JP7005580B2 - 多重ガイドｒｎａ - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１３年１２月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／９２１，００７
号明細書；２０１４年３月１４日に出願された同第１４／２１１，１１７号明細書；２０
１４年３月１４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９０６８号明細書；２０１４
年３月１４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２８６３０号明細書；２０１４年３
月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３５１６２号明細書；及び２０１４年３
月１４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９３０４号明細書の利益を主張する。
前述の出願は全て、参照により本明細書に援用される。
連邦政府の支援による研究又は開発
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａ
ｌｔｈ）から付与された助成第ＤＰ１ ＧＭ１０５３７８号に基づく連邦政府の支援を受
けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
任意選択で哺乳類細胞において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びＩＩＩプロモーターから
高活性ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を多重発現させるための方法及びコンスト
ラクトが記載される。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、インビトロで、哺乳類細胞において、及びゼブラフィッシュ
などの生きているモデル生物において、標的ＤＮＡ配列に部位特異的切断を作り出すため
に使用し得るプログラム可能なＲＮＡによってガイドされるクラスター化した規則的な間
隔の短いパリンドローム型リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）シス
テム（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４８２，３３１－３３８（
２０１２）；Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７，１６７－１７０
（２０１０）；Ｔｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
１４，３２１－３２７（２０１１））の基礎をなす（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ
１５３，９１０－９１８（２０１３）；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ（
２０１３）；Ｄｉｃａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２
０１３）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３－
２３９（２０１３）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ ２，ｅ００４７１（２０
１３）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２２７－２
２９（２０１３）；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９－８２３
（２０１３）；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３－８２６（２
０１３ｃ）；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３０－２
３２（２０１３）；Ｇｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９４（４）：１０
２９－３５（２０１３））。短い約１００ｎｔのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）がＣａｓ９と
複合体を形成し、ヌクレアーゼを特定の標的ＤＮＡ部位に誘導する；標的化は、ｇＲＮＡ
の５’末端にある少なくとも１７～２０ヌクレオチド（ｎｔ）の配列によって媒介され、
これらのヌクレオチドは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば配列ＮＧＧ
又はＮＡＧに一致するＰＡＭの隣にある目的の標的ゲノムＤＮＡ配列の相補鎖に相補的で
あるように設計され、それと操作されたｇＲＮＡの最初の１７～２０ヌクレオチドとの間
の単純な塩基対相補性によって相互作用する（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅ
ｓ（２０１３）；Ｄｉｃａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
（２０１３）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３
３－２３９（２０１３）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ ２，ｅ００４７１（
２０１３）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２２７
－２２９（２０１３）；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９－８
２３（２０１３）；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３－８２６
（２０１３ｃ）；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３０
－２３２（２０１３）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－
８２１（２０１２））。ｇＲＮＡはまた、触媒的に不活性化したＣａｓ９タンパク質（ｄ
Ｃａｓ９として知られる、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６
－８２１（２０１２）を参照）も誘導し、次にはこのｄＣａｓ９がエフェクタードメイン
（例えば転写活性化ドメイン）に融合することができる（例えば、２０１３年３月１５日
に出願された米国特許出願第６１／７９９，６４７号明細書、及び２０１３年６月２１日
に出願された同第６１／８３８，１４８号明細書（これらは両方ともに、参照により本明
細書に援用される）を参照のこと）。これらの後者のシステムは、ＲＮＡのガイドによっ
て異種エフェクタードメインを目的のゲノム遺伝子座に動員することを可能にする。
本発明は、少なくとも一部には、ショートＲＮＡヘアピン配列を認識するエンドリボヌ
クレアーゼであるＣｓｙ４を使用して、個々のｇＲＮＡがＣｓｙ４切断部位によって分か
れている単一の長鎖ＲＮＡ転写物（ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ又はＩＩＩプロモーターから産
生される）にコードされた複数の機能性ｇＲＮＡを切り出すことができるという発見に基
づく。
従って、第１の態様において本発明は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする複数の
配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を提供し、ここで各ｇＲＮＡには、配列ＧＴ
ＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）又はＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡ
ＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（配列番号２）を含むか又はそれからなる少なくとも１
つのＣｓｙ４切断配列が隣接する。
一部の実施形態において、ＤＮＡ分子はプロモーター配列に作動可能に連結されている
。
一部の実施形態において、ＤＮＡ分子は、各々少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣
接する２つ、３つ、又はそれ以上のｇＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態において、プロモーター配列はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ
）プロモーター又はＰｏｌ ＩＩＩプロモーター、好ましくはＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロ
モーターである。一部の実施形態において、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、ＣＡＧ、ＥＦ
１Ａ、ＣＡＧＧＳ、ＰＧＫ、ＵｂｉＣ、ＣＭＶ、Ｂ２９、デスミン、エンドグリン、ＦＬ
Ｔ－１、ＧＦＰＡ、及びＳＹＮ１プロモーターからなる群から選択される。
別の態様において、本発明は、Ｃｓｙ４切断部位、例えば配列番号１又は２に連結した
、ガイドＲＮＡをコードする配列、即ち、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ベー
スのシステムについて約１００ｎｔ、例えば、９５～３００ｎｔ、例えば、９５～１０５
ｎｔの配列を含む１つ、２つ、３つ又はそれ以上のカセットと連結したプロモーター配列
を含むＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態において、ＤＮＡ分子は、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第３のガイドＲ
ＮＡをコードする第３の配列に連結した、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第２のガイドＲＮ
Ａをコードする第２の配列に連結した、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第１のガイドＲＮＡ
をコードする第１の配列に作動可能に連結したＰｏｌ ＩＩプロモーターを含む。一部の
実施形態において、Ｃｓｙ４切断部位に連結したさらなるガイドＲＮＡが含まれる。例え
ば、ＤＮＡ分子は、以下の構造：
