JP6814155B2 - 対象とする細胞を選択的に除去する方法及び組成物 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６２／０９１，４３１号に対する優先権を主張し、その開示を本明細書に参考として援用する。

本発明は、選択的細胞除去に一般的に関する。

癌は、世界的な疾病及び死亡の主因をなし、２０１２年には新規症例は約１４百万例、癌関連死は８．２百万例あり、これは全死亡人数の１４．６％を占めた（ＷＨＯウェブサイト（２０１４年１１月）「Ｃａｎｃｅｒ」）。癌の主な特徴として、身体のその他の部分に浸潤又は拡大する可能性を有する異常な細胞増殖である。癌の理想的な療法は、すべての健常細胞を無傷のままにして、すべての癌細胞を完全に除去することである。しかし、治療薬の非選択性に起因して、現行の全身療法を受ける癌患者は、悪心から不妊症まで複数の副作用を経験する。従って、癌細胞を選択的に除去するが非癌細胞を保存する新規治療薬を開発するニーズがなおも認められる。

本開示は、非標的細胞には影響を及ぼさずに、標的細胞を選択的に殺傷するのに適する組成物及び方法に一般的に関する。

１つの態様では、本出願は、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ；ｂ）Ｃａｓタンパク質；及びｃ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物について開示する。いくつかの実施形態では、前記標的配列は、標的細胞に固有である。一実施形態では、標的配列は、標的細胞内に染色体転座のブレークポイント結合部を含む。一実施形態では、標的細胞は、癌細胞である。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一実施形態では、自殺遺伝子は、ウイルス性チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、抗酸化系酵素（ＡＯＥ）に対する細胞内抗体、細菌性ニトロレダクターゼ、カスパーゼ、及びＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される。一実施形態では、自殺遺伝子は、制御エレメントと作動可能に連結している。一実施形態では、制御エレメントは、最小プロモーターである。一実施形態では、自殺遺伝子は、癌特異的プロモーターと作動可能に連結している。

１つの態様では、本出願は、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列；及びｃ）自殺遺伝子をコードする第３のヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターを含み、第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列が同一の又は異なるベクター（複数可）内にある組成物について開示する。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする前記第２のヌクレオチド配列は、癌特異的プロモーターと作動可能に連結している。

１つの態様では、本出願は、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する第１の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第１のガイドＲＮＡ；ｂ）標的細胞のゲノム内に存在する第２の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第２のガイドＲＮＡ；ｃ）Ｃａｓタンパク質；及びｄ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物について開示する。

別の態様では、本出願は、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する第１の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第１のガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）標的細胞のゲノム内に存在する第２の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第２のガイドＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列；ｃ）Ｃａｓタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列；及びｄ）自殺遺伝子をコードする第４のヌクレオチド配列を含み、第１、第２、第３、及び第４のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある組成物について開示する。

１つの態様では、本出願は、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列；及びｃ）自殺遺伝子をコードする第３のヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターを含み、第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある細胞について開示する。

１つの態様では、本出願は、ａ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第１の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第１のガイドＲＮＡ；ｂ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第２の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第２のガイドＲＮＡ；ｃ）Ｃａｓタンパク質；及びｄ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物について開示する。

別の態様では、本出願は、ａ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第１の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第１のガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第２の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第２のガイドＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列；ｃ）Ｃａｓタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列；及びｄ）自殺遺伝子をコードする第４のヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターを含み、第１、第２、第３、及び第４のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある組成物について開示する。

なおも別の態様では、本出願は、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ；ｂ）Ｃａｓタンパク質；及びｃ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を標的細胞に導入するステップを含む方法について開示する。いくつかの実施形態では、前記標的配列は、コントロール細胞のゲノム内には存在しない。一実施形態では、標的細胞は癌細胞であり、またコントロール細胞は健常細胞である。

別の態様では、本出願は、標的細胞を、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列；及びｃ）自殺遺伝子をコードする第３のヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターと接触させるステップを含み、第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある方法について開示する。

１つの態様では、本出願は、複数の標的細胞を、ａ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第１の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第１のガイドＲＮＡ；ｂ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第２の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第２のガイドＲＮＡ；ｃ）Ｃａｓタンパク質；及び、ｄ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物と接触させるステップを含む方法について開示する。

１つの態様では、本出願は、複数の標的細胞を、ａ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第１の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第１のガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第２の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第２のガイドＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列；ｃ）Ｃａｓタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列；及びｄ）自殺遺伝子をコードする第４のヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターと接触させるステップを含み、第１、第２、第３、及び第４のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある方法について開示する。

１つの態様では、本出願は、癌細胞を、ａ）癌細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列；及びｃ）自殺遺伝子をコードする第３のヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターと接触させるステップを含み、第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある、癌を治療する方法について開示する。一実施形態では、前記標的配列は、癌細胞に固有である。

別の態様では、本出願は、ａ）遺伝子ターゲティングヌクレアーゼ又はその変異体；及びｂ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、遺伝子ターゲティングヌクレアーゼが、標的細胞のゲノム内に存在する標的配列への自殺遺伝子の組込みを促進する能力を有する組成物について開示する。一実施形態では、遺伝子ターゲティングヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓタンパク質、又はメガヌクレアーゼである。

１つの態様では、本出願は、標的細胞内の第１の染色体に存在する配列に対して相補的な第１のヌクレオチド配列、及び標的細胞内の第２の染色体に存在する配列に対して相補的な第２のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡについて開示する。

１つの態様では、本出願は、（ａ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチド；（ｂ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドの上流に位置する第１のホモロジーアームであって、標的細胞内の第１の染色体内の配列を含む第１のホモロジーアーム；及び（ｃ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドの下流に位置する第２のホモロジーアームであって、標的細胞内の第２の染色体内の配列を含む第２のホモロジーアームを含むベクターについて開示する。

別の態様では、本開示は、少なくとも第１の細胞と第２の細胞とを含む細胞集団内の第１の細胞を選択的に除去する方法に関し、同方法は、ａ）第１の細胞のゲノム内に存在する遺伝子座を同定するステップであって、前記遺伝子座がポリヌクレオチド配列を含み、第２の細胞が、そのゲノム内にポリヌクレオチド配列を含まないステップと、ｂ）前記遺伝子座に自殺遺伝子を組み込んで、第１の細胞の細胞死を誘発するステップとを含む。特定の実施形態では、第１の細胞は癌細胞である。

特定の実施形態では、本開示は、ａ）対象の癌細胞のゲノム内に存在する標的遺伝子座を同定するステップであって、前記遺伝子座が、標的ポリヌクレオチド配列を含むが、健常細胞は、そのゲノム内に標的ポリヌクレオチド配列を含まないステップと、ｂ）組成物を対象に投与するステップであって、前記組成物が、（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質、及び（ｉｉｉ）自殺遺伝子を含むステップと、ｃ）癌細胞のゲノム内に存在する遺伝子座に自殺遺伝子を組み込むステップと、ｄ）癌細胞の細胞死を誘発するステップを含む、対象における癌細胞を選択的に除去する又は低減する方法を提供する。

本発明のこれらの及びその他の特徴、態様、及び利点は、下記の説明、添付の特許請求の範囲、及び添付図面においてより良く理解されるようになる。

染色体転座を含有する標的細胞に固有の標的配列に、自殺遺伝子を挿入する説明図である。遺伝子１のＤＮＡ断片は、遺伝子２の遺伝子座に転座し、遺伝子２のＤＮＡ断片と融合する。染色体転座を含有する細胞に固有の標的配列が、結合ポイント周辺の配列に基づき同定される。 ＡＡＶＳ１遺伝子座の配列を説明する図である。ガイドＲＮＡ（Ｔ１及びＴ２）を設計するのに用いられる配列に下線を付す。 ＡＬＬ患者におけるｔ（９；２２）の結合配列の説明図である。染色体９、９ｑ⁺、２２ｑ^-、及び２２は、転座前後のブレークポイント結合部周辺の配列を表す。第９番染色体に由来の配列を大文字で、第２２番染色体に由来の配列を小文字で表す。Ｃａｓ９ ＰＡＭ配列（下線）を含有する標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡデザインツールにより同定される。

