JP2022512726A - 核酸構築物及び使用方法 - Google Patents

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Abstract

導入遺伝子などの目的の配列の挿入及び／または発現を可能にする核酸構築物が提供される。例えば、ポリペプチドまたは治療用薬剤の発現のためにそのような構築物を使用する組成物及び方法もまた提供される。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１８年１０月１８日に出願された米国仮出願第６２／７４７，３９３号、及び２０１９年４月２９日に出願された米国仮出願第６２／８４０，３４３号から優先権の利益を主張する。前述の出願の各々の明細書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
遺伝子療法アプローチにおけるゲノム編集は、欠損またはそうでなければ損なわれた遺伝子材料の外因性導入が遺伝子疾患を是正することができるという考えから起こる。遺伝子療法は、開業医がヒト疾患にどのようにアプローチし、治療するかにおけるその非常に大きな可能性について長い間認識されてきた。薬物または手術に依存する代わりに、根底にある遺伝的要因を有する患者は、根底にある原因を直接標的とすることによって治療され得る。さらに、根底にある遺伝的原因を標的とすることによって、遺伝子療法は、患者を効果的に治癒させる可能性を有し得る。しかし、既存のアプローチの臨床応用は、いくつかの側面において改善が依然として必要である。
本開示は、目的の核酸配列の増強された挿入及び発現を可能にする双方向性核酸構築物であって、例えば、ポリペプチドなどの治療用薬剤をコードする、双方向性核酸構築物を提供する。本明細書に記載されるように、双方向性構築物は、少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、目的の薬剤をコードするコード配列（コード配列は、本明細書では「導入遺伝子」または第１の導入遺伝子と称され得る）を含むが、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が目的の薬剤をコードする配列、すなわち、第２の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、構築物は、少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、目的のポリペプチドをコードするコード配列を含むが、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が目的のポリペプチドをコードする配列を含む。遺伝子編集系と組み合わせて使用した場合、核酸構築物の双方向性は、構築物を標的挿入部位内のいずれかの方向（１つの方向への挿入に限定されない）で挿入することを可能にし、本明細書に例示されるように、ａ）一方のセグメントのコード配列、またはｂ）他方の（第２の）セグメントの相補体のいずれかから目的のポリペプチドの発現を可能にし、それによって、挿入及び発現効率を向上させる。
ＡＡＶゲノムに表される構築物フォーマットを示す。ＳＡ＝スプライスアクセプター、ｐＡ＝ポリＡシグナル配列、ＨＡ＝相同性アーム、ＬＨＡ＝左相同性アーム、ＲＨＡ＝右相同性アーム。 相同性アームを有さないベクターが、不死化肝臓細胞株（Ｈｅｐａ１－６）において有効ではないことを示す。２００ｂｐの相同性アームを含むプラスミドＰ００２０４に由来するｓｃＡＡＶは、この細胞株において検出可能なｈＦＩＸの発現をもたらした。Ｐ００１２３（相同性アームを欠くｓｃＡＡＶ）及びＰ００１４７（相同性アームを欠くｓｓＡＡＶ双方向性構築物）に由来するＡＡＶベクターの使用は、ｈＦＩＸの検出可能な発現をもたらさなかった。 Ｐ００１２３、Ｐ００１４７、またはＰ００２０４に由来するベクターを使用した相同性アームあり及びなしの挿入テンプレートのインビボ試験の結果を示す。Ａは、約６０％のインデル形成によって測定された肝臓編集レベルが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系成分を含むＬＮＰで処置された動物の各群において検出されたことを示す。Ｂは、ＬＮＰ処置と組み合わせた相同性アームなしのｓｓＡＡＶベクター（Ｐ００１４７に由来する）を受けている動物が、血清において最高レベルのｈＦＩＸ発現をもたらしたことを示す。 相同性アームあり及びなしのｓｓＡＡＶ挿入テンプレートのインビボ試験の結果を示す。標的挿入を、プラスミドＰ００３５０、Ｐ００３５６、Ｐ００３６２（示されるような非対称相同性アームを有する）、及びＰ００１４７（Ｂに示されるような双方向性構築物）に由来するベクターと比較する。 相同性アームあり及びなしのｓｓＡＡＶ挿入テンプレートのインビボ試験の結果を示す。標的化された第２の部位への挿入を、プラスミドＰ００３５３、Ｐ００３５４（示されるような対称相同性アームを有する）、及びＰ００１４７に由来するベクターと比較する。 初代マウス肝細胞における２０個の標的部位にわたる３つの双方向性構築物による標的挿入の結果を示す。試験したベクターの各々の概略図を示す。 初代マウス肝細胞における２０個の標的部位にわたる３つの双方向性構築物による標的挿入の結果を示す。試験した各組み合わせにわたる処置群の各々について、インデル形成によって測定された編集を示す。 初代マウス肝細胞における２０個の標的部位にわたる３つの双方向性構築物による標的挿入の結果を示す。有意なレベルの編集（特定の標的部位での）が、必ずしも導入遺伝子のより効率的な挿入または発現をもたらさなかったことを示す。試験した構築物は、この標的挿入研究において導入遺伝子発現を効果的にもたらした。ｈＳＡ＝ヒトＦ９スプライスアクセプター、ｍＳＡ＝マウスアルブミンスプライスアクセプター、ＨｉＢｉｔ＝ルシフェラーゼに基づく検出のためのタグ、ｐＡ＝ポリＡシグナル配列、Ｎｌｕｃ＝ナノルシフェラーゼレポーター、ＧＦＰ＝緑色蛍光レポーター。 初代マウス肝細胞における２０個の標的部位にわたる３つの双方向性構築物による標的挿入の結果を示す。有意なレベルの編集（特定の標的部位での）が、必ずしも導入遺伝子のより効率的な挿入または発現をもたらさなかったことを示す。試験した構築物は、この標的挿入研究において導入遺伝子発現を効果的にもたらした。ｈＳＡ＝ヒトＦ９スプライスアクセプター、ｍＳＡ＝マウスアルブミンスプライスアクセプター、ＨｉＢｉｔ＝ルシフェラーゼに基づく検出のためのタグ、ｐＡ＝ポリＡシグナル配列、Ｎｌｕｃ＝ナノルシフェラーゼレポーター、ＧＦＰ＝緑色蛍光レポーター。 Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを用いる１０の標的部位にわたる双方向性構築物による標的挿入のインビボスクリーニングの結果を示す。示されるように、著しいレベルの編集は、必ずしも高レベルの導入遺伝子発現をもたらすものではない。 図７Ａ～図７Ｄは、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを使用する２０の標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニングの結果を示す。Ａは、試験した各ＬＮＰ／ベクターの組み合わせの、処置群の各々について検出された編集を示す。 図７Ａ～図７Ｄは、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを使用する２０の標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニングの結果を示す。Ｂは、対応する標的挿入データを提供する。結果は、編集と双方向性構築物の挿入／発現との間の不十分な相関を示す。 図７Ａ～図７Ｄは、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを使用する２０の標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニングの結果を示す。Ｃでは、結果は、インビトロ結果とインビボ結果との間の正の相関を示す。 図７Ａ～図７Ｄは、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを使用する２０の標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニングの結果を示す。Ｄでは、結果は、編集と双方向性構築物の挿入／発現との間の不十分な相関を示す。 ｈＦＩＸ導入遺伝子とマウスアルブミンエクソン１配列との間の接合部を検出することができるプローブを使用するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を使用して、細胞レベルでの双方向性構築物の挿入を示す。 循環ｈＦＩＸレベルは、ハイブリッド転写産物に対して陽性であった細胞の数と相関していた。 インビボでのｈＦＩＸ発現の耐久性を示す。 アルブミンのイントロン１からの発現が維持されたことを示す。 ＡＡＶまたはＬＮＰ用量を変化させることにより、インビボでのアルブミン遺伝子のイントロン１からのｈＦＩＸの発現の量を調節することができることを示す。 ＡＡＶまたはＬＮＰ用量を変化させることにより、インビボでのアルブミン遺伝子のイントロン１からのｈＦＩＸの発現の量を調節することができることを示す。 初代カニクイザル肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。試料の各々について検出されたインデル形成によって測定された様々なレベルの編集を示す。 初代カニクイザル肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミンのイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。 初代カニクイザル肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミンのイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。 初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。試料の各々について検出されたインデル形成によって測定された編集を示す。 初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミン遺伝子のイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。 初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミン遺伝子のイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。 著しいレベルのインデル形成が、アルブミン遺伝子のイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。 非ヒト霊長類が双方向性ｈＦＩＸ挿入テンプレート（Ｐ００１４７に由来する）と共にＬＮＰを投与されたインビボ研究の結果を示す。全身ｈＦＩＸレベルは、ＡＡＶまたはＬＮＰ単独を使用して検出可能なｈＦＩＸがない、ＬＮＰ及びＡＡＶの両方で処置された動物においてのみ達成された。
ここで、本発明の特定の実施形態を詳細に参照し、本発明の実施形態の例は添付の図面で例示される。本教示は様々な実施形態と併せて説明されるが、それは本教示をそれらの実施形態に限定することを意図するものではない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替物、改変物、及び均等物を包含する。
本教示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、したがって変化し得ると理解されるべきである。本明細書及び添付の請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途指示しない限り、複数の参照物を含めることに留意されたい。したがって、例えば、「複合体（ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」への言及は、複数の複合体を含み、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞などを含む。本明細書で使用される「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語及びその文法上の変形は、リスト内の項目の列挙が、リストされた項目に置換または追加することができる他の同様の項目を除外しないように、非限定的であることを意図する。
数値範囲には、その範囲を定義する数値が含まれる。測定値及び測定可能な値は、有効桁及び測定に関連する誤差を考慮して、おおよその値であると理解される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。上述の概略的な説明と、詳細な説明はいずれも例示であり、単に説明するためのものであり、その教示を限定するものではないことが理解されるべきである。
本明細書に特に記載されていない限り、様々な構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「からなる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「から本質的になる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれらを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ものであると想定される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「または」という用語は、文脈が別途明確に示さない限り、包括的な意味で、すなわち、「及び／または」に等しい意味で使用される。「約」という用語は、リストの前に使用される場合、リストの各要素を修飾する。「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるかに部分的に依存する。
本明細書で使用される章の見出しは、構成的な目的のみのためであり、所望の主題を決して限定するものとして解釈されるべきではない。参照により組み込まれる任意の資料が、本明細書で定義される任意の用語または本明細書の任意の他の明示的な内容と矛盾する場合、本明細書が優先する。
Ｉ．定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び句は、以下の意味を有することを意図する。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、骨格に沿って一緒に連結された窒素系複素環式塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログ（従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、及びそれらのアナログであるポリマーを含む）を含む多量体化合物を指すために本明細書で使用される。核酸「骨格」は、糖ホスホジエステル連結、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ、ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な連結から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または任意の置換、例えば、２’メトキシまたは２’ハロゲン化物置換を有する類似の化合物であり得る。窒素系塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、そのアナログ（例えば、５－メトキシウリジン、シュードウリジン、もしくはＮ１－メチルシュードウリジンなどの修飾ウリジン、またはその他のもの）、イノシン、プリンもしくはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－もしくはアザ－プリン、デアザ－もしくはアザ－ピリミジン、５位もしくは６位に置換基を有するピリミジン塩基（例えば、５－メチルシトシン）、２、６、もしくは８位に置換基を有するプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、及びＯ４－アルキル－ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号及びＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）であってもよい。一般的な考察については、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２を参照されたい）。核酸は、骨格がポリマーの位置（複数可）に窒素系塩基を含まない１つ以上の「脱塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡもしくはＤＮＡ糖、塩基、及び連結のみを含んでもよく、または従来の構成要素及び置換の両方（例えば、２’メトキシ置換基を有する従来のヌクレオシド、または従来のヌクレオチド及び１つ以上のヌクレオチドアナログの両方を含むポリマー）を含むことができる。核酸は、ＲＮＡ模倣糖構造にロックされた二環式フラノース単位を有し、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有するアナログである「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含む（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３－４１）。ＲＮＡ及びＤＮＡは異なる糖部分を有し、ＲＮＡ内のウラシルもしくはそのアナログ及びＤＮＡ内のチミンもしくはそのアナログの存在によって異なり得る。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び単に「ガイド」は、ガイド配列、例えば、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとしても知られる）を含むガイド、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの組み合わせ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）のいずれかを指すために、本明細書で互換的に使用される。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として会合し得るか、または例えば、２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）において会合し得る。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、各種類を指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列、または天然に存在する配列と比較して修飾もしくは変異を有するｔｒＲＮＡ配列であり得る。ＳｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡなどのガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるような修飾ＲＮＡを含み得る。
本明細書で使用される場合、「ガイド配列」は、標的配列に対して相補的であり、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤による結合または修飾（例えば、切断）のための標的配列に対してガイドＲＮＡを指向させるように機能する、ガイドＲＮＡ内の配列を指す。「ガイド配列」は、「標的化配列」または「スペーサー配列」とも称され得る。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）及び関連するＣａｓ９ホモログ／オルソログの場合、２０塩基対の長さであり得る。例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長のような、より短い配列またはより長い配列もまたガイドとして使用することができる。いくつかの実施形態では、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、ガイド配列に対して相補的である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、少なくとも１個のミスマッチを含んでもよい。例えば、ガイド配列及び標的配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含んでもよく、標的配列の全長は、少なくとも１７、１８、１９、２０個以上の塩基対である。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１～４個のミスマッチを含んでもよく、ガイド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１、２、３、または４個のミスマッチを含んでもよく、ガイド配列は、２０個のヌクレオチドを含む。
ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の核酸基質は二本鎖核酸であるので、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の標的配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖（すなわち、与えられる配列と、配列の逆相補体）の両方を含む。したがって、ガイド配列が、「標的配列に対して相補的」であると言われる場合、標的配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖（例えば、逆相補体）に結合するようにガイドＲＮＡを指向させ得ると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、ガイド配列が、標的配列の逆相補体に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列におけるＵのＴへの置換を除いて、標的配列の特定のヌクレオチド（例えばＰＡＭを含まない標的配列）と同一である。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤」は、ＲＮＡ及びＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ＤＮＡ結合活性は、配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤という用語は、そのようなポリペプチドをコードする核酸も含む。例示的なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤には、Ｃａｓクリベース／ニッカーゼが含まれる。例示的なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤には、その不活性化形態（「ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤」）が含まれ得る（例えば、これらの薬剤が、例えば、ＦｏｋＩクリベースドメインとの融合を介して、ＤＮＡ切断を可能にするように修飾された場合）。本明細書で使用される「Ｃａｓヌクレアーゼ」は、Ｃａｓクリベース及びＣａｓニッカーゼを包含する。Ｃａｓクリベース及びＣａｓニッカーゼには、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍもしくはＣｍｒ複合体、そのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２のＣａｓヌクレアーゼが含まれる。本明細書で使用される場合、「クラス２のＣａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２のＣａｓヌクレアーゼには、ＲＮＡガイドＤＮＡクリベースもしくはニッカーゼ活性をさらに有するクラス２のＣａｓクリベース／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）、及びクリベース／ニッカーゼ活性が不活性化されたクラス２のｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤（それらの薬剤がＤＮＡ切断を可能にするように修飾されている場合）が含まれる。クラス２のＣａｓヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）タンパク質、ならびにそれらの修飾が含まれる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５））もまた、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１及びＳ３を参照されたい。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照されたい。本明細書で使用する場合、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）の送達は、ポリペプチドまたはｍＲＮＡの送達を含む。
本明細書で使用される場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓクリベース、Ｃａｓニッカーゼ、Ｃａｓ９クリベース、またはＣａｓ９ニッカーゼと合わせたガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を標的配列へと誘導し、ガイドＲＮＡが標的配列とハイブリダイズし、薬剤が標的配列と結合し、結合の後に切断またはニッキングを行うことができる。
本明細書で使用する場合、第２の配列に対する第１の配列のアライメントにより、第２の配列の位置の全体でのＸ％以上が第１の配列によって一致することが示される場合、第１の配列は、第２の配列と「少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」とみなされる。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧと１００％同一性を有する配列を含むが、その理由は、アライメントが、第２の配列の３つの全ての位置において一致があるという点で１００％同一性を与えるからである。ＲＮＡとＤＮＡとの間の差（一般に、チミジンをウリジンに交換すること、またはその逆）、及び修飾ウリジンなどのヌクレオシドアナログの存在は、関連するヌクレオチド（チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンなど）が同じ相補体（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンの全てについてのアデノシン、別の例は、シトシン及び５－メチルシトシンであり、これらの両方が相補体としてグアノシンまたは修飾グアノシンを有する）を有する限り、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の差に寄与しない。したがって、例えば、Ｘがいずれかの修飾ウリジン、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、または５－メトキシウリジンである配列５’－ＡＸＧは、両方とも同じ配列（５’－ＣＡＵ）に完全に相補的である点において、ＡＵＧと１００％同一であるとみなされる。例示的なアライメントアルゴリズムは、当該技術分野で周知である、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである。当業者は、アライメントされる配列の所与の対について、どのようなアルゴリズム及びパラメータ設定の選択が適切であることを理解するであろう。一般的に類似する長さ及び予想される同一性がアミノ酸については５０％超の配列、またはヌクレオチドについては７５％超の配列に関して、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋウェブサーバでＥＢＩによって提供されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムインターフェースのデフォルト設定を用いるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが一般的に適切である。
本明細書で使用される場合、第１の配列は、第１の配列の塩基のＸ％が第２の配列と塩基対合する場合、第２の配列に対して「Ｘ％相補的」であるとみなされる。例えば、第１の配列５’ＡＡＧＡ３’は、第２の配列３’ＴＴＣＴ５’と１００％相補的であり、第２の配列は、第１の配列に対して１００％相補的である。いくつかの実施形態では、第１の配列５’ＡＡＧＡ３’は、第２の配列３’ＴＴＣＴＧＴＧＡ５’と１００％相補的であるが、一方、第２の配列は、第１の配列に対して５０％相補的である。
「ｍＲＮＡ」は、全体的にまたは主にＲＮＡまたは修飾ＲＮＡであり、かつポリペプチドに翻訳することができる（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として機能することができる）オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指すために本明細書で使用される。ｍＲＮＡは、リボース残基またはそのアナログ、例えば、２’－メトキシリボース残基を含む、リン酸糖骨格を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡリン酸糖骨格の糖は、リボース残基、２’－メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせから本質的になる。ｍＲＮＡの塩基は、シュードウリジン、Ｎ－１－メチル－シュードウリジン、または他の天然に存在するもしくは非天然に存在する塩基などの修飾塩基であり得る。
本明細書に記載される組成物及び方法に有用な例示的なガイド配列を、表１及び本出願全体に示す。
本明細書で使用される場合、「インデル」は、標的核酸内の二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位において挿入されるか、または欠失するかのいずれかであるいくつかのヌクレオチドからなる挿入／欠失変異を指す。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、野生型タンパク質またはバリアントタンパク質（例えば、変異体、断片、融合、またはそれらの組み合わせ）を指す。バリアントポリペプチドは、野生型ポリペプチドの少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の機能活性を有し得る。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型ポリペプチドの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、活動亢進型バリアントであり得る。ある特定の例では、バリアントは、野生型ポリペプチドの機能活性の約８０％～約１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％、３００％、４００％、５００％以上を有する。
本明細書で使用される場合、「異種遺伝子」は、宿主細胞ゲノム内の部位（例えば、アルブミンイントロン１部位を含むセーフハーバー遺伝子座などのゲノム遺伝子座において）への外因性源として導入されている遺伝子を指す。すなわち、導入された遺伝子は、その挿入部位に関して異種である。そのような異種遺伝子から発現されるポリペプチドは、「異種ポリペプチド」と称される。異種遺伝子は、天然に存在するか、または操作されることができ、野生型またはバリアントであり得る。異種遺伝子は、異種ポリペプチド（例えば、内部リボソーム侵入部位）をコードする配列以外のヌクレオチド配列を含み得る。異種遺伝子は、野生型またはバリアント（例えば、変異体）として宿主ゲノム内で天然に存在する遺伝子であり得る。例えば、宿主細胞は（野生型としてまたはバリアントとして）目的の遺伝子を含むが、同じ遺伝子またはそのバリアントは、例えば、高度に発現される遺伝子座での発現のための外因性源として導入され得る。異種遺伝子はまた、宿主ゲノムにおいて天然に存在しない、または宿主ゲノムにおいて天然に存在しない異種ポリペプチドを発現する遺伝子であり得る。「異種遺伝子」、「外因性遺伝子」、及び「導入遺伝子」は、互換的に使用される。いくつかの実施形態では、異種遺伝子または導入遺伝子は、外因性核酸配列を含み、例えば、核酸配列は、レシピエント細胞に対して内因性ではない。ある特定の実施形態では、異種遺伝子は、レシピエント細胞において天然に存在しない。例えば、異種遺伝子は、その挿入部位に関して、及びそのレシピエント細胞に関しての両方で異種であり得る。
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、ｇＲＮＡのガイド配列に対して相補性を有する標的遺伝子内の核酸配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用により、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、標的配列内で結合し、潜在的に（薬剤の活性に応じて）ニッキングまたは切断するように指向される。
