JP6721508B2 - 多重ガイドrna - Google Patents
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Description
本願は、2013年12月26日に出願された米国仮特許出願第61/921,007号明細書;2014年3月14日に出願された同第14/211,117号明細書;2014年3月14日に出願されたPCT/US2014/029068号明細書;2014年3月14日に出願されたPCT/US2014/028630号明細書;2014年3月23日に出願されたPCT/US2014/035162号明細書;及び2014年3月14日に出願されたPCT/US2014/029304号明細書の利益を主張する。前述の出願は全て、参照により本明細書に援用される。
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)から付与された助成第DP1 GM105378号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
プロモーター−C4−gRNA−C4−gRNA−C4−gRNA−C4
プロモーター−C4−gRNA−C4−gRNA−C4−gRNA−C4−gRNA−C4
プロモーター−C4−gRNA−C4−gRNA−C4−gRNA−C4−gRNA−C4−gRNA C4
などを有し得る。この例において、C4は、Csy4 RNA切断部位をコードする配列であり、及びgRNAは、ガイドRNAをコードする配列である。
(式中、X17−20は、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の直ちに5’側の標的配列の17〜20個の連続ヌクレオチドの相補鎖に相補的な配列であり、及びXNは、リボ核酸とCas9との結合を妨げない任意の配列である)。X17−20の配列は、本明細書では化膿レンサ球菌(S.pyogenes)Cas9システムで例示されるが、例えば他のシステムに応じて適切に、より長い配列もまた使用することができる。
従って、本明細書には、本明細書において多量体カセットと称される、2つ以上のgRNA配列を含む長鎖RNA転写物をコードするDNA分子が記載され、ここで各gRNAにはCsy4切断配列が隣接している。このDNA分子はまたプロモーターも含むことができ、及び任意選択で、1つ以上の他の転写調節配列、例えば、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、及びポリA配列を含むことができる。例えば、Xu et al.,Gene.2001 Jul 11;272(1−2):149−56を参照のこと。
本方法で使用することのできる幾つものプロモーターが、当該技術分野において公知である。一部の実施形態において、プロモーターはPolII又はPol IIIプロモーター、好ましくはPol IIプロモーターである。CAGプロモーターを含め、様々なPol IIプロモーターが記載されており、本組成物及び方法に使用することができる(例えば、Alexopoulou et al.,BMC Cell Biology 9:2,2008;Miyazaki et al.,Gene 79(2):269−77(1989);Niwa et al.,Gene 108(2):193−9(1991)を参照のこと;さらなるプロモーターとしては、EF1A、CAGGS、PGK、UbiC及びCMVプロモーター、並びに組織特異的プロモーター、例えば、とりわけ、B29、デスミン、エンドグリン、FLT−1、GFPA、SYN1が挙げられる;多数のプロモーターの配列が当該技術分野において公知である。例えば、CMV及びPGKプロモーターは、それぞれpSicoR及びpSicoR PGKから増幅することができ(Ventura et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 101:10380−10385(2004))、UbiCプロモーターはpDSL_hpUGIH(ATCC)から増幅することができ、CAGGSプロモーターはpCAGGS(BCCM)から増幅することができ、及びEF1AプロモーターはpEF6ベクター(Invitrogen)から増幅することができる。Pol IIコアプロモーターは、Butler and Kadonaga,Genes & Dev.16:2583−2592(2002)に記載されている。Pol II発現によって駆動される大型転写物からのgRNAの切断は、最も5’側の位置に任意のヌクレオチドを有するgRNAの産生を可能にする(U6又は他のRNAポリメラーゼIIIプロモーターからの標準発現は、このヌクレオチドのアイデンティティに制約を加える)。
