JP2017509350A - ガイドｒｎａの生成のための方法および組成物 - Google Patents

ガイドｒｎａの生成のための方法および組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2017509350A
JP2017509350A JP2016560684A JP2016560684A JP2017509350A JP 2017509350 A JP2017509350 A JP 2017509350A JP 2016560684 A JP2016560684 A JP 2016560684A JP 2016560684 A JP2016560684 A JP 2016560684A JP 2017509350 A JP2017509350 A JP 2017509350A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleotide sequence
engineered construct
engineered
grna
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2016560684A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2017509350A5 (ja
Inventor
ルー，ティモシー，クアン−タ
ニッシム，リオル
ペルリ，サミュエル，デービッド
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Massachusetts Institute of Technology filed Critical Massachusetts Institute of Technology
Publication of JP2017509350A publication Critical patent/JP2017509350A/ja
Publication of JP2017509350A5 publication Critical patent/JP2017509350A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/128—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes processing or releasing ribozyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本開示の多様な側面および態様は、ヒト細胞において、RNA三重らせん構造、イントロン、マイクロRNAおよびリボザイムを含む哺乳動物の複数のRNA調節戦略を、Casに基づくCRISPR転写因子およびリボヌクレアーゼに基づくRNAプロセッシングと組み合わせる方法および組成物に関する。本開示の方法および組成物は、いくつかの態様において、合成コンストラクトおよび内在型ヒトプロモーターの効率的な調節のための、単一のコンパクトなRNAポリメラーゼＩＩにより発現される転写物からの、タンパク質および複数のガイドRNAのマルチプレックスな産生を可能にする。

