JP2022508716A - Ｎｍｅ２Ｃａｓ９－デアミナーゼ融合タンパク質によるブログラム可能なＤＮＡ塩基編集 - Google Patents

Ｎｍｅ２Ｃａｓ９－デアミナーゼ融合タンパク質によるブログラム可能なＤＮＡ塩基編集 Download PDF

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Abstract

本発明は、遺伝子編集分野に関する。特に、遺伝子編集は、単一ヌクレオチド塩基編集に向けられている。例えば、かかる単一ヌクレオチド塩基編集により、ＯＧ塩基対がＴ＊Ａ塩基対に変換される。本開示の単一ヌクレオチド塩基遺伝子エディターの正確度および精度は、ヌクレオチドデアミナーゼタンパク質に融合したＮｍｅＣａｓ９ヌクレアーゼによって高められる。より多数の適合性プロトスペーサー隣接モチーフと併せてＮｍｅＣａｓ９が小型であることにより、他の従来のＳｐｙＣａｓ９塩基エディタープラットフォームによって標的にできない部位を編集することができる遺伝子編集ウィンドウを有することが本明細書中で企図されるＣａｓ９融合構築物が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１５日出願の米国特許仮出願第６２／７４５，６６６号（その全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。
本発明は、遺伝子編集分野に関する。特に、遺伝子編集は、単一ヌクレオチド塩基編集に向けられている。例えば、かかる単一ヌクレオチド塩基編集により、Ｃ・Ｇ塩基対がＴ・Ａ塩基対に変換される。本開示の単一ヌクレオチド塩基遺伝子エディターの正確度および精度は、ヌクレオチドデアミナーゼタンパク質に融合したＮｍｅＣａｓ９ヌクレアーゼによって高められる。より多数の適合性プロトスペーサー隣接モチーフと併せてＮｍｅＣａｓ９が小型であることにより、他の従来のＳｐｙＣａｓ９塩基エディタープラットフォームによって標的にできない部位を編集することができる遺伝子編集ウィンドウを有することが本明細書中で企図されるＣａｓ９融合構築物が提供される。
多数のヒト疾患は、一塩基の変異によって生じる。かかる遺伝子異常を補正することができることは、これらの遺伝的障害の処置において最も重要である。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質と共に、古細菌および細菌におけるＲＮＡ誘導型適応免疫システムを含む。これらのシステムは、外来遺伝因子に由来する核酸を標的にして不活化することによって免疫を与える。
ＳｐｙＣａｓ９塩基編集プラットフォームは、編集ウィンドウが制限されているために、全ての一塩基変異を標的にするために使用できるわけではない。編集ウィンドウは、ＮＧＧ ＰＡＭに必要であること、および編集される塩基（複数可）のＰＡＭからの距離が、非常に精度が高い必要があることにより、一部制限される。また、ゲノム編集におけるオフターゲット効果の高さは、ＳｐｙＣａｓ９が本質的に関連している。
多種多様なＰＡＭ部位の集団が認識されることに起因してプログラム可能な標的特異性を有する正確度の高いＣａｓ９一塩基編集プラットフォームが当該分野で必要である。
本発明は、遺伝子編集分野に関する。特に、遺伝子編集は、単一ヌクレオチド塩基編集に向けられている。例えば、かかる単一ヌクレオチド塩基編集により、Ｃ・Ｇ塩基対がＴ・Ａ塩基対に変換される。本開示の単一ヌクレオチド塩基遺伝子エディターの正確度および精度は、ヌクレオチドデアミナーゼタンパク質に融合したＮｍｅＣａｓ９ヌクレアーゼによって高められる。より多数の適合性プロトスペーサー隣接モチーフと併せてＮｍｅＣａｓ９が小型であることにより、他の従来のＳｐｙＣａｓ９塩基エディタープラットフォームより優れた遺伝子編集ウィンドウを有することが本明細書中で企図されるＣａｓ９融合構築物が提供される。
１つの実施形態では、本発明は、融合ヌクレオチドデアミナーゼおよびＮ４ＣＣヌクレオチド配列の結合領域を含む変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質を企図する。１つの実施形態では、前記タンパク質は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９である。１つの実施形態では、前記タンパク質は、核局在シグナルタンパク質をさらに含む。１つの実施形態では、前記ヌクレオチドデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼである。１つの実施形態では、前記ヌクレオチドデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼである。１つの実施形態では、タンパク質は、ウラシルグルコシラーゼ阻害剤をさらに含む。１つの実施形態では、前記核局在シグナルタンパク質には、ヌクレオプラスミン（ＮＬＳ）および／またはＳＶ４０ ＮＬＳおよび／またはＣ－ｍｙｃ ＮＬＳが含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、前記結合領域は、プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインである。１つの実施形態では、前記プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインは、前記変異を含む。１つの実施形態では、前記変異は、Ｄ１６Ａ変異である。１つの実施形態では、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質は、ＣＢＥ４をさらに含む。１つの実施形態では、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質は、リンカーをさらに含む。１つの実施形態では、前記リンカーは、７３ａａリンカーである。１つの実施形態では、前記リンカーは、３ｘＨＡ－タグである。
１つの実施形態では、本発明は、最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘである構築物を企図する。
１つの実施形態では、本発明は、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４である構築物を企図する。
１つの実施形態では、本発明は、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩである構築物を企図する。
１つの実施形態では、本発明は、変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質を含むアデノ随伴ウイルスであって、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質が、融合ヌクレオチドデアミナーゼおよびＮ４ＣＣヌクレオチド配列の結合領域を含む、アデノ随伴ウイルスを企図する。１つの実施形態では、前記ウイルスは、アデノ随伴ウイルス８である。１つの実施形態では、前記ウイルスは、アデノ随伴ウイルス６である。１つの実施形態では、前記タンパク質は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９である。１つの実施形態では、前記タンパク質は、核局在シグナルタンパク質をさらに含む。１つの実施形態では、前記ヌクレオチドデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼである。１つの実施形態では、前記ヌクレオチドデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼである。１つの実施形態では、タンパク質は、ウラシルグルコシラーゼ阻害剤をさらに含む。１つの実施形態では、核局在シグナルタンパク質には、ヌクレオプラスミン（ＮＬＳ）および／またはＳＶ４０ ＮＬＳおよび／またはＣ－ｍｙｃ ＮＬＳが含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、前記結合領域は、プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインである。１つの実施形態では、前記プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインは、前記変異を含む。１つの実施形態では、前記変異は、Ｄ１６Ａ変異である。１つの実施形態では、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質は、ＣＢＥ４をさらに含む。１つの実施形態では、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質は、リンカーをさらに含む。１つの実施形態では、前記リンカーは、７３ａａリンカーである。１つの実施形態では、前記リンカーは、３ｘＨＡ－タグである。
１つの実施形態では、本発明は、最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘである構築物を企図する。
１つの実施形態では、本発明は、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４である構築物を企図する。
１つの実施形態では、本発明は、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩである構築物を企図する。
１つの実施形態では、本発明は、方法であって、ａ）ｉ）変異一塩基を有する遺伝子を含むヌクレオチド配列であって、前記遺伝子がＮ４ＣＣヌクレオチド配列に挟まれた、ヌクレオチド配列；ｉｉ）融合ヌクレオチドデアミナーゼおよび前記Ｎ４ＣＣヌクレオチド配列の結合領域を含む変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質を準備すること；ｂ）前記ヌクレオチド配列を、前記結合領域が前記Ｎ４ＣＣヌクレオチド配列に付着するような条件下で、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質と接触させること；およびｃ）前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質に関して、前記変異一塩基を野生型塩基で置き換えることを含む方法を企図する。１つの実施形態では、前記タンパク質は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９である。１つの実施形態では、前記タンパク質は、核局在シグナルタンパク質をさらに含む。１つの実施形態では、前記ヌクレオチドデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼである。１つの実施形態では、前記ヌクレオチドデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼである。１つの実施形態では、タンパク質は、ウラシルグルコシラーゼ阻害剤をさらに含む。１つの実施形態では、核局在シグナルタンパク質には、ヌクレオプラスミン（ＮＬＳ）および／またはＳＶ４０ ＮＬＳおよび／またはＣ－ｍｙｃ ＮＬＳが含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、前記結合領域は、プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインである。１つの実施形態では、前記プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインは、前記変異を含む。１つの実施形態では、前記変異は、Ｄ１６Ａ変異である。１つの実施形態では、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質は、ＣＢＥ４をさらに含む。１つの実施形態では、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質は、リンカーをさらに含む。１つの実施形態では、前記リンカーは、７３ａａリンカーである。１つの実施形態では、前記リンカーは、３ｘＨＡ－タグである。１つの実施形態では、前記遺伝子は、チロシナーゼをコードする。１つの実施形態では、前記遺伝子はＦａｈである。１つの実施形態では、前記遺伝子はｃ－ｆｏｓである。
１つの実施形態では、本発明は、方法であって、ａ）ｉ）変異一塩基を有する遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む患者であって、前記遺伝子がＮ４ＣＣヌクレオチド配列に挟まれ、前記変異遺伝子が遺伝子に基づく医学的状態を引き起こす、患者；ｉｉ）変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質を含むアデノ随伴ウイルスであって、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質が、融合ヌクレオチドデアミナーゼおよび前記Ｎ４ＣＣヌクレオチド配列の結合領域を含む、アデノ随伴ウイルスを準備すること；ｂ）前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質が前記変異一塩基を野生型一塩基で置き換えるような条件下で、前記患者を前記アデノ随伴ウイルスで処置することであって、その結果、前記遺伝子に基づく医学的状態が発症しない、処置することを含む、方法を企図する。１つの実施形態では、前記遺伝子は、チロシナーゼタンパク質をコードする。１つの実施形態では、前記遺伝子に基づく医学的状態は、チロシン血症である。１つの実施形態では、前記ウイルスは、アデノ随伴ウイルス８である。１つの実施形態では、前記ウイルスは、アデノ随伴ウイルス６である。１つの実施形態では、前記タンパク質は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９である。１つの実施形態では、前記タンパク質は、核局在シグナルタンパク質をさらに含む。１つの実施形態では、前記ヌクレオチドデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼである。１つの実施形態では、前記ヌクレオチドデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼである。１つの実施形態では、タンパク質は、ウラシルグルコシラーゼ阻害剤をさらに含む。１つの実施形態では、核局在シグナルタンパク質は、ヌクレオプラスミン（ＮＬＳ）および／またはＳＶ４０ ＮＬＳおよび／またはＣ－ｍｙｃ ＮＬＳを含むが、これらに限定されない。１つの実施形態では、前記結合領域は、プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインである。１つの実施形態では、前記プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインは、前記変異を含む。１つの実施形態では、前記変異は、Ｄ１６Ａ変異である。１つの実施形態では、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質は、ＣＢＥ４をさらに含む。１つの実施形態では、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質は、リンカーをさらに含む。１つの実施形態では、前記リンカーは、７３ａａリンカーである。１つの実施形態では、前記リンカーは、３ｘＨＡ－タグである。１つの実施形態では、前記遺伝子は、チロシナーゼをコードする。１つの実施形態では、前記遺伝子はＦａｈである。１つの実施形態では、前記遺伝子はｃ－ｆｏｓである。
１つの実施形態では、本発明は、方法であって、ａ）ｉ）変異一塩基を有する遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む患者であって、前記遺伝子がＮ４ＣＣヌクレオチド配列に挟まれ、前記変異遺伝子が遺伝子に基づく医学的状態を引き起こす、患者；ｉｉ）変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質を含む最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘであって、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質が、融合ヌクレオチドデアミナーゼおよび前記Ｎ４ＣＣヌクレオチド配列の結合領域を含む、最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘを準備すること；ｂ）前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質が前記変異一塩基を野生型一塩基で置き換えるような条件下で、前記患者を前記最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘで処置することであって、その結果、前記遺伝子に基づく医学的状態が発症しない、処置することを含む方法を企図する。
１つの実施形態では、本発明は、方法であって、ａ）ｉ）変異一塩基を有する遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む患者であって、前記遺伝子がＮ４ＣＣヌクレオチド配列に挟まれ、前記変異遺伝子が遺伝子に基づく医学的状態を引き起こす、患者；ｉｉ）変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質を含むｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４であって、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質が、融合ヌクレオチドデアミナーゼおよび前記Ｎ４ＣＣヌクレオチド配列の結合領域を含む、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４を準備すること；ｂ）前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質が前記変異一塩基を野生型一塩基で置き換えるような条件下で、前記患者を前記ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４で処置することであって、その結果、前記遺伝子に基づく医学的状態が発症しない、処置することを含む方法を企図する。
１つの実施形態では、本発明は、方法であって、ａ）ｉ）変異一塩基を有する遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む患者であって、前記遺伝子がＮ４ＣＣヌクレオチド配列に挟まれ、前記変異遺伝子が遺伝子に基づく医学的状態を引き起こす、患者；ｉｉ）変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質を含むＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩであって、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質が、融合ヌクレオチドデアミナーゼおよび前記Ｎ４ＣＣヌクレオチド配列の結合領域を含む、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩを準備すること；ｂ）前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質が前記変異一塩基を野生型一塩基で置き換えるような条件下で、前記患者を前記ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４で処置することであって、その結果、前記遺伝子に基づく医学的状態が発症しない、処置することを含む方法を企図する。
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書中に定義した用語は、本発明に関連する分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの用語は、単一の実体のみを指すのではなく、説明のために具体例を使用することができる一般的クラスが含まれることを意図する。本明細書中の用語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用されるが、特許請求の範囲に概説されたものを除いて、その使用によって本発明は制限されない。
本明細書中で使用される場合、用語「編集する」、「編集」、「編集された」は、特異的ゲノム標的の選択的欠失によってポリヌクレオチドの核酸配列（例えば、野生型の天然に存在する核酸配列または変異した天然に存在する配列）を変化させる方法を指す。かかる特異的ゲノム標的には、染色体領域、遺伝子、プロモーター、読み取り枠、または任意の核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、用語「一塩基」は、核酸配列内の１つおよびたった１つのヌクレオチドを指す。一塩基編集の文脈で使用する場合、核酸配列内の特異的部位の塩基が異なる塩基に置き換えられていることを意味する。この置き換えは、多数の機序（置換または修飾が含まれるが、これらに限定されない）によって生じ得る。
本明細書中で使用される場合、用語「標的」または「標的部位」は、任意の組成および／または長さの予め同定された核酸配列を指す。かかる標的部位には、染色体領域、遺伝子、プロモーター、読み取り枠、または任意の核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明は、ｇＲＮＡの相補配列を用いてこれらの特異的ゲノム標的配列を調査する。
本明細書中で使用される用語「オンターゲット結合配列」は、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよび／またはシングルガイドＲＮＡ配列に完全に相補的であり得る特異的ゲノム標的の部分配列を指す。
本明細書中で使用される用語「オフターゲット結合配列」は、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよび／またはシングルガイドＲＮＡ配列に部分的に相補的であり得る特異的ゲノム標的の部分配列を指す。
本明細書中で使用される用語「有効量」は、臨床的に有利な結果（すなわち、例えば、症状の軽減）を達成する治療剤を含む医薬組成物の特定の量を指す。かかる組成物の毒性および治療有効性を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死亡する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療効果のある用量）を決定するための細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。治療指数の高い化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよびさらなる動物研究から得たデータを、ヒトへ使用するための投与量範囲の策定において使用することができる。かかる化合物の投与量は、毒性がほとんどないか全く無いＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用した剤形、患者の感度、および投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
用語「症状」は、本明細書中で使用される場合、患者によって観察された疾患または身体の障害の任意の主観的または客観的なエビデンスを指す。例えば、主観的エビデンスには、通常、患者自身が訴えるものに基づき、疼痛、頭痛、視覚障害、悪心および／または嘔吐が含まれ得るが、これらに限定されない。あるいは、客観的エビデンスは、通常、医学的検査の結果であり、体温、全血球算定、脂質パネル、甲状腺パネル、血圧、心拍数、心電図、組織および／または身体の画像スキャンが含まれるが、これらに限定されない。
用語「疾患」または「医学的状態」は、本明細書中で使用される場合、生活機能の実行を妨害するか改変する、生きている動物体もしくは植物体またはその一部の正常な状態の任意の機能障害を指す。典型的には、「疾患」または「医学的状態」は、徴候および症状を識別することによって明らかになり、通常、ｉ）環境因子（栄養失調、産業上の危険、または気候など）；ｉｉ）特異的な感染因子（蠕虫（worm）、細菌、またはウイルスなど）；ｉｉｉ）生物固有の欠陥（遺伝子異常など）；および／またはｉｖ）これらの要因の組み合わせに対する応答である。
用語「低下する」、「阻害する」、「減弱する」、「抑制する」、「減少する」、「防止する」、および文法上の等価な表現（「より低い」、「より小さい」などが含まれる）は、処置された被験体と比較した無処置の被験体における任意の症状の表出について言及する場合、任意の医学的に訓練された人員によって臨床的に関連すると認識される任意の量で、処置された被験体の症状の量および／または大城さが無処置の被験体より低いことを意味する。１つの実施形態では、処置された被験体の症状の量および／または大城さは、無処置の被験体の症状の量および／または大城さより少なくとも１０％低い、少なくとも２５％低い、少なくとも５０％低い、少なくとも７５％低い、および／または少なくとも９０％低い。
本明細書中で使用される用語「付着した」は、媒体（または担体）と薬物との間の任意の相互作用を指す。付着は、可逆的でも不可逆的でもよい。かかる付着には、共有結合、イオン結合、およびファンデルワールス力または摩擦などが含まれるが、これらに限定されない。例えば、薬物が浸透したか、組み込まれたか、コーティングされたか、懸濁したか、溶解したか、混合したなどの場合、薬物は、媒体（または担体）に付着している。
本明細書中で使用される用語「薬物」または「化合物」は、投与されて所望の効果を達成することができる任意の薬理学的に活性な物質を指す。薬物または化合物は、合成または天然に存在する、非ペプチド、タンパク質またはペプチド、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド、ポリサッカリドまたは糖であり得る。
用語「投与された」、「投与」は、本明細書中で使用される場合、組成物が患者に対してその意図する効果を有するように、組成物を患者に提供する任意の方法を指す。投与方法の例は、例えば、組織への局所投与（すなわち、例えば、血管外への配置）、経口摂取、経皮パッチ、局所、吸入、坐剤などの直接的な機序による投与方法である。
用語「患者」または「被験体」は、本明細書中で使用される場合、ヒトまたは動物であり、入院している必要はない。例えば、外来患者、ナーシングホーム内の人は、「患者」である。患者は、任意の年齢のヒトまたは非ヒト動物を含んでよく、したがって、成人および若年者（すなわち、小児）の両方が含まれる。用語「患者」は医学的処置の必要性を意味することを意図しないので、患者は、自発的または非自発的に、臨床研究または基礎科学研究を支援してのいずれかの実験に参加し得る。
本明細書中で使用される用語「親和性」は、物質または粒子が化学的な組み合わせ中に侵入して維持される物質または粒子の間の任意の引力を指す。例えば、受容体に対する親和性が高い阻害化合物は、低親和性の阻害剤よりも、受容体のその天然のリガンドとの相互作用を防止する有効性がより高い。
用語「薬学的に」または「薬理学的に許容され得る」は、本明細書中で使用される場合、動物またはヒトに投与したときに有害反応、アレルギー反応、や他の不適当な反応を生じない分子実体および組成物を指す。
用語「薬学的に許容され得る担体」には、本明細書中で使用される場合、ありとあらゆる溶媒または分散媒（水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油、コーティング、等張性の吸収遅延剤、リポソーム、および市販のクレンザーなどが含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。また、補助生物活性成分を、かかる担体に組み込むことができる。
用語「ウイルスベクター」は、宿主生物内での発現のために異種核酸配列を組み込むことができるウイルスゲノム由来の任意の核酸構築物を包含する。例えば、かかるウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターが含まれ得るが、これらに限定されない。ウイルスベクターは時折病原性ウイルスから作出されるが、ウイルスベクターは、その全体的な健康リスクを最小にするような方法で改変され得る。この改変は、通常、ウイルス複製に関与するウイルスゲノムの一部の欠失を含む。かかるウイルスは、効率的に細胞に感染することができるが、感染した時点で、ウイルスは、新規ビリオンの産生のために欠損したタンパク質を提供するヘルパーウイルスを必要とし得る。好ましくは、ウイルスベクターは、感染した細胞の生理機能に及ぼす影響が最小であり、遺伝的に安定な性質を示さなければならない（例えば、自発的なゲノム再配列を起こさない）。ほとんどのウイルスベクターは、できるだけ広い範囲の細胞型に感染するように操作されている。そうであったとしても、ウイルス受容体を、ウイルスが特定の種類の細胞を標的にするように改変することができる。この様式で改変されたウイルスは、シュードタイピングと呼ばれる。ウイルスベクターは、どの細胞がウイルス遺伝子を取り込むのかを同定するのに役立つある特定の遺伝子を組み込むように操作されることが多い。これらの遺伝子は、マーカー遺伝子と呼ばれる。例えば、一般的なマーカー遺伝子は、ある種の抗生物質に対する抗生物質耐性を付与する。
本明細書中で使用される「ＲＯＳＡ２６遺伝子」または「Ｒｏｓａ２６遺伝子」は、マウス内に全般的に発現させるために広く使用されているヒトまたはマウス（それぞれ）の遺伝子座を指す。遺伝子座の第１のイントロン内の元の遺伝子トラップラインのおよそ２４８ｂｐ上流の固有のＸｂａＩ部位に所望の遺伝子を導入することによってＲＯＳＡ２６遺伝子座を標的にすることができる。アデノウイルススプライス受容体、その後の目的の遺伝子および固有のＸｂａＩ部位に挿入されたポリアデニル化部位を使用して構築物を構築してもよい。ネオマイシン耐性カセットを、ターゲティングベクターに含めてもよい。
本明細書中で使用される「ＰＣＳＫ９遺伝子」または「Ｐｃｓｋ９遺伝子」は、ＰＣＳＫ９タンパク質をコードするヒトまたはマウス（それぞれ）の遺伝子座を指す。ＰＣＳＫ９遺伝子は、第１番染色体上のバンド１ｐ３２．３に存在し、１３個のエクソンを含む。この遺伝子は、オルタナティブスプライシングによって少なくとも２つのイソ型を産生し得る。
用語「プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型」および「ＰＣＳＫ９」は、低密度リポタンパク質レベルをモジュレートする遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。ＰＣＳＫ９としても公知のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型は、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされるヒトに存在する酵素である。Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．，’’Ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｎｅｕｒａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ １（ＮＡＲＣ－１）：ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ’’ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（３）：９２８－９３３（２００３）。類似の遺伝子（オルソログ）が多くの種にわたって見いだされている。多数の酵素（ＰＳＣＫ９が含まれる）は、最初に合成されたときは不活性であり、これは、これらの酵素がその活性を遮断するペプチド鎖のセクションを有するからである；プロタンパク質転換酵素は、このセクションを除去して酵素を活性化させる。ＰＳＣＫ９は、コレステロールホメオスタシスを制御する役割を果たすと考えられる。例えば、ＰＣＳＫ９は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）の上皮成長因子様反復Ａ（ＥＧＦ－Ａ）ドメインに結合し、それにより、ＬＤＬ－Ｒを内在化して分解することができる。明らかに、ＬＤＬ－Ｒレベルが低下すればＬＤＬ－Ｃの代謝が減少し、高コレステロール血症に至り得ると予想される。