Cas9ヌクレアーゼは、その5’末端にゲノムDNA標的部位に相補的な少なくとも17〜20ntを有する単一gRNAを使用することによって、配列NGGのさらなる近位プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を有する少なくとも17〜20ntの特定のゲノム標的にガイドすることができる。
(式中、X17−20は、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、例えば、NGG、NAG、又はNNGGの直ちに5’側の標的配列の少なくとも17〜20個の連続ヌクレオチドの相補鎖に相補的な配列である(しかしながら一部の実施形態では、この相補性領域は20ntより長く、例えば、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30nt又はそれ以上、例えば、17〜30ntであってもよい))。XNは、任意の配列であり、ここでNは(RNAにおいては)、リボ核酸とCas9との結合を妨げない0〜300又は0〜200、例えば、0〜100、0〜50、又は0〜20であり得る。一部の実施形態において、RNAは、RNA PolIII転写を終結するための終結シグナルとして使用される1つ以上のTが任意選択で存在する結果として、分子の3’末端に1つ以上のU、例えば1〜8個又はそれ以上のU(例えば、U、UU、UUU、UUUU、UUUUU、UUUUUU、UUUUUUU、UUUUUUUU)を含む。一部の実施形態において、RNAは、そのRNA分子の5’末端に、標的配列に相補的でない1つ以上、例えば最大3つ、例えば、1つ、2つ、又は3つ、又はそれ以上のさらなるヌクレオチドを含む。任意選択で、RNAヌクレオチドの1つ以上、例えば、配列X17−20内のヌクレオチドの1つ以上、配列XN内のヌクレオチドの1つ以上、又はgRNAの任意の配列内のヌクレオチドの1つ以上は修飾されており、例えばロックされている(2’−O−4’−Cメチレン架橋)、5’−メチルシチジンであるか、2’−O−メチル−プソイドウリジンであるか、又はそこでリボースリン酸骨格がポリアミド鎖によって置換されている。
(X17−20)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(配列番号8);(X17−20)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGG(配列番号9)を使用することができ;一部の実施形態では、標的DNA配列に相補的な5’末端17〜20ヌクレオチド配列、及びJinek et al.,Elife.2:e00471(2013)に記載されるCas9結合に必要な42ヌクレオチド3’末端ステムループ構造を有するsgRNA、例えば、(X17−20)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(配列番号8)が使用される。
crRNA配列:X17−20−GTTTTAGAGCTAGAAA(配列番号15)
tracrRNA配列:TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(配列番号16)を使用することになる。この場合、crRNAが本明細書に記載される方法及び分子におけるガイドRNAとして使用され、及びtracrRNAは同じ又は異なるDNA分子から発現し得る。
本明細書に記載される方法及び組成物においては、各ガイドRNAに切断配列が隣接することで1つ又は少なくとも1つの切断配列が各ガイドRNAの間にあるように、DNA分子にCsy4切断配列が挿入される。例示的Csy4切断配列としては、GTTCACTGCCGTATAGGCAG(トランケート型20nt)(配列番号1)及びGTTCACTGCCGTATAGGCAGCTAAGAAA(完全28nt)(配列番号2)が挙げられる。本明細書において実証されるとおり、トランケート型Csy4切断部位(配列番号1)の使用は、標準的な部位を使用するよりヒト細胞において効率が高い。本発明者らの知る限りでは、これは、ヒト細胞におけるCsy4活性の利用を初めて実証するものである。
本明細書に記載される方法においては、Csy4切断部位で転写物を切断する能力を有する機能性Csy4酵素もまた細胞で発現する。