Description

関連出願
本願は、2014年4月3日に出願された米国仮出願番号61/974,672の35 U.S.C.§119(e)下における利益を主張し、該仮出願は、その全体において本明細書において参考として援用される。
連邦政府により資金援助された研究
本発明は、Army Research Officeにより授与された契約番号W911NF-11-2-0056下における政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の分野
本開示の側面は、バイオテクノロジーに関する。特に、いくつかの態様は、転写の制御および合成生物学の分野に向けられている。
発明の背景
近年、細菌のＩＩ型CRISPR/Casシステム（clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats（CRISPR）（クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート）/CRISPR associate system (Cas)（CRISPR関連システム））が、複雑なタンパク質操作を必要とすることなくプログラム可能なDNA結合を達成するために適応されてきた。Casタンパク質は、DNAを切断することに特化したヌクレアーゼである。ＩＩ型CRISPR/Casシステムにおいて、Cas DNA結合タンパク質の配列特異性は、標的DNA部位に対してヌクレオチド塩基対相補性を有するガイドRNA（gRNA）により決定される。このことが、シンプルかつ高度に柔軟なCas結合のプログラミングを可能にする。
発明の要旨
哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）においてCRISPRに基づく回路、特に内在プロモーターを妨害するものを構築することにおける主要な問題は、所望される活性化レベルを達成するために、複数のgRNAがしばしば必要であることである。現在の技術は、各々がそれら自体のプロモーターを有する複数のgRNA発現コンストラクトの使用に頼っている。本明細書において記載される操作されたコンストラクトは、いくつかの態様において、単一の転写物から多くの機能的gRNAを発現させるために用いることができ、それにより、複数のアウトプットを有する合成遺伝子回路のコンパクトなコード化、ならびにネイティブな遺伝子を調節するため、およびネイティブなネットワークを再配線するための簡潔な戦略を可能にする。したがって、本明細書において提供されるのは、いくつかの態様において、RNA干渉およびCRISPR/Casシステムなどのリボ核酸（RNA）に基づく制御機構を組み込むことにより、スケーラブルな合成遺伝子回路の生成ならびに／または内在遺伝子および遺伝子ネットワークの改変を可能にする、方法および組成物（例えば核酸および細胞）である。例えば、本明細書における多様な態様は、RNA三重らせん構造、イントロン、マイクロRNAおよびリボザイムを含む複数の哺乳動物RNA調節戦略を、ヒト細胞において、細菌のCasに基づくCRISPR 転写因子（CRISPR-TF）およびリボヌクレアーゼに基づく（例えばCas6/Csy4に基づく）RNAプロセッシングと組み合わせて、遺伝子発現を改変する。驚くべきことに、本開示の補完的方法は、RNAポリメラーゼＩＩ（RNA pol IIまたはRNAP II）プロモーターにより生成される転写物からの機能的gRNAの発現を可能にしつつ、目的のタンパク質の共発現を許容する。さらに、本明細書において提供される遺伝子コンストラクトは、合成コンストラクトおよび内在型ヒトプロモーターの効率的な調節のために、いくつかの態様においては単一の転写物からの、複数のgRNAによるタンパク質および／またはRNA干渉分子（例えばマイクロRNA）のマルチプレックスな発現を可能にする。
本明細書において提供される操作されたコンストラクトは、例えば、マルチステージ転写カスケードを含む調整可能な合成遺伝子回路を実現するために、有用である。さらに、本開示の方法および組成物は、いくつかの態様において、複雑な機能的挙動を達成するために、複数のアウトプットおよびフィードバックループを有するRNA依存的遺伝子回路における調節関係を再配線するために用いることができる。本明細書において提供される操作されたコンストラクトは、基礎生物学、治療的および合成生物学的適用のための、例えばヒト細胞における、スケーラブルな遺伝子回路の構築および天然の制御ネットワークの改変（例えば妨害）のために有用である。
本開示の多様な側面は、（ａ）少なくとも１のガイドRNA（gRNA）をコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）（ｉ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列および（ｉｉ）RNA干渉分子をコードするヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクトを提供する。いくつかの態様において、プロモーターは、RNAポリメラーゼＩＩ依存的（RNA pol II）プロモーターである。
いくつかの態様において、少なくとも１のgRNAは、リボヌクレアーゼ認識部位をコードするヌクレオチド配列に隣接する。リボヌクレアーゼ認識部位は、例えば、Csy4リボヌクレアーゼ認識部位であってよい。
いくつかの態様において、少なくとも１のgRNAは、リボザイムをコードするヌクレオチド配列に隣接する。リボザイムは、例えば、ハンマーヘッド型リボザイムおよびデルタ型肝炎ウイルスリボザイムから選択することができる。
いくつかの態様において、（ａ）のヌクレオチド配列は、コグネート（cognate）イントロンスプライス部位に隣接する。
本開示のいくつかの側面は、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する少なくとも１のガイドRNA（gRNA）をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクトを提供する。いくつかの態様において、プロモーターは、RNAポリメラーゼＩＩ依存的（RNA pol II）プロモーターである。RNA pol IIプロモーターは、例えば、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトユビキチンプロモーター、ヒトヒストンH2A1プロモーター、またはヒト炎症性ケモカインCXCL1プロモーターであってよい。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列は、コグネートイントロンスプライス部位に隣接する。
いくつかの態様において、核酸はさらに、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列内にあっても、または第２のヌクレオチド配列が第１のヌクレオチド配列の上流にあってもよい。
いくつかの態様において、操作されたコンストラクトはさらに、少なくとも１のマイクロRNAをコードするヌクレオチド配列を含む。マイクロRNAは、例えば、目的のタンパク質内にコードされていてもよい。
いくつかの態様において、核酸はさらに、三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、ここで、第３のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列と第１のヌクレオチド配列との間にある。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、またはそれより多くのgRNAをコードし、各々のgRNAは、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列は、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接している少なくとも２のgRNAをコードし、該gRNAは互いに異なる。
いくつかの態様において、リボヌクレアーゼ認識部位は、Csy4リボヌクレアーゼ認識部位である。Csy4リボヌクレアーゼ認識部位の各々は、例えば、２８ヌクレオチドの長さであってよい。いくつかの態様において、Csy4リボヌクレアーゼ認識部位は、Pseudomonas aeruginosaからのものである。
いくつかの態様において、三重らせん構造は、MALAT1遺伝子座の３’末端またはMENβ遺伝子座の３’末端からのヌクレオチド配列によりコードされる。
本開示のいくつかの側面は、目的のタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列およびリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する少なくとも１のガイドRNA（gRNA）をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクトを提供し、ここで、第２のヌクレオチド配列は、コグネートイントロンスプライス部位をコードするヌクレオチド配列に隣接し、第１のヌクレオチド配列内にある。いくつかの態様において、プロモーターは、RNAポリメラーゼＩＩ依存的（RNA pol II）プロモーターである。RNA pol IIプロモーターは、例えば、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトユビキチンプロモーター、ヒトヒストンH2A1プロモーター、またはヒト炎症性ケモカインCXCL1プロモーターであってよい。
いくつかの態様において、操作されたコンストラクトはさらに、少なくとも１のマイクロRNAをコードするヌクレオチド配列を含む。マイクロRNAは、例えば、目的のタンパク質内にコードされていてもよい。
いくつかの態様において、核酸はさらに、三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列、およびリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する少なくとも１のgRNAをコードする第４のヌクレオチド配列を含み、ここで、第３のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列の下流にあり、かつ第４のヌクレオチド配列の上流にある。
いくつかの態様において、第２のヌクレオチド配列は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、またはそれより多くのgRNAをコードし、各々のgRNAは、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する。
いくつかの態様において、第２のヌクレオチド配列は、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接している少なくとも２のgRNAをコードし、該gRNAは互いに異なる。
いくつかの態様において、リボヌクレアーゼ認識部位は、Csy4リボヌクレアーゼ認識部位である。Csy4リボヌクレアーゼ認識部位は、例えば、２８ヌクレオチドの長さであってよい。いくつかの態様において、Csy4リボヌクレアーゼ認識部位は、Pseudomonas aeruginosaからのものである。
いくつかの態様において、コグネートイントロンスプライス部位は、コンセンサスイントロンからのものである。いくつかの態様において、コグネートイントロンスプライス部位は、HSV1潜伏期関連イントロンからのものである。いくつかの態様において、コグネートイントロンスプライス部位は、sno-IncRNA2イントロンからのものである。
いくつかの態様において、三重らせん構造は、MALAT1遺伝子座の３’末端またはMENβ遺伝子座の３’末端からのヌクレオチド配列によりコードされる。
いくつかの態様において、第４のヌクレオチド配列は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、またはそれより多くのgRNAをコードし、各々のgRNAは、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する。
いくつかの態様において、第４のヌクレオチド配列は、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接している少なくとも２のgRNAをコードし、該gRNAは互いに異なる。
本開示のいくつかの側面は、リボザイムに隣接する少なくとも１のガイドRNA（gRNA）をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクトを提供する。いくつかの態様において、プロモーターは、RNAポリメラーゼＩＩ依存的（RNA pol II）プロモーターである。RNA pol IIプロモーターは、例えば、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトユビキチンプロモーター、ヒトヒストンH2A1プロモーター、またはヒト炎症性ケモカインCXCL1プロモーターであってよい。
いくつかの態様において、核酸はさらに、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含み、ここで、第２のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列の上流にある。
いくつかの態様において、操作されたコンストラクトはさらに、少なくとも１のマイクロRNAをコードするヌクレオチド配列を含む。マイクロRNAは、例えば、目的のタンパク質内にコードされていてもよい。
いくつかの態様において、核酸はさらに、三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、ここで、第３のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列と第１のヌクレオチド配列との間にある。
いくつかの態様において、第４のヌクレオチド配列は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、またはそれより多くのgRNAをコードし、各々のgRNAは、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列は、リボザイムに隣接する少なくとも２のgRNAをコードし、該gRNAは互いに異なる。
いくつかの態様において、リボザイムは、シス作用性リボザイムである。例えば、シス作用性リボザイムは、ハンマーヘッド型リボザイムまたはデルタ型肝炎ウイルスリボザイムであってよい。いくつかの態様において、ハンマーヘッド型リボザイムは、少なくとも１のgRNAの５’末端にある。いくつかの態様において、ハンマーヘッド型リボザイムは、少なくとも１のgRNAの３’末端にある。いくつかの態様において、デルタ型肝炎ウイルスリボザイムは、少なくとも１のgRNAの５’末端にある。いくつかの態様において、デルタ型肝炎ウイルスリボザイムは、少なくとも１のgRNAの３’末端にある。
いくつかの態様において、三重らせん構造は、MALAT1遺伝子座の３’末端またはMENβ遺伝子座の３’末端からのヌクレオチド配列によりコードされる。
本開示のいくつかの側面は、目的のタンパク質中の少なくとも１のRNA干渉分子をコードする第１のヌクレオチド配列、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する少なくとも１のガイドRNAをコードする第２のヌクレオチド配列、および三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクトを提供し、ここで、第３のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間にある。
本開示のいくつかの側面は、目的のタンパク質中の少なくとも１のRNA干渉分子をコードする第１のヌクレオチド配列、リボザイムに隣接する少なくとも１のガイドRNAをコードする第２のヌクレオチド配列、および三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクトを提供し、ここで、第３のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間にある。
いくつかの態様において、RNA干渉分子は、マイクロRNA（miRNA）および低分子干渉RNA（siRNA）から選択される。いくつかの態様において、少なくとも１のRNA干渉分子は、少なくとも１のmiRNAを含む。
いくつかの側面は、本開示の操作されたコンストラクトを１または２以上含むベクターを提供する。
いくつかの側面は、本開示の操作されたコンストラクトおよび／または本開示のベクターを含む細胞を提供する。
本明細書においてまた提供されるのは、本開示の操作されたコンストラクトのうちの少なくとも２つおよび／または本開示のベクターのうちの少なくとも２つを含む細胞である。
いくつかの態様において、細胞は、リボヌクレアーゼを安定して発現するように改変される。リボヌクレアーゼは、例えばCsy4リボヌクレアーゼであってよい。
いくつかの態様において、細胞は、Casタンパク質を安定して発現するように改変される。いくつかの態様において、Casタンパク質は、例えばCas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼである。いくつかの態様において、Casタンパク質は、転写的に活性なCasタンパク質である。いくつかの態様において、転写的に活性なCasタンパク質は、転写的に活性なCas9タンパク質である。
いくつかの態様において、細胞は、リボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、操作された核酸をさらに含む。リボヌクレアーゼは、例えばCsy4リボヌクレアーゼであってよい。
いくつかの態様において、細胞は、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、操作された核酸をさらに含む。いくつかの態様において、Casタンパク質は、例えばCas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼである。いくつかの態様において、Casタンパク質は、転写的に活性なCasタンパク質である。いくつかの態様において、転写的に活性なCasタンパク質は、転写的に活性なCas9タンパク質である。
いくつかの態様において、細胞は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、少なくとも１の（または少なくとも２の）さらなる操作された核酸を、さらに含む。いくつかの態様において、さらなる操作された核酸の目的のタンパク質は、該細胞の任意の他の目的のタンパク質とは異なる。
いくつかの態様において、細胞は細菌細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。
本明細書においてまた提供されるのは、本開示の細胞のうちの任意のものを培養することを含む方法である。いくつかの態様において、方法は、核酸の発現を許容する条件下において細胞を培養することを含む。
本開示のいくつかの側面は、細胞の遺伝子回路を生成、改変または再配線する方法を提供し、該方法は、細胞において本明細書において提供される操作されたコンストラクトのうちの任意のものから選択される第１の操作されたコンストラクトを発現させること、および細胞において本明細書において提供される操作されたコンストラクトのうちの任意のものから選択される第２の操作されたコンストラクトを発現させることを含み、ここで、第１の操作されたコンストラクトのうちの少なくとも１のgRNAは、第２の操作されたコンストラクトのプロモーターの領域または内在プロモーターの領域に対して相補的であり、これに結合する。
いくつかの態様において、方法は、本明細書において提供される操作されたコンストラクトのうちの任意のものから選択される第３の操作されたコンストラクトを発現させることをさらに含み、ここで、第２の操作されたコンストラクトのうちの少なくとも１のgRNAは、第３の操作されたコンストラクトのプロモーターの領域または内在プロモーターの領域に対して相補的であり、これに結合する。
いくつかの態様において、方法は、本明細書において提供される操作されたコンストラクトのうちの任意のものから選択される少なくとも１のさらなる操作された核酸を発現させることをさらに含み、ここで、少なくとも１のさらなる操作された核酸のうちの少なくとも１のgRNAは、細胞の操作された核酸のうちのいずれか１つのプロモーターの領域または少なくとも１の内在プロモーターの領域に対して相補的であり、これに結合する。
いくつかの態様において、細胞は、リボヌクレアーゼを安定して発現するように改変される。リボヌクレアーゼは、例えばCsy4リボヌクレアーゼであってよい。
いくつかの態様において、細胞は、Casタンパク質を安定して発現するように改変される。いくつかの態様において、Casタンパク質は、例えばCas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼである。いくつかの態様において、Casタンパク質は、転写的に活性なCasタンパク質である。いくつかの態様において、転写的に活性なCasタンパク質は、転写的に活性なCas9タンパク質である。
いくつかの態様において、細胞は、リボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、操作された核酸をさらに含む。リボヌクレアーゼは、例えばCsy4リボヌクレアーゼであってよい。
いくつかの態様において、細胞は、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、操作された核酸をさらに含む。いくつかの態様において、Casタンパク質は、例えばCas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼである。いくつかの態様において、Casタンパク質は、転写的に活性なCasタンパク質である。いくつかの態様において、転写的に活性なCasタンパク質は、転写的に活性なCas9タンパク質である。
いくつかの態様において、方法は、細胞を培養することをさらに含む。
本開示のいくつかの側面は、ガイドリボ核酸（gRNA）のマルチプレックスな細胞発現の方法を提供し、該方法は、細胞において、少なくとも２のgRNAをコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクトを発現させることを含み、各々のgRNAは、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する。
いくつかの態様において、核酸はさらに、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含み、ここで、第２のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列の上流にある。
いくつかの態様において、操作されたコンストラクトはさらに、少なくとも１のマイクロRNAをコードするヌクレオチド配列を含む。マイクロRNAは、例えば、目的のタンパク質内にコードされていてもよい。
いくつかの態様において、核酸はさらに、三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、ここで、第３のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列と第１のヌクレオチド配列との間にある。
いくつかの態様において、細胞は、リボヌクレアーゼを安定して発現するように改変される。リボヌクレアーゼは、例えばCsy4リボヌクレアーゼであってよい。
いくつかの態様において、細胞は、Casタンパク質を安定して発現するように改変される。いくつかの態様において、Casタンパク質は、例えばCas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼである。いくつかの態様において、Casタンパク質は、転写的に活性なCasタンパク質である。いくつかの態様において、転写的に活性なCasタンパク質は、転写的に活性なCas9タンパク質である。
いくつかの態様において、細胞は、リボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、操作された核酸をさらに含む。リボヌクレアーゼは、例えばCsy4リボヌクレアーゼであってよい。
いくつかの態様において、細胞は、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、操作された核酸をさらに含む。いくつかの態様において、Casタンパク質は、例えばCas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼである。いくつかの態様において、Casタンパク質は、転写的に活性なCasタンパク質である。いくつかの態様において、転写的に活性なCasタンパク質は、転写的に活性なCas9タンパク質である。
いくつかの態様において、方法は、細胞を培養することをさらに含む。
図１Ａは、操作されたコンストラクト、CMVp-mK-Tr-28-g1-28を示し、これは、mKate2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したCMVプロモーター（CMVp）を含む。該核酸は、三重らせん構造（三重鎖）をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、該ヌクレオチド配列は、Csy4認識部位（28bp）に隣接するガイドRNA（gRNA1）をコードするヌクレオチド配列の上流にある。この操作されたコンストラクトの立体配置は、「三重鎖／Csy4」立体配置として言及される場合がある。図１Ａ中の模式図は、転写的に活性な形態のCas9タンパク質（taCas9）、Csy4リボヌクレアーゼ、CMVp-mK-Tr-28-g1-28、およびP1-EYFPを共発現する細胞において、mKate2タンパク質およびガイドRNAの両方が発現されることを示す。転写的に活性なCas9タンパク質に関連するガイドRNA（gRNA）は、高感度黄色蛍光タンパク質（P1-EYFP）の発現を駆動する合成プロモーター（Ｐ１）を活性化する。
図１Ｂは、CMVp-mK-Tr-28-g1-28、Cas9およびCsy4を共発現する細胞からのCsy4のレベルを相対的なEYFPおよびmKate2の発現レベルと比較するグラフを示す。６０倍のEYFP発現レベルの増大が存在し、このことは、機能的gRNAの生成を実証する。Csy4発現プラスミドの濃度の増大は、mKate2発現レベルの増大をもたらす。「三重鎖／Csy4」と以下に議論される「イントロン／Csy4」立体配置との間の交差比較が可能となるように、蛍光値を、この図中のデータと図２Ｂ〜２Ｄ中のデータとの間で、それぞれの最大の蛍光に対して正規化した。
図１Ｃは、CMVp-mK-Tr-28-g1-28、Csy4およびCas9を共発現する細胞におけるmKate2発現レベルに対するCsy4およびCas9の発現の効果を比較するグラフを示す。Csy4およびtaCas9は、mKate2蛍光に対して反対の効果を有する。taCas9コンストラクト単独では、mKate2レベルを低下させたが、一方、Csy4コンストラクト単独では、mKate2蛍光を増強した。mKate2発現レベルは、試験した４つの条件全体で、観察された最大mKate2発現値（Csy4のみ）に対して正規化した。
図１Ｄは、相対的なIL1RNのmRNA発現レベルに対する異なるRNAP IIプロモーターの効果を比較するグラフを示す。ヒトRNAP IIプロモーター、CXCL1p、H2A1pおよびUbCp、ならびにRNAP IIプロモーター、CMVpを用いて、「三重鎖／Csy4」コンストラクトからIL1RNプロモーターを活性化させる４つの異なるgRNA（gRNA3〜6、表１）の発現を駆動させた。結果を、同じgRNAの直接発現に対するRNAP IIIプロモーター、U6pの効果と比較した。各々が示されるプロモーターのうちの１つおよびgRNA 3〜6を含む４つの異なるプラスミドを、Csy4を発現するプラスミドと共に、またはこれを用いずに、taCas9をコードするプラスミドと共に細胞においてコトランスフェクトした。非特異的gRNAを含む対照コンストラクト（NS、CMVp-mK-Tr-28-g1-28）と比較した、相対的なIL1RNのmRNA発現を、qRT-PCRを用いてモニタリングした。RNAP IIプロモーターは、広範なIL1RNの活性化をもたらし、Csy4の存在下において、Csy4の不在下と比較して、活性化は著しく増大した。IL1RNの活性化は、Csy4の不在下においてもRNAP IIプロモーターにより達成されたが、Csy4の存在下よりもはるかに低いレベルであった。
図１Ｅは、mKate2発現レベル（インプットの代理として）を、相対的なIL1RNのmRNA発現レベル（アウトプットとして）に対してプロットすることにより決定した、「三重鎖／Csy4」コンストラクトによる内在IL1RN遺伝子座の活性化についてのインプット−アウトプット移行曲線を比較するグラフを示す。データは、様々な強度のRNAP IIプロモーターにより、内在遺伝子座の調整可能な調節を達成することができることを示した。IL1RN データは、図１Ｄにおいて示されるものと同じである）。
図２Ａは、操作されたコンストラクト、CMVp-mKEX1-[28-g1-28]intron-mKEX2を示し、これは、Csy4認識部位（28bp）に隣接するガイドRNA（gRNA1）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したCMVプロモーター（CMVp）を含む。Csy4認識部位は、コグネートイントロンスプライス部位に隣接し、これらは、mKate2タンパク質をコードするヌクレオチド配列中にある。この操作されたコンストラクトの立体配置は、「イントロン／Csy4」立体配置として言及される場合がある。図２Ａ中の模式図は、転写的に活性な形態のCas9タンパク質、Csy4リボヌクレアーゼ、CMVp-mKEX1-[28-g1-28]intron-mKEX2、およびP1-EYFPを共発現する細胞において、ガイドRNAが発現されること、これが次いで転写的に活性なCas9タンパク質と関連して、高感度黄色蛍光タンパク質（P1-EYFP）の発現を駆動する合成プロモーター（P1）を活性化することを示す。図１Ａにおいて示されるCsy4レベルを増大させる「三重鎖／Csy4」立体配置とは対照的に、「イントロン／Csy4」立体配置はmKate2遺伝子の発現の減少をもたらし、これは、理論により拘束されることはないが、スプライシングの前のmRNA前駆体の切断に起因し得る。
図２Ｂは、CMVp-mKEX1-[28-g1-28]intron-mKEX2、Cas9およびCsy4を共発現する細胞からのCsy4のレベルを、相対的なEYFPおよびmKate2の発現レベルと比較するグラフを示し、ここで、コグネートイントロンスプライス部位は、コンセンサスイントロンからのものである。 図２Ｃは、CMVp-mKEX1-[28-g1-28]intron-mKEX2、Cas9およびCsy4を共発現する細胞からのCsy4のレベルを、相対的なEYFPおよびmKate2の発現レベルと比較するグラフを示し、ここで、コグネートイントロンスプライス部位は、snoRNA2イントロンからのものである。 図２Ｄは、CMVp-mKEX1-[28-g1-28]intron-mKEX2、Cas9およびCsy4を共発現する細胞からのCsy4のレベルを、相対的なEYFPおよびmKate2の発現レベルと比較するグラフを示し、ここで、コグネートイントロンスプライス部位は、HSV1イントロンからのものである。
図２Ｅは、CMVp-mKEX1-[28-g1-28]intron-mKEX2、Cas9およびCsy4を共発現する細胞からのCsy4のレベルを、相対的なEYFPおよびmKate2の発現レベルと比較するグラフを示し、ここで、単一のCsy4結合部位が、gRNAの上流でHSV1イントロン中に位置する。この立体配置は、機能的gRNAを生成しなかったが、mKate2蛍光の低下とより高いCsy4レベルをもたらした。蛍光値は、本実験と[28-g1-28]HSV1対照（図１１）との間の最大蛍光レベルに対して正規化した。
図２Ｆは、CMVp-mKEX1-[28-g1-28]intron-mKEX2、Cas9およびCsy4を共発現する細胞からのCsy4のレベルを、相対的なEYFPおよびmKate2の発現レベルと比較するグラフを示し、ここで、単一のCsy4結合部位は、gRNAの下流でHSV1イントロン内に位置する。この立体配置は、低レベルの機能的gRNAを生成し、また、mKate2レベルの低下と、より高いCsy4発現プラスミド濃度とをもたらした。蛍光値は、本実験と[28-g1-28]HSV1対照（図１１）との間の最大蛍光レベルに対して正規化した。
図３Ａは、操作されたコンストラクト、CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDVを示し、これは、mKate2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したCMVプロモーター（CMVp）を含む。該核酸は、三重らせん構造（三重鎖）をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、これは、リボザイム（５’ハンマーヘッド型（ＨＨ）リボザイム、および３’HDVリボザイム）に隣接するガイドRNA（gRNA1）をコードするヌクレオチド配列の上流にある。この操作されたコンストラクトの立体配置は、「三重鎖／リボザイム」立体配置として言及される場合がある。図３Ａ中の模式図は、転写的に活性な形態のCas9タンパク質、Csy4リボヌクレアーゼ、およびCMVp-mK-Tr-HH-g1-HDVを共発現する細胞において、mKate2タンパク質およびガイドRNAの両方が発現されることを示す。
図３Ｂは、操作されたコンストラクト、CMVp-mK-HH-g1-HDVを示し、これは、mKate2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したCMVプロモーター（CMVp）を含む。該核酸は、リボザイム（５’ハンマーヘッド型（ＨＨ）リボザイム、および３’HDVリボザイム）に隣接するガイドRNA（gRNA1）をコードするヌクレオチド配列の上流にある。図３Ｂ中の模式図は、転写的に活性な形態のCas9タンパク質、Csy4リボヌクレアーゼ、およびCMVp-mK-HH-g1-HDVを共発現する細胞において、mKate2タンパク質およびガイドRNAの両方が発現されることを示す。
図３Ｃは、操作されたコンストラクト、CMVp-HH-g1-HDVを示し、これは、リボザイム（５’ハンマーヘッド型（ＨＨ）リボザイム、および３’HDVリボザイム）に隣接するガイドRNA（gRNA1）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したCMVプロモーター（CMVp）を含む。図３Ｃ中の模式図は、転写的に活性な形態のCas9タンパク質、Csy4リボヌクレアーゼ、およびCMVp-HH-g1-HDVを共発現する細胞において、ガイドRNAが発現されることを示す。 図３Ｄは、CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV、CMVp-mK-HH-g1-HDVまたはCMVp-HH-g1-HDVおよびP1-EYFPを共発現する細胞からの相対的なEYFPおよびmKate2の発現レベルを比較するグラフを示す。Csy4を用いた場合またはこれを用いない場合の、「三重鎖／Csy4」コンストラクト（mK-Tr-28-g1-28）を発現する細胞、ならびに、gRNA1（U6p-g1）駆動するRNAP IIIプロモーター、U6pを発現する細胞からの発現レベルを、比較のために示す。
