительно 2 ч, а затем выполняли центрифугирование при 1000 g в течение 10 мин, после чего собирали сыворотку. Многоканальный анализ с магнитными гранулами на основе Luminex (Affymetrix ProcartaPlus, номер по каталогу Exp040-00000-801), позволяющий измерять ИЛ-6, ФНО-альфа, ИФН-альфа и MCP-1, использовали для анализа цитокинов в собранных образцах. Реагенты и стандарты набора подготавливали в соответствии с протоколом производителя. 25 мкл сыворотки мыши добавляли в лунки, содержавшие 25 мкл разбавленных магнитных гранул с иммобилизованными антителами. Планшет инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем промывали. Разбавленное антитело с биотином (50 мкл) добавляли к гранулам и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Гранулы повторно промывали, а затем в каждую лунку добавляли 50 мкл разбавленного стрептавидина-PE с последующим инкубированием в течение 30 мин. Гранулы повторно однократно промывали, а затем суспендировали в 100 мкл буфера для промывки и считывали на приборе Bio-Plex 200 (Bio-Rad). Данные анализировали в аналитическом пакете Bioplex Manager версии 6.1, концентрации цитокинов рассчитывали по стандартной кривой с использованием аппроксимации кривой пятипараметрической логистической моделью.
Выделение геномной ДНК.
Для исследований in vivo геномную ДНК выделяли из 10 мг ткани с использованием набора для выделения на основе гранул, MagMAX-96 DNA Multi-Sample Kit (ThermoFisher, № по каталогу 4413020) в соответствии с протоколом производителя, включавшим гомогенизирование ткани в лизирующем буфере (приблизительно 400 мкл/10 мг ткани). Все образцы ДНК нормировали до концентрации 100 нг/мкл для ПЦР и последующего NGS-анализа, описанного в настоящем документе.
Анализ транстиретина (TTR) с помощью твердофазного ИФА.
Отбор крови и выделение сыворотки выполняли в соответствии с указаниями. Уровень общего TTR в сыворотке определяли с использованием анализа преальбумина (транстиретина) мыши с помощью твердофазного ИФА (Aviva Systems Biology, № по каталогу OKIA00111). Реагенты и стандарты набора подготавливали в соответствии с протоколом производителя. Сыворотку мыши разбавляли 1x разбавителем для анализа до конечного 10000-кратного разведения. Разбавление выполняли путем выполнения двух последовательных 50-кратных разведений, что приводило к 2500-кратному разбавлению. Этап окончательного 4-кратного разбавления выполняли для получения общего 10000-кратного разведения образца. Как разведения для получения стандартной кривой (по 100 мкл), так и разбавленные образцы сыворотки добавляли в каждую лунку планшета для твердофазного ИФА с заранее иммобилизованным антителом для захвата. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем промывали. Добавляли конъюгат фермент - антитело (100 мкл на лунку) и выполняли инкубирование в течение 20 мин. Несвязанный конъюгат антитела удаляли, планшет повторно промывали и добавляли раствор хромогенного субстрата. Планшет инкубировали в течение 10 мин, а затем добавляли 100 мкл стоп-раствора, например, серной кислоты (приблизительно 0,3М). Планшет считывали на планшетридере SpectraMax M5, регистрируя поглощение при 450 нм. Уровень TTR в сыворотке рассчитывали с использованием программного обеспечения SoftMax Pro версии 6.4.2 с использованием четырехпараметрической логистической аппроксимации стандартной кривой. Окончательные значения в сыворотке рассчитывали с поправкой на разбавление при анализе.
Пример 2. Конструирование и тестирование модифицированной gPHK in vitro.
Модифицированные gPHK проектировали в формате двойной направляющей РНК (dgPHK), как показано в табл. 4. Соответственно, проектировали и химически синтезировали как модифицированные crPHK, так и trPHK с целью сопряжения модифицированных и немодифицированных компонентов с образованием dgPHK. Эти сопряженные пары трансфицировали в клетки Neuro2A в концентрациях, указанных на Фигурах, и измеряли эффективность редактирования (например, процент редактирования) с помощью NGS, как описано в примере 1.
Некоторые модифицированные crPHK из табл. 4, обеспечивающие адресное воздействие на ген TTR мыши, трансфицировали с мРНК Cas9 и немодифицированной trPHK (TR000002). Протестированные направляющие РНК включали SEQ ID No: 1-18. Как показано на фиг. 1, некоторые из модифицированных crPHK (вместе с немодифицированными trPHK) обеспечивали аналогичную или усиленную ак
- 68 046927 тивность по сравнению с немодифицированным контролем, в то время как другие модифицированные crPHK снижали активность.
Параллельно модифицированные trPHK из табл. 4 трансфицировали с мРНК Cas9 наряду с немодифицированной crPHK (CR000686), обеспечивавшей адресное воздействие на ту же последовательность гена TTR мыши. Протестированные направляющие РНК включали SEQ ID No: 188-200 и 204. Как показано на фиг. 2, многие из модифицированных trPHK (вместе с немодифицированными crPHK) обеспечивали аналогичную или усиленную активность по сравнению с немодифицированным контролем, в то время как некоторые модифицированные trPHK снижали активность.
В дополнение к замещению химически модифицированных нуклеотидов, некоторые из протестированных сопряженных пар crPHK и trPHK также сконструировали с замещениями в последовательности, например, приводившими к образованию пар G-C, не встречающихся в исходных последовательностях. Протестированные направляющие РНК включали SEQ ID No: 15 и 201; 16 и 202; 1 и 188. Как показано на фиг. 3, одна из таких сопряженных пар (SEQ ID No: 16 и 202) приводила к аналогичной или усиленной активности по сравнению с немодифицированным контролем, в то время как две другие сопряженные пары снижали активность.
Затем протестировали сопряженные пары модифицированных crPHK и модифицированных trPHK из табл. 4. Как показано на фиг. 4, многие из сопряженных пар модифицированной crPHK и модифицированной trPHK обеспечивали аналогичную или усиленную активность по сравнению с немодифицированным контролем, в то время как некоторые сопряженные пары снижали активность. Заголовки столбцов на фиг. 4 обозначают различные trPHK, использованные в эксперименте, а заголовки строк - различные использованные crPHK. Для определения комбинации, использованной в эксперименте, необходимо сопоставить столбец и строку. TR000002 и CR000686 являются немодифицированными контролями (см. нижние правые ячейки).
На основании конструкции dgPHK сконструировали одиночные направляющие РНК (sgPHK), характеризующиеся аспектами некоторых модифицированных crPHK и trPHK, изображенных в табл. 4 и на фиг. 15D. Эти sgPHK, SEQ ID No: 228-234, также протестировали в клетках Neuro2A, и, как показано на фиг. 5, каждая из модифицированных sgPHK демонстрировала активность, сопоставимую с контролями, содержавшими только 5'- и 3'-концевые модификации (G0000209; SEQ ID NO: 228).
Аналогичный набор экспериментов выполнили для дополнительных dgPHK, описанных в табл. 4 и на фиг. 6. Протестированные направляющие РНК включали SEQ ID No: 32-47 и 1. Модифицированные crPHK, также обеспечивающие адресное воздействие на ген TTR мыши, трансфицировали с мРНК Cas9 и немодифицированной trPHK (TR000002). Как показано на фиг. 6, некоторые из модифицированных crPHK (вместе с немодифицированной trPHK) обеспечивали аналогичную или усиленную активность по сравнению с немодифицированным контролем (CR000686), в то время как другие модифицированные crPHK снижали активность.
Параллельно, как показано на фиг. 7, модифицированные trPHK из табл. 4 трансфицировали с мРНК Cas9 наряду с немодифицированной crPHK (CR000686), обеспечивавшей адресное воздействие на ту же последовательность гена TTR мыши. Протестированные направляющие РНК включали SEQ ID No: 205-222 и 1. Как показано на фиг. 7, многие из модифицированных trPHK (вместе с немодифицированной crPHK) обеспечивали аналогичную или усиленную активность по сравнению с немодифицированным контролем (TR000002), в то время как некоторые модифицированные trPHK снижали активность.
