KR20240034143A

KR20240034143A - 신규한 유전체 세이프 하버 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240034143A
Application number: KR1020230117859A
Authority: KR
Inventors: 최용진; 김기철; 안경훈; 유종상
Original assignee: 주식회사 대웅제약; 주식회사 에피바이오텍; 주식회사 아피셀테라퓨틱스
Priority date: 2022-09-05
Filing date: 2023-09-05
Publication date: 2024-03-13
Also published as: WO2024054006A1

Abstract

본 발명은 신규한 유전체 세이프 하버(GSH; genomic safe harbor) 및 이를 사용하여 외래 유전자를 발현시키는 방법, 상기 방법으로 외래 유전자가 도입된 세포에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 유전체 세이프 하버를 사용하여 외래 유전자를 발현시키는 방법은 근접한 유전자의 전사 교란 없이 외래 유전자가 안전하게 도입되고, 장기간 안정적으로 외래 유전자를 발현시킴으로써, 세포 내에서 다양한 외래 유전자를 안전상의 문제점이 없이 발현시킬 수 있다.

Description

신규한 유전체 세이프 하버 및 이의 용도 {NOVEL GENOMIC SAFE HARBOR AND THE USE THEREOF}

본 발명은 신규한 유전자 삽입용 유전체 세이프 하버(GSH; genomic safe harbor) 및 이를 사용하여 외래 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 유전체 세이프 하버는 외래 유전자가 안전하게 도입되고 안정적으로 외래 유전자를 발현시킴으로써, 세포 내에서 다양한 외래 유전자를 안전상의 문제점이 없이 발현시킬 수 있다.

인간의 질병을 치료하기 위한 강력한 수단 중 하나로 인간 유전체에 외래 유전자 (transgene)을 삽입하는 방법이 있다. 인간 세포에 삽입된 유전자는 숙주 세포의 특성을 변화시켜 질병치료에 적용할 수 있지만 유전자의 정확한 전달과 지속적인 발현을 위한 기술들이 적용되어야 한다.

인간 유전체에 유전자를 삽입하는 가장 일반적인 방법은 레트로바이러스 혹은 렌티바이러스 벡터를 이용하는 것이다. 그러나 해당 벡터들은 전사가 활성화 되어있는 유전자의 주위에 삽입되는 경향이 있어 숙주 세포에 돌연변이가 생길 가능성이 높다. 돌연변이가 암 관련 유전자에서 일어나 발현이 교란되면 다양한 종류의 암을 유발할 수 있다.

바이러스 벡터의 대안으로 CRISPR-Cas9과 homology-directed repair (HDR)를 기반으로 한 위치 특이적 유전자 삽입 시스템이 사용되고 있다. CRISPR는 clustered regularly interspaced short palindromic repeats의 약자로 박테리아의 적응성 면역체계로 작용하는 유전자 서열이다. 박테리아가 바이러스에 감염되면 CRISPR로부터 발현된 guide RNA (gRNA)가 핵산 가수분해효소인 Cas9과 결합하여 바이러스의 유전체 중 gRNA와 상보적인 서열을 지닌 부분을 인식하고 잘라 감염을 막는다. HDR은 DNA 이중 가닥 절단 (double strand break: DSB)가 발생했을 때 해당 위치서열과 상동성을 가지는 DNA 절편 등을 이용하여 손상된 DNA를 수복하는 과정이다. gRNA와 Cas9을 통해 유전체에 DSB를 유도하는 동시에 외래 유전자와 상동 서열을 가진 공여자 벡터를 도입하면 정밀한 유전자 삽입을 유도할 수 있다.

CRISPR-Cas9과 같은 기술을 사용함에 따라 외래 유전자를 도입하기에 적합한 유전체 상의 영역에 대한 탐색도 진행되고 있다. 인접한 유전자의 전사를 교란시키지 않으면서 외래 유전자의 발현을 유지할 수 있는 영역을 유전체 세이프 하버 (genomic safe harbor: GSH)라 한다. 기존에 연구된 19번 염색체에 존재하는 adeno-associated virus integration site 1 (AAVS1)이 GSH로 이용되지만, 유전자가 밀집해 있는 영역에 위치해 근접한 유전자의 전사를 교란시킬 가능성이 있음이 알려져 있고 (Sadelain et al., 2012), 도입된 외래 유전자의 발현이 억제되는 경향이 있다 (Ordovas et al., 2015). 따라서, 외래 유전자의 안전한 도입과 안정적인 발현을 위해 새로운 GSH 후보의 발굴이 필요하다.