図４Ａは、Csy4認識部位（28bp）に隣接するガイドRNA（gRNA1）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したCMVプロモーター（CMVp）を含む、操作されたコンストラクトを示す。Csy4認識部位は、コグネートイントロンスプライス部位に隣接し、これはmKate2タンパク質をコードするヌクレオチド配列中にあり、これは三重らせん構造（三重鎖）をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、これは、Csy4認識部位（28bp）に隣接するgRNA（gRNA2）をコードするヌクレオチド配列の上流にある（インプットＡ、「イントロン−三重鎖」）。gRNA1特異的P1-EYFPコンストラクトおよびgRNA2特異的P2-ECFPコンストラクトの活性化により、機能的gRNA発現を評価した。
図４Ｂは、mKate2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したCMVプロモーター（CMVp）を含む、操作されたコンストラクトを示す。該核酸は、三重らせん構造（三重鎖）をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、これは、各々がCsy4認識部位に隣接する２つのgRNA（gRNA1およびgRNA2）をコードするヌクレオチド配列の上流にある。gRNAは、介入および隣接するCsy4認識部位と共に、タンデムにコードされる（インプットＢ、「三重鎖−タンデム」）。gRNA1特異的P1-EYFPコンストラクトおよびgRNA2特異的P2-ECFPコンストラクトの活性化により、機能的gRNA発現を評価した。
図４Ｃは、マルチプレックスなgRNA発現コンストラクト（インプットＡおよびインプットＢ）の両方が、Csy4の存在下においてEYFPおよびECFPの発現の効率的な活性化を示し、したがって、単一の転写物からの多重活性gRNAの生成を示したことを実証するグラフを示す。さらに、図１および図２から予測されるように、mKate2レベルは、インプットＡにより、イントロン型立体配置に起因して低下したが、一方で、mKate2レベルは、インプットＢにより、非イントロン型立体配置に起因して増大した。
図５Ａは、mKate2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したCMVプロモーター（CMVp）を含む操作されたコンストラクトを示す。該核酸は、三重らせん構造（三重鎖）をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、これは、各々がCsy4認識部位に隣接する４つの異なるgRNA（gRNA 3〜6）をコードするヌクレオチド配列の上流にある。gRNAは、介入および隣接するCsy4認識部位と共にタンデムにコードされる（mK-Tr-(28-g-28)3-6）。 図５Ｂは、マルチプレックスなmK-Tr-(28-g-28)3-6コンストラクトが、Csy4の存在下において、Csy4の不在下における同じコンストラクトと比較して、IL1RN発現の高レベルの活性化を示したことを実証するグラフを示す。相対的なIL1RNのmRNA発現は、「三重鎖／Csy4」立体配置を介して発現される非特異的gRNA1（NS、CMVp-mK-Tr-28-g1-28）を有する対照コンストラクトと比較して決定した。比較のために、各々が別々の個々のプラスミドから発現される同じgRNA（gRNA3〜6）を含む、非マルチプレックスなプラスミドのセットを示す。
図６Ａは、第１ステージとしてイントロンgRNA1（CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV-mKEX2）を用いることにより実現される、３ステージの転写カスケードを示す。gRNA1は、gRNA2（P1-EYFP-Tr-28-g2-28）を発現するためのP1プロモーターを特異的に標的とし、これは次いで、P2プロモーター（P2-ECFP）からのECFPの発現を活性化した。 図６Ｂは、gRNA1（CMVp-mK-Tr-28-g1-28）を発現させるための、「三重鎖／Csy4」立体配置を用いることにより実現される、３ステージの転写カスケードを示す。gRNA1は、gRNA2（P1-EYFP-Tr-28-g2-28）を発現するための、P1プロモーターを特異的に標的とし、これは次いで、P2（P2-ECFP）からのECFPの発現を活性化した。
図６Ｃは、図６Ａからの完全な３ステージの転写カスケードが、３つすべての蛍光タンパク質の発現を示したことを実証するグラフを示す。カスケードにおける３つのステージの各々の１つを取り除くと、特定のステージおよび依存的な下流のステージの蛍光の喪失がもたらされる。 図６Ｄは、図６Ｂからの完全な３ステージの転写カスケードが、３つすべての蛍光タンパク質の発現を示したことを実証するグラフを示す。カスケードにおける３つのステージの各々の１つを取り除くと、特定のステージおよび依存的な下流のステージの蛍光の喪失がもたらされる。
図７Ａは、「三重鎖／Csy4」立体配置（CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28）からのmKate2およびgRNA1中のイントロンからmiRNAを発現させることにより、miRNAおよびCRISPR-TFに基づく制御の両方をコードする、操作されたコンストラクトを示す。taCas9は存在するがCsy4が不在である場合、この回路は、下流のgRNA1特異的P1-EYFPコンストラクトを活性化せず、Csy4認識部位に隣接する８個の（８×）miRNA結合部位（CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS）を有する下流のECFP転写物を抑制した。taCas9およびCsy4の両方の存在下において、この回路は、gRNA1生成およびその後のEYFPの発現を活性化することにより、ならびにECFP転写物を８×miRNA結合部位から分離して、それによりECFP発現のmiRNA阻害を遮断することにより、再配線された。
図７Ｂは、Csy4発現が、回路相互接続を再配線することにより、図７Ａ中の回路の挙動を変化させ得ることを実証するグラフを示す。 図７Ｃは、Csy4により触媒される再配線を説明する回路モチーフ図を示す。 図７Ｄは、インプット転写物（CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28-miR4xBS）の３’末端における４×miRNA結合部位をコードすることにより、図７Ａにおいて記載される回路のネットワークトポロジー中に組み込まれる、自己調節フィードバックループを示す。このネガティブフィードバックは、Csy4の不在下においてmKate2の発現を抑制した。しかし、Csy4の存在下においては、４×miRNA結合部位はmKate2 mRNAから分離し、それによりmKate2の発現をもたらした。
図７Ｅは、Csy4発現が、回路相互接続を再配線することにより、図７Ｄ中の回路の挙動を変化させ得ることを実証するグラフを示す。図７Ａ中の回路とは対照的に、Csy4の不在下においてmKate2は抑制されたが、Csy4の存在下においては、miRNAに基づく自己調節型ネガティブフィードバックの消失に起因して高度に発現された。 図７Ｆは、Csy4により触媒される再配線を説明する回路モチーフ図を示す。図７Ｂおよび図７ＥにおけるmKate2、EYFP、およびECFPの各々のレベルを、全ての試験されたシナリオの間のそれぞれの最大蛍光レベルに対して正規化した。図７Ａおよび７Ｄ中の２つの回路が、同じ対照による同じ実験において試験されたことから、図７Ｂおよび７Ｅの列３および４中の対照を２つ組にする。
図８Ａは、RNAP II転写物から機能的gRNAを生成するための「三重鎖／csy4」立体配置に対応するフローサイトメトリーデータを示す。 図８Ｂは、RNAP II転写物から機能的gRNAを生成するための「イントロン／Csy4」立体配置を示す。略号：Comp-PE-Tx-Red-YG-A（mKate2）；Comp-FITC-A (EYFP）。Triplex：コンストラクト＃３（CMVp-mK-Tr-28-g1-28、１μｇ）。コンセンサス、snoRNA2、およびHSV1：それぞれ、コンストラクト＃８〜１０（gRNAおよびCsy4認識部位（「28」）に隣接する対応するイントロン配列を有する、CMVp-mKEX1-[28-g1-28]「イントロン型」-mKEX2）。これらのプラスミドを、１μｇでトランスフェクトした。加えて、各試料中のトランスフェクトされたCsy4発現プラスミド（コンストラクト＃２）の量を示す。トランスフェクトされた他のプラスミドは、コンストラクト＃１（taCas9、１μｇ）および＃５（P1-EYFP、１μｇ）を含む。
図９は、CMVp-mK-Tr-28-g1-28立体配置について、Csy4およびtaCas9の多様な組み合わせが、どのようにしてmKate2遺伝子の発現に影響を及ぼすかを分析するための、図１Ｂに対応するフローサイトメトリーデータを示す。略号：Comp-PE-Tx-Red-YG-A (mKate2）。全ての試料は、コンストラクト＃３（CMVp-mK-Tr-28-g1-28、１μｇ）を含んだ。コンストラクト＃１（taCas9、１μｇ）およびコンストラクト＃２（Csy4、１００ｎｇ）は、示されるとおりに適用した。
図１０は、gRNA3によるP1プロモーターの最少非特異的活性化（上の２つのパネル）、およびCsy4結合部位を有さないイントロンgRNA1によるプロモーターP1からの最少EYFP活性化（下のパネル）を実証するための多様な対照を提供する、フローサイトメトリーデータを示す。略号：Comp-PE-Tx-Red-YG-A（mKate2）；Comp-FITC-A（EYFP）。上の２つのパネルにおける各試料中のトランスフェクトされたCsy4 DNAの量を、図中に示す。下のパネル（CMVp-mKEX1-[g1]cons-mKEX2）は、Csy4の不在下において試験された。本実験においてトランスフェクトされた他のプラスミドは、コンストラクト＃１（taCas9、１μｇ）およびコンストラクト＃５（P1-EYFP、１μｇ）を含んだ。
図１１は、イントロン中のgRNAに隣接するCsy4認識部位の多様な立体配置が、どのようにしてCRISPR-TFの活性に影響を及ぼすかを分析するための、図２Ｅおよび２Ｆに対応するフローサイトメトリーデータを示す。略号：Comp-PE-Tx-Red-YG-A（mKate2）；Comp-FITC-A (EYFP）。「28-gRNA-28」は、２つのCsy4認識部位に隣接するHSV1のイントロンgRNAである（コンストラクト＃4、CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV1-mKEX2）；「28-gRNA」は、５’Csy4認識部位のみを有するHSV1のイントロンgRNAである（コンストラクト＃１０、CMVp-mKEX1-[28-g1]HSV1-mKEX2）；「gRNA-28」は、３’Csy4認識部位のみを有するHSV1のイントロンgRNAである（コンストラクト＃１１、CMVp-mKEX1-[g1-28]HSV1-mKEX2）。加えて、各試料中のトランスフェクトされたCsy4発現プラスミドの量を、各図と共に示す。本実験においてトランスフェクトされた他のプラスミドは、コンストラクト＃１（taCas9、１μｇ）およびコンストラクト＃５（P1-EYFP、１μｇ）を含む。
図１２は、図３に対応するフローサイトメトリーデータを示す。略号：Comp-PE-Tx-Red-YG-A（mKate2）；Comp-FITC-A (EYFP）「Triplex-Csy4」機構は、コンストラクト＃３（CMVp-mK-Tr-28-g1-28）を含む。本実験においてトランスフェクトされた他のプラスミドは、コンストラクト＃１（taCas9、１μｇ）；コンストラクト＃５（P1-EYFP）；コンストラクト＃２（Csy4、示される濃度）を含む。「リボザイムデザイン１」は、コンストラクト＃１3（CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV）を含む。本実験においてトランスフェクトされた他のプラスミドは、コンストラクト＃１（taCas9、１μｇ）；コンストラクト＃５（P1-EYFP、１μｇ）を含む。「リボザイムデザイン２」は、コンストラクト＃１４（CMVp-mK-HH-g1-HD）を含む。本実験においてトランスフェクトされた他のプラスミドは、コンストラクト＃１（taCas9、１μｇ）；コンストラクト＃５（P1-EYFP、１μｇ）を含む。「リボザイムデザイン３」は、コンストラクト＃１５（CMVp-HH-g1-HDV）を含む。本実験においてトランスフェクトされた他のプラスミドは、コンストラクト＃１（taCas9、１μｇ）；コンストラクト＃５（P1-EYFP、１μｇ）を含む。「U6p-gRNA1」は、コンストラクト＃７（U6p-g1、１μｇ）を含む。本実験においてトランスフェクトされた他のプラスミドは、コンストラクト＃１（taCas9、１μｇ）を含む。
図１３は、図４Ｃに対応するフローサイトメトリーデータを示す。略号：Comp-PE-Tx-Red-YG-A（mKate2）；Comp-FITC-A（EYFP）；Comp-Pacific Blue-A（ECFP）。「機構１」とは、「イントロン−三重鎖」立体配置を指し、コンストラクト＃１6（CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV1-mKEX2-Tr-28-g2-28、１μｇ）；＃５（P1-EYFP、１μｇ）；＃６（P2-ECFP、１μｇ）；および＃１（taCas9、１μｇ）を含む。「機構２」とは、「タンデム−三重鎖」立体配置を指し、コンストラクト＃１７（CMVp-mK-Tr-28-g1-28-g2-28、１μｇ）；＃５（P1-EYFP、１μｇ）および＃６（P2-ECFP、１μｇ）；および＃１（taCas9、１μｇ）を含む。加えて、各試料中のトランスフェクトされたCsy4発現プラスミドDNA（コンストラクト＃２）の量を、各プロットの上に示す。
図１４は、図６Ｃおよび６Ｄに対応するフローサイトメトリーデータを示す。略号：Comp-PE-Tx-Red-YG-A（mKate2）；Comp-FITC-A（EYFP）；Comp-Pacific Blue-A（ECFP）。全ての試料を、各プロットの表題中に列記したコンストラクト（各１μｇ、表２）および２００ｎｇのCsy4発現プラスミド（コンストラクト＃２）でトランスフェクトした。
図１５は、図７Ｂおよび７Ｅに対応するフローサイトメトリーデータを示す。略号：Comp-PE-Tx-Red-YG-A（mKate2）；Comp-FITC-A（EYFP）；Comp-Pacific Blue-A（ECFP）。「機構１」は、以下のコンストラクトを含む：＃２０（CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28）；＃２２（CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS-28）；および＃５（P1-EYFP）。これらのプラスミドを、各１μｇの濃度でトランスフェクトした。この機構は、図７Ａ中の回路図に対応する。「機構２」は、以下のコンストラクトを含む：＃２１（CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28-miR4xBS）；＃２２（CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS-28）；および＃５（P1-EYFP）。これらのプラスミドを、各１μｇの濃度でトランスフェクトした。この機構は、図７Ｄ中の回路図に対応する。「対照」試料は、コンストラクト＃２２（CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS-28）および＃５（P1-EYFP）のみを含む。これらのプラスミドを、各１μｇの濃度でトランスフェクトした。加えて、各試料中のトランスフェクトされたCsy4発現プラスミド（コンストラクト＃２）の量を、各プロットの上に示す。
発明の詳細な説明
人工の部分とネイティブな細胞のプロセスとの間の定義された相互接続により作動する、複雑で強力かつスケーラブルな合成遺伝子ネットワークを構築する能力は、生物学的システムの操作の中心となる。この能力は、例えば天然の生物学的ネットワークを再配線すること、妨害すること、および探索することのための新たな戦略を可能にする。調整可能で、直交性で、コンパクトかつ多重化可能な遺伝子制御機構の大きなセットは、これらの適用を実現するための基礎的な重要性を有する。転写の制御および合成生物学の分野における多大な進歩にもかかわらず、本開示の前に利用可能であったツールは、上記の基準の１または２以上を満たせずにいる。
転写の制御は、予め決定された目的のDNA配列に結合する転写因子を利用する。ＩＩ型CRISPR/Casシステム（例えばDNAを標的とするCasタンパク質によるもの）は、複雑なタンパク質操作を必要とすることなくプログラム可能なDNA結合を達成するために適応されてきた（Sander and Joung, 2014）。これらのシステムにおいて、Cas9 DNA結合タンパク質の配列特異性は、標的DNA部位に対する塩基対相補性を有するガイドRNA（gRNA）により決定される。このことが、シンプルかつ高度に柔軟なCas9結合のプログラミングを可能にする。
本開示以前には、ヒト細胞における遺伝子制御のためのgRNAは、RNAポリメラーゼＩＩＩ（RNAP III）プロモーターからのみ発現されていた。このことは、CRISPR/Cas制御を内在遺伝子ネットワークに組み込むことに関する限定要因である。なぜならば、RNAP IIIプロモーターは、細胞のプロモーターのうちの僅かな部分のみを含み、多くは構成的に活性であり、それにより、多くの細胞のプロモーターおよびシグナルのCRISPR-TFに基づくネットワークへの連結を妨げるからである。さらに、内在プロモーターを効率的に活性化するためには、典型的には複数のgRNAが必要とされるが、転写の制御のための単一の転写物からのマルチプレックスなgRNA生成のための戦略は、本開示以前には利用可能ではなかった。結果として、天然の転写ネットワークを妨害するために、複数のgRNA発現コンストラクトが必要とされ、それによってスケーラビリティが限定されていた。
転写の制御に加えて、天然の回路が、複雑な挙動を達成するためにRNAに基づく翻訳および翻訳後の制御に梃入れする。本明細書において提供されるようなRNAと転写工学とを組み合わせる合成遺伝子制御戦略は、天然のシステムをモデリングするか、または人工挙動を実現する上で有用である。したがって、本明細書において多様な側面において提供されるのは、例えば複雑な合成回路トポロジーを作製するため、および内在プロモーターを制御するために哺乳動物と細菌のRNAに基づく制御機構とを統合する方法および組成物である。複数の哺乳動物RNAプロセッシング戦略を用いることができ、これは、３’RNA三重らせん（三重鎖として言及される）、イントロンおよびリボザイムと共に、哺乳動物miRNA制御、細菌由来のCRISPR-TFおよびP. aeruginosaからのCsy4 RNA調節タンパク質を含む。これらのコンストラクトは、例えば、ヒト細胞においてRNAP-IIにより制御されるmRNAから機能的gRNAを生成しつつ、mRNAの同時翻訳を調整可能にするために、用いることができる。
本明細書において示されるように、機能的gRNAを用いて、合成および内在の両方のプロモーターを、CRISPR-TFを介する活性化のためにターゲティングした。加えて、マルチプレックスなgRNA生成のための戦略を開発し、それにより、単一の転写物中でのタンパク質および複数のgRNAのコンパクトなコード化を可能にした。これらの調節部の有用性を実証するために、複雑な合成遺伝子回路の構築のために用いることができるマルチステージ転写カスケードを実現した。また本明細書において組み合わされたのは、フィードバックループを有する多成分性の遺伝子回路を作製するためのCRISPR-TFを用いた哺乳動物miRNAに基づく制御、相互接続、および、いくつかの態様においてはCsy4に基づくRNAプロセッシングにより再配線することができる挙動である。したがって、本開示のプラットフォームは、例えば、合成的転写による機構およびRNA依存的機構を用いて、人工および内在型の両方の複雑な制御ネットワークを構築し、同期させ、切り替えることができる。CRISPR-TFに基づく遺伝子制御システムと哺乳動物RNA調節立体配置との統合は、いくつかの態様において、合成生物学ならびに基礎生物学の適用のためのスケーラブルな遺伝子制御システムを可能にする。
本開示の側面は、操作されたコンストラクトおよび操作された核酸に関する。「操作されたコンストラクト」とは、例えば、プロモーターおよび多様なヌクレオチド配列（例えば、本明細書において記載されるような、タンパク質および／またはRNA干渉分子をコードするヌクレオチド配列）を含む、複数の遺伝子エレメントを有する操作された核酸を記載するために用いられる用語である。核酸は、共有結合により一緒に連結された少なくとも２のヌクレオチドであり、いくつかの例においては、ホスホジエステル結合を含んでいる場合がある（例えばホスホジエステル「骨格」）。操作された核酸は、天然には存在しない核酸である。しかし、操作された核酸は、全体としては天然に存在しないが、天然に起こるヌクレオチド配列を含んでいてもよいことが、理解されるべきである。いくつかの態様において、操作された核酸は、異なる生物からの（例えば異なる種からの）ヌクレオチド配列を含む。例えば、いくつかの態様において、操作された核酸は、マウスのヌクレオチド配列、細菌のヌクレオチド配列、ヒトヌクレオチド配列、および／またはウイルスのヌクレオチド配列を含む。操作された核酸は、組み換え核酸および合成核酸を含む。組み換え核酸は、核酸（例えば、単離された核酸、合成核酸またはそれらの組み合わせ）を連結させることにより構築される分子であり、いくつかの態様において、生細胞において複製することができる。合成核酸は、増幅されるか、または化学的にもしくは他の手段により合成される分子である。合成核酸は、化学的に修飾された、または他の方法で修飾されたものを含むが、天然に存在する核酸分子と塩基対を形成することができる。組み換えおよび合成核酸はまた、前述のいずれかの複製から生じる分子を含む。
いくつかの態様において、本開示の核酸は、少なくとも部分的に、例えばホルホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合および／またはペプチド核酸を含む他の骨格を含んでもよい、核酸アナログであると考えられる。核酸は、特定されるように、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）であっても、または一本鎖および二本鎖の両方の配列の部分を含んでもよい。いくつかの態様において、核酸は、三重鎖配列の部分を含んでもよい。核酸は、ゲノムおよび／またはcDNAの両方のDNA、RNAまたはハイブリッドであってよく、ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド（例えば人工または天然のもの）の任意の組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ハイポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の任意の組み合わせを含む。
本開示の操作されたコンストラクト（操作された核酸を含む）は、１または２以上の遺伝子エレメントを含む。「遺伝子エレメント」は、核酸の発現において役割を有する（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター）か、または操作された核酸の別々の産物をコードする（例えば、ガイドRNA、タンパク質および／またはRNA干渉分子をコードするヌクレオチド配列）、特定のヌクレオチド配列を指す。本開示の遺伝子エレメントの例として、限定することなく、プロモーター、およびタンパク質、ガイドRNA、Csy4結合部位、三重らせん構造、イントロンおよびイントロン配列（例えばドナー部位、アクセプター部位および／またはブランチ部位）、エキソンおよびリボザイムをコードするヌクレオチド配列が挙げられる。
本開示の操作された核酸の遺伝子エレメントの位置は、５’から３’方向のコード（センス）鎖に沿って、他の遺伝子エレメントに相対的に定義することができる。例えば、図１Ａは、mKate2タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したCMVプロモーターを示し、該ヌクレオチド配列は、三重らせん構造（または「三重鎖」）をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、三重らせん構造は、Csy4結合部位に隣接するガイドRNAをコードするヌクレオチド配列の上流にある。代替的に、図１Ａにおいて表される操作された核酸は、Csy4結合部位に隣接するガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を有するものとして説明することができ、これは、三重らせん構造をコードするヌクレオチド配列の下流にあり、これは、mKate2タンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流にあり、これは、上流のプロモーターに作動的に連結する。したがって、第１の遺伝子エレメントが第２の遺伝子エレメントの３’側に位置する場合、第１の遺伝子エレメントは、第２の遺伝子エレメントの下流にあると考えられる。同様に、第２の遺伝子エレメントが第１の遺伝子エレメントの５’側に位置する場合、第２の遺伝子エレメントは、第１の遺伝子エレメントの上流にあると考えられる。２つの遺伝子エレメントが互いに近位にある場合、１つの遺伝子エレメントは、別の遺伝子エレメントの「すぐ下流」または「すぐ上流」であると考えられる（例えば、２つの間に他の遺伝子エレメントが位置していない）。図１Ａにおいて示される立体配置において、例えば、Csy4結合部位に隣接するガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、三重らせん構造をコードするヌクレオチド配列のすぐ下流にある。
本開示のいくつかの側面は、（例えば少なくとも１、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、またはそれより多くの）ガイドRNA（gRNA）をコードする（例えば１または２以上、少なくとも１の）ヌクレオチド配列を含む、操作された核酸に関する。gRNAは、CRISPR/Casシステムの成分である。CRISPR/Casシステムは、ウイルスおよび他の外来核酸に対する防御を媒介するために、多様な細菌および古細菌により用いられる。CRISPR/Casシステムの成分は、核酸を選択的に切断するように協調する。ＩＩ型CRISPR/Casシステムは、DNAを標的とするCasタンパク質を含み、一方、ＩＩＩ型CRISPR/Casシステムは、RNAを標的とするCasタンパク質を含む。Cas DNA結合タンパク質の配列特異性は、標的DNA部位に対する塩基対相補性を有するgRNAにより決定される。したがって、Casタンパク質は、gRNAにより標的DNA部位に対して「ガイド」される。gRNAの塩基対相補性は、いくつかの態様において、シンプルかつ柔軟なCas結合のプログラミングを可能にする。塩基対相補性とは、アデニンとチミン（DNA）またはウラシル（RNA）との間、およびグアニンとシトシンとの間の特徴的な相互作用を指す。
本開示のガイドRNAは、いくつかの態様において、１０〜５００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、gRNAは、１０〜２０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、１０〜７０ヌクレオチド、１０〜８０ヌクレオチド、１０〜９０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜７０ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜９０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、３０〜４０ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド、３０〜７０ヌクレオチド、３０〜８０ヌクレオチド、３０〜９０ヌクレオチド、３０〜１００ヌクレオチド、４０〜５０ヌクレオチド、４０〜６０ヌクレオチド、４０〜７０ヌクレオチド、４０〜８０ヌクレオチド、４０〜９０ヌクレオチド、４０〜１００ヌクレオチド、５０〜６０ヌクレオチド、５０〜７０ヌクレオチド、５０〜８０ヌクレオチド、５０〜９０ヌクレオチドまたは５０〜１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、gRNAは、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜２５０ヌクレオチド、１０〜３００ヌクレオチド、１０〜３５０ヌクレオチド、１０〜４００ヌクレオチドまたは１０〜４５０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、gRNAは、５００ヌクレオチドより長い長さを有する。いくつかの態様において、gRNAは、１０、１５、２０、１５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００またはそれより多くのヌクレオチドの長さを有する。
本開示の方法および組成物は、驚くべきことに、いくつかの態様においては単一の転写物からの、複数のガイドRNA（gRNA）の生成を許容する。しかし、単一の細胞において複数の転写物から複数のgRNAを生成してもよいことが、理解されるべきである。本明細書において提供されるように生成されたgRNAは、同じヌクレオチド配列を有していても、異なるヌクレオチド配列を有していてもよい。したがって、gRNAは、同じ標的部位または異なる標的部位（例えば特定のプロモーター内の領域）を標的として、これに結合することができる。例えば、いくつかの操作された核酸は、第１のgRNAをコードするヌクレオチド配列および第２のgRNAをコードするヌクレオチド配列（または少なくとも２のgRNAをコードするヌクレオチド配列）を含む。第１のgRNAは、第２のgRNAと同じRNA配列を有していてもよく、それにより、２つのgRNAは同じ部位を標的としてもよい。代替的に、第１のgRNAは、第２のgRNAとは異なるRNA配列を有していてもよく、それにより、２つのgRNAは、異なる部位を標的としてもよい（例えば同じプロモーター内または異なるプロモーター内）。図４Ａにおいて例示されるように、「gRNA1」は、高感度黄色蛍光タンパク質（EYFP）に作動的に連結したプロモーター（P1）を標的とし、一方、「gRNA2」は、高感度シアン蛍光タンパク質（ECFP）に作動的に連結したプロモーター（P2）を標的とする。
第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列の２個のヌクレオチドの間に挿入される場合、または、当該ヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列の一続きの切れ目のないヌクレオチドを置き換える場合、第１のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列「内」にあると考えられる。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、目的のタンパク質内でgRNAまたはRNA干渉分子をコードする。この立体配置において、例えばgRNAをコードするヌクレオチド配列は、コードされたgRNAが取り除かれる（例えば、gRNAがコグネートイントロンスプライス部位に隣接する場合はRNAスプライシングにより）とタンパク質が翻訳されるように、目的のタンパク質の２つの隣接するエキソンの間に配置される。上で議論されるようなガイドRNAは、いくつかの態様において、Casタンパク質を核酸に「ガイド」する。
Casタンパク質は、核酸を切断するヌクレアーゼである。Casタンパク質（例えばCas9タンパク質）のヌクレアーゼ活性は、いくつかの態様において、原核生物または真核生物細胞における正確かつ効率的なゲノム編集のために利用することができる。変異体Casタンパク質もまた、本明細書において企図される。いくつかの態様において、変異体Casタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠失する（例えばdCas9）。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ活性を欠失する変異体Casタンパク質は、哺乳動物細胞においてCRISPRに基づく転写因子（CRISPR-TF）を作製するための、異所性およびネイティブの両方のプロモーターのプログラム可能な転写制御を可能にする（Cheng et al., 2013；Farzadfard et al., 2013；Gilbert et al., 2013；Maeder et al., 2013a；Mali et al., 2013a；Perez-Pinera et al., 2013a）。例えば、活性化ドメイン（例えばVP16、VP64またはp65）をCasタンパク質に融合することにより、Casは転写活性となる（また「taCas」タンパク質としても言及される）。転写活性化タンパク質は、RNAポリメラーゼＩＩ機構およびクロマチン修飾活性を、プロモーターへと動員する。したがって、いくつかの態様において、ヌクレアーゼ活性を欠失する「転写活性」Cas（taCas）タンパク質を、本開示に従って用いることができる。いくつかの態様において、転写活性Casタンパク質は、転写活性Cas9（taCas9）タンパク質である。他の転写活性Casタンパク質は、本明細書において企図される。