本明細書中で使用される用語「高コレステロール血症」は、血中コレステロールレベルが臨床的に推奨されるレベルを超えて上昇した任意の医学的状態を指す。例えば、コレステロールを低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を使用して測定する場合、測定されたＬＤＬレベルが、例えば、およそ７０ｍｇ／ｄｌを超えた場合に高コレステロール血症であり得る。あるいは、コレステロールを遊離血漿コレステロールを使用して測定する場合、測定された遊離コレステロールレベルが、例えば、およそ２００～２２０ｍｇ／ｄｌを超えた場合に高コレステロール血症であり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ」または「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」は、塩基配列の複数の短い直列反復物を含むＤＮＡ遺伝子座の頭字語を指す。各反復は、一連の塩基の後に、「スペーサーＤＮＡ」として公知の３０個ほどの塩基対を含む。スペーサーは、ウイルス由来の短いＤＮＡセグメントであり、将来の侵入に対する適応的防衛を容易にするための過去の曝露の「記憶」としての機能を果たし得る。
本明細書中で使用される場合、用語「Ｃａｓ」または「ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）」は、ＣＲＩＳＰＲ反復－スペーサーアレイに関連することが多い遺伝子を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「Ｃａｓ９」は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステム由来のヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼを指し、このヌクレアーゼは、ＤＮＡの二本鎖切断物を生成するように特化された酵素であって、２つの活性切断部位（ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）（二重らせんの各鎖について１つ）を有する。Ｊｉｎｅｋは、ｔｒａｃｒＲＮＡとスペーサーＲＮＡを「シングルガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）分子に組み合わせ、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９と混合されて、ｓｇＲＮＡ内のガイド配列と標的ＤＮＡ配列との間のワトソン・クリック対合を介してＤＮＡ標的を見出して切断することができる。
本明細書中で使用される用語「プロトスペーサー隣接モチーフ」（またはＰＡＭ）は、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡがＲ－ループを形成して、そのガイドＲＮＡとゲノムとのワトソン・クリック対合を介して特異的ＤＮＡ配列を調べるために必要とし得るＤＮＡ配列を指す。ＰＡＭ特異性は、Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ結合特異性の一機能であり得る（例えば、Ｃａｓ９のＣ末端の「プロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメイン」）。
本明細書中で使用される場合、用語「ｓｇＲＮＡ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連システム（Ｃａｓ）と併用されるシングルガイドＲＮＡを指す。ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合物であり、所望の標的部位に相補的な配列のヌクレオチドを含む。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，’’Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ’’ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）。ｓｇＲＮＡが標的部位とワトソン・クリック対合するとＲ－ループが形成され、それにより機能的ＰＡＭと併せてＤＮＡを切断するか、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９の場合には、その遺伝子座でＤＮＡと結合する。
本明細書中で使用される場合、用語「蛍光タンパク質」は、適切な波長に応じた蛍光を放出する少なくとも１つの有機化合物部分を含むタンパク質ドメインを指す。例えば、蛍光タンパク質は、赤色、青色、および／または緑色の光を放出し得る。かかるタンパク質は、容易に購入することができ、以下が含まれるが、これらに限定されない：ｉ）ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）：励起：５５６／２０ｎｍ（波長／バンド幅）；発光：６３０／９１ｎｍ；ｉｉ）ｓｆＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）：励起：４７０／２８ｎｍ；発光：５１２／２３ｎｍ；ｉｉｉ）ＴａｇＢＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）：励起３８７／１１ｎｍ；発光４６４／２３ｎｍ。
本明細書中で使用される場合、用語「ｓｇＲＮＡ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連システム（Ｃａｓ）と併用されるシングルガイドＲＮＡを指す。ｓｇＲＮＡは、所望の標的部位に相補的な配列のヌクレオチドを含む。ｓｇＲＮＡが標的部位とワトソン・クリック対合すると、その遺伝子座でＤＮＡと結合するためのヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を動員する。
本明細書中で使用される場合、用語「直交性の」は、重複していないか、無相関であるか、独立している標的を指す。例えば、２つの直交性ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９遺伝子が異なるエフェクタードメインに融合する場合、各々のためにコードされたｓｇＲＮＡはクロストークも重複もしない。全てのヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９遺伝子が同じように働くわけではなく、直交性ｓｇＲＮＡが適切である場合、異なるエフェクタードメインに融合した直交性ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９遺伝子を使用することができる。
本明細書中で使用される場合、用語「表現型の変化」または「表現型」は、生物の観察可能な特徴または形質の複合物（生物の形態、発生、生化学的または生理学的性質、生物季節、行動、および行動の産物など）を指す。表現型は、生物の遺伝子の発現、環境因子の影響、およびこれらの２つの間の相互作用に起因する。
本明細書中で使用される「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびその断片または一部、ならびに一本鎖または二本鎖であってよく、センス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
用語「単離された核酸」は、本明細書中で使用される場合、その天然の状態から取り出されている（例えば、細胞から取り出されており、好ましい実施形態では、他のゲノム核酸を含まない）任意の核酸分子を指す。
本明細書中で使用される用語「アミノ酸配列」および「ポリペプチド配列」は、互換的であり、アミノ酸の配列を指す。
タンパク質に関して言及する場合（「所与のタンパク質の一部」などの場合）に本明細書中で使用される用語「一部」は、対象タンパク質の断片を指す。断片は、４個のアミノ酸残基から全アミノ酸配列マイナス１個のアミノ酸までのサイズの範囲であり得る。
ヌクレオチド配列に関して言及する場合の用語「一部」は、対象ヌクレオチド配列の断片を指す。断片は、５個のヌクレオチド残基から全ヌクレオチド配列マイナス１個の核酸残基までのサイズの範囲であり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「相補的な」または「相補性」は、塩基対合則で関連付けた「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」（ヌクレオチドの配列を指す互換的用語である）に関して言及する場合に使用される。例えば、配列「Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｔ」は、配列「Ｇ－Ｔ－Ｃ－Ａ」と相補的である。相補性は、「部分的」または「全体」であり得る。「部分的」相補性は、塩基対合則に従うと１またはそれを超える核酸塩基が適合しない場合を示す。核酸の間の「全体」または「完全な」相補性は、塩基対合則下でありとあらゆる核酸塩基が別の塩基と適合する場合を示す。核酸鎖間の相補度は、核酸鎖間のハイブリッド形成の効率および強度に大きな影響を及ぼす。これは、増幅反応、また、核酸間の結合に依存する検出方法で特に重要である。
ヌクレオチド配列に関して言及する場合の本明細書中で使用される用語「相同性」および「相同な」は、他のヌクレオチド配列との相補度を指す。部分的相補性または完全な相補性（すなわち、同一性）が存在し得る。核酸配列と部分的に相補的な（すなわち、「実質的に相同な」）ヌクレオチド配列は、完全に相補的な配列を標的核酸配列と少なくとも部分的にハイブリッド形成させないヌクレオチド配列である。完全に相補的な配列の標的配列とのハイブリッド形成の阻害を、低ストリンジェンシー条件下でのハイブリッド形成アッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、および溶液ハイブリッド形成など）を使用して試験することができる。実質的に相同な配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下での完全に相同な配列の標的配列との結合（すなわち、ハイブリッド形成）を競合して妨害する。これは、非特異的結合が許容されるほど低いストリンジェンシー条件を述べているのではなく；低ストリンジェンシー条件には、２つの配列の相互の結合が特異的な（すなわち、選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異的結合の不在は、部分的な相補性でさえも欠く（例えば、約３０％未満の同一性）第２の標的配列を使用して試験され得る；非特異的結合の非存在下では、プローブは第２の非相補性標的とハイブリッド形成しない。
アミノ酸配列に関して言及する場合の本明細書中で使用される用語「相同性」および「相同な」は、２つのアミノ酸配列の間の一次構造の同一度を指す。かかる同一度は、各アミノ酸配列の一部、またはアミノ酸配列の全長を対象とし得る。「実質的に相同な」２つまたはそれを超えるアミノ酸配列は、少なくとも５０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性、または１００％の同一性を有し得る。
「ホモログ」であるオリゴヌクレオチド配列は、１００ｂｐまたはそれを超える長さを有する配列を比較した場合に配列に対して５０％またはそれを超える同一性を示すオリゴヌクレオチド配列と本明細書中で定義される。
低ストリンジェンシー条件は、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、０．１％ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬（５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔは、５００ｍｌあたり以下を含む：５ｇ Ｆｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇ ＢＳＡ（ＦｒａｃｔｉｏｎＶ；Ｓｉｇｍａ））、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃での結合またはハイブリッド形成、その後の５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中での４２℃での洗浄（約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合）に等価な条件を含む。多数の等価な条件を低ストリンジェンシー条件に含めて使用してもよい；プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）および標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中に存在するか、固定されているかなど）および塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無）、ならびにハイブリッド形成溶液の成分などの要因を、上記で列挙の条件と異なるが、等価な低ストリンジェンシーハイブリッド形成条件が得られるように変動させてよい。さらに、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリッド形成を促進する条件（例えば、ハイブリッド形成工程および／または洗浄工程の温度を上昇させること、ハイブリッド形成溶液中でホルムアミドを使用することなど）も使用してよい。
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリッド形成」は、塩基対合を介して核酸の鎖が相補鎖と連結してハイブリッド形成複合体を形成する任意のプロセスを使用した相補的核酸の対合に関して言及する場合に使用される。ハイブリッド形成およびハイブリッド形成の強度（すなわち、核酸の間の関連の強さ）は、核酸間の相補度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの要因に影響を受ける。
本明細書中で使用される用語「ハイブリッド形成複合体」は、相補的なＧ塩基とＣ塩基との間および相補的なＡ塩基とＴ塩基との間の水素結合の形成によって２つの核酸配列の間に形成された複合体を指し；これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用によってさらに安定化され得る。２つの相補的核酸配列は、逆平行配置で水素結合する。ハイブリッド形成複合体は、溶液中（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ解析）または溶液中に存在する一方の核酸配列と固体支持体（例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ドットブロッティングで使用されるナイロンメンブレンもしくはニトロセルロースフィルター、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成）が含まれる）で使用されるスライドガラス）に固定された別の核酸配列との間で形成され得る。
ＤＮＡ分子は、ホスホジエステル結合を介して１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がその隣接する３’酸素に一方向で付着するような様式でモノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを作製するので、「５’末端」および「３’末端」を有するといわれる。したがって、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結していない場合、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結していない場合、「３’末端」と称される。本明細書中で使用される場合、核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にあったとしても、５’および３’末端を有するといってもよい。線状または環状のＤＮＡ分子のいずれかでは、別個のエレメントを、「下流」または３’エレメントの「上流」または５’であると称される。この用語法は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進行するという事実を反映している。連結した遺伝子の転写を指示するプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントは、一般に、コード領域の５’または上流に存在する。しかしながら、エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントおよびコード領域の３’側に存在する場合でさえも、その効果を発揮することができる。転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’側または下流に存在する。
用語「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」は、細胞内への外来ＤＮＡの移入を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「～をコードする核酸分子」、「～をコードするＤＮＡ配列、および「～をコードするＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定づける。したがって、ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードする。
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、構造遺伝子のコード領域を含み、コード領域の５’および３’末端の両方に隣接して、いずれかの末端に約１ｋｂの距離で配置された配列を含むデオキシリボヌクレオチド配列を意味し、したがって、遺伝子は全長ｍＲＮＡの長さに対応する。コード領域の５’側に配置され、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’側または下流に配置され、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード領域で中断されたコード領域を含む。イントロンは、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり；イントロンは、エンハンサーなどの制御エレメントを含んでよい。イントロンは、核転写物または一次転写物から除去または「切り出され」；したがって、イントロンは、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物中に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳中に、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を特定するように機能する。
イントロンを含むことに加えて、遺伝子のゲノム形態は、ＲＮＡ転写物に存在する配列の５’および３’末端の両方に配置された配列も含み得る。これらの配列は、「隣接」配列または領域と称される（これらの隣接配列は、ｍＲＮＡ転写物に存在する非翻訳配列の５’側または３’側に配置されている）。５’隣接領域は、遺伝子の転写を調節するか影響を及ぼすプロモーターおよびエンハンサーなどの制御配列を含み得る。３’隣接領域は、転写の終結、転写後切断、およびポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
用語「標識」または「検出可能な標識」は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物を指すために本明細書中で使用される。かかる標識には、標識されたストレプトアビジンコンジュゲートを用いた染色のためのビオチン、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、および緑色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般的に使用されている他の酵素）、および熱量測定標識（calorimetric label）（コロイド金または有色のガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズなど）が含まれる。かかる標識の使用を教示した特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号（これらの全てのその全体が本明細書中で参考として援用される）が含まれるが、これらに限定されない。本発明で企図される標識は、多数の方法によって検出され得る。例えば、放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、放射光を検出するための光検知器を使用して検出することができる。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素作用によって生成した反応生成物を検出することによって検出され、熱量測定標識は、有色標識を簡潔に可視化することによって検出される。
本特許書類または本出願書類には、カラーで作成した少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または本特許出願の複製は、米国特許商標庁に必要な料金を支払って請求すれば得られる。
図１は、ＮｍｅＣａｓ９デアミナーゼ融合タンパク質一塩基エディターの模式的実施形態の例および塩基エディターの構築されたプラスミドの例を示す。 図１Ａは、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ構築物の例を示す。 図１Ｂは、ＡＢＥ７．１０ ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）構築物の例を示す。 図１Ｃは、２つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列を含むＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）構築物の例を示す。 図１Ｄは、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４（ＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩとも呼ばれる）構築物の例を示す。 図１Ｅは、最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘ構築物の例を示す。
図２は、ヌクレオフェクションを介してＨＥＫ２９３Ｔ細胞内の内因性標的部位２５（ＴＳ２５）でＣをＴに効率的に変換するＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ融合タンパク質を含むＤＮＡプラスミドを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のエレクトロポレーションのデータの例を示す。 図２Ａは、ＴＳ２５内因性標的部位の配列の例（黒色矩形内）を示す。ＧＮ２３ｓｇＲＮＡは標的ＤＮＡ鎖と塩基対を形成し、置き換えられたＤＮＡ鎖をシチジンデアミナーゼが編集するようになる（例えば、新規の緑色ヌクレオチド）。 図２Ｂは、シチジンからチミジンへの首尾の良い一塩基編集（例えば、Ｔ・Ａ塩基対へのＣ・Ｇ塩基対の変換）を実証している二重ヌクレオチドピーク（５’末端から７番目の位置；矢印）を示す配列決定データの例を示す。 図２Ｃは、Ｃ→Ｔ一塩基編集の変換率をプロットした図２Ｂに示したデータの定量の例を示す。ＣのＴへの変換率は、塩基エディターおよびｓｇＲＮＡで処理した試料において約４０％である（ｐ値＝６．８８×１０－６）。「ｓｇＲＮＡなし」対照は、Ｓａｎｇｅｒ配列決定に起因するバックグラウンドノイズを示す。ＥｄｉｔＲ（Ｋｌｕｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）を使用して、解析を行った。 同上。
図３は、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９／Ｄ１６Ａ変異体融合タンパク質にそれぞれ取り込まれ、安定なＫ５６２由来細胞株において高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）と共発現した特異的ＵＧＩ標的部位の例を示す。変換された塩基を橙色で強調している。バックグラウンドシグナルを、負の対照試料（ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９をヌクレオフェクションしたｓｇＲＮＡ構築物を含まないＫ５６２細胞）を用いてフィルタリングした。Ｎ４ＣＣ ＰＡＭをボックスで囲んでいる。塩基－エディター標的部位の変異を示す全リードに対する比率を、右のカラムに示す。 図３Ａは、ＥＧＦＰ－部位１の例を示す。 図３Ｂは、ＥＧＦＰ－部位２の例を示す。 図３Ｃは、ＥＧＦＰ－部位３の例を示す。 図３Ｄは、ＥＧＦＰ－部位４の例を示す。 図３Ｅは、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９が内因性ｃ－ｆｏｓプロモーター領域のＣ残基をＴ残基に変換することを示すディープシーケンシング解析の例を示す。塩基－エディター標的部位の変異を示す全リードに対する比率を、右のカラムに示す。変換された塩基を橙色または黄色で強調している。バックグラウンドシグナルを、負の対照試料を用いてフィルタリングした。最高の編集率は３２．５０％である。 図３Ｆは、ＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９またはＡＢＥｍａｘ（Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９が内因性ｃ－ｆｏｓプロモーター領域のＡ残基をＧ残基に変換することを示すディープシーケンシング解析の例を示す。塩基－エディター標的部位の変異を示す全リードに対する比率を、右のカラムに示す。変換された塩基を橙色で強調している。バックグラウンドシグナルを、負の対照試料を用いてフィルタリングした。編集率は、ＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９による０．５３％またはＡＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９による２．３３％である（Ｄ１６Ａ）。 同上。
図４は、野生型Ｆａｈ遺伝子とチロシン血症Ｆａｈ変異体遺伝子とのアラインメントの例を示し、Ａ－Ｇ一塩基遺伝子編集の標的部位（９位）を示す。ＳｐｙＣａｓ９ ＰＡＭ部位と比較して最適以下の標的ウィンドウを示すために、ＳｐｙＣａｓ９単一ＰＡＭ部位およびＮｍｅＣａｓ９二重ＰＡＭ部位をそれぞれ示す。
図５は、別個のＰＡＭを有する３つの密接に関連するＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９オルソログの例を示す。 図５Ａは、ＰＩＤ（黒色）中の変異クラスターを示す、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９の推定構造上にマッピングしたＮｍｅ２Ｃａｓ９（左）とＮｍｅ３Ｃａｓ９（右）との間の変異残基（橙色の球）を示す模式図の例を示す。 図５Ｂは、１０－ｂｐの無作為化したＰＡＭ領域を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＭ発見アッセイの実験ワークフローの例を示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化後、ライブラリーの構築および配列決定のために、アダプターを切断産物にライゲーションした。 図５Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＭ発見に起因する配列ロゴの例からＮｍｅ１Ｃａｓ９についてＮ４ＧＡＴＴ ＰＡＭが富化されることが判明したことを示し、このことは、以前に確立されたＮｍｅ１Ｃａｓ９の特異性と一致する。 図５Ｄは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤをＮｍｅ２Ｃａｓ９（左）またはＮｍｅ３Ｃａｓ９（右）のＰＩＤで交換したＮｍｅ１Ｃａｓ９にはＰＡＭの５位のＣが必要であることを示す配列ロゴの例を示す。ＰＩＤ交換タンパク質キメラの切断効率がわずかなので、残りのヌクレオチドは高い信頼度では決定されなかった（図６Ｃを参照のこと）。 図５Ｅは、ＰＡＭの５位をＣに固定した場合、およびＰＡＭの１～４ｎｔおよび６～８ｎｔを無作為化した場合の標的プールの基質切断効率に基づいて、全長Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がＮ４ＣＣ ＰＡＭを認識することを示す配列ロゴの例を示す。 同上。
図６は、図５に関連して、急速に進化したＰＩＤを有するＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９オルソログの特徴づけを示す。 図６Ａは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９と８０％を超えて同一なＮｍｅＣａｓ９オルソログの無根系統樹の例を示す。３つの別個の枝が出現し、大部分の変異はＰＩＤ内に密集している。群１（青色）、２（橙色）、および３（緑色）は、それぞれＮｍｅ１Ｃａｓ９に対して９８％超、約５２％、および約８６％の同一性を有するＰＩＤを有する。３つの代表的なＣａｓ９オルソログ（各群由来の１つ）（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、およびＮｍｅ３Ｃａｓ９）を示す。 図６Ｂは、（Ａ）由来の３つのＣａｓ９オルソログ（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、およびＮｍｅ３Ｃａｓ９）をコードする株のＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ遺伝子座を示す模式図の例を示す。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ８０１３（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９をコードする）に対する各ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ成分の同一率を示す。青色および赤色の矢印は、それぞれｐｒｅ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ転写開始部位を示す。 図６Ｃは、インタクトなＮｍｅ１Ｃａｓ９（灰色）、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤをＮｍｅ２Ｃａｓ９のＰＩＤおよびＮｍｅ３Ｃａｓ９のＰＩＤで交換したキメラ（混合色）ならびに全長Ｎｍｅ２Ｃａｓ９（橙色）についての、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける切断ＤＮＡ由来の正規化リードカウント（総リードに対する％）の例をプロットしたものを示す。正規化リードカウントの減少は、キメラの切断効率の低下を示す。 図６Ｄは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤをＮｍｅ２Ｃａｓ９（左）またはＮｍｅ３Ｃａｓ９（右）のＰＩＤで交換したＮｍｅ１Ｃａｓ９によるＮＮＮＮＣＮＮＮ ＰＡＭプールに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＭ発見アッセイ由来の配列ロゴの例を示す。 同上。