В дополнение к замещению химически модифицированных нуклеотидов, некоторые из протестированных сопряженных пар crPHK и trPHK из табл. 4 также сконструировали с замещениями в последовательности, например, приводившими к образованию пар G-C или несовпадений G-U (прецессии GU), не встречающихся в исходных последовательностях. Как показано на фиг. 8, некоторые из модификаций и сопряженных пар обеспечивали аналогичную или усиленную активность по сравнению с немодифицированным контролем, в то время как некоторые (например, сопряженные пары с прецессией GU или несовпадениями) снижали активность. На фиг. 8 показаны результаты использования направляющих trPHK, показанных в SEQ ID No: 223-227 и 188 с направляющими crPHK, показанными в SEQ ID No: 4852 и 1.
Затем протестировали выбранные сопряженные пары модифицированных crPHK и модифицированных trPHK из табл. 4, как показано на фиг. 9. Некоторые из сопряженных пар модифицированной crPHK и модифицированной trPHK обеспечивали аналогичную или усиленную активность по сравнению с немодифицированным контролем, в то время как некоторые сопряженные пары снижали активность. Заголовки столбцов на фиг. 9 обозначают различные trPHK, использованные в эксперименте, а заголовки строк - различные использованные crPHK. Для определения комбинации, использованной в эксперименте, необходимо сопоставить столбец и строку. Немодифицированные контроли являются TR000002 и CR000686.
Некоторые из модифицированных gPHK (dgPHK и sgPHK) из табл. 4 также тестировали в чисто биохимическом анализе (т.е. бесклеточном анализе гидролиза). Интересно, что многие из модифицированных gPHK, которые были в основном неактивны в клетках Neuro2A, являлись активными при биохимическом анализе, что указывало на то, что такие биохимические анализы могут не позволять прогнози
- 69 046927 ровать активность модифицированных gPHK в клетках (данные не показаны).
Пример 3. Дальнейшее тестирование модифицированных gPHK по отношению к другим мишеням.
На следующем этапе после установления влияния некоторых модификаций на активность gPHK протестировали возможность влияния таких модификаций на активность при адресном воздействии на (1) отдельную последовательность в том же гене или (2) последовательность в другом гене. Соответственно, сконструировали и синтезировали gPHK, обеспечивавшие адресное воздействие на другую последовательность в гене TTR мыши, а также последовательность в гене фактора VII (FVII) мыши, характеризовавшиеся некоторыми шаблонами модификации, протестированными в примере 2 (см. табл. 4). Эти gPHK трансфицировали в клетки Neuro2A в концентрациях, указанных на фигурах, и измеряли эффективность редактирования (например, процент редактирования) с помощью NGS, как описано в примере 1.
Модифицированные crPHK из табл. 4, обеспечивающие адресное воздействие на ген TTR мыши (другую последовательность в отличие от адресного воздействия в примере 2) или ген FVII мыши, трансфицировали с мРНК Cas9 и немодифицированной trPHK (TR000002). Протестированные направляющие РНК включали последовательности, показанные на фиг. 12A и 12B. Некоторые из модифицированных crPHK (вместе с немодифицированной trPHK) обеспечивали аналогичную или усиленную активность по сравнению с немодифицированными контролями, в то время как другие модифицированные crPHK снижали активность.
Параллельно модифицированные trPHK из табл. 4 трансфицировали с мРНК Cas9 наряду с немодифицированной crPHK, обеспечивавшей адресное воздействие на ген TTR мыши (CR000705; другую последовательность в отличие от адресного воздействия в примере 2) или ту же последовательность, что и в гене FVII мыши (CR000657). Как показано на фиг. 13A и 13B, многие из модифицированных trPHK (вместе с немодифицированными crPHK) обеспечивали аналогичную или усиленную активность по сравнению с немодифицированными контролями, в то время как некоторые модифицированные trPHK снижали активность. Эти данные показывают тенденцию к тому, что некоторые шаблоны модификации обладают аналогичным действием на различные последовательности.
На основании вышеописанной конструкции dgPHK сконструировали одиночные направляющие РНК (sgPHK), характеризующиеся аспектами некоторых модифицированных crPHK и trPHK. См. табл. 4. Эти sgPHK также протестировали в клетках Neuro2A. Результаты показаны на фиг. 10 (TTR мыши) и Фиг. 11 (FVII мыши). Эти эксперименты показали, что некоторые шаблоны модификации приводят к аналогичному действию даже при адресном воздействии на другие гены.
Пример 4. Тестирование модифицированной gPHK in vivo.
После тестирования in vitro выполнили доставку модифицированных sgPHK в организмы животных в шести отдельных исследованиях с целью определения возможности получения благоприятного эффекта для редактирования in vivo за счет этих модификаций.
LNP составляли с IVT мРНК Cas9 совместно с химически модифицированной sgPHK (обеспечивавшей адресное воздействие на TTR или FVII), как описано в примере 1. Соотношение мРНК^РНК составляло приблизительно 1:1 по массе РНК-компонентов. Если не указано иное, мРНК Cas9, использованная в исследованиях, описанных в данном примере, обладала последовательностью согласно SEQ ID NO: 360, a LNP составляли с использованием процедуры A составления LNP, описанной выше.
В одном эксперименте мышам (n=5 на группу) однократно вводили LNP в дозе 2 мг/кг и выполняли отбор крови для анализа цитокинов в сыворотке через четыре ч после введения. Через 7 дней после введения во время аутопсии выполняли сбор печени и крови для измерений эффективности редактирования с помощью NGS и анализа TTR в сыворотке, соответственно. Каждая из sgPHK в данном эксперименте обеспечивала адресное воздействие на одну и ту же последовательность в гене TTR, единственным различием между sgPHK являлись модификации, внесенные в каждую из них (см. фиг. 14A-D и 15A-E; табл. 4, SEQ ID No: 228-234). G000209 (две протестированные партии) использовали в качестве в меньшей степени модифицированного контроля, содержавшего лишь 2'-О-метил модификации и фосфоротиоатные связи в трех концевых положениях и между ними как в 5'-, так и в 3'-концевых областях sgPHK, соответственно. (См. фиг. 15D).
Результаты, приведенные на фиг. 14A-D, показали наличие тенденции к тому, что в большей степени модифицированные sgPHK индуцируют ответ каждого из проанализированных цитокинов в меньшей степени по сравнению с менее модифицированными контролями G000209. В большей степени модифицированные sgPHK также обеспечивали повышенную эффективность редактирования в печени обработанных животных, причем процент редактирования достигал ~60% для двух в большей степени модифицированных sgPHK (например, G000263 и G000267) по сравнению с ~44-47% для менее модифицированных контролей (партий G000209) (фиг. 15A). Важно отметить, что эффективность редактирования коррелировала с фенотипическими изменениями, поскольку уровни нокдауна TTR в сыворотке были сопоставимы или значительно превышали таковые для менее модифицированных контролей (см., например, G000263 и G000267 по сравнению с партиями G000209 на фиг. 15A-15B). Сводные различия между G000209 с концевыми модификациями и значительно модифицированной G000267 приведены на фиг. 15D и 15E (2'-O-Me модифицированные нуклеотиды показаны полужирным шрифтом, а * является
- 70 046927 фосфоротиоатной связью).
В еще одном исследовании in vivo протестировали три sgPHK, обеспечивавшие адресное воздействие на отдельные последовательности в гене TTR мыши. Мышам (n=5 на группу) однократно вводили LNP в дозе 2 мг/кг, 1 мг/кг или 0,3 мг/кг. Отбор крови для анализа цитокинов в сыворотке выполняли через четыре ч после введения. Через 7 дней после введения во время аутопсии выполняли сбор печени и крови для измерений эффективности редактирования с помощью NGS и анализа TTR в сыворотке, соответственно. В данном исследовании каждая из sgPHK обеспечивала адресное воздействие на одну и ту же последовательность в гене TTR (другую последовательность в отличие от адресного воздействия в предыдущем исследовании in vivo), причем одна sgPHK являлась полностью немодифицированной (G000201 (SEQ ID NO: 243)), еще одна содержала лишь концевые модификации (G000211 (SEQ ID NO: 241)), причем 2'-О-метил модификации и фосфоротиоатные связи располагались в трех концевых положениях и между ними как в 5'-, так и 3'-концевых областях sgPHK, соответственно), а третья sgPHK характеризовалась тем же шаблоном модификации, что и G000267 в предыдущем исследовании in vivo (G000282 (SEQ ID NO: 242)).
