CN108728441B

CN108728441B - 特异性识别p53突变的基因系统

Info

Publication number: CN108728441B
Application number: CN201810350560.8A
Authority: CN
Inventors: 黄卫人; 刘宇辰; 詹恒基; 蔡志明
Original assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2038-04-18
Also published as: CN108728441A

Abstract

本申请公开了一种特异性识别P53突变的基因系统，包括至少一段核苷酸序列，所述核苷酸序列含有能被野生型P53蛋白特异结合的靶标序列。本发明的基因系统可以特异性识别并杀死P53缺陷细胞。

Description

特异性识别P53突变的基因系统

技术领域

本发明涉及领域生物技术领域，具体涉及一种DNA分子以及一种特异性识别P53突变的基因系统。

背景技术

P53作为一种重要的肿瘤抑制蛋白，在调节细胞正常活动和防止细胞癌变中发挥着核心作用。P53是人类基因组中突变频率最高的基因之一，在人类癌症中有一半以上的癌症细胞发现不同类型的P53突变或缺失，此种改变在肿瘤的形成过程中发挥着极其重要的作用。与正常细胞相比，肿瘤细胞通常缺乏野生型P53蛋白并具有突变型的P53蛋白^(1-3)。

CRISPR相关(CAS)系统是存在于某些细菌中用于清除外来的遗传物质的特殊系统。作为II型CRISPR系统中最具有特征性的成员，核酸酶Cas9可在单引导RNA(sgRNA)的引导下，广泛地运用于哺乳动物细胞中进行双链DNA切割以及基因敲除^(4-6)。

白喉毒素(DT)是一种由白喉棒状杆菌分泌的能使细胞死亡并引起“白喉”症状的致病蛋白质⁽⁷⁾。完整的DT是含有大量精氨酸的多肽链，通过蛋白酶的作用后可水解成A、B两个片段，片段A是白喉毒素的主要致病部分，具有酶活性，能使真核细胞中的延伸因子(EF-2)失活而阻碍细胞内蛋白质的合成，从而导致了细胞死亡，片段B能被对白喉毒素敏感的细胞的细胞膜上特定的表面受体所识别⁽⁸⁾。白喉毒素选择性地在肿瘤细胞内表达将发挥杀死细胞的作用，将是治疗肿瘤的一种新的有效策略。

参考文献：

1.Kandoth C,McLellan MD,Vandin F,Ye K,Niu B,Lu C,et al.Mutationallandscape and significance across 12major cancer types.Nature.2013；502(7471):333-9.

2.Hainaut P,Pfeifer GP.Somatic TP53Mutations in the Era of GenomeSequencing.Cold Spring Harbor perspectives in medicine.2016；6(11).

3.Vousden KH,Lu X.Live or let die:the cell's response to p53.Naturereviews Cancer.2002；2(8):594-604.

4.Mali P,Yang L,Esvelt KM,Aach J,Guell M,DiCarlo JE,et al.RNA-guidedhuman genome engineering via Cas9.Science(New York,NY).2013；339(6121):823-6.

5.Ran FA,Hsu PD,Wright J,Agarwala V,Scott DA,Zhang F.Genomeengineering using the CRISPR-Cas9 system.Nature protocols.2013；8(11):2281-308.

6.Farzadfard F,Perli SD,Lu TK.Tunable and multifunctional eukaryotictranscription factors based on CRISPR/Cas.ACS synthetic biology.2013；2(10):604-13.

7.Hadfield TL,McEvoy P,Polotsky Y,Tzinserling VA,Yakovlev AA.Thepathology of diphtheria.The Journal of infectious diseases.2000；181 Suppl 1:S116-20.

8.Pappenheimer AM,Jr.Diphtheria toxin.Annual review ofbiochemistry.1977；46:69-94.