図７は、Ｎ４ＣＣ ＰＡＭに隣接する部位を編集するためにＮｍｅ２Ｃａｓ９が２２～２４ｎｔのスペーサーを使用していることを示すデータの例を示す。全ての実験を３連で行い、エラーバーは平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。 図７Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ ＴＬＲ２．０細胞の一過性トランスフェクションおよび編集を示す概要図の例を示し、トランスフェクションから７２時間後にフローサイトメトリーによってｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞が検出された。 図７Ｂは、ＴＬＲ２．０レポーターのＮｍｅ２Ｃａｓ９編集の例を示す。Ｎ４ＣＣ ＰＡＭを有する部位は様々な効率で標的にされ、一方で、Ｎ４ＧＡＴＴ ＰＡＭにおいて、またはｓｇＲＮＡの存在下ではＮｍｅ２Ｃａｓ９ターゲティングは認められなかった。ＳｐｙＣａｓ９（以前に確認されたＮＧＧ ＰＡＭを有する部位を標的にする）およびＮｍｅ１Ｃａｓ９（Ｎ４ＧＡＴＴを標的にする）を、正の対照として使用した。 図７Ｃは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の編集効率に及ぼすスペーサーの長さの効果の例を示す。スペーサーの長さが２４ｎｔから２０ｎｔまで様々である（Ｕ６プロモーターに必要とされる５’末端Ｇを含む）単一のＴＬＲ２．０部位を標的にするｓｇＲＮＡは、２２～２４ｎｔスペーサーで最も高い編集効率が得られることを示す。 図７Ｄは、例示的なＮｍｅ２Ｃａｓ９デュアルニッカーゼをタンデムで使用して、ＴＬＲ２．０においてＮＨＥＪおよびＨＤＲベースの編集物を生成することができることを示す。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを発現するプラスミドを、相同修復のための８００ｂｐのｄｓＤＮＡドナーと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ ＴＬＲ２．０細胞にエレクトロポレーションし、ＮＨＥＪ（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）の結果およびＨＤＲ（ＧＦＰ＋）の結果の両方を、フローサイトメトリーによってスコアリングした。ＨＮＨニッカーゼ、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９Ｄ１６Ａ；ＲｕｖＣニッカーゼ、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９Ｈ５８８Ａ。３２ｂｐおよび６４ｂｐ離れた切断部位を、いずれかのニッカーゼを使用して標的にした。ＨＮＨニッカーゼ（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９Ｄ１６Ａ）は、特に切断部位が３２ｂｐ離れている場合に効率的に編集し、それに対して、ＲｕｖＣニッカーゼ（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９Ｈ５８８Ａ）は有効ではなかった。野生型Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を対照として使用した。 同上。
図８は、図７に関連して、哺乳動物細胞におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９ターゲティングのためのＰＡＭ、スペーサー、およびシードの要件を示すデータの例を示す。全ての実験を３連で行い、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。 図８Ａは、ＴＬＲ２．０における
Figure 2022508716000002
 部位でのＮｍｅ２Ｃａｓ９ターゲティングの例を示し、編集は、ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞に基づいて評価した。試験した位置
Figure 2022508716000003
 での各非Ｃのヌクレオチドについて４つの部位を試験し、Ｎ４ＣＣ部位を正の対照として使用した。
図８Ｂは、ＴＬＲ２．０における
Figure 2022508716000004
 部位でのＮｍｅ２Ｃａｓ９ターゲティングの例を示す（（Ａ）に類似する）。
図８Ｃは、Ｎ４ＣＣＡ ＰＡＭを有するＴＬＲ２．０部位（図２Ｃとは異なる）上のガイド短縮の例を示し、他の部位で認められた長さと類似の長さが必要であることが明らかとなった。
図８Ｄは、例示的なＮｍｅ２Ｃａｓ９ターゲティング効率は、ｓｇＲＮＡのシード領域内の単一ヌクレオチドミスマッチに対する感受性が異なることを示す。データは、ＴＬＲ２．０標的部位における２３ｎｔスペーサーに沿った単一ヌクレオチドｓｇＲＮＡミスマッチのウォーキングの効果を示す。
同上。
図９は、複数の送達方法による哺乳動物細胞内の内因性遺伝子座でのＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集を示すデータの例を示す。全ての結果は３つの独立した生物学的反復を示し、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。 図９Ａは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを発現するプラスミドの一過性トランスフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞内の内因性ヒト部位のＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集の例を示す。４０の部位を最初にスクリーニングし（表１）；次いで、示した１４の部位（ＴＩＤＥによって測定した場合の種々の編集効率の代表を含むように選択された）を、３連で再解析した。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９標的部位（Ｎ４ＧＡＴＴ ＰＡＭを有する）を、負の対照として使用した。 図９Ｂは、データチャートの例を示す：左側のパネル：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ（Ｐｃｓｋ９遺伝子座およびＲｏｓａ２６遺伝子座を標的にする）の両方を発現する単一プラスミドの一過性トランスフェクションにより、ＴＩＤＥによって検出した場合にＨｅｐａ１－６マウス細胞で編集できることを示す。右側のパネル：レンチベクター由来のＮｍｅ２Ｃａｓ９を安定に発現するＫ５６２細胞へのｓｇＲＮＡプラスミドのエレクトロポレーションにより、効率的にインデルが形成される。 図９Ｃは、ＲＮＰ複合体としてＮｍｅ２Ｃａｓ９をエレクトロポレーションしてゲノム編集を誘導できる例を示す。４０ピコモルのＣａｓ９を、５０ピコモルの３つの異なる遺伝子座を標的にするｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｓｇＲＮＡと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にエレクトロポレーションした。７２時間後にＴＩＤＥを使用してインデルを測定した。
図１０は、図９に関連して、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９による用量依存性および分節欠失（segmental deletion）を示すデータの例を示す。 図１０Ａは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９プラスミドのエレクトロポレーション量が増加すると（図３Ａ中の５００ｎｇ対２００ｎｇ）２つの部位（ＴＳ１６およびＴＳ６）で編集効率が改善されることの例を示す。黄色で示したデータは、図９Ａからの再利用である。 図１０Ｂは、例示的なＮｍｅ２Ｃａｓ９を使用して正確な分節欠失を生じさせることができることを示す。３２ｂｐ離れた切断部位を有する２つのＴＬＲ２．０標的を、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を用いて同時に標的にした。作製された傷害の大部分は、正確に３２ｂｐの欠失であった（青色）。
図１１は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞内でタイプＩＩ－Ｃ抗ＣＲＩＳＰＲファミリーのサブセットによる阻害に供されることを示すデータの例を示す。全ての実験を３連で行い、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。 図１１Ａは、５つの以前に特徴づけられた抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の存在下でのＮｍｅ１Ｃａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイの例（Ａｃｒ：Ｃａｓ９比１０：１）を示す。上：Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、Ａｃｒの非存在下または負の対照Ａｃｒ（ＡｃｒＥ２）の存在下でＮ４ＧＡＴＴ ＰＡＭを有するプロトスペーサーを含む断片を効率的に切断する。５つ全ての以前に特徴づけられたタイプＩＩ－Ｃ Ａｃｒファミリーは、予想通りＮｍｅ１Ｃａｓ９を阻害した。下：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９阻害は、ＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕによる阻害を欠くこと以外は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９阻害に酷似している。 図１１Ｂは、５つの以前に特徴づけられた抗ＣＲＩＳＰＲファミリーの存在下での遺伝子編集の例を示す。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９（２００ｎｇ）、ｓｇＲＮＡ（１００ｎｇ）、および各Ａｃｒ（２００ｎｇ）を発現するプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、トランスフェクションの７２時間後に分解によるインデルの追跡（Tracking of Indels by Decompostion）（ＴＩＤＥ）を使用して遺伝子編集を測定した。本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏ解析と一致して、ＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕを除いた全てのタイプＩＩ－Ｃ抗ＣＲＩＳＰＲは、効率は異なるがゲノム編集を阻害した。 図１１Ｃは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の例示的なＡｃｒ阻害が異なる見かけ上の効力で用量依存性であることを示す。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は、ＡｃｒおよびＮｍｅ２Ｃａｓ９を共トランスフェクトしたプラスミドの質量比２：１および１：１のＡｃｒＩＩＣ１ＮｍｅおよびＡｃｒＩＩＣ４Ｈｐａによってそれぞれ完全に阻害された。
図１２は、図１１に関連して、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ ＰＩＤ交換がＮｍｅ１Ｃａｓ９をＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕ阻害に対して非感受性にすることを示すデータの例を示す。以前に特徴づけられたＡｃｒタンパク質（１０ｕＭ Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ＋１００ｕＭ Ａｃｒ）の存在下でのＮｍｅ１Ｃａｓ９－Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ＰＩＤキメラによるｉｎ ｖｉｔｒｏ切断。
図１３は、図１２に関連して、二重標的部位でのＮｍｅ２Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の直交性および相対的正確度を示すデータの例を示す。 図１３Ａは、例示的なＮｍｅ２Ｃａｓ９ガイドおよびＳｐｙＣａｓ９ガイドが直交性であることを示す。ＴＩＤＥの結果は、同族ｓｇＲＮＡまたは他のオルソログのｓｇＲＮＡのいずれかを用いてＤＳ２を標的にする両方のヌクレアーゼによって作出されたインデルの頻度を示す。 図１３Ｂは、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって査定した場合に類似のオンターゲット編集効率を示すＮｍｅ２Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の例を示す。バーは、各オルソログによって標的にされた３つのデュアル部位でのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ由来のオンターゲットリードカウントを示す。橙色のバーはＮｍｅ２Ｃａｓ９を示し、黒色のバーはＳｐｙＣａｓ９を示す。 図１３Ｃは、各部位についてのＳｐｙＣａｓ９のオンターゲット対オフターゲットリードカウントの例を示す。橙色のバーはオンターゲットリードを示し、一方で、黒色のバーはオフターゲットを示す。 図１３Ｄは、各部位についてのＮｍｅ２Ｃａｓ９のオンターゲット対オフターゲットリードの例を示す。 図１３Ｅは、ＣＲＩＳＰＲＳｅｅｋによって予想された潜在的なオフターゲット部位でのインデル効率（ＴＩＤＥによって測定）の例を示す棒グラフである。オンターゲット部位およびオフターゲット部位の配列を左側に示し、ＰＡＭ領域には下線を引き、ｓｇＲＮＡミスマッチおよび非コンセンサスＰＡＭヌクレオチドを赤色で示した。 同上。
図１４は、哺乳動物細胞においてＮｍｅ２Ｃａｓ９がオフターゲティングをほとんど検出できないか全く検出できないことを示すデータの例を示す。 図１４Ａは、ＳｐｙＣａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９の両方がそれらの非重複ＰＡＭのおかげで標的にできるデュアル部位（ＤＳ）を示す模式図の例を示す。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ ＰＡＭ（橙色）およびＳｐｙＣａｓ９ ＰＡＭ（青色）を強調している。２４ｎｔのＮｍｅ２Ｃａｓ９ガイド配列を黄色で示し；ＳｐｙＣａｓ９の対応するガイド配列は５’末端が４ｎｔ短い。 図１４Ｂは、共にＤＳでインデルを誘導するＮｍｅ２Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の例を示す。ＶＥＧＦＡ（ＧＮ３ＧＮ１９ＮＧＧＮＣＣ配列を有する）中の６つのＤＳを、２つのオルソログによる編集の直接的な比較のために選択した。各Ｃａｓ９を発現するプラスミド（同一のプロモーター、リンカー、タグ、およびＮＬＳを有する）およびその同族ガイドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、ＴＩＤＥによってインデル効率を決定した。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９編集は、６つ全ての部位で検出可能であり、２つの部位（それぞれ、ＤＳ２およびＤＳ６）でＳｐｙＣａｓ９よりわずかにまたは有意に効率的であった。ＳｐｙＣａｓ９は６つの部位のうちの４つを編集し（ＤＳ１、ＤＳ２、ＤＳ４、およびＤＳ６）、２つの部位はＮｍｅ２Ｃａｓ９より編集効率が有意に高かった（ＤＳ１およびＤＳ４）。ＤＳ２、ＤＳ４、およびＤＳ６は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がこれらの部位でそれぞれＳｐｙＣａｓ９と比較して効率が等しく、より低く、およびより高いので、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ解析のために選択された。 図１４Ｃは、ヒト細胞における高度に正確なＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集の例を示す。個々の標的部位での各ヌクレアーゼについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって検出されるオフターゲット部位の数を示す。デュアル部位に加えて、本発明者らは、マウスＨｅｐａ１－６細胞におけるＴＳ６部位（オンターゲット編集効率が高いため）ならびにＰｃｓｋ９部位およびＲｏｓａ２６部位を解析した（別の細胞型における正確度を測定するため）。 図１４Ｄは、編集された細胞におけるインデルを検出するための例示的な標的化ディープシーケンシングにより、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって示されたＮｍｅ２Ｃａｓ９の正確度の高さが確認されたことを示す。 図１４Ｅは、Ｒｏｓａ２６ガイドの検証されたオフターゲット部位の配列の例を示し、ＰＡＭ領域（下線）、コンセンサスＣＣ ＰＡＭジヌクレオチド（太字）、およびスペーサーのＰＡＭ遠位部分中の３つのミスマッチ（赤色）を示す。 同上。
図１５は、オール・イン・ワンＡＡＶ送達を介したｉｎ ｖｉｖｏでのＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集を示すデータの例を示す。 図１５Ａは、Ｐｃｓｋ９を標的にすることによってマウスにおけるコレステロールレベルを低下させるためのＡＡＶ８．ｓｇＲＮＡ．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の送達についてのワークフローの例を示す。上：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ（縮尺通りではない個々のゲノムエレメント）を発現するオール・イン・ワンＡＡＶベクターの模式図。ＢＧＨ、ウシ成長ホルモンポリ（Ａ）部位；ＨＡ、エピトープタグ；ＮＬＳ、核局在化配列；ｈ、ヒトコドン最適化。下：ＡＡＶ８．ｓｇＲＮＡ．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９尾静脈注射（４×１０１１個のＧＣ）、その後の注射後１４日目のコレステロール測定ならびに２８日目のインデル、組織学的検査、およびコレステロール分析のタイムライン。 図１５Ｂは、Ｐｃｓｋ９遺伝子座およびＲｏｓａ２６遺伝子座（対照）を標的にするＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡを注射したマウスの肝臓から抽出したＤＮＡ中のインデルを測定するためのＴＩＤＥ解析の例を示す。また、これら２つのｓｇＲＮＡについてＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって同定された孤立オフターゲット部位（Ｒｏｓａ２６｜ＯＴ１）でのインデル効率を、ＴＩＤＥによって査定した。 図１５Ｃは、Ｒｏｓａ２６ターゲティング対照と比較したＰｃｓｋ９ターゲティングガイドを注射したマウスにおける血清コレステロールレベルの低下の例を示す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定によって計算する。
図１６は、図１５に関連する、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ ＡＡＶ送達および編集後のＰＣＳＫ９ノックダウンおよび肝臓の組織学的検査を示すデータの例を示す。 図１６Ａは、抗ＰＣＳＫ９抗体を使用した例示的なウェスタンブロッティングが、ｓｇＲｏｓａ２６で処置したマウスと比較して、ｓｇＰｃｓｋ９で処置したマウスの肝臓中のＰＣＳＫ９レベルが顕著に低下することを明らかにしていることを示す。２ｎｇの組換えＰＣＳＫ９を移動度標準として使用し（一番左のレーン）、肝臓試料の交差反応バンドを星印によって示す。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した（下のパネル）。 図１６Ｂは、ＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲｏｓａ２６ベクター（左）またはＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＰｃｓｋ９ベクター（右）を注射したマウスの肝臓由来のＨ＆Ｅ染色の例を示す。スケールバー、２５μｍ。
図１７は、図１６に関連する、マウス接合体におけるｅｘ ｖｉｖｏでのＴｙｒ編集を示すデータの例を示す。 図１７Ａは、それぞれＮ４ＣＣ ＰＡＭを有するＴｙｒにおける例示的な２つの部位を、Ｈｅｐａ１－６細胞での編集のために試験したことを示す。ｓｇＴｙｒ２ガイドはより高い編集効率を示し、さらなる試験のために選択された。 図１７Ｂは、生後に生存して発育した７匹のマウスの例を示し、各マウスについて毛色の表現型を示し、ＴＩＤＥによってアッセイした場合のオンターゲット編集も示した。 図１７Ｃは、ＴＩＤＥ解析によって示した（Ｂ）由来の各マウスおよび未編集Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪマウスの尾ＤＮＡ由来のインデルスペクトラムの例を示す。種々のサイズの挿入（正）および欠失（負）の効率を示す。
図１８は、オール・イン・ワンＡＡＶ送達を介したｅｘ ｖｉｖｏでのＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集を示すデータの例を示す。 図１８Ａは、Ｔｙｒ遺伝子を標的にすることによってアルビノＣ５７ＢＬ／６ＮＪマウスを生成するためのｅｘ ｖｉｖｏでの単一ＡＡＶ Ｎｍｅ２Ｃａｓ９編集のワークフローの例を示す。接合体を、ＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９：ｓｇＴｙｒを含むＫＳＯＭ中で５～６時間培養し、Ｍ２でリンスし、１日培養後、偽妊娠レシピエントの卵管に移入する。 図１８Ｂは、ＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９：ｓｇＴｙｒを用いた接合体の３×１０９個のＧＣによって生成されたアルビノ（左）およびチンチラまたは斑のマウス（中央）、ならびに３×１０８個のＧＣによって生成されたチンチラまたは斑の毛色のマウス（右）の例を示す。 図１８Ｃは、２つのＡＡＶ用量でのＮｍｅ２Ｃａｓ９．ｓｇＴｙｒ単一ＡＡＶ ｅｘ ｖｉｖｏ Ｔｙｒ編集実験のまとめの例を示す。
図１９は、ｎＳｐＣａｓ９－ＡＢＥｍａｘの活性および最適化したＡＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）の活性についてのｍＣｈｅｒｒｙレポーターアッセイの例を示す。 図１９Ａは、ＡＢＥ－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターの配列情報の例示的な配列情報を示す。ｍＣｈｅｒｒｙコード領域内にはＴＡＧ終止コドンが存在する。レポーターが取り込まれた安定な細胞株では、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルは存在しない。ｎＳｐＣａｓ９－ＡＢＥｍａｘまたは最適化したＡＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）がＴＡＧをＣＡＧ（Ｇｌｎをコードする）に変換することができる場合にｍＣｈｅｒｒｙシグナルが出現する。 図１９Ｂは、ＳｐＣａｓ９－ＡＢＥまたはＡＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）がｍＣｈｅｒｒｙレポーターの特異的領域内で活性であるため、例示的なｍＣｈｅｒｒｙシグナルが光を発することを示す。上のパネルは負の対照であり、中央のパネルはｎＳｐＣａｓ９－ＡＢＥｍａｘで処置したレポーター細胞内でｍＣｈｅｒｒｙシグナルが光を発することを示し、下のパネルは最適化したＡＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）で処置したレポーター細胞内でｍＣｈｅｒｒｙシグナルが光を発することを示す。 図１９Ｃは、ＳｐＣａｓ９－ＡＢＥまたはＡＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）でトランスフェクトしたｍＣｈｅｒｒｙレポーター細胞における塩基編集事象のＦＡＣｓ定量の例を示す。Ｎ＝６；エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。結果は、技術的複製で行われた生物学的反復に由来する。
図２０は、ｎＳｐＣａｓ９－ＣＢＥ４（Ａｄｄｇｅｎｅ番号１００８０２）活性およびＣＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩ（ＣＢＥ４をＡｄｄｇｅｎｅ番号１００８０２からクローニングした）活性についてのＧＦＰレポーターアッセイの例を示す。 図２０Ａは、ＣＢＥ－ＧＦＰレポーターの配列情報の例を示す。ＧＦＰレポーター株のフルオロフォアコア領域には、ＧＹＧからＧＨＧに変換される変異が存在する。したがって、ＧＦＰシグナルは存在しない。ｎＳｐＣａｓ９－ＣＢＥ４またはＣＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩがＣＡＣからＴＡＣ／ＴＡＴ（ヒスチジンからチロシン）に変換することができる場合にＧＦＰシグナルが出現する。 図２０Ｂは、ｎＳｐＣａｓ９－ＣＢＥ４またはＣＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩがＧＦＰレポーターの特異的領域内で活性であるための、典型的なＧＦＰシグナル（緑色）を示す。上のパネルは負の対照である。中央のパネルは、ＣＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩで処置したレポーター細胞内でｍＣｈｅｒｒｙシグナルが光を発することを示す。下のパネルは、ＣＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩ）で処置したレポーター細胞中でＧＦＰシグナルが光を発することを示す。 図２０Ｃは、ｎＳｐＣａｓ９－ＣＢＥ４またはＣＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩでトランスフェクトしたＧＦＰレポーター細胞における塩基編集事象のＦＡＣｓ定量の例を示す。Ｎ＝６；エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。結果は、技術的複製で行われた生物学的反復に由来する。
図２１は、ＣＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩによるシトシン編集の例を示す。上のパネルは、負の対照試料におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９のＫＡＮＫ３ターゲティング配列情報（ＰＡＭ配列を赤色で示す）および塩基編集を示す。下のパネルは、ＫＡＮＫ３標的配列のＣＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩ編集ウィンドウにおける各塩基タイプの置換率の定量を示す。配列表は、各位置におけるヌクレオチド頻度を示す。予想されるＣからＴへの変換頻度を、赤色で強調している。
図２２は、ＣＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩおよび最適化したＡＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）のそれぞれによるシトシンおよびアデニン編集の例を示す。上のパネルは、負の対照試料におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９のＰＬＸＮＢ２ターゲティング配列情報（ＰＡＭ配列を赤色で示す）および塩基編集を示す。中央のパネルは、ＰＬＸＮＢ２標的配列の最適化したＡＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）編集ウィンドウにおける各塩基タイプの置換率の定量を示す。配列表は、各位置におけるヌクレオチド頻度を示す。予想されるＡからＧへの変換頻度を、赤色で強調している。下のパネルは、ＰＬＸＮＢ２標的配列のＣＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩ編集ウィンドウにおける各塩基タイプの置換率の定量を示す。配列表は、各位置におけるヌクレオチド頻度を示す。予想されるＣからＴへの変換頻度を、赤色で強調している。
本発明は、遺伝子編集分野に関する。特に、遺伝子編集は、単一ヌクレオチド塩基編集に向けられている。例えば、かかる単一ヌクレオチド塩基編集により、Ｃ・Ｇ塩基対がＴ・Ａ塩基対に変換される。本開示の単一ヌクレオチド塩基遺伝子エディターの正確度および精度は、ヌクレオチドデアミナーゼタンパク質に融合したＮｍｅＣａｓ９ヌクレアーゼによって高められる。より多数の適合性プロトスペーサー隣接モチーフと併せてＮｍｅＣａｓ９が小型であることにより、従来のＳｐｙＣａｓ９塩基エディタープラットフォームによって標的にできない部位を編集することができる、本明細書中で企図されるＣａｓ９融合構築物が提供される。
Ａ．ＮｍｅＣａｓ９一塩基編集
Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡを使用して任意の所望のゲノム遺伝子座に二本鎖切断を作出するプログラム可能なヌクレアーゼである。このプログラム可能性は、生物医学的アプローチおよび治療的アプローチのために活用されてきた。しかしながら、Ｃａｓ９誘導性の切断物は細胞機構によって不正確に修復されることが多いため、一塩基修正および均一かつ正確な遺伝子ノックアウトを行う治療への適用を妨げている。さらに、有糸分裂後の細胞（例えば、ニューロン細胞）における遺伝子変異を修正するためにＣａｓ９誘導性ＤＮＡ二本鎖切断物と相同組換え修復（ＨＤＲ）のための修復テンプレートを組み合わせることは極めて困難である。
単一ヌクレオチド塩基編集は、ヌクレアーゼ不活性型または欠損型のＣａｓ９（例えば、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）またはニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９））がＤＮＡ二本鎖切断物を生じることなくヌクレオチドを塩基編集することができる別の酵素に融合するゲノム編集アプローチである。今日までに、以下の２つの広範なＣａｓ９塩基エディタークラスが開発されている：ｉ）シチジンデアミナーゼ（Ｃ・Ｇ塩基対をＴ・Ａ塩基対に編集する）ＳｐｙＣａｓ９融合タンパク質；およびｉｉ）アデノシンデアミナーゼ（Ａ・Ｔ塩基対をＧ・Ｃ塩基対に編集する）ＳｐｙＣａｓ９。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，’’Ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ’’ ＵＳ２０１７／０１２１６９３号；およびＬｕｉ ｅｔ ａｌ．，’’Ｆｕｓｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｓ９ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ’’ ＵＳ２０１５／０１６６９８０号（両方が本明細書中で参考として援用される）。
しかしながら、上述のように、ＳｐｙＣａｓ９塩基編集プラットフォームは、その編集ウィンドウが制限されているために、それを使用して全ての一塩基変異を標的にすることはできない。編集ウィンドウは、ＮＧＧ ＰＡＭを必要とするために制限される。また、ゲノム編集におけるオフターゲット効果の高さは、ＳｐｙＣａｓ９が本質的に関連している。
１つの実施形態では、本発明は、小型で正確度が極めて高いＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｓｐｐ．）とのデアミナーゼ融合タンパク質を企図する。このＮｍｅ２Ｃａｓ９は、１，３６８個のアミノ酸を有するＳｐｙＣａｓ９と比較して、１，０８２個のアミノ酸を有する。このＮｍｅ２Ｃａｓ９オルソログは、哺乳動物細胞において効率的に機能し、Ｎ４ＣＣ ＰＡＭを認識し、本質的に極めて正確である。Ｅｄｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．（準備中）。
本発明の機序を理解する必要はないが、小型で正確度が極めて高いＮｍｅＣａｓ９塩基エディターが現在当該分野で公知の他のＣａｓ９プラットフォームでは以前には到達できなかった一塩基変異を標的にすると考えられる。本明細書中で企図されるＮｍｅＣａｓ９塩基エディターが現在の塩基エディタープラットフォームでは実行不可能である病原性変異を、高められた塩基編集の正確度で標的にするとさらに考えられる。