上記発明の概要及び発明を実施するための形態、及び下記の特許請求の範囲、及び添付図面では、本発明の特別な特徴（方法ステップを含む）について触れられている。本明細書の本発明の開示には、そのような特別な特徴のすべての考え得る組合せが含まれるものと理解される。例えば、特別な特徴が、本発明の特別な態様若しくは実施形態、又は特別な特許請求の範囲に関して開示される場合、当該特徴は、可能な範囲で、本発明のその他の特別な態様及び実施形態と組み合わせて、及び／又はそれに関してやはり利用可能であり、また本発明において一般的に利用可能である。

用語「含む」及びその文法的に同等な用語は、本明細書では、その他の構成成分、配合物質、ステップ等が、任意選択的に存在することを意味するように用いられる。例えば、構成成分Ａ、Ｂ、及びＣ「を含む」（又は、それらを「含む」ところの）ものは、構成成分Ａ、Ｂ、及びＣから構成され得る（すなわち、これらのみを含み得る）、又は構成成分Ａ、Ｂ、及びＣに限らず、１つ若しくは複数のその他の構成成分も含み得る。

２つ以上の定義されたステップを含む方法について本明細書で触れられる場合、定義されたステップは、任意の順序で、又は同時に実施可能であり（文脈によりそのような可能性が除外される場合を除く）、また方法は、定義されたどのステップよりも前に、２つの定義されたステップの間において、又は定義された全ステップの後に実施される１つ若しくは複数のその他のステップを含み得る（文脈によりそのような可能性が除外される場合を除く）。

ある範囲の数値が提示される場合、文脈より別途明確に規定されない限り、下限値の単位の１／１０までの、その範囲の上限値と下限値の間の各中間の数値、及びその記載された範囲内の任意のその他の記載された数値又は中間の数値が、記載された範囲内で特に除外される任意の限界値の対象である開示内に含まれると理解される。限界値の一方又は両方が記載された範囲に含まれる場合、そのような範囲に含まれる限界値のいずれか一方又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。

説明図の簡略化及び明確化を目的として、該当する場合には、対応する要素又は類似する要素を示すために、異なる図中で参照番号が繰り返し用いられるものと認識される。更に、非常に多くの具体的詳細内容が、本明細書に記載する実施形態について理解を徹底させるために記載される。但し、本明細書に記載する実施形態は、それらの具体的詳細内容がなくても実践可能である。その他の事例では、方法、手順、及び構成成分は、記載されている、関係のある該当機能が分かりにくくならないように、詳細には記載されていない。またやはり、説明は、本明細書に記載する実施内容の範囲を制限するものとはみなされない。本開示に記載する実施形態の説明及び特徴付けは、別途明記しない限り、相互に排他的とはみなされないものと理解される。

本開示は、特に標的細胞を殺傷するのに利用可能である組成物に関する。１つの態様では、本出願は、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ；ｂ）Ｃａｓタンパク質；及びｃ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物について開示する。

本明細書で用いる場合、「標的配列」とは、ガイド配列がそれと相補性を有するように設計される配列を意味し、この場合、標的配列とガイド配列の間でハイブリダイゼーションが生じて、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）複合体の形成が促進される。ＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素、及び遺伝子編集用にＣＲＩＳＰＲ複合体を用いる機構は記載されている（例えば、Ｍ Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年、第３３７巻：８１６〜８２１頁；Ｌ Ｃｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年、第３３９巻：８１９〜８２３頁；国際公開広報ＷＯ２０１３１７６７７２、ＷＯ２０１３１６９８０２、ＷＯ２０１４０１８４２３、及び米国特許第８，６９７，３５９号）。標的配列が、標的配列においてＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに必要とされるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を標的配列の３’末端に含む限り、標的配列は、標的細胞のゲノム内に存在する任意の配列であり得る。例示的な標的配列として、標的細胞のゲノム中のユニークな配列が挙げられる。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合、ゲノム内に存在するユニーク標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの形式のＣａｓ９標的部位を含み得るが、但し、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣである；及びＸは、任意のヌクレオチドであり得る）は、ゲノム中に単一回出現する。この場合、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮは、ガイドＲＮＡに対して相補的であり、またＸＧＧはＰＡＭ配列である。Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９の場合、ゲノム内に存在するユニーク標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷの形式のＣａｓ９標的部位を含み得るが、但し、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣである；Ｘは、任意のヌクレオチドであり得る；及びＷは、Ａ又はＴである）は、ゲノム中に単一回出現する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり得るが、また配列をユニーク配列として同定する際に考慮に入れる必要はない。

いくつかの実施形態では、前記標的配列は、標的細胞のゲノムに固有である、すなわち当該標的配列は、コントロール細胞のゲノム内には存在しない。本明細書で用いる場合、「コントロール細胞」とは、標的細胞のゲノムとの比較において、その細胞のゲノムでは標的配列が欠損している細胞を意味する。コントロール細胞は任意の細胞であり得る。コントロール細胞は、標的細胞の起源となる種と同一の又は異なる種に由来し得る。コントロール細胞は、標的細胞と同一の又は異なるタイプであり得る。いくつかの実施形態では、コントロール細胞は、標的細胞が得られる動物と同一の動物から得られる。一実施形態では、標的細胞は癌細胞であり、またコントロール細胞は健常細胞である。一実施形態では、癌細胞は、癌患者から得られる。一実施形態では、癌細胞及び健常細胞の両方は、同一の患者から得られる。

いくつかの好ましい実施形態では、標的細胞に固有の標的配列の場合、標的配列は下記の特徴を内包する：１）標的配列は標的細胞に固有であり、非標的細胞には存在しない（例えば、癌細胞内に存在する標的配列は、染色体の再構成又は転座に起因する領域であり、従って非癌細胞内には存在しない）；２）標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列において形成可能なように、ガイドＲＮＡ配列及びＰＡＭ配列に対して相補的な配列を含む。必須ではないが、標的配列は、好ましくは標的細胞内の染色体の活性な領域又は高発現領域に位置する。現在のゲノム配列技術を前提とすれば（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ＳＣ、Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｓ ｔｏｄａｙ’ｓ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００８年、第５巻（１号）：１６〜８頁）、このような配列は、パブリックドメイン内で公知、又は任意の所与の標的細胞又は標的細胞サンプルについて容易に配列決定可能であると考えることができる。