본 발명자들은 새로운 유전체 세이프 하버에 적합한 영역을 찾기 위해 다양한 연구를 수행하였으며, 그 결과로 근접한 유전자의 전사를 교란시키지 않으며 외래 유전자를 안정적으로 발현하는 새로운 유전체 세이프 하버 영역을 찾음으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 외래 유전자가 안전하게 도입되고 안정적으로 발현되는 신규한 유전체 세이프 하버를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 신규한 유전체 세이프 하버를 이용하여 세포에서 외래 유전자를 발현하는 방법을 제공한다.

본 발명은 세포에 핵산분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입시켜 핵산 분해효소를 발현시키는 단계, 상기 핵산분해효소가 인간 유전체의 염색체 9에서 24894446번째 내지 24894525번째 제1 핵산 영역, 염색체 3에서 9064276번째 내지 9064355번째 제2 핵산 영역, 및 염색체 4에서 120174229번째 내지 120174308번째 제3 핵산 영역으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 핵산 영역에 특이적으로 결합하여 핵산 영역을 절단하는 단계, 및 상기 세포에 외래 폴리뉴클레오티드를 도입하고 상기 핵산 영역의 절단 부위에 삽입시키는 단계를 포함하는 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법을 제공한다.

일 실시태양에서, 상기 세포는 인간 혈액, 체액, 조직, 줄기세포 또는 암종에서 유래된 세포일 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 세포는 체세포, 생식세포, 줄기세포, 암세포 또는 세포주일 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 핵산분해효소는 아연 핑거 뉴클레이즈(Zinc Finger Nuclease), 탈렌(TALENs: Transcriptor Activator-Like Effector Nuclease), RGEN(RNA-guided engineered nucleases)에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 핵산분해효소는 Cas9일 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 핵산분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 결합 도메인, 가이드 RNA, 절단 도메인에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 세포에 핵산분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입시켜 핵산 분해효소를 발현시키는 단계 이후 상기 세포에 가이드 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 기능적 폴리리보뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 기능적 폴리리보뉴클레오티드는 마이크로 RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 피위-결합 RNA(piRNA), 소핵소체 RNA(snoRNA), 작은 핵 RNA(snRNA), 세포 외 RNA(exRNA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 항체, 효소, 성장인자, 수용체, 호르몬, 림포카인, 사이토카인, 신호전달인자, 리포터, 및 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 암호화하는 것일 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 소닉 헤지호그 유전자(Sonic hedgehog; SHH)일 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 열린 해독틀, 폴리아데닐화 서열, 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, 전사 조절 인자, 신호 서열, 및 하나 이상의 상동성 영역으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 핵산분해효소가 인간 유전체의 염색체 9에서 24894446번째 내지 24894525번째 제1 핵산 영역, 염색체 3에서 9064276번째 내지 9064355번째 제2 핵산 영역, 및 염색체 4에서 120174229번째 내지 120174308번째 제3 핵산 영역으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 핵산 영역에 특이적으로 결합하여 핵산 영역을 절단하는 단계 이후 제1 내지 제3 핵산 영역의 절단부위 중 하나 이상에서 좌측 1kb까지의 영역에 결합하는 부위인 좌측 상동성 암(left homology arm; LHA) 및 우측 1kb까지의 영역에 결합하는 부위인 우측 상동성 암(right homology arm; RHA)를 외래 폴리뉴클레오티드에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 핵산분해효소가 인간 유전체의 염색체 9에서 24894446번째 내지 24894525번째 제1 핵산 영역, 염색체 3에서 9064276번째 내지 9064355번째 제2 핵산 영역, 및 염색체 4에서 120174229번째 내지 120174308번째 제3 핵산 영역으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 핵산 영역에 특이적으로 결합하여 핵산 영역을 절단하는 단계 이후 제1 내지 제3 핵산 영역의 절단부위 중 하나 이상에서 좌측 0.8kb까지의 영역에 결합하는 부위인 좌측 상동성 암(left homology arm; LHA) 및 우측 0.8kb까지의 영역에 결합하는 부위인 우측 상동성 암(right homology arm; RHA)를 외래 폴리뉴클레오티드에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 하나 이상의 핵산분해효소에 의해 세포의 유전체에 외래 폴리뉴클레오티드가 삽입된 세포를 제공하며, 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 세포의 유전체에서 인간 유전체의 염색체 9에서 24894446번째 내지 24894525번째 제1 핵산 영역, 염색체 3에서 9064276번째 내지 9064355번째 제2 핵산 영역, 및 염색체 4에서 120174229번째 내지 120174308번째 제3 핵산 영역 중 선택된 하나 이상에 삽입된 것일 수 있다.