いくつかの態様において、本開示のガイドRNAは、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する。リボヌクレアーゼ（RNaseと略称される）は、RNAの加水分解を触媒するヌクレアーゼである。リボヌクレアーゼは、エンドリボヌクレアーゼまたはエキソリボヌクレアーゼであってよい。エンドリボヌクレアーゼは、一本鎖または二本鎖のいずれかのRNAを切断する。エキソリボヌクレアーゼは、RNAの５’末端または３’末端のいずれかから末端ヌクレオチドを取り除くことにより、RNAを分解する。いくつかの態様において、本開示のガイドRNAは、Csyリボヌクレアーゼ認識部位（例えばCsy4リボヌクレアーゼ認識部位）に隣接する。Csy4は、特定のRNA配列を認識し、RNAを切断し、そして上流のフラグメントに結合し続ける、エンドリボヌクレアーゼである。いくつかの態様において、Csyリボヌクレアーゼ（例えばCsy4リボヌクレアーゼ）は、操作された核酸転写物からガイドRNAを遊離させるために用いることができる。したがって、いくつかの態様において、細胞は、Csy4または他のCas6リボヌクレアーゼ認識部位に隣接するガイドRNAをコードするヌクレオチド配列およびCsy4または他のCas6リボヌクレアーゼをコードする操作された核酸を含む操作されたコンストラクトで、コトランスフェクトされる。代替的に、またはこれに加えて、細胞は、Csy4または他のCas6リボヌクレアーゼを安定に発現しても、またはこれを安定に発現するように改変されていてもよい。いくつかの態様において、Csyリボヌクレアーゼ（例えばCsy4リボヌクレアーゼ）は、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus epidermidis、Pyrococcus furiosusまたはSulfolobus solfataricusからのものである。他のリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ認識部位は、本明細書において企図される（例えば、Mojica, F.J.M.ら、CRISPR-Cas Systems, RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea、Barrangou, Rodolphe, van der Oost, John（編）、2013年、ISBN 978-3-642-34657-6を参照；このうち、リボヌクレアーゼ／認識部位に関係する主題は、本明細書において参考として援用される）。
いくつかの態様において、リボヌクレアーゼ認識部位（例えばCsy4リボヌクレアーゼ認識部位）は、１０〜５０ヌクレオチドの長さである。例えば、Csyリボヌクレアーゼ認識部位は、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２０〜５０、２０〜４０または２０〜３０ヌクレオチドの長さであってもよい。いくつかの態様において、Csyリボヌクレアーゼ認識部位は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、Csyリボヌクレアーゼ認識部位（例えばCsy4リボヌクレアーゼ認識部位）は、２８ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、リボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列認識部位は、配列番号２６を含む。Csyのホモログもまた、本明細書において企図される（例えば、Mojica, F.J.M.ら、CRISPR-Cas Systems, RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea、Barrangou, Rodolphe, van der Oost, John（編）、2013年、ISBN 978-3-642-34657-6を参照；このうち、リボヌクレアーゼ／認識部位に関係する主題は、本明細書において参考として援用される）。
第１の遺伝子エレメントが、他の遺伝子エレメントの間に、およびこれに対してすぐ隣に配置される場合、第１の遺伝子エレメントは他の遺伝子エレメントに「隣接する」と言われる。例えば図１Ａは、Csy4結合部位（「28bp」）に隣接する「gRNA1」をコードするヌクレオチド配列の模式図による代表例を示す。同様に、図２Ａ中の模式図は、Csy4結合部位（「28bp」）に隣接する「gRNA1」をコードするヌクレオチド配列の代表例であり、これはさらにコグネートイントロンスプライス部位をコードするヌクレオチド配列に隣接し、これはさらにmKate2タンパク質のエキソンをコードするヌクレオチド配列に隣接する。いくつかの態様において、操作されたコンストラクトは、例えば図５Ａにおいて示されるように、複数のgRNAをタンデムに含む。かかるコンストラクトは、少なくとも２のgRNAをコードするヌクレオチド配列を有するものとして記載される場合があり、各gRNAは、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する。この立体配置は、図５Ａにおいて示されるように各gRNAが単一のリボヌクレアーゼ認識部位（RRS）（図中で「28bp」として参照されるRRS）に隣接する複数のタンデムなgRNA、ならびに、各gRNAが２または３以上のリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する複数のタンデムなgRNAを包含することを意図することが、理解されるべきである。例えば、遺伝子エレメントは、以下のような操作されたコンストラクトにおいて指示されてもよい：RRS1-gRNA1-RRS2-gRNA2-RRS3-gRNA-RRS4（これにより、単一のリボヌクレアーゼ認識部位が、１つのgRNAを隣のgRNAから分離する）；またはRRS1-gRNA1-RRS2-RRS3-gRNA2-RRS4-RRS5-gRNA-RRS6（これにより、２つのリボヌクレアーゼ認識部位が、１つのgRNAを隣のgRNAから分離する）。RRSは、同じであっても異なっていてもよい。すなわち、いくつかの態様において、操作されたコンストラクトから１または２以上のgRNAを遊離させるために、異なる型のリボヌクレアーゼを用いてもよい。
本開示のいくつかの側面は、例えば三重らせん構造（または「三重鎖」）を形成するRNA配列などの３’RNA安定化配列を含む、操作されたコンストラクトに関する。３’RNA安定化配列は、ポリ（Ａ）テイルの欠失を補完するために、産物をコードするヌクレオチド配列の３’末端に付加されたヌクレオチド配列である。したがって、三重らせん構造を形成するものなどの３’RNA安定化配列は、いくつかの態様において、ポリ（Ａ）テイルを欠失するmRNAの効率的な翻訳を可能にする。三重らせん構造は、例えばアデニンまたはウリジンリッチなモチーフにより形成される二次または三次のRNA構造である。いくつかの態様において、３’RNA安定化配列は、核酸の３’非翻訳領域（UTR）からのものである。
三重らせん構造は、いくつかの態様において、RNAの安定性および／または翻訳を促進する。いくつかの態様において、本開示の三重らせん構造は、MALAT1（転移関連肺腺癌転写物１）遺伝子座またはMENβ（多発性内分泌腫瘍症β）遺伝子座の３’末端からのヌクレオチドフラグメントによりコードされる。いくつかの態様において、三重らせん構造は、MALAT1遺伝子座の３’末端またはMENβ遺伝子座の３’末端からのヌクレオチドフラグメントによりコードされる（例えば、本明細書において参考として援用されるWilusz et al., 2012を参照；また、本明細書において参考として援用されるBrown JA et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Nov 20;109(47)を参照）。いくつかの態様において、三重らせん構造は、MALAT1遺伝子座の３’末端からの１１０ヌクレオチド配列（例えば１１０個の切れ目のないヌクレオチド配列）によりコードされる。いくつかの態様において、三重らせん構造は、配列番号１を含むかまたは配列番号１からなる核酸によりコードされる。三重らせん構造をコードするものを含む他の３’RNA安定化配列は、本明細書において企図される（例えば、本明細書において参考として援用されるWilusz J.E. et al. RNA 2010. 16: 259-266を参照）。
本開示のいくつかの側面は、リボヌクレアーゼ（例えばCsy4）認識部位に隣接するgRNAをコードするヌクレオチド配列を含む操作されたコンストラクトに関し、ここで、該ヌクレオチド配列は、コグネートイントロンスプライス部位をコードするヌクレオチド配列に隣接する。当該分野において、用語「イントロン」は、しばしば、遺伝子内のDNA配列およびRNA転写物中の対応する配列の両方を指す。本明細書における明確性および一貫性のために、操作されたコンストラクトの文脈において、「イントロンをコードするヌクレオチド配列」はDNA配列を指し、一方、用語「イントロン」はRNA配列を指すことが、理解されるべきである。イントロンは、RNAスプライシングにより取り除かれる非コードRNA配列である。RNAスプライシングは、メッセンジャーRNA前駆体が、イントロンを取り除いてエキソン（例えば核酸のタンパク質コード領域）を一緒に結合し、成熟メッセンジャーRNA（mRNA）分子を形成するよう改変されるプロセスである。「コグネートイントロンスプライス部位」は、RNAスプライシングの間に任意の介在配列（例えば５’スプライス部位と３’スプライス部位との間の配列）が取り除かれるように、ドナー部位（例えばイントロンの５’末端に）、ブランチ部位（例えばイントロンの３’末端近傍に）およびアクセプター部位（例えばイントロン３’末端に）を含む。例えば、図２Ａにおいて表される操作されたコンストラクトは、イントロンスプライス部位に隣接する介在遺伝子エレメント（例えば、Csy4結合部位に隣接するgRNAをコードするヌクレオチド配列）を含む。図２Ａの操作されたコンストラクトから生成される転写物のプロセッシングの間に、介在遺伝子エレメントが取り除かれる。
いくつかの態様において、５’スプライスドナー部位は、より大きな、より保存性の低い領域内に、ほぼインバリアントな配列ＧＵを含む。いくつかの態様において、３’スプライスアクセプター部位は、ほぼインバリアントなＡＧ配列を含む。いくつかの態様において、ＡＧの上流にピリミジン（例えばＣおよびＵ）が豊富な領域が存在し、これはポリピリミジントラクトと呼ばれる。いくつかの態様において、ポリピリミジントラクトの上流は、枝分かれ部位であり、これは、例えばアデニンヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの態様において、イントロンのためのコンセンサス配列（IUPAC核酸記号におけるもの）は、以下のとおりである：Ｍ−Ａ−Ｇ−［cut］−Ｇ−Ｕ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｕ（ドナー部位）．．．イントロン配列．．．Ｃ−Ｕ−Ｒ−［Ａ］−Ｙ（ブランチ配列、例えばアクセプター部位の２０〜５０ヌクレオチド上流）．．．Ｙリッチ−Ｎ−Ｃ−Ａ−Ｇ−［cut］−Ｇ（アクセプター部位）。
本明細書においていくつかの態様において企図されるのは、比較的安定な（例えば「長命の」）イントロンを生成するイントロン配列である。かかる配列の例として、限定することなく、安定な環状イントロンを形成するHSV-1潜伏期関連イントロン（Block and Hill, 1997）、およびsno-IncRNA2イントロン（Yin et al., 2012）が挙げられる。sno-IncRNA2イントロン（または「sno-RNA2イントロン」）は、両端でsnoRNAマシナリー（machinery）によりプロセッシングされ、これが、それを分解から保護し、５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）テイルを欠失したsnoRNA配列に隣接するIncRNAの蓄積をもたらす。イントロン配列に構造的安定性を付与する他の配列もまた、本明細書において企図される。
本開示のいくつかの側面は、リボザイムに隣接するgRNAをコードするヌクレオチド配列を含む、操作されたコンストラクトに関する。リボザイムは、タンパク質酵素の作用と同様に特定の生化学的反応を触媒することができるRNA分子である。シス作用性リボザイムは、典型的には自己形成型であり、自己切断することができる。シス作用性リボザイムは、RNA pol IIプロモーターからの機能的gRNA発現を媒介することができる。トランス作用性リボザイムは、対照的に、自己切断は行わない。自己切断とは、リボザイムを含むRNA分子がそれ自体で切断される、分子内触媒のプロセスを指す。本開示による使用のためのシス作用性リボザイムの例として、限定することなく、ハンマーヘッド型（ＨＨ）リボザイム（例えば、本明細書において参考として援用されるPley et al., 1994を参照）およびデルタ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム（例えば、本明細書において参考として援用されるFerre-D’Amare et al., 1998を参照）が挙げられる。本開示による使用のためのトランス作用性リボザイムの例として、限定することなく、タバコ輪斑ウイルス（sTRSV）、チコリ黄斑ウイルス（chicory yellow mottle virus：sCYMV）およびアラビスモザイクウイルス（sARMV）のサテライトRNA中に見いだされる、天然および人工バージョンのヘアピンリボザイムが挙げられる。例えば図３Ａ〜３Ｃは、リボザイムに隣接する「gRNA1」をコードするヌクレオチド配列の模式的代表例を示す。いくつかの態様において、操作されたコンストラクトは、各々がリボザイムをコードするヌクレオチド配列に隣接する複数のgRNAをタンデムに含む。かかるコンストラクトは、本明細書において、少なくとも２のgRNAをコードするヌクレオチド配列を有するものとして記載される場合があり、各々のgRNAは、リボザイムに隣接する。この立体配置は、各gRNAが単一のリボザイム（Ribo）に隣接する複数のタンデムなgRNA、ならびに各gRNAが２または３より多くのリボザイムに隣接する複数のタンデムなgRNAを包含することを意図されることが、理解されるべきである。例えば、遺伝子エレメントは、以下のような操作されたコンストラクトにおいて整理されてもよい：Ribo1-gRNA1- Ribo2-gRNA2- Ribo3-gRNA- Ribo4（これにより、単一のリボザイムが、１つのgRNAを隣接するgRNAから分離する）；またはRibo1-gRNA1- Ribo2- Ribo3-gRNA2- Ribo4- Ribo5-gRNA- Ribo6（これにより、２つのリボザイムが１つのgRNAを隣接するgRNAから分離する）。リボザイムは、同じであっても異なっていてもよい。すなわち、いくつかの態様において、１または２以上のgRNAを操作されたコンストラクトから遊離させるために、異なる型のリボザイムを用いることができる。
本開示のいくつかの側面は、目的のタンパク質をコードする核酸に関する。目的のタンパク質は、任意のタンパク質であってよい。目的のタンパク質の例として、限定することなく、細胞のシグナル伝達（例えば受容体／リガンド結合）およびシグナル伝達に関与するものが挙げられる。目的のタンパク質は、例えば線維状タンパク質または球状タンパク質であってよい。線維状タンパク質の例として、限定することなく、細胞骨格タンパク質および細胞外マトリックスタンパク質が挙げられる。球状タンパク質の例として、限定することなく、血漿タンパク質（例えば、凝固因子、急性期タンパク質）、血液タンパク質、細胞接着タンパク質、膜貫通型輸送タンパク質（例えばイオンチャネルタンパク質、共輸送タンパク質、逆輸送タンパク質）、ホルモンおよび増殖因子、受容体（例えば膜貫通型受容体、細胞内受容体）、DNA結合タンパク質（例えば転写因子または転写の制御に関与する他のタンパク質）、免疫系タンパク質、栄養貯蔵／輸送タンパク質、シャペロンタンパク質および酵素が挙げられる。他のタンパク質が企図され、本開示に従って用いることができる。
本開示のいくつかの側面は、例えばより洗練された回路トポロジーを実現するために、CRISPRに基づく機構を哺乳動物のRNA干渉機構に組み込むことを企図する。非限定的な例８において示されるように、マイクロRNA制御を、CRISPR-TFおよびCsy4と共に組み込み、コグネートなmiRNA結合部位を取り除くことにより、標的RNAのmiRNAの阻害を妨害した。RNA干渉は、一般に、典型的には特定のmRNA分子の破壊を引き起こすことによりRNA分子が遺伝子発現を阻害する、生物学的プロセスを指す。かかるRNA分子の例として、マイクロRNA（miRNA）および低分子干渉RNA（siRNA）が挙げられる。
miRNAsは、短い非コードの一本鎖RNA分子である。本開示のmiRNAは、天然に存在するものであっても合成（例えば人工）であってもよい。miRNAは、通常、標的mRNAの３’UTR（非翻訳領域）内に見出される標的部位に結合することにより、遺伝子サイレンシングを誘導する。この相互作用は、タンパク質合成を抑制することにより、および／またはmRNA分解を開始させることにより、タンパク質の産生を妨害する。mRNA上の多くの標的部位は、それらの対応するマイクロRNAと、部分的な塩基相補性のみを有し、したがって、個々のマイクロRNAは、１００の異なるmRNAまたはそれより多くを標的とすることができる。さらに、個々のmRNAは、異なるmiRNAのための複数の結合部位を含んでもよく、これにより複雑な制御ネットワークがもたらされる。いくつかの態様において、miRNAは、１０〜５０ヌクレオチドの長さである。例えば、miRNAは、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２０〜５０、２０〜４０または２０〜３０ヌクレオチドの長さであってよい。いくつかの態様において、miRNAは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、miRNAは、２２ヌクレオチドの長さである。
siRNAは短い非コードの一本鎖RNA分子である。本開示のsiRNAは、天然に存在するものであっても合成（例えば人工）であってもよい。コグネートなmRNAへのsiRNAの結合は、典型的には、mRNAの分解をもたらす。いくつかの態様において、siRNAは、１０〜５０ヌクレオチドの長さである。例えば、siRNAは、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２０〜５０、２０〜４０または２０〜３０ヌクレオチドの長さであってよい。いくつかの態様において、siRNAは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、siRNAは、２１〜２５ヌクレオチドの長さである。
本開示の操作されたコンストラクトは、いくつかの態様において、ヌクレオチド配列（例えば目的のタンパク質をコードするもの）に作動的に連結したプロモーターを含む。「プロモーター」は、核酸の制御領域であって、そこにおいて核酸のうちの残りの転写の開始および速度が制御される。プロモーターはまた、制御タンパク質および分子がRNAポリメラーゼおよび他の転写因子などに結合することができる、部分領域を含んでもよい。プロモーターは、構成的であっても、誘導性であっても、活性化可能であっても、抑制可能であっても、組織特異的であっても、またはそれらの組み合わせであってもよい。
プロモーターは、それが制御する核酸配列の発現を駆動するかまたは転写を駆動する。プロモーターは、それが、その配列の転写開始および／または発現を制御してコントロール（「駆動」）するヌクレオチド配列に関して正しい機能的位置および方向にある場合に、「作動的に連結している」と考えられる。
プロモーターは、RNAポリメラーゼ（および／またはシグマ因子）に対するそのアフィニティに従って、強または弱として分類することができる；これは、プロモーター配列が、ポリメラーゼのための理想的なコンセンサス配列にどれほど近く似ているかに関する。プロモーターの強度は、転写の開始が、そのプロモーターにおいて高い頻度で起きるかまたは低い頻度で起きるかに依存し得る。異なるレベルの遺伝子／タンパク質発現を有する核酸を構築するために、異なる強度を有する異なるプロモーターを用いることができる（例えば、弱いプロモーターから開始された発現のレベルは、強力なプロモーターから開始された発現のレベルよりも低い）。
プロモーターは、遺伝子または配列に天然に結合するものであってよく、これは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することにより得ることができる。かかるプロモーターは、「内在型」として言及され得る。いくつかの態様において、本開示のgRNAは、内在プロモーター（例えば内在型ヒトプロモーター）を標的とするように設計される。
いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、組み換えまたは異種プロモーターの制御下に位置してもよく、これは、その天然の環境において、通常では当該ヌクレオチド配列に結合しないプロモーターを指す。かかるプロモーターは、他の遺伝子のプロモーター；任意の他の原核生物細胞から単離されたプロモーター；および「天然に存在しない」合成プロモーター、例えば、異なる転写制御領域の異なるエレメントを含むもの、および／または、当該分野において公知の遺伝子操作の方法を通して発現を改変する変異を含むものを、含んでもよい。プロモーターのヌクレオチド配列を合成により生成することに加えて、配列は、組み換えクローニングおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む核酸増幅技術を用いて生成することができる。
いくつかの態様において、プロモーターからの転写の開始は、RNAポリメラーゼ（またDNA依存的RNAポリメラーゼとしても言及される）の活性に依存する。RNAポリメラーゼは、RNA転写物の３’末端でリボヌクレオチドを重合するヌクレオチジルトランスフェラーゼである。真核生物は、複数の型の核RNAポリメラーゼを有し、各々がRNAの別々のサブセットの合成を担当する。これらは全て、互いに対して、および細菌のRNAポリメラーゼに対して、構造的におよび機構的に関連する。RNAポリメラーゼＩは、プレrRNA 45S（酵母においては35S）を合成し、これは、リボソームの主要なRNAセクションを形成する28S、18Sおよび5.8S rRNAへと成熟する。RNAポリメラーゼＩＩは、mRNAの前駆体、ならびに多くのsnRNAおよびマイクロRNAを合成する。RNAポリメラーゼＩＩＩは、tRNA、rRNA 5S、ならびに核および細胞質ゾル中で見出される他の低分子RNAを合成する。RNAポリメラーゼＩＶは、植物においてsiRNAを合成する。RNAポリメラーゼＶは、植物においてsiRNAにより指揮されるヘテロクロマチン形成に関与するRNAを合成する。
本明細書においていくつかの態様において企図されるのは、RNA pol IIおよびRNA pol IIIプロモーターである。RNAポリメラーゼＩＩによる正確な転写の開始を指揮するプロモーターは、RNA pol IIプロモーターとして言及される。本開示による使用のためのRNA pol IIプロモーターの例として、限定することなく、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトユビキチンプロモーター、ヒトヒストンH2A1プロモーターおよびヒト炎症性ケモカインCXCL 1プロモーターが挙げられる。他のRNA pol IIプロモーターもまた、本明細書において企図される。RNAポリメラーゼＩＩＩによる正確な転写の開始を指揮するプロモーターは、RNA pol IIIプロモーターとして言及される。本開示による使用のためのRNA pol IIIプロモーターの例として、限定することなく、U6プロモーター、H1プロモーター、ならびにトランスファーRNA、5SリボソームRNA（rRNA）およびシグナル認識粒子7SL RNAのプロモーターが挙げられる。
いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターは、誘導因子または誘導剤の存在下にあるか、これらによって影響を受けるか、またはこれらと接触した場合に、転写活性を開始させるかまたはこれを増強することにより特徴づけられるものである。誘導因子または誘導剤は、内因性であっても、通常は外因性の条件であってもよく、誘導性プロモーターから転写活性を誘導することにおいて活性となるように操作された核酸と接触する、化合物またはタンパク質であってもよい。
本開示の操作された核酸は、標準的な分子生物学の方法を用いて生成することができる（例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Pressを参照）。
いくつかの態様において、操作されたコンストラクトおよび／または操作された核酸は、GIBSON ASSEMBLY（登録商標）クローニングを用いて生成される（例えば、Gibson, D.G. et al. Nature Methods, 343-345, 2009；およびGibson, D.G. et al. Nature Methods, 901-903, 2010を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。GIBSON ASSEMBLY（登録商標）は、典型的には、単一チューブの反応において３つの酵素活性：５’エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼの３’伸長活性およびDNAリガーゼ活性を用いる。５’エキソヌクレアーゼ活性は、５’末端配列を削り取って、相補的な配列をアニーリングのために暴露する。次いで、ポリメラーゼ活性が、アニーリングされた領域におけるギャップを埋める。次いで、DNAリガーゼが、ニックを閉じて、DNAフラグメントを一緒にして共有結合させる。隣接しているフラグメントの重複している配列は、Golden Gate Assemblyにおいて用いられるものよりもはるかに長く、したがって、より高いパーセンテージの正確な会合をもたらす。
いくつかの態様において、操作されたコンストラクトおよび／または操作された核酸は、ベクター中に含まれる。ベクターは、遺伝子材料（例えば操作された核酸）を、例えばそれが複製および／または発現され得る別の細胞に人工的に運搬するために、媒体として用いられる核酸（例えばDNA）である。いくつかの態様において、ベクターは、エピソームベクターである（例えば、本明細書において参考として援用されるVan Craenenbroeck K. et al. Eur. J. Biochem. 267, 5665, 2000を参照）。ベクターの非限定的な例は、プラスミドである。プラスミドは、二本鎖の一般に環状のDNA配列であって、宿主細胞中で自己複製することができるものである。プラスミドベクターは、典型的には、宿主中でのプラスミドの半独立的な複製を可能にする複製起点、およびまた導入遺伝子インサートを含む。プラスミドは、より多くの特徴を含んでもよく、これは、例えば、核酸インサートの挿入のためのヌクレオチドオーバーハングおよび当該インサートの両側に対して複数の制限酵素コンセンサス部位を含む「マルチプルクローニング部位」を含む。ベクターの別の非限定的な例は、ウイルスベクターである。
本開示の操作されたコンストラクトは、多様な細胞型において発現させることができる。いくつかの態様において、操作されたコンストラクトは、哺乳動物細胞において発現される。例えば、いくつかの態様において、操作されたコンストラクトは、ヒト細胞、霊長類細胞（例えばベロ細胞）、ラット細胞（例えばGH3細胞、OC23細胞）またはマウス細胞（例えばMC3T3細胞）において発現される。限定することなく以下を含む多様なヒト細胞株が存在する：HEK細胞、HeLa細胞、国立がん研究所の60種の癌細胞株（NCI60）からの癌細胞、DU145（前立腺癌）細胞、Lncap（前立腺癌）細胞、MCF-7（乳癌）細胞、MDA-MB-438（乳癌）細胞、PC3（前立腺癌）細胞、T47D（乳癌）細胞、THP-1（急性骨髄性白血病）細胞、U87（神経膠芽腫）細胞、SHSY5Yヒト神経芽細胞腫細胞（骨髄腫からクローニングされたもの）およびSaos-2（骨癌）細胞。いくつかの態様において、操作されたコンストラクトは、ヒト胎児由来腎臓（HEK）細胞（例えばHEK 293またはHEK 293T細胞）において発現される。いくつかの態様において、操作されたコンストラクトは、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または他の型の細胞において発現される。いくつかの態様において、操作されたコンストラクトは、幹細胞（例えばヒト幹細胞）、例えば、多能性幹細胞（例えばヒト由来多能性幹細胞（hiPSC）を含むヒト多能性幹細胞）などにおいて発現される。「幹細胞」とは、培養中で不特定の期間にわたり分裂して、特化した細胞を生じることができる能力を有する細胞を指す。「多能性幹細胞」とは、生物の全ての組織に分化することができるが、単独では完全な生物の発達を維持することはできない幹細胞の型を指す。「ヒト由来多能性幹細胞」とは、遺伝子および胚幹細胞を規定する特性を維持するために重要な因子を強制発現させることにより、胚幹細胞様の状態へと再プログラムされている、体性（例えば成熟または成体）の細胞を指す（例えば、本明細書において参考として援用されるTakahashi and Yamanaka, Cell 126 (4): 663-76, 2006を参照）。ヒト由来多能性幹細胞細胞は、幹細胞マーカーを発現し、３つ全ての胚葉（外胚葉、内胚葉、中胚葉）の細胞の特徴を生じることができる。
本開示により用いることができる細胞株のさらなる非限定的な例として、293-T、293-T、3T3、4T1、721、9L、A-549、A172、A20、A253、A2780、A2780ADR、A2780cis、A431、ALC、B16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Cal-27、CGR8、CHO、CML T1、CMT、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、Hepa1c1c7、High Five細胞、HL-60、HMEC、HT-29、HUVEC、J558L細胞、Jurkat、JY細胞、K562細胞、KCL22、KG1、Ku812、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1、2、3．．．48、MC-38、MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MDCK II、MG63、MONO-MAC 6、MOR/0.2R、MRC5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NW-145、OPCN/OPCT Peer、PNT-1A/PNT 2、PTK2、Raji、RBL細胞、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、S2、Saos-2細胞、Sf21、Sf9、SiHa、SKBR3、SKOV-3、T-47D、T2、T84、THP1、U373、U87、U937、VCaP、WM39、WT-49、X63、YAC-1およびYAR細胞が挙げられる。
本開示の細胞は、いくつかの態様において、改変されている。改変された細胞とは、外因性の核酸または天然には存在しない核酸を含む細胞である。いくつかの態様において、改変された細胞は、ゲノム核酸中に突然変異を含む。いくつかの態様において、改変された細胞は、外因性の独立して複製する核酸（例えば、エピソームベクター上に存在する操作された核酸）を含む。いくつかの態様において、改変された細胞は、外来のまたは外因性の核酸を細胞中に導入することにより生成される。核酸は、例えばエレクトロポレーション（例えばHeiser W.C. Transcription Factor Protocols: Methods in Molecular Biology（商標）2000; 130: 117-134を参照）、化学的（例えばリン酸カルシウムまたは脂質）トランスフェクション（例えばLewis W.H., et al., Somatic Cell Genet. 1980 May; 6(3): 333-47; Chen C., et al., Mol Cell Biol. 1987 August; 7(8): 2745-2752を参照）、組み換えプラスミドを含む細菌プロトプラストとの融合（例えばSchaffner W. Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Apr; 77(4): 2163-7を参照）、または細胞の核中への直接的な精製DNAのマイクロインジェクション（例えばCapecchi M.R. Cell. 1980 Nov; 22(2 Pt 2): 479-88を参照）などの慣用的な方法により細胞中に導入することができる。
いくつかの態様において、細胞を、内因性の目的のタンパク質を過剰発現するように改変する（例えば、目的のタンパク質をコードする内在遺伝子の近傍に、その発現レベルを増大させるために、プロモーターまたは他の制御エレメントを導入または改変することを介して）。いくつかの態様において、細胞を、変異誘発により改変する。いくつかの態様において、目的の遺伝子の変更をもたらすために、組み換え核酸を細胞中に導入することにより、細胞を改変する（例えば挿入または相同組み換えを介して）。
いくつかの態様において、例えばヒト細胞または他の型の細胞における発現のために、操作された核酸をコドン最適化してもよい。コドン最適化は、１つの種のヌクレオチドのDNA配列を別の種のヌクレオチドのDNA配列に形質転換することにより目的の遺伝子の翻訳効率を増大させることにより、生物中でのタンパク質発現を最大化するための技術である。
本開示の操作されたコンストラクトは、一過性に発現されても安定に発現されてもよい。「一過性細胞発現」とは、細胞の核ゲノム中に組み込まれない核酸の、当該細胞による発現を指す。比較として、「安定な細胞発現」とは、細胞またはその娘細胞の核ゲノム中に残る核酸の、当該細胞による発現を指す。典型的には、安定な細胞発現を達成するために、細胞を、マーカー遺伝子、および細胞における安定な発現を意図される外因性の核酸（例えば操作された核酸）でコトランスフェクトする。マーカー遺伝子は、細胞に何らかの選択可能な利点（例えば、トキシン、抗生物質または他の因子に対する耐性）を付与する。僅かなトランスフェクトされた細胞が、偶然により、それらのゲノム中に外因性の核酸を組み込まれる。その後、例えばトキシンを細胞培養に添加した場合、トキシン耐性マーカー遺伝子がそのゲノム中に組み込まれたそれらの僅かな細胞のみが増殖することができ、一方、他の細胞は死滅する。この選択圧を一定期間にわたり適用した後で、安定なトランスフェクションを有する細胞のみが残り、さらに培養することができる。本開示による使用のためのマーカー遺伝子および選択剤の例として、限定することなく、ジヒドロ葉酸レダクターゼとメトトレキサート、グルタミンシンターゼとメチオニンスルホキサミン、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼとハイグロマイシン、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼとピューロマイシン、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼとジェネテシン（別名G418）が挙げられる。他のマーカー遺伝子／選択剤は、本明細書において企図される。
一過性にトランスフェクトされた、および／または安定にトランスフェクトされた細胞における核酸の発現は、構成的であっても誘導性であってもよい。本明細書において提供されるような使用のための誘導性プロモーターは、上に記載される。