標的細胞に固有の非常に多くのＤＮＡ配列の例が実証されている。癌細胞との関連において、例えば、染色体転座により引き起こされた一意的に異常なＤＮＡ配列が、特定の癌において記載されている（例えば、急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白血病）。そのような癌では、転座により、２つの別々に分離した遺伝子が結合すると、遺伝子融合体が生み出される可能性があり、その結果、遺伝子融合体の過剰発現及び癌細胞の異常増殖が引き起こされる。癌関連の転座の事例として、バーキットリンパ腫（第８番染色体上のｃ−ｍｙｃが、第１４番染色体上の免疫グロブリン重鎖遺伝子座に転座する）、マントル細胞リンパ腫（第１１番染色体上のサイクリンＤ１が、免疫グロブリン重鎖遺伝子座に転座する）、濾胞性リンパ腫（ｂｃｌ−２が、免疫グロブリン重鎖遺伝子座に転座する）、濾胞性甲状腺癌（第２番染色体上のＰＡＸ−８遺伝子が転座し、第３番染色体上のＰＰＡＲ−γ１遺伝子と融合する）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び急性リンパ芽球性白血病（第９番染色体上のＡｂｌ１遺伝子が転座し、第２２番染色体上のＢＣＲ（ブレークポイントクラスター領域）と融合する）が挙げられる。これらの症例のそれぞれにおいて、癌細胞に固有の標的配列は、転座のブレークポイント結合部周辺のＤＮＡ配列に基づいて同定され得る（例えば、Ｍ Ｊ ｖａｎ ｄｅｒ Ｆｅｌｔｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１月１１日、１９８９年；第１７巻（１号）：１〜１０頁；Ｒｏｓｓｉの米国特許第４，８７４，８５３号、及びＳａｕｎｄｅｒｓらの同第５，０６６，７９２号；及び米国ＰＧ公開第２０１３０２０９４７３Ａ１号を参照）。ガイドＲＮＡとハイブリダイズ可能な標的配列の同定において、標的配列は、長さが約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５個又はそれ以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列から選択され得るが、同配列は、転座の結合ポイントを含み、そして配列の３’末端にＣａｓタンパク質のＰＡＭ配列を含む（例えば、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９の場合、ＸＧＧ）。そのような標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡデザインツール（例えば、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ ｌａｂ’ｓ ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｕｔｒｏｓ ｌａｂ’ｓ Ｔａｒｇｅ Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ−ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ（Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ）、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ、ＣＲＩＳＰＲ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、ＤＮＡ２．０）を用いて同定され得る。１つの例では、そのような標的配列は、第９番染色体上のＡｂｌ１遺伝子が転座し、第２２番染色体上のＢＣＲと融合したＡＬＬ患者に由来の癌細胞において同定される。標的特異的配列は、標的細胞及び非標的細胞の両方に存在する配列ではないことに留意されたい（例えば、正常な細胞を癌細胞に変化させる癌遺伝子）。標的特異的配列は、遺伝子が癌細胞内で突然変異する、又は癌細胞内で再構成される若しくは転座するように、細胞が発達した結果（例えば、癌の増殖）生じた配列であるが、但しそのいずれも正常細胞又は非癌細胞には存在しない。

標的細胞に固有の標的配列を同定する方法は、当技術分野において公知である。例示的方法として、ＰＣＲ法、サザンブロット法、マイクロアレイ法、及び配列決定法が含まれる。一実施形態では、標的細胞及びコントロール細胞のゲノムは配列決定され、そして標的細胞に固有の配列を同定するために比較され得る。例えば、Ｇａｒｎｅｔｔらは、癌細胞内の突然変異した癌遺伝子を系統的に同定した（Ｎａｔｕｒｅ、２０１２年、第４３３巻：５７０〜５７５頁）。別の例では、Ｎ Ｗｉｎｈｏｌｄらは、癌における非コード化調節突然変異についてゲノム全域にわたる分析を実施し、そして癌内の非コード化突然変異を系統的に同定した（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１４年、第４６巻、１１６０〜１１６５頁）。標的細胞に固有の配列を同定するのに利用可能であるその他の方法は、当業者により想起される。

１つの例では、癌患者が同定され、そして患者から癌細胞を取得するために生検が実施される。次に、癌細胞のゲノムが配列決定され、そして同一患者に由来する健常細胞のゲノムと比較される。癌細胞のゲノム内にのみ存在し、また３’末端にＰＡＭ配列を含有する配列が次に同定され、そして特徴が本明細書に記載するパラメーターに適合するとき、標的配列として用いられる。

本明細書で用いる場合、「ガイドＲＮＡ」とは、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を導くＲＮＡを意味する。一般的に、ガイドＲＮＡは、（ｉ）標的配列とハイブリダイズするのに十分な相補性を、標的ポリヌクレオチド配列について有するガイド配列、及び（ｉｉ）トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）メイト配列を含む。ガイドＲＮＡは、３’末端で融合したｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む場合があり、その結果、単一のキメラガイドＲＮＡが得られる。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、Ｃａｓ、ガイドＲＮＡ、３’末端にＰＡＭを有する標的配列、及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ガイドＲＮＡと融合している場合もあれば、またガイドＲＮＡとは分離している場合もある）と共に形成される。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適するアライメントアルゴリズムを用いて最適に位置合わせしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又はそれ以上である。最適な位置合わせは、配列を位置合わせするための任意の適するアルゴリズムを使用して決定され得るが、その非限定的な例として、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにて入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにて入手可能）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、長さが約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５個、又はそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、長さが約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２個未満、又はそれより少ないヌクレオチドである。ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を標的配列と関連付けるガイド配列の能力は、任意の適するアッセイにより評価され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、試験対象となるガイド配列を含め、例えばＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターをトランスフェクションし、その後に、例えば本明細書に記載するサーベイヤーアッセイ等により標的配列内の優先的な切断を評価することにより、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得る。同様に、試験対象となるガイド配列、及び試験ガイド配列とは異なるコントロールガイド配列を含め、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素を提供し、そして試験ガイド配列の反応とコントロールガイド配列の反応との間で、標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、試験管内で評価され得る。その他のアッセイも可能であり、当業者により見出される。

いくつかの実施形態では、ガイド配列内の二次構造の程度を抑えるように、ガイド配列が選択される。二次構造は、任意の適するポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムにより決定され得る。いくつかのプログラムは、最低ギブス自由エネルギーの計算に基づく。そのようなアルゴリズムの１つの例は、Ｚｕｋｅｒ及びＳｔｉｅｇｌｅｒが記載するｍＦｏｌｄ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第９巻（１９８１年）、１３３〜１４８頁）である。フォールディングアルゴリズムの別の例は、セントロイド構造予測アルゴリズムを用いてウィーン大学の理論化学研究所で開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒら、２００８年、Ｃｅｌｌ 第１０６巻（１号）：２３〜２４頁；及びＰＡ Ｃａｒｒ及びＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ、２００９年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第２７巻（１２号）：１１５１〜６２頁を参照）。

本明細書で用いる場合、ｔｒａｃｒメイト配列は、（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞内に存在するｔｒａｃｒメイト配列と隣接するガイド配列の切除；及び（２）標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成のうちの１つ又は複数を促進するために、ｔｒａｃｒ配列と十分な相補性を有する任意の配列を含むが、この場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒ配列とハイブリダイズしたｔｒａｃｒメイト配列を含む。一般的に、相補性の程度は、２つの配列のうちのより短い方の長さに沿った、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列との最適な位置合わせと関連する。最適な位置合わせは、任意の適するアライメントアルゴリズムにより決定可能であり、また二次構造、例えばｔｒａｃｒ配列又はｔｒａｃｒメイト配列内の自己相補性等を更に説明し得る。いくつかの実施形態では、２つのうちのより短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列との間の相補性の程度は、最適に位置合わせしたとき、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又はそれ以上である。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ配列と融合したガイド配列を含む、すなわち、ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒメイト配列は、両者間のハイブリダイゼーションが、ヘアピン等の二次構造を有する転写物を生成するように単一の転写物内に含まれる。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、長さが約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０個、又はそれ以上のヌクレオチドである。ヘアピン構造で用いられる好ましいループ形成性の配列は、長さが４個のヌクレオチドであり、最も好ましくは、配列ＧＡＡＡを有する。但し、長め又は短めのループ配列も、代替的配列として利用可能である。配列は、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）、及び更なるヌクレオチド（例えば、Ｃ又はＧ）を含むことが好ましい。ループ形成性の配列の例として、ＣＡＡＡ及びＡＡＡＧが挙げられる。本出願の一実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態では、ガイドＲＮＡは、２、３、４、又は５個のヘアピンを有する。本発明の更なる実施形態では、ガイドＲＮＡは、最大で５個のヘアピンを有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、転写終結配列、好ましくはポリＴ配列、例えば６個のＴヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列を含む転写物とは別個の転写物である。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、ガイドＲＮＡとは別個のベクター内にある（例えば、米国特許公開第２０１４００６８７９７号を参照）。