１つの実施形態では、本発明は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびデアミナーゼタンパク質を含む融合タンパク質を企図し、例としては、ＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）；最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘ；ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４（ＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩに等しい）、およびＡＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）が含まれる。図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、および図１Ｅを参照のこと。
図１は、ＮｍｅＣａｓ９デアミナーゼ融合タンパク質一塩基エディターの模式的実施形態の例および塩基エディターの構築されたプラスミドの例を示す。図１Ａは、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ構築物の例を示す。図１Ｂは、ＡＢＥ７．１０ ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）構築物の例を示す。図１Ｃは、ＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）構築物の例を示す。図１Ｃは、２つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列を含むＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）構築物の例を示す。図１Ｄは、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４（ＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩとも呼ばれる）構築物の例を示す。図１Ｅは、最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘ構築物の例を示す。
１つの実施形態では、デアミナーゼタンパク質はＡｐｏｂｅｃ１（ＹＥ１－ＢＥ３）である。Ａｐｏｂｅｃ１が１つの生物に制限されることを意図しない。１つの実施形態では、Ａｐｏｂｅｃ１は、ラット種に由来する。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，’’Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９－ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎｓ’’．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３５（２０１７）。１つの実施形態では、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９ Ｄ１６Ａ変異体を含む。１つの実施形態では、融合タンパク質は、ウラシルグルコシラーゼ阻害タンパク質（ＵＧＩ）をさらに含む。１つの実施形態では、融合タンパク質は、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ構築物を含む。１つの実施形態では、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ構築物は、以下の配列を有する：
Figure 2022508716000005
Figure 2022508716000006
 ＹＥ１－ＢＥ３（下線）；リンカー（太字）、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（斜体）、ＵＧＩ（太字／下線）、ＳＶ４０ ＮＬＳ（文字修飾なし）。
１つの実施形態では、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ構築物は、以下の配列を有する：
Figure 2022508716000007
Figure 2022508716000008
 ＹＥ１－ＢＥ３（下線）；リンカー（太字）、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（斜体）、ＵＧＩ（太字／下線）、ＳＶ４０ ＮＬＳ（文字修飾なし）。
１つの実施形態では、本発明は、ＮｍｅＣａｓ９／ＡＢＥ７．１０デアミナーゼタンパク質を含む融合タンパク質を企図する。１つの実施形態では、デアミナーゼタンパク質はＴａｄＡである。１つの実施形態では、デアミナーゼタンパク質はＴａｄＡ ７．１０である。１つの実施形態では、ＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）構築物は、以下の配列を有する：
Figure 2022508716000009
Figure 2022508716000010
 ＴａｄＡ（下線）、ＴａｄＡ ７．１０（下線／太字）、リンカー（太字）、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（斜体）、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（文字修飾なし）。
１つの実施形態では、ＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）構築物は、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2022508716000011
Figure 2022508716000012
 ＴａｄＡ（下線）、ＴａｄＡ ７．１０（下線／太字）、リンカー（太字の斜体）、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（斜体）、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（文字修飾なし）。
１つの実施形態では、ＡＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）構築物は、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2022508716000013
Figure 2022508716000014
 ＴａｄＡ（下線）、ＴａｄＡ＊７．１０（下線／太字）、リンカー（太字の斜体）、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（斜体）、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（文字修飾なし）、およびＳＶ４０ ＮＬＳ（太字）。
１つの実施形態では、ＣＢＥ４－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩ構築物は、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2022508716000015
Figure 2022508716000016
 ｒＡｐｏｂｅｃ１（下線）、ＵＧＩ（下線／太字）、リンカー（太字の斜体）、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）（斜体）、Ｃｍｙｃ－ＮＬＳ（文字修飾なし）、およびＳＶ４０ ＮＬＳ（太字）。
１つの実施形態では、最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘ構築物は、改良されたプロモーター、ＮＬＳ配列、およびリンカー配列を有する最適化したバージョンを指す。いくつかの実施形態では、最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘ構築物は、５’から３’への方向で、Ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、１２ａａリンカー、１５ａａリンカー、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ＴａｄＡ、ＴａｄＡ＊７．１０、４８ａａリンカー、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９、７３ａａリンカー（３ｘＨＡ－タグ）、１５ａａリンカー、およびＣ－ｍｙｃ ＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘ構築物は、少なくとも２つの各々交互のＣ－ｍｙｃ ＮＬＳおよび１２ａａリンカーを３’末端にさらに含む。いくつかの実施形態では、最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘ構築物は、少なくとも２つの各々交互の１５ａａリンカーおよびＣ－ｍｙｃ ＮＬＳを５’末端にさらに含む。例えば、図１Ｅを参照のこと。
１つの実施形態では、最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘ構築物は、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2022508716000017
Figure 2022508716000018
 ｈＴａｄＡ７．１０（下線）、ｈＴａｄＡ＊７．１０（下線／太字）、リンカー（太字の斜体）、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（斜体）、Ｃｍｙｃ－ＮＬＳ（文字修飾なし）、ＳＶ４０－ＮＬＳ（太字）。
いくつかの実施形態では、プラスミド ｎＳｐＣａｓ９－ＡＢＥｍａｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：１１２０９５）を、実験の対照および分子クローニングのために使用した。いくつかの実施形態では、プラスミドｎＳｐＣａｓ９－ＣＢＥ４（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：１００８０２）を、実験の対照および分子クローニングのために使用した。
ＹＥ１－ＢＥ３－Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ヌクレオチドデアミナーゼ融合タンパク質を含むＤＮＡプラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をエレクトロポレーションすると、内因性標的部位（ＴＳ２５）でＣ・Ｇ塩基対からＴ・Ａ塩基対へのロバストな一塩基編集が達成された。図２Ａ～Ｃを参照のこと。
図２は、ヌクレオフェクションを介してＨＥＫ２９３Ｔ細胞内の内因性標的部位２５（ＴＳ２５）でＣをＴに効率的に変換するＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）－ＵＧＩ融合タンパク質を含むＤＮＡプラスミドを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のエレクトロポレーションのデータの例を示す。図２Ａは、ＴＳ２５内因性標的部位の配列の例（黒色矩形内）を示す。ＧＮ２３ｓｇＲＮＡは標的ＤＮＡ鎖と塩基対を形成し、置き換えられたＤＮＡ鎖をシチジンデアミナーゼが編集するようになる（例えば、新規の緑色ヌクレオチド）。図２Ｂは、シチジンからチミジンへの首尾の良い一塩基編集（例えば、Ｔ・Ａ塩基対へのＣ・Ｇ塩基対の変換）を実証している二重ヌクレオチドピーク（５’末端から７番目の位置；矢印）を示す配列決定データの例を示す。図２Ｃは、Ｃ→Ｔ一塩基編集の変換率をプロットした図２Ｂに示したデータの定量の例を示す。ＣのＴへの変換率は、塩基エディターおよびｓｇＲＮＡで処理した試料において約４０％である（ｐ値＝６．８８×１０－６）。「ｓｇＲＮＡなし」対照は、Ｓａｎｇｅｒ配列決定に起因するバックグラウンドノイズを示す。ＥｄｉｔＲ（Ｋｌｕｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）を使用して、解析を行った。
４つの他のＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９／Ｄ１６Ａ変異体融合タンパク質は、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現する安定なＫ５６２由来細胞株において、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）と共発現された。各ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９／Ｄ１６Ａ変異体融合タンパク質は、特異的なＵＧＩ標的部位を有していた。図３Ａ～Ｄを参照のこと。
ディープシーケンシング解析は、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９が４つのＥＧＦＰ標的部位の各々でＣ残基をＴ残基に変換することを示す。編集率は、０．２４％～２％の範囲であった。潜在的な塩基編集ウィンドウは、５’（ＰＡＭ遠位）末端のヌクレオチドをヌクレオチド番号１とカウントして、置き換えられたＤＮＡ鎖中でヌクレオチド２～８である。図３Ａ～Ｄを参照のこと。
図３は、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９／Ｄ１６Ａ変異体融合タンパク質にそれぞれ取り込まれ、安定なＫ５６２由来細胞株において高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）と共発現した特異的ＵＧＩ標的部位の例を示す。変換された塩基を橙色で強調している。バックグラウンドシグナルを、負の対照試料（ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９をヌクレオフェクションしたｓｇＲＮＡ構築物を含まないＫ５６２細胞）を用いてフィルタリングした。Ｎ４ＣＣ ＰＡＭをボックスで囲んでいる。塩基－エディター標的部位の変異を示す全リードに対する比率を、右のカラムに示す。図３Ａは、ＥＧＦＰ－部位１の例を示す。図３Ｂは、ＥＧＦＰ－部位２の例を示す。図３Ｃは、ＥＧＦＰ－部位３の例を示す。図３Ｄは、ＥＧＦＰ－部位４の例を示す。
ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９ ｃ－ｆｏｓプロモーターを含むＤＮＡプラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をエレクトロポレーションすると、ｃ－ｆｏｓプロモーター内の内因性標的部位でＣ・Ｇ塩基対からＴ・Ａ塩基対へのロバストな一塩基編集が達成された（図３Ｅ）。図３Ｅは、ＹＥ１－ＢＥ３－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９が内因性ｃ－ｆｏｓプロモーター領域のＣ残基をＴ残基に変換することを示すディープシーケンシング解析の例を示す。塩基－エディター標的部位の変異を示す全リードに対する比率を、右のカラムに示す。変換された塩基を橙色または黄色で強調している。バックグラウンドシグナルを、負の対照試料を用いてフィルタリングした。最高の編集率は３２．５０％である。図３Ｆは、ＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９またはＡＢＥｍａｘ（Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９が内因性ｃ－ｆｏｓプロモーター領域のＡ残基をＧ残基に変換することを示すディープシーケンシング解析の例を示す。塩基－エディター標的部位の変異を示す全リードに対する比率を、右のカラムに示す。変換された塩基を橙色で強調している。バックグラウンドシグナルを、負の対照試料を用いてフィルタリングした。編集率は、ＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９による０．５３％またはＡＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９による２．３３％である（Ｄ１６Ａ）。
１つの実施形態では、本発明は、塩基編集のためのＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）融合タンパク質の発現を企図する。本発明の機序を理解する必要はないが、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９塩基編集がＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）融合タンパク質を用いたＦａｈ遺伝子内のＧからＡへの点変異の逆転によるチロシン血症の有効な処置であり得ると考えられる。
Ｆａｈ遺伝子内のエクソン８の最後のヌクレオチドでのＧからＡへの変異（赤色）がエクソンスキッピングを引き起こす。ＦＡＨが欠乏すると、毒素が蓄積し、重症肝損傷を引き起こす。Ａ変異がＡＢＥ７．１０の有効な塩基編集ウィンドウ（５’（ＰＡＭ遠位）末端の４～７番目のｎｔ（下線）である）の範囲外であるので、変異から下流のＳｐｙＣａｓ９ ＰＡＭ（黒色の矩形ボックス）の位置は、ｓｇＲＮＡのデザインには最適ではない（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
しかしながら、下流配列中には潜在的にＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）を介して変異を修正してＤＮＡ配列を野生型に戻すことができる２つのＮｍｅ２Ｃａｓ９ ＰＡＭｓ（赤色矩形ボックス）が存在する。図４を参照のこと。
図４は、野生型Ｆａｈ遺伝子とチロシン血症Ｆａｈ変異体遺伝子とのアラインメントの例を示し、Ａ－Ｇ一塩基遺伝子編集の標的部位（９位）を示す。ＳｐｙＣａｓ９ ＰＡＭ部位と比較して最適以下の標的ウィンドウを示すために、ＳｐｙＣａｓ９単一ＰＡＭ部位およびＮｍｅＣａｓ９二重ＰＡＭ部位をそれぞれ示す。この図は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が既存の塩基エディターの限界を克服することができる部位の潜在的な例として役立つ。本明細書中に記載のＮｍｅＣａｓ９塩基エディターが、利用可能な隣接ＰＡＭと比較して塩基編集ウィンドウが最適以下であることに起因する従来のＳｐｙＣａｓ９由来の塩基エディターでは達成できない正確な塩基編集を行うことができるとさらに考えられる。
さらに、本発明者らは、ＡＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）を使用したウイルス送達方法によるＧからＡへの点変異の逆転（利用可能な隣接ＰＡＭと比較して塩基編集ウィンドウが最適以下であることに起因して（例えば、図４）、ＳｐｙＣａｓ９由来の塩基エディターでは所望の編集が達成できない）のためのチロシン血症マウスモデルに塩基編集を広げることを意図する。
Ｂ．ＮｍｅＣａｓ９構築物：小型かつ極めて正確
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質と共に、ファージおよび他の可動遺伝因子（ＭＧＥ）に対する細菌および古細菌の適応免疫経路を構成する（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ａｎｄ Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，２００８）。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）はトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に結合され、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質上にロードされて、ｃｒＲＮＡに相補的なＭＧＥ核酸を切断する（Ｇａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に融合することができる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＲＮＡをプログラム可能であることから、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは生物工学および医学における強力なゲノム編集プラットフォームとなっている（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３ｂ）。
ｓｇＲＮＡに加えて、Ｃａｓ９の標的認識は、通常、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる相補的ＤＮＡ配列の下流の１～５ヌクレオチドシグネチャーと関連している（Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。Ｃａｓ９オルソログは、ＰＡＭの長さおよび配列が非常に多様である。特徴づけられているＣａｓ９オルソログのうちで、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）は、短いＮＧＧ ＰＡＭ（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）（Ｎは任意のヌクレオチドを示す）を認識し、高密度の標的可能部位を提供することを理由の一端として、最も広く使用されている。それにもかかわらず、Ｓｐｙのサイズが比較的大きいことが（すなわち、１，３６８アミノ酸）、このＣａｓ９を（ｓｇＲＮＡおよびプロモーターと共に）単一の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）にパッケージングすることを困難にしている。これは、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達のためのＡＡＶベクターが示す有望性を考慮すると、治療に適用する際の欠点であることが示されている（Ｋｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。さらに、ＳｐｙＣａｓ９およびそのＲＮＡガイドには、同族に近いオフターゲット部位を編集する傾向を最小にするために、広範な特徴づけおよび操作が必要であった。（Ｂｏｌｕｋｂａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ；Ｔｓａｉ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ，２０１６；Ｔｙｃｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｃａｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。今日までに、その後も操作が試みられているが、これらのサイズの制限は克服されていない。
多様な種から得た１，１００アミノ酸長未満のいくつかのＣａｓ９オルソログは、哺乳動物ゲノム編集について検証されており、以下の株Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮｍｅＣａｓ９、１，０８２ａａ）（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａｕＣａｓ９、１，０５３ａａ）（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊｅＣａｓ９、９８４ａａ）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、およびＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＧｅｏＣａｓ９、１，０８９ａａ）（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｂ）が含まれる。ＮｍｅＣａｓ９、ＣｊｅＣａｓ９、およびＧｅｏＣａｓ９は、タイプＩＩ－Ｃ Ｃａｓ９の代表であり（Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、そのほとんどが１，１００ａａ未満である。ＧｅｏＣａｓ９を除き、これらのより短い配列のオルソログの各々は、オール・イン・ワンＡＡＶ送達（単一のベクターがガイドおよびエフェクターの両方を発現する）を介したｉｎ ｖｉｖｏ編集のために首尾よく開発されている（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｉｂｒａｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８、投稿中）。さらに、ＮｍｅＣａｓ９およびＣｊｅＣａｓ９は、オフターゲット編集に対して天然に耐性を示すことが示されている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８、投稿中）。しかしながら、小型のＣａｓ９によって認識されるＰＡＭは、通常、ＳｐｙＣａｓ９より長く、所与の遺伝子座または遺伝子座付近の標的可能部位の数が実質的に減少する；例えば、ｉ）ＮｍｅＣａｓ９についてはＮ４ＧＡＹＷ／Ｎ４ＧＹＴＴ／Ｎ４ＧＴＣＴ（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）；ｉｉ）ＳａｕＣａｓ９についてはＮ２ＧＲＲＴ（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）；ｉｉｉ）ＣｊｅＣａｓ９についてはＮ４ＲＹＡＣ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７）；およびｉｖ）ＧｅｏＣａｓ９についてはＮ４ＣＲＡＡ／Ｎ４ＧＭＡＡ（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｂ）（Ｙ＝Ｃ、Ｔ；Ｒ＝Ａ、Ｇ；Ｍ＝Ａ、Ｃ；Ｗ＝Ａ、Ｔ）。標的部位のサブセットが小さいほど正確度および精度が高い遺伝子編集タスクに有利であり、前記遺伝子編集タスクには、以下が含まれるが、これらに限定されない：ｉ）小さい標的（例えば、ｍｉＲＮＡ）の編集；ｉｉ）ＰＡＭと比較して非常に狭い塩基ウィンドウを変化させる塩基編集による変異の修正（Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）；またはｉｉｉ）書き換えられた塩基が切断部位に近い場合に最も効率的な相同組換え修復（ＨＤＲ）を介した高精度の編集（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，２０１８）。ＰＡＭによって制限されるので、これらのより短いＣａｓ９タンパク質を使用した場合でさえも、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のためにオール・イン・ワンＡＡＶベクターを用いて多くの編集部位を標的にすることはできない。例えば、ＰＡＭの制約が軽減されている（Ｎ３ＲＲＴ）ＳａｕＣａｓ９変異体（ＳａｕＣａｓ９ＫＫＨ）が開発されているが、この標的範囲の増加にはオンターゲット編集効率の低下という代償が払われることが多く、オフターゲット編集物が依然として認められる。（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
ヒト細胞における活性が高く、オフターゲットに耐性を示し、オール・イン・ワンＡＡＶ送達に十分に小型であり、高密度のゲノム部位に接近できるＣａｓ９オルソログおよびバリアントにより、安全かつ有効なＣＲＩＳＰＲベースの治療遺伝子編集は非常に強化される。１つの実施形態では、本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる株由来の小型で極めて正確なＣａｓ９（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）を企図する。１つの実施形態では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで効率の良いゲノム編集を行うためのＮｍｅ２Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡの単一ＡＡＶ送達方法を企図する。本発明の機序を理解する必要はないが、このオルソログが哺乳動物細胞中で効率的に機能し、Ｎ４ＣＣ ＰＡＭを認識し、野生型ＳｐｙＣａｓ９の標的部位密度と同一の標的部位密度（例えば、両方のＤＮＡ鎖を考慮した場合、平均８ｂｐ毎）が得られると考えられる。
１．ＰＡＭ相互作用ドメインおよび抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質
Ｃａｓ９オルソログによるＰＡＭ認識は、主に、ＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩＤ）とプロトスペーサーに隣接するヌクレオチドとの間のタンパク質－ＤＮＡ相互作用によって生じる（Ｊｉａｎｇ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ，２０１７）。ＰＡＭが変異すると、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ免疫をファージが回避できることが多く（Ｐａｅｚ－Ｅｓｐｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、これらのシステムが、新規のＣＲＩＳＰＲスペーサーを獲得するだけでなく、ＰＩＤ変異を介して新規のＰＡＭ特異性を進化させるための選択圧下に置かれる。さらに、いくつかのファージおよびＭＧＥは、Ｃａｓ９を阻害する抗ＣＲＩＳＰＲ（Ａｃｒ）タンパク質を発現する（Ｐａｗｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＰＩＤ結合は、いくつかのＡｃｒに採用されている有効な阻害機序であり（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０１７）、ＰＩＤの変動もＡｃｒ阻害を回避するための選択圧によって駆動され得ることが示唆される。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓの２つの種によって最近示されているように、密接に関連するオルソログが別個のＰＡＭを認識するようにＣａｓ９ ＰＩＤが進化することができる。Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓによってコードされるＣａｓ９は、Ｎ４ＣＲＡＡ ＰＡＭを認識するが、そのＰＩＤをＬＣ３００株のＣａｓ９のＰＩＤで交換した場合、その必要とされるＰＡＭはＮ４ＧＭＡＡに変化した（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｂ）。
１つの実施形態では、本発明は、異なるＰＡＭを認識する多様なＰＩＤを有する複数のＮ．ｍｅｎｉｎｉｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９オルソログを企図する。１つの実施形態では、本発明は、ＮｍｅＣａｓ９株８０１３のＣａｓ９タンパク質（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９）に対する配列同一性が高い（その全長に沿って８０％超）Ｃａｓ９タンパク質を企図する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。また、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、上で考察されるように、小型で本来正確度が高い。（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。アラインメントにより、３つのクレードの髄膜炎菌Ｃａｓ９オルソログが明らかとなっており、各々のＮ末端の約８２０個のアミノ酸（ａａ）残基が９８％を超える同一性を有し、ＰＩＤ以外のタンパク質の全ての領域を含む。図５Ａおよび図６Ａを参照のこと。