本開示の操作されたコンストラクトを含むように改変された哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）は、慣用的な哺乳動物細胞培養法を用いて、培養する（例えば細胞培養中に維持する）ことができる（例えば、本明細書において参考として援用されるPhelan M.C.、Curr Protoc Cell Biol.、2007年9月；第1章：ユニット1.1を参照）。例えば、細胞は、細胞インキュベーター中で、適切な温度および気体混合物で（例えば、哺乳動物細胞のためには３７℃、５％ＣＯ２）、増殖させ、維持することができる。培養条件は、各々の細胞型について異なり得る。例えば、細胞増殖培地は、ｐＨ、グルコース濃度、増殖因子、および他の栄養の存在において異なり得る。培地を補充するために用いられる増殖因子は、しばしば、ウシ胎仔血清（FBS）、仔ウシ血清、ウマ血清および／またはブタ血清などの動物の血液の血清に由来する。いくつかの態様において、本明細書において提供されるように用いられる培養培地は、市販のものであっても、十分に記載されたものであってもよい（例えば、Birch J. R.、R.G. Spier（編）、Encyclopedia of Cell Technology、Wiley、411-424、2000年；Keen M. J.、Cytotechnology 17：125-132、1995年；Zangら、Bio/Technology. 13：389-392、1995年を参照）。いくつかの態様において、化学的に定義される培地を用いる。
また、本明細書において多様な側面において企図されるのは、転写カスケードを含む遺伝子回路を細胞（例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞）内に構築するための方法および組成物である。多くの複雑な遺伝子回路は、１つのステージに組み込まれたシグナルが、プロセッシングおよび動作（actuation）のための複数の下流のステージに伝達されるカスケードを実現する能力を必要とする。例えば、遺伝子カスケードは、生細胞において演算を行う多層人工遺伝子回路などの合成生物学適用のために重要である（Weber and Fussenegger, 2009）。転写カスケードは、卵割、性決定および発達を制御するものなどの天然の制御システムにおいて重要である（Dequeant and Pourquie, 2008；Peel et al., 2005；Sinha et al., 2014）。図６Ａおよび６Ｂは、複数の本開示の操作されたコンストラクトを、単一の細胞中で一緒に転写カスケードを構築するために用いることができる方法の、非限定的な例を提供する。
図６Ａにおいて示されるとおり、細胞は、例えば、第１のgRNA（「gRNA1」）およびmKate2を発現するための「イントロン−Csy4」立体配置を有する第１の操作されたコンストラクト、第２のgRNA（「gRNA2」）およびEYFPを発現するための「三重鎖−Csy4」立体配置を有する第２の操作されたコンストラクト、ならびにECFPを発現するように設計された第３の操作されたコンストラクトで、コトランスフェクトすることができる。細胞はまた、Csy4および転写活性Cas9（taCas9）を発現する。操作されたコンストラクトは、Csy4の存在下においてリボヌクレアーゼを発現した場合、コンストラクトからgRNA1が遊離して、taCas9タンパク質を、第２の操作されたコンストラクトのプロモーター内の相補的gRNA1結合部位へとガイドする（そしてmKate2が発現される）ように、設計される。taCas9タンパク質が、次いで、第２の操作されたコンストラクトの転写を活性化し、それにより、第２のgRNA（「gRNA2」）を生成する（そしてEYFPが発現される）。gRNAは、次いで、taCas9タンパク質を、第３の操作されたコンストラクトのプロモーター内の相補的gRNA2結合部位へとガイドする。taCas9タンパク質は、次いで、第３の操作されたコンストラクトの転写を活性化し、これがECFPを発現する。
図６Ｂにおいて示されるように、細胞は、例えば、各々が「三重鎖−Csy4」立体配置を有する２つの操作されたコンストラクトでコトランスフェクトすることができ、ここで、第１のコンストラクトによりコードされるgRNA（「gRNA1」）は、第２のコンストラクトによりコードされるgRNA（「gRNA2」）とは異なる。図６Ｂにおける各コンストラクトの活性化の機構は、図６Ａにおいて記載される機構と同様である。
本開示は、いくつかの態様において、本明細書において提供される複数の操作されたコンストラクトの発現を企図する。例えば、細胞は、２〜５００個の、またはそれより多くの異なる操作されたコンストラクトを発現してもよい。いくつかの態様において、細胞は、２〜１０、２〜２５、２〜５０、２〜７５、２〜１００、２〜２００、２〜３００または２〜４００個の異なる操作されたコンストラクトを発現してもよい。いくつかの態様において、細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれより多くの異なる本開示の操作されたコンストラクトを発現してもよい。操作されたコンストラクトは、図６Ａにおいて示すように、それらの遺伝子エレメントの立体配置が異なる場合、互いに異なると考えられる。操作されたコンストラクトはまた、図６Ｂにおいて示すように、それらの遺伝子エレメントの立体配置は同じであるが、特定のエレメントが異なる場合、互いに異なると考えられる。
本明細書において提供される遺伝子エレメントは、いくつかの態様においては、モジュール式であり、したがって、細胞が、各コンストラクトが異なる様式において設計されたエレメントの異なる組み合わせを含む、複数の本開示の操作されたコンストラクトを含んでもよい（エレメントが転写の活性化とその後の核酸の発現を許容する様式において設計されることを前提とする）ことが理解されるべきである。例えば、操作されたコンストラクトは、以下を含む核酸に作動的に連結したプロモーター（例えばRNA pol IIプロモーター）を含んでもよい：（ａ）少なくとも１のガイドRNA（gRNA）をコードするヌクレオチド配列；ならびに（ｂ）（ｉ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列および（ｉｉ）RNA干渉分子をコードするヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列。かかる操作されたコンストラクトは、gRNAまたはRNA干渉分子（例えばmiRNA）に隣接するコグネートイントロンスプライス部位をさらに含んでも、これを含まなくてもよい。
gRNAをコードするヌクレオチド配列は、リボヌクレアーゼ認識部位（例えばCsy4認識部位）に隣接してもよく、またはgRNAがリボザイムに隣接してもよい。いくつかの態様において、操作されたコンストラクトは、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接するgRNAをコードするヌクレオチド配列と、リボザイムに隣接するgRNAをコードするヌクレオチド配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、操作されたコンストラクトは、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接するgRNAをコードする第１のヌクレオチド配列と、リボザイムに隣接するgRNAをコードする第２のヌクレオチド配列との組み合わせを含み、ここで、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、コグネートイントロンスプライス部位に隣接する。いくつかの態様において、操作されたコンストラクトは、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接するgRNAをコードする第１のヌクレオチド配列と、リボザイムに隣接するgRNAをコードする第２のヌクレオチド配列との組み合わせを含み、ここで、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、各々、コグネートイントロンスプライス部位に隣接する。いくつかの態様において、操作されたコンストラクトは、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接するgRNAをコードする第１のヌクレオチド配列、および／またはリボザイムに隣接するgRNAをコードする第２のヌクレオチド配列、およびコグネートイントロンスプライス部位に隣接するgRNA（リボヌクレアーゼ認識部位またはリボザイムに隣接しているかまたはこれに隣接していない）をコードするさらなるヌクレオチド配列の組み合わせを含む。
目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、いくつかの態様においてまた、コグネートイントロンスプライス部位に隣接するリボヌクレアーゼ認識部位に隣接するgRNAをコードしてもよい。いくつかの態様において、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接するgRNAはまた、目的のタンパク質内に、RNA干渉分子（例えばmiRNAおよび／またはsiRNA）をコードしていてもよい。
本開示の操作されたコンストラクトは、コンストラクトの特定の立体配置および安定性に依存して、三重らせん構造をコードするヌクレオチド配列を含んでも、これを含まなくてもよい。
本明細書において多様な側面においてまた企図されるのは、細胞の制御回路を「再配線」するための方法および組成物である。CRISPR転写因子に基づく制御は、例えば抑制性アウトプットを不活化するために、および／または他の不活性アウトプットを活性化するために、RNA干渉に組み込んでもよい。図７Ａ〜７Ｆにおいて示されるように、組み込まれた本開示の方法を、遺伝子成分間の複数の相互接続およびフィードバックループを再配線して、回路挙動におけるシフトの同期をもたらすために用いることができる。
したがって、本開示の多様な側面および態様は、RNA干渉およびCRISPRに基づくシステムを調整可能なマルチアウトプット遺伝子制御のために統合する、多機構の遺伝子回路の構築を容易にするために、用いることができる。さらに、リボヌクレアーゼに基づくRNAプロセッシングは、遺伝子成分間の複数の相互接続およびフィードバックループを再配線して、回路挙動におけるシフトの同期をもたらすために用いることができる。
例
例１．RNA三重らせんおよびCsy4による機能的gRNA生成
複雑なCRISPR-TFに基づく回路を可能にするための重要な第１のステップは、ヒト細胞においてRNAP IIプロモーターから機能的gRNAを生成することであり、これが、gRNA生成を特定の調節シグナルにカップリングすることを許容する。例えば、gRNA依存的回路の活性化は、既定の細胞型または状態において、または外部インプットに応答して、開始させることができる。さらに、単一の転写物からタンパク質と共にgRNAを同時発現させる能力は、有益である。このことが、エフェクタータンパク質および調節のリンクを含む複数のアウトプットを、簡潔な遺伝子の立体配置から生成させることを可能にする。それはまた、内在型遺伝子座中へのgRNA発現の組み込みを可能にする。したがって、本例は、内在型RNAP IIプロモーターにより機能的gRNAおよびタンパク質が同時に生成されるシステムを実証する。
本例において、P. aeruginosaからのCsy4タンパク質のRNA結合およびRNAエンドヌクレアーゼの能力（Haurwitz et al., 2012；Sternberg et al., 2012）を利用した。Csy4は、２８ヌクレオチドのRNA配列を認識し（本明細書において以後「28」配列として言及される）、RNAを切断し、上流のRNAフラグメントに結合し続ける（Haurwitz et al., 2012）。したがって、RNAP IIプロモーターにより生成される、機能的なタンパク質配列をもコードする転写物からgRNAを遊離させるために、Csy4を利用した。gRNAを含む転写物を生成するために、強力なCMVプロモーター（CMVp）を用いて、mKate2タンパク質を発現させた。２つのCsy4結合部位に隣接するgRNA（gRNA1）を、mKate2のコード領域の下流にコードさせた（図１Ａ）。この立体配置において、Csy4によるRNA切断は、機能的gRNAを遊離させるが、また上流のmRNA（この場合はmKate2をコードするもの）からポリ（Ａ）テイルを取り除き、殆どの真核生物のmRNAの翻訳を損なう（Jackson, 1993；Proudfoot, 2011）。
ポリ（Ａ）テイルを欠失したmRNAの効率的な翻訳を可能にするために、三重らせん構造を用いて、ポリ（Ａ）の欠失を機能的に補完した。マウスMALAT1遺伝子座の３’末端から誘導された１１０ｂｐのフラグメント（Wilusz et al., 2012）を、mKate2の下流かつCsy4認識部位に隣接するgRNA配列の上流にクローニングした。MALAT1 lncRNAは、多くのヒトのがんにおいて調節解除されており（Lin et al., 2006）、ポリ（Ａ）テイルを欠失するにもかかわらず、MALAT1は、高度に保存された３’三重らせん構造（三重鎖）によりエキソソームおよび３’−５’エキソヌクレアーゼから保護された（Wilusz et al., 2012）安定な転写物である（Wilusz et al., 2008；Wilusz et al., 2012）。したがって、最終的な「三重鎖／Csy4」立体配置は、３’三重鎖配列と、それに続く28-gRNA-28配列とを有するCMVp駆動型mKate2転写物である（CMVp-mK-Tr-28-gRNA-28）（図１Ａ）。
gRNA活性を特徴づけるために、HEK-293T細胞を、CMVp-mK-Tr-28-gRNA1-28発現プラスミドと共に、gRNA1により特異的に活性化されてEYFPを発現する合成P1プロモーターをコードするプラスミドでコトランスフェクトした。P1プロモーターは、gRNA1のための８×の結合部位を含み、最少プロモーターコンストラクトに基づく（Farzadfard et al., 2013）。本実験および以下の実験において（他に示されない限り）、細胞を、CMVプロモーターにより発現される転写活性dCas9-NLS-VP64タンパク質（taCas9）でコトランスフェクトした。HEK-293T細胞を、０〜４００ｎｇのCsy4発現プラスミド（ここでCsy4はマウスPGK1プロモーターにより生成された）と共に、１μｇの他のプラスミドでコトランスフェクトした（生データについては図１Ｂおよび図８Ａ）。
Csy4濃度レベルを増大させることによって、mKate2レベルの低下はもたらされず、代わりに５倍までの増大がもたらされた（図１Ｂ）。さらに、このコンストラクトから生成された機能的gRNAは、P1プロモーターからのEYFP発現を６０倍まで増加させた。mKate2発現がCsy4発現プラスミドの濃度と共に増加し続ける一方で、EYFP活性化は、５０ｎｇのCsy4生成プラスミドの後でプラトーに達した。加えて、４００ｎｇのCsy4プラスミド濃度において細胞毒性の証左が存在した。したがって、その後の実験においては（他に記述される場合を除いて）１００〜２００ｎｇのCsy4プラスミドを用いたが、これは、トランスフェクション後のCsy4陽性細胞の数を減少させる。代替的に、Csy4発現レベルを低下させるためにより弱いプロモーターを用いてもよく、または低レベルまたは中程度のレベルのCsy4を有する安定な細胞株を作製してもよい。
興味深いことに、RNA転写物からgRNAを遊離させるためには、５’Csy4認識部位単独で十分であるべきであるが、このバリアント立体配置は、下流の標的プロモーターをバックグラウンドレベルより上に活性化することができる機能的gRNAを生成しなかった（データは示さず）。理論により拘束されることはないが、このことは、RNA不安定化、ポリ（Ａ）により媒介される細胞質輸送、taCas9活性によるポリ（Ａ）テイルの妨害、または他の機構の結果である可能性がある。
mKate2の発現に対するCsy4およびtaCas9の相対効果を、さらに特徴づけた。Csy4およびtaCas9、Csy4単独、taCas9単独の存在下において、またはいずれのタンパク質も不在で、「三重鎖／Csy4」に基づくgRNA発現コンストラクトからのmKate2の蛍光を測定した（図１Ｃおよび図９）。最も低いmKate2蛍光レベルは、taCas9のみの条件からもたらされた。理論により拘束されることはないが、強力な核移行配列（NLS）を有するtaCas9を用いたため、mRNA内のgRNAへのtaCas9の結合、および転写物の核への局在化から、この効果が生じた可能性がある。この理論は、Csy4の不在下においてすら「三重鎖／Csy4」に基づく立体配置から生成されるgRNAにより、内在プロモーターを活性化させることができることを実証するデータにより、支持される（以下および図１Ｄ、１Ｅを参照）。最も高いmKate2発現レベルは、Csy4単独により得た。このことは、Csy4のプロセッシングがmKate2レベルを増強し得たことを示唆する。Csy4およびtaCas9の両方の不在下における、ならびにCsy4およびtaCas9の両方の存在下におけるmKate2の発現は、類似しており、Csy4のみによる場合と比較して３〜４倍低下した。
例２．ヒトプロモーターから発現されるCRISPR-TFによる内在遺伝子座の調節
「三重鎖／Csy4」立体配置の頑強さを検証するために、それを、ヒト細胞におけるネイティブなゲノム標的の発現を制御するために適応させた。内在IL1RN遺伝子座を、４つの異なるgRNA、gRNA3〜6（表１）の共発現を介する遺伝子活性化の標的とした（Perez-Pinera et al., 2013a）。
４つのgRNAの各々を、各々が別々のプラスミドから、mKate2と同時に発現されるように設計した。４つのgRNAの各セットを、以下のプロモーターのうちの１つにより制御した（HEK-293T細胞におけるそれらの活性レベルに従って降順で）：サイトメガロウイルス最初期（CMVp）、ヒトユビキチンC（UbCp）、ヒトヒストンH2A1 (H2A1p）（Rogakou et al., 1998）、およびヒト炎症性ケモカインCXCL1（CXCL1p）プロモーター（Wang et al., 2006）。対照として、RNAP IIIプロモーターU6（U6p）を用いて、４つのgRNAの発現を駆動した。試験された各プロモーターについて、４つの異なるgRNAをコードする４つのプラスミドを、taCas9およびCsy4を発現するプラスミドと共にコトランスフェクトした。陰性対照として、IL1RNを標的とするgRNA発現プラスミドを、IL1RNプロモーターについて非特異的な、gRNA1を発現するプラスミドで置換した（図１Ｄ、「NS」）。
qRT-PCRを用いて、内在IL1RN遺伝子のmRNAレベルを定量し、結果を、陰性対照に対して正規化した。U6プロモーターにより制御される４つのgRNAにより、IL1RN活性化レベルは、陰性対照に対して、Csy4の不在下において８，４１０倍、１００ｎｇのCsy4発現プラスミドを用いた場合６，４７６倍増大した（図１Ｄ、「U6p」）。CMVプロモーターから発現されるgRNAによるIL1RN活性化は、実質的であり（図１Ｄ、「CMVp」）、Csy4の不在下において６１倍増強され、Csy4を用いた場合１５３９倍増強された。ヒトRNAP IIプロモーターは、Csy4の不在下において約２〜７倍の活性化、Csy4を用いた場合約８５〜３２８倍の活性化をもたらした（図１Ｄ、「CXCL1p」、「H2A1p」、「UbCp」）。
内在遺伝子制御のインプット−アウトプット移行機能をさらに特徴づけるために、各プロモーターにより生成されるmKate2蛍光を、多様なRNAP IIプロモーターについてのインプットプロモーター活性のマーカーとして用いた（図１Ｅ）。もたらされた移行機能は、試験されたmKate2の範囲にわたって、IL1RN活性化においてほぼ直線的であった。このデータは、IL1RN活性化は、試験された条件において飽和しなかったこと、およびヒトRNAP IIプロモーターを用いて内在遺伝子制御の大きなダイナミックレンジを達成することができることを示す。したがって、CRISPR-TFを、「三重鎖／Csy4」立体配置から発現されるgRNAと共に用いて、ネイティブな遺伝子の調整可能な調節を達成することができる。
例３．Csy4によるイントロンからの機能的gRNA生成
「三重鎖／Csy4」立体配置に対する補完として、遺伝子のコード配列中のイントロン内にgRNAをコードすることにより、RNAP IIプロモーターから機能的gRNAを生成するための、代替的な戦略を開発した。具体的には、gRNA1を、「コンセンサス」アクセプター、ドナー、およびブランチ配列を用いて（Smith et al., 1989; Taggart et al., 2012）、mKate2のコード配列内のイントロンとしてコードした（図２Ａ）。予想外に、このシンプルな立体配置は、検出不能なEYFPレベルをもたらした（図１０、下のパネル）。理論により拘束されることはないが、何らかの安定化を行わないと、イントロンgRNAは、急速に分解すると考えられる。
イントロンgRNAを安定化するために、長命のイントロンを生成するイントロン配列を用いた。これらは、安定な環状イントロンを形成するHSV-1潜伏期関連イントロン（Block and Hill, 1997）、およびsno-lncRNA2（snoRNA2）イントロンなどの配列を含む。snoRNA2イントロンは、両端においてsnoRNA機構によりプロセッシングされる。これは、snoRNA2イントロンを分解から保護し、５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）テイルを欠失したsnoRNA配列に隣接するIncRNAの蓄積をもたらす（Yin et al., 2012）。しかし、安定なイントロンgRNAを生成するためのこれらのアプローチもまた、標的プロモーターの検出不能な活性化をもたらした（データは示さず）。
代替的な戦略として、gRNAカセットを２つのCsy4認識部位に隣接させることにより、イントロンgRNAを安定化させた。理論により拘束されることはないが、スプライシングされたgRNA含有イントロンは、Csy4に結合しているはずであり、これは、機能的gRNAを遊離するはずである。「三重鎖／Csy4」のセッティングとは対照的に、Csy4はまた潜在的に、スプライシングが起こる前にmRNA前駆体に結合し、これを消化することができる。この場合、機能的gRNAが生成されるであろうが、mKate含有mRNA前駆体は、該プロセスにおいて破壊されるであろう（図２Ａ）。したがって、Csy4濃度の増加は、mKate2レベルの低下をもたらすが、より高いレベルの機能的gRNAをもたらすと予想されるであろう。理論により拘束されることはないが、この立体配置において、Csy4濃度に伴うmKate2レベルの低下および機能的gRNAの増加は、図２Ａにおいて説明されるいくつかの要因に依存すると予想した（黒色の線、Csy4非依存的プロセス；灰色の線、Csy4により媒介されるプロセス）。これらの競合する要因として、Csy4がその標的部位に結合してRNAを切断する速度、スプライシングの速度、およびCsy4の不在下におけるスプライシングされたgRNAの分解の速度が挙げられる。「イントロン／Csy4」立体配置の挙動を試験するために、CMVプロモーターを用いて、EYFPの発現を制御する合成P1プロモーターと共に、HSV1、snoRNA、および２つのCsy4結合部位に隣接するgRNA1を含むコンセンサスイントロン（CMVp-mKEX1-[28-g1-28]イントロン-mKEX2）で、mKate2の発現を駆動させた（図２Ａ）。
Csy4の存在は、EYFP活性化により決定されたように、機能的gRNA1を生成した（図２Ｂ〜２Ｄおよび生データについては図８Ｂ）。HSV1イントロンから生成されたgRNA1は、最も強力なEYFP活性化をもたらし（図２Ｄ）、これは、２００ｎｇのCsy4プラスミドで飽和に達した。対照的に、snoRNA2イントロンは、５０ｎｇのCsy4プラスミドでEYFP発現を飽和させたが、このイントロンによりもたらされる最大EYFPレベルは、試験された全てのイントロンのうちの最低であった（HSV1イントロンの約６５％）。加えて、Csy4レベルの増大は、同時にmKate2レベルを低下させた。これらの傾向は、試験された３つ全てのイントロンについて同様であったが、一方で、効果の規模はイントロン特異的であった。snoRNA2イントロンは、Csy4プラスミド濃度を増加させることにより、mKate2レベルの最大の低下を示し、Csy4なしの条件と比較して、４００ｎｇのCsy4プラスミドで、mKate2蛍光は１５倍低下した（図２Ｃ）。コンセンサスおよびHSV1イントロンは、Csy4レベルの増大に対してより感受性が低いmKate2レベルを示した（図２Ｂおよび２Ｄ）。したがって、「三重鎖／Csy4」立体配置と一緒に、「イントロン／Csy4」アプローチは、翻訳された遺伝子からの機能的gRNAの調整可能な生成のための部分のセットを提供する。特に、gRNA含有遺伝子および下流の標的遺伝子の絶対的なタンパク質レベル、ならびにそれらの間の比率は、Csy4の特異的部位および濃度の選択により決定することができる。
例４．Csy4とイントロンgRNAとの間の相互作用
５’および３’の両方のCsy4認識部位が、イントロンからの機能的gRNA生成のために必要であるか否かを決定するために、mKate2内にHSV1に基づくイントロンを用いた。このイントロンは、その５’側がCsy4結合部位に先行されるか（「28-gRNA」、図２Ｅおよび図１１）、またはその３’末端にCsy4結合部位が続く（「gRNA-28」、図２Ｆおよび図１１）、いずれかのgRNA1配列を保有する。合成P1-EYFPコンストラクトを用いて、gRNA1活性を評価した。図２Ｅおよび２Ｆについてのデータを、イントロンgRNA1が２つのCsy4結合部位に隣接する「イントロン／Csy4」立体配置の性能により正規化した（「28-gRNA-28」、図１１）。１つのみのCsy4結合部位を含む両方の立体配置は、Csy4の添加により、Csy4なしと比較して低下したmKate2レベルを有した（図２Ｅ、２Ｆ）。
対照的に、gRNA1により指揮されるCRISPR-TFによる下流のEYFPの活性化は、単一のCsy4結合部位の立体配置（図２Ｅ、２Ｆ）について、「イントロン／Csy4」コンストラクト（図２Ｄ）と比較して、著しく低かった。１つのみのCsy4結合部位をgRNA1イントロンの５’末端に位置させた場合、EYFP発現は検出可能ではなかった（図２Ｅ）。１つのみのCsy4結合部位をgRNA1イントロンの３’末端に位置させた場合、gRNA1に隣接するCsy4認識部位を含む「イントロン／Csy4」立体配置（図２Ｄ）と比較して、６倍のEYFPレベルの低下が観察された（図２Ｆ）。理論により拘束されることはないが、Csy4が、イントロンgRNAを安定化させることに役立ち得る可能性がある。例えば、Csy4で切断されたRNAの５’末端は、ヒドロキシル（ＯＨ−）を含み、これは、基質認識のために５’リン酸を必要とするXRNファミリーなどの主要な５’−＞３’の細胞のRNaseから、それらを保護し得る（Houseley and Tollervey, 2009；Nagarajan et al., 2013）。加えて、切断されたgRNAの３’末端へのCsy4タンパク質の結合（Haurwitz et al., 2012）は、真核生物エキソソーム複合体により媒介される３’−＞５’分解からそれを保護し得る（Houseley and Tollervey, 2009）。
例５．シス作用性リボザイムによる機能的gRNA生成
上記の「三重鎖／Csy4」および「イントロン／Csy4」に基づく機構に加えて、自己切断型リボザイムもまた、ヒト細胞におけるRNAP IIプロモーターから生成されたgRNAを介した遺伝子制御を可能にするために使用した。具体的には、図３において示すとおり、gRNAを、その５’末端にハンマーヘッド型（ＨＨ）リボザイム（Pley et al., 1994）を、その３’末端にHDVリボザイム（Ferre-D'Amare et al., 1998）を含むように操作した。いずれもCMVpにより駆動される３つの異なる立体配置におけるリボザイムを試験した：（１）mKate2転写物の後に三重鎖およびHH-gRNA1-HDV配列が続く（CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV、図３Ａ）；（２）mKate2転写物の後にHH-gRNA1-HDV配列が続く（CMVp-mK-HH-g1-HDV、図３Ｂ）；および（３）配列HH-gRNA1-HDVのみで、関連するタンパク質コード配列を有さない（CMVp-HH-g1-HDV、図３Ｃ）。これらの立体配置から生成されたgRNAを、先に記載したRNAP IIIプロモーターU6および「三重鎖／Csy4」立体配置により（２００ｎｇのCsy4プラスミドで）生成されたgRNAと比較した。全てのコンストラクトが、P1-EYFP含有プラスミドからのEYFPの発現を駆動するgRNA1を利用した。
mKate2を含む全てのコンストラクトが、検出可能な蛍光レベルを示した（図３Ｄおよび図１２）。驚くべきことに、これはCMVp-mK-HH-g1-HDVを含んだ。CMVp-mK-HH-g1-HDVは三重鎖配列を有さず、それにより、ポリ（Ａ）テイルの除去に起因して低いmKate2レベルを有すると予測されていた。理論により拘束されることはないが、このことは、非効率的なリボザイム切断に起因している可能性があり（Beck and Nassal, 1995；Chowrira et al., 1994；R Hormes, 1997）、これにより、プロセッシングされなかった転写物が細胞質へ輸送されて翻訳されること、つまり残りの３’リボザイム配列または他の機構によるmKate2転写物の保護が可能となる。アウトプットEYFPの活性化に関して、U6pにより発現されたgRNAから最も高いEYFP蛍光レベルがもたらされ、CMVp-HH-g1-HDVおよびCMVp-mK-HH-g1-HDVコンストラクトが続いた（図３Ｄ）。CMVp-mK-Tr-HH-gRNA1-HDVおよび「三重鎖／Csy4」立体配置は、類似のEYFPレベルを有した。
シス作用性リボザイムは、有用であり、RNAP IIプロモーターからの機能的gRNA発現を媒介する。テオフィリンなどの外部リガンドにより制御されることができる活性を有するリボザイムもまた、外因的にgRNA遊離を惹起するために用いることができる。しかし、かかる戦略は、細胞内リボザイム活性を、単一の細胞内で生じる内在型シグナルに関連付けることはできない。対照的に、以下に示すように、遺伝子によりコードされるCsy4の発現を、RNAにより指揮される遺伝子回路を再配線してそれらの挙動を変更するために用いることができる（図７）。したがって、トランス作用性リボザイムを、RNA切断およびgRNA生成を細胞内イベントに関連付けるために用いることができる。
例６．単一のRNA転写物からのマルチプレックスなgRNA発現
単一のRNA転写物からの２つの独立したgRNAの発現が２つの独立した下流のプロモーターを活性化することを実証するために、２つの立体配置を用いた。第１の立体配置（「イントロン−三重鎖」）において、gRNA1を、mKate2のコード配列内の２つのCsy4結合部位に隣接するHSV1イントロン内にコードした。さらに、２つのCsy4結合部位に囲まれたgRNA2を、mKate2−三重鎖配列の下流にコードした（図４Ａ、CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV1-mKEX2-Tr-28-g2-28）。第２の立体配置（「三重鎖−タンデム」）において、gRNA1およびgRNA2の両方を、Csy4結合部位で囲み、mKate2−三重鎖配列の下流でタンデムに配置した（図４Ｂ、CMVp-mK-Tr-28-g1-28-g2-28）。いずれの立体配置においても、gRNA1およびgRNA2は、それぞれ、合成プロモーターP1-EYFPおよびP2-ECFPを標的とした。
図４Ｃにおいて示すとおり（生データについては図１３を参照）、いずれの戦略も、活性なマルチプレックスなgRNA生成をもたらした。「イントロン−三重鎖」コンストラクトは、２００ｎｇのCsy4プラスミドの存在下において、Csy4なしと比較して、３倍のmKate2の低下、１０倍のEYFPの増大、および１００倍のECFPの増大を示した。「三重鎖−タンデム」立体配置において、２００ｎｇのCsy4プラスミドの存在下において、Csy4なしと比較して、mKate2、EYFPおよびECFPの発現はそれぞれ、３倍、３６倍、および６６倍増大した。「イントロン−三重鎖」立体配置は、「三重鎖−タンデム」コンストラクトと比較してより高いEYFPおよびECFPのレベルを有した。したがって、マルチプレックスなgRNA発現のためのいずれの戦略も、複数の下流の標的に対して機能的なCRISPR-TF活性を可能にし、所望される適用のために調整することができる。
マルチプレックスなコンストラクトのスケーラビリティをさらに調べるために、および内在遺伝子座をターゲティングすることにおけるその有用性を実証するために、４つの異なるgRNA種を単一の転写物から生成させた。IL1RN活性化のために必要とされる４つのgRNAを、Csy4結合部位により分離して、単一の転写物上で、mKate2−三重鎖配列の下流でタンデムにクローニングした（図５Ａ）。マルチプレックスな単一転写物コンストラクトによるIL1RN活性化を、４つの異なるgRNAが４つの異なるプラスミドから発現される立体配置と比較した（図５Ｂ、それぞれ「マルチプレックス」対「非マルチプレックス」）。１００ｎｇのCsy4プラスミドの存在下において、マルチプレックスな立体配置は、非特異的gRNA1（「NS」）に対して約１１１１倍の活性化をもたらし、単一のgRNA発現するプラスミドの非マルチプレックスなセットよりも約２．５倍効率的だった。さらに、マルチプレックスな立体配置により、Csy4の不在下においてすら、約１５５倍のIL1RN活性化を検出した。このことは、Csy4が存在しないにもかかわらず、taCas9がgRNAに結合して、それらを遺伝子活性化のために動員することができることを示唆する。これらの結果は、複数の機能的gRNAを、単一のコンサイスなRNA転写物からのマルチプレックスな発現のためにコードすることが可能であることを実証する。したがって、これらの立体配置は、内在遺伝子を調節するために、および潜在的に条件的なマルチプレックスなゲノム編集を達成するために、マルチアウトプット合成遺伝子回路を実現するためのCas9の機能のコンパクトなプログラミングを可能にする。
例７．RNAによりガイドされる制御による合成転写カスケード
RNA依存的調節性コンストラクトの有用性を実証するために、それを、本明細書において、第１のCRISPR-TFに基づく転写カスケードを作製するために用いた。「三重鎖／Csy4」および「イントロン／Csy4」戦略を統合して、２つの異なる３ステージのCRISPR-TFにより媒介される転写カスケードを構築した（図６）。第１のデザインにおいて、CMVpにより駆動される「イントロン／Csy4」コンストラクトからのgRNA1の発現は、HSV1イントロンからgRNA1を生成し、これが、合成プロモーターP1を活性化して「三重鎖／Csy4」立体配置からgRNA2を生成し、これが次いで、ECFPを制御する下流の合成プロモーターP2を活性化した（図６Ａ）。第２のデザインにおいて、カスケードの第１のステージにおけるイントロンgRNA発現カセットを、gRNA1を発現させるための「三重鎖／Csy4」立体配置で置き換えた（図６Ｂ）。これら２つのデザインを、２００ｎｇのCsy4プラスミドの存在下において試験した（図６Ｃ、６Ｄおよび図１４）。