本明細書で用いる場合、「Ｃａｓタンパク質」とは、ガイドＲＮＡと結合し、ヌクレアーゼ活性を示すポリペプチドを意味する。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、その同族体、又はその修飾バージョンが挙げられる。これらの酵素は公知である；例えば、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、受け入れ番号Ｑ９９ＺＷ２としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに見出され得る。いくつかの実施形態では、非修飾型Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡ切断活性を有する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的配列内、及び／又は標的配列の相補配列内等の標的配列の場所において、ストランドの一方又は両方の切断を導く。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００個、又はそれ以上の塩基対において、ストランドの一方又は両方の切断を導く。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、突然変異したＣａｓタンパク質が標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方又は両方のストランドを切断する能力を欠くように突然変異する。例えば、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９のＲｕｖＣＩ触媒ドメイン内のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方のストランドを切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換させる。Ｃａｓ９をニッカーゼたらしめる突然変異のその他の例として、非限定的にＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａが挙げられる。

本明細書で用いる場合、用語「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）」とは、Ｃａｓタンパク質の標的対象であるＤＮＡ配列の直後に位置するＤＮＡ配列を意味する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、標的配列の３’末端に位置し、またＣａｓタンパク質が標的配列にうまく結合するのに必要である。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓタンパク質の起源となる細菌の種により異なる。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のＣａｓ９の場合、そのＰＡＭ配列はＮＧＧである（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧのいずれかであり得る）。別の例では、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＰＡＭ配列は、ＮＮＮＮＧＡＴＴである。ストレプトコッカス・サー
モフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＰＡＭ配列は、ＮＮＡＧＧＡＡである。トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）のＰＡＭ配列は、ＮＡＡＡＡＣである。

本明細書で用いる場合、用語「自殺遺伝子」は、細胞それ自体の殺傷を引き起こす遺伝子を意味する。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、アポトーシスを通じて細胞それ自体の殺傷を引き起こす。自殺遺伝子の非限定的な例として、ウイルス性チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、抗酸化系酵素（ＡＯＥ）に対する細胞内抗体、細菌性ニトロレダクターゼ、カスパーゼ、及びＤＮＡ分解酵素が挙げられる（Ｍａｌｅｃｋｉ Ｍ．、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｓｙｎｄｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２年（第３巻）、及び同文献中の参照資料を参照）。

１つの実施形態では、自殺遺伝子は、ウイルス性チミジンキナーゼ（ＴＫ）である。チミジンキナーゼは、デオキシチミジンをデオキシチミジン５’−モノホスフェートに変換するＡＴＰ−チミジン５’−ホスホトランスフェラーゼであり、デオキシチミジン５’−モノホスフェートは、ウイルス性チミジンキナーゼ及びヌクレオシドジホスフェートキナーゼにより、更にリン酸化されてデオキシチミジンジホスフェートに、そしてその後デオキシチミジントリホスフェートにそれぞれ変換される。デオキシチミジントリホスフェートは、ＤＮＡポリメラーゼによって、合成ＤＮＡ分子に取り込まれる。いくつかのｄＮＴＰ類似体、例えば２’−デオキシ−グアノシンの合成類似体であるガンシクロビル（ＧＣＶ）等は、合成ＤＮＡに取り込まれるとＤＮＡ合成を終了させる能力を有する。合成の終了は、アポトーシスシグナリングカスケードを引き起こす契機となる。ＧＣＶは、ヒトチミジンキナーゼにより認識されないが、一部のウイルス性チミジンキナーゼ、例えば単純ヘルペスウイルス−１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）等に対する基質として認識される。その結果、ＨＳＶ−ＴＫを発現するヒト細胞は、ＧＣＶをＧＣＶホスフェートに変換し、ＧＣＶホスフェートは更にリン酸化され、そして合成ＤＮＡに取り込まれ、合成の終了及びアポトーシスを引き起こす。

一実施形態では、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼである。シトシンデアミナーゼは、アンモニアの放出を伴って、シトシンをウラシルに加水分解する。生理条件では、修飾部位はエンドヌクレアーゼにより認識され、次にＤＮＡ内のホスホジエステル結合が破壊され、新たなシトシンの取込みによる修復が開始する。但し、シトシンデアミナーゼは、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に変換することもできる。従って、無毒性プロドラッグ５−ＦＣを添加すると、シトシンデアミナーゼは、それを極めて毒性の高い５−ＦＵ（チミジレートシンテターゼの自殺インヒビター）に変換し、細胞増殖の阻害及びアポトーシスを引き起こす。

別の態様では、本出願は、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列；及びｃ）自殺遺伝子をコードする第３のヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターを含み、第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある組成物について開示する。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする前記第２のヌクレオチド配列は、癌特異的プロモーターと作動可能に連結している。

本明細書で用いる場合、用語「ベクター」とは、特別な興味の対象となる遺伝子又は核酸配列を含むポリヌクレオチド分子を意味する。一般的に、構築物は、しかるべき制御配列も含む。例えば、ポリヌクレオチド分子は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び／又はＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び／又は自殺遺伝子をコードするヌクレオチド配列の５’隣接領域に位置し、宿主細胞内で所望の遺伝子を複製及び発現する能力を有するように、コーディング配列と作動可能に連結した制御配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、自殺遺伝子を含むベクターは、自殺遺伝子を標的配列に組み込むのに適するヌクレオチド配列を更に含む。例えば、自殺遺伝子は、標的配列周辺の組換えに適する２つの領域と隣接する。一般的に、第１の領域は、Ｃａｓタンパク質により生成された二本鎖切断（ＤＳＢ）のすぐ上流に位置する配列と、一方第２の領域は、ＤＳＢの下流に位置する配列と高度の相同性を有する。標的配列において、ＣａｓによりＤＳＢが生成されると、標的細胞に内在する相同組換え修復（ＨＤＲ）装置が、ＤＳＢの遺伝子座に動員され、そして同機構は、ＤＳＢに自殺遺伝子を正確に導入するための適するテンプレートとしてベクターを利用する。一実施形態では、標的配列が標的細胞内の染色体転座により生成される場合、ＤＳＢの上流に位置する配列は、１つの染色体に由来し、またＤＳＢの下流に位置する配列は、別の染色体に由来する。従って、ベクターは、標的細胞に固有の標的配列を含まない非標的細胞内のＨＤＲ装置においてテンプレートとして用いられない。

ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び／又はＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び／又は自殺遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、当技術分野において周知の方法を用いて調製され得る。例えば、ポリヌクレオチド分子は、より大きなプラスミドの一部分として調製され得る。当技術分野において公知なように、そのような調製は、正しい構築物の効率的なクローニング及び単離を可能にする。プラスミドの調製、及び宿主生物の変換で採用される様々な方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年を参照）。いくつかの実施形態では、ベクターは、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及びｔｒａｃｒ配列は、１つ又は２つのベクターから得られた２つの異なる転写物内で発現する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、並びにＣａｓタンパク質及び／又は自殺遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、同一の又は異なるベクター内に存在し得る。

本明細書に開示する組成物は、標的細胞に導入されると、標的配列における自殺遺伝子の組込みを媒介することが可能となり、その結果、自殺遺伝子が発現し、標的細胞の死を引き起こす。一実施形態では、自殺遺伝子が、標的細胞に固有の標的配列に組み込まれ、その結果、標的配列を含まない細胞を生存させたまま、標的細胞を特異的に殺傷する。

一実施形態では、自殺遺伝子は、制御エレメントと作動可能に連結している。一実施形態では、制御エレメントはプロモーターである。一実施形態では、制御エレメントは最小プロモーターである。一実施形態では、自殺遺伝子を含む前記ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子と作動可能に連結するプロモーターを含まない；そのようなケースでは、自殺遺伝子は、すでに活性な遺伝子転写部位である標的配列部位に組み込まれた後に発現する。

