JP6960438B2 - 特定のゲノム遺伝子座へのゲノムおよびエピゲノム調節タンパク質のrna誘導型標的化 - Google Patents
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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Description
本願は、2013年3月15日に出願された米国特許出願第61/799,647号;
2013年6月21日に出願された米国特許出願第61/838,178号;2013年
6月21日に出願された米国特許出願第61/838,148号および2013年12月
26日に出願された米国特許出願第61/921,007号の利益を主張するものである
。上記出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成番号DP1GM105378およ
び米国国防総省の国防高等研究計画局により授与された助成番号W911NF−11−2
−0056の下、政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を
有する。
修飾酵素、DNAメチル化修飾因子を特定のゲノム遺伝子座にRNA誘導により標的化す
るための方法および構築物に関する。
およびCRISPR関連(cas)遺伝子はCRISPR/Cas系と呼ばれ、様々な細
菌および古細菌によってウイルスおよび他の外来核酸に対する防御を媒介するのに利用さ
れている。これらの系は、低分子RNAを用いて外来核酸を配列特異的に検出し、その発
現を抑制するものである。
Nat.Rev.Microbiol.9,467(2011);Makarovaら,
Biol.Direct 1,7(2006);Makarovaら,Biol.Dir
ect 6,38(2011))。最近の研究では、標的化された二本鎖DNA切断を、
そのDNA標的部位に相補的な単一「ガイドRNA」およびCas9ヌクレアーゼを用い
ることによって、in vitroで誘導するようII型CRISPR/Cas系を設計
することが可能であることが示されている(Jinekら,Science 2012;
337:816−821)。この標的化可能なCas9ベースの系は、培養ヒト細胞(M
aliら,Science.2013 Feb 15;339(6121):823−6
;Congら,Science.2013 Feb 15;339(6121):819
−23)で、またゼブラフィッシュではin vivoで(HwangおよびFuら,N
at Biotechnol.2013 Mar;31(3):227−9)内在遺伝子
内に標的化された変化を誘発するのにも有効である。
s9ヌクレアーゼ(「dCas9」としても知られる)と融合した異種機能ドメイン(例
えば、転写活性化ドメイン)を含む融合タンパク質の開発に基づくものである。公開され
ている研究では、触媒的に活性なCas9ヌクレアーゼタンパク質および触媒的に不活性
なCas9ヌクレアーゼタンパク質を特定のゲノム遺伝子座に標的化するのにガイドRN
Aが用いられてきたが、これまで、さらなるエフェクタードメインを動員するのにこの系
の使用を適用した研究はない。本研究はほかにも、標的遺伝子の発現レベルを(低下する
のではなく)上昇させるRNA誘導型の過程を初めて示すものである。
ーターへの融合をもたらすことによって、相乗的な転写活性化を生じさせることが可能で
あることを初めて示すものである。
する異種機能ドメイン(HFD)、例えば、転写活性化ドメイン、転写リプレッサー(例
えば、ヘテロクロマチンタンパク質1(HP1)、例えばHP1αもしくはHP1βなど
のサイレンサーまたは転写抑制ドメイン、例えば、クルッペル関連ボックス(KRAB)
ドメイン、ERFリプレッサードメイン(ERD)もしくはmSin3A相互作用ドメイ
ン(SID))、DNAのメチル化状態を修飾する酵素(例えば、DNAメチルトランス
フェラーゼ(DNMT)もしくはTen−Eleven Translocation(
TET)タンパク質、例えば、Tetメチルシトシンジオキシゲナーゼ1としても知られ
るTET1)またはヒストンサブユニットを修飾する酵素(例えば、ヒストンアセチルト
ランスフェラー(HAT)、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)またはヒストンデメチ
ラーゼ)と連結した触媒的に不活性なCRISPR関連9(dCas9)タンパク質を含
む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは転写活性化
ドメイン、例えばVP64もしくはNF−κB p65由来の転写活性化ドメイン;DN
A脱メチル化を触媒する酵素、例えば、TET;またはヒストン修飾を触媒する酵素(例
えば、LSD1、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、HDACまたはHAT)または転
写サイレンシングドメイン、例えば、ヘテロクロマチンタンパク質1(HP1)からのも