これら全てのＣａｓ９オルソログは、１，０７８～１，０８２ａａ長である。第１のクレード（群１）は、９８％を超えるＮｍｅ１Ｃａｓ９とのａａ配列同一性がＰＩＤにまで及ぶオルソログを含む。対照的に、他の２つの群は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤと有意に異なるＰＩＤを有し、群２および群３のオルソログのＮｍｅ１Ｃａｓ９に対するＰＩＤの配列同一性はそれぞれ平均約５２％および約８６％であった。１つの髄膜炎菌株を、以下の各群から選択した：ｉ）群２由来のＤｅ１１４４４；およびｉｉ）詳細な分析用の群３由来の９８００２（本明細書中でそれぞれＮｍｅ２Ｃａｓ９（１，０８２ａａ）およびＮｍｅ３Ｃａｓ９（１，０８１ａａ）と称される）。これら２つの株由来のＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ遺伝子座は、反復配列を有し、スペーサー長は８０１３株と同一である。図６Ｂを参照のこと。これにより、その成熟ｃｒＲＮＡも２４ｎｔガイド配列および２４ｎｔ反復配列を有することが強く示唆された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。同様に、Ｄｅ１１４４４および９８００２のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、８０１３ ｔｒａｃｒＲＮＡと１００％同一であった。図６Ｂを参照のこと。これらの所見は、同一のｓｇＲＮＡ配列足場が３つ全てのＣａｓ９によってＤＮＡ切断を誘導することができるということを意味する。
これらのＣａｓ９オルソログが別個のＰＡＭを有するかどうかを判定するために、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤを、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９またはＮｍｅ３Ｃａｓ９のいずれかのＰＩＤで置き換えた。対応するＰＡＭ要件を特定するために、これらのタンパク質キメラを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で発現させ、精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＭ同定のために使用した（Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。簡潔に述べれば、プロトスペーサーの後に１０－ｎｔの無作為化配列を含むＤＮＡ断片のプールを、組換えＣａｓ９および同族のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｓｇＲＮＡを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで切断した。図５Ｂを参照のこと。Ｃａｓ９ ＰＡＭ配列を含むＤＮＡのみが切断されると予測された。次いで、切断産物を配列決定してＰＡＭを同定した。図５Ｃ～Ｄを参照のこと。
予測されたＮ４ＧＡＴＴ ＰＡＭコンセンサスを、回収した全長Ｎｍｅ１Ｃａｓ９において検証した。図５Ｃを参照のこと。キメラＰＩＤ交換誘導体は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９によって認識される５位のＧ残基の代わりに５位のＣ残基に高い優先度を示した。図５Ｄを参照のこと。
１つの実施形態では、ＡＢＥ７．１０－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）を、Ａ・Ｔ塩基対からＧ・Ｃ塩基対への一塩基編集のために使用する。１つの実施形態では、ＢＥｍａｘ－ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ）を、Ａ・Ｔ塩基対からＧ・Ｃ塩基対への一塩基編集のために使用する。（図３Ｆを参照のこと）。
図５は、別個のＰＡＭを有する３つの密接に関連するＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９オルソログの例を示す。図５Ａは、ＰＩＤ（黒色）中の変異クラスターを示す、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９の推定構造上にマッピングしたＮｍｅ２Ｃａｓ９（左）とＮｍｅ３Ｃａｓ９（右）との間の変異残基（橙色の球）を示す模式図の例を示す。図５Ｂは、１０－ｂｐの無作為化したＰＡＭ領域を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＭ発見アッセイの実験ワークフローの例を示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化後、ライブラリーの構築および配列決定のために、アダプターを切断産物にライゲーションした。図５Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＭ発見に起因する配列ロゴの例からＮｍｅ１Ｃａｓ９においてＮ４ＧＡＴＴ ＰＡＭが富化されることが判明したことを示し、このことは、以前に確立されたＮｍｅ１Ｃａｓ９の特異性と一致する。図５Ｄは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤをＮｍｅ２Ｃａｓ９（左）またはＮｍｅ３Ｃａｓ９（右）のＰＩＤで交換したＮｍｅ１Ｃａｓ９にはＰＡＭの５位のＣが必要であることを示す配列ロゴの例を示す。ＰＩＤ交換タンパク質キメラの切断効率がわずかなので、残りのヌクレオチドは高い信頼度では決定されなかった（図６Ｃを参照のこと）。図５Ｅは、ＰＡＭの５位をＣに固定した場合、およびＰＡＭの１～４ｎｔおよび６～８ｎｔを無作為化した場合の標的プールの基質切断効率に基づいて、全長Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がＮ４ＣＣ ＰＡＭを認識することを示す配列ロゴの例を示す。
いかなる残存するＰＡＭヌクレオチドも、使用した条件下においてキメラタンパク質の切断効率が低いので、確信して割り付けることができなかった。図６Ｃを参照のこと。これらのＰＡＭの問題をさらに解決するために、５番目のＰＡＭ位にインバリアントなＣを保有する７－ｎｔの無作為化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ非相補鎖上の５’－ＮＮＮＮＣＮＮＮ－３’）を有するライブラリーに対してｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行った。このストラテジーによって遥かに高い切断効率が得られ、結果は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびＮｍｅ３Ｃａｓ９のＰＩＤがＮＮＮＮＣＣ（Ａ）およびＮＮＮＮＣＡＡＡ ＰＡＭをそれぞれ認識することを示していた。図６Ｃ～Ｄを参照のこと。Ｎｍｅ３Ｃａｓ９コンセンサスは、ＧｅｏＣａｓ９のコンセンサスに類似している（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｂ）。
これらの試験を、全長Ｎｍｅ２Ｃａｓ９（ＰＩＤ交換キメラではなく）をＮＮＮＮＣＮＮＮ ＤＮＡプールと共に使用して繰り返し、ＮＮＮＮＣＣ（Ａ）コンセンサスを再度回収した。図５Ｅを参照のこと。この試験によってより効率的な切断が示された。図６Ｃを参照のこと。これらのデータは、ＰＩＤの外側の（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９と比較した）Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の１５アミノ酸の変化の１つまたは複数が効率的なＤＮＡ切断活性を支持していることを示唆している。図６Ｃを参照のこと。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の固有の２～３ｎｔのＰＡＭが以前に記載された小型のＣａｓ９オルソログよりも潜在的な標的部位の密度が高いので、これをさらなる解析のために使用した。
図６は、図５に関連して、急速に進化したＰＩＤを有するＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９オルソログの特徴づけを示す。図６Ａは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９と８０％を超えて同一なＮｍｅＣａｓ９オルソログの無根系統樹の例を示す。３つの別個の枝が出現し、大部分の変異はＰＩＤ内に密集している。群１（青色）、２（橙色）、および３（緑色）は、それぞれＮｍｅ１Ｃａｓ９に対して９８％超、およそ５２％、およびおよそ８６％同一のＰＩＤを有する。３つの代表的なＣａｓ９オルソログ（各群由来の１つ）（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、およびＮｍｅ３Ｃａｓ９）を示す。図６Ｂは、（Ａ）由来の３つのＣａｓ９オルソログ（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、およびＮｍｅ３Ｃａｓ９）をコードする株のＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ遺伝子座を示す模式図の例を示す。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ８０１３（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９をコードする）に対する各ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ成分の同一率を示す。青色および赤色の矢印は、それぞれｐｒｅ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ転写開始部位を示す。図６Ｃは、インタクトなＮｍｅ１Ｃａｓ９（灰色）、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤをＮｍｅ２Ｃａｓ９のＰＩＤおよびＮｍｅ３Ｃａｓ９のＰＩＤで交換したキメラ（混合色）ならびに全長Ｎｍｅ２Ｃａｓ９（橙色）についての、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける切断ＤＮＡ由来の正規化リードカウント（総リードに対する％）の例をプロットしたものを示す。正規化リードカウントの減少は、キメラの切断効率の低下を示す。図６Ｄは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤをＮｍｅ２Ｃａｓ９（左）またはＮｍｅ３Ｃａｓ９（右）のＰＩＤで交換したＮｍｅ１Ｃａｓ９によるＮＮＮＮＣＮＮＮ ＰＡＭプールに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＭ発見アッセイ由来の配列ロゴの例を示す。
２．Ｎ４ＣＣ ＰＡＭによる遺伝子編集
ヒトゲノム編集におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９の有効性を試験するために、全長（例えば、ＰＩＤ交換されていない）ヒトコドン最適化Ｎｍｅ２Ｃａｓ９構築物を、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９に適することが以前に検証されている核局在シグナル（ＮＬＳ）およびリンカーを付加した哺乳動物発現プラスミドにクローニングした（Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。初期試験のために、改変された蛍光ベースのトラフィックライトレポーター（ＴＬＲ２．０）を使用した（Ｃｅｒｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。簡潔に述べれば、崩壊ＧＦＰに、アウトオブフレームＴ２ＡペプチドおよびｍＣｈｅｒｒｙカセットが続いている。ＤＮＡ二本鎖切断物（ＤＳＢ）が破壊ＧＦＰカセットに導入された場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復事象のサブセットは、＋１フレームシフトしたインデルを残し、ｍＣｈｅｒｒｙをフレーム内に配置し、フローサイトメトリーによって容易に定量できる赤色蛍光を生じる。図７Ａを参照のこと。また、相同組換え修復（ＨＤＲ）の結果を、機能的ＧＦＰ配列を修復して緑色蛍光を生じるＤＮＡドナーを含めることによって同時にスコアリングすることができる（Ｃｅｒｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。いくつかのインデルは＋１フレームシフトを導入しないので、蛍光リードアウトは、一般に、真の編集効率より過小評価される。にもかかわらず、この迅速、簡潔、および安価なアッセイは、レンチベクターを介して組み込まれた単一のＴＬＲ２．０遺伝子座を保有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるゲノム編集の初期の半定量的尺度として有用である。
初期試験のために、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９プラスミドを、Ｎ４ＣＣ ＰＡＭを有するＴＬＲ２．０部位を標的にするスペーサーを保有する１５のｓｇＲＮＡプラスミドのうちの１つと一過性に共トランスフェクトした。ＨＤＲドナーが含まれなかったので、ＮＨＥＪベースの編集（ｍＣｈｅｒｒｙ）のみをスコアリングした。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のために日常的に使用されているので、ほとんどのｓｇＲＮＡはＧ２３形式（すなわち、転写を容易にするための５’末端Ｇ、その後の２３ｎｔガイド配列）であった（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｐａｗｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｉｂｒａｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ｓｇＲＮＡなしおよびＮ４ＧＡＴＴ ＰＡＭを標的にするｓｇＲＮＡを負の対照として使用し、ＳｐｙＣａｓ９＋ｓｇＲＮＡおよびＮｍｅ１Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡの共トランスフェクション（ＮＧＧおよびＮ４ＧＡＴＴプロトスペーサーをそれぞれ標的にする）を正の対照として含めた。ＳｐｙＣａｓ９およびＮｍｅ１Ｃａｓ９による編集は、容易に検出可能であった（それぞれ、約２８％および１０％のｍＣｈｅｒｒｙ）。図７Ｂを参照のこと。
Ｎｍｅ２Ｃａｓ９について、Ｎ４ＣＣ ＰＡＭを有する１５種全ての標的は機能的であったが、ｍＣｈｅｒｒｙの範囲は４％から２０％までと様々な程度であった。これらの１５の部位は、７番目のＰＡＭ位に４つの可能なヌクレオチドの各々を有する例を含み（例えば、ＣＣジヌクレオチド後）、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて認められたＡ残基への優先度の低さ（図５Ｅ）が、ヒト細胞において編集を適用するためのＰＡＭの要件を反映していないことを示す。Ｎ４ＧＡＴＴ ＰＡＭ対照は、ｓｇＲＮＡなし対照に類似のｍＣｈｅｒｒｙシグナルを生じた。図７Ｂを参照のこと。
Ｎ４ＣＣ ＰＡＭ中の両方のＣ残基が編集に関与するかどうかを判断するために、一連のＮ４ＤＣ（Ｄ＝Ａ、Ｔ、Ｇ）およびＮ４ＣＤ ＰＡＭ部位を、ＴＬＲ２．０レポーター細胞において試験した。図８Ａおよび８Ｂを参照のこと。これらの部位のいずれにおいても検出可能な編集は見いだされず、Ｎ４ＣＣ ＰＡＭコンセンサスの両方のＣ残基が効率的なＮｍｅ２Ｃａｓ９活性に必要であることが最初に示された。
ｃｒＲＮＡ中のスペーサーの長さがＣａｓ９オルソログ間で異なり、このことがオンターゲット活性対オフターゲット活性に影響を及ぼし得る（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＳｐｙＣａｓ９の最適なスペーサーの長さは２０ｎｔであり、１７ｎｔまでの短縮が許容される（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。対照的に、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、通常は２４－ｎｔスペーサーを有し（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、１８～２０ｎｔまでの短縮が許容される（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９についてのスペーサーの長さの要件を試験するために、各々が単一のＴＬＲ２．０部位を標的にするが、スペーサーの長さが様々なガイドＲＮＡプラスミドを作出した。図７Ｃおよび図８Ｃを参照のこと。Ｇ２３、Ｇ２２、およびＧ２１ガイドを使用すると類似の活性が認められたが、Ｇ２０およびＧ１９の長さにさらに短縮した場合には、活性は有意に減少した。図７Ｃを参照のこと。これらの結果により、培養ヒト細胞におけるＮ４ＣＣ ＰＡＭ部位での２２～２４ｎｔのガイド配列を用いたゲノム編集プラットフォームとしてＮｍｅ２Ｃａｓ９が検証される。
図７は、Ｎ４ＣＣ ＰＡＭに隣接する部位を編集するためにＮｍｅ２Ｃａｓ９が２２～２４ｎｔのスペーサーを使用していることを示すデータの例を示す。全ての実験を３連で行い、エラーバーは平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。図７Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ ＴＬＲ２．０細胞の一過性トランスフェクションおよび編集を示す概要図の例を示し、トランスフェクションから７２時間後にフローサイトメトリーによってｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞が検出された。図７Ｂは、ＴＬＲ２．０レポーターのＮｍｅ２Ｃａｓ９編集の例を示す。Ｎ４ＣＣ ＰＡＭを有する部位は様々な効率で標的にされ、一方で、Ｎ４ＧＡＴＴ ＰＡＭにおいて、またはｓｇＲＮＡの存在下ではＮｍｅ２Ｃａｓ９ターゲティングは認められなかった。ＳｐｙＣａｓ９（以前に確認されたＮＧＧ ＰＡＭを有する部位を標的にする）およびＮｍｅ１Ｃａｓ９（Ｎ４ＧＡＴＴを標的にする）を、正の対照として使用した。図７Ｃは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の編集効率に及ぼすスペーサーの長さの効果の例を示す。スペーサーの長さが２４ｎｔから２０ｎｔまで様々である（Ｕ６プロモーターに必要とされる５’末端Ｇを含む）単一のＴＬＲ２．０部位を標的にするｓｇＲＮＡは、２２～２４ｎｔスペーサーで最も高い編集効率が得られることを示す。図７Ｄは、例示的なＮｍｅ２Ｃａｓ９デュアルニッカーゼをタンデムで使用して、ＴＬＲ２．０においてＮＨＥＪおよびＨＤＲベースの編集物を生成することができることを示す。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを発現するプラスミドを、相同修復のための８００ｂｐのｄｓＤＮＡドナーと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ ＴＬＲ２．０細胞にエレクトロポレーションし、ＮＨＥＪ（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）の結果およびＨＤＲ（ＧＦＰ＋）の結果の両方を、フローサイトメトリーによってスコアリングした。ＨＮＨニッカーゼ、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９Ｄ１６Ａ；ＲｕｖＣニッカーゼ、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９Ｈ５８８Ａ。３２ｂｐおよび６４ｂｐ離れた切断部位を、いずれかのニッカーゼを使用して標的にした。ＨＮＨニッカーゼ（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９Ｄ１６Ａ）は、特に切断部位が３２ｂｐ離れている場合に効率的に編集し、それに対して、ＲｕｖＣニッカーゼ（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９Ｈ５８８Ａ）は有効ではなかった。野生型Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を対照として使用した。
３．ＨＤＲおよびＨＮＨニッカーゼによる精度の高い編集
Ｃａｓ９酵素は、それらのＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメインを使用して、標的ＤＮＡのガイド相補鎖および非相補鎖をそれぞれ切断する。ＨＮＨドメインまたはＲｕｖＣドメインのいずれかが変異によって不活化したＳｐｙＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９ｓ）は、相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘導するため、およびデュアルニッカーゼによるＤＳＢ誘導を介してゲノム編集の特異性を改善するために使用されている（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３ａ；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ニッカーゼとしてのＮｍｅ２Ｃａｓ９の有効性を試験するために、それぞれＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの触媒残基中にアラニン変異を保有するＮｍｅ２Ｃａｓ９Ｄ１６Ａ（ＨＮＨニッカーゼ）およびＮｍｅ２Ｃａｓ９Ｈ５８８Ａ（ＲｕｖＣニッカーゼ）を作出した（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＴＬＲ２．０細胞を、ＧＦＰドナーｄｓＤＮＡと共に使用して、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９誘導性ニックがＨＤＲを介して制度の高い編集を誘導することができるかどうかを決定した。ＴＬＲ２．０内の標的部位を使用して、３２ｂｐおよび６４ｂｐ離れた切断部位を標的にするガイドを使用する各ニッカーゼの機能性を試験した。図７Ｄを参照のこと。ＮＨＥＪおよびＨＤＲの両方の修復の結果として、単一部位を標的にする野生型Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は効率的な編集を示した。ニッカーゼについて、３２ｂｐおよび６４ｂｐ離れた切断部位は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９Ｄ１６Ａ（ＨＮＨニッカーゼ）を使用して編集されたが、いずれの標的対もＮｍｅ２Ｃａｓ９Ｈ５８８Ａで働かなかった。これらの結果は、部位が接近している限り、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ ＨＮＨニッカーゼを効率的なゲノム編集のために使用することができることが示唆される。
以前に特徴づけられたＣａｓ９の研究により、Ｃａｓ９活性が配列ミスマッチに高感受性であるＰＡＭに近接する特異的領域が同定されている。この８～１２－ｎｔの領域は、シード配列として公知であり、現在までに特徴づけられている全てのＣａｓ９の間で認められている（Ｇｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がシード配列も保有するかどうかを決定するために、ＴＬＲ２．０中の同一の遺伝子座であるが、ガイドの異なる位置に単一ヌクレオチドミスマッチを有する遺伝子座を各々が標的にする一連の一過性トランスフェクションを行った。図８Ｄを参照のこと。ＰＡＭに近接する最初の１０～１２ｎｔ中のミスマッチについてｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞数が有意に減少し、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がこの領域中にシード配列を保有することが示唆された。
図８は、図７に関連して、哺乳動物細胞におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９ターゲティングのためのＰＡＭ、スペーサー、およびシードの要件を示すデータの例を示す。全ての実験を３連で行い、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。図８Ａは、ＴＬＲ２．０における
Figure 2022508716000019
 部位でのＮｍｅ２Ｃａｓ９ターゲティングの例を示し、編集は、ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞に基づいて評価した。試験した位置
Figure 2022508716000020
 での各非Ｃのヌクレオチドについて４つの部位を試験し、Ｎ４ＣＣ部位を正の対照として使用した。図８Ｂは、ＴＬＲ２．０における
Figure 2022508716000021
 部位でのＮｍｅ２Ｃａｓ９ターゲティングの例を示す（（Ａ）に類似する）。図８Ｃは、Ｎ４ＣＣＡ ＰＡＭを有するＴＬＲ２．０部位（図２Ｃとは異なる）上のガイド短縮の例を示し、他の部位で認められた長さと類似の長さが必要であることが明らかとなった。図８Ｄは、例示的なＮｍｅ２Ｃａｓ９ターゲティング効率は、ｓｇＲＮＡのシード領域内の単一ヌクレオチドミスマッチに対する感受性が異なることを示す。データは、ＴＬＲ２．０標的部位における２３ｎｔスペーサーに沿った単一ヌクレオチドｓｇＲＮＡミスマッチのウォーキングの効果を示す。
４．哺乳動物細胞型への送達方法
Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が異なる哺乳動物細胞株で機能する能力を、種々の送達方法を使用して試験した。初期試験として、４０個の異なる部位（Ｎ４ＣＣ ＰＡＭについては２９個、Ｎ４ＣＤ ＰＡＭについては１１個の部位）を試験した。いくつかの遺伝子座を選択し（ＡＡＶＳ１、ＶＥＧＦＡなど）、Ｎ４ＣＣ ＰＡＭを有する標的部位を、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９での編集のために無作為に選択した。編集率（％）を、１５０ｎｇのＮｍｅ２Ｃａｓ９を１５０ｎｇのｓｇＲＮＡプラスミドと共に一過性にトランスフェクトした後、トランスフェクションの７２時間後にＴＩＤＥ解析を行うことによって決定した。この初期スクリーニングにおいて一連の編集効率を示す部位のサブセットを、３連での反復解析のために選択した。図９Ａおよび表１を参照のこと。
図９は、複数の送達方法による哺乳動物細胞内の内因性遺伝子座でのＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集を示すデータの例を示す。全ての結果は３つの独立した生物学的反復を示し、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。図９Ａは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを発現するプラスミドの一過性トランスフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞内の内因性ヒト部位のＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集の例を示す。４０の部位を最初にスクリーニングし（表１）；次いで、示した１４の部位（ＴＩＤＥによって測定した場合の種々の編集効率の代表を含むように選択された）を、３連で再解析した。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９標的部位（Ｎ４ＧＡＴＴ ＰＡＭを有する）を、負の対照として使用した。図９Ｂは、データチャートの例を示す：左側のパネル：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ（Ｐｃｓｋ９遺伝子座およびＲｏｓａ２６遺伝子座を標的にする）の両方を発現する単一プラスミドの一過性トランスフェクションにより、ＴＩＤＥによって検出した場合にＨｅｐａ１－６マウス細胞で編集できることを示す。右側のパネル：レンチベクター由来のＮｍｅ２Ｃａｓ９を安定に発現するＫ５６２細胞へのｓｇＲＮＡプラスミドのエレクトロポレーションにより、効率的にインデルが形成される。図９Ｃは、ＲＮＰ複合体としてＮｍｅ２Ｃａｓ９をエレクトロポレーションしてゲノム編集を誘導できる例を示す。４０ピコモルのＣａｓ９を、５０ピコモルの３つの異なる遺伝子座を標的にするｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｓｇＲＮＡと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にエレクトロポレーションした。７２時間後にＴＩＤＥを使用してインデルを測定した。
表１．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９によって標的にされる内因性ヒトゲノム編集部位の例。
Figure 2022508716000022
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して一過性トランスフェクションを支持し、トランスフェクションの７２時間後に細胞を採取後、ゲノムＤＮＡを抽出し、標的遺伝子座を選択的に増幅させた。ＴＩＤＥ解析を使用して、各遺伝子座のインデル効率を測定した（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９編集は、標的配列に応じて効率は変動するが、これらの部位のほとんどで検出可能であった。表１。興味深いことに、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は、一貫性は低く、低レベルではあるが、Ｎ４ＣＤ ＰＡＭを有するいくつかのゲノム部位でインデルを誘導した。表１。Ｎ４ＣＣ ＰＡＭを有する１４個の部位を３連で解析し、一貫して編集が認められた。図９Ａを参照のこと。さらに、編集効率を、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９プラスミドの送達量の増加によって有意に改善することができ、この効率の高さを、２つのガイドを使用した正確な分節欠失に拡大することができる。図１０Ａおよび１０Ｂを参照のこと。
Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が機能する能力を、マウスＨｅｐａ１－６細胞（ヘパトーム由来）で試験した。Ｈｅｐａ１－６細胞について、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡの両方をコードする単一プラスミド（Ｒｏｓａ２６またはＰｃｓｋ９のいずれかを標的にする）を、一過性にトランスフェクトし、７２時間後にインデルを測定した。両方の部位で編集が容易に認められた。図９Ｂの左側を参照のこと。また、ヒト白血病Ｋ５６２細胞で安定に発現されたときのＮｍｅ２Ｃａｓ９の機能性を試験した。この目的を達成するために、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を発現するレンチウイルス構築物を作出し、ＳＦＦＶプロモーターの調節下でＮｍｅ２Ｃａｓ９を安定に発現するように細胞に形質導入した。この安定な細胞株は、非形質導入細胞と比較して、成長および形態に関していかなる明らかな相違も示さず、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は安定に発現された場合に有毒ではないことが示唆された。これらの細胞を、ｓｇＲＮＡを発現するプラスミドで一過性にエレクトロポレーションし、７２時間後にＴＩＤＥによって解析してインデル効率を測定した。３つ全ての試験部位で効率的な（５０％超）編集が認められ、Ｋ５６２細胞におけるレンチウイルス送達の際にＮｍｅ２Ｃａｓ９が機能することができることが検証された。図９Ｂを参照のこと。