用語「作動可能に連結した」とは、そのように記載される構成要素が、その通常の機能を実施するように構成されているエレメントの配置を意味する。プロモーターの場合、コーディング配列と作動可能に連結するプロモーターは、コーディング配列の発現を導く。プロモーター又はその他のコントロールエレメントは、コーディング配列の発現を指示するように機能する限り、コーディング配列と隣接する必要はない。例えば、翻訳済みではないが転写済みの中間的な配列が、プロモーター配列とコーディング配列の間に存在し得るが、プロモーター配列は、コーディング配列と「作動可能に連結している」となおもみなすことができる。

「プロモーター」とは、特定の遺伝子の転写を開始するＤＮＡ配列を意味する。真核細胞において遺伝子の転写を開始するのに一般的に用いられるプロモーターの非限定的な例として、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びテトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）プロモーターが挙げられる。

１つの実施形態では、本明細書に記載する組成物で用いられるプロモーターは、自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドが標的細胞のゲノムに組み込まれないとき、自殺遺伝子について少量の転写を開始する又は転写を開始しないミニマルプロモーターである。１つの例では、最小又はコアプロモーターは、転写開始部位に対して−３５〜＋３５領域の間に位置するプロモーターの一部分である。最小又はコアプロモーターは、３つの保存的な配列、すなわちＴＡＴＡボックス、イニシエーター領域、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位のうちの１つ又は複数、及び下流プロモーターエレメントを有する。そのような例では、標的細胞に導入されると、自殺遺伝子の組込みが生じない限り、組成物は標的細胞を殺傷しない。

１つの実施形態では、自殺遺伝子を含むポリヌクレオチドは、自殺遺伝子と作動可能に連結したプロモーターを含まない。１つの例では、標的配列は、標的細胞のゲノム内に存在する内因性プロモーターの近傍にある。自殺遺伝子がゲノム内に存在する標的配列に組み込まれると、内因性プロモーターの存在に起因して、自殺遺伝子の転写が開始する。別の例では、標的配列は、発現が極めて活発な遺伝子座にある（例えば、Ｂ細胞の免疫グロブリン遺伝子座）。自殺遺伝子は、高発現性遺伝子座に組み込まれたとき、高度に発現し、そして標的細胞のみを殺傷する。１つの例では、Ｃｈｉａｒｌｅらは、Ｂ細胞において、ゲノム全域にわたる染色体切断の転移及び再構成を系統的に同定し、そして転移は転写された染色体領域を選好的に標的とすることを見出した（Ｃｅｌｌ．２０１１年、第１４７巻（１号）：１０７〜１９頁）。転移したＢ細胞に固有の標的配列が、転移のブレークポイント結合部周辺のＤＮＡ配列に基づいて同定される。プロモーターと作動可能に連結しない自殺遺伝子が標的配列に組み込まれると、自殺遺伝子は発現し、Ｂ細胞を殺傷する。対照的に、非組込み型の自殺遺伝子は、たとえ細胞に導入されたとしても発現しない。

いくつかの実施形態では、前記標的細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記標的細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態では、前記標的細胞は哺乳動物細胞、例えば齧歯類の細胞（例えば、マウス細胞）、及びヒト細胞である。例示的な標的細胞として、上皮細胞、神経細胞（例えば、ニューロン、アストロサイト）、肝細胞、血球、脂肪細胞、及び腎細胞が挙げられる。

いくつかの実施形態では、前記標的細胞は癌細胞である。癌細胞は、未制御で加速したペースで増殖及び分裂する細胞を意味する。癌の例として、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質カルチノーマ、肛門癌、星状細胞腫、小児の小脳又は大脳の癌、基底細胞カルチノーマ、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、脳癌、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視覚路及び視床下部の神経膠腫、乳癌、バーキットリンパ腫、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、肺気腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、網膜芽細胞腫、胃（ｇａｓｔｒｉｃ／ｓｔｏｍａｃｈ）癌、神経膠腫、頭部及び頸部の癌、心臓癌、ホジキンリンパ腫、島細胞癌（膵内分泌）、カポジ肉腫、腎癌（腎細胞癌）、喉頭癌、白血病、肝癌、肺癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞カルチノーマ（腎癌）、網膜芽細胞腫、ユーイングファミリー腫瘍、皮膚癌、胃癌、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、腟癌が挙げられる。

癌療法の重要な問題として、癌細胞を選択的に除去することが挙げられ、それは、癌細胞が健常細胞と混在している場合に特に重要である。外科切除は、癌と共に機能的な健常細胞もやむを得ず取り除く。照射療法は、すべての曝露された細胞に影響を及ぼす。照射療法は、急速に増殖する細胞（例えば、癌細胞）が電離照射に対してより高い感受性を有することに依拠するが、健常細胞の一部は、生殖系、免疫系、及びホルモン系の細胞を含め、やはり感受性が高く、従って照射療法で障害を受ける。同様に、化学療法剤は、すべての細胞に進入し、影響を及ぼす。ほとんどの化学療法剤は、急速に増殖する細胞に対する取込み速度が高いこと、及び有糸分裂を阻止することに依拠し、アポトーシスカスケードを作動させる。それにもかかわらず、健常細胞集団も、再生及び免疫に関与する細胞を含め、重大な影響を受ける。

本明細書に開示する組成物は、癌細胞を選択的に除去するのに利用可能である。癌細胞に固有の標的配列を識別することにより、癌細胞内への自殺遺伝子の選択的組込みを促進する能力を組成物は有し、癌細胞それ自体を殺傷する。

１つの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列は、癌特異的プロモーターと作動可能に連結している。Ｃａｓタンパク質をコードする配列を癌特異的プロモーターと作動可能に連結させることにより、Ｃａｓタンパク質の発現は癌細胞に限定される。その結果、自殺遺伝子の標的細胞のゲノムへの組込みが癌細胞においてのみ生ずる。癌特異的プロモーターの事例として、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）プロモーター、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）プロモーター、癌胎児抗原（ＣＥＡ）プロモーター、テロメラーゼプロモーター、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモーター、サイトケラチン１８及び１９（ＣＫ１９）プロモーター、及びシクロオキシゲナーゼ（Ｃｏｘ）プロモーターが挙げられる。

別の実施形態では、自殺遺伝子は、癌特異的プロモーターと作動可能に連結している。従って、若干の非特異的な組込みが生ずる可能性があるという事実にもかかわらず、組み込まれた自殺遺伝子は、癌細胞においてのみ発現する。

ほとんどのヒトの癌は、極めて不均一である。単一の細胞は、複数の突然変異をそのゲノム内に内包する可能性がある。従って、１つの態様では、本出願は、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する第１の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第１のガイドＲＮＡ；ｂ）標的細胞のゲノム内に存在する第２の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第２のガイドＲＮＡ；ｃ）Ｃａｓタンパク質；及びｄ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物について開示する。そのような組成物は、標的細胞のゲノム内に存在する複数の標的配列への自殺遺伝子の組込みを促進するのに利用可能である。

別の態様では、本出願は、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する第１の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第１のガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）標的細胞のゲノム内に存在する第２の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第２のガイドＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列；ｃ）Ｃａｓタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列；及びｄ）自殺遺伝子をコードする第４のヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターを含み、第１、第２、第３、及び第４のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある組成物について開示する。

癌の不均一性は、１つの癌細胞だけでなく、癌組織内の癌細胞集団にも認められ、すなわち異なる癌細胞が、細胞形態、遺伝子発現、代謝、運動性、増殖、及び転移能力を含め、異なる形態プロファイル及び表現型プロファイルを示す可能性がある。その結果、１つの癌細胞に対して有効である癌療法が、同一の癌組織内の別の癌細胞に対しては有効でない可能性があるので、癌細胞の不均一性は、有効な治療戦略を設計する上で重大な課題を提起する。

癌の不均一性の一般的な特徴は、複数の原因に由来し得る遺伝的不均一性である。一部の癌は、外生要因、例えば紫外線照射（例えば、皮膚癌）やタバコ（例えば、肺癌）等が突然変異を導入すると開始される。より一般的な原因としてゲノムの不安定性が挙げられ、多くの場合、重要な制御経路が細胞内で破壊されると発生する。いくつかの例として、ＤＮＡ修復機構の障害が挙げられ、複製過誤の増加、及び染色体全体の大規模な取得又は喪失を可能にする有糸分裂装置内の欠陥を引き起こすおそれがある。