プロモーター－Ｃ４－ｇＲＮＡ－Ｃ４－ｇＲＮＡ－Ｃ４－ｇＲＮＡ－Ｃ４
プロモーター－Ｃ４－ｇＲＮＡ－Ｃ４－ｇＲＮＡ－Ｃ４－ｇＲＮＡ－Ｃ４－ｇＲＮＡ－Ｃ
４
プロモーター－Ｃ４－ｇＲＮＡ－Ｃ４－ｇＲＮＡ－Ｃ４－ｇＲＮＡ－Ｃ４－ｇＲＮＡ－Ｃ
４－ｇＲＮＡ Ｃ４
などを有し得る。この例において、Ｃ４は、Ｃｓｙ４ ＲＮＡ切断部位をコードする配列
であり、及びｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列である。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡは以下の配列を含む：
Figure 0007005580000001
（式中、Ｘ１７－２０は、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ
）の直ちに５’側の標的配列の１７～２０個の連続ヌクレオチドの相補鎖に相補的な配列
であり、及びＸＮは、リボ核酸とＣａｓ９との結合を妨げない任意の配列である）。Ｘ１
７－２０の配列は、本明細書では化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９シス
テムで例示されるが、例えば他のシステムに応じて適切に、より長い配列もまた使用する
ことができる。
一部の実施形態において、ＤＮＡ分子はまた、機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする配列も
含む。
また、本明細書には、例えば機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする配列を任意選択で含む、
本明細書に記載されるＤＮＡ分子を含むベクターも提供される。また、本明細書には、Ｄ
ＮＡ分子によって産生される多重転写物、例えば、未だＣｓｙ４で切断されていないイン
タクトなＲＮＡも提供される。
さらに別の態様において、本明細書には、細胞において複数のガイドＲＮＡを産生させ
る方法が提供される。本方法は、細胞において本明細書に記載されるＤＮＡ分子を発現さ
せるステップを含む。
一部の実施形態において、細胞は哺乳類細胞であり、この細胞はまた、外因性機能性Ｃ
ｓｙ４酵素配列も発現し、又は本方法は、機能性Ｃｓｙ４酵素又は機能性Ｃｓｙ４酵素を
コードする核酸を投与するステップをさらに含む。
別の態様において、本発明は、細胞において１つ又は複数の標的遺伝子の発現を改変す
る方法を提供する。本方法は、本明細書に記載されるとおりのＤＮＡ分子、例えば、ガイ
ドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする複数の配列を含むＤＮＡ分子を発現させるステップを
含み、ここで各ｇＲＮＡは、１つ以上の標的遺伝子の少なくとも１７～２０ｎｔに相補的
な可変配列を含み、及び各ｇＲＮＡには、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡ
Ｇ（配列番号１）又はＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（配
列番号２）を含むか又はそれからなる少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣接する。
本方法及び組成物において、ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるとおり、融合したｔｒ
ａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを含む単一ガイドＲＮＡであってもよく、或いはｃｒＲＮＡ
だけを含んでもよく、ｔｒａｃｒＲＮＡは同じ又は異なるＤＮＡ分子から発現してもよい
。従って一部の実施形態において、本明細書に記載されるＤＮＡ分子はまた、ｔｒａｃｒ
ＲＮＡをコードする配列も含む。一部の実施形態において、本方法は、細胞において別個
のｔｒａｃｒＲＮＡを発現させるステップ、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡを発現するベクタ
ー又はＤＮＡ分子と細胞を接触させるステップを含む。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技
術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書には、本発明に使用さ
れる方法及び材料が記載される；当該技術分野において公知の他の好適な方法及び材料も
また使用することができる。材料、方法、及び例は例示に過ぎず、限定することを意図す
るものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベ
ースエントリ、及び他の参照文献は、全体として参照により援用される。矛盾が生じる場
合、定義を含め、本明細書が優先するものとする。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図、並びに特許請求の範囲から明
らかとなるであろう。
以下のとおりの初期多重化実験で使用するコンストラクトを示す略図である： １＋２：別個のｔｒａｃｒＲＮＡを伴う、ダイレクトリピートｃｒＲＮＡアレイ及びＣａｓ９ ３＋４：Ｃｓｙ４、Ｃａｓ９、及び別個のｔｒａｃｒＲＮＡを伴う、Ｃｓｙ４部位によって分かれるショートｃｒＲＮＡアレイ ５＋６：Ｃｓｙ４部位によって分かれる完全長キメラｇＲＮＡ ７：ｎｌｓ－ＦＬＡＧタグ付加Ｃａｓ９ 図１に示すコンストラクトを発現する細胞における実験結果を示す棒グラフである。Ｃｓｙ４部位＋完全ｇＲＮＡ（コンストラクト５及び６）が、最も高効率の多重化フレームワークであった。 例示的標準及び多重Ｃｓｙ４ベースｇＲＮＡフレームワーク、及びそれらが産生する転写物の概略図及び比較である。Ｃｓｙ４は、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターのＵ６に代えてＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、ＣＡＧ）の使用を可能にすることに留意されたい。 Ｃｓｙ４がヒト細胞においてトランケート型認識部位を切断してｇＲＮＡをより高い活性で産生することを示す棒グラフである。トランケート型部位のプロセシングはまた、クリーンな５’末端を残すため、Ｕ６プロモーターによって課されるｇＲＮＡ標的配列の５’Ｇ制約が事実上除かれる。 図５Ａ～図５Ｃは、単一ヒト細胞における２標的多重編集のエビデンスを示す配列である。意図した部位２又は３に個々の欠失が観察される。部位２及び３について、同じ配列上の複数の欠失が観察される。部位２及び３にまたがる欠失もまた観察される。 図５Ａ～図５Ｃは、単一ヒト細胞における２標的多重編集のエビデンスを示す配列である。意図した部位２又は３に個々の欠失が観察される。部位２及び３について、同じ配列上の複数の欠失が観察される。部位２及び３にまたがる欠失もまた観察される。 図５Ａ～図５Ｃは、単一ヒト細胞における２標的多重編集のエビデンスを示す配列である。意図した部位２又は３に個々の欠失が観察される。部位２及び３について、同じ配列上の複数の欠失が観察される。部位２及び３にまたがる欠失もまた観察される。 Ｃｓｙ４ベースのシステムを使用した３つのｇＲＮＡの多重発現の成功を示す略図である。 ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ転写ｍＲＮＡからＣｓｙ４によって切断されたｇＲＮＡがヒト細胞においてＣａｓ９ヌクレアーゼを特定の標的に効率的に動員し得ることを示す棒グラフである。これらの実験において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ ＣＡＧプロモーターから作られる長鎖ｍＲＮＡ転写物において発現した。
Ｃａｓ９システムの潜在的利点の一つは、細胞においてヌクレアーゼ活性或いは異種エ
フェクタードメインを２つ以上のゲノム遺伝子座又は標的部位に動員する能力である。し
かしながら、かかる多重的適用のためには、細胞において２つ以上のｇＲＮＡが効率的に
発現可能である必要がある。哺乳類細胞に関しては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモー
ター（例えば、Ｕ６プロモーター）が、単一のショートｇＲＮＡの発現に用いられている
。ヒト細胞において単一の転写物から複数のｇＲＮＡ構成要素を発現させる先行の試みは
、効率的でないことが分かっている。
Ｃａｓ９システムのさらなる望ましい能力は、誘導性バージョンの構成要素を作り出し
、且つそれらの構成要素の組織特異的発現を可能にすることであろう。誘導性の及び／又
は組織特異的なＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターについては、これまでに記載がなさ
れている。しかしながら、かかるＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターからＣａｓ９又はｄ
Ｃａｓ９タンパク質は発現し得るものの、短い定義付けられたｇＲＮＡは、ＲＮＡ ｐｏ
ｌ ＩＩからの転写の開始及び終結部位が不正確であるため、このようにして発現させる
ことができない。実際、これまで全てのｇＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ
ー（理想的にはショートＲＮＡの発現に適している）から発現されている。
本明細書において実証するとおり、ショートＲＮＡヘアピン配列を認識するエンドリボ
ヌクレアーゼであるＣｓｙ４を使用して、個々のｇＲＮＡがＣｓｙ４切断部位によって分
かれている単一長鎖ＲＮＡ転写物（ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターから産生される
）カセットにコードされた複数の機能性ｇＲＮＡを切り出すことができる。機能性ｇＲＮ
Ａは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターから発現する長鎖ＲＮＡ転写物から成功裏に切
断されることができる。
ｇＲＮＡ／Ｃｓｙ４多量体カセット
従って、本明細書には、本明細書において多量体カセットと称される、２つ以上のｇＲ
ＮＡ配列を含む長鎖ＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ分子が記載され、ここで各ｇＲＮＡ
にはＣｓｙ４切断配列が隣接している。このＤＮＡ分子はまたプロモーターも含むことが
でき、及び任意選択で、１つ以上の他の転写調節配列、例えば、エンハンサー、サイレン
サー、インスレーター、及びポリＡ配列を含むことができる。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ
．，Ｇｅｎｅ．２００１ Ｊｕｌ １１；２７２（１－２）：１４９－５６を参照のこと
。
プロモーター
本方法で使用することのできる幾つものプロモーターが、当該技術分野において公知で