第１のカスケードデザインにおいて、カスケードの第２のステージ（P1-EYFP-Tr-28-g2-28）が空のプラスミドで置き換えられている対照と比較して、７６倍のEYFPの増大および１３倍のECFPの増大が観察された（図６Ｃ）。第２のカスケードデザインにおいて、カスケードの第２のステージ（P1-EYFP-Tr-28-g2-28）が空のプラスミドで置き換えられている対照と比較して、３１倍のEYFPの増大および２１倍のECFPの増大が観察された（図６Ｄ）。これらの結果は、gRNA1によるプロモーターP2の非特異的活性化は最小限であることを実証し、このことは、転写カスケードのスケーラビリティおよび信頼性のために必須である。さらに、カスケード中の各ステージの活性化の倍率は、正しく機能する転写カスケードにおいて予測される全ての上流のノードの存在に依存した（図６Ｃ、６Ｄ）。
例８．RNA依存的合成調節回路の再配線
以下の実験は、より洗練された回路トポロジーを実現するために、どのようにしてCRISPR-TFの制御を哺乳動物のRNA干渉に統合することができるかを実証することを目的とした。さらに、以下の実験は、どのようにしてネットワークモチーフをCsy4に基づくRNAプロセッシングに基づいて再配線することができるかを示した。具体的には、コグネートなmiRNA結合部位を取り除くことにより、miRNAの制御をCRISPR-TFに組み入れ、Csy4を用いて標的RNAのmiRNAの阻害を妨害した。機能的miRNA（Greber et al., 2008; Xie et al., 2011）および機能的gRNAの両方を発現することができる単一のRNA転写物を構築した。これは、哺乳動物miRNAを、mKate2遺伝子内のコンセンサスイントロン内部にコードし、その後に三重鎖配列と、Csy4認識部位に隣接するgRNA1配列とを続けることにより達成した（図７Ａ、CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28）。また、操作されたコンストラクトによるマルチプレックスな遺伝子制御のための潜在能力を実証するために、２つのアウトプットコンストラクトを実現した。第１のアウトプットは、構成的に発現されたECFP遺伝子と、その後に続く三重鎖配列、Csy4認識部位、８×miRNA結合部位（８×miRNA-BS）、および別のCsy4認識部位であった（図７Ａ）。第２のアウトプットは、EYFP発現を制御する合成P1プロモーターであった（図７Ａ）。
Csy4の不在下において、ECFPおよびEYFPのレベルは低かった。なぜならば、miRNAがECFP発現を抑制し、機能的gRNA1が生成されないからである（図７Ｂおよび図１５「機構１」）。Csy4の存在下において、ECFP発現は、Csy4なしの条件と比較して３０倍増加した。本発明者らは、これは、Csy4により誘導される、ECFP転写物からの８×miRNA-BSの分離が原因であると考える（図７Ｂ）。さらに、Csy4の存在は機能的gRNA1を生成し、Csy4なしの条件と比較して１７倍高いEYFP発現をもたらした（図７Ｂ）。mKate2蛍光レベルは、Csy4陽性およびCsy4陰性の両方の条件において高かった。したがって、Csy4は、抑制性のアウトプットリンクを不活化し、同時にアウトプットリンクを活性化することを可能にすることにより、インプットノードとその２つのアウトプットとの間の回路の接続の、RNAに基づく再配線を触媒した（図７Ｃ）。
容易な性質によりRNA依存的機構を用いてさらなる回路トポロジーをプログラムすることができることを実証するために、図７Ａにおけるデザインを、mKate含有転写物の３’末端にさらなる４×miRNA-BSを組み込むことにより拡張した（図７Ｄ、CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28-miR4xBS）。Csy4の不在下において、これは、mKate2イントロン内で生成されたmiRNAによる、mKate2発現の自己調節性ネガティブフィードバック抑制をもたらした（図７Ｅおよび図１５「機構２」）。加えて、ECFPおよびEYFPの両方のレベルは、miRNAによるECFPの抑制および機能的gRNA1生成の欠如に起因して、低いままであった。しかし、Csy4の存在下において、Csy4により媒介されるmKate2転写物からの４×miRNA-BSの分離に起因して、mKate2レベルは２１倍増大した。さらに、miRNAによるECFP阻害は、類似の様式において緩和され、２７倍のECFPレベルの増加をもたらした。最終的に、機能的gRNA1が生成され、５０倍のEYFPレベルの増大をもたらした（図７Ｅ）。したがって、Csy4は、抑制性のアウトプットリンクを不活化し、同時にアウトプットリンクを活性化することを可能にし、自己調節フィードバックループを不活化することにより、インプットノードとその２つのアウトプットとの間の回路の接続の、RNAに基づく再配線を触媒した（図７Ｆ）。
合成生物学は、天然のネットワークモチーフを妨害し、再配線し、模倣することにより、天然の制御ネットワークを研究するためのツールを提供する。加えて、合成回路は、生物医学的適用に取り組むために、および細胞の演算（computation）を行うために、外因性シグナルを内在遺伝子制御に関連付けるために用いることができる。多くの合成遺伝子回路は転写の制御に基づくが、RNAに基づく制御は、多様な合成遺伝子回路を構築するために用いることができる。多くの進歩にもかかわらず、先の努力は、まだRNAに基づく制御をCRISPR-TFに統合していない。これらは、それらのプログラム可能性および多重化についての潜在能力を考慮すると、いずれもスケーラブルな遺伝子回路を実現するために有望な戦略である。本明細書において提供されるのは、人工遺伝子回路の操作およびヒト細胞における内在遺伝子制御のためのコンストラクトである。このフレームワークは、哺乳動物RNA調節機構を、細菌からのRNA依存的タンパク質dCas9、およびRNAプロセッシングタンパク質Csy4に組み込む。さらに、それは、核酸の間の塩基対相補性に基づいて、制御リンクの便利なプログラミングを可能にする。
本明細書においていくつかの態様において提供されるのは、RNAP IIプロモーターにより制御されるタンパク質のコード配列から機能的gRNAを生成するための、複数の相補的アプローチであり、これはまた、目的のタンパク質の同時発現を許容する。用いられた遺伝子は、蛍光遺伝子である。なぜならば、それらはプロモーター活性の便利なレポーターであるからである。しかし、これらの遺伝子は、任意の他のタンパク質をコードする配列と容易に交換することができ、それにより、単一のコンストラクトからの任意のタンパク質アウトプットと共にマルチプレックスなgRNAの発現を可能にする。これらの戦略が、合成プロモーターをターゲティングすることにより機能的gRNAを生成する能力を、Csy4によるRNA三重鎖、Csy4によるRNAイントロン、およびシス作用性リボザイムに基づいて検証した。さらに、gRNAがCsy4認識部位に隣接し、遺伝子の下流に位置し、その後にRNA三重鎖が続いていた場合、遺伝子のレベルは、Csy4のレベルと共に増大した。gRNAがイントロン中のCsy4認識部位に隣接していた場合は、逆の効果が見出され、効果の規模は、用いられたイントロンの特定の配列に基づいて変化した。したがって、これらの相補的立体配置は、合成遺伝子回路内で調整可能なRNAおよびタンパク質レベルを達成することを可能にする。
合成回路の補完として、複数の異なるヒトRNAP IIプロモーター、ならびにCMVプロモーターから、内在プロモーターを活性化するために、本開示の操作されたコンストラクトを用いることができる。本明細書においていくつかの態様において提供されるのは、合成およびネイティブのプロモーターの両方を調節するための、コンパクトな単一の転写物からのマルチプレックスなgRNA発現のための新規の戦略である。この特徴は、例えば、単一のノードから複数のノードを制御するために用いることができるため、有用である。単一の転写物内に複数のgRNAを簡潔にコードする能力は、多数のパラレルな「ファンアウト（fan-out）」（例えば、所与のノードからの外向きの相互接続）および高密度の相互接続を有するネットワークを備えた洗練された回路を可能にする。さらに、いくつかのgRNAにより凝縮された様式において内在遺伝子座を相乗的に調節する能力は有利である。これは例えば、ネイティブなプロモーターの実質的な調節を規定するためにはしばしば複数のgRNAが必要とされるからである。したがって、本明細書において記載される操作されたコンストラクトは、いくつかの例において、効率的な人工遺伝子ネットワークを構築するために、およびネイティブな制御ネットワークを妨害するために、用いることができる。
転写の制御に加えて、ヌクレアーゼ能力があるCas9は、いくつかの態様において、マルチプレックスなゲノム編集活性を、gRNA発現の制御を介して細胞のシグナルに条件的に関連付けるために、taCas9の代わりに用いることができる。このことは、in vivoのセッティング内での条件的なマルチプレックスなノックアウトを可能にする（例えば、細胞特異的、時間的または空間的制御）。遺伝子研究に加えて、この能力を、いくつかの態様において、細胞のイベントを変異に関連付ける、in vivoでのDNAに基づく「ティッカーテープ」を作製するために用いることができる。
これらの立体配置は、いくつかの態様において、ヒト細胞における洗練されコンパクトな合成遺伝子回路の構築のための基礎を築く。理論により拘束されることはないが、操作されたコンストラクトによる調節的相互接続の特異性はRNA配列によってのみ決定されるので、ほぼあらゆるネットワークトポロジーを有するスケーラブルな回路を構築することができる。例えば、多層ネットワークトポロジーは、人工および天然の両方の遺伝子的文脈において洗練された挙動を達成するために重要である。したがって、より複雑な合成回路を実現するための本発明のコンストラクトの有用性を実証するために、それらを用いて第１のCRISPR-TFに基づく、高度に特異的かつ有効な転写カスケードを作製した。本明細書において提供される例により実証されるのは、RNA三重鎖、イントロン、Csy4およびCRISPR-TFを組み込んだ２つの異なる立体配置を有する、信頼し得る３ステップの転写カスケードである。カスケードの異なるステージの間の望ましくないクロストークの不在は、合成遺伝子回路デザインのためのRNA依存的制御スキームの直交性およびスケーラビリティを強調する。マルチプレックスなgRNA発現を転写カスケードと組み合わせることにより、いくつかの例において、内在システムを論理的に接続し、演算し、これを仲介することができる、マルチステージ、マルチインプット／マルチアウトプットの遺伝子ネットワークを作製するために用いることができる。加えて、マルチステージフィードフォワードおよびフィードバックループなどの有用なトポロジーは、いくつかの態様において、容易にプログラミングすることができる。
さらに、CRISPR-TFおよびRNA干渉などのRNA調節部を、一緒に統合して、条件的RNAプロセッシングを介して再配線することができる、多様な回路トポロジーを作製した。同じtaCas9タンパク質を用いて正および負の両方の制御が可能であり、miRNAは調整可能な負の調節を規定するので、この調節部のセットを用いて多くの重要な多成分ネットワークトポロジーを実現することができる。加えて、Csy4は、例えば、RNA転写物を改変することにより遺伝子発現の変化を触媒させるために用いることができる。例えば、機能的gRNAを転写の調節のために遊離させ、RNA転写物からmiRNA結合部位を取り除いてmiRNAに基づくリンクを除去した。加えて、Csy4の存在または不在を、miRNAに基づく自己調節型ネガティブフィードバックループの、それぞれオンとオフを切り替えるために用いた（図７Ｂ）。この特徴は、いくつかの態様において、ポジティブフィードバックループにおける望ましくない漏れを最小化するために、および異なる状態の間で回路を動的に切り替えるために、回路において拡張することができる。Csy4発現を、例えば内在プロモーターに関連付けることにより、回路とネットワーク挙動との間の相互接続をまた、特定の組織、イベント（例えば細胞周期、突然変異）、または環境条件に、条件的に関連付けることができる。Csy4に対するゲノムマイニングまたは定方向突然変異誘発により、より複雑なRNAプロセッシングスキームのために直交性のCsy4バリアントを用いることができる。さらに、直交性のCas9タンパク質を用いることにより、さらなる柔軟性およびスケーラビリティを達成することができる。
まとめると、本開示は、スケーラブルな制御遺伝子回路を構築し、それらを調整し、回路の成分間の連結を改変し、ネットワークにおける複数の遺伝子の発現を同期させるための多様なコンストラクトのセットを提供する。さらに、これらの調節部は、いくつかの態様において、内在システムにより合成遺伝子回路を仲介するために、ならびに内在型ネットワークを再配線するために用いることができる。RNA依存的制御機構をRNAプロセッシングに組み込むことは、洗練された転写の制御および転写後の制御を可能にし、合成生物学を加速させ、ヒト細胞における基礎生物学の研究を促進するであろう。
プラスミド構築
CMVp-dCas9-3xNLS-VP64（taCas9、コンストラクト1、表２）プラスミドを、先に記載されるように構築した（Farzadfard et al., 2013）。Pseudomonas aeruginosaの株UCBPP-PA14（Qi et al., 2012）からのcsy4遺伝子を、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化し、Ｎ末端6x-HisタグおよびTEV 認識配列を含むようにPCRで増幅し、PGK1-EBFP2プラスミド中のHindIII/SacI部位の間のPGK1プロモーターの下流にクローニングして（Farzadfard et al., 2013）、PGK1p-Csy4-pAを作製した（コンストラクト２、表２）。
プラスミドCMVp-mKate2-Triplex-28-gRNA1-28-pA（コンストラクト３、表２）は、GIBSON ASSEMBLY（登録商標）を用いて、適切な相同オーバーハングを有して増幅した、３つの部分から構築した：１）mKate2の全長コード配列；２）マウスMALAT1の３’三重らせんの最初の１１０塩基対（ｂｐ）（Wilusz et al., 2012）；ならびに３）２８ヌクレオチド（ｎｔ）のCsy4認識部位と共に、２０ｂｐの特異性決定配列（SDS）およびS. pyogenesのgRNA足場を含むgRNA1。
レポータープラスミドP1-EFYP-pA（コンストラクト5、表２）およびP2-ECFP-pA（コンストラクト６、表２）は、８個のgRNA1結合部位のリピートおよび８個のgRNA2結合部位リピートを、pG5-Luc（Promega）のNheI部位中に、相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングすることを介してクローニングすることにより構築した。次いで、EYFPおよびECFPを、それぞれNcoI/FseI部位中にクローニングした。
プラスミドCMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-pA（コンストラクト４、表２）は、適切な相同オーバーハングにより、以下の部分のGIBSON ASSEMBLY（登録商標）により構築した：１）mKate2のmKate2_EX1（ａ．ａ．１〜９０）；２）mKate2のmKate_EX2（ａ．ａ．９１〜２３９）；ならびに３）Csy4認識部位ならびにHSV1アクセプター、ドナーおよびブランチ配列に隣接する、２０ｂｐのSDSと、それに続くS. pyogenesのgRNA足場を含むgRNA1。コンセンサスおよびSnoRNA2アクセプター、ドナー、およびブランチ配列を含み、Csy4認識配列を有するかまたはこれを有さない、CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-pAプラスミドのバリエーション（コンストラクト８〜１２、表２）を、類似の様式において構築した。
リボザイム発現プラスミドCMVp-mKate2-Triplex-HHRibo-gRNA1-HDVRibo-pAおよびCMVp-mKate2-HHRibo-gRNA1-HDVRibo-pAプラスミド（それぞれコンストラクト１３および１４、表２）は、XmaIで消化したCMVp-mKate2およびPCRで伸長させたgRNA1のアンプリコン（三重鎖を有するかまたはこれを有さず、５’末端にHHRibo（Gao and Zhao, 2014）を、３’末端にHDVRibo（Gao and Zhao, 2014）を含むもの）のGIBSON ASSEMBLY（登録商標）により構築した。プラスミドCMVp-HHRibo-gRNA1-HDVRibo-pA（コンストラクト１５、表２）は、SacIで消化したCMVp-mKate2およびPCRで伸長させたgRNA1のアンプリコン（５’末端にHHRiboを、３’末端にHDVRiboを含むもの）のGIBSON ASSEMBLY（登録商標）により、同様に構築した。
プラスミドCMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-Triplex-28-gRNA2-28-pA（コンストラクト１６、表２）は、適切な相同性を用いて、以下の部分のGIBSON ASSEMBLY（登録商標）により構築した：１）XmaIで消化したCMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-pA（コンストラクト４、表２）、および２）CMVp-mKate2-Triplex-28-gRNA1-28-pA（コンストラクト３、表２）からのPCR増幅したTriplex-28-gRNA2-28 。
プラスミドCMVp-mKate2-Triplex-28-gRNA1-28-gRNA2-28-pA（コンストラクト１７、表２）は、適切な相同性を用いて、以下の部分のGIBSON ASSEMBLY（登録商標）により構築した：１）XmaIで消化したCMVp-mKate2-Triplex-28-gRNA1-28-pA（コンストラクト３、表２）、および２）PCR増幅した28-gRNA2-28。
プラスミドCMVp-mKate2-Triplex-28-gRNA3-28-gRNA4-28-gRNA5-28-gRNA6-28-pA（コンストラクト１９、表２）は、ＩＩ型制限酵素BsaIを用いるGolden Gateアプローチを用いて構築した。具体的には、S. pyogenesのgRNA足場と共に２０ｂｐのSDSを含むgRNA3、gRNA4、gRNA5、gRNA6配列を標的とするIL1RNを、その５’末端にBsaI制限部位を、その３’末端にCsy4「28」およびBsaI制限部位を含むように、PCRで増幅した。PCR増幅産物を、３０回の交代の消化のサイクルに供し、その後、それぞれ３７℃および２０℃におけるライゲーションを行った。gRNA3-28-gRNA4-28-gRNA5-28-gRNA6-28アレイを含む５４０ｂｐのPCR産物を増幅し、NheI/XmaIで消化し、CMVp-mKate2-Triplex-28-gRNA1-28-pAプラスミド（コンストラクト３、表２）中にクローニングした。
イントロン性FF4（合成miRNA）を含むCMVp-mKate2_EX1-[miRNA]-mKate2_EX2-pAプラスミドは、Lila Wroblewskaから寄贈として受領した。合成FF4 miRNAを、コンセンサスアクセプター、ドナーおよびブランチ配列を有するイントロン中に、mKate2のａ．ａ．９０と９１との間でクローニングして、CMVp-mKate2_EX1-[miRNA]-mKate2_EX2-Triplex-28-gRNA1-28-pA（コンストラクト２０、表２）およびCMVp-mKate2_EX1-[miRNA]-mKate2_EX2-Triplex-28-gRNA1-28-4xFF4BS-pA（コンストラクト２１、表２）を作製した。
プラスミドCMVp-ECFP-Triplex-28-8xmiRNA-BS-28-pA（コンストラクト２２、表２）は、以下の部分を用いるGIBSON ASSEMBLY（登録商標）を介してクローニングした：１）ECFPの全長コード配列、および２）両端に８個のFF4 miRNA結合部位およびCsy4認識配列を含むオリゴヌクレオチドを用いてPCR伸長を介して増幅した、１１０ｎｔのMALAT1の３’三重らせん配列。
細胞培養およびトランスフェクション
HEK293T細胞は、American Tissue Collection Center（ATCC）から入手し、１０％ウシ胎仔血清（FBS）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％のGlutaMAX、非必須アミノ酸を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。HEK293T細胞は、FuGENE（登録商標）HDトランスフェクション試薬（Promega）を用いて、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。各トランスフェクションは、６ウェルプレートにおいて、１ウェルあたり２００，０００個の細胞を用いて行った。対照として、CMVプロモーターがmKate2を制御する２μｇの単一のプラスミドを用いて、トランスフェクション効率は、常に９０％よりも高かった（実験と同じセッティングで行われたフローサイトメトリーにより決定した）。他に示されない限り、各々のプラスミドを、１μｇ／試料でトランスフェクトした。特に示されない限り、全ての試料をtaCas9でトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの７２時間後に、フローサイトメトリーまたはqRT-PCR分析のために処理した。
定量逆転写PCR（RT-PCR）
従った実験手順は、Perez-Pinera et al., 2013aにおいて記載されるとおりであった。細胞を、トランスフェクションの７２時間後に採取した。RNeasy Plus RNA単離キット（Qiagen）を用いて、総RNAを単離した。qScript cDNA SuperMix（Quanta Biosciences）を用いて、cDNA合成を行った。PerfeCTa SYBR Green FastMix（Quanta Biosciences）を用いたリアルタイムPCRを、Mastercycler ep realplexリアルタイムPCRシステム（Eppendorf）により、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った：IL1RN−フォワードＧＧＡＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＧＡＡＧＡＴ（配列番号２２）、リバースＴＧＴＴＣＴＣＧＣＴＣＡＧＧＴＣＡＧＴＧ（配列番号２３）；GAPDH−フォワードＣＡＡＴＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣ（配列番号２４）、リバースＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号２５）。プライマーは、Primer3Plusソフトウェアを用いて設計し、IDTから購入した。融解曲線分析により、プライマー特異性を確認した。標準曲線の直線性を確実にするために、適切なダイナミックレンジにわたる反応効率を計算した。GAPDH発現に対して正規化した目的の遺伝子のmRNA発現の増加倍率は、ｄｄＣｔ法により計算した。本発明者らは、次いで、mRNAレベルを、非特異的なgRNA1対照条件に対して正規化した。報告される値は、３回の独立した生物学的複製の平均値であり、技術的複製は、各々の実験について平均した。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を表す。
フローサイトメトリー
細胞を、トリプシンを用いて、トランスフェクションの７２時間後に採取し、DMEM培地および１×PBSで洗浄し、１×PBSでフローサイトメトリー管中に再懸濁し、すぐにBecton Dickinson LSRII Fortessaフローサイトメーターでアッセイした。各データセットにおける試料ごとに、少なくとも５０，０００個の細胞を記録した。各実験の結果は、少なくとも３回の生物学的複製からのデータを表す。エラーバーは、蛍光値の加重中央値に対するｓ．ｅ．ｍ．である（データ分析についての詳細な情報については、Extended Experimental Proceduresを参照）。
コンペンセーション対照
コンペンセーション対照は、厳密であり、真陽性細胞を取り除くという代償を払っても偽陽性細胞を除去するために設計された。コンペンセーションは、BD FACSDiva（バージョン番号6.1.3；BD Biosciences）を用いて、詳しくは以下のとおり行った：
フローサイトメトリー分析
コンペンセーションフローサイトメトリーの結果を、FlowJoソフトウェア（vX.0.7r2）を用いて分析した。計算は、以下のように行った：
全ての試料を、細胞の凝集塊および壊死組織片を除外するために、ゲーティングした（集団P1）。同じ獲得条件におけるトランスフェクトされていない細胞の自家蛍光に従って、偽陽性細胞の比率が０．１％よりも低くなるように決定された以下のゲートに従って、P1細胞のヒストグラムを分析した：
mKate2：「mKate2陽性」細胞を、蛍光閾値が１００ａ．ｕ．より上の細胞として定義した。
EYFP：「EYFP陽性」細胞を、蛍光閾値が３００ａ．ｕ．より上の細胞として定義した。
ECFP：「ECFP陽性」細胞を、蛍光閾値が４００ａ．ｕ．より上の細胞として定義した。
陽性細胞のパーセント（％陽性）および各々の「陽性細胞」集団についての蛍光中央値を計算した。％陽性細胞に蛍光中央値を乗算することにより、蛍光強度を細胞数と相関させた、蛍光発現レベルの加重中央値がもたらされた。この測定戦略は、いくつかの先の研究と一致する（Auslander et al., 2012；Xie et al., 2011）。
各々の試料について、蛍光の加重中央値を決定した。生物学的３つ組の蛍光の加重中央値の平均値を計算した。これらは、論文において表されたデータである。平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）をまた、コンピューター計算し、エラーバーとして表した。
多様なコンストラクト間の比較を容易にするため、異なる蛍光タンパク質の明度のバリエーションを説明するために、各実験条件についての蛍光の加重中央値を、同じ実験のセットにおいて試験された全ての条件の間で同じフルオロフォアについての蛍光の最大加重中央値で除算した。
補遺情報中に示されるフローサイトメトリーデータのプロットは、単一の実験からの代表的なコンペンセーションされたデータである。上記のとおり、細胞を、細胞凝集塊および壊死組織片を除外するためにゲーティングし（集団P1）、ゲーティングした生細胞の全集団を、各図において表した。各部分集団Q1〜Q4についての閾値は、上記の閾値に従って設定した。各部分集団中の細胞のパーセンテージを、プロット中に示す。プロット中の黒色の十字は、特定の部分集団についての蛍光の中央値を示す。
本明細書において、いくつかの本発明の態様を記載し、説明してきたが、当業者は、本明細書において記載される機能を実施するため、および／または結果を得るため、および／または利点の１または２以上のための、多様な他の手段および／または構造を容易に想起するであろう。そして、かかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書において記載される本発明の態様の範囲内であるものとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメーター、寸法、材料および立体配置が、例示的なものであることを意図されること、および、実際のパラメーター、寸法、材料および／または立体配置は、本発明の教示が用いられる特定の適用に依存するであろうことを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書において記載される特定の本発明の態様に対する多くの均等物を、認識するか、または慣用的な実験のみを用いて確認することができるであろう。すなわち、したがって、上述の態様は単に例として表されるものであり、添付の請求の範囲およびそれらに対する均等物の範囲内において、本発明の態様を、特に記載され請求されるものとは異なる方法で実施することができることが、理解されるべきである。本開示の本発明の態様は、本明細書において記載される各々の個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法に対して向けられる。加えて、２または３以上のかかる特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせが、かかる特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに矛盾しない場合は、本開示の発明の範囲内に含まれる。
全ての定義は、本明細書において定義され用いられる場合、辞書の定義、参考として援用される文書中の定義、および／または定義される用語の通常の意味に対して優先するものと理解されるべきである。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、逆であることが明らかに示されない限り、「少なくとも１」を意味するものと理解されるべきである。
句「および／または」は、本明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、そのように結合された要素のうちの「いずれかまたは両方」、すなわち、いくつかの場合においては接続的に存在し、他の場合においては離接的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」により列記される複数の要素は、同じ様式において解釈されるべきであり、すなわち、そのようにして結合された要素の「１または２以上」である。「および／または」節により特に同定された要素の他の要素は、特に同定された要素に関係しているか無関係であるかにかかわらず、任意に存在していてもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」についての言及は、「含む（comprising）」などの開放的（open-ended）表現と組み合わせられる場合、一態様においてはＡのみ（任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様においてはＢのみ（任意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の態様においてはＡおよびＢの両方（任意に他の要素を含む）を指すことができる、など。
本明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、「または」は、上で定義されるとおりの「および／または」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、境界を含むこと（inclusive）、すなわち、多くの要素または要素のリストのうちの少なくとも１を包含するが、また１より多くをも包み、および任意にさらなる列記されていない項目をも含むものとして解釈されるべきである。「〜のうちの１のみ」または「〜のうちの正確に１」、または請求の範囲において用いられる場合は「〜からなる（consisting of）」などの、明らかに逆を示す用語のみが、多くの要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含を指すであろう。一般的に、用語「または」は、本明細書において用いられる場合、「いずれか」、「〜のうちの１」、「〜のうちの１のみ」、または「〜のうちの正確に１」などの排他性の用語に先行される場合にのみ、排他的な選択肢（すなわち「一方または他方であるが、両方ではない」）を示すものとして解釈されるべきである。「〜から本質的になる」は、請求の範囲において用いられる場合、特許法の分野において用いられるその通常の意味を有するべきである。
本明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、１または２以上の要素のリストを参照する句「少なくとも１」は、要素のリスト中の要素のうちの任意の１または２以上から選択される少なくとも１の要素を意味するが、必ずしも要素のリスト中に特に列記される各々および全ての要素のうちの少なくとも１を含まず、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを排除しないものと理解されるべきである。この定義はまた、句「少なくとも１」が参照する要素のリスト中に特に同定される要素以外の要素が、特に同定される要素に関係するか無関係であるかに関わらず、任意に存在してもよいことを許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１」（または、同等のものとして「ＡまたはＢのうちの少なくとも１」、または同等のものとして「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１」）は、一態様において、少なくとも１の、任意に１より多くを含む、Ａ（Ｂは存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む））；別の態様においては、少なくとも１の、任意に１より多くを含む、Ｂ（Ａは存在しない（および任意にＡ以外の要素を含む））；さらに別の態様においては、少なくとも１の、任意に１より多くを含む、Ａ、および少なくとも１の、任意に１より多くを含む、Ｂ（および任意に他の要素を含む）を指すことができる、など。
また、明らかに逆であることが示されない限り、本明細書において請求される、１より多くのステップまたは動作を含む任意の方法において、当該方法のステップまたは動作の順序は、そのステップまたは動作が記述される順序に必ずしも限定されないことが、理解されるべきである。
本明細書において開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、それについて各々が引用される主題に関して、参考として援用され、それは、いくつかの場合においては、文書の全体を包含する場合もある。
請求の範囲において、ならびに上の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「運搬する（carrying）」、「有する（having）」、「含む（containing）」、「含む（involving）」、「保持する（holding）」、「からなる（composed of）」などの全ての移行句は、開放的（open-ended）である、すなわち、それを含むがそれらに限定されないことを意味するものとして理解されるべきである。米国特許庁特許審査手順のマニュアル（United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures）、セクション2111.03において記載されるとおり、移行句「からなる（consisting of）」および「から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、それぞれ閉鎖型または半閉鎖型の移行句であるべきである。
参考文献
（以下の各参考文献は、本明細書において参考として援用される。）