本明細書で使用される場合、「双方向性核酸構築物」（本明細書では「双方向性構築物」と互換的に称される）は、少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、目的の薬剤をコードするコード配列（コード配列は、本明細書では「導入遺伝子」または第１の導入遺伝子と称され得る）を含むが、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が目的の薬剤をコードする配列、すなわち、第２の導入遺伝子を含む。薬剤は、ポリペプチド、機能性ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの治療用薬剤であり得る。導入遺伝子は、ポリペプチド、機能性ＲＮＡ、またはｍＲＮＡなどの薬剤をコードし得る。いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、目的のポリペプチドをコードするコード配列を含むが、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が目的のポリペプチドをコードする配列、すなわち、第２の導入遺伝子を含む。すなわち、少なくとも２つのセグメントは、同一もしくは異なるポリペプチドまたは同一もしくは異なる薬剤をコードすることができる。２つのセグメントが同一のポリペプチドをコードする場合、第１のセグメントのコード配列は、第２のセグメントの配列の相補体と同一である必要はない。いくつかの実施形態では、第２のセグメントの配列は、第１のセグメントのコード配列の逆相補体である。双方向性構築物は、一本鎖または二本鎖であり得る。本明細書に開示される双方向性構築物は、目的の任意のポリペプチドを発現することができる構築物を包含する。双方向性構築物は、導入遺伝子配列のゲノム挿入、特に導入遺伝子の標的挿入に有用である。
本明細書で使用される場合、「逆相補体」は、参照配列の相補配列である配列を指し、相補配列は、逆方向で書かれている。例えば、仮定配列５’ＣＴＧＧＡＣＣＧＡ３’（配列番号５００）について、「完璧な」相補配列は、３’ＧＡＣＣＴＧＧＣＴ５’（配列番号５０１）であり、「完璧な」逆相補配列は、５’ＴＣＧＧＴＣＣＡＧ３’（配列番号５０２）と書かれている。逆相補配列は、「完璧」である必要はなく、依然として、参照配列と同じポリペプチドまたは類似のポリペプチドをコードし得る。コドン使用頻度の冗長性のため、逆相補体は、同じポリペプチドをコードする参照配列から逸脱し得る。本明細書で使用される場合、「逆相補体」はまた、参照配列の逆相補体配列と、例えば、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。
いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、第１のポリペプチドをコードするコード配列（第１の導入遺伝子）を含む第１のセグメントと、配列の相補体が第２のポリペプチドをコードする配列（第２の導入遺伝子）を含む第２のセグメントとを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチドは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチドは、例えば、５０、１００、２００、５００、１０００以上のアミノ酸残基にわたって、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ＩＩ．双方向性核酸構築物
増強された挿入を促進する、例えば、目的の遺伝子の生産的な挿入及び発現を増強する双方向性核酸構築物が本明細書に記載される。簡潔には、本明細書に開示される様々な双方向性構築物は、少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、目的の薬剤、例えば、異種遺伝子をコードするコード配列（コード配列は、本明細書では「導入遺伝子」または第１の導入遺伝子と称され得る）を含むが、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が目的の薬剤、例えば、異種遺伝子をコードする配列、すなわち、第２の導入遺伝子を含む。薬剤は、ポリペプチド、機能性ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの治療用薬剤であり得る。導入遺伝子は、ポリペプチド、機能性ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、または転写因子などの薬剤をコードし得る。いくつかの実施形態では、コード配列は、ポリペプチド、または機能性ＲＮＡなどの治療用薬剤をコードする。少なくとも２つのセグメントは、同一もしくは異なるポリペプチドまたは同一もしくは異なる薬剤をコードすることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性構築物は、少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、目的のポリペプチドをコードするコード配列を含むが、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が目的のポリペプチドをコードする配列を含む。
一実施形態では、双方向性構築物は、ｃｉｓに少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、コード配列（本明細書において、時に「導入遺伝子」と互換的に称される）を含むが、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が導入遺伝子をコードする配列を含む。第１の導入遺伝子及び第２の導入遺伝子は、同一であっても異なっていてもよい。双方向性構築物は、ｃｉｓに少なくとも２つの核酸セグメントを含み得、一方のセグメント（第１のセグメント）は、一方の配向で異種遺伝子をコードするコード配列を含むが、他方のセグメント（第２のセグメント）は、相補体が他方の配向で異種遺伝子をコードする配列を含む。すなわち、第１のセグメントは、第２のセグメントの相補体であり（必ずしも完全な相補体ではない）、第２のセグメントの相補体は、第１のセグメントの逆相補体である（両方とも同じ異種タンパク質をコードするが、必ずしも完全な逆相補体ではない）。双方向性構築物は、スプライスアクセプターに連結した異種遺伝子をコードする第１のコード配列と、相補体が他方の配向で異種遺伝子をコードし、スプライスアクセプターにも連結した第２のコード配列とを含み得る。
本明細書で使用される場合、そのような構築物は、時に、「ドナー構築物／テンプレート」と称される。いくつかの実施形態では、構築物は、ＤＮＡ構築物である。ドナー構築物に対する様々な機能的／構造的修飾を設計及び作製する方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、構築物は、ポリアデニル化テール配列、ポリアデニル化シグナル配列、スプライスアクセプター部位、または選択可能マーカーのうちのいずれか１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化テール配列は、コード配列の３’末端で、例えば、「ポリ－Ａ」ストレッチとしてコードされる。
本明細書に記載の遺伝子編集系と組み合わせて使用した場合、核酸構築物の双方向性は、構築物を標的挿入部位内のいずれかの方向（１つの方向への挿入に限定されない）で挿入することを可能にし、本明細書に例示されるように、ａ）一方のセグメントのコード配列（例えば、図１の左上のｓｓＡＡＶ構築物の「ヒトＦ９」をコードする左側セグメント）、またはｂ）他方のセグメントの相補体（例えば、図１の左上のｓｓＡＡＶ構築物において逆さまに示される「ヒトＦ９」をコードする右側セグメントの相補体）のいずれかから目的のポリペプチドの発現を可能にし、それによって、挿入及び発現効率を向上させる。遺伝子編集系による標的切断は、構築物組み込み及び／または導入遺伝子発現を促進し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を含む部位特異的ＤＮＡ切断系を含む、様々な既知の遺伝子編集系が本開示の実施において使用され得る。
いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、薬剤またはポリペプチドの発現を駆動するプロモーターを含まない。例えば、ポリペプチドの発現は、宿主細胞のプロモーター（例えば、導入遺伝子が宿主細胞のアルブミン遺伝子座に組み込まれるときの内因性アルブミンプロモーター）によって駆動される。
いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、ポリペプチドのコード配列を含む第１のセグメント、及びポリペプチドのコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントを含む。非ポリペプチド薬剤についても同様である。すなわち、第１のセグメントにおけるコード配列は、ポリペプチドを発現することができるが、第２のセグメントにおける逆相補体の相補体もまたポリペプチドを発現することができる。本明細書で使用される場合、逆相補配列を含む第２のセグメントを指す場合、「コード配列」は、第２のセグメントの相補的（コード）鎖（すなわち、第２のセグメントにおける逆相補配列の相補的コード配列）を指す。
いくつかの実施形態では、第１のセグメントにおけるポリペプチドＡをコードするコード配列は、同じくポリペプチドＡをコードするコード配列の逆相補体に対して１００％未満相補的である。すなわち、いくつかの実施形態では、第１のセグメントは、ポリペプチドＡのコード配列（１）を含み、第２のセグメントは、ポリペプチドＡのコード配列（２）の逆相補体であり、コード配列（１）は、コード配列（２）と同一ではない。例えば、ポリペプチドＡをコードするコード配列（１）及び／またはコード配列（２）は、異なるコドンを利用し得る。いくつかの実施形態では、コード配列（１）とコード配列（２）の逆相補体が１００％または１００％未満の相補性を有するように、一方または両方の配列が、コドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、第２のセグメントのコード配列は、第１のセグメントにおけるコード配列によってコードされる同じポリペプチドの１つ以上のアミノ酸のための１つ以上の代替コドンを使用して、ポリペプチドをコードする。本明細書で使用される「代替コドン」は、所与のアミノ酸についてのコドン使用頻度の変形を指し、所与の発現系に好ましいまたは最適化されたコドン（コドン最適化）であってもなくてもよい。好ましいコドン使用頻度、または所与の発現系において良好に耐容されるコドンは、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、ヘアピン形成を低減するために、第１のセグメントのコード配列とは異なるコドン使用頻度を採用する逆相補配列を含む。そのような逆相補体は、第１のセグメントにおけるコード配列の全てのヌクレオチドよりも少ない塩基対を形成するが、依然として、任意に同じポリペプチドをコードする。そのような場合では、例えば、ポリペプチドＡの、第１のセグメントのコード配列は、例えば、ポリペプチドＡの、双方向性構築物の後半のコード配列と相同であり得るが、同一ではない。いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントにおけるコード配列に対して実質的に相補的ではない（例えば、７０％以下相補的である）逆相補配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントにおけるコード配列に対して高度に相補的（例えば、少なくとも９０％相補的）である逆相補配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントにおけるコード配列に対して少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、または約９９％相補性を有する逆相補配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントにおけるコード配列に対して１００％相補性を有する逆相補配列を含む。すなわち、第２のセグメント内の配列は、第１のセグメントにおけるコード配列の完全な逆相補体である。例として、第１のセグメントは、仮定配列５’ＣＴＧＧＡＣＣＧＡ３’（配列番号５００）を含み、第２のセグメントは、配列番号１の逆相補体、すなわち、５’ＴＣＧＧＴＣＣＡＧ３’（配列番号５０２）を含む。
いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、ポリペプチドまたは薬剤（例えば、第１のポリペプチド）のコード配列を含む第１のセグメント、及びポリペプチドまたは薬剤（例えば、第２のポリペプチド）のコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、上に記載されるように、同じである。いくつかの実施形態では、第１の治療用薬剤及び第２の治療用薬剤は、上に記載されるように、同じである。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、異なる。いくつかの実施形態では、第１の治療用薬剤及び第２の治療用薬剤は、異なる。例えば、第１のポリペプチドは、ポリペプチドＡであり、第２のポリペプチドは、ポリペプチドＢである。さらなる例として、第１のポリペプチドは、ポリペプチドＡであり、第２のポリペプチドは、ポリペプチドＡのバリアント（例えば、断片（機能性断片など）、変異体、融合体（ポリペプチド末端でわずか１つのアミノ酸の付加を含む）、またはそれらの組み合わせ）である。ポリペプチドをコードするコード配列は、任意に、ポリペプチドに連結されたシグナル配列、標識配列（例えば、ＨｉＢｉｔ）、または異種機能配列（例えば、核局在化配列（ＮＬＳ）または自己切断）などのアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸配列をコードする配列など１つ以上の追加の配列を含み得る。ポリペプチドをコードするコード配列は、任意に、１つ以上のアミノ末端シグナルペプチド配列をコードする配列を含み得る。これらの追加の配列の各々は、構築物の第１のセグメント及び第２のセグメントにおいて同じまたは異なってもよい。
本明細書に記載される双方向性構築物を使用して、本明細書に開示される方法に従って任意のポリペプチドを発現することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、分泌ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その機能が分泌ポリペプチドとして通常作用する（例えば、機能的に活性である）ものである。本明細書で使用される「分泌ポリペプチド」は、細胞によって分泌され、及び／または可溶性細胞外タンパク質として機能的に活性であるタンパク質を指す。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、細胞内ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その機能が細胞内で通常作用する（例えば、機能的に活性である）ものである。本明細書で使用される「細胞内ポリペプチド」は、可溶性細胞質ポリペプチドを含む、細胞によって分泌されないタンパク質を指す。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、肝臓タンパク質またはそのバリアントである。本明細書で使用される場合、「肝臓タンパク質」は、例えば、肝臓において内因性で生成され、及び／または肝臓において機能的に活性であるタンパク質である。いくつかの実施形態では、肝臓タンパク質は、肝臓またはそのバリアントによって生成される循環タンパク質である。いくつかの実施形態では、肝臓タンパク質は、肝臓またはそのバリアントにおいて機能的に活性であるタンパク質である。いくつかの実施形態では、肝臓タンパク質は、１つ以上の他の組織型と比較して、肝臓において上昇した発現を呈する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、非肝臓タンパク質である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、限定されないが、第ＩＸ因子及びそのバリアントが含まれる。
いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、直鎖状である。例えば、第１及び第２のセグメントは、リンカー配列を通して直鎖様式で結合される。いくつかの実施形態では、逆相補配列を含む第２のセグメントの５’末端は、第１のセグメントの３’末端に連結される。いくつかの実施形態では、第１のセグメントの５’末端は、逆相補配列を含む第２のセグメントの３’末端に連結される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００、１５００、２０００以上のヌクレオチド長である。当業者によって理解されるように、リンカー配列に加えて、またはリンカー配列の代わりに他の構造要素が、第１のセグメントと第２のセグメントとの間に挿入され得る。
本明細書に開示される構築物は、任意の特定の使用に必要な、及び／または１つ以上の所望の機能を付与する任意の好適な構造特徴を含むように修飾され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物は、相同性アームを含まない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物は、相同性非依存性ドナー構築物である。いくつかの実施形態では、部分的には、核酸構築物の双方向性機能に起因して、双方向性構築物は、目的のポリペプチドの効率的な挿入及び／または発現を可能にするために、本明細書に記載のいずれかの方向（配向）でゲノム遺伝子座に挿入され得る。いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、各々が導入遺伝子の上流にスプライスアクセプターを有する第１のセグメント及び第２のセグメントを含む。ある特定の実施形態では、スプライスアクセプターは、宿主細胞のセーフハーバー部位のスプライスドナー配列、例えば、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１のスプライスドナーと適合性である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、１つ以上の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。特徴ピコルナウイルスＲＮＡとして最初に特定されたＩＲＥＳは、５’キャップ構造の不在下でタンパク質合成を開始する上で重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として作用し得るか、またはポリヌクレオチドの複数のリボソーム結合部位の１つとして作用し得る。１つを超える機能性リボソーム結合部位を含む構築物は、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチド（「マルチシストロン核酸分子」）をコードし得る。あるいは、構築物は、内因性ポリペプチド（すなわち、アルブミンシグナルペプチド）に融合されていない異種タンパク質を発現するためにＩＲＥＳを含み得る。利用され得るＩＲＥＳ配列の例には、限定されないが、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、害虫ウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、古典的なブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはクリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、２Ａ配列または２Ａ様配列などの自己切断ペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、目的のポリペプチドの上流に位置する。一実施形態では、２Ａペプチドをコードする配列を使用して、目的の２つ以上のポリペプチドのコード領域を分離することができる。別の実施形態では、この配列を使用して、コード配列を構築物から分離し、コード配列を内因性遺伝子座（すなわち、内因性アルブミンシグナル配列）から分離することができる。非限定的な例として、２Ａペプチドをコードする配列は、領域Ａと領域Ｂとの間（Ａ－２Ａ－Ｂ）にあり得る。２Ａペプチドの存在は、１つの長いタンパク質のプロテインＡ、プロテインＢ、及び２Ａペプチドへの切断をもたらす。プロテインＡ及びプロテインＢは、目的の同一または異なるポリペプチドであり得る。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のセグメントの一方または両方は、オープンリーディングフレームの下流にポリアデニル化テール配列及び／またはポリアデニル化シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化テール配列は、第１及び／または第２のセグメントの３’末端で、例えば、「ポリ－Ａ」ストレッチとしてコードされる。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化テール配列は、第１及び／または第２のセグメントの３’末端で、またはその近傍においてコードされるポリアデニル化シグナル配列の結果として共転写的に提供される。いくつかの実施形態では、ポリ－Ａテールは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアデニンを含み、任意に、３００個までのアデニンを含む。いくつかの実施形態では、ポリ－Ａテールは、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個のアデニンヌクレオチドを含む。好適なポリアデニル化テール配列及び／またはポリアデニル化シグナル配列を設計する方法は、当該技術分野で周知である。マウスアルブミン及びヒトＦＩＸスプライスアクセプター部位を含む、好適なスプライスアクセプター配列が本明細書に開示され、例示される。いくつかの実施形態では、ＵＡＵＡＡＡ（配列番号８０１）またはＡＵ／ＧＵＡＡＡ（配列番号８０２）などのバリアントが同定されているが、ポリアデニル化シグナル配列ＡＡＵＡＡＡ（配列番号８００）は、哺乳動物系で一般的に使用される。例えば、ＮＪ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．２５（１７）：１７７０－８２，２０１１を参照されたい。いくつかの実施形態では、ポリＡテール配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、または部分的に一本鎖及び部分的に二本鎖であり得、直鎖または環状（例えば、ミニサークル）形態で宿主細胞に導入され得る。例えば、米国特許公開第２０１０／００４７８０５号、第２０１１／０２８１３６１号、第２０１１／０２０７２２１号を参照されたい。直鎖形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、直鎖分子の３’末端に添加され、及び／または自己相補性オリゴヌクレオチドは、一方または両方の末端にライゲーションされる。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法は、限定されないが、末端アミノ基（複数可）の添加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、及びＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間連結の使用を含む。
いくつかの実施形態では、構築物は、その発現が挿入部位における内因性プロモーター（例えば、ドナーが宿主細胞のアルブミン遺伝子座に組み込まれるときの内因性アルブミンプロモーター）によって駆動されるように挿入され得る。そのような場合、導入遺伝子は、その発現を駆動する制御エレメント（例えば、プロモーター及び／またはエンハンサー）を欠いていてもよい（例えば、プロモーターレス構築物）。それにもかかわらず、他の場合において、構築物は、プロモーター及び／またはエンハンサー、例えば、組み込み時に機能性タンパク質の発現を駆動する構成的プロモーター、または誘導性もしくは組織特異的（例えば、肝臓または血小板特異的）プロモーターを含み得ることが明らかであろう。構築物は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列の下流にある異種タンパク質をコードする配列を含み得、シグナルペプチドをコードするシグナル配列に作動可能に連結され得る。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、異種ポリペプチドをコードする核酸の相同性非依存挿入において作用する。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、非分裂細胞、例えば、ＨＲではなくＮＨＥＪが、二本鎖ＤＮＡ切断が修復される一次機序である細胞において作用する。核酸は、相同性非依存性ドナー構築物であり得る。例えば、構築物は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように（例えばヌクレオシドアナログを使用して）修飾され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、構築物のいずれかまたは両方の末端、例えば、第１及び／または第２のセグメントにおけるオープンリーディングフレームの５’、または一方もしくは両方の導入遺伝子配列の５’上にスプライスアクセプター部位を含む。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプター部位は、ＮＡＧを含む。さらなる実施形態では、スプライスアクセプター部位は、ＮＡＧからなる。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、アルブミンスプライスアクセプター、例えば、アルブミンのエクソン１及び２の一緒のスプライシングで使用されるアルブミンスプライスアクセプターである。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、ヒトアルブミン遺伝子由来である。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、マウスアルブミン遺伝子由来である。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、Ｆ９（または「ＦＩＸ」）スプライスアクセプターであり、例えば、Ｆ９のエクソン１及び２の一緒のスプライシングで使用されるＦ９スプライスアクセプターである。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、ヒトＦ９遺伝子由来である。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、マウスＦ９遺伝子由来である。人工スプライスアクセプターを含む、真核生物において有用な追加の好適なスプライスアクセプター部位が既知であり、当該技術分野に由来し得る。例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，７１５５－７１７４、Ｂｕｒｓｅｔ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９，２５５－２５９を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、必要に応じて１つ以上の好適な構造特徴を含むように、及び／または１つ以上の機能的利益を付与するように、いずれかまたは両方の末端で修飾され得る。例えば、構造修飾は、本明細書に開示される構築物を宿主細胞に送達するのに使用される方法（複数可）、例えば、ウイルスベクター送達の使用または送達のための脂質ナノ粒子へのパッケージングに応じて変化し得る。そのような修飾には、限定されないが、例えば、逆位末端反復（ＩＴＲ）、ヘアピン、ループ、及びトロイドなどの他の構造などの末端構造が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、１、２、または３つのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、２つ以下のＩＴＲを含む。構造修飾の様々な方法は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、構築物の一方または両方の末端は、当該技術分野で既知の方法によって（例えば、エキソ核酸分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、直鎖分子の３’末端に添加され、及び／または自己相補性オリゴヌクレオチドは、一方または両方の末端にライゲーションされる。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。構築物を分解から保護するための追加の方法は、限定されないが、末端アミノ基（複数可）の添加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、及びＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間連結の使用を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、例えば、複製起源、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクターの一部として細胞内に導入され得る。構築物は、ウイルス要素を省き得る。いくつかの実施形態では、構築物は、裸の核酸として、リポソーム、ポリマー、もしくはポロキサマーなどの薬剤と複合体化した核酸として導入され得るか、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）によって送達され得る。
いくつかの実施形態では、発現には必要ではないが、本明細書に開示される構築物はまた、転写または翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム侵入部位、ペプチドをコードする配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。
いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドのコード配列を含む構築物は、以下の修飾：コドン最適化（例えば、ヒトコドンへ）及び／または１つ以上のグリコシル化部位の追加のうちの１つ以上を含み得る。例えば、ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｌｏｏｄ（１７）：３３３５－４４を参照されたい。
ＩＩＩ．遺伝子編集系
例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を含む、様々な既知の遺伝子編集系が本開示の実施において使用され得る。一般に、これらの方法は、標的ＤＮＡ配列において二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニック（例えば、一本鎖切断すなわちＳＳＢ）を誘導するために操作された切断系の使用を伴い得る。切断またはニッキングは、操作されたＺＦＮ、ＴＡＬＥＮなど特異的ヌクレアーゼの使用を通じて、または操作されたガイドＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、標的ＤＮＡ配列の特異的切断またはニッキングを誘導することによって生じ得る。さらに、例えば、ゲノム編集及び遺伝子療法における使用の可能性も有し得る、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ系（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として知られるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１を参照されたい）に基づいて、標的ヌクレアーゼは開発されてきており、さらなるヌクレアーゼが開発されている。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、宿主ゲノム内の所望の遺伝子座に挿入部位を作成することができ、その部位で、本明細書に開示される双方向性構築物挿入して、目的の１つ以上のポリペプチドを発現することができる。挿入のために宿主ゲノムの任意の所望の遺伝子座を標的とする好適なガイドＲＮＡを設計する方法は、当該技術分野で周知である。導入遺伝子を含む双方向性構築物は、その挿入部位、例えば、「セーフハーバー」遺伝子座への異種導入遺伝子の挿入に関して、異種であり得る。導入遺伝子を含む双方向性構築物は、その挿入部位、例えば、その内因性遺伝子座への野生型導入遺伝子の挿入に関して、非異種であり得る。