ある。一部の実施形態において、プロモーターはＰｏｌＩＩ又はＰｏｌ ＩＩＩプロモー
ター、好ましくはＰｏｌ ＩＩプロモーターである。ＣＡＧプロモーターを含め、様々な
Ｐｏｌ ＩＩプロモーターが記載されており、本組成物及び方法に使用することができる
（例えば、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
９：２，２００８；Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７９（２）：２６９
－７７（１９８９）；Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０８（２）：１９３－９（
１９９１）を参照のこと；さらなるプロモーターとしては、ＥＦ１Ａ、ＣＡＧＧＳ、ＰＧ
Ｋ、ＵｂｉＣ及びＣＭＶプロモーター、並びに組織特異的プロモーター、例えば、とりわ
け、Ｂ２９、デスミン、エンドグリン、ＦＬＴ－１、ＧＦＰＡ、ＳＹＮ１が挙げられる；
多数のプロモーターの配列が当該技術分野において公知である。例えば、ＣＭＶ及びＰＧ
Ｋプロモーターは、それぞれｐＳｉｃｏＲ及びｐＳｉｃｏＲ ＰＧＫから増幅することが
でき（Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ
Ａ １０１：１０３８０－１０３８５（２００４））、ＵｂｉＣプロモーターはｐＤＳ
Ｌ＿ｈｐＵＧＩＨ（ＡＴＣＣ）から増幅することができ、ＣＡＧＧＳプロモーターはｐＣ
ＡＧＧＳ（ＢＣＣＭ）から増幅することができ、及びＥＦ１ＡプロモーターはｐＥＦ６ベ
クター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅することができる。Ｐｏｌ ＩＩコアプロモー
ターは、Ｂｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１６：２
５８３－２５９２（２００２）に記載されている。Ｐｏｌ ＩＩ発現によって駆動される
大型転写物からのｇＲＮＡの切断は、最も５’側の位置に任意のヌクレオチドを有するｇ
ＲＮＡの産生を可能にする（Ｕ６又は他のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからの
標準発現は、このヌクレオチドのアイデンティティに制約を加える）。
一部の実施形態において、組織特異的プロモーターが使用され、及び短い定義付けられ
たｇＲＮＡ配列がＲＮＡ－Ｐｏｌ ＩＩ転写物からプロセシングされ得る。
Ｕ６核内低分子（ｓｎ）ＲＮＡプロモーター、７ＳＫプロモーター、及びＨ１プロモー
ターを含め、幾つものＰｏｌ ＩＩＩプロモーターが当該技術分野において公知である。
例えば、Ｒｏ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３８（４）：６２５－６２
７（２００５）を参照のこと。
ガイドＲＮＡ
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、その５’末端にゲノムＤＮＡ標的部位に相補的な少なくとも
１７～２０ｎｔを有する単一ｇＲＮＡを使用することによって、配列ＮＧＧのさらなる近
位プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する少なくとも１７～２０ｎｔの特定の
ゲノム標的にガイドすることができる。
従って、本明細書に記載される組成物は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、ＮＧＧ、ＮＡＧ、又はＮＮＧＧの直ちに５’側の標的配列の１７～２０ヌクレオチド（ｎｔ）に相補的な配列を５’末端に有する、通常トランスにコードされたｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、例えばＭａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８２３－６に記載されるとおりの単一Ｃａｓ９ガイドＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
ガイドＲＮＡを設計し及び発現させる方法は当該技術分野において公知である。ガイド
ＲＮＡは、一般的に言えば、２つの異なるシステムとして提供される：１）システム１は
、一緒になってＣａｓ９による切断をガイドする働きをする別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａ
ｃｒＲＮＡを使用し；及び２）システム２は、２つの別個のガイドＲＮＡを組み合わせて
単一のシステムにしたキメラｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを使用する（Ｊ
ｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．２０１２）。ｔｒａｃｒ－ＲＮＡは可変的にトランケートされる
ことができ、別個のシステム（システム１）及びキメラｇＲＮＡシステム（システム２）
の両方で様々な長さが機能することが示されている。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２；３３７：８１６－８２１；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８２３－６；Ｃｏｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９－
２３；及びＨｗａｎｇ ａｎｄ Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
２０１３ Ｍａｒ；３１（３）：２２７－９；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ
２，ｅ００４７１（２０１３））を参照のこと。システム２については、概して長さが長
いキメラｇＲＮＡほど高いオンターゲット活性を示しているが、しかし種々の長さのｇＲ
ＮＡの相対的特異性は今のところ不明確のままであり、従って場合によっては短いｇＲＮ
Ａの使用が望ましい可能性もある。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、転写開始部位
の上流約１００～８００ｂｐの範囲内、例えば、転写開始部位の上流約５００ｂｐの範囲
内の領域、転写開始部位を含む領域、又は転写開始部位の下流約１００～８００ｂｐの範
囲内、例えば約５００ｂｐの範囲内の領域に相補的である。一部の実施形態において、２
つ以上のｇＲＮＡをコードするベクター（例えばプラスミド）、例えば、標的遺伝子の同
じ領域内の異なる部位に向けた２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｇＲＮＡをコー
ドするプラスミドが使用される。さらなるガイドＲＮＡ、及びゲノム編集の特異性を高め
る方法が、「ＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧ ＳＰＥＣＩＦＩＣＩＴＹ ＦＯＲ ＲＮＡ－ＧＵＩ
ＤＥＤ ＧＥＮＯＭＥ ＥＤＩＴＩＮＧ」と題される米国仮特許出願第６１／８３８，１
７８号明細書に記載される。
一部の実施形態において、ｇＲＮＡは以下の配列を含むか又はそれからなる：
Figure 0007005580000002
（式中、Ｘ１７－２０は、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ
）、例えば、ＮＧＧ、ＮＡＧ、又はＮＮＧＧの直ちに５’側の標的配列の少なくとも１７
～２０個の連続ヌクレオチドの相補鎖に相補的な配列である（しかしながら一部の実施形
態では、この相補性領域は２０ｎｔより長く、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、
２６、２７、２８、２９、又は３０ｎｔ又はそれ以上、例えば、１７～３０ｎｔであって
もよい））。ＸＮは、任意の配列であり、ここでＮは（ＲＮＡにおいては）、リボ核酸と
Ｃａｓ９との結合を妨げない０～３００又は０～２００、例えば、０～１００、０～５０
、又は０～２０であり得る。一部の実施形態において、ＲＮＡは、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩ
転写を終結するための終結シグナルとして使用される１つ以上のＴが任意選択で存在する
結果として、分子の３’末端に１つ以上のＵ、例えば１～８個又はそれ以上のＵ（例えば
、Ｕ、ＵＵ、ＵＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵ
ＵＵＵＵ）を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡは、そのＲＮＡ分子の５’末端に、
標的配列に相補的でない１つ以上、例えば最大３つ、例えば、１つ、２つ、又は３つ、又
はそれ以上のさらなるヌクレオチドを含む。任意選択で、ＲＮＡヌクレオチドの１つ以上
、例えば、配列Ｘ１７－２０内のヌクレオチドの１つ以上、配列ＸＮ内のヌクレオチドの
１つ以上、又はｇＲＮＡの任意の配列内のヌクレオチドの１つ以上は修飾されており、例
えばロックされている（２’－Ｏ－４’－Ｃメチレン架橋）、５’－メチルシチジンであ
るか、２’－Ｏ－メチル－プソイドウリジンであるか、又はそこでリボースリン酸骨格が
ポリアミド鎖によって置換されている。
例えば、一部の実施形態では、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７（
６０９６）：８１６－２１（２０１２））に記載されるキメラガイドＲＮＡ、例えば、
（Ｘ１７－２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡ
ＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号８）；（Ｘ１７－２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡ
ＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧ（配列番号９）を使用することができ；一部
の実施形態では、標的ＤＮＡ配列に相補的な５’末端１７～２０ヌクレオチド配列、及び
Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２：ｅ００４７１（２０１３）に記載されるＣ
ａｓ９結合に必要な４２ヌクレオチド３’末端ステムループ構造を有するｓｇＲＮＡ、例
えば、（Ｘ１７－２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡ
ＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号８）が使用される。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、３’末端に１つ以上のアデニン（Ａ）又は
ウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含む。
本明細書に記載される例は単一ｇＲＮＡを利用するが、本方法はまた、二重ｇＲＮＡ（
例えば、天然に存在するシステムに見られるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）で用いる
こともできる。この場合、単一のｔｒａｃｒＲＮＡを、本システムを使用して発現する複
数の異なるｃｒＲＮＡと併せて、例えば、以下（ＲＮＡについては、Ｔは本明細書ではＵ
であると理解されることに留意されたい）：
ｃｒＲＮＡ配列：Ｘ１７－２０－ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡ（配列番号１５）
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴ
ＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣ（配列番号１６）
を使用することになる。この場合、ｃｒＲＮＡが本明細書に記載される方法及び分子にお
けるガイドＲＮＡとして使用され、及びｔｒａｃｒＲＮＡは同じ又は異なるＤＮＡ分子か
ら発現し得る。
さらに、相補性の１７～２０ヌクレオチドの配列を有するガイドＲＮＡが本明細書に例
示されるが、一部の実施形態では、１７～２０ｎｔの代わりにより長い配列、例えば、２
１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｎｔ又はそれ以上、例
えば１７～３０ｎｔを使用することができる。
Ｃｓｙ４切断配列
本明細書に記載される方法及び組成物においては、各ガイドＲＮＡに切断配列が隣接することで１つ又は少なくとも１つの切断配列が各ガイドＲＮＡの間にあるように、ＤＮＡ分子にＣｓｙ４切断配列が挿入される。例示的Ｃｓｙ４切断配列としては、ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（トランケート型２０ｎｔ）（配列番号１）及びＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（完全２８ｎｔ）（配列番号２）が挙げられる。本明細書において実証されるとおり、トランケート型Ｃｓｙ４切断部位（配列番号１）の使用は、標準的な部位を使用するよりヒト細胞において効率が高い。本発明者らの知る限りでは、これは、ヒト細胞におけるＣｓｙ４活性の利用を初めて実証するものである。
機能性Ｃｓｙ４酵素配列
本明細書に記載される方法においては、Ｃｓｙ４切断部位で転写物を切断する能力を有
する機能性Ｃｓｙ４酵素もまた細胞で発現する。
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＵＣＢＰＰ－ＰＡ１４（Ｐ
ａ１４）、エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）ＡＡＭ８５２９５
（Ｙｐ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＵＴＩ８９（Ｅｃ８９）、ディ
ケロバクター・ノドーサス（Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｎｏｄｏｓｕｓ）ＶＣＳ１７
０３Ａ（Ｄｎ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕ
ｍａｎｎｉｉ）ＡＢ００５７（Ａｂ）、モリテーラ属種（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ ｓｐ．）
ＰＥ３６（ＭＰ１、ＭＰ０１）、シュワネラ属種（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．）Ｗ３
－１８－１（ＳＷ）、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ
ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）Ｐｍ７０（Ｐｍ）、ペクトバ
クテリウム・ワサビエ（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗａｓａｂｉａｅ）（Ｐｗ）、
及びディケヤ・ダダンティイ（Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ）Ｅｃｈ７０３（Ｄｄ
）由来のＣｓｙ４ホモログの例示的Ｃｓｙ４配列が、Ｈａｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９（５９９７）：１３５５－１３５８（２０１０）の図Ｓ６に示さ
れる。好ましい実施形態において、Ｃｓｙ４は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒ
ｕｇｉｎｏｓａ）由来である。
一部の実施形態において、Ｃｓｙ４は、異種エフェクタードメインをｇＲＮＡに共有結
合的に連結するためにも使用される。Ｃｓｙ４は、シングルターンオーバー酵素であり、
切断後もその標的ヘアピン配列に結合したままであると考えられる（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ
ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２０１２ Ａｐｒ；１８（４）：６６１－７２）。従ってＣｓ
ｙ４は、切断された各ｇＲＮＡの３’末端に結合したままであると予想される。本明細書
において実証されるとおり、切断されたｇＲＮＡはヒト細胞において機能性であると思わ
れるため、ｇＲＮＡの３’末端におけるこのＣｓｙ４タンパク質の存在は、ｇＲＮＡがＣ
ａｓ９と複合体を形成してその活性を誘導する能力に影響を及ぼさないものと思われる。
従って、これらのｇＲＮＡ－Ｃｓｙ４融合物はまた、その触媒ヌクレアーゼ活性を不活性
化する突然変異を有するＣａｓ９突然変異体（ｄＣａｓ９タンパク質）も誘導可能であろ
うと考えられる。従って、異種機能ドメイン（ＨＦＤ）をＣｓｙ４と融合することができ
（Ｃｓｙ４－ＨＦＤ）、次にはｄＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ：Ｃｓｙ４－ＨＦＤ複合体がかか
るドメインを特定のゲノム遺伝子座に誘導し得る。かかるＨＦＤの例には、他のヌクレア
ーゼドメイン、例えばＦｏｋＩ由来のもの、転写活性化因子若しくはリプレッサードメイ
ン、又はヒストン若しくはＤＮＡメチル化状態を修飾する他のドメインが含まれ得る。
Ｃｓｙ４－ＨＦＤは、異種機能ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン、例えばＶＰ６
４又はＮＦ－κＢ ｐ６５由来）を、介在リンカー、例えば約５～２０又は１３～１８ヌ
クレオチドのリンカーを伴い又は伴わずＣｓｙ４タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合す
ることによって作り出される。転写活性化ドメインはＣｓｙ４のＮ末端又はＣ末端に融合
することができる。転写活性化ドメインに加えて、当該技術分野において公知のとおりの
他の異種機能ドメイン（例えば、転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢ、ＳＩＤなど）又
はサイレンサー、例えばヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１、別名ｓｗｉ６）、例え
ばＨＰ１α又はＨＰ１β；ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、
又はλＮタンパク質が結合するものなどの固定的なＲＮＡ結合配列に融合したロング非コ
ードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を動員することのできるタンパク質又はペプチド；ＤＮＡの
メチル化状態を修飾する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）又
はＴＥＴタンパク質）；又はヒストンサブユニットを修飾する酵素（例えば、ヒストンア
セチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）、ヒスト
ンメチルトランスフェラーゼ（例えば、リジン又はアルギニン残基のメチル化について）
又はヒストンデメチラーゼ（例えば、リジン又はアルギニン残基の脱メチル化について）
）もまた使用することができる。かかるドメインの幾つもの配列、例えばＤＮＡにおける
メチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒するドメインが当該技術分野において公知であ
る。例示的タンパク質としては、ＤＮＡにおいて５－メチルシトシン（５－ｍＣ）を５－
ヒドロキシメチルシトシン（５－ｈｍＣ）に変換する酵素である１０－１１転座（ＴＥＴ
）１～３ファミリーが挙げられる。例えば、国際公開第２０１４／１４４７６１号パンフ
レットを参照のこと。
ヒトＴＥＴ１～３の配列は当該技術分野において公知であり、以下の表に示す：
Figure 0007005580000003
一部の実施形態において、触媒ドメインの完全長配列の全て又は一部、例えば、７つの
高度に保存されたエクソンによってコードされるシステインリッチ伸長部及び２ＯＧＦｅ
ＤＯドメインを含む触媒モジュール、例えばアミノ酸１５８０～２０５２を含むＴｅｔ１
触媒ドメイン、アミノ酸１２９０～１９０５を含むＴｅｔ２及びアミノ酸９６６～１６７
８を含むＴｅｔ３が含まれ得る。例えば、３つ全てのＴｅｔタンパク質における主要な触
媒残基を示すアラインメントについては、Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌ
ｅ．２００９ Ｊｕｎ １；８（１１）：１６９８－７１０．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕ
ｎ ２７の図１、及び完全長配列についてはその補助資料（ｆｔｐサイトｆｔｐ．ｎｃｂ
ｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ａｒａｖｉｎｄ／ＤＯＮＳ／ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ
＿ｍａｔｅｒｉａｌ＿ＤＯＮＳ．ｈｔｍｌで利用可能）（例えばｓｅｑ ２ｃを参照）を
参照のこと；一部の実施形態において、配列はＴｅｔ１のアミノ酸１４１８～２１３６又
はＴｅｔ２／３における対応する領域を含む。
他の触媒モジュールは、例えば、Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９に同定されるタン