본 발명은 인간 유전체의 염색체 9에서 24894446번째 내지 24894525번째 제1 핵산 영역, 염색체 3에서 9064276번째 내지 9064355번째 제2 핵산 영역, 및 염색체 4에서 120174229번째 내지 120174308번째 제3 핵산 영역 중 선택된 하나 이상에 특이적으로 결합하는 핵산분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 외래 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포에 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 조성물을 제공한다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 제1 내지 제3 핵산 영역의 절단부위 중 하나 이상에서 좌측 1kb까지의 영역에 결합하는 부위인 좌측 상동성 암(left homology arm; LHA) 및 우측 1kb까지의 영역에 결합하는 부위인 우측 상동성 암(right homology arm; RHA)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 서열번호 3 내지 5의 서열 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%, 95% 또는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 서열번호 3 내지 5의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일 실시태양에서, 상기 서열번호 3의 서열은 인간 유전체의 염색체 9에서 24894446번째 내지 24894525번째 핵산 영역과 특이적으로 결합할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 서열번호 4의 서열은 인간 유전체의 염색체 3에서 9064276번째 내지 9064355번째 핵산 영역과 특이적으로 결합할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 서열번호 5의 서열은 인간 유전체의 염색체 4에서 120174229번째 내지 120174308번째 핵산 영역과 특이적으로 결합할 수 있다.

본 발명은 서열번호 14 및 15의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 서열번호 16 및 17의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 서열번호 17 및 18의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 유전체 세이프 하버는 외래 유전자가 도입되어도 인접한 유전자의 전사를 교란시키지 않으면서, 안정적으로 외래 유전자의 발현을 유지하는 특징을 갖는다. 따라서 본 발명의 유전체 세이프 하버는 다양한 외래 유전자의 세포 내 발현에 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 gRNA/Cas9 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 공여자 벡터의 모식도이다.
도 3은 AAVS1 및 본 발명의 GSH 1 내지 3을 표적으로 하는 gRNA/Cas9 발현 벡터 제작 과정의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 공여자 벡터 제작 과정의 모식도이다.
도 5는 본 발명의 gRNA/Cas9 발현 벡터와 공여자 벡터를 사용한 외래 유전자 도입 과정의 모식도이다.
도 6은 GFP 유전자가 도입된 세포의 평균 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 AAVS 및 본 발명의 GSH 1 내지 3 근접 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 ES-MSC의 GSH3 위치에 SHH 유전자를 도입하는 과정의 모식도이다.
도 9는 SHH 과발현 ES-MSC (SHH-ES-MSC)의 SHH mRNA 발현을 나타낸 그래프 및 모낭 신생능을 나타낸 사진이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.

본원 명세서 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 "유전체 세이프 하버"는 인접한 유전자의 전사를 교란시키지 않으면서 외래 유전자의 발현을 유지할 수 있는 영역을 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 "핵산 분해 효소"는 유전체 편집 또는 유전자 편집에 사용되는 단백질로, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레이즈(Zinc Finger Nuclease), 탈렌(TALENs: Transcriptor Activator-Like Effector Nuclease), RGEN(RNA-guided engineered nucleases)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 사용된 용어 "외래 폴리뉴클레오티드"는 인위적으로 도입되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

본 발명에 사용된 용어 "가이드 RNA"는 표적 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA와 상보적으로 결합하여 핵산분해효소가 표적 DNA를 절단할 수 있게 한다.