本明細書に記載される方法においては、Cas9もまた細胞において発現する。幾つもの細菌がCas9タンパク質変異体を発現する。化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)由来のCas9が、現在最も一般的に用いられている;他のCas9タンパク質の幾つかは化膿レンサ球菌(S.pyogenes)Cas9と高い配列同一性レベルを有し、同じガイドRNAを使用する。他はさらに多様で、異なるgRNAを使用し、その上認識するPAM配列(RNAによって指定される配列に隣接するタンパク質によって指定される2〜5ヌクレオチド配列)も異なる。Chylinski et al.が大規模な細菌群からCas9タンパク質を分類しており(RNA Biology 10:5,1−12;2013)、参照によって本明細書に援用されるその補図1及び補表1に多数のCas9タンパク質が掲載されている。本明細書に記載されるコンストラクト及び方法は、それらのCas9タンパク質の任意のもの、及びそれらの対応するガイドRNA又は適合性のある他のガイドRNAの使用を含み得る。ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)LMD−9 CRISPR1システム由来のCas9もまた、Cong et al(Science 339,819(2013))の中でヒト細胞において機能することが示されている。加えて、Jinek et al.は、インビトロで、S.サーモフィルス(S.thermophilus)及びL.イノキュア(L.innocua)由来のCas9オルソログ(但し髄膜炎菌(N.meningitidis)又はC.ジェジュニ(C.jejuni)由来のものではない、これらは異なるガイドRNAを使用するものと思われる)が、二重化膿レンサ球菌(S.pyogenes)gRNAによってガイドされることで、効率はやや低いが、標的プラスミドDNAを切断し得ることを示した。
Jinek et al,2013、前掲を参照のこと。
例えば、Mali et al.,2013、前掲;及びJinek et al.,2012、前掲を参照のこと。或いは、Cas9は、2013年6月21日に出願され、且つ通し番号61/838,148が割り当てられた、「RNA−GUIDED TARGETING OF GENETIC AND EPIGENOMIC REGULATORY PROTEINS TO SPECIFIC GENOMIC LOCI」と題される米国仮特許出願、及びPCT/US2014/027335号明細書に記載されるとおりのdCas9−ヘテロ機能ドメイン融合物(dCas9−HFD)であってもよい。
例えば、本明細書に記載されるCsy4/ガイドRNAコンストラクトのインビボ又はインビトロ発現に、発現ベクターを含む核酸分子を使用することができる。複数のgRNAを(潜在的に誘導性の又は組織型/細胞型特異的な形で)発現するベクターは、研究及び治療用途に使用することができる。
また、本明細書には、研究用途、例えば潜在的な薬物標的のスクリーニング又は遺伝子レベルの相互作用の定義付けのための、例えば、誘導性の、組織型又は細胞型特異的多重ベクターにおけるgRNAのコンビナトリアルライブラリも提供される。
記載される本方法は、本明細書に記載されるとおりの多量体カセットと、加えて短縮型gRNAによってガイドされ得るヌクレアーゼ、例えば、上記に記載したとおりのCas9ヌクレアーゼ、及び上記に記載したとおり、Csy4ヌクレアーゼを、細胞において発現させるステップ、又は細胞と接触させるステップを含み得る。
以下のとおりの、単一転写物から発現するcrRNA又はsgRNAのいずれかのアレイからCRISPR/Cas9によって多重編集を行う目的で3つの戦略を試みた:
1.別個のtracrRNAを伴う、ダイレクトリピート隣接crRNAアレイ及びCas9
2.Csy4、Cas9、及び別個のtracrRNAと共に発現する、Csy4部位によって分かれるショートcrRNAアレイ
3.Csy4部位によって分かれる完全長単一ガイドRNA(sgRNA)
コンストラクトの各セットについて(図1に示される)、U2OS−EGFP破壊アッセイにおいてEGFPを効率的に破壊する能力を試験した。結果は図2に示す。戦略1及び2を用いて設計したコンストラクトは、単一の標的であっても、EGFP破壊アッセイにおいて最も低い活性を呈した;従ってさらなる実験(以下に記載する)は、戦略3の最適化に重点を置いた。
長鎖転写物からCsy4ヌクレアーゼを使用してgRNAを切り出す例示的戦略の概略図を図3に示す。概念実証を行う初期実験では、ヒト細胞における切断について、2つのバージョンのCsy4切断RNAヘアピン部位を試験した。これを行うため、2つのCsy4切断部位のうちの一方が隣接するgRNAを発現させた:
1.GTTCACTGCCGTATAGGCAGCTAAGAAA(完全28nt)(配列番号2)
2.GTTCACTGCCGTATAGGCAG(トランケート型20nt)(配列番号1)
この結果、その5’末端及び3’末端にトランケート型20nt配列が隣接したgRNAは、より長い28nt配列が隣接するものと比べて哺乳類細胞において活性がより高いことが示された(図4)。本発明者らの知る限りでは、これは、ヒト生細胞においてCsy4ヌクレアーゼを使用してRNA転写物をプロセシングし得ることを初めて実証するものである。20ntトランケート部位の一つの重要なさらなる利点は、より長い28nt配列と異なり、長鎖転写物からプロセシングされたgRNAの5’末端に追加のヌクレオチドが残らないことである(図4)。これにより、最も5’側の位置にいかなる所望のヌクレオチドを有するgRNAの発現も可能になる。これは、最も5’側の位置に特定の1つ又は複数のヌクレオチドを必要とするRNAポリメラーゼIIIプロモーターからのgRNAの発現と比べて改善である。
本発明はその詳細な説明と併せて説明されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するのでなく、例示するよう意図されることが理解されるべきである。他の態様、利点、及び変形例が以下の特許請求の範囲内にある。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
[1]
ガイドRNA(gRNA)をコードする複数の配列
を含むデオキシリボ核酸(DNA)分子であって、各gRNAには、配列GTTCACTGCCGTATAGGCAG(配列番号1)又はGTTCACTGCCGTATAGGCAGCTAAGAAA(配列番号2)を含むか又はそれからなる少なくとも1つのCsy4切断配列が隣接する、DNA分子。
[2]
プロモーター配列に作動可能に連結されている、上記[1]に記載のDNA分子。
[3]
2つ、3つ、又はそれ以上のgRNA配列を含む、上記[1]に記載のDNA分子。
[4]
前記プロモーター配列がRNAポリメラーゼII(Pol II)プロモーター又はPol IIIプロモーターである、上記[1]に記載のDNA分子。
[5]
前記プロモーター配列がRNA Pol IIプロモーターである、上記[1]に記載のDNA分子。
[6]
前記Pol IIプロモーターが、CAG、EF1A、CAGGS、PGK、UbiC、CMV、B29、デスミン、エンドグリン、FLT−1、GFPA、及びSYN1プロモーターからなる群から選択される、上記[5]に記載のDNA分子。
[7]
Csy4切断部位に連結したガイドRNA(gRNA)をコードする配列を含む1つ、2つ、3つ又はそれ以上のカセットと連結したプロモーター配列を含むDNA分子。
[8]
Csy4切断部位に連結した第3のガイドRNAをコードする第3の配列に連結した、Csy4切断部位に連結した第2のガイドRNAをコードする第2の配列に連結した、Csy4切断部位に連結した第1のガイドRNAをコードする第1の配列に作動可能に連結したPol IIプロモーターを含む、上記[7]に記載のDNA分子。
[9]
約100ntのガイドRNA配列を含む、上記[7]に記載のDNA分子。
[10]
配列番号1又は2のCsy4切断部位を含む、上記[7]に記載のDNA分子。
[11]
機能性Csy4酵素をコードする配列をさらに含む、上記[1]又は[7]に記載のDNA分子。
[12]
前記gRNAが配列:
(式中、X 17−20 は、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の直ちに5’側の標的配列の17〜20個の連続ヌクレオチドの相補鎖に相補的な配列であり、及びX N は、リボ核酸とCas9との結合を妨げない任意の配列である)を含む、上記[1]又は[7]に記載のDNA分子。
[13]
前記分子の3’末端に1つ以上のUを含む、上記[1]又は[7]に記載のDNA分子。
[14]
上記[1]〜[13]のいずれか一項に記載のDNA分子によってコードされるRNA分子。
[15]
上記[1]〜[13]のいずれか一項に記載のDNA分子を含むベクター。
[16]
機能性Csy4酵素をコードする配列をさらに含む、上記[15]に記載のベクター。
[17]
細胞において複数のガイドRNAを産生させる方法であって、前記細胞において上記[1]〜[13]のいずれか一項に記載のDNA分子を発現させるステップ、又は上記[14]に記載のRNA分子と前記細胞を接触させるステップを含む方法。
[18]