パク質由来であり得る。
一部の実施形態において、融合タンパク質は、Ｃｓｙ４と異種機能ドメインとの間にリ
ンカーを含む。これらの融合タンパク質に（又はコンカテネート構造の融合タンパク質間
に）使用することのできるリンカーには、融合タンパク質の機能を妨げない任意の配列が
含まれ得る。好ましい実施形態において、リンカーは短く、例えば２～２０アミノ酸であ
り、典型的には可動性である（即ち、グリシン、アラニン、及びセリンなど、高い自由度
のアミノ酸を含む）。一部の実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号３）又
はＧＧＧＧＳ（配列番号１７）からなる１つ以上のユニット、例えば、ＧＧＧＳ（配列番
号３）又はＧＧＧＧＳ（配列番号１７）ユニットの２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のリ
ピートを含む。他のリンカー配列、例えば、ＧＧＳ、ＧＧＳＧ（配列番号２２）、ＳＧＳ
ＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号２３）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号２
４）、又はＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号２５）もまた使用す
ることができる。
Ｃａｓ９
本明細書に記載される方法においては、Ｃａｓ９もまた細胞において発現する。幾つも
の細菌がＣａｓ９タンパク質変異体を発現する。化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９が、現在最も一般的に用いられている；他の
Ｃａｓ９タンパク質の幾つかは化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と高い
配列同一性レベルを有し、同じガイドＲＮＡを使用する。他はさらに多様で、異なるｇＲ
ＮＡを使用し、その上認識するＰＡＭ配列（ＲＮＡによって指定される配列に隣接するタ
ンパク質によって指定される２～５ヌクレオチド配列）も異なる。Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．が大規模な細菌群からＣａｓ９タンパク質を分類しており（ＲＮＡ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ １０：５，１－１２；２０１３）、参照によって本明細書に援用されるその補
図１及び補表１に多数のＣａｓ９タンパク質が掲載されている。本明細書に記載されるコ
ンストラクト及び方法は、それらのＣａｓ９タンパク質の任意のもの、及びそれらの対応
するガイドＲＮＡ又は適合性のある他のガイドＲＮＡの使用を含み得る。ストレプトコッ
カス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭ
Ｄ－９ ＣＲＩＳＰＲ１システム由来のＣａｓ９もまた、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ３３９，８１９（２０１３））の中でヒト細胞において機能することが示され
ている。加えて、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．は、インビトロで、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ
．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）由来のＣａｓ
９オルソログ（但し髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）又はＣ．ジェジュニ（Ｃ
．ｊｅｊｕｎｉ）由来のものではない、これらは異なるガイドＲＮＡを使用するものと思
われる）が、二重化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡによってガイドされ
ることで、効率はやや低いが、標的プラスミドＤＮＡを切断し得ることを示した。
一部の実施形態において、本システムは、細菌にコードされたものとしての、又は哺乳
類細胞における発現にコドンが最適化されたものとしての、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏ
ｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を利用する。ＨＡエピトープ（アミノ酸配列ＤＡ
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬ（配列番号１８））及び核局在化シグナル（アミノ酸配列ＰＫＫ
ＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号１９））に融合した化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（残基１～１３６８）の例示的配列は
、以下のとおりである：
Figure 0007005580000004
Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ，２０１３、前掲を参照のこと。
一部の実施形態において、ヌクレアーゼをニッカーゼにするためＤ１０Ａ及びＨ８４０
Ａのいずれかの突然変異を含むか、又はタンパク質のヌクレアーゼ部分を触媒的に不活性
にするためＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａの両方の突然変異を含むＣａｓ９配列が使用される。
本明細書に記載される方法及び組成物で使用し得る触媒的に不活性の化膿レンサ球菌（Ｓ
．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）の配列は、以下のとおりである；突然変異
は太字及び下線で示す。
Figure 0007005580000005
Figure 0007005580000006
例えば、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３、前掲；及びＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，
２０１２、前掲を参照のこと。或いは、Ｃａｓ９は、２０１３年６月２１日に出願され、
且つ通し番号６１／８３８，１４８が割り当てられた、「ＲＮＡ－ＧＵＩＤＥＤ ＴＡＲ
ＧＥＴＩＮＧ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣ ＡＮＤ ＥＰＩＧＥＮＯＭＩＣ ＲＥＧＵＬＡＴ
ＯＲＹ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＴＯ ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＧＥＮＯＭＩＣ ＬＯＣＩ」と題
される米国仮特許出願、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７３３５号明細書に記載される
とおりのｄＣａｓ９－ヘテロ機能ドメイン融合物（ｄＣａｓ９－ＨＦＤ）であってもよい
。
Ｃａｓ９は、本明細書に記載されるとおりの発現ベクター、例えば、Ｃａｓ９をコード
する配列、例えばＣａｓ９ ｃＤＮＡ又は遺伝子を含む染色体外プラスミド又はウイルス
ベクターから発現させてもよく；細胞のゲノムに組み込まれた外因性Ｃａｓ９ ｃＤＮＡ
又は遺伝子から発現させてもよく；Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ；実際のＣａｓ９タン
パク質それ自体；又は、非哺乳類細胞の場合、外因性Ｃａｓ９であってもよい。
発現系
例えば、本明細書に記載されるＣｓｙ４／ガイドＲＮＡコンストラクトのインビボ又は
インビトロ発現に、発現ベクターを含む核酸分子を使用することができる。複数のｇＲＮ
Ａを（潜在的に誘導性の又は組織型／細胞型特異的な形で）発現するベクターは、研究及
び治療用途に使用することができる。
本明細書に記載される融合タンパク質及び多量体ガイドＲＮＡカセットを使用するため
には、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましい場合もあり得る。
これは種々の方法で実施することができる。例えば、ガイドＲＮＡカセット又はＣｓｙ４
又はＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を、複製及び／又は発現用の原核細胞又は真核
細胞に形質転換される中間ベクターにクローニングすることができる。中間ベクターは、
典型的には、融合タンパク質をコードする核酸の保存若しくは操作用又は融合タンパク質
の産生用の原核生物ベクター、例えば、プラスミド、又はシャトルベクター、又は昆虫ベ
クターである。ガイドＲＮＡ又は融合タンパク質をコードする核酸はまた、植物細胞、動
物細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は原虫細胞への投
与用の発現ベクターにクローニングすることもできる。
発現を得るため、ガイドＲＮＡ又は融合タンパク質をコードする配列は、典型的には、
転写を誘導するプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングされる。好適な細菌
及び真核生物プロモーターは当該技術分野において周知されており、例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｄ ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１
９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２０１０）に記載されている。
操作されたタンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ
）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ）において利用可能である（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ ２２
：２２９－２３５）。かかる発現系のキットが市販されている。哺乳類細胞、酵母、及び
昆虫細胞用の真核生物発現系は当該技術分野において周知されており、同様に市販されて
いる。
幾つもの好適なベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、組換えレトロウイルス
、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び単純ヘルペスウイルス１
型、アデノウイルス由来ベクター、又は組換え細菌若しくは真核生物プラスミドが、当該