发明内容

为解决上述问题，本发明的一个目的是提供一种可以用于探测P53突变的基因系统，进一步地，提供一种可以特异性识别并杀死P53缺陷细胞的基因系统。

因此，在第一方面，本发明提供一种DNA分子，所述DNA分子具有SEQID NO.1所述的序列，或者所述DNA分子具有与SEQ ID NO.1互补的序列。

在本发明的另一面，本发明提供一种特异性识别P53突变的基因系统，所述基因系统包括至少一段核苷酸序列，所述核苷酸序列含有能被野生型P53蛋白特异结合的靶标序列，所述靶标序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列。

具体的，所述系统还包括有基因启动子序列，所述基因启动子序列位于靶标序列的下游。

在本发明优选的实施方式中，所述基因启动子为SV40启动子。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述基因系统还含有CRISPR-Cas9调控序列，所述CRISPR-Cas9调控序列通过SV40启动子启动表达。

具体的，所述CRISPR-Cas9调控序列包括Cas9蛋白的DNA序列及可经转录成为sgRNA的DNA序列，所述sgRNA的靶向基因为编码细胞毒性蛋白的基因。

在本发明优选的实施方式中，所述基因系统还包括编码细胞毒性蛋白的基因表达系统，所述表达系统包括启动子和编码细胞毒性蛋白的基因。

在本发明中，所述编码细胞毒性蛋白优选为白喉毒素(DT)，并且，由于DT的两个蛋白片段A、B中，片段A是白喉毒素的主要致病部分，而片段B并不直接导致细胞死亡，因此，在本发明中，细胞毒性蛋白至少包括白喉毒素的片段A即可，也就是说，本发明的细胞毒性蛋白可以是完整的白喉毒素，也可以仅包括白喉毒素的片段A。编码细胞毒性蛋白的基因启动子优选为hEF1a启动子。

在本发明中，所述白喉毒素或白喉毒素A蛋白的表达系统，与由SV40启动表达的CRISPR-Cas9调控序列表达系统，可以分属于不同的表达系统，分别进行表达，也可以位于同一个表达系统中表达，两者效果相当。

在本发明具体的实施方式中，所述sgRNA的序列靶标白喉毒素的片段如SEQ IDNO.2所示。

在本发明优选的实施方式中，CRISPR-Cas9调控序列的结构如图1A所示，

Cas9蛋白的DNA序列两端连接有核定位序列NLS；

可经转录成为sgRNA的DNA序列两侧连接有核酶(ribozyme)结构；

Cas9蛋白的DNA序列及可经转录成为sgRNA的DNA序列之间，还具有三螺旋结构(Triplex)，优选的，所述三螺旋结构的序列具有如SEQ ID NO.3所示的序列。

本发明的有益效果：

本发明的特异性识别P53突变的基因系统，能有效识别细胞的P53蛋白，并可以实现选择性地使细胞毒性蛋白在P53缺陷细胞中表达，从而达到选择性杀死P53缺陷细胞，并保证正常细胞免收细胞毒性蛋白的损害。而与正常细胞相比，由于肿瘤细胞通常缺乏野生型P53蛋白并具有突变型的P53蛋白，因此，利用本发明，有望实现白喉毒素或类似的细胞毒性蛋白在肿瘤细胞内的选择性表达，并发挥选择性杀死肿瘤细胞而使正常细胞免收伤害，从而成为治疗肿瘤的一种新的有效策略。

附图说明

图1是本发明的同一启动子表达CRI SPR系统的示意图。

图2是根据本发明实施例，在P53BER-SV40下游连接绿色荧光蛋白(GFP)，通过比较GFP在正常细胞系和P53缺陷细胞系中的表达情况以验证P53BER-SV40这一识别P53蛋白的基因装置的实用性的结果图，并使用有hEF1a启动子表达的远红色荧光蛋白(mKate)作为内参。将构建好的质粒转染进293T和5637细胞中，在mKate蛋白表达基本相同的背景下，GFP在293T中正常表达，而在5637细胞中几乎没有表达。其中，A、B为GFP、mKate在293T中的表达情况；C、D为GFP、mKate在5637中的表达情况。

图3是本发明实施例的Caspase-3ELISA实验结果图。

图4是本发明实施例的细胞流式实验结果图。

图3、图4显示：将构建的由P53BER-Cas9-sgRNA和白喉毒素组成的基因系统转染进293T和5637细胞，运用Caspase-3ELISA实验和细胞流式实验评估此基因系统的选择性识别能力和杀伤能力。结果显示，通过化学合成的白喉毒素序列能在细胞中正常表达白喉毒素蛋白并诱导细胞凋亡。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