Claims (127)

  1. 以下：
    （ａ）少なくとも１のガイドRNA（gRNA）をコードするヌクレオチド配列；ならびに
    （ｂ）（ｉ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列および（ｉｉ）RNA干渉分子をコードするヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列
    を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクト。
  2. プロモーターが、RNAポリメラーゼＩＩ依存的（RNA pol II）プロモーターである、請求項１に記載の操作されたコンストラクト。
  3. 少なくとも１のgRNAが、リボヌクレアーゼ認識部位をコードするヌクレオチド配列に隣接する、請求項１または２に記載の操作されたコンストラクト。
  4. リボヌクレアーゼ認識部位が、Csy4リボヌクレアーゼ認識部位である、請求項３に記載の操作されたコンストラクト。
  5. 少なくとも１のgRNAが、リボザイムをコードするヌクレオチド配列に隣接する、請求項１または２に記載の操作されたコンストラクト。
  6. リボザイムが、ハンマーヘッド型リボザイムおよびデルタ型肝炎ウイルスリボザイムから選択される、請求項５に記載の操作されたコンストラクト。
  7. （ａ）のヌクレオチド配列が、コグネートイントロンスプライス部位に隣接する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  8. リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する少なくとも１のガイドRNA（gRNA）をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクト。
  9. 第１のヌクレオチド配列が、コグネートイントロンスプライス部位に隣接する、請求項８に記載の操作されたコンストラクト。
  10. 核酸がさらに、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含み、ここで第１のヌクレオチド配列が、第２のヌクレオチド配列内にある、請求項８または９に記載の操作されたコンストラクト。
  11. 核酸がさらに、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含み、ここで、第２のヌクレオチド配列が、第１のヌクレオチド配列の上流にある、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  12. 少なくとも１のマイクロRNAをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  13. 少なくとも１のマイクロRNAが、目的のタンパク質内にコードされる、請求項１２に記載の操作されたコンストラクト。
  14. 核酸がさらに、三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、ここで、第３のヌクレオチド配列が、第２のヌクレオチド配列と第１のヌクレオチド配列との間にある、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  15. プロモーターが、RNAポリメラーゼＩＩ依存的（RNA pol II）プロモーターである、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  16. RNA pol IIプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトユビキチンプロモーター、ヒトヒストンH2A1プロモーター、またはヒト炎症性ケモカインCXCL1プロモーターである、請求項１５に記載の操作されたコンストラクト。
  17. 第１のヌクレオチド配列が少なくとも２のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  18. 第１のヌクレオチド配列が少なくとも３のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、請求項１７に記載の操作されたコンストラクト。
  19. 第１のヌクレオチド配列が少なくとも４のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、請求項１８に記載の操作されたコンストラクト。
  20. 第１のヌクレオチド配列が少なくとも５のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、請求項１９に記載の操作されたコンストラクト。
  21. 第１のヌクレオチド配列は、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接している少なくとも２のgRNAをコードし、該gRNAは互いに異なる、請求項８〜２０のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  22. リボヌクレアーゼ認識部位が、Csy4リボヌクレアーゼ認識部位である、請求項８〜２１のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  23. Csy4リボヌクレアーゼ認識部位の各々が、２８ヌクレオチドの長さを有する、請求項２２に記載の操作されたコンストラクト。
  24. Csy4リボヌクレアーゼ認識部位が、Pseudomonas aeruginosaからのものである、請求項２２または２３に記載の操作されたコンストラクト。
  25. 三重らせん構造が、MALAT1遺伝子座の３’末端またはMENβ遺伝子座の３’末端からのヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  26. 以下：
    目的のタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；および
    リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する少なくとも１のガイドRNA（gRNA）をコードする第２のヌクレオチド配列、ここで、第２のヌクレオチド配列は、コグネートイントロンスプライス部位をコードするヌクレオチド配列に隣接し、第１のヌクレオチド配列内にある、
    を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクト。
  27. 少なくとも１のマイクロRNAをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２６に記載の操作されたコンストラクト。
  28. 少なくとも１のマイクロRNAが、目的のタンパク質内にコードされる、請求項２７に記載の操作されたコンストラクト。
  29. 核酸がさらに、以下：
    三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列；および
    リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する少なくとも１のgRNAをコードする第４のヌクレオチド配列、ここで、第３のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列の下流にあり、かつ第４のヌクレオチド配列の上流にある、
    を含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  30. プロモーターが、RNAポリメラーゼＩＩ依存的（RNA pol II）プロモーターである、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  31. RNA pol IIプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトユビキチンプロモーター、ヒトヒストンH2A1プロモーター、またはヒト炎症性ケモカインCXCL1プロモーターである、請求項３０に記載の操作されたコンストラクト。
  32. 第２のヌクレオチド配列が少なくとも２のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  33. 第２のヌクレオチド配列が少なくとも３のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、請求項３２に記載の操作されたコンストラクト。
  34. 第２のヌクレオチド配列が少なくとも４のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、請求項３３に記載の操作されたコンストラクト。
  35. 第２のヌクレオチド配列が少なくとも５のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、請求項３４に記載の操作されたコンストラクト。
  36. 第２のヌクレオチド配列が、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接している少なくとも２のgRNAをコードし、該gRNAは互いに異なる、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  37. リボヌクレアーゼ認識部位が、Csy4リボヌクレアーゼ認識部位である、請求項２６〜３６のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  38. Csy4リボヌクレアーゼ認識部位の各々が、２８ヌクレオチドの長さを有する、請求項３７に記載の操作されたコンストラクト。
  39. Csy4リボヌクレアーゼ認識部位が、Pseudomonas aeruginosaからのものである、請求項３７または３８に記載の操作されたコンストラクト。
  40. コグネートイントロンスプライス部位が、コンセンサスイントロンからのものである、請求項２６〜３９のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  41. コグネートイントロンスプライス部位が、HSV1潜伏期関連イントロンからのものである、請求項２６〜３９のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  42. コグネートイントロンスプライス部位が、sno-IncRNA2イントロンからのものである、請求項２６〜３９のいずれか一項に記載の操作された核酸。
  43. 三重らせん構造が、MALAT1遺伝子座の３’末端またはMENβ遺伝子座の３’末端からのヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２９〜４２のいずれか一項に記載の操作された核酸。
  44. 第４のヌクレオチド配列が少なくとも２のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  45. 第４のヌクレオチド配列が少なくとも３のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、請求項４４に記載の操作されたコンストラクト。
  46. 第４のヌクレオチド配列が少なくとも４のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、請求項４５に記載の操作されたコンストラクト。
  47. 第４のヌクレオチド配列が少なくとも５のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、請求項４６に記載の操作されたコンストラクト。
  48. 第４のヌクレオチド配列が、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接している少なくとも２のgRNAをコードし、該gRNAは互いに異なる、請求項２９〜４７のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  49. リボザイムに隣接する少なくとも１のガイドRNA（gRNA）をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクト。
  50. 核酸がさらに、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含み、ここで、第２のヌクレオチド配列が、第１のヌクレオチド配列の上流にある、請求項４９に記載の操作されたコンストラクト。
  51. 少なくとも１のマイクロRNAをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４９または５０に記載の操作されたコンストラクト。
  52. 少なくとも１のマイクロRNAが、目的のタンパク質内にコードされる、請求項５１に記載の操作されたコンストラクト。
  53. 核酸がさらに、三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、ここで、第３のヌクレオチド配列が、第２のヌクレオチド配列と第１のヌクレオチド配列との間にある、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  54. プロモーターが、RNAポリメラーゼＩＩ依存的（RNA pol II）プロモーターである、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  55. RNA pol IIプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトユビキチンプロモーター、ヒトヒストンH2A1プロモーター、またはヒト炎症性ケモカインCXCL1プロモーターである、請求項５４に記載の操作されたコンストラクト。
  56. 第１のヌクレオチド配列が少なくとも２のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボザイムに隣接する、請求項４９〜５５のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  57. 第１のヌクレオチド配列が少なくとも３のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボザイムに隣接する、請求項５６に記載の操作されたコンストラクト。
  58. 第１のヌクレオチド配列が少なくとも４のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボザイムに隣接する、請求項５７に記載の操作されたコンストラクト。
  59. 第１のヌクレオチド配列が少なくとも５のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボザイムに隣接する、請求項５８に記載の操作されたコンストラクト。
  60. 第１のヌクレオチド配列が、リボザイムに隣接する少なくとも２のgRNAをコードし、該gRNAは互いに異なる、請求項４９〜５９のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  61. リボザイムが、シス作用性リボザイムである、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  62. シス作用性リボザイムのうちの少なくとも１つが、ハンマーヘッド型リボザイムである、請求項６１に記載の操作されたコンストラクト。
  63. ハンマーヘッド型リボザイムが、少なくとも１のgRNAの５’末端にある、請求項６２に記載の操作されたコンストラクト。
  64. シス作用性リボザイムのうちの少なくとも１つが、デルタ型肝炎ウイルスリボザイムである、請求項６１に記載の操作されたコンストラクト。
  65. デルタ型肝炎ウイルスリボザイムが、少なくとも１のgRNAの３’末端にある、請求項６４に記載の操作されたコンストラクト。
  66. 三重らせん構造が、MALAT1遺伝子座の３’末端またはMENβ遺伝子座の３’末端からのヌクレオチド配列によりコードされる、請求項５３〜６５のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
  67. 以下：
    目的のタンパク質内に少なくとも１のRNA干渉分子をコードする第１のヌクレオチド配列；
    リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する少なくとも１のガイドRNAをコードする第２のヌクレオチド配列；および
    三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列、ここで、第３のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間にある、
    を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクト。
  68. 以下：
    目的のタンパク質内に少なくとも１のRNA干渉分子をコードする第１のヌクレオチド配列；
    リボザイムに隣接する少なくとも１のガイドRNAをコードする第２のヌクレオチド配列；および
    三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列、ここで、第３のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間にある、
    を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクト。
  69. 少なくとも１のRNA干渉分子が、マイクロRNA（miRNA）および低分子干渉RNA（siRNA）から選択される、請求項６７または６８に記載の操作されたコンストラクト。
  70. 少なくとも１のRNA干渉分子が、少なくとも１のmiRNAを含む、請求項６９に記載の操作されたコンストラクト。
  71. 請求項１〜７０のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクトを含む、ベクター。
  72. 請求項１〜７０のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクトまたは請求項７１に記載のベクターを含む、細胞。
  73. 請求項１〜７０のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクトのうちの少なくとも２つまたは請求項７１に記載のベクターのうちの少なくとも２つを含む、細胞。
  74. リボヌクレアーゼを安定して発現するように改変されている、請求項７２または７３に記載の細胞。
  75. リボヌクレアーゼがCsy4リボヌクレアーゼである、請求項７４に記載の細胞。
  76. Casタンパク質を安定して発現するように改変されている、請求項７２〜７５のいずれか一項に記載の細胞。
  77. Casタンパク質がCasヌクレアーゼである、請求項７６に記載の細胞。
  78. CasヌクレアーゼがCas9ヌクレアーゼである、請求項７６に記載の細胞。
  79. Casタンパク質が転写活性Casタンパク質である、請求項７６に記載の細胞。
  80. 転写活性Casタンパク質が転写活性Cas9タンパク質である、請求項７９に記載の細胞。
  81. リボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、操作された核酸をさらに含む、請求項７２〜８０のいずれか一項に記載の細胞。
  82. リボヌクレアーゼがCsy4リボヌクレアーゼである、請求項８１に記載の細胞。
  83. Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、操作された核酸をさらに含む、請求項７２〜８２のいずれか一項に記載の細胞。
  84. Casタンパク質がCasヌクレアーゼである、請求項８３に記載の細胞。
  85. CasヌクレアーゼがCas9ヌクレアーゼである、請求項８４に記載の細胞。
  86. Casタンパク質が転写活性Casタンパク質である、請求項８３に記載の細胞。
  87. 転写活性Casタンパク質が転写活性Cas9タンパク質である、請求項８６に記載の細胞。
  88. 目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、少なくとも１のさらなる操作された核酸をさらに含む、請求項７２〜８７のいずれか一項に記載の細胞。
  89. 少なくとも１のさらなる操作された核酸の目的のタンパク質が、該細胞の任意の他の目的のタンパク質とは異なる、請求項８８に記載の細胞。
  90. 細菌細胞である、請求項７２〜８９のいずれか一項に記載の細胞。
  91. ヒト細胞である、請求項７２〜８９のいずれか一項に記載の細胞。
  92. 請求項７２〜９１のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含む、方法。
  93. 核酸の発現を許容する条件下において細胞を培養することを含む、請求項９２に記載の方法。
  94. 細胞の遺伝子回路を生成、改変または再配線する方法であって、以下：
    細胞において、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクトから選択される第１の操作されたコンストラクトを発現させること；および
    細胞において、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクトから選択される第２の操作されたコンストラクトを発現させること、
    ここで、第１の操作されたコンストラクトのうちの少なくとも１のgRNAは、第２の操作されたコンストラクトのプロモーターの領域または内在プロモーターの領域に対して相補的であり、これに結合する、
    を含む、前記方法。
  95. 請求項１〜７０のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクトから選択される第３の操作されたコンストラクトを発現させることをさらに含む、請求項９４に記載の方法であって、第２の操作されたコンストラクトのうちの少なくとも１のgRNAは、第３の操作されたコンストラクトのプロモーターの領域または内在プロモーターの領域に対して相補的であり、これに結合する、前記方法。
  96. 請求項１〜７０のいずれか一項に記載の操作された核酸から選択される少なくとも１のさらなる操作された核酸を発現させることをさらに含む、請求項９５に記載の方法であって、少なくとも１のさらなる操作された核酸のうちの少なくとも１のgRNAは、細胞の操作された核酸のうちのいずれか１つのプロモーターの領域または少なくとも１の内在プロモーターの領域に対して相補的であり、これに結合する、前記方法。
  97. 細胞が、Casタンパク質を安定して発現するように改変されている、請求項９４〜９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. Casタンパク質がCasヌクレアーゼである、請求項９７に記載の方法。
  99. CasヌクレアーゼがCas9ヌクレアーゼである、請求項９８に記載の方法。
  100. Casタンパク質が転写活性Casタンパク質である、請求項９７に記載の方法。
  101. 転写活性Casタンパク質が転写活性Cas9タンパク質である、請求項１００に記載の方法。
  102. 細胞が、リボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、操作された核酸をさらに含む、請求項９４〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. リボヌクレアーゼがCsy4リボヌクレアーゼである、請求項１０２に記載の方法。
  104. 細胞が、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、操作された核酸をさらに含む、請求項９４〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. Casタンパク質がCasヌクレアーゼである、請求項１０４に記載の方法。
  106. CasヌクレアーゼがCas9ヌクレアーゼである、請求項１０５に記載の方法。
  107. Casタンパク質が転写活性Casタンパク質である、請求項１０４に記載の方法。
  108. 転写活性Casタンパク質が転写活性Cas9タンパク質である、請求項１０７に記載の方法。
  109. 細胞を培養することをさらに含む、請求項９４〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. ガイドリボ核酸（gRNA）のマルチプレックスな細胞発現の方法であって、細胞において、少なくとも２のgRNAをコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクトを発現させることを含み、各々のgRNAは、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する、前記方法。
  111. 核酸が、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、第２のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列の上流にある、請求項１１０に記載の方法。
  112. 操作されたコンストラクトが、少なくとも１のマイクロRNAをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１１１に記載の方法。
  113. 少なくとも１のマイクロRNAが、目的のタンパク質中にコードされる、請求項１１２に記載の操作されたコンストラクト。
  114. 核酸が、三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、第３のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列と第１のヌクレオチド配列との間にある、請求項１１１〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 細胞が、Casタンパク質を安定して発現するように改変されている、請求項１１０〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. Casタンパク質がCasヌクレアーゼである、請求項１１５に記載の方法。
  117. CasヌクレアーゼがCas9ヌクレアーゼである、請求項１１６に記載の方法。
  118. Casタンパク質が転写活性Casタンパク質である、請求項１１５に記載の方法。
  119. 転写活性Casタンパク質が転写活性Cas9タンパク質である、請求項１１８に記載の方法。
  120. 細胞が、リボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、操作された核酸をさらに含む、請求項１１０〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. リボヌクレアーゼがCsy4リボヌクレアーゼである、請求項１２０に記載の方法。
  122. 細胞が、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、操作された核酸をさらに含む、請求項１１０〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. Casタンパク質がCasヌクレアーゼである、請求項１２２に記載の方法。
  124. CasヌクレアーゼがCas9ヌクレアーゼである、請求項１２３に記載の方法。
  125. Casタンパク質が転写活性Casタンパク質である、請求項１２２に記載の方法。
  126. 転写活性Casタンパク質が転写活性Cas9タンパク質である、請求項１２５に記載の方法。
  127. 細胞を培養することをさらに含む、請求項１１０〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
JP2016560684A 2014-04-03 2015-04-03 ガイドｒｎａの生成のための方法および組成物 Pending JP2017509350A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461974672P 2014-04-03 2014-04-03
US61/974,672 2014-04-03
PCT/US2015/024196 WO2015153940A1 (en) 2014-04-03 2015-04-03 Methods and compositions for the production of guide rna