従って、１つの態様では、本出願は、ａ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第１の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第１のガイドＲＮＡ；ｂ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第２の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第２のガイドＲＮＡ；ｃ）Ｃａｓタンパク質；及びｄ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物について開示する。

別の態様では、本出願は、ａ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第１の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第１のガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第２の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第２のガイドＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列；ｃ）Ｃａｓタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列；及びｄ）自殺遺伝子をコードする第４のヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターを含み、第１、第２、第３、及び第４のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある組成物について開示する。

いくつかの実施形態では、上記のような組成物は、遺伝的不均一性を有する細胞集団を殺傷するのに利用可能である、すなわち当該集団内の細胞はゲノム変異を有する。１つの実施形態では、上記のような組成物は、遺伝的不均一性を有する癌細胞を殺傷するのに利用可能である。１つの例では、癌細胞の生検が得られ、また癌細胞のゲノムが配列決定され、そして健常細胞のゲノムと比較して、癌細胞のゲノミクスに特異的な２つ以上の標的ヌクレオチド配列が同定される。標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡが設計される。癌細胞に導入された後に、自殺遺伝子が癌細胞のゲノム内に存在する標的配列に組み込まれ、その結果、癌細胞の死を引き起こす。従って、集団内には遺伝的不均一性が認められるにもかかわらず、各癌細胞が少なくとも１つの標的配列を内包する限り、自殺遺伝子が癌細胞集団のゲノムに組み込まれる。

なおも別の態様では、本出願は、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ；ｂ）Ｃａｓタンパク質；及びｃ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を、標的細胞に導入するステップを含む方法について開示する。いくつかの実施形態では、前記標的配列は、標的細胞のゲノムに固有である。

別の態様では、本出願は、標的細胞を、ａ）標的細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列；及びｃ）自殺遺伝子をコードする第３のヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターと接触させるステップを含み、第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある方法について開示する。一実施形態では、前記第２のヌクレオチド配列は、癌特異的プロモーターと作動可能に連結している。

従来型のウイルス式及び非ウイルス式の遺伝子移入法が、ベクターを標的細胞に導入するのに利用可能である。そのような方法は、組成物の構成成分をコードする核酸を、培養物又は宿主生物内の細胞に投与するのに利用可能である。非ウイルスベクター送達系として、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載するベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及び送達媒体と複合体形成した核酸、例えばリポソーム等、送達媒体と複合体形成したタンパク質、例えばリポソーム等が挙げられる。ウイルスベクター送達系として、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが挙げられ、細胞への送達後にエピソームゲノム又は組込みゲノムを有する。遺伝子療法手順のレビューについては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）；Ｎａｂｅｌ及びＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ 第１１巻：２１１〜２１７頁（１９９３年）；Ｍｉｔａｎｉ及びＣａｓｋｅｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ 第１１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）；Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ 第１１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ 第３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）；Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ 第８巻：３５〜３６頁（１９９５年）；Ｋｒｅｍｅｒ及びＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 第５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）；Ｈａｄｄａｄａら、ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ及びＢｉｈｍ（編）（１９９５年）；及びＹｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ 第１巻：１３〜２６頁（１９９４年）を参照。

核酸の非ウイルス送達法として、リポフェクション、ヌクレオフェクション、電気穿孔、微量注射、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及びＤＮＡの作用物質増強型取込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号；及び同第４，８９７，３５５号に記載されており、またリポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適するカチオン性及び中性の脂質として、Ｆｅｉｇｎｅｒの脂質、ＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４が挙げられる。送達は、細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏ投与）、又は標的組織（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ投与）に対して可能である。

標的化リポソーム、例えば免疫脂質複合体等を含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知されている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２７０号：４０４〜４１０頁（１９９５年）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．第２号：２９１〜２９７頁（１９９５年）；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第５号：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第５号：６４７〜６５４頁（１９９４年）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ 第２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）；Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、及び同第４，９４６，７８７号を参照）。

核酸の送達用にＲＮＡ又はＤＮＡウイルス式の系を利用すれば、ウイルスが身体内の特定の細胞を標的とし、またウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスという利点が得られる。ウイルスベクターは、患者に直接投与可能（ｉｎ ｖｉｖｏ）、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を治療するのに利用可能であり、また修飾された細胞は、患者（ｉｎ ｖｉｖｏ）に任意選択的に投与され得る。従来型のウイルス式の系として、遺伝子移入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、及び単純ヘルペスウイルスの各ベクターを挙げることができる。宿主ゲノム内への組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスによる遺伝子移入法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子は長期間発現する。更に、高効率の形質導入が、多くの異なる細胞型及び標的組織に認められている。

本明細書に開示するように、自殺遺伝子の発現は、それが標的配列に組み込まれない場合、最低限に抑えられることが好ましい。１つの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が存在しない場合には、標的細胞のゲノムに組み込まれる可能性が低いので、アデノウイルスに基づく系が用いられる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率を実現する能力を有し、また細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いれば、高い力価及びレベルの発現が得られる。このベクターは、比較的単純な系内で大量に生成可能である。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸及びペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ製造において、及びｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法手順用として、細胞に標的核酸を形質導入するのにも利用可能である（例えばＷｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第１６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ 第５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第９４巻：１３５１頁（１９９４年））を参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ及びＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ 第８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）；並びにＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含め、いくつかの公表文献に記載されている。

パッケージング細胞が、宿主細胞に感染する能力を有するウイルス粒子を形成するのに一般的に用いられる。そのような細胞として、アデノウイルスをパッケージする２９３個の細胞、及びレトロウイルスをパッケージするψ２細胞又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法で用いられるウイルスベクターは、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージする細胞株を生成することにより通常生み出される。ベクターは、パッケージング及び後続する宿主への組込みに必要とされる最小イルス配列を一般的に含み、その他のウイルス配列は、ポリヌクレオチド（複数可）を発現させるための発現カセットと置換する。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞株によりｔｒａｎｓで一般的に供給される。例えば、遺伝子療法で用いられるＡＡＶベクターは、パッケージング及び宿主ゲノムへの組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを一般的に有する。ウイルスＤＮＡは、その他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラスミドを含有する細胞株内にパッケージングされる。細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスを用いて、これにも感染し得る。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドに由来するＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くことから、かなりの量でもパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えばアデノウイルスの方がＡＡＶよりも感受性が高い加熱処理により低減可能である。核酸を細胞に送達する更なる方法は、当業者にとって公知である。例えば、本明細書に参考として援用する米国特許第２００３００８７８１７号を参照。

１つの態様では、本出願は、複数の標的細胞に、ａ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第１の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第１のガイドＲＮＡ；ｂ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第２の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第２のガイドＲＮＡ；ｃ）Ｃａｓタンパク質；及びｄ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を導入するステップを含む方法について開示する。

１つの態様では、本出願は、複数の標的細胞を、ａ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第１の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第１のガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）複数の標的細胞のゲノム内に存在する第２の標的配列とハイブリダイズする能力を有する第２のガイドＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列；ｃ）Ｃａｓタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列；及びｄ）自殺遺伝子をコードする第４のヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターと接触させるステップを含み、第１、第２、第３、及び第４のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある方法について開示する。

１つの態様では、本出願は、癌細胞を、ａ）癌細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列；及びｃ）自殺遺伝子をコードする第３のヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターと接触させるステップを含み、第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある、癌を治療する方法について開示する。一実施形態では、前記標的配列は、癌細胞のゲノムに固有である。１つの実施形態では、方法は、プロドラッグ、例えばＧＣＶ及び５−ＦＣで癌細胞を治療するステップを更に含む。