본 발명에 사용된 용어 "좌 상동성 서열(left homology arm; LHA)"는 인간 유전체 DNA에서 핵산 분해 효소에 의해 절단된 부위의 좌단과 결합 가능한 서열을 의미하며, 바람직하게는 1000 베이스 페어, 더욱 바람직하게는 800 베이스 페어일 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "우 상동성 서열(right homology arm; RHA)"는 인간 유전체 DNA에서 핵산 분해 효소에 의해 절단된 부위의 우단과 결합 가능한 서열을 의미하며, 바람직하게는 1000 베이스 페어, 더욱 바람직하게는 800 베이스 페어일 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포 내에 1개 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있는, 바람직하게는 이를 발현시킬 수 있는 구축물을 의미할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예를 들어 생산자 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "예방"은 조성물의 투여에 의해 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 조성물의 투여에 의해 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1]

유전체 세이프 하버 발현을 위한 벡터의 제작

gRNA 서열을 포함하며 Cas9 단백질을 발현시킬 수 있고, gRNA에 상보적인 서열에 Cas9이 작용하여 DNA 이중사슬 손상(Double-Strand Break; DSB)를 유도하는 서열번호 1의 gRNA/Cas9 발현 벡터를 준비하였다.

gRNA/Cas9 발현 벡터는 도 1에 나타낸 바와 같이, 복제 기점 (origin of replication: ori), U6 프로모터, gRNA scaffold, 사이토메갈로바이러스 프로모터 (CMV promoter), 닭 베타 액틴 프로모터 (chicken beta actin promoter), Cas9 유전자, puromycin 저항성 유전자, Poly(A) tail, ampicillin 저항성 유전자를 포함한다.

표적 단백질을 암호화하는 유전자 서열이 GSH에 삽입되도록 하는 서열번호 2의 공여자 벡터를 준비하였다. 본 연구에서는 형광을 발광하는 green fluorescent protein (GFP) 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 삽입하여 시스템의 효율을 측정하였다. 공여자 벡터는 도 2에 나타낸 바와 같이, 복제 기점, GSH 상동성 영역, puromycin 저항성 유전자, 닭 베타 액틴 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, GFP 유전자, cHS4 인슐레이터, kanamycin 저항성 유전자를 포함하며, 상기 상동성 영역은 GSH 위치에 따라 달라지게 제작하였다.

[실시예 2]

유전체 세이프 하버 후보 선별

암 관련 유전자이며, miRNA이고, functional small RNA로부터 300 kb 이상 떨어진 위치, 유전자의 5' 말단으로부터 50 kb 이상 떨어진 위치, 복제 기점으로부터 50 kb 이상 떨어진 위치, Ultra-conserved 영역으로부터 50 kb 이상 떨어진 위치, 낮은 전사 활성도를 보이는 위치, 복제수 변이 (copy number variation) 영역에 포함되지 않는 위치, Open chromatin 영역에 포함되는 위치, 인간 염색체 상에 한 개의 copy만 존재하는 서열 및 TTAA sequence (transposon) 없는 서열을 기준으로 잡아 GSH 후보를 선별하였다.

이후, gRNA 도출 tool인 CRISPick, DeepSpCas9 및 RGEN을 사용하여 표 1에 나타낸 바와 같이, 3개의 GSH 후보 영역 및 그에 상응하는 gRNA 서열을 확보하였다. 상기 CRISPick (Broad institute)은 gRNA가 유전체 상의 상보적인 위치에 얼마나 특이적으로 반응할 수 있는지 여부를 on-target score를 통해 나타낸다. DeepSpCas9은 gRNA에 의한 유전체 편집 효율성을 indel frequency score를 통해 보여준다. RGEN은 염색체와 gRNA의 mismatch 여부를 확인할 수 있다.