また、Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）送達は、ゲノム編集へ適用するのに有用であり、Ｃａｓ９の存在が一過性であるほどオフターゲット編集を最小にすることができる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｚｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。さらに、いくつかの細胞型（例えば、ある特定の免疫細胞）は、ＤＮＡトランスフェクションベースの編集が困難である（Ｓｃｈｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がＲＮＰ送達によって機能的であるかどうか試験するために、６×Ｈｉｓタグ化Ｎｍｅ２Ｃａｓ９（３つのＮＬＳに融合）を、細菌発現構築物にクローニングし、組換えタンパク質を精製した。次いで、組換えタンパク質に、３つの以前に検証された部位を標的にするＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写ｓｇＲＮＡを負荷した。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体をエレクトロポレーションすると、ＴＩＤＥによって検出した場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中の３つの標的部位の各々で首尾の良い標的が誘導された。図９Ｃを参照のこと。まとめると、これらの結果は、複数の細胞型においてプラスミドまたはレンチウイルスを介するか、ＲＮＰ複合体としてＮｍｅ２Ｃａｓ９を有効に送達させることができることを示す。
５．抗ＣＲＩＳＰＲ制御
今日までに、多様な細菌種由来のＡｃｒの５つのファミリーが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびヒト細胞においてＮｍｅ１Ｃａｓ９を阻害することが示されている（Ｐａｗｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８、投稿中）。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９とＮｍｅ２Ｃａｓ９との間の高い配列同一性を考慮すると、これらのＡｃｒファミリーのうちの少なくともいくつかは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を阻害するはずである。これを試験するために、組換えＡｃｒの５つ全てのファミリーを発現させ、精製し、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が各ファミリーのメンバーの存在下にてｉｎ ｖｉｔｒｏで標的を切断する能力について試験した（Ａｃｒ：Ｃａｓ９のモル比１０：１）。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタイプＩ－Ｅ ＣＲＩＳＰＲシステム（ＡｃｒＥ２）のための阻害剤を負の対照として使用した一方で、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９を正の対照として使用した。（Ｐａｗｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４）；（Ｐａｗｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。予想通り、５つ全てのファミリーがＮｍｅ１Ｃａｓ９を阻害した一方で、ＡｃｒＥ２は阻害できなかった。図１１Ａの上を参照のこと。ＡｃｒＩＩＣ１Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ２Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ３Ｎｍｅ、およびＡｃｒＩＩＣ４Ｈｐａは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を完全に阻害した。しかしながら、驚いたことに、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９の最も強力な阻害剤として以前に報告されているＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）は、１０倍モル過剰でさえもｉｎ ｖｉｔｒｏでＮｍｅ２Ｃａｓ９を阻害しなかった。これは、ＡｃｒＩＩＣ５ＳｍｕがおそらくそのＰＩＤとの相互作用によってＮｍｅ１Ｃａｓ９を阻害することを示唆している。
図１０は、図９に関連して、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９による用量依存性および分節欠失を示すデータの例を示す。図１０Ａは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９プラスミドのエレクトロポレーション量が増加すると（図３Ａ中の５００ｎｇ対２００ｎｇ）２つの部位（ＴＳ１６およびＴＳ６）で編集効率が改善されることの例を示す。黄色で示したデータは、図９Ａからの再利用である。図１０Ｂは、例示的なＮｍｅ２Ｃａｓ９を使用して正確な分節欠失を生じさせることができることを示す。３２ｂｐ離れた切断部位を有する２つのＴＬＲ２．０標的を、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を用いて同時に標的にした。作り出された傷害の大部分は、正確に３２ｂｐの欠失であった（青色）。
図１１は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞内でタイプＩＩ－Ｃ抗ＣＲＩＳＰＲファミリーのサブセットによる阻害に供されることを示すデータの例を示す。全ての実験を３連で行い、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。図１１Ａは、５つの以前に特徴づけられた抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の存在下でのＮｍｅ１Ｃａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイの例（Ａｃｒ：Ｃａｓ９比１０：１）を示す。上：Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、Ａｃｒの非存在下または負の対照Ａｃｒ（ＡｃｒＥ２）の存在下でＮ４ＧＡＴＴ ＰＡＭを有するプロトスペーサーを含む断片を効率的に切断する。５つ全ての以前に特徴づけられたタイプＩＩ－Ｃ Ａｃｒファミリーは、予想通りＮｍｅ１Ｃａｓ９を阻害した。下：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９阻害は、ＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕによる阻害を欠くこと以外は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９阻害に酷似している。図１１Ｂは、５つの以前に特徴づけられた抗ＣＲＩＳＰＲファミリーの存在下での遺伝子編集の例を示す。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９（２００ｎｇ）、ｓｇＲＮＡ（１００ｎｇ）、および各Ａｃｒ（２００ｎｇ）を発現するプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、トランスフェクションの７２時間後に分解によるインデルの追跡（ＴＩＤＥ）を使用して遺伝子編集を測定した。本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏ解析と一致して、ＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕを除いた全てのタイプＩＩ－Ｃ抗ＣＲＩＳＰＲは、効率は異なるがゲノム編集を阻害した。図１１Ｃは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の例示的なＡｃｒ阻害が異なる見かけ上の効力で用量依存性であることを示す。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は、ＡｃｒおよびＮｍｅ２Ｃａｓ９を共トランスフェクトしたプラスミドの質量比２：１および１：１のＡｃｒＩＩＣ１ＮｍｅおよびＡｃｒＩＩＣ４Ｈｐａによってそれぞれ完全に阻害された。
これをさらに試験するために、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９のＰＩＤを有するＮｍｅ１Ｃａｓ９／Ｎｍｅ２Ｃａｓ９キメラを試験した。図５Ｄおよび図６Ｄを参照のこと。このハイブリッドの活性が低いので、類似の切断効率を達成するために約３０倍高い濃度のＣａｓ９を使用した一方で、Ｃａｓ９：Ａｃｒのモル比を１０：１に維持した。このタンパク質キメラはＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕによって阻害されなかった。図１２を参照のこと。このデータは、ＡｃｒＩＩＣ５ＳｍｕがおそらくＮｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤと相互作用するというさらなる証拠を提供する。ＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕによる阻害の相違についての基本機序と無関係に、これらの結果は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が他の４つのタイプＩＩ－Ｃ Ａｃｒファミリーによる阻害に供されることを示す。
図１２は、図１１に関連して、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ ＰＩＤ交換がＮｍｅ１Ｃａｓ９をＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕ阻害に対して非感受性にすることを示すデータの例を示す。以前に特徴づけられたＡｃｒタンパク質（１０ｕＭ Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ＋１００ｕＭ Ａｃｒ）の存在下でのＮｍｅ１Ｃａｓ９－Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ＰＩＤキメラによるｉｎ ｖｉｔｒｏ切断。
上記のｉｎ ｖｉｔｒｏデータに基づいて、ＡｃｒＩＩＣ１Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ２Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ３Ｎｍｅ、およびＡｃｒＩＩＣ４ＨｐａをＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集のオフスイッチとして使用することができるとの仮説を立てた。これを試験するために、ＴＳ１６を標的にするＮｍｅ２Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドトランスフェクション（１５０ｎｇの各プラスミド）を、Ａｃｒ発現プラスミドの存在下または非存在下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞において行い、これは、前記プラスミド比でほとんどのＡｃｒがＮｍｅ１Ｃａｓ９を阻害することが報告されているからである（Ｐａｗｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。予想通り、ＡｃｒＩＩＣ１Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ２Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ３Ｎｍｅ、およびＡｃｒＩＩＣ４Ｈｐａは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集を阻害した一方で、ＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕは効果がなかった。図１１Ｂを参照のこと。ＡｃｒＩＩＣ３ＮｍｅおよびＡｃｒＩＩＣ４Ｈｐａによる完全な阻害が認められ、これらがＡｃｒＩＩＣ１ＮｍｅおよびＡｃｒＩＩＣ２Ｎｍｅと比較してＮｍｅ２Ｃａｓ９に対する効力が高いことが示唆された。ＡｃｒＩＩＣ１ＮｍｅおよびＡｃｒＩＩＣ４Ｈｐａの効力とさらに比較するために、本発明者らは、Ａｃｒプラスミド対Ｃａｓ９プラスミドの種々の比で実験を繰り返した。図１１Ｃを参照のこと。データは、ＡｃｒＩＩＣ４ＨｐａプラスミドがＮｍｅ２Ｃａｓ９に対して特に強力であることを示す。まとめると、これらのデータは、いくつかのＡｃｒタンパク質をＮｍｅ２Ｃａｓ９ベースの適用のためのオフスイッチとして使用することができることを示唆している。
６．極めて高い正確度
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、細胞およびマウスモデルにおいて顕著な編集忠実度が実証されている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｉｂｒａｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。さらに、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９はＮｍｅ１Ｃａｓ９とその長さがほとんど類似しているので、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は同様に非常に正確である可能性があることが示唆される。しかしながら、ジヌクレオチドＰＡＭの結果としてゲノム中にサンプリングされた部位の数が多いほど、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９と比較してＮｍｅ２Ｃａｓ９オフターゲティングの機会が増え、４－ヌクレオチドＰＡＭに遭遇する頻度が低下し得る。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９のオフターゲットプロフィールを査定するために、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ（配列決定によって可能にされる二本鎖切断物のゲノムワイドな偏りのない同定）を使用して、潜在的なオフターゲット部位を経験的に偏りのない様式で同定した（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。最良のオフターゲット予測アルゴリズムでさえも偽陰性になりがちであり、経験的な標的部位プロファイリング法が必要である（Ｂｏｌｕｋｂａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ；Ｔｓａｉ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ，２０１６；Ｔｙｃｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑは、ゲノム全体のＤＮＡ二本鎖切断部位への二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）の組み込みに依存する。次いで、これらの挿入部位を、増幅およびハイスループット配列決定によって検出する。
ＳｐｙＣａｓ９が十分に特徴づけられたＣａｓ９オルソログであるので、他のＣａｓ９を使用する多重適用に、および、その編集特性のベンチマークとして有用である（Ｊｉａｎｇ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ，２０１７；Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＳｐｙＣａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９を、同一のＵＴＲ、リンカー、ＮＬＳ、およびプロモーターとともに、同一のプラスミドバックボーンに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への並行一過性トランスフェクションのために（同様に適合するｓｇＲＮＡ発現プラスミドと共に）クローニングした。最初に、ＳｐｙＣａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９のＲＮＡガイドが直交性であること、すなわち、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡがＳｐｙＣａｓ９による編集を指示しないことおよびその逆が確認された。図１３Ａを参照のこと。これは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９を用いた以前に報告された結果と対照的であった（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
次に、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑのベンチマークとしてのＳｐｙＣａｓ９の使用を確認するために、ＳｐｙＣａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９が非重複のＰＡＭを有するので、したがって、ＳｐｙＣａｓ９は５’－ＮＧＧＮＣＣ－３’配列に挟まれた任意のデュアル部位（ＤＳ）を潜在的に編集することができ、これは両方のＣａｓ９のＰＡＭの要件を同時に満たす。これにより、的確な同一のオンターゲット部位の編集を容易にするＲＮＡガイドを用いたオフターゲティングが対照比較される。図１４Ａを参照のこと。ＶＥＧＦＡ中の６つのＤＳが標的にされ、これらの各々は、ＳｐｙＣａｓ９ガイドおよびＮｍｅ２Ｃａｓ９ガイド（Ｕ６プロモーターによって駆動される）の両方が標的部位と１００％相補的になるように、ＰＡＭの５’側の適切な位置にＧも有する。トランスフェクションの７２時間後、各ヌクレアーゼによって標的にされるこれらの部位に対してＴＩＤＥ解析を行った。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は６つ全ての部位でインデルを誘導したが、そのうちの２つの効率は低く、一方、ＳｐｙＣａｓ９は６つの部位のうちの４つでインデルを誘導した。図１４Ｂを参照のこと。ＳｐｙＣａｓ９が有効であった４つの部位のうちの２つ（ＤＳ１およびＤＳ４）で、ＳｐｙＣａｓ９はＮｍｅ２Ｃａｓ９より約７倍のインデルを誘導し、一方、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は、ＤＳ６でＳｐｙＣａｓ９より約３倍高い頻度でインデルを誘導した。両方のＣａｓ９オルソログは、およそ等しい効率でＤＳ２を編集した。
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑについて、ＤＳ２、ＤＳ４、およびＤＳ６を、対応するＳｐｙＣａｓ９ガイドと同一の効率、それより低い効率、またはそれより高い効率でオンターゲット編集を指示するＮｍｅ２Ｃａｓ９ガイドを用いたオフターゲット切断をサンプリングするためにそれぞれ選択した。３つのデュアル部位に加えて、ＴＳ６は効率的に編集されるＮｍｅ２Ｃａｓ９標的部位であり、細胞型に応じておよそ３０～５０％のインデル効率を有することが認められているので、ＴＳ６を追加した。図９Ａおよび１０Ａを参照のこと。マウスＰｃｓｋ９およびＲｏｓａ２６ Ｎｍｅ２Ｃａｓ９部位を用いて類似のデータが認められる。図９Ｂを参照のこと。
各Ｃａｓ９について、同族のｓｇＲＮＡおよびｄｓＯＤＮと共に、プラスミドトランスフェクションを行った。引き続いて、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑライブラリーを、以前に記載のように調製した（Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ解析により、ＴＩＤＥによって認められる相対効率に類似の相対効率（ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑのリードカウントにより示される）で、両方のＣａｓ９オルソログについて効率的なオンターゲット編集が明らかとなった。図１３Ｂおよび表２。（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
図１３は、図１２に関連して、二重標的部位でのＮｍｅ２Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の直交性および相対的正確度を示すデータの例を示す。図１３Ａは、例示的なＮｍｅ２Ｃａｓ９ガイドおよびＳｐｙＣａｓ９ガイドが直交性を示すことを示す。ＴＩＤＥの結果は、同族ｓｇＲＮＡまたは他のオルソログのｓｇＲＮＡのいずれかを用いてＤＳ２を標的にする両方のヌクレアーゼによって作出されたインデルの頻度を示す。図１３Ｂは、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって査定した場合に類似のオンターゲット編集効率を示すＮｍｅ２Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の例を示す。バーは、各オルソログによって標的にされた３つのデュアル部位でのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ由来のオンターゲットリードカウントを示す。橙色のバーはＮｍｅ２Ｃａｓ９を示し、黒色のバーはＳｐｙＣａｓ９を示す。図１３Ｃは、各部位についてのＳｐｙＣａｓ９のオンターゲット対オフターゲットリードカウントの例を示す。橙色のバーはオンターゲットリードを示し、一方で、黒色のバーはオフターゲットを示す。図１３Ｄは、各部位についてのＮｍｅ２Ｃａｓ９のオンターゲット対オフターゲットリードの例を示す。図１３Ｅは、ＣＲＩＳＰＲＳｅｅｋによって予想された潜在的なオフターゲット部位でのインデル効率（ＴＩＤＥによって測定）の例を示す棒グラフである。オンターゲット部位およびオフターゲット部位の配列を左側に示し、ＰＡＭ領域には下線を引き、ｓｇＲＮＡミスマッチおよび非コンセンサスＰＡＭヌクレオチドを赤色で示した。
表２：ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑデータ
Figure 2022508716000023
Figure 2022508716000024
Figure 2022508716000025
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オフターゲット識別について、解析により、プラスミドベースのＳｐｙＣａｓ９編集をＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって解析した場合のオフターゲットの通常範囲で、ＤＳ２、ＤＳ４、およびＤＳ６ ＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡがそれぞれ９３、１０、および１１８個の候補オフターゲット部位での編集を指示するようであることが明らかとなった（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。顕著に対照的に、ＤＳ２、ＤＳ４、およびＤＳ６ Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡは、それぞれ１、０、および１個のオフターゲット部位での編集を指示するようであった。図１４Ｃおよび表２。ＳｐｙＣａｓ９オフターゲットについてのＧＵＩＤＥ－ｓｅｑのリードカウントと比較した場合、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９のリードカウントは非常に低く、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が非常に特異的であることがさらに示唆された。図１３Ｃ、図１３Ｄを参照のこと。ＴＳ６、Ｐｃｓｋ９、およびＲｏｓａ２６を用いたＮｍｅ２Ｃａｓ９ ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ解析により、類似の結果が得られた（それぞれ、０、０、および１個のオフターゲット部位、Ｒｏｓａ２６－ＯＴ１オフターゲット部位についてのリードカウントが適度であった）。図１３Ｃ、図１４Ｄ、および表２。
図１４は、哺乳動物細胞においてＮｍｅ２Ｃａｓ９がオフターゲティングをほとんど検出できないか全く検出できないことを示すデータの例を示す。図１４Ａは、ＳｐｙＣａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９の両方が、それらの非重複ＰＡＭに基づいて標的とすることができるデュアル部位（ＤＳ）を示す模式図の例を示す。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ ＰＡＭ（橙色）およびＳｐｙＣａｓ９ ＰＡＭ（青色）を強調している。２４ｎｔのＮｍｅ２Ｃａｓ９ガイド配列を黄色で示し；ＳｐｙＣａｓ９の対応するガイド配列は５’末端が４ｎｔ短い。図１４Ｂは、共にＤＳでインデルを誘導するＮｍｅ２Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の例を示す。ＶＥＧＦＡ（ＧＮ３ＧＮ１９ＮＧＧＮＣＣ配列を有する）中の６つのＤＳを、２つのオルソログによる編集の直接的な比較のために選択した。各Ｃａｓ９を発現するプラスミド（同一のプロモーター、リンカー、タグ、およびＮＬＳを有する）およびその同族ガイドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、ＴＩＤＥによってインデル効率を決定した。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９編集は、６つ全ての部位で検出可能であり、２つの部位（それぞれ、ＤＳ２およびＤＳ６）でＳｐｙＣａｓ９よりわずかにまたは有意に効率的であった。ＳｐｙＣａｓ９は６つの部位のうちの４つを編集し（ＤＳ１、ＤＳ２、ＤＳ４、およびＤＳ６）、２つの部位はＮｍｅ２Ｃａｓ９より編集効率が有意に高かった（ＤＳ１およびＤＳ４）。ＤＳ２、ＤＳ４、およびＤＳ６は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がこれらの部位でそれぞれＳｐｙＣａｓ９と比較して効率が等しく、より低く、およびより高いので、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ解析のために選択された。図１４Ｃは、ヒト細胞における高度に正確なＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集の例を示す。個々の標的部位での各ヌクレアーゼについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって検出されるオフターゲット部位の数を示す。デュアル部位に加えて、本発明者らは、マウスＨｅｐａ１－６細胞におけるＴＳ６部位（オンターゲット編集効率が高いため）ならびにＰｃｓｋ９部位およびＲｏｓａ２６部位を解析した（別の細胞型における正確度を測定するため）。図１４Ｄは、編集された細胞におけるインデルを検出するための例示的な標的化ディープシーケンシングにより、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって示されたＮｍｅ２Ｃａｓ９の正確度の高さが確認されることを示す。図１４Ｅは、Ｒｏｓａ２６ガイドの検証されたオフターゲット部位の配列の例を示し、ＰＡＭ領域（下線）、コンセンサスＣＣ ＰＡＭジヌクレオチド（太字）、およびスペーサーのＰＡＭ遠位部分中の３つのミスマッチ（赤色）を示す。
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって検出されたオフターゲット部位を検証するために、標的化ディープシーケンシングを実施して、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ非依存性編集（すなわち、ｄｓＯＤＮの共トランスフェクションを用いない）後のトップオフターゲット遺伝子座でのインデル情報を測定した。ＳｐｙＣａｓ９が試験したほとんどのオフターゲット部位でかなりの編集を示し、いくつかの例では、対応するオンターゲット部位での編集より効率的であった一方で、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は、孤立ＤＳ２およびＤＳ６候補オフターゲット部位に検出可能なインデルは検出できなかった。図１４Ｄを参照のこと。Ｒｏｓａ２６ ｓｇＲＮＡの場合、約３０％のオンターゲット編集と比較して、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９はＨｅｐａ１－６細胞においてＲｏｓａ２６－ＯＴ１部位で約１％の編集を誘導した。図１４Ｄを参照のこと。このオフターゲット部位がコンセンサスＮｍｅ２Ｃａｓ９ ＰＡＭ
Figure 2022508716000029
 を有し、ガイド相補領域のＰＡＭ遠位末端（すなわち、シードの外側）にミスマッチが３つしかないことは注目に値する。図１４Ｅを参照のこと。これらのデータは、哺乳動物細胞におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集の正確度の高さを示す本発明者らのＧＵＩＤＥ－ｓｅｑの結果を支持し、強固にする。
上記のＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの結果をさらに実証するために、ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋを使用して、ＴＳ２５およびＴＳ４７（両方はＶＥＧＦＡ中にも存在する）を標的にする２つの活性Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡの潜在的なオフターゲット部位を計算的に予測した。図９Ａ；（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を参照のこと。最も厳密に適合した予測部位のうちの３つ（ＴＳ２５）または４つ（ＴＳ４７）、Ｎ４ＣＣ ＰＡＭを有する５つおよびＮ４ＣＡ ＰＡＭを有する２つの各々は、ほとんどがＰＡＭ遠位の非シード領域に２～５個のミスマッチを有していた。図１３Ｅを参照のこと。オンターゲット編集対オフターゲット編集を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＮｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡプラスミドトランスフェクション後に、各遺伝子座の標的化増幅、その後のＴＩＤＥ解析によって比較した。一貫して、ＴＩＤＥによっていずれのｓｇＲＮＡについてのこれらのオフターゲット部位にもインデルを検出することができなかった一方で、同一の細胞集団由来のＤＮＡ中に効率的なオンターゲット編集が容易に検出された。まとめると、本発明者らのデータは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が哺乳動物細胞における本来正確度の極めて高いゲノム編集プラットフォームであることを示す。
７．アデノ随伴ウイルス送達
Ｎｍｅ２Ｃａｓ９のサイズの小ささ、小さなＰＡＭ、および高い忠実度は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達を使用したｉｎ ｖｉｖｏ ゲノム編集に大きな利益をもたらす。単一ＡＡＶ送達を介して有効なＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集を行うことができるかどうかを試験するために、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を、そのｓｇＲＮＡおよびプロモーター（それぞれ、Ｕ１ａおよびＵ６）とともにＡＡＶベクターバックボーンにクローニングした。図１５Ａを参照のこと。オール・イン・ワンＡＡＶを、マウス肝臓中の以下の２つの遺伝子を標的にするための肝臓指向性ＡＡＶ８キャプシドにパッケージングされたｓｇＲＮ－．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を用いて調製した：ｉ）負の対照としてのＲｏｓａ２６（導入遺伝子挿入のために一般的に用いられているセーフハーバー遺伝子座）（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ａｎｄ Ｓｏｒｉａｎｏ，１９９１）；およびｉｉ）表現型標的としてのＰｃｓｋ９（循環コレステロールホメオスタシスの主な制御因子）（Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．、２００５）。