「セーフハーバー」遺伝子座は、ゲノム内の遺伝子座であり、外因性核酸は、例えば、アポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、または対照細胞と比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、もしくは４０％を超えるアポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、宿主細胞、例えば、肝細胞に対する著しい有害作用なく、挿入され得る。例えば、Ｈｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，”２０１７を参照されたい。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、例えば、アポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、または対照細胞集団と比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、もしくは４０％を超えるアポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、肝細胞または肝臓細胞などの、宿主細胞または細胞集団に対する著しい有害作用なく、外因性核酸（例えば、外因性遺伝子）の発現を可能にする。セーフハーバーは、ヒトアルブミン遺伝子などのアルブミン遺伝子内にあり得る。セーフハーバーは、アルブミンイントロン１領域、例えば、ヒトアルブミンイントロン１内にあり得る。セーフハーバーは、例えば、肝臓組織または肝細胞宿主細胞のヒトセーフハーバーであり得る。ヌクレアーゼ（複数可）によって標的とされるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例としては、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａ、アルブミン、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１ Ｒ１２Ｃ）、ＡｎｇｐｔｉＳ、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、ＳＥＲＰＩＮＡｌ、ＴＦ、及びＴＴＲが挙げられる。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号及び第８，１１０，３７９号、米国公開第２００８／０１５９９９６号、第２０１０／００２１８２６４号、第２０１２／００１７２９０号、第２０１１／０２６５１９８号、第２０１３／０１３７１０４号、第２０１３／０１２２５９１号、第２０１３／０１７７９８３号、第２０１３／０１７７９６０号、ならびにＷＯ２０１７／０９３８０４を参照されたい。本明細書に例示されるように、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヒトまたはマウスアルブミン遺伝子座（例えば、イントロン１）を標的とするように設計され得る。本明細書に例示されるガイドＲＮＡの例を表５～１０に示す。本方法による導入遺伝子を含む双方向性構築物の挿入のために、任意の他の遺伝子座を標的化することができることが理解されよう。
いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、セーフハーバー遺伝子座に挿入され、セーフハーバー遺伝子座の内因性シグナル配列、例えば、エクソン１によってコードされるアルブミンシグナル配列を使用してもよい。例えば、コード配列は、それがヒトアルブミンエクソン１のシグナル配列の下流であり、それと融合するように、ヒトアルブミンイントロン１に挿入され得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子は、それ自身のシグナル配列を含んでもよく、セーフハーバー遺伝子座に挿入されてもよく、セーフハーバー遺伝子座の内因性シグナル配列をさらに使用してもよい。例えば、その天然シグナル配列を含むコード配列は、それがエクソン１によってコードされるヒトアルブミンのシグナル配列の下流であり、それと融合するように、ヒトアルブミンイントロン１に挿入され得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子は、それ自身のシグナル配列及び内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含んでもよく、セーフハーバー遺伝子座に挿入されてもよく、セーフハーバー遺伝子座の内因性シグナル配列をさらに使用してもよい。例えば、自身の天然シグナル配列及びＩＲＥＳ配列を含むコード配列は、それがエクソン１によってコードされるヒトアルブミンのシグナル配列の下流であり、それと融合するように、ヒトアルブミンイントロン１に挿入され得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子は、それ自身のシグナル配列及びＩＲＥＳを含んでもよく、セーフハーバー遺伝子座に挿入されてもよく、セーフハーバー遺伝子座の内因性シグナル配列を使用しない。例えば、自身の天然シグナル配列及びＩＲＥＳ配列を含むコード配列は、それがエクソン１によってコードされるヒトアルブミンのシグナル配列と融合しないように、ヒトアルブミンイントロン１に挿入され得る。これらの実施形態では、タンパク質は、ＩＲＥＳ部位から翻訳され、かつキメラ（例えば、異種タンパク質に融合されたアルブミンシグナルペプチド）ではなく、それは、有利に非免疫原性または低免疫原性であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞外で分泌及び／または輸送されない。
いくつかの実施形態では、遺伝子は、セーフハーバー遺伝子座に挿入されてもよく、ＩＲＥＳを含んでもよく、いかなるシグナル配列も使用しない。例えば、ＩＲＥＳ配列を含み、天然シグナル配列を含まないコード配列は、それがエクソン１によってコードされるヒトアルブミンのシグナル配列と融合しないように、ヒトアルブミンイントロン１に挿入され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、任意のシグナル配列なしでＩＲＥＳ部位から翻訳される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞外で分泌及び／または輸送されない。
本方法で使用され得るＣａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼのガイドＲＮＡは、標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵ残基の代わりに、またはそれらに加えて使用される１つ以上の非天然及び／または天然に存在する構成要素または配置の存在を含む、様々な既知の変形及び修飾（例えば、化学修飾）のうちのいずれかを含み得ることも理解されよう。例えば、本明細書に例示されるガイド配列の各々（表５～１０）は、例えば、ＳｐｙＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系から、ｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、及び／またはｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでもよい。例えば、本明細書に例示されるガイド配列の各々（表５～１０）は、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでもよく、その３’末端で、ガイド配列に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２００）。ｓｇＲＮＡの場合、表５～１０に列挙されるガイド配列などのガイド配列は、ｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでもよく、例えば、ガイド配列の３’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列（ＳｐｙＣａｓ９ガイド配列）を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号２０１）またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２０２）。
ガイドＲＮＡは、任意にｔｒＲＮＡを含み得る。本明細書に記載される各組成物及び方法の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、シングルＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として会合してもよく、または別個のＲＮＡ上にあってもよい（ｄｇＲＮＡ）。ｓｇＲＮＡの文脈において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの構成要素は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介して共有結合され得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではないヌクレオチド間の１つ以上の連結を含む。本明細書に記載される組成物、使用、及び方法の実施形態の各々では、ガイドＲＮＡは、「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」として２つのＲＮＡ分子を含み得る。ｄｇＲＮＡは、例えば、表５～１０のうちのいずれか１つに示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含む。第１のＲＮＡ分子及び第２のＲＮＡ分子は共有結合しなくてもよいが、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対合を介してＲＮＡ二本鎖を形成してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、プロポスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流の領域に結合する。当業者によって理解されるように、ＰＡＭ配列は、標的配列を含む鎖の反対側の鎖上で生じる。すなわち、ＰＡＭ配列は、標的鎖（ガイドＲＮＡが結合する標的配列を含む鎖）の相補鎖上にある。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、ＮＧＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＧＲＲ（Ｎ）、ＮＮＡＧＡＡＷ、ＮＮＮＮＧ（Ａ／Ｃ）ＴＴ、及びＮＮＮＮＲＹＡＣからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、ＮＧＧである。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるガイドＲＮＡ配列は、ＰＡＭ配列に隣接する配列に対して相補的である。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、ヒト参照ゲノムｈｇ３８内の座標に従って本明細書の表から選択されるゲノム領域内の配列に対して相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、表５～１０から選択されるゲノム領域内から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続ヌクレオチドを含む配列に対して相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、表５～１０から選択されるゲノム領域にわたる５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続ヌクレオチドを含む配列に対して相補的である配列を含む。
本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす標的特異的切断を媒介する。本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、一本鎖切断（ＳＳＢまたはニック）をもたらす標的特異的切断を媒介する。
様々なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼの使用方法もまた、当該技術分野で周知である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する双方向性核酸の使用が本明細書に例示されるが、系に対する好適な変形も使用され得ることが理解されるであろう。文脈に応じて、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）としてまたはタンパク質として提供され得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を既に含む及び／または発現する宿主細胞で実施され得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、クリベース活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ニッカーゼ活性を有し、これは一本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。Ｃａｓヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び他の原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のもの（例えば、次の段落のリストを参照されたい）、ならびにそれらのバリアントまたは変異体（例えば、操作型、非天然型、天然型、または他のバリアント）のバージョンが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８Ａ１、ＵＳ２０１６／０３１２１９９Ａ１を参照されたい。
Ｃａｓヌクレアーゼの由来となり得る非限定的な例示的な種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ細菌、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ細菌、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ細菌、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と合わせたｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼと合わせたｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＰと呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９と合わせたｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰと呼ばれる。
野生型Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメイン：ＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。ＲｕｖＣドメインは、非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインはＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、１つを超えるＲｕｖＣドメイン及び／または１つを超えるＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９である。組成物、使用、及び方法の実施形態の各々では、Ｃａｓは、標的ＤＮＡにおける二本鎖切断を誘導する。
いくつかの実施形態では、キメラＣａｓヌクレアーゼが使用され、タンパク質の１つのドメインまたは領域が、異なるタンパク質の一部分によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１等の異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、修飾ヌクレアーゼであってもよい。
他の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のカスケード複合体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断活性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、一本鎖ニッカーゼ活性を有し、すなわち、１つのＤＮＡ鎖を切断して一本鎖切断（「ニック」としても知られる）を生成することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、ｄｓＤＮＡ内でニックを作成する酵素であり、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖を切断するが、他方の鎖を切断しない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、例えば、触媒ドメイン内の１つ以上の改変（例えば、点変異）によって、エンドヌクレオチド分解活性部位が不活性化されたＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上で考察されたＣａｓヌクレアーゼ）の一態様である。例えば、Ｃａｓニッカーゼ及び例示的な触媒ドメイン改変の考察については、米国特許第８，８８９，３５６号を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼなどのＣａｓニッカーゼは、不活性化されたＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインを有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１つの機能的ヌクレアーゼドメインのみを含むように修飾される。例えば、薬剤タンパク質は、核酸切断活性を低下させるために、ヌクレアーゼドメインの１つが突然変異されるか、または完全もしくは部分的に欠失するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、活性が低下したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、活性が低下したＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低下させるか、または変化させるように置換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）：７５９－７７１を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、及びＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。さらなる例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ）に基づく）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、それぞれ、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対して相補的な一対のガイドＲＮＡと組み合わせて提供される。この実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的配列の反対側の鎖にニックを生成することによって（すなわち、二重ニッキング）、ニッカーゼを標的配列に指向させ、ＤＳＢを導入する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ＤＮＡの反対側の鎖を標的とする２つの別個のガイドＲＮＡと共に使用され、標的ＤＮＡ内に二重ニックを生成する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ごく接近した位置にあるように選択された２つの別個のガイドＲＮＡと共に使用され、標的ＤＮＡ内に二重ニックを生成する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１つ以上の異種機能ドメインを含む（例えば、融合ポリペプチドであるか、または融合ポリペプチドを含む）。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の細胞核への輸送を促進し得る。例えば、異種機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１～１０個のＮＬＳ（複数可）と融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１～５個のＮＬＳ（複数可）と融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個のＮＬＳと融合され得る。１個のＮＬＳが使用される場合、ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列のＮ末端部またはＣ末端部で連結され得る。これをＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列内に挿入することもできる。他の実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個より多いＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２、３、４、または５個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合され得る。特定の状況では、２個のＮＬＳは、同じ（例えば、２個のＳＶ４０ ＮＬＳ）であってもよく、または異なってもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、カルボキシ末端部で連結された２個のＳＶ４０ ＮＬＳの配列に融合される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合してもよく、１つはＮ末端部に連結しており、１つはＣ末端部に連結している。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、３個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＮＬＳなしで融合され得る。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、単節型配列、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号６０１）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、双節型配列、例えば、ヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６０２）であってもよい。特定の実施形態では、単一のＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤のＣ末端部で連結され得る。１つ以上のリンカーは、任意に、融合部位に含まれる。
上述のように、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする核酸であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、本明細書に記載されるＣａｓ組み込みヌクレアーゼなどの、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが提供されるか、使用されるか、または投与される。以下に記載されるように、Ｃａｓヌクレアーゼを含むｍＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、クリベース、ニッカーゼ、及び／または部位特異的ＤＮＡ結合活性を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするＯＲＦは、「修飾ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤ＯＲＦ」または単に「修飾ＯＲＦ」であり、ＯＲＦが修飾されることを示すための略語として使用される。
修飾Ｃａｓ９ ＯＲＦを含むＣａｓ９ ＯＲＦは、本明細書において提供され、当該技術分野で既知である。一例として、Ｃａｓ９ ＯＲＦは、コード配列が１つ以上のアミノ酸の１つ以上の代替コドンを含むように、コドン最適化することができる。本明細書で使用される「代替コドン」は、所与のアミノ酸についてのコドン使用頻度の変形を指し、所与の発現系に好ましいまたは最適化されたコドン（コドン最適化）であってもなくてもよい。好ましいコドン使用頻度、または所与の発現系において良好に耐容されるコドンは、当該技術分野で既知である。ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１６／１０６１２１、及びＷＯ２０１９／０６７９１０のＣａｓ９コード配列、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、及びＣａｓ９タンパク質配列は、参照により本明細書に組み込まれる。特に、ＷＯ２０１９／０６７９１０の段落［０４４９］の表のＯＲＦ及びＣａｓ９アミノ酸配列、ならびにＷＯ２０１９／０６７９１０の段落［０２１４］～［０２３４］のＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びＯＲＦは、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、修飾ＯＲＦは、少なくとも１つ、複数、または全てのウリジン位置に、修飾ウリジンを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで、５位で修飾されたウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで、１位で修飾されたシュードウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、シュードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、シュードウリジン及びＮ１－メチル－シュードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、シュードウリジン及び５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチルシュードウリジン及び５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジン及びＮ１－メチル－シュードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、シュードウリジン及び５－ヨードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジン及び５－メトキシウリジンの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍＲＮＡは、５’キャップ、例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２を含む。５’キャップは、一般に、ｍＲＮＡの５’－３’鎖の第１のヌクレオチド（すなわち、第１のキャップ近位のヌクレオチド）の５’位に対して５’－トリホスフェートを介して連結した７－メチルグアニンリボヌクレオチド（例えば、ＡＲＣＡに関して、以下で考察されるようにさらに修飾されてもよい）である。Ｃａｐ０において、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１において、ｍＲＮＡの第１及び第２の転写ヌクレオチドのリボースは、それぞれ、２’－メトキシ及び２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ２において、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、２’－メトキシを含む。例えば、Ｋａｔｉｂａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（３３）：１２０２５－３０、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１４（１１）：Ｅ２１０６－Ｅ２１１５を参照されたい。ヒトｍＲＮＡなどの哺乳動物ｍＲＮＡを含む、ほとんどの内因性の高級真核生物ｍＲＮＡは、Ｃａｐ１またはＣａｐ２を含む。Ｃａｐ０ならびにＣａｐ１及びＣａｐ２とは異なる他のキャップ構造は、ＩＦＩＴ－１及びＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素によって「非自己」として認識されるため、ヒトなどの哺乳動物において免疫原性である場合があり、Ｉ型インターフェロンを含むサイトカインレベルの上昇を引き起こし得る。ＩＦＩＴ－１及びＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素はまた、Ｃａｐ１またはＣａｐ２以外のキャップとのｍＲＮＡの結合についてｅＩＦ４Ｅと競合する場合があり、ｍＲＮＡの翻訳を潜在的に阻害する。
キャップは、共転写的に含めることができる。例えば、ＡＲＣＡ（抗逆キャップアナログ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＡＭ８０４５）は、グアニンリボヌクレオチドの５’位に連結する７－メチルグアニン３’－メトキシ－５’－トリホスフェートを含むキャップアナログであり、開始時にインビトロで転写物に組み込むことができる。ＡＲＣＡは、第１のキャップ近位のヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるＣａｐ０キャップをもたらす。例えば、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ‘ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ’ ｃａｐ ａｎａｌｏｇｓ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ）ＧｐｐｐＧ ａｎｄ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’ｄｅｏｘｙ）ＧｐｐｐＧ，”ＲＮＡ ７：１４８６－１４９５を参照されたい。ＡＲＣＡの構造を以下に示す。
Figure 2022512726000001
ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１１３）またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１３３）を使用して、Ｃａｐ１構造を共転写的に提供することができる。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ及びＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧの３’－Ｏ－メチル化態様も、それぞれ、カタログ番号Ｎ－７４１３及びＮ－７４３３としてＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから利用可能である。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧの構造を以下に示す。
Figure 2022512726000002
あるいは、転写後に、キャップをＲＮＡに付加することができる。例えば、Ｖａｃｃｉｎｉａキャッピング酵素は市販されており（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ２０８０Ｓ）、そのＤ１サブユニットによって提供されるＲＮＡトリホスファターゼ及びグアニリルトランスフェラーゼ活性と、そのＤ１２サブユニットによって提供されるグアニンメチルトランスフェラーゼとを有する。したがって、Ｓ－アデノシルメチオニン及びＧＴＰの存在下で、Ｃａｐ０を与えるように、７－メチルグアニンをＲＮＡに付加することができる。例えば、Ｇｕｏ，Ｐ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，４０２３－４０２７、Ｍａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２４４７２－２４４７９を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリアデニル化（ポリ－Ａ）テールをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリ－Ａテールは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアデニンを含み、任意に、３００個までのアデニンを含む。いくつかの実施形態では、ポリ－Ａテールは、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個のアデニンヌクレオチドを含む。