別の態様では、本出願は、ａ）遺伝子ターゲティング物又はその変異体；及びｂ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、遺伝子ターゲティング物又はその変異体が、標的細胞のゲノム内に存在する標的配列への自殺遺伝子の組込みを促進する能力を有する組成物について開示する。一実施形態では、遺伝子ターゲティングヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓタンパク質、又はメガヌクレアーゼである。遺伝子ターゲティングヌクレアーゼは、ゲノム内の所望の場所（例えば、標的配列）において特異的二本鎖切断を形成する能力を有し、また細胞の内因性機構を利用して相同的組換え（ＨＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により誘発された切断を修復し、その結果、所望の場所に自殺遺伝子が組み込まれる。特定の実施形態では、遺伝子ターゲティングヌクレアーゼの変異体は、遺伝子ターゲティングリコンビナーゼ、例えばジンクフィンガーリコンビナーゼ（ＺＦＲ）等である（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら、（２０１１年）Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｄａｐｔａｂｌｅ ＤＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ、ＰＬｏＳ ＯＮＥ 第６巻（４号）：ｅ１９５３７）。

１つの態様では、本出願は、癌を有することが疑われる対象において、１つ又は複数のベクターを対象に導入することにより癌を治療する方法であって、１つ又は複数のベクターが、ａ）癌細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列；ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列；及びｃ）自殺遺伝子をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある方法について開示する。

いくつかの実施形態では、対象は、動物、例えば哺乳動物（例えば齧歯類（例えばマウス、ラット、ウサギ）、ネコ、イヌ、ウシ、霊長類、及びヒト）である。

いくつかの実施形態では、方法は、ゲノム配列決定を実施して癌細胞に固有の標的配列を同定するために、対象に由来する癌細胞のサンプルを取得するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、自殺遺伝子がそのゲノムに組み込まれている癌細胞を殺傷するが、非癌細胞は殺傷しない化合物を対象に投与するステップを更に含む。１つの例では、自殺遺伝子がＨＳＶ−ＴＫのとき、化合物はＧＣＶである。別の例では、自殺遺伝子がシトシンデアミナーゼのとき、化合物は５−ＦＣである。

１つの態様では、本出願は、本明細書に開示する組成物で用いられるガイドＲＮＡについて開示する。１つの実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的細胞内の第１の染色体に存在する配列に対して相補的な第１のヌクレオチド配列；及び標的細胞内の第２の染色体に存在する配列に対して相補的な第２のヌクレオチド配列を含む。一般的に、第１のヌクレオチド配列は、長さが約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれ以上のヌクレオチドであり、また第２のヌクレオチド配列は、長さが約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれ以上のヌクレオチドである。一実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、染色体転座のブレークポイント結合部周辺の配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。

１つの態様では、本出願は、（ａ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチド；（ｂ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドの上流に位置する第１のホモロジーアームであって、標的細胞内の第１の染色体内の配列を含む第１のホモロジーアーム；及び（ｃ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドの下流に位置する第２のホモロジーアームであって、標的細胞内の第２の染色体内の配列を含む第２のホモロジーアームを含むベクターについて開示する。本明細書で用いる場合、「ホモロジーアーム」とは、相同的組換えを通じて、ゲノムに対して遺伝子を標的化するのに適するポリヌクレオチドを意味する。一般的に、２つのホモロジーアームがゲノムに組み込まれる遺伝子と隣接し、各ホモロジーアームは、組込みが起きる遺伝子座の上流及び下流に配列を含む。一般的に、第１のホモロジーアームは、長さが約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００個又はそれ以上の塩基対であり、及び第２のホモロジーアームは、長さが少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００個のヌクレオチドである。

下記は、細胞死を誘発するために、自殺遺伝子を細胞内の標的配列に挿入するステップの実施例である。

本出願で開示される戦略の機能性を試験するために、ＨＳＶ−ＴＫを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の第１９番染色体上にあるＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子に位置するＡＡＶＳ１（アデノ随伴ウイルス組込み部位１）遺伝子座に組み込む。

Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ発現構築物の調製
２つの発現カセット、すなわちヒトコドン最適化Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９発現カセット、及び単一のガイドＲＮＡを発現するＵ６プロモーター駆動型カセットを含有するプラスミドｐＸ３３０は、Ａｄｄｇｅｎｅ社から得られる（ＩＤ Ｎｏ：４８１４０）。２つのＣａｓ９標的、Ｔ１及びＴ２（図２を参照）に対するガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、ｐＸ３３０プラスミドのガイドＲＮＡ発現カセットにそれぞれクローン化する（Ｒａｎら（２０１３年）Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ 第８巻、２２８１〜２３０８頁を参照）。

ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含有する標的プラスミドの調製
ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含有する標的プラスミドを、ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ Ｇａｔｅｗａｙ Ｔｈｒｅｅ−Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて調製する（Ｂｏｕｄａｂｅ及びＯｋｋｅｎｈａｕｇ（２０１３年）Ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．第１０６４巻：３３７〜３５４頁を参照）。要約すれば、ＡＡＶＳ１遺伝子座周辺の配列に対応する５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームを、エントリーベクターにそれぞれ挿入する。ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を、次に５’相同性アームを含有するエントリーベクターに挿入する。得られたエントリーベクターをデスティネーションベクターで組み換え、標的ベクターｐＴａｒｇｅｔ−ＨＳＶ−ＴＫ−１を生成する。コントロールとして、５’及び３’相同性アームに隣接するＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子を含む標的ベクターを生成する（ｐＴａｒｇｅｔ−ＧＦＰ）。コントロール標的ベクターも、ＧＦＰ遺伝子の下流の３’に、ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）配列に続いてプロトスペーサー２配列を含有する。標的プラスミドを、ホモロジーアームの一方に近いベクターバックボーン内に存在する制限部位で１回切断することにより直鎖状にする。

ＣＲＩＳＰＲプラスミド及びドナーＤＮＡのＨＥＫ２９３Ｔ細胞への同時トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を製造業者の推奨に基づき維持し、またＤ１０培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ及び１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ培地）内で３７℃及び５％ＣＯ₂にて培養する。ＣＲＩＳＰＲプラスミド（５００ｎｇ）及び直鎖状の標的プラスミド（５００ｎｇ）を混合し、そしてＡｍａｘａ ＳＦ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ ｋｉｔ Ｓ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、トランスフェクション溶液を調製する。トランスフェクション溶液を細胞に添加し、そしてＡｍａｘａ、ＣＭ−１３０（Ｌｏｎｚａ）を用いて細胞を電気穿孔する。

自殺遺伝子のＡＡＶＳ１遺伝子座への挿入
同時トランスフェクション後３日目に、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）を細胞培養物に添加して、標的ベクターを含有する細胞を選択する。選択から７日後に、細胞をクローン化し、増殖させる。ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の挿入を確認するために、各クローンのＡＡＶＳ１遺伝子座の配列を、ＰＣＲ法又は配列決定法により決定する。結果は、Ｔ１及びＴ２の両方のｇＲＮＡは、相同的組換え及びＨＳＶ−ＴＫ遺伝子のＡＡＶＳ１遺伝子座への挿入を誘発することができることを示す。コントロール標的ベクターの場合、ＧＦＰ遺伝子がＡＡＶＳ１に挿入された細胞を、同一のプロトコールを用いてクローン化する。

自殺遺伝子が挿入された細胞の選択的除去
ＨＳＶ−ＴＫ挿入物を含有するクローンのそれぞれについて、ガンシクロビル（０．５μｇ／ｍｌ）を添加する。３日後、ＨＳＶ−ＴＫ含有クローンでは、生存細胞は見出されない。コントロールとして、ガンシクロビルは、ＧＦＰ遺伝子が挿入された細胞において細胞死を誘発しない。自殺遺伝子が挿入された細胞の選択的除去を実証するために、ＨＳＶ−ＴＫ挿入物を含有する細胞を、ＧＦＰ遺伝子を含有する細胞と混合する。ガンシクロビルで処理した後、ＧＦＰ発現細胞のみが細胞培養物中で生存する。