Как показано на фиг. 16A-16D, каждая из sgPHK приводила к аналогичным ответам каждого из протестированных цитокинов в зависимости от дозы. По отношению к эффективности редактирования немодифицированная sgPHK (G000201 (SEQ ID NO: 243)) обеспечивала незначительное редактирование in vivo, в то время как значительно модифицированная sgPHK (G000282 (SEQ ID NO: 242)) обеспечивала достижение ~60% уровня в дозе 2 мг/кг, что значительно превышало уровни, достигаемые с использованием в меньшей степени модифицированной sgPHK (G000211 (SEQ ID NO: 241)) (фиг. 17A и B). Как и в предыдущем исследовании in vivo, уровень редактирования коррелировал с количественным нокдауном TTR в сыворотке (фиг. 17C и D).
Затем выполнили исследование, аналогичное второму исследованию in vivo с использованием еще одного набора трех sgPHK, обеспечивавших адресное воздействие на другую последовательность TTR в гене TTR мыши (адресное воздействие на другую последовательность в отличие от адресного воздействия в двух предыдущих исследованиях in vivo). Мышам (n=5 на группу) однократно вводили LNP в дозе 2 мг/кг, 1 мг/кг или 0,3 мг/кг. Отбор крови для анализа цитокинов в сыворотке выполняли через четыре ч после введения. Через 7 дней после введения во время аутопсии выполняли сбор печени и крови для измерений эффективности редактирования с помощью NGS и анализа TTR в сыворотке, соответственно. В данном исследовании каждая из sgPHK обеспечивала адресное воздействие на одну и ту же последовательность в гене TTR (другую последовательность в отличие от адресного воздействия в двух предыдущих исследованиях in vivo), причем одна sgPHK являлась полностью немодифицированной (G000285; (SEQ ID NO: 332)), еще одна содержала лишь концевые модификации (G000269 (SEQ ID NO: 330)), причем 2'-O-метил модификации и фосфоротиоатные связи располагались в трех концевых положениях и между ними как на 5'-, так и 3'-конце sgPHK, соответственно), а третья sgPHK характеризовалась тем же шаблоном модификации, что и G000267 и G000282 в двух предыдущих исследованиях in vivo (G000283 (SEQ ID NO: 331)).
В данном исследовании немодифицированная sgPHK (G000285 (SEQ ID NO: 332)) обеспечивала незначительное редактирование in vivo, в то время как значительно модифицированная sgPHK (G000283 (SEQ ID NO: 331)) обеспечивала достижение ~60% уровня в дозе 2 мг/кг, что значительно превышало уровни, достигаемые с использованием в меньшей степени модифицированной sgPHK (G000269 (SEQ ID NO: 330)) (фиг. 18A-18B). Как и в предыдущих исследованиях in vivo, уровень редактирования коррелировал с количественным нокдауном TTR в сыворотке (фиг. 18C).
В четвертом исследовании in vivo выполнили оценку влияния модификаций gPHK для другого гена (FVII). Для сравнений в рамках исследования включили две из sgPHK, протестированные в первом исследовании in vivo (G000209 и G000267). Мышам (n=5 на группу) однократно вводили LNP в дозе 2 мг/кг, 1 мг/кг и 0,3 мг/кг и выполняли отбор крови для анализа цитокинов в сыворотке через четыре ч после введения. Через 6 дней после введения во время аутопсии выполняли сбор печени для измерений эффективности редактирования с помощью NGS. В данном исследовании каждая из sgPHK обеспечивала адресное воздействие на одну и ту же последовательность в генах TTR или FVII, причем одна sgPHK для каждого гена содержала лишь концевые модификации (G000208 (SEQ ID NO: 286)) для FVII, G000209 для TTR, причем обе они содержали 2' -O-метил модификации и фосфоротиоатные связи в трех концевых положениях и между ними как на 5'-, так и на 3'-конце sgPHK, соответственно), а вторая sgPHK характеризовалась теми же шаблонами модификации, что и G000267, G000282 и G000283 в предыдущих исследованиях in vivo (G000373 (SEQ ID NO: 287) для FVII; G000267 (SEQ ID NO: 234) для TTR).
Как показано на фиг. 19A-19D, каждая из sgPHK приводила к аналогичным ответам каждого из протестированных цитокинов в зависимости от дозы. По отношению к эффективности редактирования в большей степени модифицированная sgPHK, обеспечивавшая адресное воздействие на FVII (G000373 (SEQ ID NO: 287)), обладала повышенной эффективностью редактирования по сравнению с менее модифицированной версией (G000208 (SEQ ID NO: 286)) во всем диапазоне протестированных доз (фиг. 18A). Эти результаты также наблюдали для sgPHK, обеспечивавших адресное воздействие на TTR (фиг. 20A20B).
- 71 046927
В еще одном исследовании in vivo протестировали десять дополнительных sgPHK, обеспечивавшие адресное воздействие на ту же последовательность в гене TTR мыши, что и G000282. G000282 также включили в данное исследование для целей сравнения. Мышам (n=5 на группу) однократно вводили LNP в дозе 1 мг/кг или 0,5 мг/кг. LNP, использованные в данном исследовании, составляли с использованием процедуры B составления LNP, описанной выше. Через семь (7) дней после введения во время аутопсии выполняли сбор печени и крови для измерений эффективности редактирования с помощью NGS и анализа TTR в сыворотке, соответственно. В данном исследовании каждая из sgPHK обеспечивала адресное воздействие не одну и ту же последовательность в гене TTR. Шаблон модификации для каждой протестированной sgPHK различался и включал 2'-ОМе, 2'-F и PS модификации в 5'-концевой области, 3'концевой области, шпильке 1, шпильке 2, связке, нижнем стебле, расширении и верхнем стебле sgPHK. Результаты данного исследования показаны на фиг. 22A-22C, включая % редактирования (фиг. 22A), среднее значение и стандартное отклонение редактирования (фиг. 22B) и уровень TTR в сыворотке (фиг. 22C). Эти же sgPHK протестировали в первичных гепатоцитах мыши согласно способам, описанным в настоящем документе. Результаты данного исследования редактирования TTR в зависимости от дозы показаны на фиг. 24A-24C, включая % редактирования (фиг. 24A), кривые зависимости ответа от дозы (фиг. 24B) и значения EC50 (фиг. 24C).
В еще одном исследовании in vivo протестировали тринадцать sgPHK, обеспечивавших адресное воздействие на ту же последовательность в гене TTR мыши, что и G000282. G000282 также включили в данное исследование для целей сравнения. Мышам (n=5 на группу) однократно вводили LNP в дозе 1 мг/кг. LNP, использованные в данном исследовании, составляли с использованием процедуры С составления LNP, описанной выше. мРНК Cas9, использованная в данном исследовании, обладала последовательностью согласно SEQ ID NO: 359. Отбор крови для анализа цитокинов в сыворотке выполняли через четыре ч после введения. Через 7 дней после введения во время аутопсии выполняли сбор печени и крови для измерений эффективности редактирования с помощью NGS и анализа TTR в сыворотке, соответственно. В данном исследовании каждая из sgPHK обеспечивала адресное воздействие на одну и ту же последовательность в гене TTR. Протестированные sgPHK включали дополнительные 2'-OMe и PS модификации в 5'-концевой области, 3'-концевой области, шпильке 1, шпильке 2 и верхнем стебле sgPHK. Результаты данного исследования показаны на фиг. 23A-23C, включая % редактирования (фиг. 23A), средний % редактирования (фиг. 23B) и уровень TTR в сыворотке (фиг. 23C).