ＩＶ．送達方法
本明細書に開示される核酸構築物は、当該技術分野で利用可能な様々な既知の好適な方法を使用して、宿主細胞または対象に、インビボまたはエクスビボで送達され得る。核酸構築物は、本明細書に記載される好適な遺伝子編集系の構成成分（例えば、その対応するガイドＲＮＡを有するＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤）と一緒に送達され得る。
従来のウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子送達方法を使用して、本明細書に開示される構築物、ならびに細胞（例えば、哺乳動物細胞）及び標的組織内に遺伝子編集系の構成成分を導入することができる。本明細書でさらに提供されるように、非ウイルスベクター送達系は、非ウイルスベクター、プラスミドベクターなどの核酸、ならびに例えば、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、またはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸を含む。ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれる。
核酸の非ウイルス送達のための方法及び組成物には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ウイルソソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ＬＮＰ、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸の核酸（例えば、裸のＤＮＡ／ＲＮＡ）、人工ビリオン、及びＤＮＡの薬剤強化取り込みが含まれる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００系（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションもまた、核酸の送達に使用され得る。
さらなる例示的な核酸送達系としては、ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａ．）、及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）により提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号、及び第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。免疫脂質複合体などの標的リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載される通りである。
双方向性構築物及び／または遺伝子編集構成要素（例えば、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ）を含む様々な送達系（例えば、ベクター、リポソーム、ＬＮＰ）はまた、単独でまたは組み合わせて、インビボで細胞に送達するための生物に投与され得るか、またはエクスビボで細胞もしくは細胞培養物に投与され得る。投与は、限定されないが、注射、注入、局所適用、及びエレクトロポレーションを含む、血液、液体、または細胞との最終的な接触に分子を導入するために通常使用される経路のうちのいずれかによるものである。そのような核酸を投与する好適な方法が利用可能であり、当業者に周知である。
ある特定の実施形態では、本開示は、宿主細胞への送達のために本明細書に開示される双方向性核酸構築物を含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、遺伝子編集系の構成成分（例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及びガイドＲＮＡ）もまた、ベクターの一部として宿主細胞に送達される。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、双方向性核酸構築物、ガイドＲＮＡ、及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤のうちのいずれか１つ以上を宿主細胞に送達するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物を宿主細胞または対象に送達するための組成物及び方法が本明細書に提供され、構築物は、本明細書に記載されるベクター系の一部である。いくつかの実施形態では、ベクター系は、遺伝子編集系の構成成分（例えば、ガイドＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤）などの追加の構成成分を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物を含むベクター組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、組成物は、遺伝子編集系の構成成分（例えば、ガイドＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、環状であってもよい。他の実施形態では、ベクターは、直鎖状であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、脂質ナノ粒子、リポソーム、非脂質ナノ粒子、またはウイルスカプシドを介して送達され得る。非限定的な例示的なベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、トランスポゾン、ウイルスベクター、及び発現ベクターを含む。
いくつかの実施形態では、ベクター系は、細胞内で１つ以上のヌクレアーゼ構成要素の発現を駆動することができる場合がある。いくつかの実施形態では、双方向性構築物は、任意にベクター系の一部として、細胞内でコード配列の発現を駆動することができるプロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物細胞などの真核生物細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、げっ歯類細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、ヒト細胞であってもよい。異なる種類の細胞における発現を駆動するための好適なプロモーターは、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、野生型であってもよい。他の実施形態では、プロモーターは、より効率的または効果的な発現のために修飾されてもよい。さらに他の実施形態では、プロモーターは短縮されているが、依然としてその機能を維持し得る。例えば、プロモーターは、ウイルスへのベクターの適切なパッケージングに好適な通常のサイズまたは低減されたサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞において１つ以上のコード配列の発現を駆動するプロモーターを含まない（例えば、コード配列の発現は、標的内因性遺伝子座に挿入されると、内因性プロモーターによって駆動される）。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、その野生型の対応物から遺伝子組換えされてもよい。例えば、ウイルスベクターは、クローニングを促進するため、またはベクターの１つ以上の特性を変更するようにするため、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。このような特性は、パッケージング能力、形質導入効率、免疫原性、ゲノム組み込み、複製、転写、及び翻訳を含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムの一部分は、ウイルスがより大きなサイズを有する外来性配列をパッケージングすることができるように、削除され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、増強した形質導入効率を有し得る。いくつかの実施形態では、宿主におけるウイルスによって誘発される免疫応答は低減され得る。いくつかの実施形態では、宿主ゲノムへのウイルス配列の組み込みを促進するウイルス遺伝子（例えば、インテグレースなど）は、ウイルスが非組み込み性になるように変異され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、複製欠損であってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ベクター上のコード配列の発現を駆動する外来性の転写または翻訳の制御配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ヘルパー依存性であってもよい。例えば、ウイルスは、ベクターを増幅し、ウイルス粒子にパッケージングするのに必要とされるウイルスの構成要素（例えば、ウイルスタンパク質など）を供給するための１つ以上のヘルパーウイルスを必要とし得る。このような場合、ウイルス構成要素をコードする１つ以上のベクターを含む１つ以上のヘルパー構成要素は、本明細書に記載されるベクター系と共に宿主細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ヘルパーフリーであってもよい。例えば、ウイルスは、ヘルパーウイルスなしでベクターを増幅及びパッケージングすることが可能であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるベクター系はまた、ウイルス増幅及びパッケージングに必要なウイルスの構成要素をコードし得る。
核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、対象に（インビボで）直接的に投与することができるか、またはそれらを使用して、インビトロで細胞を処置することができる。いくつかの実施形態では、インビトロで修飾された細胞は、対象に投与される（例えば、対象由来またはドナー源由来の細胞のエクスビボ操作として）。非限定的な例示的なウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）ベクター、バクテリオファージＴ４、バキュロウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターが含まれる。宿主ゲノム内の組み込みは、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法により可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞型及び標的組織において高い形質導入効率が観察されている。
レトロウイルスのトロピズムは、外来エンベロープタンパク質を組み込むことによって変更することができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができ、かつ典型的には高ウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング容量を有するシス作用長末端反復からなる。最小シス作用ＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングに十分であり、次いで、これを使用して、導入遺伝子を含む双方向性構築物を標的細胞に組み込み、永続的な導入遺伝子発現を提供する。幅広く使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせに基づくものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率を有することができ、細胞分裂を必要としない。このようなベクターにより、高力価及び高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系において大量に生成され得る。複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、高力価で生成することができ、いくつかの異なる細胞型に容易に感染する。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、及び／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作され、その後、複製欠損ベクターは、トランスで欠失した遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞で増殖する。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、及び筋肉に見られるものなどの非分裂分化細胞を含む複数の型の組織をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな輸送容量を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を伴った（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－９（１９９８））。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５－１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３－１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５－１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７－６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７－５１３ ０１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－１０８９（１９９８）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、本明細書に提供される双方向性核酸構築物を送達するために使用される。ＡＡＶベクターは周知であり、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ生成、ならびにインビボ及びエクスビボ遺伝子治療手順において、標的核酸を有する細胞を形質導入するために使用されている（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４））を参照されたい。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）、及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）を含むいくつかの出版物に記載されている。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶＬＫ０３であり、ならびに任意の新規のＡＡＶ血清型はまた、本発明に従って使用され得る。ＡＡＶベクター組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、有望な代替核酸送達系、例えば、欠陥及び非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づくものである。
本明細書に使用される場合、「ＡＡＶ」は、全ての血清型、サブタイプ、及び天然に存在するＡＡＶ、ならびに組換えＡＡＶを指す。「ＡＡＶ」は、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びそれらのハイブリッド、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、ならびに天然末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びキャプシドサブユニットの配列は、当該技術分野で既知である。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに見出され得る。本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではない異種配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種の核酸配列）を含むＡＡＶベクターを指し、典型的には、目的の異種ポリペプチドをコードする配列を含む。構築物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びそれらのハイブリッド、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶキャプシド配列を含み得る。一般に、異種核酸配列（導入遺伝子）は、少なくとも１つ、及び一般に２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであってもよい。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、レンチウイルスは、非組み込み性であってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、アデノウイルスは、全てのコードウイルス領域が、５’及び３’の末端逆位配列（ＩＴＲ）から離れており、パッケージングシグナル（「Ｉ」）がウイルスから削除されてそのパッケージング能力が増加している、高クローニング能、または「ガットレス」アデノウイルスであってもよい。さらに他の実施形態では、ウイルスベクターは、ＨＳＶ－１ベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ－１に基づいたベクターは、ヘルパー依存性であり、他の実施形態では、それはベクター非依存性である。例えば、パッケージング配列のみを保持するアンプリコンベクターは、パッケージングのために構造的な構成要素を有するヘルパーウイルスを必要とし、一方で、非必須のウイルス機能を除去した３０ｋｂ欠失ＨＳＶ－１ベクターは、ヘルパーウイルスを必要としない。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、バクテリオファージＴ４であってもよい。いくつかの実施形態では、バクテリオファージＴ４は、ウイルスの頭部が空であるとき、任意の直鎖状または環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をパッケージングすることができる。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、バキュロウイルスベクターであってもよい。なおもさらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであってもよい。より小さいクローニング能力を有するＡＡＶまたはレンチウイルスベクターを使用する実施形態では、本明細書に開示されるようなベクター系の全ての構成要素を送達するために１つを超えるベクターを使用する必要がある場合がある。例えば、１つのＡＡＶベクターは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする配列を含み得、一方で、第２のＡＡＶベクターは、１つ以上のガイド配列を含み得る。
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成する。かかる細胞には、アデノウイルス及びＡＡＶをパッケージングすることができる２９３細胞、ならびにレトロウイルスをパッケージングするΨ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子療法で使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングに必要な最小のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする配列によって置き換えられる。欠損しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法で使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングに必要なＡＡＶゲノム由来の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株においてパッケージングされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染し得る。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。
遺伝子療法ベクターは、以下に記載されるように、個々の患者への投与、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所適用によって、インビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、個々の患者から摘出された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）またはユニバーサルドナー造血幹細胞などの細胞にエクスビボで送達され、続いて、通常、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞を患者に再移植することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物に加えて、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物に加えて、ベクター系は、ガイドＲＮＡをコードする核酸、及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質であり得る）をコードする核酸をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードする核酸及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤もしくはヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に開示される双方向性構築物を含むベクターとは別個のベクター上に各々または両方にある。実施形態のうちのいずれかでは、ベクター系は、本明細書に記載されるように、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、制御配列を含む他の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ベクター系内のプロモーターは、双方向性構築物の導入遺伝子の発現を駆動しない。いくつかの実施形態では、ベクター系は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとを含み、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）であり得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとを含み、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼであり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであり得る）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来の反復配列の全てまたは一部分が隣接するガイド配列を含むか、またはそれらからなる。ベクター系は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含むか、またはそれらからなる核酸を含んでもよく、ベクター系は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡと共に自然に見出されない核酸を含むか、またはそれらからなる。本明細書に記載されるベクターのうちのいずれも、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、微小胞、及び／または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって送達され得る。１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ結合ＤＮＡ結合剤（例えば、ｍＲＮＡ）、または異種タンパク質をコードする配列を含むドナー構築物は、個別にまたは任意の組み合わせで、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞によって送達され得る。１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ結合ＤＮＡ結合剤（例えば、ｍＲＮＡ）、または異種タンパク質をコードする配列を含むドナー構築物は、個別にまたは任意の組み合わせで、ＬＮＰによって送達され得る。本明細書に記載されるＬＮＰ及びＬＮＰ製剤のいずれも、ガイドの送達に好適である。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヌクレオチド及びタンパク質カーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示される双方向性核酸構築物の送達に使用され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、遺伝子編集系の構成成分を送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、タンパク質（例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤）、またはタンパク質と共に核酸を送達する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物を宿主細胞または対象に送達する方法が本明細書に提供され、構築物は、ＬＮＰを介して送達される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物を宿主細胞または対象に送達する方法が本明細書に提供され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系などの遺伝子編集系の１つ以上の構成成分は、ＬＮＰを介して送達される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、双方向性構築物及び／または遺伝子編集系の１つ以上の構成成分（例えば、ガイドＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤もしくはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物及びＬＮＰを含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、遺伝子編集系の構成成分（例えば、ガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓ９もしくはそれをコードすることができるベクター系などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤）をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物、ならびにガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを含む組成物が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、生分解性イオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）とも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート、または別のイオン性脂質を含む。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５３５５９（２０１８年９月２８日出願）、ＷＯ／２０１７／１７３０５４、ＷＯ２０１５／０９５３４０、及びＷＯ２０１４／１３６０８６の脂質、ならびにそこに提供される参照文献を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ脂質の文脈において、陽イオン性及びイオン化可能という用語は、互換的であり、例えば、イオン性脂質は、ｐＨに応じて陽イオン性である。
電気穿孔法は、カーゴの送達のための周知の手段であり、任意の電気穿孔法方法論は、本明細書に開示される双方向性構築物の送達に使用され得る。いくつかの実施形態では、電気穿孔法を使用して、本明細書に開示される双方向性構築物を送達することができ、任意に、同じまたは異なる手段によって送達されるガイドＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡと共に送達することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される双方向性構築物を、インビトロで細胞に送達する方法を含み、双方向性構築物は、ＬＮＰを介して送達される。いくつかの実施形態では、双方向性構築物は、ＡＡＶ系を介してなど、非ＬＮＰ手段によって送達され、ガイドＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡは、ＬＮＰによって送達される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される双方向性構築物は、単独でまたはベクターの一部として、脂質ナノ粒子で製剤化されるか、または脂質ナノ粒子を介して投与され、例えば、ＷＯ／２０１７／１７３０５４を参照されたく、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されるベクターのうちのいずれも、ＬＮＰによって送達され得る。本明細書に記載のＬＮＰ及びＬＮＰ製剤のうちのいずれも、本明細書に開示されるｇＲＮＡ、ＣａｓヌクレアーゼもしくはＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、それらの組み合わせ、及び／または双方向性構築物の送達に好適である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ成分及び脂質成分を含むＬＮＰ組成物が包含され、脂質成分は、生分解性イオン性脂質などのアミン脂質を含み、ＲＮＡ成分は、ガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。
いくつかの例では、脂質成分は、生分解性、イオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＭＧを含む。
遺伝子編集系の構成成分（例えば、ガイドＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤）、及び双方向性構築物は、同じまたは異なる系を使用して送達され得ることが明らかであろう。例えば、ガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤配列、及び双方向性構築物は、同じベクター（例えば、ＡＡＶベクター）によって担持され得るか、または１つ以上のＬＮＰ成分で製剤化され得る。あるいは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（タンパク質またはｍＲＮＡとして）及び／またはｇＲＮＡは、ＬＮＰによって担持され得るか、またはＬＮＰに関連し得るが、一方、双方向性構築物は、ベクターによって担持され得るか、またはその逆であり得る。さらに、異なる送達系は、同じまたは異なる経路によって投与され得る。