下記は、対象とする細胞を選択的に除去する実施例である。この例では、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子が、プロトスペーサー配列を含有する細胞に挿入され、そして細胞死を誘発する。

実施例１で開示するようなＧＦＰ遺伝子が挿入された細胞も、ＧＦＰ遺伝子の下流にプロトスペーサー２配列（配列番号：５）を含み、自殺遺伝子挿入用としてこの実施例で用いられる。ガイドＲＮＡは、プロトスペーサー２配列に基づき設計され、そしてＣＲＩＳＰＲプラスミドｐＸ３３０−ｐを生成させるために、ｐＸ３３０ベクターに挿入される。標的ベクターは、実施例１に開示するように構築され、そして５’相同性アームと隣接したＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含有するが、ＧＦＰ遺伝子及び実施例１で用いたものと同様の３’相同性アームから構成される。その結果、標的ベクターが相同的組換えを通じて挿入される場合、ＧＦＰの発現は妨害されない。

プロトスペーサー配列を含有する細胞の選択的除去を示すために、ＧＦＰ−プロトスペーサー配列が挿入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（実施例１を参照）を、非修飾ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と混合する。混合した細胞集団に、２つのディッシュに分割する。一方のディッシュをＣＲＩＳＰＲプラスミドｐＸ３３０−ｐ及び標的プラスミドｐＴａｒｇｅｔ−ＨＳＶ−ＴＫ−２を同時トランスフェクトする。他方のディッシュをコントロールとし、ｐＸ３３０及び標的プラスミドｐＴａｒｇｅｔ−ＨＳＶ−ＴＫ−２を同時トランスフェクトする。３日後、ガンシクロビルをディッシュに添加する。翌日、各ディッシュ内のＧＦＰ発現細胞の数を、ＦＡＣＳを用いてカウントする。ｐＸ３３０−ｐをトランスフェクトしたディッシュ内では、ＧＦＰ発現細胞の割合（％）が有意に低下することが認められ、プロトスペーサー配列を含有する細胞が選択的に除去されることを示す。

下記は、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ陽性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の対象において、癌細胞を除去する実施例である。

成人ＡＬＬに認められた最も一般的な染色体異常は、転座ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）である。患者１例のＤＮＡから得られたブレークポイント結合部断片を、クローニング及び制限酵素マッピングにより特徴付けた（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９年１月、第１７巻（１号）：１〜１０頁）。結合部は、エクソンＩａと共通エクソン（ａ２）の間にあるＡＢＬのイントロン内に局在した。第２２番染色体上のブレークポイントは、第１のイントロン内に位置した。結合部周辺の配列を決定し（図３）、そしてＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡデザインツール（ＤＮＡ２．０）を用いて分析した。ガイド配列候補を同定した（図３）。

対象の血液サンプルを取得する。ブレークポイント結合部周辺の配列を、ＰＣＲ法及び配列決定法により特徴付ける。ガイド配列を、ブレークポイント結合部周辺の配列に基づき設計する。ガイド配列を、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）／ＣＲＩＳＰＲベクターにクローン化する（Ｓｅｎｉｓ Ｅ ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０１４年、第９巻：１４０２〜１２頁）。クローン化したＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲベクターを、ＡＡＶ／ＨＳＶ−ＴＫベクター（Ｋａｎａｚａｗａ Ｔら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００３年、第１０巻：５１〜５８頁）と共に、組換えＡＡＶにパッケージングする。ＡＡＶ／ＨＳＶ−ＴＫベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子と隣接する２つのホモロジーアームを含有するが、各ホモロジーアームは、ブレークポイント結合部のすぐ上流及び下流に配列を含む。ＡＡＶベクター内のＨＳＶ−ＴＫは、最小プロモーターと作動可能に連結して、ブレークポイント結合部の遺伝子座への組込みが存在しない場合、その発現が最低限に抑えられることを保証する。組換えＡＡＶは、次に対象に送達される。対象の血液サンプルを取得して、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ陽性癌細胞内にあるブレークポイント結合部の遺伝子座におけるＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の組込み及び発現を確認する。ガンシクロビル（ＧＣＶ）を、次に対象に投与する。Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ陽性癌細胞の細胞死が認められる一方、健常細胞は無傷である。

Claims (12)

1. 対象における癌細胞を選択的に除去又は低減する方法に用いるための組成物であって、
   （ｉ）標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ、ここで、
   該標的ポリヌクレオチド配列は、前記対象の癌細胞のゲノム内に存在する標的遺伝子座に含まれるが、健常細胞のゲノム内には含まれず、
   前記対象の癌細胞のゲノム内に存在する標的遺伝子座に含まれるが、健常細胞のゲノム内には含まれない前記標的ポリヌクレオチド配列は、染色体の再構成又は転座に起因する領域である、と、
   （ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と、
   （ｉｉｉ）自殺遺伝子と
   を含み、
   前記方法は、
   ａ）前記対象の癌細胞のゲノム内に存在する前記標的遺伝子座を同定するステップであって、前記遺伝子座が、前記標的ポリヌクレオチド配列を含むが、健常細胞は、そのゲノム内に前記標的ポリヌクレオチド配列を含まないステップと、
   ｂ）前記組成物を前記対象に投与するステップと、
   ｃ）癌細胞のゲノム内に存在する遺伝子座に前記自殺遺伝子を組み込むステップと、
   ｄ）癌細胞の細胞死を誘発するステップと
   を含む、組成物。
2. ａ）癌細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ、ここで、
   該標的配列は前記癌細胞に特異的であり、
   前記癌細胞に特異的である前記標的配列は、染色体の再構成又は転座に起因する領域である、と、
   ｂ）Ｃａｓタンパク質と、
   ｃ）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドと
   を含む組成物。
3. Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２に記載の組成物。
4. 自殺遺伝子が、ウイルス性チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、抗酸化系酵素に対する細胞内抗体、細菌性ニトロレダクターゼ、カスパーゼ、及びＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
5. 自殺遺伝子が、制御エレメントと作動可能に連結している、請求項２に記載の組成物。
6. 制御エレメントが、癌特異的プロモーターである、請求項５に記載の組成物。
7. ａ）癌細胞のゲノム内に存在する標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列、ここで、
   該標的配列は前記癌細胞に特異的であり、
   前記癌細胞に特異的である前記標的配列は、染色体の再構成又は転座に起因する領域である、と、
   ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列と、
   ｃ）自殺遺伝子をコードする第３のヌクレオチド配列と
   を含む１つ又は複数のベクターを含み、第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある組成物。
8. Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列が、癌特異的プロモーターと作動可能に連結している、請求項７に記載の組成物。
9. 請求項２から８のいずれかに記載の組成物を含む細胞。
10. 標的細胞を、請求項２から８のいずれかに記載の組成物と接触させるステップを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
11. 対象における癌を治療する方法に用いられる１つ又は複数のベクターであって、
    ａ）癌細胞のゲノムに固有の標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列、ここで、
    前記癌細胞のゲノムに固有の前記標的配列は、染色体の再構成又は転座に起因する領域である、と、
    ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列と、
    ｃ）自殺遺伝子をコードする第３のヌクレオチド配列と
    を含み、第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列が、同一の又は異なるベクター内にある、ベクター。
12. 少なくとも第１の細胞と第２の細胞とを含む細胞集団内の第１の細胞を選択的に除去するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、第１の細胞が癌細胞であり、
    ａ）第１の細胞のゲノム内に存在する遺伝子座を同定するステップであって、前記遺伝子座が、ポリヌクレオチド配列を含み、第２の細胞が、そのゲノム内に前記ポリヌクレオチド配列を含まず、該ポリヌクレオチド配列が、染色体の再構成又は転座に起因する領域である、ステップと、
    ｂ）前記遺伝子座に自殺遺伝子を組み込んで、第１の細胞の細胞死を誘発するステップと
    を含む方法。