实施例：

技术与方法：

细胞培养

使用的肾胚胎细胞(293T)以及人膀胱癌细胞(5637)均购自American TypeCulture Collection(ATCC,Manassas,USA)。293T培养使用的培养液是由90％的DMEM培养基混合10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素配制而成。5637培养所用的培养液是由90％的1640培养基混合10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素配制而成。所有细胞都在37℃，5％CO²环境中培养。

质粒构建：

实验中所有的序列均用体外化学合成的方式合成。我们将P53BER-SV40-NLS-hCas9-NLS-Triplex-ribozyme-sgRNA-ribozyme-ploy(A)插入到在载体pHS-BVC-LW183(Addgene,Cambridge,MA,USA)中的EcoRV/Bsal的限制性位点处，构成质粒A。

我们用EcoRV/Esp3I作用载体pHS-BVC-LW182(Addgene,Cambridge,MA,USA)后，将P53BER-SV40-EGFP-ploy(A)-hEF1a-mKate-ploy(A)的基因序列插入该载体中，构成质粒B。

我们用NcoI/MluI消化载体pHS-BVC-LW182(Addgene)，将hEF1a-DT-ploy(A)的基因序列插入到该载体中，构成质粒C。

其中P53BER的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，sgRNA的序列靶标白喉毒素的片段为CGGCACCAAGCCCGGCTACG(SEQ ID NO.2)。Triplex的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

将质粒C用lipo3000转染试剂分别转染进293T和5637两个细胞系中，6小时后更换成正常的培养基，再培养48小时后用荧光显微镜观察两个细胞系中的GFP表达情况。

将质粒A和B用lipo3000转染试剂分别共转染进293T和5637两个细胞系中，6小时后更换成正常的培养基，再培养48小时后，把细胞收集起来，用Caspase-3和细胞流式实验来评估细胞的死亡情况。

细胞转染：

质粒转染使用lipofectamine3000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)试剂盒进行DNA瞬时转染实验。当细胞生长至80％的汇合度时，进行细胞转染。转染后的细胞继续培养48小时后收集起来，以继续下一步的实验操作。

具体地，转染前一天，4-5×10⁴个细胞接种在24孔板上，加入0.5ml培养基，放在37℃、5％CO²培养箱内。生长24小时后，细胞汇合度达到70％，在50ul的无血清培养基内加入1ug重组质粒，柔和混匀。在50ul无血清培养基内加入1ul Lipofectamin3000(Invitrogen,CA)试剂，轻轻混匀，室温放置5min。将稀释好的质粒和Lipo3000轻柔混匀，室温放置20分钟，以便形成质粒/lipofectamin复合物。将质粒/lipofectamin混合物加入24孔板内，轻柔摇晃24孔板。放入培养箱内，4-6小时后更换培养基，48小时后收集细胞，准备下一步实验。

细胞凋亡检测

帖壁细胞经轻吹打收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02％的EDTA消化使之脱壁，

每样本细胞数为(1～5)×10⁶，500～1000r/min离心5min弃去培养液。用孵育缓冲液洗1次，500～1000r/min离心5min。用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min。500～1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。流式细胞仪(EPICS,XL-4,Beckman,CA,USA)分析细胞凋亡率。

Caspase-3ELISA实验(BioVision,Milpitas,CA,USA)：

测定细胞中Caspase-3的蛋白水平评估细胞的凋亡水平，Caspase-3ELISA试剂盒(BioVision，Mipitas，CA，USA)被用来测量细胞的Caspase-3的蛋白表达水平。细胞经过处理后，使用酶标仪(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)测量在405nm波长下的吸光度。测得的吸光度与细胞中释放出来的Caspase-3的蛋白酶的量成正比，以此来评估细胞的凋亡情况。重复实验5次。