異なる送達系は、インビトロまたはインビボで、同時にまたは任意の逐次的順序で送達することができる。いくつかの実施形態では、双方向性構築物、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、インビトロまたはインビボで、同時に、例えば、１つのベクター、２つのベクター、個々のベクター、１つのＬＮＰ、２つのＬＮＰ、個々のＬＮＰ、またはそれらの組み合わせで送達され得る。いくつかの実施形態では、双方向性構築物は、ガイドＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をベクターとして及び／または単独でＬＮＰと会合してまたは合わせてリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）として送達する（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上）前に、ベクターとして及び／またはＬＮＰと会合してインビボまたはインビトロで送達され得る。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、例えば、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、または４週間毎に、複数回投与で送達され得る。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、例えば、１週目、２週目、及び３週目などの１週間間隔で送達され得る。さらなる例として、ガイドＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ベクターとして、及び／または単独でＬＮＰと会合してまたは合わせてリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）として、双方向性構築物をベクターとして及び／またはＬＮＰと会合して送達する（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上）前に、インビボまたはインビトロで送達され得る。いくつかの実施形態では、アルブミンガイドＲＮＡは、例えば、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、または４週間毎に、複数回投与で送達され得る。いくつかの実施形態では、アルブミンガイドＲＮＡは、例えば、１週目、２週目、及び３週目などの１週間間隔で送達され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、複数回投与で送達され得、例えば、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、または４週間毎に送達され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、例えば、１週目、２週目、及び３週目などの１週間間隔で送達され得る。
Ｖ．使用方法
本開示は、様々な用途で本明細書に記載される双方向性核酸構築物を使用する方法を提供する。いくつかの実施形態では、様々な用途で本明細書に記載される双方向性核酸構築物を使用する方法は、本明細書に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系等などの遺伝子編集系の使用を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される双方向性核酸構築物、ガイドＲＮＡ、及び本明細書に記載されるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を宿主細胞に投与または送達することを含む、標的遺伝子座を修飾する（例えば、遺伝子座内の標的部位で導入遺伝子を挿入する）インビトロまたはインビボ方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、任意に本明細書に記載されるガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を切断ステップで使用して、宿主細胞において標的配列を切断すること及び本明細書に記載される双方向性核酸構築物を挿入することを含む、標的遺伝子座を修飾するインビトロまたはインビボ方法が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される双方向性核酸構築物、ガイドＲＮＡ、及び本明細書に記載されるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を宿主細胞に投与または送達することを含む、宿主細胞に構築物を導入するインビトロまたはインビボ方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される双方向性核酸構築物、及びＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系などの遺伝子編集系を宿主細胞に投与または送達することを含む、宿主細胞に構築物を導入するインビトロまたはインビボ方法が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される双方向性核酸構築物、ガイドＲＮＡ、及び本明細書に記載されるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を宿主細胞に投与または送達することを含む、宿主細胞におけるポリペプチドの発現を増加させるインビトロまたはインビボ方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される双方向性核酸構築物、及びＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系などの遺伝子編集系を宿主細胞に投与または送達することを含む、宿主細胞においてポリペプチドの発現を増加させるインビトロまたはインビボ方法が本明細書に提供される。ポリペプチドは、細胞外であってもよい。
双方向性構築物は、核酸ベクターなどのベクターを介して投与され得る。ガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、個別に、または任意の組み合わせで、例えば、ガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを介して投与され得る。宿主細胞への投与及び送達は、本明細書に記載される送達方法のうちのいずれかによってもたらされ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される双方向性核酸構築物、ガイドＲＮＡ、及び本明細書に記載されるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を宿主細胞に投与または送達することを含む、標的遺伝子座で導入遺伝子によってコードされるポリペプチドを発現するインビトロまたはインビボ方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される双方向性核酸構築物、及びＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系などの遺伝子編集系を宿主細胞に投与または送達することを含む、標的遺伝子座で導入遺伝子によってコードされるポリペプチドを発現するインビトロまたはインビボ方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを発現するための宿主細胞を作製する方法は、本明細書に記載される双方向性核酸構築物、及びＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系などの遺伝子編集系を宿主細胞に投与または送達することを含む。
双方向性構築物、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、例えば、本明細書に記載のように、個別に、または任意の組み合わせで投与され得る。いくつかの実施形態では、双方向構築物、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、同時にまたは逐次的に、同時に、例えば、１つのベクター、２つのベクター、個々のベクター、１つのＬＮＰ、２つのＬＮＰ、個々のＬＮＰ、またはそれらの組み合わせで送達され得る。宿主細胞への投与及び送達は、本明細書に記載される送達方法のうちのいずれかによってもたらされ得る。
加えて、いくつかの実施形態では、方法は、例えば、表５、６、７、８、９、及び１０のうちのいずれかから選択される配列を含むガイドＲＮＡを使用する、アルブミンイントロン１などのアルブミン遺伝子座への挿入を伴う。アルブミン遺伝子座への挿入を伴うある特定の実施形態では、個体の循環アルブミンレベルは、正常である。方法は、個体の循環アルブミンレベルを、正常な循環アルブミンレベルに対して±５、±１０、±１５、±２０、または±５０％以内に維持することを含み得る。ある特定の実施形態では、個体のアルブミンレベルは、少なくとも４週目、８週目、１２週目、または２０週目までに、未治療の個体のアルブミンレベルと比較して変化していない。ある特定の実施形態では、個体のアルブミンレベルは、一時的に低下し、次いで、正常レベルに戻る。特に、方法は、血漿アルブミンのレベルにおける有意な変化を検出しないことを含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を、宿主細胞または宿主細胞集団に投与または送達することを含む、ヒトアルブミン遺伝子などのアルブミン遺伝子を修飾する（例えば、二本鎖切断を作成する）方法またはその使用を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、異種ポリペプチドをコードする核酸を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸）のうちのいずれか１つ以上を、宿主細胞または宿主細胞集団に投与または送達することを含む、ヒトアルブミンイントロン１などのアルブミンイントロン１領域を修飾する（例えば、二本鎖切断を作成する）方法またはその使用を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、異種ポリペプチドをコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸）のうちのいずれか１つ以上を、宿主細胞または宿主細胞集団に投与または送達することを含む、肝臓細胞または肝細胞宿主細胞などのヒトセーフハーバーを修飾する（例えば、二本鎖切断を作成する）方法またはその使用を含む。
導入遺伝子の挿入及び／または発現は、本明細書に記載されるように、その同族遺伝子座（例えば、野生型導入遺伝子の内因性遺伝子座への挿入）で、または非同族遺伝子座（例えば、アルブミンなどのセーフハーバー遺伝子座）へのものであり得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、非分裂細胞型である。本明細書で使用される場合、「非分裂細胞」は、末端分化され、分裂しない細胞、ならびに分裂しないが、細胞分裂及び増殖に再び入る能力を保持する静止細胞を指す。例えば、肝臓細胞は、（例えば、傷害または切除されたときに）分裂する能力を保持するが、典型的には分裂しない。有糸分裂細胞分裂中、相同組換えは、ゲノムが保護され、二本鎖切断が修復される機序である。いくつかの実施形態では、「非分裂」細胞は、相同組換え（ＨＲ）が、例えば、対照分裂細胞と比較して、細胞内で二本鎖ＤＮＡ切断が修復される一次機序ではない細胞を指す。いくつかの実施形態では、「非分裂」細胞は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）が、例えば、対照分裂細胞と比較して、細胞内で二本鎖ＤＮＡ切断が修復される一次機序である細胞を指す。非分裂細胞型は、文献に記載されており、例えば、活性ＮＨＥＪ二本鎖ＤＮＡ切断修復機序により記載されている。例えば、Ｉｙａｍａ，ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ．）２０１３，１２（８）：６２０－６３６を参照されたい。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、限定されないが、肝臓細胞、筋肉細胞、またはニューロン細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス、カニクイザル、またはヒト肝細胞などの肝細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス、カニクイザル、またはヒト筋細胞などの筋細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性構築物を含む、上に記載される宿主細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示される双方向性構築物によってコードされる導入遺伝子ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって作製される宿主細胞が本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載される双方向性核酸構築物、及びＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系などの遺伝子編集系を宿主細胞に投与または送達することによって作製される。
本明細書に記載にされる双方向性構築物由来のポリペプチドを発現する方法もまた提供される。同様に、本明細書に記載される双方向性構築物を含む宿主細胞は、構築物によってコードされるポリペプチドを発現することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、分泌ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その機能が分泌ポリペプチドとして通常作用する（例えば、機能的に活性である）ものである。本明細書で使用される「分泌ポリペプチド」は、細胞によって分泌されるタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、細胞内ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その機能が細胞内で通常作用する（例えば、機能的に活性である）ものである。本明細書で使用される「細胞内ポリペプチド」は、可溶性細胞質ポリペプチドを含む、細胞によって分泌されないタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、変異体ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチドの活動亢進型変異体）である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、肝臓タンパク質である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、非肝臓タンパク質である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、限定されないが、第ＩＸ因子及びそのバリアントが含まれる。いくつかの実施形態では、肝臓ポリペプチドは、例えば、限定されないが、チロシン血症、ウィルソン病、テイ・サックス病、高ビリルビン血症（クリグラー・ナジャール）、急性間欠性ポルフィリン症、１型シトルリン血症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、またはメープルシロップ尿症などの肝臓障害に対処するためのポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、方法は、長期的な効果、例えば、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、または２年の効果を達成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、長期的かつ持続的な様式で、例えば、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、または２年の効果で治療効果を達成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチド活性及び／またはレベルのレベルは、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年以上安定する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの定常状態活性及び／またはレベルは、少なくとも７日、少なくとも１４日、または少なくとも２８日までに達成される。さらなる実施形態では、方法は、双方向性構築物の単回投与後、少なくとも１、２、４、もしくは６ヶ月、または少なくとも１、２、３、４、もしくは５年間、異種ポリペプチド活性及び／またはタンパク質レベルを維持することを含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞によるポリペプチドの発現（インビトロまたはインビボにかかわらず）は、導入遺伝子を含む構築物を投与しなかった宿主細胞対照により発現されるレベルに対して、少なくとも２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、またはそれ以上増加される。いくつかの実施形態では、宿主細胞によるポリペプチドの発現（インビトロまたはインビボにかかわらず）は、既知の正常レベル（例えば、健康な対象におけるポリペプチドのレベル）の少なくとも２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、またはそれ以上まで増加される。いくつかの実施形態では、宿主細胞によるポリペプチドの発現（インビトロまたはインビボにかかわらず）は、例えば、対象の細胞、血漿、及び／または血清中で決定される場合、少なくとも約１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５５μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、６５μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、８５μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、９５μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１２０μｇ／ｍｌ、１４０μｇ／ｍｌ、１６０μｇ／ｍｌ、１８０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、２７５μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３２５μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５５０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、６５０μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、８５０μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、１１００μｇ／ｍｌ、１２００μｇ／ｍｌ、１３００μｇ／ｍｌ、１４００μｇ／ｍｌ、１５００μｇ／ｍｌ、１６００μｇ／ｍｌ、１７００μｇ／ｍｌ、１８００μｇ／ｍｌ、１９００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、またはそれ以上まで増加される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法による肝臓関連障害を治療する方法が本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、「肝臓関連障害」は、肝臓組織に対する損傷を直接的に引き起こす障害、肝臓組織に対する損傷から生じる障害、及び／または肝臓における欠損から生じた非肝臓器官もしくは組織の障害を指す。
いくつかの実施形態では、双方向性構築物、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、個別に、または任意の組み合わせで、局所的にまたは全身的に、例えば、静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、双方向性構築物、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、個別に、または任意の組み合わせで、肝循環に投与される。
いくつかの実施形態では、宿主または対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主または対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、宿主または対象は、霊長類である。いくつかの実施形態では、宿主または対象は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ウシ、ブタ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚、または家禽である。
この説明及び例示的な実施形態は、限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書及び添付の請求項の目的について、特に明記しない限り、本明細書及び請求項で使用される量、パーセンテージ、または割合、及び他の数値を表す全ての数字は、どの場合においても「約」という用語によって、まだそれほど修飾されていない程度まで修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうでないことが示されない限り、以下の明細書及び添付の請求項に示される数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。非常に少なくとも、及び均等論の適用を請求項の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
以下の実施例は、ある特定の開示された実施形態を例示するために提供され、本開示の範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１－材料及び方法
クローニング及びプラスミド調製
ＩＴＲに隣接する双方向性挿入構築物を合成し、商業的ベンダーによってｐＵＣ５７－Ｋａｎにクローニングした。得られた構築物（Ｐ００１４７）を、他のベクターの親クローニングベクターとして使用した。他の挿入構築物（ＩＴＲを含まない）も商業的に合成し、ｐＵＣ５７にクローニングした。精製したプラスミドをＢｇｌＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｒ０１４４Ｓ）で消化し、挿入構築物を親ベクターにクローニングした。プラスミドをＳｔｂｌ３（商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ７３７３０３）中で増殖させた。
ＡＡＶ生成
ＨＥＫ２９３細胞におけるトリプルトランスフェクションを使用して、ＡＡＶ８及びＡＡＶＤＪ生成のための目的の構築物と共にゲノムをパッケージングし、得られたベクターを、イオジキサノール勾配超遠心分離法により溶解細胞及び培養培地の両方から精製した（例えば、Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｏｃｔ；２１（１０）：１２５９－７１を参照されたい）。目的の構築物を有するゲノムを含んだトリプルトランスフェクションで使用されるプラスミドは、実施例において「ＰＸＸＸＸ」数で参照され、例えば、表１１も参照されたい。単離したＡＡＶを貯蔵緩衝液（０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含むＰＢＳ）中で透析した。ＩＴＲ領域内に位置するプライマー／プローブを使用して、ｑＰＣＲによってＡＡＶ力価を決定した。
ヌクレアーゼｍＲＮＡのインビトロ転写（「ＩＶＴ」）
Ｎ１－メチルプソイド－Ｕを含むキャップされたポリアデニル化Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（「Ｓｐｙ」）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、直鎖状化プラスミドＤＮＡテンプレート及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロ転写によって生成した。一般に、Ｔ７プロモーター及び１００ｎｔポリ（Ａ／Ｔ）領域を含むプラスミドＤＮＡを、３７℃でＸｂａＩと共にインキュベートし、消化を完了させ、続いて、６５℃でＸｂａＩの熱不活性化を完了させることによって直鎖状化した。直鎖状化プラスミドを、酵素及び緩衝塩から精製した。Ｃａｓ９修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応物を、３７℃で４時間、以下の条件でインキュベートした：５０ｎｇ／μＬの直鎖状化プラスミド、各２ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１－メチルシュードＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、１０ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１Ｕ／μＬのマウスＲｎａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）、ならびに１倍反応緩衝液。ＴＵＲＢＯ Ｄｎａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、最終濃度が０．０１Ｕ／μＬになるように添加し、反応物をさらに３０分間インキュベートしてＤＮＡテンプレートを除去した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキットを使用し、製造者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従って、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを精製した。あるいは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿、酢酸アンモニウム沈殿、及び酢酸ナトリウム沈殿を使用して、またはＬｉＣｌ沈殿法を使用して精製し、続いて、タンジェント流濾過によりさらなる精製を行った。転写物濃度を、２６０ｎｍでの光吸光度を測定することによって決定し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、転写物をＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
以下のＣａｓ９ ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＯＲＦ配列番号７０３もしくは配列番号７０４、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３４２３（参照により本明細書に組み込まれる）の表２４の配列を含む。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡの送達のための脂質製剤
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）とも呼ばれる、イオン性脂質（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む脂質製剤を利用して、細胞及び動物に送達した。
予め混合された脂質製剤（本明細書では「脂質パケット」と称される）を利用する実験について、本明細書にさらに記載されるように、構成要素を、約６．０の脂質アミン対ＲＮＡリンホスフェート（Ｎ：Ｐ）モル比でＲＮＡカーゴ（例えばＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ）と混合される前に、５０：３８：９：３のイオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのモル比で、１００％エタノール中で再構成した。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化された構成要素を利用する実験について、構成要素を、様々なモル比で、１００％エタノール中に希釈した。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ）を２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）に溶解して、約０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴ濃度を得た。
実施例２に記載される実験について、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用し、製造者のプロトコルに従って、脂質及びＲＮＡ溶液をマイクロ流体混合することによって、ＬＮＰを形成した。差動流量を使用して、混合中、水性溶媒対有機溶媒の２：１の比を維持した。混合後、ＬＮＰを収集し、水中に希釈し（約１：１ｖ／ｖ）、室温で１時間保持し、さらに水で希釈した（約１：１ｖ／ｖ）後、最終緩衝液交換を行った。５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）への最終緩衝液交換を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて完了した。必要な場合、Ａｍｉｃｏｎ １００ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で遠心分離することによって、製剤を濃縮した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰを、さらなる使用まで－８０℃で保存した。ＬＮＰを、約４．５の脂質アミン対ＲＮＡホスフェート（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：１のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で、４５：４４：９：２のイオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのモル比で製剤化した。
他の実施例に記載される実験について、クロスフロー技術を使用し、エタノール中の脂質を２体積のＲＮＡ溶液及び１体積の水と衝突噴流混合することによって、ＬＮＰを調製した。エタノール中の脂質を、混合交差部（ｍｉｘｉｎｇ ｃｒｏｓｓ）により、２体積のＲＮＡ溶液と混合した。第４の水の流れを、ライン内のティーを通る交差部の出口流と混合した（ＷＯ２０１６０１０８４０の図２を参照されたい）。ＬＮＰを室温で１時間保持し、さらに水で希釈した（約１：１ｖ／ｖ）。希釈したＬＮＰを、フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）上でタンジェント流濾過を使用して濃縮し、次いで、透析濾過により、５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）へと緩衝液交換した。あるいは、ＴＳＳへの最終緩衝液交換をＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて完了した。必要な場合、Ａｍｉｃｏｎ １００ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で遠心分離することによって、製剤を濃縮した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰを、さらなる使用まで４℃または－８０℃で保存した。ＬＮＰを、約６．０の脂質アミン対ＲＮＡホスフェート（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：１のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で、５０：３８：９：３のイオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのモル比で製剤化した。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及び挿入構築物の細胞培養及びインビトロ送達
Ｈｅｐａ１－６細胞
Ｈｅｐａ１－６細胞を、９６ウェルプレート中に１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、細胞をＬＮＰ及びＡＡＶで処理した。処理前に、培地をウェルから吸引した。ＬＮＰを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、さらに、１０％ＦＢＳ（ＤＭＥＭ中）中で２ｎｇ／ｕｌに希釈し、３７℃で１０分間（５％ＦＢＳの最終濃度で）インキュベートした。ＡＡＶの標的ＭＯＩは１ｅ６であり、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中で希釈した。２ｎｇ／ｕｌで５０μｌの上記希釈ＬＮＰを細胞に添加し（合計１００ｎｇのＲＮＡカーゴを送達する）、続いて、５０μｌのＡＡＶを添加した。ＬＮＰ及びＡＡＶの処理は、数分間隔であった。細胞中の培地の総体積は１００μｌであった。処理後７２時間及び処理後３０日後、これらの処理した細胞からの上清を、以下に記載されるように、ヒトＦＩＸ ＥＬＩＳＡ分析のために収集した。
初代肝細胞