技術分野において公知である。例えば、発現コンストラクトは以下を含み得る：コード領
域；プロモーター配列、例えば、発現を選択の細胞型に制限するプロモーター配列、条件
的プロモーター、又は強力な汎用プロモーター；エンハンサー配列；非翻訳調節配列、例
えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ；ポリアデニル化部位；及び／又はインス
レーター配列。かかる配列は当該技術分野において公知であり、当業者であれば好適な配
列を選択することが可能である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ
．）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅ
ｃｔｉｏｎｓ ９．１０－９．１４及び他の標準実験マニュアルを参照のこと。一部の実
施形態では、当該技術分野において公知のとおりの組織特異的プロモーターを使用して、
発現を特定の細胞型に限定することができる。
上記に記載したとおり、ガイドＲＮＡを発現させるベクターは、ガイドＲＮＡの発現を
駆動するためＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ又はＰｏｌ ＩＩＩプロモーターを含み得る。これら
のヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクション後の哺乳類細胞におけるｇＲＮ
Ａの発現を可能にする。或いは、例えばインビトロ転写のため、Ｔ７プロモーターを使用
してもよく、ＲＮＡをインビトロで転写して精製することができる。核酸の発現を誘導す
るために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、融合タンパク質の
発現及び精製には、典型的には強力な構成的プロモーターが使用される。対照的に、遺伝
子調節のため融合タンパク質がインビボ投与される場合、融合タンパク質の詳細な用途に
応じて構成的プロモーター又は誘導性プロモーターのいずれかが使用され得る。加えて、
融合タンパク質の投与に好ましいプロモーターは、ＨＳＶ ＴＫなどの弱いプロモーター
、又は同様の活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターにはまた、トランス活
性化に応答するエレメント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、
ｌａｃリプレッサー応答エレメント、及びテトラサイクリン調節系及びＲＵ－４８６系な
どの小分子制御系も含まれ得る（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ ＆ Ｂｕｊａｒｄ，１９９２，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７；Ｏｌｉｇｉｎｏ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５：４９１－４９６；Ｗａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２－４４１；Ｎｅｅｒｉｎｇ ｅｔ
ａｌ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８８：１１４７－５５；及びＲｅｎｄａｈｌ ｅｔ
ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：７５７－７６１を参照のこ
と）。
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的には、原核生物又は真核生物のいずれで
あれ、宿主細胞での核酸の発現に必要なあらゆる追加的なエレメントを含む転写ユニット
又は発現カセットを含む。従って典型的な発現カセットは、例えば融合タンパク質をコー
ドする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、及び例えば転写物の効率的なポリ
アデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、又は翻訳終結に必要な任意のシグナルを含
む。カセットの追加的なエレメントには、例えば、エンハンサー、及び異種スプライシン
グイントロンシグナルが含まれ得る。
遺伝情報を細胞に運び込むために使用される詳細な発現ベクターは、融合タンパク質の
目的の用途、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原虫等における発現に関連して選択され
る。標準的な細菌発現ベクターは、プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミ
ド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、及び市販のタグ融合発現系、例えばＧＳＴ及びＬａｃＺを
含む。好ましいタグ融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。か
かるタグ融合タンパク質は、操作されたＴＡＬＥリピートタンパク質の精製に使用するこ
とができる。組換えタンパク質にエピトープタグ、例えば、ｃ－ｍｙｃ又はＦＬＡＧもま
た付加することができ、それにより単離、発現のモニタリング、並びに細胞及び細胞内局
在性のモニタリングに好都合な方法がもたらされる。
真核細胞発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、及
びエプスタイン・バーウイルス由来のベクターにおいては、多くの場合に真核生物ウイル
ス由来の調節エレメントを含む発現ベクターが用いられる。他の例示的真核生物ベクター
としては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、
バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及び任意の他の、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後
期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター
、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞における
発現に有効であることが示される他のプロモーターの誘導下でタンパク質の発現を可能に
するベクターが挙げられる。
一部の発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、
及びジヒドロ葉酸レダクターゼなどの、安定にトランスフェクトされた細胞株を選択する
ためのマーカーを有する。昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用するなど、
高収率発現系もまた好適であり、ここで融合タンパク質コード配列はポリヘドリンプロモ
ーター又は他の強力なバキュロウイルスプロモーターの誘導下にある。
発現ベクターに典型的に含まれるエレメントとしてはまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で
機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にするための抗生物質
耐性をコードする遺伝子、及び組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域に
おけるユニークな制限部位も挙げられる。
標準的なトランスフェクション方法を用いて、多量のタンパク質を発現する細菌、哺乳
類、酵母又は昆虫細胞株が作製され、次にはそれが標準的な技法を用いて精製される（例
えば、Ｃｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１
７６１９－２２；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ
，ｅｄ．，１９９０）を参照のこと）。真核及び原核細胞の形質転換は、標準的な技法に
従い実施される（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３
２：３４９－３５１；Ｃｌａｒｋ－Ｃｕｒｔｉｓｓ ＆ Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７－３６２（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ
ｓ，１９８３を参照のこと）。
宿主細胞への外来性ヌクレオチド配列の導入には、公知の手順のいずれを用いてもよい
。それらの手順は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラス
ト融合、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネ
イキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソーム及び組込みの両方
）、及びクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の外来性遺伝物
質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用を含む（例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前掲を参照のこと）。用いられる特定の遺伝子操作手順が選
択のタンパク質の発現能を有する宿主細胞への少なくとも１つの遺伝子の導入を成功させ
ることが可能であれば、十分である。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９又はＣｓｙ４タンパク質は、タンパク質の核移行を
もたらす核局在ドメインを含む。幾つかの核局在配列（ＮＬＳ）が知られており、任意の
好適なＮＬＳを使用することができる。例えば、多くのＮＬＳは、二分塩基性リピート（
ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ｂａｓｉｃ ｒｅｐｅａｔ）と称される複数の塩基性アミノ酸を有
する（Ｇａｒｃｉａ－Ｂｕｓｔｏｓ ｅｔ ａｌ，１９９１，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０７１：８３－１０１にレビューされる）。二分塩基性リピートを
含むＮＬＳは、キメラタンパク質の任意の部分に置くことができ、核内に局在化するキメ
ラタンパク質をもたらす。好ましい実施形態において、本明細書に記載される融合タンパ
ク質の究極的な機能は典型的にはタンパク質の核局在を必要とするため、最終的な融合タ
ンパク質に核局在ドメインが取り込まれる。しかしながら、タンパク質が内因性の核局在