Перечень последовательностей <110> INTELLIA THERAPEUTICS, INC.
<120> МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НАПРАВЛЯЮЩИЕ РНК <130> 01155-0004-00PCT <140>
<141>
<150> 62/431,756 <151> 2016-12-08 <160> 360 <170> Патентная версия 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 1 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 2
- 72 046927 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 2 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 3 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 3 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 4 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 4 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210>5 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 5 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210>6 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник
- 73 046927 <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 6 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210>7 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 7 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210>8 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 8 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210>9 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 9 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 10 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 10 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
- 74 046927 <210> 11 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 11 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 12 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 12 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 13 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 13 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 14 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 14 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 15 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность
- 75 046927 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 15 ccaguccagc gaggcaaagg ggcgcagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 16 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 16 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuggcg cg 42 <210> 17 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 17 ccaguccagc gaggcaaagg ggcgcagagc uaugcuggcg cg 42 <210> 18 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 18 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 19 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 19
- 76 046927 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 20 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 20 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 21 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 21 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 22 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 22 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 23 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 23 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 24 <211> 22 <212> РНК
- 77 046927 <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 24 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 25 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 25 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 26 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 26 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 27 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 27 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 28 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 78 046927 <400> 28 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 29 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 29 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 30 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 30 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 31 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 31 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 32 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 32 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 33
- 79 046927 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 33 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 34 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 34 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 35 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 35 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 36 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 36 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 37 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник
- 80 046927 <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 37 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 38 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 38 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 39 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 39 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 40 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 40 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 41 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 41 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
- 81 046927 <210> 42 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 42 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 43 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 43 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 44 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 44 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 45 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 45 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 46 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность
- 82 046927 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 46 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 47 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 47 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 48 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 48 ccaguccagc gaggcaaagg gucucagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 49 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 49 ccaguccagc gaggcaaagg gcuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 50 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 50
- 83 046927 ccaguccagc gaggcaaagg gucuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 51 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 51 ccaguccagc gaggcaaagg guucuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 52 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 52 ccaguccagc gaggcaaagg guuucagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 53 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 53 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 54 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 54 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 55 <211> 22 <212> РНК
- 84 046927 <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 55 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 56 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 56 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 57 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 57 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 58 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 58 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 59 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 85 046927 <400> 59 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 60 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 60 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 61 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 61 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 62 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 62 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 63 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 63 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 64
- 86 046927 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 64 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 65 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 65 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 66 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 66 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 67 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 67 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 68 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник
- 87 046927 <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 68 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 69 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 69 gucucagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 70 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 70 gcuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 71 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 71 gucuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 72 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 72 guucuagagc uaugcuguuu ug 22
- 88 046927 <210> 73 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 73 guuucagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 74 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 74 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 75 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 75 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 76 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 76 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 77 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность
- 89 046927 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 77 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 78 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 78 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 79 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 79 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 80 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 80 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 81 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 81
- 90 046927 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 82 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 82 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 83 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 83 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 84 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 84 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 85 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 85 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 86 <211> 42 <212> РНК
- 91 046927 <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 86 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 87 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 87 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 88 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 88 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 89 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 89 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 90 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 92 046927 <400> 90 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 91 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 91 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 92 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 92 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 93 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 93 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 94 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 94 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 95
- 93 046927 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 95 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 96 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 96 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 97 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 97 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 98 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 98 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 99 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник
- 94 046927 <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 99 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 100 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 100 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 101 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 101 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 102 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 102 uuacagccac gucuacagca ggcgcagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 103 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 103 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uaugcuggcg cg 42
- 95 046927 <210> 104 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 104 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 105 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 105 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 106 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 106 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 107 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 107 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 108 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность
- 96 046927 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 108 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 109 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 109 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 110 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>110 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 111 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>111 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 112 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>112
- 97 046927 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210>113 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>113 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 114 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>114 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210>115 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>115 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210>116 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>116 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210>117 <211> 22 <212> РНК