初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）、初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）、及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を解凍し、追加物質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む肝細胞解凍培地に再懸濁させ、続いて、遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化細胞を肝細胞播種培地及びサプリメントパック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に再懸濁した。細胞を計数し、ＰＨＨについては３３，０００細胞／ウェル、ＰＣＨについては５０，０００細胞／ウェル、及びＰＭＨについては１５，０００細胞／ウェルの密度でＢｉｏ－ｃｏａｔ ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉでコーティングした９６ウェルプレート上に播種した。播種した細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２雰囲気での組織培養インキュベーター中で５時間放置し、接着させた。インキュベーション後、細胞を単層形成について調べ、肝細胞維持で３回洗浄し、３７℃でインキュベートした。
脂質パケット送達を利用する実験では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを各々、維持培地中で２ｍｇ／ｍｌに別々に希釈し、各々の２．９μｌを、１２．５μｌの５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５）、及び６．９μｌの水を含むウェル（９６ウェルのＥｐｐｅｎｄｏｒｆプレート中）に添加した。次いで、１２．５μｌの脂質パケット製剤、続いて１２．５μｌの水、及び１５０μｌのＴＳＳを添加した。各ウェルを、肝細胞維持培地を使用して２０ｎｇ／μｌ（総ＲＮＡ含有量に関して）に希釈し、次いで、６％の新鮮なマウス血清で１０ｎｇ／μｌ（総ＲＮＡ含有量に関して）に希釈した。培地をトランスフェクションの前に細胞から吸引し、４０μｌの脂質パケット／ＲＮＡ混合物を細胞に添加し、続いて、ＡＡＶ（維持培地中で希釈した）を１ｅ５のＭＯＩで添加した。培地を、本明細書に記載されるように、分析のために処理後７２時間に収集し、細胞をさらなる分析のために採取した。
ルシフェラーゼアッセイ
細胞培地におけるＮａｎｏＬｕｃ検出を伴う実験では、１体積のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質を、５０体積のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液と組み合わせた。試料の１：１０希釈（５０μｌの試薬＋４０μｌの水＋１０μｌの細胞培地）を使用して、０．５秒の積分時間でＰｒｏｍｅｇａ Ｇｌｏｍａｘランナー上でアッセイを実行した。
細胞培地中のＨｉＢｉｔタグの検出を伴う実験では、ＬｇＢｉＴタンパク質及びＮａｎｏ－ＧｌｏＲ ＨｉＢｉＴ細胞外基質を、室温のＮａｎｏ－ＧｌｏＲ ＨｉＢｉＴ細胞外緩衝液中で、それぞれ１：１００及び１：５０に希釈した。試料の１：１０希釈（５０μｌの試薬＋４０μｌの水＋１０μｌの細胞培地）を使用して、１．０秒の積分時間でＰｒｏｍｅｇａ Ｇｌｏｍａｘランナー上でアッセイを実行した。
ＬＮＰ及び／またはＡＡＶのインビボ送達
マウスに、ＡＡＶ、ＬＮＰ、ＡＡＶ及びＬＮＰの両方、またはビヒクル（ＡＡＶビヒクルについてはＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ＬＮＰビヒクルについてはＴＳＳ）を、外側尾静脈を介して投与した。ＡＡＶを、本明細書に記載される量（ベクターゲノム／マウス、「ｖｇ／ｍｓ」）で、１匹あたり０．１ｍＬの体積で投与した。ＬＮＰをＴＳＳ中で希釈し、本明細書に示される量で、約５μｌ／グラム体重で投与した。典型的には、マウスに、まずＡＡＶを注射し、次いで、適用可能な場合、ＬＮＰを注射した。治療後の様々な時点で、以下にさらに説明されるように、ある特定の分析のために血清及び／または肝臓組織を収集した。
ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）ＥＬＩＳＡ分析
インビトロ研究では、細胞培地中に分泌される総ヒト第ＩＸ因子レベルを、製造者のプロトコルに従って、ヒト第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８８３９３）を使用して決定した。分泌ｈＦＩＸレベルを、４パラメータロジスティックフィットを使用して標準曲線から定量化し、ｎｇ／ｍｌの培地として表した。
インビボ研究では、血液を収集し、示されるようにして血清を単離した。総ヒト第ＩＸ因子血清レベルを、製造者のプロトコルに従って、ヒト第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８８３９３）を使用して決定した。血清ｈＦＩＸレベルを、４パラメータロジスティックフィットを使用して標準曲線から定量化し、μｇ／ｍＬの血清として表した。
次世代シーケンシング（「ＮＧＳ」）及びオンターゲット切断効率の分析
ディープシーケンシングを利用して、遺伝子編集によって導入された挿入及び欠失（例えば、アルブミンのイントロン１内）の存在を同定した。標的部位の周りのＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅した。プライマー配列設計は、この分野で標準的に行われているように実施した。
シーケンシングのために必要な化学的性質を付加するために製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを行った。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置でシーケンシングした。低品質スコアを有する読み取り値を除去した後に、読み取り値を参照ゲノムにアライメントした。読み取り値を含む得られたファイルを、参照ゲノムに対してマッピングし（ＢＡＭファイル）、目的の標的領域と重なり合った読み取り値を選択し、野生型の読み取り値の数対挿入または欠失（「インデル」）を含む読み取り値の数を計算した。
編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」または「編集率」）は、野生型を含む配列読み取り値の総数に対する、挿入または欠失（「インデル」）を含む配列読み取り値の総数として定義される。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析
ＢａｓｅＳｃｏｐｅ（ＡＣＤｂｉｏ、Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）は、例えば、挿入導入遺伝子（ｈＦＩＸ）及び挿入部位からのコード配列（アルブミンのエクソン１）を含むハイブリッドｍＲＮＡ転写産物において、エクソン接合部の特異的検出を提供することができる、特殊なＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術である。ＢａｓｅＳｃｏｐｅを使用して、ハイブリッドｍＲＮＡを発現する肝臓細胞のパーセンテージを測定した。
ハイブリッドｍＲＮＡを検出するために、双方向性構築物の挿入後に生じ得るハイブリッドｍＲＮＡに対する２つのプローブを、ＡＣＤｂｉｏ（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）によって設計した。一方のプローブは、一方の配向での構築物の挿入から生じるハイブリッドｍＲＮＡを検出するように設計されたが、他方のプローブは、他方の配向での構築物の挿入から生じるハイブリッドｍＲＮＡを検出するように設計された。マウスの異なる群の肝臓を収集し、新鮮凍結して切片化した。製造者のプロトコルに従って、単一のプローブまたはプールされたプローブを使用して、ＢａｓｅＳｃｏｐｅアッセイを行った。スライドをスキャンし、ＨＡＬＯソフトウェアによって分析した。このアッセイの背景（生理食塩水処理群）は０．５８％であった。
実施例２－相同性アームのあり及びなしの挿入テンプレートのインビトロ試験
この実施例では、Ｈｅｐａ１－６細胞を培養し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＧ０００５５１を送達するＬＮＰの存在下または不在下で、例えば、実施例１（ｎ＝３）に記載されるように、様々な形態のＡＡＶを有する挿入テンプレート（例えば、一本鎖ゲノム（「ｓｓＡＡＶ」）または自己相補性ゲノム（「ｓｃＡＡＶ」）のいずれかを有する）で処理した。ＡＡＶ及びＬＮＰを実施例１に記載されるように調製した。処理後、実施例１に記載されるように、培地を導入遺伝子発現（例えば、ヒト第ＩＸ因子レベル）について収集した。
Ｈｅｐａ１－６細胞は、培養物中で分裂し続ける不死化マウス肝臓細胞株である。図２（治療後７２時間の時点）に示されるように、２００ｂｐの相同性アームを含むベクター（プラスミドＰ００２０４に由来するｓｃＡＡＶ）のみが、ｈＦＩＸの検出可能な発現をもたらした。Ｐ００１２３（相同性アームを欠くｓｃＡＡＶ）及びＰ００１４７（相同性アームを欠くｓｓＡＡＶ双方向性構築物）に由来するＡＡＶベクターの使用は、この実験でｈＦＩＸのいかなる検出可能な発現ももたらさなかった。細胞を培養中に維持し、これらの結果は、処理後３０日で再アッセイしたときに確認された（データには示さず）。
実施例３－相同性アームのあり及びなしの挿入テンプレートのインビボ試験
この実施例では、マウスを、実施例２でインビトロで試験されるのと同じプラスミド（Ｐ００１２３、Ｐ００２０４、及びＰ００１４７）に由来するＡＡＶで処置した。投与物質を調製し、実施例１に記載されるように投与した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、各々、３ｅ１１ベクターゲノム（ｖｇ／ｍｓ）、続いてＧ０００５５１（「Ｇ５５１」）を含むＬＮＰを４ｍｇ／ｋｇの用量（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で投与した（各群についてｎ＝５）。投与後４週間で、動物を安楽死させ、それぞれ、編集及び導入遺伝子（例えば、ｈＦＩＸ）発現のために、肝臓組織及び血清を収集した。
図３Ａ及び表１２に示されるように、マウスアルブミンのイントロン１を標的とするｇＲＮＡを含むＬＮＰで処置した動物の各群において、約６０％の肝臓編集レベルを検出した。しかしながら、各処置群においてロバストで一貫したレベルの編集にもかかわらず、ＬＮＰ処置と組み合わせた相同性アームなしのｓｓＡＡＶベクター（Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶベクター）を受けている動物は、血清中で最高レベルのｈＦＩＸ発現をもたらした（図３Ｂ及び表１３）。
表１２：インデル％
Figure 2022512726000003
表１３：第ＩＸ因子レベル
Figure 2022512726000004
実施例４－相同性アームのあり及びなしのｓｓＡＡＶ挿入テンプレートのインビボ試験
この実施例に記載される実験では、インビボで相同性アームをｓｓＡＡＶベクターに組み込む効果を調査した。
この実験で使用された投与物質を調製し、実施例１に記載されるように投与した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ、続いてＧ０００６６６（「Ｇ６６６」）またはＧ０００５５１（「Ｇ５５１」）を含むＬＮＰを０．５ｍｇ／ｋｇの用量（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で投与した（各群についてｎ＝５）。投与後４週間で、導入遺伝子（例えば、ｈＦＩＸ）発現のために動物血清を収集した。
図４Ａ及び表１４に示されるように、Ｇ５５１によって標的化される部位への挿入のための、非対称相同性アーム（それぞれ、プラスミドＰ００３５０、Ｐ００３５６、及びＰ００３６２に由来するベクターについては、３００／６００ｂｐアーム、３００／２０００ｂｐアーム、及び３００／１５００ｂｐアーム）を有するｓｓＡＡＶベクターの使用により、アッセイのための検出下限を下回った循環ｈＦＩＸのレベルが得られた。しかしながら、相同性アームなしで、かつ２つのｈＦＩＸオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を双方向配向で有するｓｓＡＡＶベクター（Ｐ００１４７に由来する）の使用により、各動物における循環ｈＦＩＸの検出可能なレベルが得られた。
同様に、Ｇ６６６によって標的化される部位への挿入のための、対称相同性アーム（それぞれ、プラスミドＰ００３５３及びＰ００３５４に由来するベクターについては５００ｂｐアーム及び８００ｂｐアーム）を有するｓｓＡＡＶベクターの使用により、相同性アーム（Ｐ００１４７に由来する）なしの双方向性ベクターの使用と比較して、より低いが検出可能なレベルが得られた（図４Ｂ及び表１５を参照されたい）。
表１４：血清ＦＩＸレベル
Figure 2022512726000005
表１５：血清ＦＩＸレベル
Figure 2022512726000006
実施例５－初代マウス肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物のインビトロスクリーニング
相同性アームを欠く双方向性構築物が他の配置を有するベクターを上回ることを実証したことにより、この実施例に記載される実験は、双方向性構築物、ここでＯＲＦ、及びスプライスアクセプターのモジュールを改変し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性挿入を標的とするためのｇＲＮＡを改変する効果を調査した。これらの多様な双方向性構築物を、初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）におけるマウスアルブミンのイントロン１を標的とする２０個の異なるｇＲＮＡを利用して、標的部位のパネルにわたって試験した。
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及び脂質パケット送達物質を調製し、実施例１に記載されるようにＰＭＨに送達し、１ｅ５のＭＯＩでＡＡＶと共に行った。処理後、単離されたゲノムＤＮＡ及び細胞培地を、それぞれ編集及び導入遺伝子発現分析のために収集した。ベクターの各々は、実施例１に記載されるように、ルシフェラーゼに基づく蛍光検出により測定することができるレポーターを含み、図５Ｃに相対ルシフェラーゼユニット（「ＲＬＵ」）としてプロットした。例えば、ｈＦＩＸ ＯＲＦを含むＡＡＶベクターは、それらの３’末端で融合したＨｉＢｉｔペプチドを含み、レポーター遺伝子のみを含むＡＡＶベクターは、ＮａｎｏＬｕｃ ＯＲＦを含んでいた（ＧＦＰに加えて）。試験したベクターの各々の概略図を図５Ａに提供する。試験したｇＲＮＡを、表４に列挙されるものについて短縮された数を使用して、図５Ｂ及び５Ｃに示す（例えば、先頭のゼロが省略されている、例えば、「Ｇ５５１」は表４の「Ｇ０００５５１」に対応する）。
図５Ｂ及び表１６に示されるように、試験した各組み合わせにわたって、処置群の各々について、一貫しているが様々なレベルの編集を検出した。テンプレート及びガイドＲＮＡの様々な組み合わせを使用する導入遺伝子発現を図５Ｃ及び表１７に示す。図５Ｄに示されるように、有意なレベルのインデル形成は、必ずしも導入遺伝子のより効率的な発現をもたらすものではなかった。Ｐ００４１１由来テンプレート及びＰ００４１８由来テンプレートを使用して、１０％未満の編集を含むガイドが含まれない場合、Ｒ２値は、それぞれ０．５４及び０．３７であった。マウスアルブミンスプライスアクセプター及びヒトＦＩＸスプライスアクセプターは、各々、有効な導入遺伝子発現をもたらした。興味深いことに、異なるＯＲＦ及びスプライスアクセプターにもかかわらず、ＲＬＵで測定される相対的な発現レベルは、試験された３つのベクター間で一貫しており、双方向性構築物系のロバスト性、再現性、及びモジュール性を実証した（図５Ｃを参照されたい）。
表１６：インデル％
Figure 2022512726000007
表１７：ルシフェラーゼレベル
Figure 2022512726000008
実施例６－標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニング
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにＣ５７Ｂｌ／６マウスに送達して、インビボで標的部位にわたる双方向性構築物の性能を評価した。投与後４週間で、動物を安楽死させ、それぞれ、編集及び導入遺伝子（例えば、ｈＦＩＸ）発現のために、肝臓組織及び血清を収集した。
初期実験では、アルブミンのイントロン１を標的とする１０個の異なるｇＲＮＡを含む１０個の異なるＬＮＰ製剤を、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶと共にマウスに送達した。ＡＡＶ及びＬＮＰを、それぞれ、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ及び４ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した。この実験で試験したｇＲＮＡを図６及び表１８に示す。図６に示され、インビトロで観察されるように、有意なレベルのインデル形成は、導入遺伝子の挿入または発現について予測的でなかった。
別の実験では、実施例５でインビトロで試験した２０個の異なる標的部位を標的とする２０個のｇＲＮＡの完全パネルをインビボで試験した。この目的のために、アルブミンのイントロン１を標的とする２０個のｇＲＮＡを含む２０個のＬＮＰ製剤を、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶと共にマウスに送達した。ＡＡＶ及びＬＮＰを、それぞれ、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ及び１ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した。この実験で試験したｇＲＮＡを、表４に列挙されるものについて短縮した数を使用して、図７Ａ及び７Ｂならびに表１９及び２０に示す。
図７Ａに示されるように、試験した各ＬＮＰ／ベクターの組み合わせにわたって、処置群の各々について、様々なレベルの編集を検出した。しかしながら、図７Ｂに示され、実施例５に記載されるインビトロデータと一致するように、より高いレベルの編集は、必ずしもインビボで導入遺伝子のより高いレベルの発現をもたらすわけではなく、双方向性構築物の編集と挿入／発現との間の相関性の欠如を示す。実際、達成された編集の量と、図７Ｄに提供されるプロットで見られる導入遺伝子（ｈＦＩＸ）発現の量との間には、ほとんど相関が存在しない。特に、１０％未満の編集を達成するｇＲＮＡが分析から除去されるとき、この実験の編集データセットと発現データセットとの間で０．３４のみのＲ２値を計算する。興味深いことに、図７Ｃに示されるように、実施例５のインビトロ実験からＲＬＵで測定される発現のレベルを、この実験で検出されたインビボでの導入遺伝子発現レベルと比較する相関プロットが提供され、Ｒ２値は０．７０であり、初代細胞スクリーニングとインビボ治療との間の正の相関を実証する。
細胞レベルでの双方向性構築物の挿入を評価するために、処置された動物由来の肝臓組織を、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＢａｓｅＳｃｏｐｅ）を使用して、例えば、実施例１に記載されるようにアッセイした。このアッセイは、ｈＦＩＸ導入遺伝子とマウスアルブミンエクソン１配列との間の接合部を検出することができるプローブをハイブリッド転写産物として利用した。図８Ａに示されるように、ハイブリッド転写産物に対して陽性の細胞を、ＡＡＶ及びＬＮＰの両方を受けた動物において検出した。具体的には、ＡＡＶのみを投与する場合、１．０％未満の細胞がハイブリッド転写産物に対して陽性であった。Ｇ０１１７２３、Ｇ０００５５１、またはＧ０００６６６を含むＬＮＰの投与では、４．９％、１９．８％、または５２．３％の細胞がハイブリッド転写産物に対して陽性であった。さらに、図８Ｂ及び表１４に示されるように、循環ｈＦＩＸレベルは、ハイブリッド転写産物に対して陽性であった細胞の数と相関していた。最後に、アッセイは、いずれかの配向での双方向性構築物の挿入を検出することができるプールされたプローブを利用した。しかしながら、単一の配向のみを検出する単一のプローブを使用した場合、ハイブリッド転写産物に対して陽性であった細胞の量は、プールされたプローブを使用して検出された細胞の約半分であり（一実施例では、４．４６％対９．６８％）、双方向性構築物がいずれかの配向で挿入することが実際に可能であり、タンパク質レベルでの導入遺伝子発現の量と相関する発現されたハイブリッド転写産物をもたらすことを示唆している。
表１８：第ＩＸ因子レベル及びインデル％
Figure 2022512726000009
表１９：肝臓編集％
Figure 2022512726000010
表２０：ＦＩＸレベル
Figure 2022512726000011
実施例７－インビボでのｈＦＩＸ発現の耐久性
この実施例では、処置された動物における経時的なｈＦＩＸ発現の耐久性を評価した。この目的のために、１年間の耐久性研究の一部として、投与後の処置された動物の血清においてｈＦＩＸを測定した。
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにＣ５７Ｂｌ／６マウスに送達した。ＬＮＰ製剤は、Ｇ０００５５１を含み、ｓｓＡＡＶは、Ｐ００１４７に由来した。ＡＡＶを３ｅ１１ｖｇ／ｍｓで送達し、ＬＮＰを０．２５または１．０ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）のいずれかで送達した（各群についてｎ＝５）。
図９Ａ及び９Ｂならびに表２１及び２２に示されるように、ｈＦＩＸ発現を、両群について評価した各時点でそれぞれ４１週間または５２週間まで維持した。図９Ａの８週間で観察されるレベルの低下は、ＥＬＩＳＡアッセイの変動性に起因すると考えられる。ＥＬＩＳＡにより２週目及び４１週目に血清アルブミンレベルを測定し、研究全体にわたって循環アルブミンレベルが維持されることを示した。
表２１：ｈＦＩＸレベル
Figure 2022512726000012
表２２：ｈＦＩＸレベル
Figure 2022512726000013
実施例８－インビボでｈＦＩＸ発現を調節するための様々な用量のＡＡＶ及びＬＮＰの効果
この実施例では、ｈＦＩＸの発現を調節するためのＡＡＶ及びＬＮＰの両方の用量を変化させる効果をＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて評価した。
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにマウスに送達した。ＬＮＰ製剤は、Ｇ０００５５３を含み、ｓｓＡＡＶは、Ｐ００１４７に由来した。ＡＡＶを１ｅ１１、３ｅ１１、１ｅ１２、または３ｅ１２ｖｇ／ｍｓで送達し、ＬＮＰを０．１、０．３、または１．０ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した（各群についてｎ＝５）。投与後２週間で、動物を安楽死させた。ｈＦＩＸ発現分析のために、２つの時点で血清を収集した。
図１０Ａ（１週間）、図１０Ｂ（２週間）、及び表２３に示されるように、ＡＡＶまたはＬＮＰのいずれかの用量を変化させることにより、インビボでのｈＦＩＸの発現の量を調節することができる。
表２３：血清ｈＦＩＸ
Figure 2022512726000014
実施例９－初代カニクイザル及び初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物のインビトロスクリーニング
この実施例では、双方向性構築物を含むｓｓＡＡＶベクターを、それぞれ、初代カニクイザル（ＰＣＨ）及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）におけるカニクイザル（「ｃｙｎｏ」）及びヒトアルブミンのイントロン１を標的とするｇＲＮＡを利用して、標的部位のパネルにわたって試験した。
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及び脂質パケット送達物質を調製し、実施例１に記載されるようにＰＣＨ及びＰＨＨに送達した。処理後、単離されたゲノムＤＮＡ及び細胞培地を、それぞれ編集及び導入遺伝子発現分析のために収集した。ベクターの各々は、実施例１に記載されるように、ルシフェラーゼに基づく蛍光検出により測定することができるレポーターを含み（Ｐ００４１５に由来）、図１１Ｂ及び１２Ｂに相対ルシフェラーゼユニット（「ＲＬＵ」）としてプロットした。例えば、ＡＡＶベクターは、ＮａｎｏＬｕｃ ＯＲＦを含んでいた（ＧＦＰに加えて）。試験したベクターの概略図を図１１Ｂ及び１２Ｂに提供する。試験したｇＲＮＡを、表１及び表７に列挙されるものについて短縮した数を使用して図の各々に示す。
ＰＣＨについては図１１Ａ、及びＰＨＨについては図１２Ａに示されるように、試験した組み合わせの各々について様々なレベルの編集を検出した（ＰＣＨ実験で試験したいくつかの組み合わせについての編集データは、アンプリコンに基づくシーケンシングに使用したある特定のプライマー対の不良に起因して図１１Ａ及び表１に報告されない）。図１１Ａ及び１２Ａに図表で示される編集データは、以下の表１及び表２に数値的に再現される。しかしながら、図１１Ｂ、１１Ｃ、ならびに図１２Ｂ及び１２Ｃに示されるように、導入遺伝子の挿入または発現について有意なレベルのインデル形成は予測的ではなく、それぞれ、ＰＣＨ及びＰＨＨにおける双方向性構築物の編集と挿入／発現との間の相関がほとんどないことを示している。一尺度として、図１１Ｃで算出したＲ２値は０．１３であり、図１２ＤのＲ２値は０．２２である。
表１：初代カニクイザル肝細胞に送達されたｓｇＲＮＡについてのアルブミンイントロン１編集及び導入遺伝子発現データ
Figure 2022512726000015
表２：初代ヒト肝細胞に送達されたｓｇＲＮＡについてのアルブミンイントロン１編集及び導入遺伝子発現データ
Figure 2022512726000016
加えて、双方向性構築物を含むｓｓＡＡＶベクターを、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）におけるヒトアルブミンのイントロン１を標的とする単一ガイドＲＮＡを利用して、標的部位のパネルにわたって試験した。
ｓｓＡＡＶ及びＬＮＰ物質を調製し、実施例１に記載されるようにＰＨＨに送達した。処理後、単離されたゲノムＤＮＡ及び細胞培地を、それぞれ編集及び導入遺伝子発現分析のために収集した。上記のように、ベクターの各々は、実施例１に記載されるように、ルシフェラーゼに基づく蛍光検出により測定することができるレポーターを含み（プラスミドＰ００４１５に由来）、図１２Ｃにプロットし、表２３に相対ルシフェラーゼユニット（「ＲＬＵ」）として示した。例えば、ＡＡＶベクターは、ＮａｎｏＬｕｃ ＯＲＦを含んでいた（ＧＦＰに加えて）。試験したベクターの概略図を図１１Ｂ及び１２Ｂに提供する。試験したｇＲＮＡを、表１及び表７に列挙されるものについて短縮した数を使用して図１２Ｃに示す。
表２３：初代ヒト肝細胞に送達されたｓｇＲＮＡについてのアルブミンイントロン１導入遺伝子発現データ
Figure 2022512726000017
実施例１０－代替セーフハーバー遺伝子座からの第ＩＸ因子発現のインビボ試験
この実施例では、代替セーフハーバー遺伝子座における双方向性ｈＦＩＸ構築物を含むｓｓＡＡＶの挿入を評価した。代替セーフハーバー遺伝子座への挿入を試験するために、ＡＡＶを上述のように調製した。マウスに、３ｅ１１ｖｇ／マウスの用量でＡＡＶを投与した後、直ちにＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰを、０．３ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。投与後４週間で動物を屠殺し、肝臓及び血液試料を収集した。ＮＧＳにより、肝臓試料中の編集を決定した。血清中のヒトｈＦＩＸレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。ＮＧＳ及びＥＬＩＳＡデータは、代替セーフハーバー遺伝子座内のｈＦＩＸの効果的な挿入及び発現を示した。
実施例１１－非ヒト霊長類におけるヒト第ＩＸ因子遺伝子挿入のインビボ試験
この実施例では、様々なガイドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び／または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の投与によるカニクイザルにおけるヒト第ＩＸ因子遺伝子挿入及びｈＦＩＸタンパク質発現を評価するために、８週間の研究を行った。この研究は、上述のように調製されたＬＮＰ製剤及びＡＡＶ製剤で実施された。各ＬＮＰ製剤は、２：１のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡの重量比で、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含んでいた。ｓｓＡＡＶは、Ｐ００１４７に由来した。
雄のカニクイザルをｎ＝３のコホートで処置した。動物に、表３に記載される用量でのゆっくりとしたボーラス注射または注入によってＡＡＶを投与した。ＡＡＶ処置後、動物は、ゆっくりとしたボーラスまたは注入によって、表３に記載されるように緩衝液またはＬＮＰを受けた。
投与後２週間で、単一の超音波ガイド下経皮生検により肝臓検体を収集した。各生検検体を液体窒素中でフラッシュ凍結し、－８６～－６０℃で保存した。前述のように、肝臓検体の編集分析をＮＧＳシーケンシングによって行った。
第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡ分析のために、投与後７日目、１４日目、２８日目、及び５６日目に動物から血液試料を収集した。採血後、血液試料を収集し、血漿に処理し、分析まで－８６～－６０℃で保存した。
ＥＬＩＳＡにより、全ヒト第ＩＸ因子レベルを血漿試料から決定した。簡潔には、Ｒｅａｃｔｉ－Ｂｉｎｄ９６ウェルマイクロプレート（ＶＷＲカタログ番号ＰＩ１５０４１）を、１μｇ／ｍｌの濃度で捕捉抗体（ヒト第ＩＸ因子抗体に対するマウスｍＡＢ（ＨＴＩ、カタログ番号ＡＨＩＸ－５０４１））でコーティングし、次いで、５％ウシ血清アルブミンを含む１倍ＰＢＳを使用してブロックした。次に、カニクイザル血漿中で希釈した精製ヒト第ＩＸ因子タンパク質（ＥＲＬ、カタログ番号ＨＦＩＸ １００９、ロット番号ＨＦＩＸ４８４０）の試験試料または標準物を、個々のウェル中でインキュベートした。検出抗体（ヒツジ抗ヒト第９因子ポリクローナル抗体、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１２８０４８）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で吸着した。二次抗体（ＨＲＰを有するロバ抗ヒツジＩｇＧ ｐＡｂ、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９７１２５）を１００ｎｇ／ｍＬで使用した。ＴＭＢ基質試薬セット（ＢＤ ＯｐｔＥＩＡカタログ番号５５５２１４）を使用してプレートを現像した。光学密度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｉ３システム）上で、４５０ｎｍで分光光度的に評価し、ＳｏｆｔＭａｘ ｐｒｏ ６．４を使用して分析した。
インデル形成が検出され、編集が生じたことを確認した。ＮＧＳデータは、効果的なインデル形成を示した。ＮＨＰにおけるアルブミン遺伝子座からのｈＦＩＸの発現を、ＥＬＩＳＡによって測定し、表４及び図１３に示す。ｈＦＩＸの血漿レベルは、治療的に有効であると以前に記載されたレベルに達した（Ｇｅｏｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３７７（２３），２２１５－２７，２０１７）。
測定されるように、循環ｈＦＩＸタンパク質レベルを、８週間の研究にわたって維持し（それぞれ、７日目、１４日目、２８日目、及び５６日目の約１３５、約１４０、約１５０、及び約１１０ｎｇ／ｍＬの平均レベルを示す図１３を参照されたい）、約７５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬの範囲のタンパク質レベルを達成した。Ｒ３３８Ｌ機能亢進型ｈＦＩＸバリアントについて約８倍高い特異的活性を使用して、血漿ｈＦＩＸレベルを計算した（Ｓｉｍｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３６１（１７），１６７１－７５，２００９）（１ミリグラムあたり３９０±２８ＵのｈＦＩＸ－Ｒ３３８Ｌのタンパク質特異的活性及び１ミリグラムあたり４５±２．４Ｕの野生型第ＩＸ因子に対するタンパク質特異的活性を報告する）。この実施例で試験した機能亢進型第ＩＸ因子バリアントの機能的に正規化された第ＩＸ因子活性を計算すると、実験は、野生型第ＩＸ因子活性の約２０～４０％に対応する８週間の研究にわたるＮＨＰにおける安定したレベルのヒト第ＩＸ因子タンパク質を達成した（野生型第ＩＸ因子活性の１２～６７％に及ぶ範囲）。
表３：肝臓における編集
Figure 2022512726000018
表４：ｈＦＩＸ発現
Figure 2022512726000019