서열번호	명칭	염색체	시작	끝	gRNA 서열
3	GSH1	9	24894446	24894525	CTTCAGTGCTCTACTCTTGT
4	GSH2	3	9064276	9064355	GTAAGCAAACCACAACGTCT
5	GSH3	4	120174229	120174308	TCTGAGACAGCTAATATCAT

[실시예 3]

유전체 세이프 하버 및 AAVS1을 표적으로 하는 gRNA/Cas9 발현 벡터 제작

AAVS1, GSH1, GSH2 및 GSH3을 표적으로 하는 gRNA insert를 gRNA/Cas9 발현 벡터(px459)에 하기와 같이 도입하였다.

AAVS1, GSH1, GSH2 및 GSH3을 표적으로 하는 gRNA insert 서열에 기반한 DNA oligo를 합성하였다. 이후 제한 효소인 BbsI을 처리하여 gRNA/Cas9 발현 벡터를 절단하고, 절단되어 선형화된 gRNA/Cas9 발현 벡터에 상기 합성한 DNA oligo를 도입한 후 ligation 하였다. 이후 PCR을 통해 도입 여부를 확인한 후, Sanger sequencing을 통해 벡터에 도입된 gRNA 서열을 검증하였다. 상기 과정에 대한 모식도를 도 3에 나타내었다.

서열번호	명칭	염기서열
6	GSH1-primerF	CACCGTTCAGTGCTCTACTCTTGT
7	GSH1-primerR	AAACACAAGAGTAGAGCACTGAAC
8	GSH2-primerF	CACCGTAAGCAAACCACAACGTCT
9	GSH2-primerR	AAACAGACGTTGTGGTTTGCTTAC
10	GSH3-primerF	CACCGTCTGAGACAGCTAATATCA
11	GSH3-primerR	AAACTGATATTAGCTGTCTCAGAC
12	AAVS1-primerF	ACCGTCCCCTCCACCCCACAGTG
13	AAVS1-primerR	AACCACTGTGGGGTGGAGGGGAC

[실시예 4]

공여자 벡터 제작

효율적인 HDR을 촉진시키기 위해 공여자 벡터에 표적에 따른 상동성 서열 (≥800 kb)을 하기와 같이 도입하였다. CRISPR-Cas9 시스템에 의해 DSB가 일어나는 위치의 상부 또는 하부 약 800 kb를 각각 좌 상동성 서열 및 우 상동성 서열 (left homology arm, right homology arm)으로 지칭하였다. 이후 AAVS1, GSH1, GSH2 및 GSH3의 유전체 내 위치에 따른 서열번호 14 내지 21의 좌 상동성 서열 및 우 상동성 서열을 PCR을 통해 인간 지방줄기세포로부터 확보한 유전체를 기반으로 합성하였다. 이후 제한 효소인 PmeI 및 NotI를 처리하여 공여자 벡터를 절단하였다. Gibson assembly master mix (NEB)를 이용해 절단으로 선형화된 공여자 벡터에 상동성 서열을 도입하고, PCR을 통해 도입 여부를 확인한 후, Sanger sequencing을 통해 벡터에 도입된 상동성 DNA 서열을 검증하였다. 상기 과정을 통하여 서열번호 22 내지 25의 공여자 벡터를 획득하였으며, 상기 과정에 대한 모식도를 도 4에 나타내었다.

[실시예 5]

유전체 내 AAVS1, GSH1, GSH2, GSH3 위치에 공여자 벡터의 GFP 발현 카세트 도입 및 발현 확인

GFP 유전자의 도입 및 발현 검증을 위해 293T 세포를 사용하였다. 상기 293T 세포는 10% fetal bovine serum (v/v), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco)에서 배양하였다.

형질감염 하루 전 24 well 배양접시의 1 well 당 5 x 10⁴ 개의 293T 세포를 분주하고 24 시간동안 CO₂incubator에서 배양한다. 24시간 후 항생제가 포함되지 않은 293T 세포 배양액으로 갈아준다. 2개의 1.5 ml tube에 25 μl의 Opti-MEM (Gibco)을 각각 분주한다. 1개의 tube (1번 tube)에 gRNA/Cas9 벡터 650 ng, 공여자 벡터 1300 ng을 혼합한다. 나머지 1개의 tube (2번 tube)에 Lipofectamine 2000 2 μl을 혼합한다. 2번 tube의 용액을 1번 tube로 옮겨서 섞어준 후 실온에서 10분간 incubation 한다. 10분 후 벡터가 포함된 약 50 μl의 용액을 24 well 배양접시에 깔려있는 293T 세포에 추가하여 형질감염 시킨다. 48시간 후 새로운 배양액으로 교체해준다.