機能を有する場合には、別個の核局在ドメインを加える必要はないこともある。
本発明は、ベクター及びベクターを含む細胞を含む。
ライブラリ
また、本明細書には、研究用途、例えば潜在的な薬物標的のスクリーニング又は遺伝子
レベルの相互作用の定義付けのための、例えば、誘導性の、組織型又は細胞型特異的多重
ベクターにおけるｇＲＮＡのコンビナトリアルライブラリも提供される。
使用方法
記載される本方法は、本明細書に記載されるとおりの多量体カセットと、加えて短縮型
ｇＲＮＡによってガイドされ得るヌクレアーゼ、例えば、上記に記載したとおりのＣａｓ
９ヌクレアーゼ、及び上記に記載したとおり、Ｃｓｙ４ヌクレアーゼを、細胞において発
現させるステップ、又は細胞と接触させるステップを含み得る。
記載されるシステムは、複数の内因性遺伝子の発現の同時修飾、又は単一遺伝子の複数
の部分の標的化に有用且つ万能なツールである。現行の方法でこれを実現するには、標的
化する部位毎に別個のｇＲＮＡコード転写物を使用する必要がある。別個のｇＲＮＡは、
各細胞が各ｇＲＮＡを発現することを保証できないため、細胞集団の多重ゲノム編集には
最適でない；複数の転写物では、細胞は、複雑で均一でないランダムなｇＲＮＡ混合物を
受け取る。しかしながら、本システムは、単一の転写物からの複数のｇＲＮＡの発現を可
能にし、これにより複数のｇＲＮＡの発現によってゲノムにおける複数の部位を標的化す
ることが可能になる。さらに、単一転写物システムでは、各細胞が全てのｇＲＮＡを同様
の化学量論で発現するはずである。従ってこのシステムを、多数の遺伝子の発現の同時改
変又は単一遺伝子、プロモーター、若しくはエンハンサーへの複数のＣａｓ９若しくはＨ
ＦＤの動員に容易に使用し得る。この能力は、例えば基礎生物学研究に（遺伝子機能を調
べ、単一経路内の複数の遺伝子の発現を操作するために用いることができる）、及び合成
生物学において（研究者は細胞内に複数の入力シグナルに応答する回路を作成することが
可能になる）、幅広い有用性を有するであろう。この技術を実施すること及び多重化に適
合させることは比較的容易であるため、これは多くの多岐にわたる適用性を有する幅広く
有用な技術となる。
本明細書に記載される方法は、１つ以上の遺伝子に向けられた本明細書に記載される多
量体ｇＲＮＡカセットをコードする核酸、及びＣｓｙ４及びＣａｓ９をコードする核酸と
細胞を接触させて、それにより１つ以上の遺伝子の発現を調節するステップを含む。
以下の例に本発明がさらに説明され、これらの例は、特許請求の範囲に記載される本発
明の範囲を限定するものではない。
実施例１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による多重編集
以下のとおりの、単一転写物から発現するｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡのいずれかのアレ
イからＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって多重編集を行う目的で３つの戦略を試みた：
１．別個のｔｒａｃｒＲＮＡを伴う、ダイレクトリピート隣接ｃｒＲＮＡアレイ及びＣａ
ｓ９
２．Ｃｓｙ４、Ｃａｓ９、及び別個のｔｒａｃｒＲＮＡと共に発現する、Ｃｓｙ４部位に
よって分かれるショートｃｒＲＮＡアレイ
３．Ｃｓｙ４部位によって分かれる完全長単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）
コンストラクトの各セットについて（図１に示される）、Ｕ２ＯＳ－ＥＧＦＰ破壊アッセ
イにおいてＥＧＦＰを効率的に破壊する能力を試験した。結果は図２に示す。戦略１及び
２を用いて設計したコンストラクトは、単一の標的であっても、ＥＧＦＰ破壊アッセイに
おいて最も低い活性を呈した；従ってさらなる実験（以下に記載する）は、戦略３の最適
化に重点を置いた。
実施例２．哺乳類細胞におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びＩＩＩプロモーターからの高
活性ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの多重発現
長鎖転写物からＣｓｙ４ヌクレアーゼを使用してｇＲＮＡを切り出す例示的戦略の概略
図を図３に示す。概念実証を行う初期実験では、ヒト細胞における切断について、２つの
バージョンのＣｓｙ４切断ＲＮＡヘアピン部位を試験した。これを行うため、２つのＣｓ
ｙ４切断部位のうちの一方が隣接するｇＲＮＡを発現させた：
１．ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（完全２８ｎｔ）（配
列番号２）
２．ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（トランケート型２０ｎｔ）（配列番号
１）
この結果、その５’末端及び３’末端にトランケート型２０ｎｔ配列が隣接したｇＲＮＡ
は、より長い２８ｎｔ配列が隣接するものと比べて哺乳類細胞において活性がより高いこ
とが示された（図４）。本発明者らの知る限りでは、これは、ヒト生細胞においてＣｓｙ
４ヌクレアーゼを使用してＲＮＡ転写物をプロセシングし得ることを初めて実証するもの
である。２０ｎｔトランケート部位の一つの重要なさらなる利点は、より長い２８ｎｔ配
列と異なり、長鎖転写物からプロセシングされたｇＲＮＡの５’末端に追加のヌクレオチ
ドが残らないことである（図４）。これにより、最も５’側の位置にいかなる所望のヌク
レオチドを有するｇＲＮＡの発現も可能になる。これは、最も５’側の位置に特定の１つ
又は複数のヌクレオチドを必要とするＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのｇＲ
ＮＡの発現と比べて改善である。
このＣｓｙ４ベースのシステムを使用して、２つ及び３つの異なるｇＲＮＡの効率的な
発現（図５及び図６）が実証された。この手法を用いて同時に発現させたｇＲＮＡは、ヒ
ト細胞において予想された部位に改変を誘導した。
これらの結果はまた、このＣｓｙ４ベースの戦略を、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモータ
ーによって産生される長鎖ｍＲＮＡにコードされるｇＲＮＡで用い得ることも実証した（
図７）。これらの実験では、トランケート型Ｃｓｙ４部位が隣接する３つの異なる単一ｇ
ＲＮＡの１つが、ＣＡＧプロモーターによって産生されるｍＲＮＡ（ＲＮＡ Ｐｏｌ Ｉ
Ｉプロモーター）にコードされた。図７に示すとおり、これらのコンストラクトの３つ全
てが、ヒト細胞においてＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導し得る機能性ｇＲＮＡを産生するこ
とができたが、但しＣｓｙ４の存在下に限られた。観察された標的化Ｃａｓ９活性のレベ
ルは、これらのｇＲＮＡが標準的なＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを単独で使用し
て又はＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからのＣｓｙ４が隣接する転写物として発現
するときに観察されるレベルと（やや低かったものの）同等であった（図７）。
要約すれば、これらの結果から以下のことが実証された：１）Ｃｓｙ４切断部位によっ
て分けたとき、且つＣｓｙ４の存在下では、ヒト細胞において単一のＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ
ＩＩ転写物から最大３つの機能性ｇＲＮＡを産生させることができる、２）複数のＣｓｙ
４によってプロセシングされたｇＲＮＡを使用してＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導し、単一
のヒト細胞に多重変化を導入することができる、及び３）Ｃｓｙ４切断部位が隣接する機
能性ｇＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから作られる長鎖ｍＲＮＡ転写物
からＣｓｙ４ヌクレアーゼによって切断することができる。
他の実施形態
本発明はその詳細な説明と併せて説明されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するのでなく、例示するよう意図されることが理解されるべきである。他の態様、利点、及び変形例が以下の特許請求の範囲内にある。

本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする複数の配列
を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であって、各ｇＲＮＡには、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）又はＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（配列番号２）を含むか又はそれからなる少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣接する、ＤＮＡ分子。
［２］
プロモーター配列に作動可能に連結されている、上記［１］に記載のＤＮＡ分子。
［３］
２つ、３つ、又はそれ以上のｇＲＮＡ配列を含む、上記［１］に記載のＤＮＡ分子。
［４］
前記プロモーター配列がＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーター又はＰｏｌ ＩＩＩプロモーターである、上記［１］に記載のＤＮＡ分子。
［５］
前記プロモーター配列がＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーターである、上記［１］に記載のＤＮＡ分子。
［６］
前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターが、ＣＡＧ、ＥＦ１Ａ、ＣＡＧＧＳ、ＰＧＫ、ＵｂｉＣ、ＣＭＶ、Ｂ２９、デスミン、エンドグリン、ＦＬＴ－１、ＧＦＰＡ、及びＳＹＮ１プロモーターからなる群から選択される、上記［５］に記載のＤＮＡ分子。
［７］
Ｃｓｙ４切断部位に連結したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列を含む１つ、２つ、３つ又はそれ以上のカセットと連結したプロモーター配列を含むＤＮＡ分子。
［８］
Ｃｓｙ４切断部位に連結した第３のガイドＲＮＡをコードする第３の配列に連結した、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列に連結した、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列に作動可能に連結したＰｏｌ ＩＩプロモーターを含む、上記［７］に記載のＤＮＡ分子。
［９］
約１００ｎｔのガイドＲＮＡ配列を含む、上記［７］に記載のＤＮＡ分子。
［１０］