- 98 046927 <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>117 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210>118 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>118 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210>119 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>119 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 120 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 120 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 121 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 99 046927 <400> 121 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 122 <211> 16 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 122 gagcuaugcu guuuug 16 <210> 123 <211> 16 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 123 gagcuaugcu guuuug 16 <210> 124 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 124 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 125 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 125 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 126
- 100 046927 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 126 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 127 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 127 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 128 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 128 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 129 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 129 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 130 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник
- 101 046927 <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 130 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 131 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 131 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 132 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 132 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 133 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 133 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 134 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 134 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
- 102 046927 <210> 135 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 135 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 136 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 136 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 137 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 137 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 138 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 138 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 139 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность
- 103 046927 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 139 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 140 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 140 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 141 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 141 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 142 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 142 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 143 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 143
- 104 046927 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 144 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 144 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 145 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 145 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 146 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 146 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 147 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 147 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 148 <211> 42 <212> РНК
- 105 046927 <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 148 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 149 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 149 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 150 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 150 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 151 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 151 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 152 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 106 046927 <400> 152 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 153 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 153 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 154 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 154 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 155 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 155 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 156 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 156 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 157
- 107 046927 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 157 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 158 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 158 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 159 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 159 cagggcucuu gaagaucucc ggcgcagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 160 <211> 42 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 160 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uaugcuggcg cg 42 <210> 161 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник
- 108 046927 <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 161 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 162 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 162 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 163 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 163 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 164 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 164 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 165 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 165 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22
- 109 046927 <210> 166 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 166 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 167 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 167 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 168 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 168 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 169 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 169 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 170 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность
- 110 046927 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 170 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 171 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 171 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 172 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 172 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 173 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 173 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 174 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 174
- 111 046927 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 175 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 175 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 176 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 176 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 177 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 177 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 178 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 178 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 179 <211> 22 <212> РНК
- 112 046927 <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 179 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 180 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 180 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 181 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 181 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 182 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 182 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 183 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 113 046927 <400> 183 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 184 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 184 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 185 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 185 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 186 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 186 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 187 <211> 22 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 187 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 188
- 114 046927 <211> 74 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 188 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu uuuu 74 <210> 189 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 189 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 190 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 190 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 191 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 191 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71
- 115 046927 <210> 192 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 192 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 193 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 193 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 194 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 194 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 195 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 195 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60
- 116 046927 ucggugcuuu u 71 <210> 196 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 196 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 197 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 197 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 198 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 198 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 199 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 199
- 117 046927 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 200 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 200 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 201 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 201 aacagcauag caaguugcgc uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 202 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 202 gccagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 203 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 118 046927 <400> 203 gccagcauag caaguugcgc uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 204 <211> 74 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 204 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu uuuu 74 <210> 205 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 205 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 206 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 206 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 207 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник
- 119 046927 <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 207 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 208 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 208 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 209 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 209 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 210 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 210 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 211 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность
- 120 046927 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 211 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 212 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 212 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 213 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 213 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 214 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 214 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 215 <211> 71 <212> РНК
- 121 046927 <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 215 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 216 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 216 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 217 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 217 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 218 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 218 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 219
- 122 046927 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 219 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 220 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 220 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 221 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 221 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 222 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 222 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71
- 123 046927 <210> 223 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 223 aacagcauag caaguugaga uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 224 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 224 aacagcauag caaguuaaag uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 225 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 225 aacagcauag caaguuaaga uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 226 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 226 aacagcauag caaguuagaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60
- 124 046927 ucggugcuuu u 71 <210> 227 <211> 71 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 227 aacagcauag caaguugaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 228 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 228 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 229 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 229 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 230 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 230
- 125 046927 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 231 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 231 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 232 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 232 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 233 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 233 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 234 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид
- 126 046927 <400> 234 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 235 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 235 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 236 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 236 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 237 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 237 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 238 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник
- 127 046927 <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 238 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 239 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 239 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 240 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 240 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 241 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 241 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 242 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность
- 128 046927 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 242 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 243 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 243 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 244 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 244 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 245 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 245 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 246 <211> 100 <212> РНК
- 129 046927 <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 246 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 247 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 247 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 248 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 248 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 249 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 249 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 250
- 130 046927 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 250 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 251 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 251 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 252 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 252 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 253 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 253 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
- 131 046927 <210> 254 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 254 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 255 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 255 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 256 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 256 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 257 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 257 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
- 132 046927 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 258 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 258 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 259 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 259 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 260 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 260 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 261 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 261
- 133 046927 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 262 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 262 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 263 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 263 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 264 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 264 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 265 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 134 046927 <400> 265 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 266 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 266 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 267 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 267 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 268 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 268 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 269 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник
- 135 046927 <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 269 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 270 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 270 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 271 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 271 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 272 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 272 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 273 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность
- 136 046927 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 273 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 274 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 274 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 275 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 275 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 276 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 276 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 277 <211> 80 <212> РНК
- 137 046927 <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 277 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 278 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 278 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 279 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 279 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 280 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 280 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 281
- 138 046927 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 281 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 282 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 282 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 283 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 283 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 284 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 284 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80
- 139 046927 <210> 285 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 285 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 286 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 286 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 287 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 287 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 288 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 288 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
- 140 046927 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 289 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 289 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 290 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 290 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 291 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 291 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 292 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 292
- 141 046927 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 293 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 293 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 294 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 294 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 295 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 295 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 296 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид
- 142 046927 <400> 296 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 297 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 297 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 298 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 298 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 299 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 299 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 300 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник
- 143 046927 <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 300 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 301 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 301 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 302 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 302 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 303 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 303 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 304 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность
- 144 046927 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 304 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 305 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 305 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 306 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 306 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 307 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 307 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 308 <211> 100 <212> РНК
- 145 046927 <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 308 cagggcucuu gaagaucucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 309 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 309 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 310 <211>80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>310 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 311 <211>80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 311 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 312
- 146 046927 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>312 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 313 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>313 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 314 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>314 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210>315 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>315 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80
- 147 046927 <210>316 <211>80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>316 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210>317 <211>80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>317 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 318 <211>80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>318 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210>319 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400>319 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
- 148 046927 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 320 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 320 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 321 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 321 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 322 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 322 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 323 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 323
- 149 046927 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 324 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 324 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 325 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 325 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 326 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 326 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 327 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 150 046927 <400> 327 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 328 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 328 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 329 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 329 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 330 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 330 cccauacucc uacagcacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 331 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник
- 151 046927 <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 331 cccauacucc uacagcacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 332 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 332 cccauacucc uacagcacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 333 <211> 24 <212> DNA <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический праймер <400> 333 agtcaataat cagaatcagc aggt 24 <210> 334 <211> 24 <212> DNA <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический праймер <400> 334 gttttgttcc agagtctatc accg 24 <210> 335 <211> 24 <212> DNA <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический праймер
- 152 046927 <400> 335 attaccagct tagcatcctg tgaa 24 <210> 336 <211> 24 <212> DNA <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический праймер <400> 336 agcacatgag accttctgtt tctc 24 <210> 337 <211> 27 <212> DNA <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический праймер <400> 337 agaaggcact tcttctttat ctaaggt 27 <210> 338 <211> 24 <212> DNA <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический праймер <400> 338 acacgaataa gagcaaatgg gaac 24 <210> 339 <211> 24 <212> DNA <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический праймер <400> 339 acacggttta tagagcaaga acac 24 <210> 340
- 153 046927 <211> 24 <212> DNA <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический праймер <400> 340 gacataggtg tgaccctcac aatc 24 <210> 341 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 341 ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 342 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 342 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 343 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 343 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 344
- 154 046927 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 344 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 345 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 345 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 346 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 346 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 347 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 347 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
- 155 046927 <210> 348 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 348 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 349 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 349 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 350 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 350 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 351 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 351 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