100 mm 배양 접시 당 1,000 개의 상기 형질감염된 세포를 접종하고, 2주 뒤 GFP가 발현되는 단일 세포 유래 콜로니를 선별하였다. AAVS1, GSH1, GSH2, GSH3에 GFP 발현 카세트를 도입한 293T 세포에서 각각 6, 7, 6, 6개의 콜로니를 선별한 후, 도 5a와 같이 PCR을 수행하여 HDR로 인한 외래 유전자의 도입을 확인하여 그 결과를 도 5b 내지 도 5e에 나타내었다.

또한, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 유전자 도입이 확인된 클론은 AAVS1, GSH1, GSH2, GSH3에서 각각 16.67%, 42.85%, 50%, 66.67%로 나타났다.

GSH	Knonk-in %
AAVS1	16.67
GSH1	42.85
GSH2	50.00
GSH3	66.67

도입된 GFP 유전자의 발현 안정성을 확인하기 위해 유세포 분석을 통해 GFP의 평균 형광 강도 (mean fluorescence intensity: MFI)를 1주일에 한 번씩 4주간 측정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, GSH1, GSH2, GSH3에 GFP를 도입한 경우 모두 AAVS1에 GFP를 도입한 경우보다 높은 MFI 수치를 나타내었다.

[실시예 6]

근접 유전자 발현 변화 확인

GSH 위치에 외래 유전자를 도입했을 때 근접한 유전자의 전사 교란 없이 외래 유전자의 안정적인 발현을 유도할 수 있는지 확인하였다. AAVS1에서 10개, GSH1에서 3개, GSH2에서 1개, GSH3에서 4개의 근접 유전자들의 발현 변화를 real-time PCR로 분석하였다. AAVS1, GSH1, GSH2, GSH3 위치와 근접한 유전자 사이의 거리는 표 6에 나타내었다.

AAVS1, GSH1, GSH2, GSH3에 GFP 발현 카세트를 도입한 293T 세포에서 PureLink RNA mini kit (Invitrogen)를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 정량하고 AccuPower RT Master Mix (BIONEER)를 사용해 complementary DNA (cDNA)를 합성하였다. QuantStudio 1 Real-time PCR 시스템 (Thermo Fisher)에서 TB Green Premix Ex Taq ±로 100 ng의 cDNA를 분석하여 각 유전자의 상대적 발현을 측정하였다. Ct 값이 37 이상인 유전자(IZUMO3)는 제외하였다.

도 7a에 나타난 바와 같이, AAVS1에 근접한 유전자 10개 중 5개 (NLRP2, EPS8L1, TNNI3, SYT5, PTPRH)의 발현이 유의적으로 증가 혹은 감소하였다. 도 7b에 나타난 바와 같이, GSH1에 근접한 유전자의 발현은 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 도 7c에 나타난 바와 같이, GSH2에 근접한 유전자 NXPH1의 발현은 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 도 7d에 나타난 바와 같이, GSH3에 근접한 4개의 유전자 모두 발현에 유의적인 차이가 나타나지 않았다.

따라서 GSH1, GSH2 및 GSH3 위치는 AAVS1에 비해 유전자 발현 효율이 높을 뿐만 아니라 근접한 유전자의 전사에 영향이 없어 외래 유전자 도입 시 우수한 안전성을 갖는 것을 알 수 있다.