具体地，计数细胞并沉淀1-5×10⁶个细胞。用50μl冷的Cell Lysis Buffer(细胞裂解液)重悬细胞，并将细胞在冰上孵育10分钟。离心1min(10,000x g)。将上清液(胞质提取物)转移到新鲜管中，放在冰上立即进行测定或分装并储存在-80℃备用。测定蛋白浓度。每次测定，将50-200ug蛋白稀释至50ul Cell LysisBuffer。向每个样品中加入50ul2XReaction Buffer(含10mM DTT)。加入5ul4mM DEVD-pNA底物(200μM终浓度)，37℃孵育1-2小时。接着测样品在405nm发射光下的吸光度。

细胞流式实验：

使用细胞流式实验测量细胞的凋亡率。使用流式试剂盒(Transgene，Cambridge，MA，USA)处理细胞后，使用FACSCanto SORP(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)来测量细胞的凋亡率。重复实验5次。

统计分析：

所有的统计分析均采用SPSS统计软件21.0版(SPSS，Chicago，IL，USA)进行。所有数据均以平均值±SE表示，并使用Student’s T-检验或方差分析进行分析。统计学的显著性设定为<0.05。

实验结果：

1、杀伤P53基因缺陷细胞系统的构建：

在位于已知的P53靶向基因附近确定能与野生型P53蛋白相互作用的区域，在这些区域内，存在可被野生型P53特异性识别并结合的保守的P53结合位点，这些结合位点被命名为P53结合增强区域(P53BERs)。用体外化学合成的方法合成了P53BER序列(SEQ IDNO.1)并将其作为野生型P53的特异性靶标区域。将化学合成的P53BER序列与minimal-SV40启动子结合作为此识别P53蛋白的基因装置，并使用P53BER-SV40基因装置驱动sgRNA和Cas9蛋白的表达，在具有野生型P53的细胞中表达CRISPR-Cas9系统。

在sgRNA两侧连接着核酶(ribozyme)的结构，使sgRNA表达并留在细胞核内。在表达Cas9蛋白的基因两端连接核定位序列(NLS)，使在细胞质中翻译成熟的Cas9蛋白在NLS多肽的作用下携带转移进细胞核内，并在表达Cas9蛋白的基因后面连接长链非编码RNAMALAT1的3’末端的三螺旋结构(Triplex)，以此来保护因核酶自我水解后失去ploy(A)后的Cas9mRNA。此质粒的构建如图1所示。

此外，使用hEF1a启动子来驱动白喉毒素基因的表达。

此P53蛋白基因检测系统主要由P53BER-SV40驱动表达的CRISPR-Cas9系统结合白喉毒素组成。构建的P53基因装置可在存在野生型P53的细胞中表达可工作的CRISPR-Cas9系统，sgRNA通过Wstson-Crick的碱基互补配对原理特异性靶标于DT的基因，sgRNA的序列靶标白喉毒素的片段具体如SEQ IDNO.2所示。Cas9蛋白在sgRNA的引导下选择性地切割白喉毒素的基因抑制其表达从而保护表达有野生型P53蛋白的细胞免受白喉毒素的破坏。在P53缺陷细胞中，由于CRISPR-Cas9系统不能正常表达，使白喉毒素正常表达而使细胞凋亡。

2、P53基因缺陷细胞识别：

在P53BER-SV40下游连接绿色荧光蛋白(GFP)，通过比较GFP在正常细胞系和P53缺陷细胞系中的表达情况以验证P53BER-SV40这一识别P53蛋白的基因装置的实用性，并使用有hEF1a启动子表达的远红色荧光蛋白(mKate)作为内参。293T和5637这两种细胞系选择作为实验细胞，分别代表具有正常和低水平的野生型p53的细胞，用来验证构建的P53蛋白识别装置的有效性。将构建好的质粒转染进293T和5637细胞中，在mKate蛋白表达基本相同的背景下，GFP在293T中正常表达，而在5637细胞中几乎没有表达。结果如图2所示。

3、白喉毒素诱导细胞凋亡：

根据白喉毒素的氨基酸序列，体外化学合成表达该氨基酸序列的核苷酸序列，并用hEF1a启动子驱动此白喉毒素的基因表达。把构建好的质粒转染进293T和5637细胞，培养48小时后，运用Caspase-3ELISA实验和细胞流式实验来评估白喉毒素的诱导凋亡的能力。结果显示，通过化学合成的白喉毒素序列能在细胞中正常表达白喉毒素蛋白并诱导细胞凋亡。结果如图3、图4所示。