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2017509350A true JP2017509350A (ja) 2017-04-06
JP2017509350A5 JP2017509350A5 (ja) 2018-05-31

Family

ID=52997563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016560684A Pending JP2017509350A (ja) 2014-04-03 2015-04-03 ガイドｒｎａの生成のための方法および組成物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20170022499A1 (ja)
EP (1) EP3126503A1 (ja)
JP (1) JP2017509350A (ja)
CN (1) CN106170550A (ja)
WO (1) WO2015153940A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017502683A (ja) * 2014-01-14 2017-01-26 ラム セラピューティクス， インコーポレイテッド 変異誘発方法

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
CA2907198C (en) 2013-03-15 2019-12-10 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
WO2015066119A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-ii crispr-cas system in lactobacillus buchneri
US9834791B2 (en) 2013-11-07 2017-12-05 Editas Medicine, Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
EP3985124A1 (en) * 2013-12-26 2022-04-20 The General Hospital Corporation Multiplex guide rnas
US10787654B2 (en) 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
CN106460003A (zh) 2014-04-08 2017-02-22 北卡罗来纳州立大学 用于使用crispr相关基因rna引导阻遏转录的方法和组合物
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US10450584B2 (en) 2014-08-28 2019-10-22 North Carolina State University Cas9 proteins and guiding features for DNA targeting and genome editing
CN107429246B (zh) * 2014-10-31 2021-06-01 麻省理工学院 用于crispr的大规模并行组合遗传学
WO2016084084A1 (en) * 2014-11-27 2016-06-02 Danziger Innovations Ltd. Nucleic acid constructs for genome editing
JP6529110B2 (ja) * 2014-12-01 2019-06-12 国立大学法人 東京大学 複数のユニットが多重に連結したｄｎａカセットおよび該カセットを含むベクターの製造方法
KR102138209B1 (ko) 2015-05-06 2020-07-28 스니프르 테크놀로지스 리미티드 미생물 개체군 변경 및 미생물군 변형
JP2018516563A (ja) 2015-05-29 2018-06-28 ノース カロライナ ステート ユニバーシティＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｒｉｓｐｒ核酸を用いて、細菌、古細菌、藻類、および、酵母をスクリーニングする方法
WO2016205276A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 North Carolina State University Methods and compositions for efficient delivery of nucleic acids and rna-based antimicrobials
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
WO2017058751A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
CN108513575A (zh) 2015-10-23 2018-09-07 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器及其用途
EP3390632A1 (en) * 2015-12-18 2018-10-24 Danisco US Inc. Methods and compositions for polymerase ii (pol-ii) based guide rna expression
WO2017112620A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of crispr based antimicrobials
CN105543223A (zh) * 2015-12-25 2016-05-04 华侨大学 一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法
EP3199632A1 (en) 2016-01-26 2017-08-02 ACIB GmbH Temperature-inducible crispr/cas system
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
WO2017189683A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Massachusetts Institute Of Technology Extensible recombinase cascades
GB201609811D0 (en) 2016-06-05 2016-07-20 Snipr Technologies Ltd Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
CA3029625A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 California Institute Of Technology Fractional initiator hybridization chain reaction
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
IL264831B (en) 2016-08-30 2022-09-01 California Inst Of Techn Immunohistochemistry by hybridization chain reaction
WO2018049168A1 (en) * 2016-09-09 2018-03-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High-throughput precision genome editing
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US20190352634A1 (en) * 2017-01-11 2019-11-21 Oxford University Innovation Limited Crispr rna
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018162702A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Nuclease fusions for enhancing genome editing by homology-directed transgene integration
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
SG11201908658TA (en) 2017-03-23 2019-10-30 Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2018231730A2 (en) * 2017-06-12 2018-12-20 California Institute Of Technology Conditional guide rnas
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
HRP20220615T1 (hr) 2017-06-30 2022-06-24 Inscripta, Inc. Postupci, moduli, instrumenti i sustavi za automatiziranu obradu stanica
US11041154B2 (en) 2017-07-21 2021-06-22 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University CRISPR fluorescent guide RNA (fgRNA) to understanding gRNAs expressed from pol II promotors
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11788088B2 (en) 2017-09-26 2023-10-17 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois CRISPR/Cas system and method for genome editing and modulating transcription
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
WO2019173942A1 (en) * 2018-03-12 2019-09-19 Nanjing Bioheng Biotech Co., Ltd Engineered chimeric guide rna and uses thereof
US10760075B2 (en) 2018-04-30 2020-09-01 Snipr Biome Aps Treating and preventing microbial infections
CN108330138B (zh) * 2018-03-29 2018-09-25 上海欣百诺生物科技有限公司 一种sgRNA的体外合成方法及其试剂盒
CN108728441B (zh) * 2018-04-18 2022-07-22 深圳市第二人民医院 特异性识别p53突变的基因系统
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
WO2019209926A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of peptide libraries
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
CA3097914A1 (en) * 2018-04-30 2019-11-07 Oregon Health & Science University Methods of gene therapy
EP4070802A1 (en) 2018-06-30 2022-10-12 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
EP3861120A4 (en) 2018-10-01 2023-08-16 North Carolina State University RECOMBINANT TYPE I CRISPR-CAS SYSTEM
US11851663B2 (en) 2018-10-14 2023-12-26 Snipr Biome Aps Single-vector type I vectors
GB201817010D0 (en) * 2018-10-18 2018-12-05 Imperial Innovations Ltd Methods
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
EP3870697A4 (en) 2018-10-22 2022-11-09 Inscripta, Inc. MODIFIED ENZYMES
WO2020114893A1 (en) * 2018-12-05 2020-06-11 Dsm Ip Assets B.V. Crispr guide-rna expression strategies for multiplex genome engineering
WO2020131986A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Multiplex genome targeting
DE112020001342T5 (de) 2019-03-19 2022-01-13 President and Fellows of Harvard College Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen
CA3134168A1 (en) * 2019-03-25 2020-10-01 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
AU2020288623A1 (en) 2019-06-06 2022-01-06 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
US10920189B2 (en) 2019-06-21 2021-02-16 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in E. coli
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
EP4069837A4 (en) 2019-12-10 2024-03-13 Inscripta, Inc. NEW MAD NUCLEASES
WO2021126886A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Inscripta, Inc. Cascade/dcas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
KR20220133257A (ko) 2020-01-27 2022-10-04 인스크립타 인코포레이티드 전기천공 모듈 및 기구
EP3889259A1 (en) 2020-03-30 2021-10-06 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Internal standard for crispr guide rna
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
EP4146804A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 The Broad Institute Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
GB202007943D0 (en) 2020-05-27 2020-07-08 Snipr Biome Aps Products & methods
CN111850011B (zh) * 2020-06-24 2022-08-26 湖南文理学院 改良的Csy4序列、改良方法及应用
US11299731B1 (en) 2020-09-15 2022-04-12 Inscripta, Inc. CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
WO2022146497A1 (en) 2021-01-04 2022-07-07 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
EP4284925A1 (en) 2021-01-26 2023-12-06 California Institute of Technology Allosteric conditional guide rnas for cell-selective regulation of crispr/cas
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
IL306038A (en) * 2021-03-22 2023-11-01 Massachusetts Inst Technology Multicellular microRNA sensing with elemental erns to regulate multipolar gene expression in mammalian cells
WO2022226107A1 (en) * 2021-04-20 2022-10-27 Texas Tech University System Tissue-culture independent gene editing of cells by a long-distance rna transport system
CN115704040A (zh) * 2021-08-06 2023-02-17 华东理工大学 基于CRISPRi和CRISPRa的转录调控系统、其建立方法及应用
WO2023018938A1 (en) * 2021-08-12 2023-02-16 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Methods for generation of precise rna transcripts
CN113604472B (zh) * 2021-09-17 2024-01-09 中国科学院植物研究所 一种应用于里氏木霉的CRISPR/Cas基因编辑系统

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3401400T3 (da) * 2012-05-25 2019-06-03 Univ California Fremgangsmåder og sammensætninger til rna-styret mål-dna-modifikation og til rna-styret transskriptionsmodulering
JP2015527889A (ja) * 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
CN103388006B (zh) * 2013-07-26 2015-10-28 华东师范大学 一种基因定点突变的构建方法
EP3985124A1 (en) * 2013-12-26 2022-04-20 The General Hospital Corporation Multiplex guide rnas

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOTECHNOL. LETT., vol. 33, JPN6019017332, 2011, pages 1723 - 1728, ISSN: 0004033975 *
CELL, vol. 152, no. 5, JPN6019017334, 2013, pages 1173 - 1183, ISSN: 0004033973 *
MOL. CELL, vol. 54, no. 4, JPN6019017339, 22 May 2014 (2014-05-22), pages 698 - 710, ISSN: 0004033974 *
NAT. BIOTECHNOL., vol. 23, no. 3, JPN6019017336, 2005, pages 337 - 343, ISSN: 0004033976 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017502683A (ja) * 2014-01-14 2017-01-26 ラム セラピューティクス， インコーポレイテッド 変異誘発方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20170022499A1 (en) 2017-01-26
CN106170550A (zh) 2016-11-30
WO2015153940A1 (en) 2015-10-08
EP3126503A1 (en) 2017-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2017509350A (ja) ガイドｒｎａの生成のための方法および組成物
CN108753836B (zh) 一种利用rna干扰机制的基因调控或编辑系统
Tang et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs
JP6788584B2 (ja) Ｃｒｉｓｐｒについての超並列コンビナトリアル遺伝学
EP2235179B1 (en) Methods for creating and identifying functional rna interference elements
KR20190017022A (ko) 화학적으로 변형된 가이드 rna를 사용하는 고 특이성 게놈 편집
WO2016057951A2 (en) Crispr oligonucleotides and gene editing
JP2015212310A (ja) ランダムＲＮＡｉライブラリ、その生成方法、及びそれを使用したスクリーニング方法
JP2021525542A (ja) 固定ガイドｒｎａペアを用いた遺伝子編集ベクターの作製方法
JP2024503437A (ja) プライム編集効率及び精度を向上させるためのプライム編集因子バリアント、構築物、及び方法
Seyhan A multiplexed miRNA and transgene expression platform for simultaneous repression and expression of protein coding sequences
US20090012016A1 (en) Short Interfering Rna and Micro-Rna Compounds and Methods of Designing, Making, and Using the Same
JP4908631B2 (ja) テオフィリンによって標的特異的ｒｎａ置換活性が調節されるアロステリックトランス−スプライシンググループｉリボザイム
JP2020037599A (ja) 新規な治療用抗癌薬の製造及び使用
US11254935B2 (en) Methods and compositions for use of non-coding RNA in cell culturing and selection
WO2006130976A1 (en) Interfering rnas, methods for their production, and use
WO2010007797A1 (ja) 高活性ｓｈＲＮＡ及びその製造方法
AU2014202015B2 (en) Random RNAi libraries, methods of generating same, and screening methods utilizing same
Bennis et al. Expanding the genome editing toolbox of Saccharomyces cerevisiae with the endonuclease Er Cas12a
Lee et al. Expansion of the Prime editing Modality with Cas9 from Francisella novicida
野瀬可那子 et al. Development of the Site-directed RNA Editing Utilizing Intracellular A-to-I RNA Editing
CN117321201A (zh) 用于增强引导编辑效率和精度的引导编辑器变体、构建体和方法
JP2022112522A (ja) 標的遺伝子を編集する蛋白質を細胞特異的に制御する方法
CN113897385A (zh) 一种利用rna干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的dna系统
Wang et al. Synthesis of complementary RNA by RNA-dependent RNA polymerases in plant extracts is independent of an RNA primer

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180403

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20180403

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180410

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190515

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20190814

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20191009

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20200127