[실시예 7]

인간 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포 (embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cell: ES-MSC)의 GSH3 위치에 Sonic hedgehog (SHH) 유전자 도입 후 모낭 신생 여부 평가

7.1 SHH 발현 카세트 제작

ES-MSC의 GSH3 위치에 SHH 유전자를 도입하기 위해 도 8과 같이, GFP 대신 SHH 유전자 서열을 삽입한 공여자 벡터를 제작하였다. 공여자 벡터 제작은 하기와 같이 진행하였다. 첫 번째로, 제한 효소를 처리해 공여자 벡터로부터 GFP 유전자 서열 제거하였다. 이후, PCR을 통해 SHH 발현 벡터 (OriGene)로부터 SHH 유전자 절편을 제작하였다. 상기 SHH 유전자 절편을 Gibson assembly 기법을 통해 공여자 벡터에 삽입하였다. PCR을 통해 상기 절편의 벡터 내 도입 여부를 검증하고, Sanger sequencing을 통해 벡터에 도입된 상동성 DNA 서열을 검증하였다.

7.2 GSH3으로의 SHH 발현 카세트 도입

GSH3 위치로 공여자 벡터의 SHH 발현 카세트를 도입하였다. 이후, SHH 발현 카세트의 발현 유무를 확인하기 위해 실험을 진행하였다. ES-MSC를 StemPro MSC SFM XenoFree medium (Gibco)에 L-glutamine (2 mM), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml)이 첨가된 배지에서 배양하였다. gRNA/Cas9 발현 벡터와 공여자 벡터를 1 : 2 비율로 조합하고, Neon electroporation (Invitrogen) 기기를 이용해 2 x 106 개의 ES-MSC 세포에 형질감염 시켰다. Real-time PCR을 통해 SHH 유전자의 과발현 여부를 검증한 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이, 형질감염된 세포에서 SHH mRNA의 발현이 약 13배 증가하였다.

7.3 SHH 발현 카세트의 모낭 신생능 평가

Patch assay를 통해 SHH 과발현 ES-MSC (SHH-ES-MSC)의 모낭 신생능을 평가하였다. 갓 태어난 C57BL/6 마우스의 피부에서 표피세포와 진피세포를 분리하였다. Ultra-low attachment 96-well round bottom plate (S-Bio)에서 배양한 ES-MSC 스페로이드 (개당 1 x 10⁴ 개의 세포) 100개와 표피세포 1 x 10⁶ 개를 섞어 6주령의 누드 마우스 (BALB/cAJcl-nu)의 등쪽 피하에 이식하였다. 표피세포와 진피세포를 섞어서 이식한 그룹을 양성 대조군으로, 표피세포만 이식한 그룹을 음성 대조군으로 사용하였다. 도 9b에 나타낸 바와 같이, 이식 3주 후 SHH-ES-MSC를 이식한 그룹에서 모낭이 형성된 것을 확인하였다.