配列番号１又は２のＣｓｙ４切断部位を含む、上記［７］に記載のＤＮＡ分子。
［１１］
機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする配列をさらに含む、上記［１］又は［７］に記載のＤＮＡ分子。
［１２］
前記ｇＲＮＡが配列：
Figure 0007005580000007
（式中、Ｘ １７－２０ は、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直ちに５’側の標的配列の１７～２０個の連続ヌクレオチドの相補鎖に相補的な配列であり、及びＸ Ｎ は、リボ核酸とＣａｓ９との結合を妨げない任意の配列である）を含む、上記［１］又は［７］に記載のＤＮＡ分子。
［１３］
前記分子の３’末端に１つ以上のＵを含む、上記［１］又は［７］に記載のＤＮＡ分子。
［１４］
上記［１］～［１３］のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子。
［１５］
上記［１］～［１３］のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
［１６］
機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする配列をさらに含む、上記［１５］に記載のベクター。
［１７］
細胞において複数のガイドＲＮＡを産生させる方法であって、前記細胞において上記［１］～［１３］のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を発現させるステップ、又は上記［１４］に記載のＲＮＡ分子と前記細胞を接触させるステップを含む方法。
［１８］
前記細胞が哺乳類細胞であり、及び前記細胞がまた外因性機能性Ｃｓｙ４酵素配列も発現し、又は前記方法が、機能性Ｃｓｙ４酵素又は機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする核酸を投与するステップをさらに含む、上記［１７］に記載の方法。
［１９］
細胞における複数の標的遺伝子の発現を改変する方法であって、前記方法が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする複数の配列を含むＤＮＡ分子を発現させるステップを含み、各ｇＲＮＡが、標的遺伝子の少なくとも１７～２０ｎｔに相補的な配列を含み、及び各ｇＲＮＡには、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）又はＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（配列番号２）を含むか又はそれからなる少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣接する、方法。
［２０］
細胞における標的遺伝子の発現を改変する方法であって、前記方法が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする複数の配列を含むＤＮＡ分子を発現させるステップを含み、各ｇＲＮＡが、前記標的遺伝子の少なくとも１７～２０ｎｔに相補的な配列を含み、及び各ｇＲＮＡには、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）又はＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（配列番号２）を含むか又はそれからなる少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣接する、方法。

Claims (19)

  1. １）ｃｒＲＮＡをコードする複数の配列であって、各ｃｒＲＮＡには、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）からなる少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣接する、ｃｒＲＮＡをコードする複数の配列；および
    ２）単一ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列
    を含む、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であって、
    ここで、少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列は、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）からなり、かつ、ｃｒＲＮＡをコードする複数の配列と単一ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列との間に位置する、ＤＮＡ分子。
  2. プロモーター配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
  3. ２つ、３つ、又はそれ以上のｃｒＲＮＡをコードする配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
  4. 前記プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーター又はＰｏｌ ＩＩＩプロモーターである、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
  5. 前記プロモーター配列がＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーターである、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
  6. 前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターが、ＣＡＧ、ＥＦ１Ａ、ＣＡＧＧＳ、ＰＧＫ、ＵｂｉＣ、ＣＭＶ、Ｂ２９、デスミン、エンドグリン、ＦＬＴ－１、ＧＦＰＡ、及びＳＹＮ１プロモーターからなる群から選択される、請求項５に記載のＤＮＡ分子。
  7. １つ、２つ、３つ又はそれ以上のカセットと連結したプロモーター配列を含むＤＮＡ分子であって、
    配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）からなるＣｓｙ４切断部位に連結したｃｒＲＮＡをコードする配列と、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列とを含み、
    ここで、少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列は、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）からなり、かつ、ｃｒＲＮＡをコードする配列とｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列との間に位置する、ＤＮＡ分子。
  8. Ｃｓｙ４切断部位に連結した第３のｃｒＲＮＡをコードする第３の配列に連結した、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第２のｃｒＲＮＡをコードする第２の配列に連結した、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第１のｃｒＲＮＡをコードする第１の配列に作動可能に連結したＰｏｌ ＩＩプロモーターを含む、請求項７に記載のＤＮＡ分子。
  9. 約１００ｎｔのｃｒＲＮＡをコードする配列を含む、請求項７に記載のＤＮＡ分子。
  10. 機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする配列をさらに含む、請求項１又は７に記載のＤＮＡ分子。
  11. 前記ｃｒＲＮＡをコードする配列は、配列：
    （Ｘ １７－２０ ）ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡ （配列番号１５）
    を含み、
    前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列は、配列：
    ＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣ （配列番号１６）
    （式中、Ｘ １７－２０ は、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直ちに５’側の標的配列の１７～２０個の連続ヌクレオチドの相補鎖に相補的な配列である）を含む、請求項１又は７に記載のＤＮＡ分子。
  12. 請求項１又は７に記載のＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子が、該ＲＮＡ分子の３’末端に１つ以上のＵを含む、ＤＮＡ分子。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子。
  14. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
  15. 機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする配列をさらに含む、請求項１４に記載のベクター。
  16. 細胞において複数のｃｒＲＮＡを産生させる方法であって、
    請求項１３に記載のＲＮＡ分子と前記細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップを含む、方法。
  17. 前記細胞が哺乳類細胞であり、前記細胞がまた外因性機能性Ｃｓｙ４酵素配列も発現する、請求項１６に記載の方法。
  18. 細胞における複数の標的遺伝子の発現を改変する方法であって、
    前記方法は、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子又は請求項１３に記載のＲＮＡ分子と前記細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップを含み、
    各ｃｒＲＮＡが、標的遺伝子の少なくとも１７～２０ｎｔに相補的である配列を含む、方法。
  19. 細胞における標的遺伝子の発現を改変する方法であって、
    前記方法は、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子又は請求項１３に記載のＲＮＡ分子と前記細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップを含み、
    各ｃｒＲＮＡが、前記標的遺伝子の少なくとも１７～２０ｎｔに相補的である配列を含む、方法。
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