- 156 046927 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 352 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 352 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 353 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 353 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 354 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>
<221> разное <222> (1)..(20) <223> n является a, c, g, или u <400> 354 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 355 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность
- 157 046927 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 355 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 356 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 356 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 357 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>
<221> разное <222> (1)..(20) <223> n является a, c, g, или u <400> 357 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 358 <211> 100 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>
<221> модифицированное_основание
- 158 046927 <222> (1)..(3) <223> Модифицированные нуклеотиды 2'-O-Me <220>
<221> разное <222> (1)..(2) <223> Фосфоротиоатная связь <220>
<221> модифицированное_основание <222> (1)..(20) <223> N = любой нуклеотид <220>
<221> разное <222> (2)..(3) <223> Фосфоротиоатная связь <220>
<221> разное <222> (3)..(4) <223> Фосфоротиоатная связь <220>
<221> разное <222> (5)..(20) <223> n является a, c, g, или u <220>
<221> модифицированное_основание <222> (29)..(40) <223> Модифицированные нуклеотиды 2'-O-Me <220>
<221> модифицированное_основание <222> (69)..(100) <223> Модифицированные нуклеотиды 2'-O-Me <220>
<221> разное <222> (97)..(98) <223> Фосфоротиоатная связь <220>
<221> разное <222> (98)..(99) <223> Фосфоротиоатная связь <220>
<221> разное <222> (99)..(100) <223> Фосфоротиоатная связь <400> 358 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 359 <211> 4514 <212> РНК
- 159 046927 <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Транскрипция мРНК <400> 359 gggucccgca gucggcgucc agcggcucug cuuguucgug ugugugucgu ugcaggccuu 60 auucggaucc auggauaaga aguacucaau cgggcuggau aucggaacua auuccguggg 120 uugggcagug aucacggaug aauacaaagu gccguccaag aaguucaagg uccuggggaa 180 caccgauaga cacagcauca agaaaaaucu caucggagcc cugcuguuug acuccggcga 240 aaccgcagaa gcgacccggc ucaaacguac cgcgaggcga cgcuacaccc ggcggaagaa 300 ucgcaucugc uaucugcaag agaucuuuuc gaacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu 360 cuuccaccgc cuggaagaau cuuuccuggu ggaggaggac aagaagcaug aacggcaucc 420 uaucuuugga aacaucgucg acgaaguggc guaccacgaa aaguacccga ccaucuacca 480 ucugcggaag aaguugguug acucaacuga caaggccgac cucagauuga ucuacuuggc 540 ccucgcccau augaucaaau uccgcggaca cuuccugauc gaaggcgauc ugaacccuga 600 uaacuccgac guggauaagc uuuucauuca acuggugcag accuacaacc aacuguucga 660 agaaaaccca aucaaugcua gcggcgucga ugccaaggcc auccuguccg cccggcuguc 720 gaagucgcgg cgccucgaaa accugaucgc acagcugccg ggagagaaaa agaacggacu 780 uuucggcaac uugaucgcuc ucucacuggg acucacuccc aauuucaagu ccaauuuuga 840 ccuggccgag gacgcgaagc ugcaacucuc aaaggacacc uacgacgacg acuuggacaa 900 uuugcuggca caaauuggcg aucaguacgc ggaucuguuc cuugccgcua agaaccuuuc 960 ggacgcaauc uugcuguccg auauccugcg cgugaacacc gaaauaacca aagcgccgcu 1020 uagcgccucg augauuaagc gguacgacga gcaucaccag gaucucacgc ugcucaaagc 1080 gcucgugaga cagcaacugc cugaaaagua caaggagauc uucuucgacc aguccaagaa 1140 uggguacgca ggguacaucg auggaggcgc uagccaggaa gaguucuaua aguucaucaa 1200 gccaauccug gaaaagaugg acggaaccga agaacugcug gucaagcuga acagggagga 1260 ucugcuccgg aaacagagaa ccuuugacaa cggauccauu ccccaccaga uccaucuggg 1320 ugagcugcac gccaucuugc ggcgccagga ggacuuuuac ccauuccuca aggacaaccg 1380 ggaaaagauc gagaaaauuc ugacguuccg caucccguau uacgugggcc cacuggcgcg 1440 cggcaauucg cgcuucgcgu ggaugacuag aaaaucagag gaaaccauca cuccuuggaa 1500 uuucgaggaa guuguggaua agggagcuuc ggcacaaagc uucaucgaac gaaugaccaa 1560 cuucgacaag aaucucccaa acgagaaggu gcuuccuaag cacagccucc uuuacgaaua 1620 cuucacuguc uacaacgaac ugacuaaagu gaaauacguu acugaaggaa ugaggaagcc 1680
- 160 046927 ggccuuucug uccggagaac agaagaaagc aauugucgau cugcuguuca agaccaaccg 1740 caaggugacc gucaagcagc uuaaagagga cuacuucaag aagaucgagu guuucgacuc 1800 aguggaaauc agcggggugg aggacagauu caacgcuucg cugggaaccu aucaugaucu 1860 ccugaagauc aucaaggaca aggacuuccu ugacaacgag gagaacgagg acauccugga 1920 agauaucguc cugaccuuga cccuuuucga ggaucgcgag augaucgagg agaggcuuaa 1980 gaccuacgcu caucucuucg acgauaaggu caugaaacaa cucaagcgcc gccgguacac 2040 ugguuggggc cgccucuccc gcaagcugau caacgguauu cgcgauaaac agagcgguaa 2100 aacuauccug gauuuccuca aaucggaugg cuucgcuaau cguaacuuca ugcaauugau 2160 ccacgacgac agccugaccu uuaaggagga cauccaaaaa gcacaagugu ccggacaggg 2220 agacucacuc caugaacaca ucgcgaaucu ggccgguucg ccggcgauua agaagggaau 2280 ucugcaaacu gugaaggugg ucgacgagcu ggugaagguc augggacggc acaaaccgga 2340 gaauaucgug auugaaaugg cccgagaaaa ccagacuacc cagaagggcc agaaaaacuc 2400 ccgcgaaagg augaagcgga ucgaagaagg aaucaaggag cugggcagcc agauccugaa 2460 agagcacccg guggaaaaca cgcagcugca gaacgagaag cucuaccugu acuauuugca 2520 aaauggacgg gacauguacg uggaccaaga gcuggacauc aaucgguugu cugauuacga 2580 cguggaccac aucguuccac aguccuuucu gaaggaugac ucgaucgaua acaagguguu 2640 gacucgcagc gacaagaaca gagggaaguc agauaaugug ccaucggagg aggucgugaa 2700 gaagaugaag aauuacuggc ggcagcuccu gaaugcgaag cugauuaccc agagaaaguu 2760 ugacaaucuc acuaaagccg agcgcggcgg acucucagag cuggauaagg cuggauucau 2820 caaacggcag cuggucgaga cucggcagau uaccaagcac guggcgcaga ucuuggacuc 2880 ccgcaugaac acuaaauacg acgagaacga uaagcucauc cgggaaguga aggugauuac 2940 ccugaaaagc aaacuugugu cggacuuucg gaaggacuuu caguuuuaca aagugagaga 3000 aaucaacaac uaccaucacg cgcaugacgc auaccucaac gcuguggucg guaccgcccu 3060 gaucaaaaag uacccuaaac uugaaucgga guuuguguac ggagacuaca aggucuacga 3120 cgugaggaag augauagcca aguccgaaca ggaaaucggg aaagcaacug cgaaauacuu 3180 cuuuuacuca aacaucauga acuuuuucaa gacugaaauu acgcuggcca auggagaaau 3240 caggaagagg ccacugaucg aaacuaacgg agaaacgggc gaaaucgugu gggacaaggg 3300 cagggacuuc gcaacuguuc gcaaagugcu cucuaugccg caagucaaua uugugaagaa 3360 aaccgaagug caaaccggcg gauuuucaaa ggaaucgauc cucccaaaga gaaauagcga 3420 caagcucauu gcacgcaaga aagacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgauucgcc 3480 gacugucgca uacuccgucc ucgugguggc caagguggag aagggaaaga gcaaaaagcu 3540
- 161 046927 caaauccguc aaagagcugc uggggauuac caucauggaa cgauccucgu ucgagaagaa 3600 cccgauugau uuccucgagg cgaaggguua caaggaggug aagaaggauc ugaucaucaa 3660 acuccccaag uacucacugu ucgaacugga aaauggucgg aagcgcaugc uggcuucggc 3720 cggagaacuc caaaaaggaa augagcuggc cuugccuagc aaguacguca acuuccucua 3780 ucuugcuucg cacuacgaaa aacucaaagg gucaccggaa gauaacgaac agaagcagcu 3840 uuucguggag cagcacaagc auuaucugga ugaaaucauc gaacaaaucu ccgaguuuuc 3900 aaagcgcgug auccucgccg acgccaaccu cgacaaaguc cugucggccu acaauaagca 3960 uagagauaag ccgaucagag aacaggccga gaacauuauc cacuuguuca cccugacuaa 4020 ccugggagcc ccagccgccu ucaaguacuu cgauacuacu aucgaucgca aaagauacac 4080 guccaccaag gaaguucugg acgcgacccu gauccaccaa agcaucacug gacucuacga 4140 aacuaggauc gaucugucgc agcugggugg cgauggcggu ggaucuccga aaaagaagag 4200 aaagguguaa ugagcuagcc aucacauuua aaagcaucuc agccuaccau gagaauaaga 4260 gaaagaaaau gaagaucaau agcuuauuca ucucuuuuuc uuuuucguug guguaaagcc 4320 aacacccugu cuaaaaaaca uaaauuucuu uaaucauuuu gccucuuuuc ucugugcuuc 4380 aauuaauaaa aaauggaaag aaccucgaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaau cuag 4514 <210> 360 <211> 4603 <212> РНК <213> Искусственная Последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание Искусственной Последовательности: Транскрипция мРНК <400> 360 gggucccgca gucggcgucc agcggcucug cuuguucgug ugugugucgu ugcaggccuu 60 auucggaucc auggauaaga aguacucaau cgggcuggau aucggaacua auuccguggg 120 uugggcagug aucacggaug aauacaaagu gccguccaag aaguucaagg uccuggggaa 180 caccgauaga cacagcauca agaaaaaucu caucggagcc cugcuguuug acuccggcga 240 aaccgcagaa gcgacccggc ucaaacguac cgcgaggcga cgcuacaccc ggcggaagaa 300 ucgcaucugc uaucugcaag agaucuuuuc gaacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu 360 cuuccaccgc cuggaagaau cuuuccuggu ggaggaggac aagaagcaug aacggcaucc 420 uaucuuugga aacaucgucg acgaaguggc guaccacgaa aaguacccga ccaucuacca 480
- 162 046927 ucugcggaag aaguugguug acucaacuga caaggccgac cucagauuga ucuacuuggc 540 ccucgcccau augaucaaau uccgcggaca cuuccugauc gaaggcgauc ugaacccuga 600 uaacuccgac guggauaagc uuuucauuca acuggugcag accuacaacc aacuguucga 660 agaaaaccca aucaaugcua gcggcgucga ugccaaggcc auccuguccg cccggcuguc 720 gaagucgcgg cgccucgaaa accugaucgc acagcugccg ggagagaaaa agaacggacu 780 uuucggcaac uugaucgcuc ucucacuggg acucacuccc aauuucaagu ccaauuuuga 840 ccuggccgag gacgcgaagc ugcaacucuc aaaggacacc uacgacgacg acuuggacaa 900 uuugcuggca caaauuggcg aucaguacgc ggaucuguuc cuugccgcua agaaccuuuc 960 ggacgcaauc uugcuguccg auauccugcg cgugaacacc gaaauaacca aagcgccgcu 1020 uagcgccucg augauuaagc gguacgacga gcaucaccag gaucucacgc ugcucaaagc 1080 gcucgugaga cagcaacugc cugaaaagua caaggagauc uucuucgacc aguccaagaa 1140 uggguacgca ggguacaucg auggaggcgc uagccaggaa gaguucuaua aguucaucaa 1200 gccaauccug gaaaagaugg acggaaccga agaacugcug gucaagcuga acagggagga 1260 ucugcuccgg aaacagagaa ccuuugacaa cggauccauu ccccaccaga uccaucuggg 1320 ugagcugcac gccaucuugc ggcgccagga ggacuuuuac ccauuccuca aggacaaccg 1380 ggaaaagauc gagaaaauuc ugacguuccg caucccguau uacgugggcc cacuggcgcg 1440 cggcaauucg cgcuucgcgu ggaugacuag aaaaucagag gaaaccauca cuccuuggaa 1500 uuucgaggaa guuguggaua agggagcuuc ggcacaaagc uucaucgaac gaaugaccaa 1560 cuucgacaag aaucucccaa acgagaaggu gcuuccuaag cacagccucc uuuacgaaua 1620 cuucacuguc uacaacgaac ugacuaaagu gaaauacguu acugaaggaa ugaggaagcc 1680 ggccuuucug uccggagaac agaagaaagc aauugucgau cugcuguuca agaccaaccg 1740 caaggugacc gucaagcagc uuaaagagga cuacuucaag aagaucgagu guuucgacuc 1800 aguggaaauc agcggggugg aggacagauu caacgcuucg cugggaaccu aucaugaucu 1860 ccugaagauc aucaaggaca aggacuuccu ugacaacgag gagaacgagg acauccugga 1920 agauaucguc cugaccuuga cccuuuucga ggaucgcgag augaucgagg agaggcuuaa 1980 gaccuacgcu caucucuucg acgauaaggu caugaaacaa cucaagcgcc gccgguacac 2040 ugguuggggc cgccucuccc gcaagcugau caacgguauu cgcgauaaac agagcgguaa 2100 aacuauccug gauuuccuca aaucggaugg cuucgcuaau cguaacuuca ugcaauugau 2160 ccacgacgac agccugaccu uuaaggagga cauccaaaaa gcacaagugu ccggacaggg 2220 agacucacuc caugaacaca ucgcgaaucu ggccgguucg ccggcgauua agaagggaau 2280 ucugcaaacu gugaaggugg ucgacgagcu ggugaagguc augggacggc acaaaccgga 2340
- 163 046927 gaauaucgug auugaaaugg cccgagaaaa ccagacuacc cagaagggcc agaaaaacuc 2400 ccgcgaaagg augaagcgga ucgaagaagg aaucaaggag cugggcagcc agauccugaa 2460 agagcacccg guggaaaaca cgcagcugca gaacgagaag cucuaccugu acuauuugca 2520 aaauggacgg gacauguacg uggaccaaga gcuggacauc aaucgguugu cugauuacga 2580 cguggaccac aucguuccac aguccuuucu gaaggaugac ucgaucgaua acaagguguu 2640 gacucgcagc gacaagaaca gagggaaguc agauaaugug ccaucggagg aggucgugaa 2700 gaagaugaag aauuacuggc ggcagcuccu gaaugcgaag cugauuaccc agagaaaguu 2760 ugacaaucuc acuaaagccg agcgcggcgg acucucagag cuggauaagg cuggauucau 2820 caaacggcag cuggucgaga cucggcagau uaccaagcac guggcgcaga ucuuggacuc 2880 ccgcaugaac acuaaauacg acgagaacga uaagcucauc cgggaaguga aggugauuac 2940 ccugaaaagc aaacuugugu cggacuuucg gaaggacuuu caguuuuaca aagugagaga 3000 aaucaacaac uaccaucacg cgcaugacgc auaccucaac gcuguggucg guaccgcccu 3060 gaucaaaaag uacccuaaac uugaaucgga guuuguguac ggagacuaca aggucuacga 3120 cgugaggaag augauagcca aguccgaaca ggaaaucggg aaagcaacug cgaaauacuu 3180 cuuuuacuca aacaucauga acuuuuucaa gacugaaauu acgcuggcca auggagaaau 3240 caggaagagg ccacugaucg aaacuaacgg agaaacgggc gaaaucgugu gggacaaggg 3300 cagggacuuc gcaacuguuc gcaaagugcu cucuaugccg caagucaaua uugugaagaa 3360 aaccgaagug caaaccggcg gauuuucaaa ggaaucgauc cucccaaaga gaaauagcga 3420 caagcucauu gcacgcaaga aagacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgauucgcc 3480 gacugucgca uacuccgucc ucgugguggc caagguggag aagggaaaga gcaaaaagcu 3540 caaauccguc aaagagcugc uggggauuac caucauggaa cgauccucgu ucgagaagaa 3600 cccgauugau uuccucgagg cgaaggguua caaggaggug aagaaggauc ugaucaucaa 3660 acuccccaag uacucacugu ucgaacugga aaauggucgg aagcgcaugc uggcuucggc 3720 cggagaacuc caaaaaggaa augagcuggc cuugccuagc aaguacguca acuuccucua 3780 ucuugcuucg cacuacgaaa aacucaaagg gucaccggaa gauaacgaac agaagcagcu 3840 uuucguggag cagcacaagc auuaucugga ugaaaucauc gaacaaaucu ccgaguuuuc 3900 aaagcgcgug auccucgccg acgccaaccu cgacaaaguc cugucggccu acaauaagca 3960 uagagauaag ccgaucagag aacaggccga gaacauuauc cacuuguuca cccugacuaa 4020 ccugggagcc ccagccgccu ucaaguacuu cgauacuacu aucgaucgca aaagauacac 4080 guccaccaag gaaguucugg acgcgacccu gauccaccaa agcaucacug gacucuacga 4140 aacuaggauc gaucugucgc agcugggugg cgauggcucg gcuuacccau acgacgugcc 4200
- 164 -
Claims (32)
- ugacuacgcc ucgcucggau cgggcucccc caaaaagaaa cggaaggugg acggaucccc 4260 gaaaaagaag agaaaggugg acuccggaug agaauuaugc agucuagcca ucacauuuaa 4320 aagcaucuca gccuaccaug agaauaagag aaagaaaaug aagaucaaua gcuuauucau 4380 cucuuuuucu uuuucguugg uguaaagcca acacccuguc uaaaaaacau aaauuucuuu 4440 aaucauuuug ccucuuuucu cugugcuuca auuaauaaaa aauggaaaga accucgagaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaauc uag 4603ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Одиночная направляющая РНК (sgPHK), содержащая:(i) 2'-O-метил (2'-O-Me) модификации в каждом из нуклеотидов в области верхнего стебля и 2'-OMe модификации в каждом из нуклеотидов в области шпильки 2; и (ii) 5'-концевую модификацию;причем 5'-концевая модификация содержит по меньшей мере две фосфоротиоатных (PS) связи в пределах первых семи нуклеотидов на 5'-конце 5'-концевой области.
- 2. sgPHK по п.1, отличающаяся тем, что sgPHK дополнительно содержит одну или более модификаций в области шпильки 1.
- 3. sgPHK по п.1 или 2, отличающаяся тем, что дополнительно содержит область нижнего стебля, содержащую модификацию.
- 4. sgPHK по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что дополнительно содержит 3'-концевую область, содержащую модификацию, необязательно где модификация в 3'-концевой области представляет собой 3'-концевую модификацию.
- 5. sgPHK по п.4, отличающаяся тем, что по меньшей мере два из последних четырех нуклеотидов на 3'-конце 3'-концевой области являются модифицированными, необязательно 2'-O-Me, 2'-F или 2'-O-moe.
- 6. sgPHK по п.4 или 5, отличающаяся тем, что дополнительно содержит фосфоротиоатные (PS) связи между одним или более из последних четырех нуклеотидов на 3'-конце 3'-концевой области.
- 7. sgPHK по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что дополнительно содержит область расширения, содержащую модификацию, и/или область связки, содержащую модификацию.