4、特异性诱导P53缺陷细胞凋亡：

将构建的由P53BER-Cas9-sgRNA和白喉毒素组成的基因系统转染进293T和5637细胞，运用Caspase-3ELISA实验和细胞流式实验评估此基因系统的选择性识别能力和杀伤能力。结果如图3、图4所示，该基因系统能特异性地诱导5637细胞凋亡，而293T细胞却存活了下来。这些结果表明，构建的P53基因装置能有效地识别细胞能的P53蛋白，由该基因装置构建的基因系统通过选择性地使白喉毒素在P53缺陷细胞中的表达，能选择性地杀死P53缺陷细胞，并保护正常细胞免受白喉毒素的损害。

以上应用了具体实例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

序列表

<110> 深圳市第二人民医院

<120> 特异性识别P53突变的基因系统

<130> 18I26147

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtcattc accatgcaac ctctgctgtt aacagatttc agactgtaat cttttgtttc 60

ttctttctaa tcctgcactt cctctgactg ttccattttg gttccgagca agcaggccgc 120

ttgtgtctga atctggccaa tcctgaaatc tctgcttggc tttgtcagac aagttcaggc 180

atgcacagac atgtccatga gtttctcaga aggttgactc tgccaaagcc agaacaccac 240

tcccccactt tccactgggt cctgtgctcc aagctattgg acataagttt gtgctttcga 300

aacttcagta tttacacgga atctgtg 327

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggcaccaag cccggctacg 20

<210> 3

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gattcgtcag tagggttgta aaggtttttc ttttcctgag aaaacaacct tttgttttct 60

caggttttgc tttttggcct ttccctagct ttaaaaaaaa aaaagcaaaa 110

Claims

1.一种基因系统在制备用于特异性诱导P53缺陷细胞凋亡的药物中的用途，其特征在于：所述基因系统包括至少一段核苷酸序列，所述核苷酸序列含有能被野生型P53蛋白特异结合的靶标序列，所述靶标序列如SEQ ID NO.1所示；

所述基因系统还含有CRISPR-Cas9调控序列，所述CRISPR-Cas9调控序列包括Cas9蛋白的DNA序列及可经转录成为sgRNA的DNA序列，所述sgRNA的靶向基因为编码细胞毒性蛋白的基因；

所述基因系统还包括有基因启动子序列，所述基因启动子序列位于靶标序列的下游；

所述基因启动子为SV40启动子；

所述CRISPR-Cas9调控序列通过SV40启动子启动表达；

所述基因系统还包括编码细胞毒性蛋白的基因表达系统，所述基因表达系统包括启动子和编码细胞毒性蛋白的基因。

2.一种特异性识别P53突变并特异性诱导P53缺陷细胞凋亡的基因系统，其特征在于：所述基因系统包括至少一段核苷酸序列，所述核苷酸序列含有能被野生型P53蛋白特异结合的靶标序列，所述靶标序列如SEQ ID NO.1所示；

所述基因启动子为SV40启动子；

所述CRISPR-Cas9调控序列通过SV40启动子启动表达；

3.根据权利要求2所述的一种特异性识别P53突变并特异性诱导P53缺陷细胞凋亡的基因系统，其特征在于：所述细胞毒性蛋白为白喉毒素。

4.根据权利要求3所述的一种特异性识别P53突变并特异性诱导P53缺陷细胞凋亡的基因系统，其特征在于：所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求2~4任意一项所述的一种特异性识别P53突变并特异性诱导P53缺陷细胞凋亡的基因系统，其特征在于：所述CRISPR-Cas9调控序列中，Cas9蛋白的DNA序列两端连接有核定位序列NLS；

可经转录成为sgRNA的DNA序列两侧连接有核酶结构；

Cas9蛋白的DNA序列及可经转录成为sgRNA的DNA序列之间，还具有三螺旋结构。

6.根据权利要求5所述的一种特异性识别P53突变并特异性诱导P53缺陷细胞凋亡的基因系统，其特征在于：所述三螺旋结构的序列如SEQ ID NO.3所示。