前記細胞が哺乳類細胞であり、及び前記細胞がまた外因性機能性Csy4酵素配列も発現し、又は前記方法が、機能性Csy4酵素又は機能性Csy4酵素をコードする核酸を投与するステップをさらに含む、上記[17]に記載の方法。
[19]
細胞における複数の標的遺伝子の発現を改変する方法であって、前記方法が、ガイドRNA(gRNA)をコードする複数の配列を含むDNA分子を発現させるステップを含み、各gRNAが、標的遺伝子の少なくとも17〜20ntに相補的な配列を含み、及び各gRNAには、配列GTTCACTGCCGTATAGGCAG(配列番号1)又はGTTCACTGCCGTATAGGCAGCTAAGAAA(配列番号2)を含むか又はそれからなる少なくとも1つのCsy4切断配列が隣接する、方法。
[20]
細胞における標的遺伝子の発現を改変する方法であって、前記方法が、ガイドRNA(gRNA)をコードする複数の配列を含むDNA分子を発現させるステップを含み、各gRNAが、前記標的遺伝子の少なくとも17〜20ntに相補的な配列を含み、及び各gRNAには、配列GTTCACTGCCGTATAGGCAG(配列番号1)又はGTTCACTGCCGTATAGGCAGCTAAGAAA(配列番号2)を含むか又はそれからなる少なくとも1つのCsy4切断配列が隣接する、方法。
Claims (19)
- ガイドRNA(gRNA)をコードする複数の配列
を含むデオキシリボ核酸(DNA)分子であって、各gRNAには、配列GTTCACTGCCGTATAGGCAG(配列番号1)からなる少なくとも1つのCsy4切断配列が隣接する、DNA分子。 - プロモーター配列に作動可能に連結されている、請求項1に記載のDNA分子。
- 2つ、3つ、又はそれ以上のgRNA配列を含む、請求項1に記載のDNA分子。
- 前記プロモーター配列がRNAポリメラーゼII(Pol II)プロモーター又はPol IIIプロモーターである、請求項1に記載のDNA分子。
- 前記プロモーター配列がRNA Pol IIプロモーターである、請求項1に記載のDNA分子。
- 前記Pol IIプロモーターが、CAG、EF1A、CAGGS、PGK、UbiC、CMV、B29、デスミン、エンドグリン、FLT−1、GFPA、及びSYN1プロモーターからなる群から選択される、請求項5に記載のDNA分子。
- Csy4切断部位に連結したガイドRNA(gRNA)をコードする配列を含む1つ、2つ、3つ又はそれ以上のカセットと連結したプロモーター配列を含むDNA分子であって、前記Csy4切断部位は、配列GTTCACTGCCGTATAGGCAG(配列番号1)からなる、DNA分子。
- Csy4切断部位に連結した第3のガイドRNAをコードする第3の配列に連結した、Csy4切断部位に連結した第2のガイドRNAをコードする第2の配列に連結した、Csy4切断部位に連結した第1のガイドRNAをコードする第1の配列に作動可能に連結したPol IIプロモーターを含む、請求項7に記載のDNA分子。
- 約100ntのガイドRNA配列を含む、請求項7に記載のDNA分子。
- 機能性Csy4酵素をコードする配列をさらに含む、請求項1又は7に記載のDNA分子。
- 前記gRNAが配列:
- 前記分子の3’末端に1つ以上のUを含む、請求項1又は7に記載のDNA分子。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のDNA分子によってコードされるRNA分子。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のDNA分子を含むベクター。
- 機能性Csy4酵素をコードする配列をさらに含む、請求項14に記載のベクター。
- 細胞において複数のガイドRNAを産生させる方法であって、請求項13に記載のRNA分子と前記細胞をインビトロで接触させるステップを含む方法。
- 前記細胞が哺乳類細胞であり、及び前記細胞がまた外因性機能性Csy4酵素配列も発現する、請求項16に記載の方法。
- 細胞における複数の標的遺伝子の発現を改変する方法であって、前記方法が、請求項1〜12のいずれか一項に記載のDNA分子又は請求項13に記載のRNA分子と前記細胞をインビトロで接触させるステップを含み、各gRNAが、標的遺伝子の少なくとも17〜20ntに相補的な配列を含む、方法。
- 細胞における標的遺伝子の発現を改変する方法であって、前記方法が、請求項1〜12のいずれか一項に記載のDNA分子又は請求項13に記載のRNA分子と前記細胞をインビトロで接触させるステップを含み、各gRNAが、前記標的遺伝子の少なくとも17〜20ntに相補的な配列を含む、方法。
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