- 8. sgPHK по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что указанная модификация содержит 2'-Oметил (2'-O-Me) модифицированный нуклеотид и/или 2'-фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид и/или фосфоротиоатную (PS) связь между нуклеотидами.
- 9. sgPHK по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что по меньшей мере первые три нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и последние три нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области являются модифицированными, необязательно где первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области соединены фосфоротиоатными (PS) связями, необязательно где концевые модификации включают 2'-O-Me или 2'-F.
- 10. sgPHK по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'концевой области и последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области соединены PS связью, а первые три нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и последние три нуклеотида на 3'-конце 3'концевой области содержат 2'-O-Me модификации.
- 11. sgPHK по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'концевой области и последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области соединены PS связью, а первые три нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'концевой области содержат 2'-O-Me модификации.
- 12. sgPHK по любому из пп.1-11, отличающаяся тем, что первые четыре нуклеотида в 5'-концевой области и последние четыре нуклеотида в 3'-концевой области соединены PS связью, а первые три нуклеотида в 5'-концевой области и последние три нуклеотида в 3'-концевой области содержат 2'-O-Me, 2'-F и/или 2'-O-moe модификации.
- 13. sgPHK по любому из пп.1-12, отличающаяся тем, что (1) область нижнего стебля содержит нуклеотиды от LS1 до LS12 от 5' к 3', и LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 и/или LS12 модифицированы 2'-O-Ме; и/или (2) каждый из нуклеотидов в области расширения модифицирован 2'-О-Ме; и/или (3) по меньшей мере 50% нуклеотидов в области расширения модифицированы 2'-O-Me.- 165 046927
- 14. sgPHK по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что область связки содержит нуклеотиды от N1 до N18 от 5' к 3', и отличающаяся тем, что N16, N17 и/или N18 в области связки и/или N15, N16, N17 и/или N18 в области связки являются модифицированными, необязательно где модификации в области связки выбраны из 2'-O-Me и 2'F, и необязательно где N16, N17 и N18 соединены PS связями.
- 15. sgPHK по любому из пп.1-14, отличающаяся тем, что каждый из нуклеотидов в области шпильки 1 модифицирован 2'-O-Me.
- 16. sgPHK по п.1, отличающаяся тем, что область верхнего стебля содержит нуклеотиды от US1 до US12, область шпильки 1 содержит нуклеотиды от H1-1 до H1-12, и область шпильки 2 содержит нуклеотиды от H2-1 до H2-15, от 5' к 3', и отличающаяся тем, что содержит:a) 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах на 5'-конце 5'-концевой области;b) 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в положениях H1-1 -H1-12;c) 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в последних четырех нуклеотидах на 3'-конце 3'концевой области.
- 17. sgPHK по п.16, отличающаяся тем, что дополнительно содержит три фосфоротиоатные (PS) связи, соединяющие первые четыре нуклеотида на 5'-конце 5'-концевой области и три PS связи, соединяющие последние четыре нуклеотида на 3'-конце 3'-концевой области.
- 18. sgPHK, содержащая GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 355), где нуклеотиды SEQ ID NO: 355 модифицированы в соответствии с паттерном модификации sgPHK по любому из пп.1-17.
- 19. sgPHK по п.1, содержащаяGUUUUAG7\mGmCmUmJ\mGmJWW\mUmJ\mGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAJiAmC mUmUmGmAmi\iiiAm7\iiiAmGmUmGmGmCiiiAmCmCmGiiiAmGmUmCmGmGmUmGmCmU * mU * mU * mU (SEQ ID NO: 356), где U* обозначает, что нуклеотид связан со следующим нуклеотидом PS связью, a mA, mG, mC или mU обозначают, что нуклеотид модифицирован 2'-O-Me.
- 20. sgPHK по п.1, где указанная sgPHK содержит любую из SEQ ID NO: 240 или 331.
- 21. sgPHK по п.1, содержащая mU* mU* mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmG mUmCmGmGmUmGmCmU * mU * mU * mU (SEQ ID No: 242); или mN * mN * mN * NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUA AAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmG mUmCmGmGmUmGmCmU * mU * mU * mU (SEQ ID NO: 358), где N* или U* обозначают, что нуклеотид связан со следующим нуклеотидом PS связью, a mA, mG, mC или mU обозначают, что нуклеотид модифицирован 2'-O-Me, где N представляет собой любой нуклеотид.
- 22. sgPHK по любому из пп.1-21, отличающаяся тем, что sgPHK образует рибонуклеопротеиновый комплекс с Cas9 S. pyogenes.
- 23. sgPHK по п.1, отличающаяся тем, что sgPHK содержит 2'-О-Me модификации в каждом нуклеотиде, начиная от H2-1 и до последнего нуклеотида 3'-концевой области, или состоит из них, где H2-1 представляет собой первый нуклеотид области шпильки 2 от 5' к 3'.
- 24. sgPHK по любому из пп.1-23, содержащая нуклеотиды SEQ ID NO: 357.
- 25. sgPHK по п.1, содержащая 2'-O-Me модифицированные нуклеотиды в:a) первых трех нуклеотидах на 5'-конце 5'-концевой области;b) каждом нуклеотиде в области шпильки 1;c) нуклеотиде между шпилькой 1 и шпилькой 2; иd) последних четырех нуклеотидах на 3'-конце 3'-концевой области.
- 26. Композиция для модификации ДНК-мишени, содержащая sgPHK по любому из пп.1-25, ассоциированную с липидной наночастицей (LNP).
- 27. Композиция для модификации ДНК-мишени, содержащая sgPHK по любому из пп.1-25, дополнительно содержащая нуклеазу или мРНК, кодирующую нуклеазу.
- 28. Композиция по п.27, отличающаяся тем, что нуклеаза является белком Cas.
- 29. Композиция по п.28, отличающаяся тем, что белок Cas является Cas9.
- 30. Композиция по п.29, отличающаяся тем, что Cas9 является Cas9 S. pyogenes.
- 31. Композиция по любому из пп.27-30, отличающаяся тем, что нуклеаза является никазой, и/или где нуклеаза является модифицированной, необязательно где модифицированная нуклеаза содержит сигнал ядерной локализации (NLS).
- 32. Фармацевтический состав, содержащий sgPHK по любому из пп.1-25 или композицию по лю- 166 -
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/431,756 | 2016-12-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA046927B1 true EA046927B1 (ru) | 2024-05-13 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102595683B1 (ko) | 변형된 가이드 rna | |
| US20210087568A1 (en) | Modified Guide RNAs for Gene Editing | |
| JP2023088933A (ja) | Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ構成成分のための脂質ナノ粒子製剤 | |
| AU2019312269A1 (en) | Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof | |
| CN114207130A (zh) | 用于从白蛋白基因座进行转基因表达的组合物和方法 | |
| CN115176001A (zh) | 用于基因编辑的修饰的引导rna | |
| JP2024522176A (ja) | 遺伝子編集用内部リンカーを含む修飾ガイドｒｎａ | |
| KR20220122727A (ko) | Rna의 표적 편집을 위한 신규한 방법 | |
| EP4096681A1 (en) | Delivery of compositions comprising circular polyribonucleotides | |
| JP2024531486A (ja) | 環状ｒｎａを調製するための構築物及び方法 | |
| EA046927B1 (ru) | Модифицированные направляющие рнк | |
| US20240285805A1 (en) | Dna compositions comprising modified uracil | |
| WO2024145248A1 (en) | Compositions and methods for generating circular rna | |
| TW202334419A (zh) | 用於基因編輯之經修飾引導rna | |
| WO2024003805A1 (en) | Methods and compositions for ttr gene editing and therapy using crispr system | |
| WO2018223843A1 (zh) | 用于dna编辑的系统及其应用 | |
| WO2023220729A2 (en) | Double stranded dna compositions and related methods | |
| WO2024220712A2 (en) | Vaccine compositions | |
| CN118613585A (zh) | 用于基因编辑的修饰的引导rna | |
| CN118291452A (zh) | 一种基于i型内含子核酶体外制备环状rna的系统及其应用 |