実施例１２非ヒト霊長類における第ＩＸ因子挿入のインビボ試験
この実施例では、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶ及び／またはＧ００９８６０を含む様々なガイド及び様々なＬＮＰ成分を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の投与後の、カニクイザルにおける第ＩＸ因子遺伝子挿入及びｈＦＩＸタンパク質発現を評価するための研究を行った。
インデル形成をＮＧＳによって測定し、編集が生じたことを確認した。実施例１１に記載されるように、ヒト第ＩＸ因子抗体（ＨＴＩ、カタログ番号ＡＨＩＸ－５０４１）、ヒツジ抗ヒト第９因子ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１２８０４８）、及びＨＲＰを有するロバ抗ヒツジＩｇＧ ｐＡｂ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９７１２５）に対するマウスｍＡＢを使用して、ＥＬＩＳＡによって、総ヒト第ＩＸ因子レベルを血漿試料から決定した。実施例１３の実験で達成されたものよりも３倍超高いヒトＦＩＸタンパク質レベルを、代替のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＮＰを使用して双方向性テンプレートから得た。この研究では、ＥＬＩＳＡアッセイ結果は、ヒトＦＩＸレベルの正常範囲（３～５ｕｇ／ｍＬ、Ａｍｉｒａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３０（９），１５１２－１６，１９８４）以上の循環ｈＦＩＸタンパク質レベルが、少なくとも１４日目及び２８日目の時点までにＮＨＰ中でＧ００９８６０を使用して達成されたことを示す。初期データは、単回用量後１４日目に約３～４μｇ／ｍＬの循環ヒトＦＩＸタンパク質レベルを示し、レベル（約３～５μｇ／ｍＬ）が研究の最初の２８日にわたって維持された。
ＥＬＩＳＡにより循環アルブミンレベルを測定し、ベースラインのアルブミンレベルが２８日の時点で維持されることを示した。研究において、未処置動物における試験されたアルブミンレベルは、±約１５％変化した。処置された動物において、循環アルブミンレベルはわずかに変化し、正常範囲から落ちることなく、レベルは１ヶ月以内にベースラインに回復した。
また、より大きなダイナミックレンジを有するサンドイッチ免疫アッセイによって、循環ヒトＦＩＸタンパク質レベルを決定した。簡潔には、ＭＳＤ ＧＯＬＤ ９６ウェルＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＳＥＣＴＯＲ Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号Ｌ１５ＳＡ－１）を、１％ＥＣＬブロッキング剤（Ｓｉｇｍａ、ＧＥＲＰＮ２１２５）でブロッキングした。ブロッキング溶液をタッピングして除いた後、ビオチン化捕捉抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１１５０３－Ｒ０４４）をプレート上に固定した。組換えヒトＦＩＸタンパク質（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＨＦＩＸ１００９）を使用して、０．５％ＥＣＬブロッキング剤中の較正標準物質を調製した。洗浄後、較正標準物質及び血漿試料をプレートに添加し、インキュベートした。洗浄後、スルホタグ標識と複合体化した検出抗体（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＨＩＸ－５０４１）をウェルに添加し、インキュベートした。あらゆる非結合検出抗体を洗い流した後、リードバッファーＴをウェルに適用した。いかなる追加のインキュベーションもなく、プレートをＭＳＤ Ｑｕｉｃｋ Ｐｌｅｘ ＳＱ１２０機器で撮像し、データをＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ４．０ソフトウェアパッケージ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で分析した。濃度は、平均計算濃度としてｕｇ／ｍｌで表される。試料については、アスタリスクで示されない限り、Ｎ＝３であり、アスタリスクで示される場合はＮ＝２である。ＭＳＤ ＥＬＩＳＡによって測定した場合の、処置した研究群におけるアルブミン遺伝子座からのｈＦＩＸの発現を表２４に示す。
表２４：血清ヒト第ＩＸ因子タンパク質レベル
Figure 2022512726000020
実施例１３－アルブミンヒトガイドのオフターゲット分析
生化学的方法（例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．６、６００－６０６；２０１７を参照されたい）を使用して、アルブミンを標的とするＣａｓ９によって切断される潜在的なオフターゲットゲノム部位を決定した。この実験では、ヒトアルブミンを標的とする１３個のｓｇＲＮＡと、既知のオフターゲットプロファイルを有する２個の対照ガイドを、単離されたＨＥＫ２９３ゲノムＤＮＡを使用してスクリーニングした。生化学アッセイにおいて１６ｎＭのガイド濃度を使用して検出される潜在的なオフターゲット部位の数を表２６に示した。このアッセイは、試験したｓｇＲＮＡについての潜在的なオフターゲット部位を特定した。
表２５：オフターゲット分析
Figure 2022512726000021
上記で使用される生化学的方法などの既知のオフターゲット検出アッセイでは、多くの潜在的なオフターゲット部位は、典型的には、設計によって、他の状況、例えば、目的の初代細胞において検証され得る潜在的な部位について「広範囲のネットをキャストする」ように回収される。例えば、生化学的方法は、典型的には、アッセイが、細胞環境を含まない精製された高分子量ゲノムＤＮＡを利用し、かつ使用されるＣａｓ９ ＲＮＰの用量に依存するため、潜在的なオフターゲット部位の数を過剰に表す。したがって、これらの方法によって特定された潜在的なオフターゲット部位は、特定された潜在的なオフターゲット部位の標的シーケンシングを使用して検証され得る。
実施例１４－分泌タンパク質または非分泌タンパク質の発現のための構築物の構築
双方向性構築物などの構築物は、それらが分泌タンパク質または非分泌タンパク質を発現するように設計され得る。分泌タンパク質の生成のために、構築物は、ポリペプチドをＥＲ内腔に転座するのを補助するシグナル配列を含み得る。あるいは、構築物は、宿主細胞の内因性シグナル配列（例えば、導入遺伝子が宿主細胞のアルブミン遺伝子座に組み込まれるときの内因性アルブミンシグナル配列）を利用し得る。
対照的に、非分泌タンパク質の発現のための構築物は、それらがシグナル配列を含まないように、かつそれらが宿主細胞の内因性シグナル配列を利用しないように設計され得る。これが達成され得るいくつかの方法は、構築物における内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列の組み込みを含む。ＥＭＣＶ ＩＲＥＳなどのＩＲＥＳ配列は、ＩＲＥＳが位置する場所からすぐ下流のｍＲＮＡ内の任意の位置からの翻訳の開始を可能にする。これにより、上流にシグナル配列を含む挿入部位からの宿主細胞の内因性シグナル配列を欠くタンパク質の発現が可能になる（例えば、アルブミン遺伝子座のエクソン１に見出されるシグナル配列は、発現タンパク質に含まれない）。シグナル配列の不在下では、タンパク質は分泌されない。構築物で使用され得るＩＲＥＳ配列の例には、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、害虫ウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、古典的なブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはクリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。
非分泌タンパク質を発現するための代替的なアプローチは、構築物中の目的のポリペプチドの上流に１つ以上の自己切断ペプチドを含むことである。２Ａまたは２Ａ様配列などの自己切断ペプチドは、単一のｍＲＮＡ転写産物から複数の個々のタンパク質を生成するためのリボソームスキッピングシグナルとして機能する。表１１からのプラスミドＩＤ Ｐ００４１５に示されるように、自己切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ）を使用して、２つの導入遺伝子（例えば、ナノルシフェラーゼ及びＧＦＰ）を発現するバイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクターを生成することができる。あるいは、自己切断ペプチドを使用して、宿主細胞の内因性シグナル配列を欠くタンパク質を発現することができる（例えば、目的のタンパク質の上流に位置する２Ａ配列は、内因性アルブミンシグナル配列と目的のタンパク質との間の切断をもたらす）。利用することができる代表的な２Ａペプチドを表１２に示す。加えて、（ＧＳＧ）残基は、表１２に示されるように、切断効率を改善するために、ペプチドの５’末端に添加されてもよい。
Figure 2022512726000022
表５：ヒトガイドＲＮＡ配列
Figure 2022512726000023
表６：マウスガイドＲＮＡ配列
Figure 2022512726000024
表７：カニクイザルガイドＲＮＡ配列
Figure 2022512726000025
表８．ヒトアルブミンｓｇＲＮＡ及び修飾パターン
Figure 2022512726000026
Figure 2022512726000027
Figure 2022512726000028
Figure 2022512726000029
Figure 2022512726000030
表９．マウスアルブミンガイドｓｇＲＮＡ及び修飾パターン
Figure 2022512726000031
Figure 2022512726000032
Figure 2022512726000033
表１０：カニクイザルｓｇＲＮＡ及び修飾パターン
Figure 2022512726000034
Figure 2022512726000035
Figure 2022512726000036
Figure 2022512726000037
Figure 2022512726000038
Figure 2022512726000039
Figure 2022512726000040
表１１：ベクター成分及び配列
Figure 2022512726000041
ヒトアルブミンイントロン１：（配列番号１）
ＧＴＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＧＴＴＣＡＡＣＴＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＧＴＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＴＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＴＴＴＡＴＴＴＣＴＡＡＡＡＴＧＧＣＡＴＡＧＴＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＴＴＡＣＡＡＧＧＴＴＡＴＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＣＣＴＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＴＣＡＧＡＡＴＴＧＴＴＴＡＧＴＧＡＣＴＧＴＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＧＣＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＡＡＣＴＴＡＧＡＧＴＧＡＣＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＣＡＧＡＡＴＡＧＧＧＴＴＧＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＴＣＴＣＡＴＡＡＡＴＡＧＡＡＣＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＴＡＡＡＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧＡＴＡＴＴＡＴＣＴＡＡＧＴＴＴＧＡＡＴＡＴＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＧＧＴＡＡＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＴＣＴＡＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＣＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＴＡＴＴＴＡＡＣＡＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧ
５’ＩＴＲ配列（配列番号２６３）：
ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
マウスアルブミンスプライスアクセプター（第１の配向）（配列番号２６４）：
ＴＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＴＡＴＴＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＡＧ
ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）、第１の配向（配列番号２６５）：
ＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＡＣＣＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＡＣＴＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＴＧＴＧＡＧＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＴＴＡＧＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＴＣＧＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＡＣＣＣＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＧＧＴＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＴＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＣＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＡＴＣＧＴＴＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＴＴＧＴＣＧＣＡＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＡＴＡＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＧＡＡＴＴＡＴＴＣＣＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＧＡＡＣＣＣＴＴＡＧＴＧＣＴＡＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＴＴＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＣＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＡＴＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＴＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＣＡＧＣＴＴＴＡＧＴＴＣＴＴＣＡＧＴＡＣＣＴＴＡＧＡＧＴＴＣＣＡＣＴＴＧＴＴＧＡＣＣＧＡＧＣＣＡＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＡＧＧＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＣＣＣＣＡＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＡＣＣＡＧＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＴＧＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＡＣＣＡＡＧＧＴＡＴＣＣＣＧＧＴＡＴＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＴＴＡＡ
ポリＡ（第１の配向）（配列番号２６６）：
ＣＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＧＧＧＧＧＴＡＴＣＣＣＣ
ポリＡ（第２の配向）（配列番号２６７）：
ＡＡＡＡＡＡＣＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡＴＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧ
ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）、第２の配向（配列番号２６８）：
ＴＴＡＧＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡＴＴＣＡＣＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＣＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＡＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＣＣＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＴＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＡＡＡＣＴＴＧＴＴＣＣＴＴＣＧＡＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＧＴＧＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＴＣＡＣＣＴＴＧＧＣＡＴＧＡＧＴＣＧＣＧＡＣＣＧＣＣＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＡＴＴＧＴＡＡＡＴＣＧＴＡＡＡＴＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＧＴＣＧＣＴＣＴＡＴＣＧＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＣＧＣＡＡＡＴＡＴＴＧＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＧＡＴＣＧＡＣＣＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＴＣＡＣＡＴＡＴＣＣＧＣＴＣＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＡＣＡＡＡＴＣＧＧＧＧＴＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＴＡＣＧＡＧＴＧＧＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＴＧＴＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＡＧＣＧＧＣＡＴＴＡＴＡＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＧＧＴＡＴＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＡＣＡＴＴＣＣＴＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＧＴＡＴＧＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＣＣＧＴＡＡＴＣＴＴＡＡＣＣＣＣＣＧＴＣＴＣＧＡＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＡＡＴＣＣＡＣＴＴＴＴＣＡＴＴＧＡＣＴＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＣＣＧＴＴＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＧＴＣＣＴＣＧＣＣＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＣＴＡＧＴＡＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＡＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＡＴＴＡＴＣＡＡＧＡＡＴＣＧＴＴＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＴＡＡＣＧＴＡＧＴＣＣＡＣＡＴＣＧＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴＧＴＣＡＡＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＣＴＴＡＣＣＣＧＡＣＣＧＣＡＣＧＧＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＡＧＣＧＡＧＣＣＧＧＴＡＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴＧＴＣＧＧＣＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＣＡＧＡＡＴＴＧＣＴＣＧＣＡＴＣＧＴＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣＧＴＣＣＡＡＣＴＣＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＣＴＣＧＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＴＡＴＣＧＴＣＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＣＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＧＧＡＴＴＡＧＡＴＴＣＧＣＡＴＴＧＧＴＣＣＣＣＡＴＣＧＡＣＡＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴＣＡＧＴＧＧＴＣＣＧＴＴＣＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＣＣＴＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＣＡＣＴＣＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＴＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＣＣＴＴＴＴＡＧＧＣＣＧＧＴＴＡＡＧＴＡＴＣＴＴＡＴＴＣＧＣＧＴＴＴＴＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＡＡＡ
マウスアルブミンスプライスアクセプター（第２の配向）（配列番号２６９）：
ＣＴＧＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＡＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＡ
３’ＩＴＲ配列（第２の配向）（配列番号２７０）：
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ヒト第ＩＸ因子スプライスアクセプター（第１の配向）（配列番号２７１）：
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ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）－ＨｉＢｉｔ（第１の配向）（配列番号２７２）：
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ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）－ＨｉＢｉｔ（第２の配向）（配列番号２７３）：
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ヒト第ＩＸ因子スプライスアクセプター（第２の配向）（配列番号２７４）：
ＣＴＧＡＡＡＴＧＴＡＡＡＡＧＡＡＴＡＡＴＴＣＴＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＡＣＡＴＣＴＣＴＴＡＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＣＣＡＡＡＴＡＡＴＣ
Ｎｌｕｃ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（第１の配向）（配列番号２７５）：
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Ｎｌｕｃ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（第２の配向）（配列番号２７６）：
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Ｐ００１４７完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２７７）
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Ｐ００４１１完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２７８）
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Ｐ００４１５完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２７９）
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Ｐ００４１８完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８０）
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Ｐ００１２３完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８１）
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Ｐ００２０４完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８２）
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Ｐ００３５３完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８３）
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Ｐ００３５４完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８４）
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Ｐ００３５０：３００／６００ｂｐのＨＡ Ｆ９構築物（Ｇ５５１について）（配列番号２８５）
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Ｐ００３５６：３００／２０００ｂｐのＨＡ Ｆ９構築物（Ｇ５５１について）（配列番号２８６）
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Ｐ００３６２：３００／１５００ｂｐのＨＡ Ｆ９構築物（Ｇ５５１について）（配列番号２８７）
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Ｃａｓ９ ＯＲＦ（配列番号７０３）
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Ｕ ｄｅｐ Ｃａｓ９（配列番号７０５）を含むｍＲＮＡ