マウス肝臓におけるＰｃｓｋ９のＳａｕＣａｓ９またはＮｍｅ１Ｃａｓ９誘導性インデルの結果およびコレステロールレベルの低下は、新規の編集プラットフォームに有用でスコアリングが容易なｉｎ ｖｉｖｏベンチマークを提供する（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｉｂｒａｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ ＲＮＡガイドは、上記で使用したものと同一であった。図９Ｂ、図１３Ｄ、および図１４を参照のこと。Ｒｏｓａ２６－ＯＴ１が培養哺乳動物細胞で検証されている唯一のＮｍｅ２Ｃａｓ９オフターゲット部位であったので、Ｒｏｓａ２６ガイドを用いてｉｎ ｖｉｖｏでオンターゲット編集対オフターゲット編集を査定する機会を得た。図１４Ｄ～Ｅを参照のこと。２つのマウス群（ｎ＝５）の尾静脈に、Ｐｃｓｋ９またはＲｏｓａ２６のいずれかを標的にする４×１０１１個のＡＡＶ８．ｓｇＲＮＡ．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ゲノムコピー（ＧＣ）を注射した。注射後０、１４、および２８日にコレステロールレベルの測定のために血清を回収した。注射後２８日にマウスを屠殺し、肝臓組織を採取した。図１５Ａを参照のこと。各遺伝子座の標的化ディープシーケンシングにより、肝臓中のＰｃｓｋ９およびＲｏｓａ２６編集部位で約３８％および約４６％のインデル誘導がそれぞれ明らかとなった。図１５Ｂを参照のこと。肝細胞は成人肝臓の総細胞成分の６５～７０％しか構成しないので、ｓｇＰｃｓｋ９およびｓｇＲｏｓａを用いたＮｍｅ２Ｃａｓ９ ＡＡＶ誘導性肝細胞編集効率は、それぞれおよそ５４～５８％および６６～７１％であった（Ｒａｃａｎｅｌｌｉ ａｎｄ Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，２００６）。
全体でたった２．２５％の肝臓インデル（肝細胞中約３～３．５％）しかＲｏｓａ２６－ＯＴ１オフターゲット部位で検出されず、これはトランスフェクトされたＨｅｐａ１－６細胞におけるこの部位で本発明者らが認めた１％編集に匹敵していた。図１５Ｂ、図１４Ｄを参照のこと。注射後１４日および２８日の両方で、Ｐｃｓｋ９編集により血清コレステロールレベルが約４４％減少したのに対して、ｓｇＲｏｓａ２６発現ＡＡＶで処置したマウスは研究を通して正常なコレステロールレベルを維持していた。図１５Ｃを参照のこと。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９／ｓｇＰｃｓｋ９ ＡＡＶ処置マウスにおける血清コレステロールの約４４％の減少は、同一の遺伝子を標的にするＳａｕＣａｓ９オール・イン・ワンＡＡＶを用いて報告された約４０％に匹敵する（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
図１５は、オール・イン・ワンＡＡＶ送達を介したｉｎ ｖｉｖｏでのＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集を示すデータの例を示す。図１５Ａは、Ｐｃｓｋ９を標的にすることによってマウスにおけるコレステロールレベルを低下させるためのＡＡＶ８．ｓｇＲＮＡ．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の送達についてのワークフローの例を示す。上：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ（縮尺通りではない個々のゲノムエレメント）を発現するオール・イン・ワンＡＡＶベクターの模式図。ＢＧＨ、ウシ成長ホルモンポリ（Ａ）部位；ＨＡ、エピトープタグ；ＮＬＳ、核局在化配列；ｈ、ヒトコドン最適化。下：ＡＡＶ８．ｓｇＲＮＡ．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９尾静脈注射（４×１０１１個のＧＣ）、その後の注射後１４日目のコレステロール測定ならびに２８日目のインデル、組織学的検査、およびコレステロール分析のタイムライン。図１５Ｂは、Ｐｃｓｋ９遺伝子座およびＲｏｓａ２６遺伝子座（対照）を標的にするＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡを注射したマウスの肝臓から抽出したＤＮＡ中のインデルを測定するためのＴＩＤＥ解析の例を示す。また、これら２つのｓｇＲＮＡについてＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって同定された孤立オフターゲット部位（Ｒｏｓａ２６｜ＯＴ１）でのインデル効率を、ＴＩＤＥによって査定した。図１５Ｃは、Ｒｏｓａ２６ターゲティング対照と比較したＰｃｓｋ９ターゲティングガイドを注射したマウスにおける血清コレステロールレベルの低下の例を示す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定によって計算している。図１６は、図１５に関連する、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ ＡＡＶ送達および編集後のＰＣＳＫ９ノックダウンおよび肝臓の組織学的検査を示すデータの例を示す。図１６Ａは、抗ＰＣＳＫ９抗体を使用した例示的なウェスタンブロッティングが、ｓｇＲｏｓａ２６で処置したマウスと比較して、ｓｇＰｃｓｋ９で処置したマウスの肝臓中のＰＣＳＫ９レベルが顕著に低下することを明らかにしていることを示す。２ｎｇの組換えＰＣＳＫ９を移動度標準として使用し（一番左のレーン）、肝臓試料の交差反応バンドを星印によって示す。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した（下のパネル）。図１６Ｂは、ＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲｏｓａ２６ベクター（左）またはＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＰｃｓｋ９ベクター（右）を注射したマウスの肝臓由来のＨ＆Ｅ染色の例を示す。スケールバー、２５μｍ。
抗ＰＣＳＫ９抗体を用いてウェスタンブロッティングを行って、ｓｇＰｃｓｋ９およびｓｇＲｏｓａ２６で処置したマウスの肝臓中のＰＣＳＫ９タンパク質レベルを推定した。肝臓ＰＣＳＫ９は、ｓｇＰｃｓｋ９で処置したマウスにおいて検出限界未満であったのに対して、ｓｇＲｏｓａ２６処置マウスは、正常レベルのＰＣＳＫ９を示した。図１６Ａを参照のこと。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および組織学的検査により、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９発現後のいずれの群においても毒性や組織損傷の兆候は見られなかった。図１６Ｂを参照のこと。これらのデータから、ｉｎ ｖｉｖｏ（単一ＡＡＶベクターによって送達した場合が含まれる）におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９が有効性の高いゲノム編集システムであることが確認される。
ＡＡＶベクターは、最近、微量注入やエレクトロポレーションを必要とせず、簡潔にＡＡＶベクター（複数可）を含む培養培地中に接合体を浸漬し、その後に偽妊娠の雌に再移植することによるゲノム編集済みマウスの生成のために使用されている（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。編集は、以前は、ＳｐｙＣａｓ９およびそのｓｇＲＮＡを別々のベクターで送達させるデュアルＡＡＶ系を用いて行われていた（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がオール・イン・ワンＡＡＶ送達系を用いてマウス接合体において正確かつ効率的に編集できるかどうかを試験するために、本発明者らは、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）を標的にした。Ｔｙｒの二対立遺伝子不活化がメラニン産生を破壊し、アルビノ表現型が得られる（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。
効率的なＴｙｒ ｓｇＲＮＡは、一過性トランスフェクションによるＨｅｐａ１－６細胞中の古典的なアルビノ変異部位からたった１７ｂｐのＴｙｒ遺伝子座を切断することが検証された。図１７Ａを参照のこと。次に、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ接合体を、Ｔｙｒ ｓｇＲＮＡと共にＮｍｅ２Ｃａｓ９を発現するオール・イン・ワンＡＡＶ６ベクターの３×１０９または３×１０８個のＧＣを含む培養培地中で５～６時間インキュベートした。新鮮培地中で一晩の培養後、二細胞期に進行した接合体を、偽妊娠レシピエントの卵管に移入し、出産予定日まで発育させた。図１８Ａを参照のこと。仔の毛色解析により、アルビノ、チンチラ（チロシナーゼの低次形態対立遺伝子を示す）であったか、アルビノおよびチンチラの斑点から構成されるが、黒色の色素を欠く斑の毛色を有するマウスが明らかとなった。図１８Ｂ～Ｃを参照のこと。野生型チロシナーゼ遺伝子座が存在すると黒色色素沈着が起こるはずであるので、これらの結果は、二対立遺伝子変異の頻度が高いことを示唆している。全部で５匹の仔（１０％）が、３×１０９個のＧＣ実験から誕生した。これらは全てインデルを保有しており；表現型的には、２匹がアルビノであり、１匹がチンチラであり、２匹が斑に色素沈着していた（モザイク現象を示す）。
３×１０８個のＧＣ実験から、４匹の仔（１４％）が得られ、そのうちの２匹が出生時に死亡していたので毛色やゲノムの解析ができなかった。残りの２匹の仔の毛色解析により、１匹がチンチラで、１匹がモザイクであることが明らかとなった。これらの結果は、微量注入やエレクトロポレーションを用いずにＮｍｅ２Ｃａｓ９およびそのガイドの単一ＡＡＶ送達を使用してマウス接合体を変異させることができることを示す。
Ｔｙｒ遺伝子におけるオンターゲットインデル形成を測定するために、各マウスの尾からＤＮＡを単離し、遺伝子座を増幅し、その際にＴＩＤＥ解析を実施した。全てのマウスは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９によるオンターゲット編集のレベルが高く、８４％から１００％まで様々であった。図１７Ｂ～Ｃを参照のこと。アルビノマウス９－１のほとんどの病変は１－ｂｐまたは４－ｂｐ欠失のいずれかであり、モザイク現象またはトランス－ヘテロ接合性のいずれかが示唆されたが、アルビノマウス９－２は均一な２－ｂｐ欠失を示していた。図１７Ｃを参照のこと。図１７は、図１６に関連する、マウス接合体におけるｅｘ ｖｉｖｏでのＴｙｒ編集を示すデータの例を示す。図１７Ａは、それぞれＮ４ＣＣ ＰＡＭを有するＴｙｒにおける例示的な２つの部位を、Ｈｅｐａ１－６細胞での編集のために試験したことを示す。ｓｇＴｙｒ２ガイドはより高い編集効率を示し、さらなる試験のために選択された。図１７Ｂは、生後に生存して発育した７匹のマウスの例を示し、各マウスについて毛色の表現型を示し、ＴＩＤＥによってアッセイした場合のオンターゲット編集も示した。図１７Ｃは、ＴＩＤＥ解析によって示した（Ｂ）由来の各マウスおよび未編集Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪマウスの尾ＤＮＡ由来のインデルスペクトラムの例を示す。種々のサイズの挿入（正）および欠失（負）の効率を示す。
図１８は、オール・イン・ワンＡＡＶ送達を介したｅｘ ｖｉｖｏでのＮｍｅ２Ｃａｓ９ゲノム編集を示すデータの例を示す。図１８Ａは、Ｔｙｒ遺伝子を標的にすることによってアルビノＣ５７ＢＬ／６ＮＪマウスを生成するためのｅｘ ｖｉｖｏでの単一ＡＡＶ Ｎｍｅ２Ｃａｓ９編集のワークフローの例を示す。接合体を、ＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９：ｓｇＴｙｒを含むＫＳＯＭ中で５～６時間培養し、Ｍ２でリンスし、１日培養後、偽妊娠レシピエントの卵管に移入する。図１８Ｂは、ＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９：ｓｇＴｙｒを用いた接合体の３×１０９個のＧＣによって生成されたアルビノ（左）およびチンチラまたは斑のマウス（中央）、ならびに３×１０８個のＧＣによって生成されたチンチラまたは斑の毛色のマウス（右）の例を示す。図１８Ｃは、２つのＡＡＶ用量でのＮｍｅ２Ｃａｓ９．ｓｇＴｙｒ単一ＡＡＶ ｅｘ ｖｉｖｏ Ｔｙｒ編集実験のまとめの例を示す。
尾試料のみを配列決定し、他の組織が別個の病変を有し得るので、マウス９－２にモザイク現象が存在しなかったかどうか、またはさらなる対立遺伝子がマウス９－１に不在であったかについては、データは決定的ではない。チンチラマウス由来の尾ＤＮＡの解析により、チンチラ毛色の潜在的な原因であるインフレーム変異の存在が明らかとなった。変異の複雑度が制限されていることは、編集がこれらのマウスの胚発生の初期に生じたことを示唆している。これらの結果は、単一ＡＡＶベクター（この場合はＮｍｅ２Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡの両方を送達する）の適用を介した哺乳動物変異誘発に対する合理性のある経路を提供する。
図１９は、ｎＳｐＣａｓ９－ＡＢＥｍａｘの活性および最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘの活性についてのｍＣｈｅｒｒｙレポーターアッセイの例を示す。図１９Ａは、ＡＢＥ－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターの配列情報の例を示す。ｍＣｈｅｒｒｙコード領域内にはＴＡＧ終止コドンが存在する。レポーターが取り込まれた安定な細胞株では、この終止コドンに起因して、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルは存在しない。ｎＳｐＣａｓ９－ＡＢＥｍａｘまたは最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘがＴＡＧをＣＡＧ（グルタミン残基をコードする）に変換することができる場合にｍＣｈｅｒｒｙシグナルが活性化される。図１９Ｂは、例示的なｍＣｈｅｒｒｙシグナルがＳｐＣａｓ９－ＡＢＥ活性またはＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥ活性に起因して活性化されることを示す。上のパネル：負の対照（編集なし）；中央のパネル：ｎＳｐＣａｓ９－ＡＢＥｍａｘによるｍＣｈｅｒｒｙ活性化；下のパネル：最適化したｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘによるｍＣｈｅｒｒｙ活性化。図１９Ｃは、ＳｐＣａｓ９－ＡＢＥまたはＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥでトランスフェクトしたｍＣｈｅｒｒｙレポーター細胞における塩基編集事象のＦＡＣＳ定量の例を示す。Ｎ＝６；エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。結果は、技術的複製で行われた３回の生物学的反復に由来する。
図２０は、ｎＳｐＣａｓ９－ＣＢＥ４（Ａｄｄｇｅｎｅ番号１００８０２）活性およびｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４（Ａｄｄｇｅｎｅ番号１００８０２と同一のプラスミドバックボーン）活性についてのＧＦＰレポーターアッセイの例を示す。図２０Ａは、ＣＢＥ－ＧＦＰレポーターの配列情報の例を示す。ＧＦＰレポーター系のフルオロフォアコア領域には、ＧＹＧからＧＨＧに変換される変異が存在する。この変異に起因するＧＦＰシグナルは存在しない。ｎＳｐＣａｓ９－ＣＢＥ４またはｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４がＣＡＣ（ヒスチジンをコードする）をＴＡＣ／ＴＡＴ（チロシンをコードする）に変換することができる場合にＧＦＰシグナルが活性化される。図２０Ｂは、例示的なＧＦＰシグナルが、ｎＳｐＣａｓ９－ＣＢＥ４活性またはｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４活性に起因して活性化されることを示す。上のパネル：負の対照（編集なし）；中央のパネル：ｎＳｐＣａｓ９－ＣＢＥ４によるＧＦＰ活性化；下のパネル：ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４によるＧＦＰ活性化。図２０Ｃは、ｎＳｐＣａｓ９－ＣＢＥ４またはｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４でトランスフェクトしたＧＦＰレポーター細胞における塩基編集事象のＦＡＣＳ定量の例を示す。Ｎ＝６；エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。結果は、技術的複製で行われた生物学的反復に由来する。
図２１は、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４によるシトシン編集の例を示す。上のパネルは、負の対照試料におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９のＫＡＮＫ３ターゲティング配列情報（ＰＡＭ配列を赤色で示す）および塩基編集を示す。下のパネルは、ＫＡＮＫ３標的配列のｎＮｍｅＣａｓ９－ＣＢＥ４編集ウィンドウにおける各塩基タイプの置換効率の定量を示す。配列表は、各位置におけるヌクレオチド頻度を示す。予想されるＣからＴへの変換頻度を、赤色で示している。
図２２は、ｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＣＢＥ４およびｎＮｍｅ２Ｃａｓ９－ＡＢＥｍａｘのそれぞれによるシトシンおよびアデニン編集の例を示す。上のパネルは、負の対照試料におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９のＰＬＸＮＢ２ターゲティング配列情報（ＰＡＭ配列を赤色で示す）および塩基編集を示す。中央のパネルは、ＰＬＸＮＢ２標的配列のｎＮｍｅＣａｓ９－ＡＢＥｍａｘ編集ウィンドウにおける各塩基タイプの置換率の定量を示す。配列表は、各位置におけるヌクレオチド頻度を示す。予想されるＡからＧへの変換頻度を、赤色で強調している。下のパネルは、ＰＬＸＮＢ２標的配列のｎＮｍｅＣａｓ９－ＣＢＥ４編集ウィンドウにおける各塩基タイプの置換効率の定量を示す。配列表は、各位置におけるヌクレオチド頻度を示す。予想されるＣからＴへの変換頻度を、赤色で強調している。
８．配列
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９のアラインメント
非ＰＩＤのａａ相違（青緑－下線）；ＰＩＤのａａ相違（黄色－太字の下線）；活性部位の残基（赤色－太字）。
Figure 2022508716000030
Figure 2022508716000031
Figure 2022508716000032
Figure 2022508716000033
 Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およびＮｍｅ３Ｃａｓ９のアラインメント
非ＰＩＤのａａ相違（青緑－下線）；ＰＩＤのａａ相違（黄色－太字の下線）；活性部位の残基（赤色－太字）。
Figure 2022508716000034
Figure 2022508716000035
Figure 2022508716000036
Figure 2022508716000037
 プラスミド発現Ｎｍｅ２Ｃａｓ９
ＳＶ４０ ＮＬＳ（黄色－太字）；３Ｘ－ＨＡ－Ｔａｇ（緑色－（下線／太字）；ｃＭｙｃ様ＮＬＳ（青緑－文字修飾なし）；リンカー（マゼンタ－太字の斜体）、およびＮｍｅ２Ｃａｓ９（斜体）。
Figure 2022508716000038
Figure 2022508716000039
 ＡＡＶ発現Ｎｍｅ２Ｃａｓ９
ＳＶ４０ ＮＬＳ（黄色－太字）；３Ｘ－ＨＡ－Ｔａｇ（緑色－（下線／太字）；ヌクレオプラスミン様ＮＬＳ（赤色－下線）；ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ（青緑－文字修飾なし）；リンカー（マゼンタ－太字の斜体）、およびＮｍｅ２Ｃａｓ９（斜体）。
Figure 2022508716000040
Figure 2022508716000041
 組換えＮｍｅ２Ｃａｓ９
ＳＶ４０ ＮＬＳ（黄色－太字）；ヌクレオプラスミン様ＮＬＳ（赤色－下線）；リンカー（マゼンタ－太字の斜体）、およびＮｍｅ２Ｃａｓ９（斜体）。
Figure 2022508716000042
 哺乳動物細胞ＲＮＰ送達で用いる組換えＮｍｅ２Ｃａｓ９：
ＳＶ４０ ＮＬＳ（黄色－太字）；ヌクレオプラスミン様ＮＬＳ（赤色－下線）；リンカー（マゼンタ－太字の斜体）、およびＮｍｅ２Ｃａｓ９（斜体）。
Figure 2022508716000043
 ９．治療への応用
小型のＣａｓ９オルソログがゲノム編集（単一ＡＡＶ送達を介するゲノム編集が含まれる）に適することが以前に検証されていたが、より広く採用されているＳｐｙＣａｓ９よりもＰＡＭが長く、標的部位頻度が低いことに起因して、治療法の開発が制限されていた。さらに、ＳａｕＣａｓ９およびそのＰＡＭ要件が緩和されたＫＫＨバリアント（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）は、ｓｇＲＮＡによってはオフターゲット編集を生じる傾向がある（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。狭い配列ウィンドウ内での編集を必要とする、すなわち、正確な分節欠失を必要とする標的遺伝子座の場合、これらの制限はより深刻になる。本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶ送達によるゲノム編集のためのジヌクレオチドＰＡＭの制限が少ない小型かつ正確度の高いＣａｓ９としてＮｍｅ２Ｃａｓ９を同定した。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の開発により、特にウイルスベクター送達を介したｉｎ ｖｉｖｏ編集のゲノム範囲が拡大する。本研究で確立されたＮｍｅ２Ｃａｓ９オール・イン・ワンＡＡＶ送達プラットフォームを原則的に使用して、同一の標的細胞に２つの別々のベクターを送達することを必要とせずに、ＳｐｙＣａｓ９ほど広い一連の部位（最適なＮ４ＣＣおよびＮＧＧ ＰＡＭの密度が同一であることに起因する）を標的にすることができる。また、触媒的不活性型バージョン（catalytically dead version）のＮｍｅ２Ｃａｓ９（ｄＮｍｅ２Ｃａｓ９）を利用可能であることは、ＣＲＩＳＰＲｉ、ＣＲＩＳＰＲａ、塩基編集、および関連するアプローチなどに適用範囲が広がる見込みがある（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。さらに、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の正確度が極めて高いことによって標的遺伝子の正確な編集が可能となり、オフターゲット活性に起因する安全性の問題を改善する可能性がある。おそらく反直感的に、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の標的部位密度がより高い（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のそれと比較して）ことは、前者のオフターゲット編集の相対的増加をもたらさない。より短いＰＡＭを有するように進化したＳｐｙＣａｓ９バリアントで類似の結果が最近報告されている（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。タイプＩＩ－Ｃ Ｃａｓ９オルソログは、ＳｐｙＣａｓ９よりｉｎ ｖｉｔｒｏでより緩慢なヌクレアーゼである（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）；興味深いことに、酵素学的原則は、見かけ上のｋｃａｔが低下すると（限度内）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのオンターゲット対オフターゲット特異性を改善することができることを示す（Ｂｉｓａｒｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびＮｍｅ３Ｃａｓ９の発見は、ヒトゲノム編集について以前に検証されたオルソログと高度に関連する（ＰＩＤを除く）未調査のＣａｓ９に依存していた（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびＮｍｅ３Ｃａｓ９がＮｍｅ１Ｃａｓ９と関連することはさらに有益であった（つまり、これらが全く同一のｓｇＲＮＡ足場を使用し、各々に機能的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列を同定および検証する必要性が回避される）。天然のＣＲＩＳＰＲ免疫において、新規のＰＡＭ特異性の進化の加速は、ＰＡＭ変異によって干渉を回避していたファージおよびＭＧＥのターゲティングを回復させるための選択圧を反映し得る（Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｐａｅｚ－Ｅｓｐｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＡｃｒＩＩＣ５ＳｍｕがＮｍｅ１Ｃａｓ９を阻害するがＮｍｅ２Ｃａｓ９を阻害しないという本発明者らの所見は、ＰＩＤ変動（すなわち、抗ＣＲＩＳＰＲ阻害の回避）の加速の第２の非相互排他的な根拠を示唆している。また、本発明者らは、変動の加速はＰＩＤに制限されず、おそらく、他のＣａｓ９ドメインに結合する抗ＣＲＩＳＰＲを回避するための選択圧に起因し得ると推測する。Ｃａｓ９のより保存された領域に結合するＡｃｒＩＩＣ１などのＣａｓ９阻害剤は、変異回避への経路がより少ない可能性があり、したがって、より法範囲の阻害を示す（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ａ）。ＡｃｒおよびＣａｓ９の共進化を駆動する選択圧の起源がどんなものであっても、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の検証された阻害剤（例えば、ＡｃｒＩＩＣ１－４）を利用できることがその活性を超えるさらなる調節レベルのための機会を提供する。
この研究で使用したアプローチ（すなわち、Ｃａｓ９内の急速に進化するドメインの検索）を、特にゲノム配列レベルで十分に試料採取された細菌種を用いて、他で実施することができる。また、このアプローチを、ゲノムまたはトランスクリプトームエンジニアリングおよび他の適用のためにも開発された他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１２およびＣａｓ１３など）に適用することができる。このストラテジーは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９の場合のように、異種の状況（例えば、真核細胞）における有効性が証明されたオルソログに密接に関連するＣａｓタンパク質を用いた場合に確固なものとなり得る。このアプローチを髄膜炎菌Ｃａｓ９オルソログに適用することにより、（一般的適用および治療への適用の両方のためのゲノム編集ツールの開発の進行が約束される特徴（小型、ジヌクレオチドＰＡＭ、極めて高い正確度、単一ＡＡＶで送達できること、およびＡｃｒ感受性）を固有に組み合わせた新規のゲノム編集プラットフォームであるＮｍｅ２Ｃａｓ９が得られる。
表３．以下は、本明細書中に開示のプラスミドおよびオリゴの配列の例を示す。
Figure 2022508716000044
Figure 2022508716000045
Figure 2022508716000046
Figure 2022508716000047
Figure 2022508716000048
Figure 2022508716000049
Figure 2022508716000050
Figure 2022508716000051
Figure 2022508716000052
Figure 2022508716000053
Figure 2022508716000054
Figure 2022508716000055
Figure 2022508716000056
Figure 2022508716000057
 哺乳動物ゲノム編集のためのＲＮＰ送達
ＲＮＰ実験のために、Ｎｅｏｎエレクトロポレーションシステムを、記載のように正確に使用した（Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。簡潔に述べれば、４０ピコモルの３ｘＮＬＳ－Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を、５０ピコモルのＴ７転写ｓｇＲＮＡと共に、緩衝液Ｒ中でアセンブリし、１０μＬ Ｎｅｏｎチップを使用してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、細胞を、抗生物質を含まない適切な培養培地を含む予め加温した２４ウェルプレートにプレーティングした。エレクトロポレーションのパラメーター（電圧、幅、パルス数）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞については１１５０Ｖ、２０ｍｓ、２パルス；Ｋ５６２細胞については１０００Ｖ、５０ｍｓ、１パルスであった。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ送達および肝臓組織の処理
ＡＡＶ８ベクター注射のために、８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪマウスに、尾静脈を介してマウスあたり４×１０１１ゲノムコピー（Ｐｃｓｋ９またはＲｏｓａ２６中のいずれかの検証された部位を標的にするｓｇＲＮＡを有する）を注射した。ベクター投与後２８日にマウスを屠殺し、分析のために肝臓組織を回収した。肝臓組織を、４％ホルマリン中で一晩固定し、パラフィン中に包埋し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。注射後０、１４、および２８日に顔面静脈から採血し、血清分離機（ＢＤ、カタログ番号３６５９６７）を使用して血清を単離し、アッセイまで－８０℃で保存した。血清コレステロールレベルを、製造者のプロトコールに従い、かつ以前に記載のように（Ｉｂｒａｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）比色エンドポイントアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。抗ＰＣＳＫ９ウェスタンブロットのために、４０μｇの組織由来のタンパク質または２ｎｇの組換えマウスＰＣＳＫ９タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，９２５８－ＳＥ－０２０）を、ＭｉｎｉＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）プレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上にロードした。分離したバンドをＰＶＤＦ膜に移し、５％ブロッキンググレードＢｌｏｃｋｅｒ溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にて室温で２時間ブロッキングした。次に、膜をウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ９４８５、１：２，０００）またはヤギ抗ＰＣＳＫ９抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＦ３９８５、１：４００）と一晩インキュベートした。膜をＴＢＳＴで洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ １７０６５１５、１：４，０００）およびロバ抗ヤギ二次抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＨＡＦ１０９、１：２，０００）と室温で２時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで再度洗浄し、Ｍ３５Ａ ＸＯＭＡＴプロセッサ（Ｋｏｄａｋ）を用いてＣｌａｒｉｔｙ（商標）ウェスタンＥＣＬ基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して可視化した。