Claims

(1) 세포에 핵산분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입시켜 핵산 분해효소를 발현시키는 단계;
(2) 상기 핵산분해효소가 인간 유전체의 염색체 9에서 24894446번째 내지 24894525번째 제1 핵산 영역, 염색체 3에서 9064276번째 내지 9064355번째 제2 핵산 영역, 및 염색체 4에서 120174229번째 내지 120174308번째 제3 핵산 영역으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 핵산 영역에 특이적으로 결합하여 핵산 영역을 절단하는 단계; 및
(3) 상기 세포에 외래 폴리뉴클레오티드를 도입하고 상기 핵산 영역의 절단 부위에 삽입시키는 단계
를 포함하는 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 인간 혈액, 체액, 조직, 줄기세포 또는 암종에서 유래된 것을 특징으로 하는, 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 체세포, 생식세포, 줄기세포, 암세포 또는 세포주인 것을 특징으로 하는, 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산분해효소는 아연 핑거 뉴클레이즈(Zinc Finger Nuclease), 탈렌(TALENs: Transcriptor Activator-Like Effector Nuclease), 및 RGEN(RNA-guided engineered nucleases)에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제4항에 있어서, 상기 핵산분해효소는 Cas9인 것을 특징으로 하는 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 결합 도메인, 가이드 RNA, 및 절단 도메인에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는, 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포에 가이드 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 기능적 폴리리보뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제8항에 있어서, 상기 기능적 폴리리보뉴클레오티드는 마이크로 RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 피위-결합 RNA(piRNA), 소핵소체 RNA(snoRNA), 작은 핵 RNA(snRNA), 및 세포 외 RNA(exRNA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제8항에 있어서, 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 항체, 효소, 성장인자, 수용체, 호르몬, 림포카인, 사이토카인, 신호전달인자, 리포터, 및 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 암호화하는 것을 특징으로 하는, 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제8항에 있어서, 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 소닉 헤지호그 유전자(Sonic hedgehog; SHH)인 것을 특징으로 하는, 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제8항에 있어서, 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 열린 해독틀, 폴리아데닐화 서열, 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, 전사 조절 인자, 신호 서열, 및 하나 이상의 상동성 영역으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제1항에 있어서, 제1 내지 제3 핵산 영역의 절단부위 중 하나 이상에서 좌측 1kb까지의 영역에 결합하는 부위인 좌측 상동성 암(left homology arm; LHA) 및 우측 1kb까지의 영역에 결합하는 부위인 우측 상동성 암(right homology arm; RHA)를 외래 폴리뉴클레오티드에 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
제13항에 있어서, 제1 내지 제3 핵산 영역의 절단부위 중 하나 이상에서 좌측 0.8kb까지의 영역에 결합하는 부위인 좌측 상동성 암(left homology arm; LHA) 및 우측 0.8kb까지의 영역에 결합하는 부위인 우측 상동성 암(right homology arm; RHA)를 외래 폴리뉴클레오티드에 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포에서 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
하나 이상의 핵산분해효소에 의해 세포의 유전체에 외래 폴리뉴클레오티드가 삽입된 세포로서,
상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 세포의 유전체에서 인간 유전체의 염색체 9에서 24894446번째 내지 24894525번째 제1 핵산 영역, 염색체 3에서 9064276번째 내지 9064355번째 제2 핵산 영역, 및 염색체 4에서 120174229번째 내지 120174308번째 제3 핵산 영역 중 선택된 하나 이상에 삽입된 것을 특징으로 하는 세포.
인간 유전체의 염색체 9에서 24894446번째 내지 24894525번째 제1 핵산 영역, 염색체 3에서 9064276번째 내지 9064355번째 제2 핵산 영역, 및 염색체 4에서 120174229번째 내지 120174308번째 제3 핵산 영역 중 선택된 하나 이상에 특이적으로 결합하는 핵산분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 외래 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포에 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 조성물.
제16항에 있어서, 제1 내지 제3 핵산 영역의 절단부위 중 하나 이상에서 좌측 1kb까지의 영역에 결합하는 부위인 좌측 상동성 암(left homology arm; LHA) 및 우측 1kb까지의 영역에 결합하는 부위인 우측 상동성 암(right homology arm; RHA)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포에 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 조성물.
제17항에 있어서, 제1 내지 제3 핵산 영역의 절단부위 중 하나 이상에서 좌측 0.8kb까지의 영역에 결합하는 부위인 좌측 상동성 암(left homology arm; LHA) 및 우측 0.8kb까지의 영역에 결합하는 부위인 우측 상동성 암(right homology arm; RHA)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포에 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 조성물.
제16항에 있어서, 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 소닉 헤지호그 유전자(Sonic hedgehog; SHH)인 것을 특징으로 하는, 세포에 외래 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 조성물.
서열번호 3 내지 5의 서열 중 어느 하나의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제20항에 있어서, 서열번호 3 내지 5의 서열 중 어느 하나의 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제20항에 있어서, 서열번호 3 내지 5의 서열 중 어느 하나의 서열과 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제20항에 있어서, 서열번호 3 내지 5의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제20항에 있어서, 상기 서열번호 3의 서열은 인간 유전체의 염색체 9에서 24894446번째 내지 24894525번째 핵산 영역과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
제20항에 있어서, 상기 서열번호 4의 서열은 인간 유전체의 염색체 3에서 9064276번째 내지 9064355번째 핵산 영역과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
제20항에 있어서, 상기 서열번호 5의 서열은 인간 유전체의 염색체 4에서 120174229번째 내지 120174308번째 핵산 영역과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
서열번호 14 및 15의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
서열번호 16 및 17의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
서열번호 18 및 19의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제27항 내지 제29항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.