ＧＧＧＵＣＣＣＧＣＡＧＵＣＧＧＣＧＵＣＣＡＧＣＧＧＣＵＣＵＧＣＵＵＧＵＵＣＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＣＧＵＵＧＣＡＧＧＣＣＵＵＡＵＵＣＧＧＡＵＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＵＡＣＡＧＣＡＵＣＧＧＡＣＵＧＧＡＣＡＵＣＧＧＡＡＣＡＡＡＣＡＧＣＧＵＣＧＧＡＵＧＧＧＣＡＧＵＣＡＵＣＡＣＡＧＡＣＧＡＡＵＡＣＡＡＧＧＵＣＣＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＧＵＵＣＡＡＧＧＵＣＣＵＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡＵＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＣＵＧＡＵＣＧＧＡＧＣＡＣＵＧＣＵＧＵＵＣＧＡＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＵＧＡＡＧＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＵＡＣＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＡＵＣＵＧＣＵＡＣＣＵＧＣＡＧＧＡＡＡＵＣＵＵＣＡＧＣＡＡＣＧＡＡＡＵＧＧＣＡＡＡＧＧＵＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＵＵＣＵＵＣＣＡＣＡＧＡＣＵＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＵＵＣＣＵＧＧＵＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡＡＡＧＡＣＡＣＣＣＧＡＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＣＡＵＣＧＵＣＧＡＣＧＡＡＧＵＣＧＣＡＵＡＣＣＡＣＧＡＡＡＡＧＵＡＣＣＣＧＡＣＡＡＵＣＵＡＣＣＡＣＣＵＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＵＧＧＵＣＧＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＡＧＧＣＡＧＡＣＣＵＧＡＧＡＣＵＧＡＵＣＵＡＣＣＵＧＧＣＡＣＵＧＧＣＡＣＡＣＡＵＧＡＵＣＡＡＧＵＵＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＵＵＣＣＵＧＡＵＣＧＡＡＧＧＡＧＡＣＣＵＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＧＡＣＧＵＣＧＡＣＡＡＧＣＵＧＵＵＣＡＵＣＣＡＧＣＵＧＧＵＣＣＡＧＡＣＡＵＡＣＡＡＣＣＡＧＣＵＧＵＵＣＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＵＣＡＡＣＧＣＡＡＧＣＧＧＡＧＵＣＧＡＣＧＣＡＡＡＧＧＣＡＡＵＣＣＵＧＡＧＣＧＣＡＡＧＡＣＵＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＵＧＧＡＡＡＡＣＣＵＧＡＵＣＧＣＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧＧＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＣＵＧＵＵＣＧＧＡＡＡＣＣＵＧＡＵＣＧＣＡＣＵＧＡＧＣＣＵＧＧＧＡＣＵＧＡＣＡＣＣＧＡＡＣＵＵＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＵＵＣＧＡＣＣＵＧＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＣＡＡＡＧＣＵＧＣＡＧＣＵＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＣＡＵＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＵＧＧＡＣＡＡＣＣＵＧＣＵＧＧＣＡＣＡＧＡＵＣＧＧＡＧＡＣＣＡＧＵＡＣＧＣＡＧＡＣＣＵＧＵＵＣＣＵＧＧＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＣＣＵＧＡＧＣＧＡＣＧＣＡＡＵＣＣＵＧＣＵＧＡＧＣＧＡＣＡＵＣＣＵＧＡＧＡＧＵＣＡＡＣＡＣＡＧＡＡＡＵＣＡＣＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＣＵＧＡＧＣＧＣＡＡＧＣＡＵＧＡＵＣＡＡＧＡＧＡＵＡＣＧＡＣＧＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＵＧＡＣＡＣＵＧＣＵＧＡＡＧＧＣＡＣＵＧＧＵＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＣＵＧＣＣＧＧＡＡＡＡＧＵＡＣＡＡＧＧＡＡＡＵＣＵＵＣＵＵＣＧＡＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＧＧＡＵＡＣＧＣＡＧＧＡＵＡＣＡＵＣＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＵＵＣＵＡＣＡＡＧＵＵＣＡＵＣＡＡＧＣＣＧＡＵＣＣＵＧＧＡＡＡＡＧＡＵＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＵＧＣＵＧＧＵＣＡＡＧＣＵＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＣＵＧＣＵＧＡＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＣＡＵＵＣＧＡＣＡＡＣＧＧＡＡＧＣＡＵＣＣＣＧＣＡＣＣＡＧＡＵＣＣＡＣＣＵＧＧＧＡＧＡＡＣＵＧＣＡＣＧＣＡＡＵＣＣＵＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＵＵＣＵＡＣＣＣＧＵＵＣＣＵＧＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＵＣＧＡＡＡＡＧＡＵＣＣＵＧＡＣＡＵＵＣＡＧＡＡＵＣＣＣＧＵＡＣＵＡＣＧＵＣＧＧＡＣＣＧＣＵＧＧＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＡＵＵＣＧＣＡＵＧＧＡＵＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＡＣＡＡＵＣＡＣＡＣＣＧＵＧＧＡＡＣＵＵＣＧＡＡＧＡＡＧＵＣＧＵＣＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＡＣＡＧＡＧＣＵＵＣＡＵＣＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＣＡＡＡＣＵＵＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＵＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＧＵＣＣＵＧＣＣＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＣＵＧＣＵＧＵＡＣＧＡＡＵＡＣＵＵＣＡＣＡＧＵＣＵＡＣＡＡＣＧＡＡＣＵＧＡＣＡＡＡＧＧＵＣＡＡＧＵＡＣＧＵＣＡＣＡＧＡＡＧＧＡＡＵＧＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＣＡＵＵＣＣＵＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＡＵＣＧＵＣＧＡＣＣＵＧＣＵＧＵＵＣＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧＧＵＣＡＣＡＧＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＧＡＡＧＧＡＡＧＡＣＵＡＣＵＵＣＡＡＧＡＡＧＡＵＣＧＡＡＵＧＣＵＵＣＧＡＣＡＧＣＧＵＣＧＡＡＡＵＣＡＧＣＧＧＡＧＵＣＧＡＡＧＡＣＡＧＡＵＵＣＡＡＣＧＣＡＡＧＣＣＵＧＧＧＡＡＣＡＵＡＣＣＡＣＧＡＣＣＵＧＣＵＧＡＡＧＡＵＣＡＵＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＵＵＣＣＵＧＧＡＣＡＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＵＣＣＵＧＧＡＡＧＡＣＡＵＣＧＵＣＣＵＧＡＣＡＣＵＧＡＣＡＣＵＧＵＵＣＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＵＧＡＵＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＵＧＡＡＧＡＣＡＵＡＣＧＣＡＣＡＣＣＵＧＵＵＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＵＣＡＵＧＡＡＧＣＡＧＣＵＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＵＡＣＡＣＡＧＧＡＵＧＧＧＧＡＡＧＡＣＵＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＵＧＡＵＣＡＡＣＧＧＡＡＵＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＵＣＣＵＧＧＡＣＵＵＣＣＵＧＡＡＧＡＧＣＧＡＣＧＧＡＵＵＣＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣＵＵＣＡＵＧＣＡＧＣＵＧＡＵＣＣＡＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＵＧＡＣＡＵＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＵＣＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＵＣＡＧＣＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧＣＣＵＧＣＡＣＧＡＡＣＡＣＡＵＣＧＣＡＡＡＣＣＵＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＵＣＡＡＧＡＡＧＧＧＡＡＵＣＣＵＧＣＡＧＡＣＡＧＵＣＡＡＧＧＵＣＧＵＣＧＡＣＧＡＡＣＵＧＧＵＣＡＡＧＧＵＣＡＵＧＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＵＣＧＵＣＡＵＣＧＡＡＡＵＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＡＧＡＡＵＣＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＵＣＡＡＧＧＡＡＣＵＧＧＧＡＡＧＣＣＡＧＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＡＡＣＡＣＣＣＧＧＵＣＧＡＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＣＵＧＣＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＵＧＵＡＣＣＵＧＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＡＧＡＡＣＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＵＧＵＡＣＧＵＣＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣＵＧＧＡＣＡＵＣＡＡＣＡＧＡＣＵＧＡＧＣＧＡＣＵＡＣＧＡＣＧＵＣＧＡＣＣＡＣＡＵＣＧＵＣＣＣＧＣＡＧＡＧＣＵＵＣＣＵＧＡＡＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＵＣＧＡＣＡＡＣＡＡＧＧＵＣＣＵＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＣＧＵＣＣＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＧＵＣＧＵＣＡＡＧＡＡＧＡＵＧＡＡＧＡＡＣＵＡＣＵＧＧＡＧＡＣＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＣＧＣＡＡＡＧＣＵＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＡＧＡＡＡＧＵＵＣＧＡＣＡＡＣＣＵＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＵＧＡＧＣＧＡＡＣＵＧＧＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＵＵＣＡＵＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＵＧＧＵＣＧＡＡＡＣＡＡＧＡＣＡＧＡＵＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＧＵＣＧＣＡＣＡＧＡＵＣＣＵＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＵＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＵＡＣＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＧＣＵＧＡＵＣＡＧＡＧＡＡＧＵＣＡＡＧＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＵＧＧＵＣＡＧＣＧＡＣＵＵＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＵＵＣＵＡＣＡＡＧＧＵＣＡＧＡＧＡＡＡＵＣＡＡＣＡＡＣＵＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＡＣＧＣＡＵＡＣＣＵＧＡＡＣＧＣＡＧＵＣＧＵＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＣＵＧＡＵＣＡＡＧＡＡＧＵＡＣＣＣＧＡＡＧＣＵＧＧＡＡＡＧＣＧＡＡＵＵＣＧＵＣＵＡＣＧＧＡＧＡＣＵＡＣＡＡＧＧＵＣＵＡＣＧＡＣＧＵＣＡＧＡＡＡＧＡＵＧＡＵＣＧＣＡＡＡＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＵＣＧＧＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＧＵＡＣＵＵＣＵＵＣＵＡＣＡＧＣＡＡＣＡＵＣＡＵＧＡＡＣＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＧＧＣＡＡＡＣＧＧＡＧＡＡＡＵＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＣＧＣＵＧＡＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＣＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＡＵＣＧＵＣＵＧＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＡＣＵＵＣＧＣＡＡＣＡＧＵＣＡＧＡＡＡＧＧＵＣＣＵＧＡＧＣＡＵＧＣＣＧＣＡＧＧＵＣＡＡＣＡＵＣＧＵＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＵＣＣＡＧＡＣＡＧＧＡＧＧＡＵＵＣＡＧＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＵＣＣＵＧＣＣＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＵＧＡＵＣＧＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡＣＵＧＧＧＡＣＣＣＧＡＡＧＡＡＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＵＵＣＧＡＣＡＧＣＣＣＧＡＣＡＧＵＣＧＣＡＵＡＣＡＧＣＧＵＣＣＵＧＧＵＣＧＵＣＧＣＡＡＡＧＧＵＣＧＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＧＣＵＧＡＡＧＡＧＣＧＵＣＡＡＧＧＡＡＣＵＧＣＵＧＧＧＡＡＵＣＡＣＡＡＵＣＡＵＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＵＵＣＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＵＣＧＡＣＵＵＣＣＵＧＧＡＡＧＣＡＡＡＧＧＧＡＵＡＣＡＡＧＧＡＡＧＵＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＵＧＡＵＣＡＵＣＡＡＧＣＵＧＣＣＧＡＡＧＵＡＣＡＧＣＣＵＧＵＵＣＧＡＡＣＵＧＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＵＧＣＵＧＧＣＡＡＧＣＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＧＡＡＣＵＧＧＣＡＣＵＧＣＣＧＡＧＣＡＡＧＵＡＣＧＵＣＡＡＣＵＵＣＣＵＧＵＡＣＣＵＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＵＡＣＧＡＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＧＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＡＣＧＡＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＵＧＵＵＣＧＵＣＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＵＡＣＣＵＧＧＡＣＧＡＡＡＵＣＡＵＣＧＡＡＣＡＧＡＵＣＡＧＣＧＡＡＵＵＣＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＵＣＡＵＣＣＵＧＧＣＡＧＡＣＧＣＡＡＡＣＣＵＧＧＡＣＡＡＧＧＵＣＣＵＧＡＧＣＧＣＡＵＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＧＡＵＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＵＣＡＵＣＣＡＣＣＵＧＵＵＣＡＣＡＣＵＧＡＣＡＡＡＣＣＵＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＵＵＣＡＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＣＡＣＡＡＣＡＡＵＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＵＡＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＧＵＣＣＵＧＧＡＣＧＣＡＡＣＡＣＵＧＡＵＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＡＣＡＧＧＡＣＵＧＵＡＣＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＵＣＧＡＣＣＵＧＡＧＣＣＡＧＣＵＧＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＵＣＵＡＧＣＵＡＧＣＣＡＵＣＡＣＡＵＵＵＡＡＡＡＧＣＡＵＣＵＣＡＧＣＣＵＡＣＣＡＵＧＡＧＡＡＵＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＡＵＣＡＡＵＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＵＣＵＣＵＵＵＵＵＣＵＵＵＵＵＣＧＵＵＧＧＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣＵＧＵＣＵＡＡＡＡＡＡＣＡＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵＵＡＡＵＣＡＵＵＵＵＧＣＣＵＣＵＵＵＵＣＵＣＵＧＵＧＣＵＵＣＡＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＡＵＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＵＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ

Claims (81)

  1. 双方向性核酸構築物であって、
    ａ）ポリペプチドなどの薬剤のコード配列を含む第１のセグメント、及び
    ｂ）前記薬剤のコード配列の逆相補体を含む第２のセグメント
    を含み、前記構築物が、ポリペプチドなどの前記薬剤の発現を駆動するプロモーターを含まない、前記双方向性核酸構築物。
  2. 双方向性核酸構築物であって、
    ａ）第１のポリペプチドなどの第１の薬剤のコード配列を含む第１のセグメント、及び
    ｂ）第２のポリペプチドなどの第２の薬剤のコード配列の逆相補体を含む第２のセグメント
    を含み、前記構築物が、前記薬剤（複数可）の発現を駆動するプロモーターを含まない、前記双方向性核酸構築物。
  3. 前記第２のセグメントが、前記第１のセグメントの３’である、請求項１または２に記載の双方向性核酸構築物。
  4. 前記第２のセグメントにおける前記逆相補体の前記コード配列が、前記第１のセグメントの前記第１のコード配列のものとは異なるコドン使用頻度を採用する、請求項１～３のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  5. 前記第２のセグメントが、前記第１のセグメントにおける前記コード配列に対して少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、または約９９％相補性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  6. 前記第２のセグメントの前記コード配列が、前記第１のセグメントにおける前記コード配列によってコードされる１つ以上のアミノ酸の１つ以上の代替コドンを使用して前記ポリペプチドをコードする、請求項１～５のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  7. 前記第２のセグメントが、前記第１のセグメントの前記コード配列の逆相補体、またはその断片を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  8. 前記逆相補体が、
    ａ．前記第１のセグメントの前記コード配列に対して実質的に相補的ではない、
    ｂ．前記第１のセグメントの前記コード配列の断片に対して実質的に相補的ではない、
    ｃ．前記第１のセグメントの前記コード配列に対して高度に相補的である、
    ｄ．前記第１のセグメントの前記コード配列の断片に対して高度に相補的である、
    ｅ．前記第１のセグメントの前記コード配列の前記逆相補体と少なくとも６０％同一である、
    ｆ．前記第１のセグメントの前記コード配列の前記逆相補体と少なくとも７０％同一である、
    ｆ．前記第１のセグメントの前記コード配列の前記逆相補体と少なくとも９０％同一である、
    ｇ．前記第１のセグメントの前記コード配列の前記逆相補体と５０～８０％同一である、及び／または
    ｈ．前記第１のセグメントの前記コード配列の前記逆相補体と６０～１００％同一である、
    請求項７に記載の双方向性核酸構築物。
  9. 前記構築物が、相同性アームを含まない、請求項１～８のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  10. 前記第１のセグメントが、リンカーによって前記第２のセグメントに連結される、請求項１～９のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  11. 前記リンカーが、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００、１５００、２０００のヌクレオチド長である、請求項１０に記載の双方向性核酸構築物。
  12. 前記第１及び第２のセグメントの各々が、ポリアデニル化シグナル配列またはポリアデニル化テール配列などのポリアデニル化配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  13. 前記構築物が、スプライスアクセプター部位を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  14. 前記構築物が、前記第１のセグメントの５’に第１のスプライスアクセプター部位及び前記第２のセグメントの３’に第２のスプライスアクセプター部位を含む、請求項１３に記載の双方向性核酸構築物。
  15. 前記構築物が、二本鎖、場合により二本鎖ＤＮＡである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  16. 前記構築物が、一本鎖、場合により一本鎖ＤＮＡである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  17. 前記ポリペプチドをコードする配列が、コドン最適化される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  18. 前記構築物が、次の末端構造：ヘアピン、ループ、末端逆位反復（ＩＴＲ）、またはトロイドのうちの１つ以上を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  19. 前記構築物が、１、２、または３つの末端逆位反復（ＩＴＲ）を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  20. 前記構築物が、２つ以下のＩＴＲを含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  21. 前記ポリペプチドが、分泌ポリペプチドである、請求項１～２０のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  22. 前記ポリペプチドが、細胞内ポリペプチドである、請求項１～２０のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  23. 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが異なる、請求項２～２２のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  24. 前記ポリペプチドが、バリアントポリペプチドである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  25. 前記ポリペプチドが、肝臓タンパク質である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  26. 前記ポリペプチドが、非肝臓タンパク質である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  27. 前記構築物が、相同性非依存性構築物である、請求項１～２６のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  28. 前記ポリペプチドが、発現されたときに、異種シグナルペプチドを含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  29. 前記核酸が、異種シグナルペプチドをコードする、請求項１～２８のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  30. 前記核酸が、シグナルペプチドをコードしない、請求項１～２７のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  31. 前記ポリペプチドが、発現されたときに、それ自身のシグナルペプチドを含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  32. 前記核酸が、異種ペプチドをコードする、請求項１～３１のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  33. 前記異種ペプチドが、２Ａである、請求項３２に記載の双方向性核酸構築物。
  34. 請求項１～３３のいずれか１項に記載の構築物を含むベクター。
  35. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３４に記載のベクター。
  36. 前記ＡＡＶが、一本鎖ゲノム（ｓｓＡＡＶ）または自己相補性ゲノム（ｓｃＡＡＶ）を含む、請求項３４または３５に記載のベクター。
  37. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びそれらのハイブリッドからなる群から選択される、請求項３４または３５に記載のベクター。
  38. ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む自己相補性（または二本鎖）核酸構築物を含むウイルスベクターであって、前記ベクターが、前記ポリペプチドの発現を駆動するプロモーターを含まない、前記ウイルスベクター。
  39. 前記ベクターが、相同性アームを含まない、請求項３８に記載のベクター。
  40. 請求項１～３３のいずれか１項に記載の構築物を含む脂質ナノ粒子。
  41. 請求項１～３３のいずれか１項に記載の構築物を含む宿主細胞。
  42. 前記宿主細胞が、肝臓細胞、筋肉細胞、またはニューロン細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
  43. 前記宿主細胞が、非分裂細胞型である、請求項４１に記載の宿主細胞。
  44. 前記宿主細胞が、前記構築物によってコードされる前記ポリペプチドを発現する、請求項４１～４３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  45. 前記宿主細胞が、肝細胞である、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  46. 細胞に、請求項１～３３のいずれか１項に記載の構築物、請求項３４～３９のいずれか１項に記載のベクター、または請求項４０に記載のＬＮＰを提供することを含む、標的遺伝子座を修飾する方法。
  47. 構築物を細胞に導入する方法であって、前記細胞に、請求項１～３３のいずれか１項に記載の構築物、請求項３４～３９のいずれか１項に記載のベクター、または請求項４０に記載のＬＮＰを提供することを含む、前記方法。
  48. 細胞においてポリペプチドを発現する方法であって、前記細胞に、請求項１～３３のいずれか１項に記載の構築物、請求項３４～３９のいずれか１項に記載のベクター、または請求項４０に記載のＬＮＰを提供することを含む、前記方法。
  49. 細胞においてポリペプチドの発現を増加させる方法であって、前記細胞に、請求項１～３３のいずれか１項に記載の構築物、請求項３４～３９のいずれか１項に記載のベクター、または請求項４０に記載のＬＮＰを提供することを含む、前記方法。
  50. 前記構築物、ベクター、またはＬＮＰが、インビボで提供される、請求項４６～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記構築物、ベクター、またはＬＮＰが、インビトロで提供される、請求項４６～４９のいずれか１項に記載の方法。
  52. 細胞に、請求項１～３３のいずれか１項に記載の構築物、請求項３４～３９のいずれか１項に記載のベクター、または請求項４０に記載のＬＮＰを提供することを含む、標的遺伝子座を修飾するエクスビボ方法。
  53. 前記細胞が、非分裂細胞型である、請求項４６～５２のいずれかに記載の方法。
  54. 前記細胞にヌクレアーゼを提供することをさらに含み、前記ヌクレアーゼが、部位特異的ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ切断を導入することができる、請求項４６～５３のいずれかに記載の方法。
  55. 前記細胞に、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供することを含む、請求項４６～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記ｇＲＮＡが、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び前記ｇＲＮＡが、前記細胞に同時に提供される、請求項５５または５６に記載の方法。
  58. 前記構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び前記ｇＲＮＡが、任意の順序で、前記細胞に逐次的に提供される、請求項５５または５６に記載の方法。
  59. 前記構築物が、前記ｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を提供する前に、前記細胞に提供される、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または組み合わせたＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及びｇＲＮＡが、前記構築物を提供する前に、前記細胞に提供される、請求項５８に記載の方法。
  61. 前記構築物が、ベクターで提供される、請求項５４～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記構築物が、脂質ナノ粒子で提供される、請求項５４～６０のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸として提供される、請求項５４～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ酵素またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとして提供される、請求項５４～６２のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼである、請求項５４～６２のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クラス２のＣａｓヌクレアーゼ、またはそのバリアントである、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、またはそのバリアントである、請求項５４～６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼである、請求項５４～６７のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記遺伝子座が、アルブミン遺伝子座である、請求項５４～６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記細胞が、非分裂細胞型である、請求項５４～６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 前記細胞が、肝臓細胞、ニューロン細胞、または筋肉細胞である、請求項５４～７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 請求項４６～７１のいずれか１項に記載の方法によって作製される細胞。
  73. 前記細胞が、宿主細胞である、請求項７２に記載の細胞。
  74. 前記宿主細胞が、肝臓細胞、筋肉細胞、またはニューロン細胞である、請求項７３に記載の宿主細胞。
  75. 前記宿主細胞が、非分裂細胞型である、請求項７２～７４のいずれか１項に記載の細胞。
  76. 前記宿主細胞が、前記構築物によってコードされる前記ポリペプチドを発現する、請求項７２～７５のいずれか１項に記載の細胞。
  77. 前記宿主細胞が、肝細胞である、請求項７２～７６のいずれか１項に記載の細胞。
  78. 前記薬剤が、治療用薬剤である、請求項１～３３のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  79. 前記薬剤が、機能性ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはポリペプチドのうちのいずれか１つ以上である、請求項１～３３のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  80. 前記薬剤が、ポリペプチドである、請求項１～３３のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
  81. 前記薬剤が、治療用ポリペプチドである、請求項１～３３のいずれか１項に記載の双方向性核酸構築物。
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