マウス接合体におけるｅｘ ｖｉｖｏでのＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９送達
接合体を、３×１０９個または３×１０８個のＧＣのＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９．ｓｇＴｙｒベクターを含むＫＳＯＭ（カリウム補充シンプレックス最適化培地、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＲ－１０６－Ｄ）の１５μｌの液滴中で５～６時間インキュベートした（各液滴中４接合体）。インキュベーション後、接合体をＭ２でリンスし、新鮮なＫＳＯＭに移し、一晩培養した。翌日に、二細胞期に進行した胚を、偽妊娠レシピエントの卵管に移入し、出産予定日まで発育させた。
実験
実施例Ｉ
差次的に分岐したＰＩＤを有するＣａｓ９オルソログの発見
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９ペプチド配列を、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ種の全てのＣａｓ９オルソログを見出すためのＢＬＡＳＴ検索におけるクエリーとして使用した。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９に対して８０％を超える同一性を有するオルソログを、本研究の残りのために選択した。次いで、ＰＩＤを、ＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用してＮｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤ（残基８２０～１０８２）とアラインメントし、ＰＩＤ中に変異クラスターを有するＰＩＤをさらなる解析のために使用した。ＮｍｅＣａｓ９オルソログの無根系統樹を、ＦｉｇＴｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｔｒｅｅ．ｂｉｏ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｆｉｇｔｒｅｅ／）を使用して構築した。
実施例ＩＩ
Ｃａｓ９およびＡｃｒオルソログのクローニング、発現、および精製
本研究で使用したプラスミドおよびオリゴヌクレオチドの例を、表３に列挙する。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびＮｍｅ３Ｃａｓ９のＰＩＤをｇＢｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ）としてオーダーし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）を使用して、６×Ｈｉｓタグを有するＮｍｅ１Ｃａｓ９をコードする細菌発現プラスミドｐＭＳＣＧ７（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）中のＮｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤを置き換えた。以前に記載のように構築物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、発現させ、精製した（Ｐａｗｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。簡潔に述べれば、各Ｃａｓ９プラスミドを含むＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞を３７℃で０．６のＯＤ６００まで成長させ、タンパク質発現を１ｍＭ ＩＰＴＧによって１８℃で１６時間誘導した。細胞を採取し、１ｍｇ／ｍＬリゾチームおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を補充した溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴ）中での超音波処理によって溶解した。次いで、ライセートをＮｉ２＋－ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に通し、結合したタンパク質を３００ｍＭイミダゾールで溶出し、保存緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ ７．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）中で透析した。Ａｃｒタンパク質について、６×Ｈｉｓタグ化タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ株 ＢＬ２１ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中に発現させた。細胞を、振盪インキュベーター中で０．６の光学密度（ＯＤ６００）まで３７℃で成長させた。細菌培養物を１８℃まで冷却し、一晩の発現のために１ｍＭ ＩＰＴＧを添加することによってタンパク質発現を誘導した。翌日に、細胞を採取し、１ｍｇ／ｍＬリゾチームおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を補充した溶解緩衝液に再懸濁し、Ｃａｓ９と同一のプロトコールを使用してタンパク質を精製した。非タグ化Ａｃｒを単離するための樹脂結合タンパク質のタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼとの４℃で一晩のインキュベーションによって６×Ｈｉｓタグを除去した。
実施例ＩＩＩ
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＡＭ発見アッセイ
無作為化したＰＡＭ配列を有するｄｓＤＮＡ標的ライブラリーを、１０－ｎｔの無作為化ＰＡＭ領域を含む順方向プライマーを用いたオーバーラッピングＰＣＲによって生成した。ライブラリーをゲル精製し、Ｔ７転写ｓｇＲＮＡと共に精製Ｃａｓ９によるｉｎ ｖｉｔｒｏ切断反応に供した。３００ｎＭ Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体を使用して、３００ｎＭの標的断片を１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１（ＮＥＢ）中にて３７℃で１時間切断した。次いで、反応物を、プロテイナーゼＫにて５０℃で１０分間処理し、４％アガロース／１×ＴＡＥゲル上で泳動した。切断生成物を切り出し、溶出し、以前に記載のプロトコール（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を修正して使用してクローニングした。簡潔に述べれば、ＤＮＡ末端を修復し、非テンプレート化２’－デオキシアデノシンテールを付加し、Ｙ型アダプターをライゲーションした。ＰＣＲ後、生成物を、ＫＡＰＡライブラリー定量キットを使用して定量し、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて配列決定して、７５ｎｔのペアード・エンドリードを得た。配列を、カスタムスクリプトおよびＲを用いて解析した。
実施例ＩＶ
トランスフェクションおよび哺乳動物ゲノム編集
ヒトコドン最適化Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙによって、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の発現のために以前に使用したｐＣＤｅｓｔ２プラスミドバックボーンへとクローニングした（Ｐａｗｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＬＲ２．０細胞のトランスフェクションを、以前に記載のように行った（Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。Ｈｅｐａ１－６トランスフェクションのために、リポフェクタミンＬＴＸを使用し、トランスフェクションの２４時間前に培養されていた細胞を使用して、２４ウェルプレート（約１０５細胞／ウェル）中で５００ｎｇのオール・イン・ワンＡＡＶ．ｓｇＲＮＡ．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９プラスミドをトランスフェクトした。レンチベクターを介して送達されたＮｍｅ２Ｃａｓ９を安定に発現するＫ５６２細胞について（以下を参照のこと）、５０，０００～１５０，０００個の細胞を、５００ｎｇ ｓｇＲＮＡプラスミドを用いて、１０μＬ Ｎｅｏｎチップでエレクトロポレーションを行った。トランスフェクションの７２時間後の全ての細胞中のインデルを測定するために、細胞を採取し、ＤＮａｅｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。標的にされた遺伝子座をＰＣＲによって増幅し、Ｓａｎｇｅｒ法で配列決定し（Ｇｅｎｅｗｉｚ）、Ｄｅｓｋｔｏｐ Ｇｅｎｅｔｉｃｓのウェブベースのインターフェース（ｈｔｔｐ：／／ｔｉｄｅ．ｄｅｓｋｇｅｎ．ｃｏｍ）を使用したＴＩＤＥ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）によって解析した。
実施例Ｖ
Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を安定に発現させるためのＫ５６２細胞のレンチウイルス形質導入
Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を安定に発現するＫ５６２細胞を、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９について以前に記載のように生成した（Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。レンチウイルス産生のために、レンチウイルスベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を使用して、６ウェルプレート中でパッケージングプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ １２２６０および１２２５９）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。２４時間後、培養培地をトランスフェクトした細胞から吸引し、１ｍＬの新鮮なＤＭＥＭと交換した。翌日に、ウイルスを含む上清を回収し、０．４５μｍフィルターで濾過した。１０ｕＬの無希釈の上清を２．５ｕｇのポリブレンと共に使用して、６ウェルプレート中で約１０６個のＫ５６２細胞を形質導入した。形質導入した細胞を、２．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを補充した培地を使用して選択した。
実施例ＶＩ
哺乳動物ゲノム編集のためのＲＮＰ送達
ＲＮＰ実験のために、Ｎｅｏｎエレクトロポレーションシステムを、記載のように正確に使用した（Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。簡潔に述べれば、４０ピコモルの３ｘＮＬＳ－Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を、５０ピコモルのＴ７転写ｓｇＲＮＡと共に、緩衝液Ｒ中でアセンブリし、１０μＬ Ｎｅｏｎチップを使用してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、細胞を、抗生物質を含まない適切な培養培地を含む予め加温した２４ウェルプレートにプレーティングした。エレクトロポレーションのパラメーター（電圧、幅、パルス数）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞については１１５０Ｖ、２０ｍｓ、２パルス；Ｋ５６２細胞については１０００Ｖ、５０ｍｓ、１パルスであった。
実施例ＶＩＩ
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験を、小さな修正を加えて（Ｂｏｌｕｋｂａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）以前に記載のように（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）行った。簡潔に述べれば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、２００ｎｇのＣａｓ９プラスミド、２００ｎｇのｓｇＲＮＡプラスミド、および７．５ｐｍｏｌのアニーリングしたＧＵＩＤＥ－ｓｅｑオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。あるいは、Ｈｅｐａ１－６細胞を、上記のようにトランスフェクトした。ゲノムＤＮＡを、製造者のプロトコールに従ってトランスフェクションの７２時間後にＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。ライブラリーの調製および配列決定を、以前に記載のように正確に行った（Ｂｏｌｕｋｂａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。解析のために、標的部位を有する１０までのミスマッチを有する配列および５番目のＰＡＭ位にＣを有する配列（Ｎ４ＣＮ）の全てを、潜在的なオフターゲット部位と見なした。データを、ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＧＵＩＤＥｓｅｑバージョン１．１．１７を使用して解析した（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
実施例ＶＩＩＩ
標的化ディープシーケンシングおよび解析
本発明者らは標的化ディープシーケンシングを使用して、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑの結果を確認し、最大の正確度でインデル率を測定した。本発明者らは、オンターゲット部位およびオフターゲット部位の各々についてのＤＮＡ断片を産生するために２工程ＰＣＲ増幅を使用した。ＤＳ２およびＤＳ６で編集するＳｐｙＣａｓ９について、本発明者らは、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑリードカウントに基づいてトップオフターゲット部位を選択した。ＤＳ４でのＳｐｙＣａｓ９編集について、より少ない候補オフターゲット部位がＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって同定され、ＮＧＧ（ＤＳ４｜ＯＴ１、ＤＳ４｜ＯＴ３、ＤＳ４｜ＯＴ６）ＰＡＭまたはＮＧＣ（ＤＳ４｜ＯＴ２）ＰＡＭを有する部位のみを配列決定によって試験した。第１の工程では、本発明者らは、アダプターに相補的な末端を有するユニバーサルオーバーハングを保有する遺伝子座特異的プライマーを使用した。第１の工程では、２×ＰＣＲマスターミックス（ＮＥＢ）を使用して、オーバーハングを保有する断片を生成した。第２の工程では、精製されたＰＣＲ産物を、ユニバーサル順方向プライマーおよびインデックス付き逆方向プライマーを用いて増幅させた。フルサイズの産物（約２５０ｂｐ）をゲル精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑにてペアードモードで配列決定した。ＭｉＳｅｑデータ解析を、以前に記載のように行った（Ｐｉｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｉｂｒａｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。
実施例ＩＸ
ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋを使用したオフターゲット解析
ＴＳ２５およびＴＳ４７についての包括的なオフターゲットの予測を、ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋを使用して行った。ＳｐｙＣａｓ９と共有しないＮｍｅ２Ｃａｓ９の特徴に適応するために、小さな変更を行った。具体的には、本発明者らは、以下への変更：ｇＲＮＡ．サイズ＝２４、ＰＡＭ＝「ＮＮＮＮＣＣ」、ＰＡＭ．サイズ＝６、ＲＮＡ．ＰＡＭ．パターン＝「ＮＮＮＮＣＮ」を使用し、ミスマッチが６未満の候補オフターゲット部位を回収した。ミスマッチの数および位置に基づいたトップの潜在的なオフターゲット部位を選択した。それぞれのｓｇＲＮＡによって標的にされた細胞由来のゲノムＤＮＡを使用して、各候補オフターゲット遺伝子座を増幅し、次いで、ＴＩＤＥによって解析した。
実施例Ｘ
マウスの系統および胚の回収
全ての動物実験を、マサチューセッツ大学医学部の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）のガイダンスの下で行った。Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ（ストック番号００５３０４）。マウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。全ての動物を、１２時間の光周期で維持した。交尾栓が認められた日の光周期の中間を、妊娠期間の胎生日０．５（Ｅ０．５）と見なした。鉗子で膨大部を切り離し、ヒアルロニダーゼを含むＭ２培地中でインキュベートして卵丘細胞を除去することによってＥ０．５に接合体を回収した。
実施例ＸＩ
ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ送達および肝臓組織の処理
ＡＡＶ８ベクター注射のために、８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪマウスに、尾静脈を介してマウスあたり４×１０１１ゲノムコピー（Ｐｃｓｋ９またはＲｏｓａ２６中のいずれかの検証された部位を標的にするｓｇＲＮＡを有する）を注射した。ベクター投与後２８日にマウスを屠殺し、分析のために肝臓組織を回収した。肝臓組織を、４％ホルマリン中で一晩固定し、パラフィン中に包埋し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。注射後０、１４、および２８日に顔面静脈から採血し、血清分離機（ＢＤ、カタログ番号３６５９６７）を使用して血清を単離し、アッセイまで－８０℃で保存した。血清コレステロールレベルを、製造者のプロトコールに従い、かつ以前に記載のように（Ｉｂｒａｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）比色エンドポイントアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。抗ＰＣＳＫ９ウェスタンブロットのために、４０μｇの組織由来のタンパク質または２ｎｇの組換えマウスＰＣＳＫ９タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，９２５８－ＳＥ－０２０）を、ＭｉｎｉＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）プレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上にロードした。分離したバンドをＰＶＤＦ膜に移し、５％ブロッキンググレードＢｌｏｃｋｅｒ溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にて室温で２時間ブロッキングした。次に、膜をウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ９４８５、１：２，０００）またはヤギ抗ＰＣＳＫ９抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＦ３９８５、１：４００）と一晩インキュベートした。膜をＴＢＳＴで洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ １７０６５１５、１：４，０００）およびロバ抗ヤギ二次抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＨＡＦ１０９、１：２，０００）と室温で２時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで再度洗浄し、Ｍ３５Ａ ＸＯＭＡＴプロセッサ（Ｋｏｄａｋ）を用いてＣｌａｒｉｔｙ（商標）ウェスタンＥＣＬ基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して可視化した。
実施例ＸＩＩ
マウス接合体におけるｅｘ ｖｉｖｏでのＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９送達
接合体を、３×１０９個または３×１０８個のＧＣのＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９．ｓｇＴｙｒベクターを含むＫＳＯＭ（カリウム補充シンプレックス最適化培地、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＲ－１０６－Ｄ）の１５μｌの液滴中で５～６時間インキュベートした（各液滴中４接合体）。インキュベーション後、接合体をＭ２でリンスし、新鮮なＫＳＯＭに移し、一晩培養した。翌日に、二細胞期に進行した胚を、偽妊娠レシピエントの卵管に移入し、出産予定日まで発育させた。
文献（各々の全体が、本明細書中で参考として援用される）：
Figure 2022508716000058
Figure 2022508716000059
Figure 2022508716000060
Figure 2022508716000061
Figure 2022508716000062
Figure 2022508716000063
Figure 2022508716000064
Figure 2022508716000065
上の明細書中で言及した全ての刊行物および特許は、本明細書中で参考として援用される。本発明の記載の方法およびシステムの種々の修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と併せて記載しているが、特許請求の範囲に記載の発明がかかる特定の実施形態に過度に制限されるべきではないと理解すべきである。実際に、生物学的調節、生化学、分子生物学、昆虫学、浮遊生物、水産業、および淡水生態学、または関連分野の当業者に明白な記載の本発明の実施の形態の種々の修正形態が、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

Claims (46)

  1. 融合ヌクレオチドデアミナーゼおよびＮ４ＣＣヌクレオチド配列の結合領域を含む変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質。
  2. 前記タンパク質がＮｍｅ２Ｃａｓ９である、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 核局在シグナルタンパク質をさらに含む、請求項１に記載のタンパク質。
  4. 前記ヌクレオチドデアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、請求項１に記載のタンパク質。
  5. 前記ヌクレオチドデアミナーゼがアデノシンデアミナーゼである、請求項１に記載のタンパク質。
  6. ウラシルグルコシラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項１に記載のタンパク質。
  7. 前記核局在シグナルタンパク質が、ヌクレオプラスミンおよびＳＶ４０から選択される、請求項１に記載のタンパク質。
  8. 前記結合領域が、プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインである、請求項１に記載のタンパク質。
  9. 前記プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインが、前記変異を含む、請求項８に記載のタンパク質。
  10. 前記変異がＤ１６Ａ変異である、請求項９に記載のタンパク質。
  11. 変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質を含むアデノ随伴ウイルスであって、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質が、融合ヌクレオチドデアミナーゼおよびＮ４ＣＣヌクレオチド配列の結合領域を含む、アデノ随伴ウイルス。
  12. 前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス８である、請求項１１に記載のウイルス。
  13. 前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス６である、請求項１１に記載のウイルス。
  14. 前記タンパク質がＮｍｅ２Ｃａｓ９である、請求項１１に記載のウイルス。
  15. 前記タンパク質が、核局在シグナルタンパク質をさらに含む、請求項１１に記載のウイルス。
  16. 前記ヌクレオチドデアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、請求項１１に記載のウイルス。
  17. 前記ヌクレオチドデアミナーゼがアデノシンデアミナーゼである、請求項１１に記載のウイルス。
  18. 前記タンパク質が、ウラシルグルコシラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項１１に記載のウイルス。
  19. 前記核局在シグナルタンパク質が、ヌクレオプラスミンおよびＳＶ４０から選択される、請求項１１に記載のウイルス。
  20. 前記結合領域が、プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインである、請求項１１に記載のウイルス。
  21. 前記プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインが、前記変異を含む、請求項２０に記載のウイルス。
  22. 前記変異がＤ１６Ａ変異である、請求項２１に記載のウイルス。
  23. 方法であって、
    ａ）
    ｉ）変異一塩基を有する遺伝子を含むヌクレオチド配列であって、前記遺伝子がＮ４ＣＣヌクレオチド配列に挟まれた、ヌクレオチド配列；
    ｉｉ）融合ヌクレオチドデアミナーゼおよび前記Ｎ４ＣＣヌクレオチド配列の結合領域を含む変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質
    を準備すること；
    ｂ）前記ヌクレオチド配列を、前記結合領域が前記Ｎ４ＣＣヌクレオチド配列に付着するような条件下で、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質と接触させること；および
    ｃ）前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質に関して、前記変異一塩基を野生型塩基で置き換えること、
    を含む、方法。
  24. 前記タンパク質がＮｍｅ２Ｃａｓ９である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記タンパク質が、核局在シグナルタンパク質をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記ヌクレオチドデアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、請求項２３に記載の方法。
  27. 前記ヌクレオチドデアミナーゼがアデノシンデアミナーゼである、請求項２３に記載の方法。
  28. 前記タンパク質が、ウラシルグルコシラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  29. 前記核局在シグナルタンパク質が、ヌクレオプラスミンおよびＳＶ４０からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  30. 前記結合領域が、プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインである、請求項２３に記載の方法。
  31. 前記プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインが、前記Ｃａｓ９タンパク質変異を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記Ｃａｓ９タンパク質変異がＤ１６Ａ変異である、請求項３１に記載の方法。
  33. 方法であって、
    ａ）
    ｉ）変異一塩基を有する遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む患者であって、前記遺伝子がＮ４ＣＣヌクレオチド配列に挟まれ、前記変異遺伝子が遺伝子に基づく医学的状態を引き起こす、患者；
    ｉｉ）変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質を含むアデノ随伴ウイルスであって、前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質が、融合ヌクレオチドデアミナーゼおよび前記Ｎ４ＣＣヌクレオチド配列の結合領域を含む、アデノ随伴ウイルス；
    を準備すること、
    ｂ）前記変異ＮｍｅＣａｓ９タンパク質が前記変異一塩基を野生型一塩基で置き換えるような条件下で、前記患者を前記アデノ随伴ウイルスで処置することであって、その結果、前記遺伝子に基づく医学的状態が発症しない、処置すること
    を含む、方法。
  34. 前記遺伝子がチロシナーゼタンパク質をコードする、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記遺伝子に基づく医学的状態がチロシン血症である、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス８である、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス６である、請求項３３に記載の方法。
  38. 前記タンパク質がＮｍｅ２Ｃａｓ９である、請求項３３に記載の方法。
  39. 前記タンパク質が、核局在シグナルタンパク質をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  40. 前記ヌクレオチドデアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、請求項３３に記載の方法。
  41. 前記ヌクレオチドデアミナーゼがアデノシンデアミナーゼである、請求項３３に記載の方法。
  42. 前記タンパク質が、ウラシルグルコシラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  43. 前記核局在シグナルタンパク質が、ヌクレオプラスミンおよびＳＶ４０からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  44. 前記結合領域が、プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインである、請求項３３に記載の方法。
  45. 前記プロトスペーサーアクセサリーモチーフ相互作用ドメインが、前記変異を含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記変異がＤ１６Ａ変異である、請求項４５に記載の方法。
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