の、例えばHP1αもしくはHP1βの転写サイレンシングドメイン;または生物学的テ
ザー、例えば、CRISPR/CasサブタイプYpestタンパク質4(Csy4)、
MS2もしくはラムダNタンパク質である。
.pyogenes)由来である。
、H983またはD986;およびH840またはN863、例えばD10およびH84
0、例えば、D10AまたはD10NおよびH840AまたはH840NまたはH840
Yに変異を含む。
に不活性なCas9タンパク質のN末端またはC末端と連結しており、リンカーは融合タ
ンパク質の活性に干渉しないものである。
ーを伴って、N末端上、C末端上または触媒的に不活性なCRISPR関連9(Cas9
)タンパク質と異種機能ドメインとの間に核局在化配列および1つまたは複数のエピトー
プタグ、例えば、c−myc、6HisまたはFLAGタグのうちの一方または両方を含
む。
ならびにこの核酸を含む発現ベクターおよびこの融合タンパク質を発現する宿主細胞を提
供する。
。この方法は、本明細書に記載されるCas9−HFD融合タンパク質を、例えば、細胞
と融合タンパク質をコードする配列を含む発現ベクターとを接触させることによって細胞
内で発現させ、さらに例えば、細胞と、1つまたは複数のガイドRNAをコードする核酸
配列を含む1つまたは複数の発現ベクターとを接触させることによって、標的遺伝子に対
して相補性を有する1つまたは複数のガイドRNAを細胞内で発現させることを含む。
発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に
は本発明で使用する方法および材料が記載されるが、ほかにも、当該技術分野で公知の他
の適切な方法および材料を使用することができる。材料、方法および具体例は単に例示的
なものであって、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される刊行物、
特許出願、特許、配列、データベースエントリをはじめとする参照物はいずれも、その全
体が参照により組み込まれる。不一致が生じた場合、定義を含めた本明細書が優先される
.
から明らかになるであろう。
る。特許局に請求し、必要な料金を支払うことによって、この特許または特許出願公開の
カラー図面(1つまたは複数)付きの写しが得られる。
本明細書には、異種機能ドメイン(例えば、転写活性化ドメイン)の、細胞および生き
た生物体の特定のゲノム位置へのRNA誘導型標的化を可能にすることを目的として、触
媒的に不活性化された型のCas9タンパク質と融合したこれらの異種機能ドメインの融
合タンパク質が記載される。
るため防御機序として進化してきた。外来核酸に由来する短いプロトスペーサーがCRI
SPR遺伝子座内に組み込まれ、次いで転写され、プロセシングを受けて短いCRISP
R RNA(crRNA)になる。第二のtracrRNAと複合体を形成したこのcr
RNAは、その侵入核酸との配列相補性を利用して、外来核酸のCas9媒介性切断とこ
れに続く破壊を誘導する。2012年、Doudnaらは、crRNAとtracrRN
Aとの融合物からなる単一ガイドRNA(sgRNA)が、in vitroで特定のD
NA配列へのCas9ヌクレアーゼの動員を媒介し得ることを示した(図1C;Jine
kら,Science 2012)。
に標的化された変化が導入されている(図1B;Maliら,Science 2013
、HwangおよびFuら,Nat Biotechnol.2013 Mar;31(
3):227−9)。Qiらは、触媒的に不活性な変異型のCas9(dCas9とも呼
ばれる)のgRNA媒介性動員によって、大腸菌(E.coli)の特定内在遺伝子およ
びヒト細胞のEGFPレポーター遺伝子の抑制を引き起こすことが可能であることを示し
た(Qiら,Cell 152,1173−1183(2013))。この研究はRNA
誘導型Cas9技術を遺伝子発現の調節に適用できる可能性を示したものであるが、プロ
グラム可能なsgRNAまたは二重gRNAs(dgRNA、すなわち、カスタマイズさ
れたcrRNAおよびtracrRNA)によって特定のゲノム部位に動員される能力を
破壊せずに異種機能ドメイン(例えば、転写活性化ドメイン)とdCas9とを融合させ
ることが可能かどうかについては検討も実証もしていない。
て、CRISPR由来RNAを用いて、Cas9と融合した異種機能ドメイン(Cas9
−HFD)をゲノムの特定部位に標的化することが可能である(図1C)。例えば、本明
細書に記載されるように、単一ガイドRNA(sgRNA)を用いてCas9−HFD、
例えばCas9−転写活性化因(以降、Cas9−活性化因子と呼ぶ)を特定遺伝子のプ
ロモーターに標的化することによって、標的遺伝子の発現を増大させることが可能である
。このように、ガイドRNAの配列相補性によって定められる標的特異性によってCas
9−HFDをゲノム内の部位に局在させることが可能である。標的配列は、PAM配列(
RNAによって特定される配列に隣接し、Cas9タンパク質によって特定される2〜5
ヌクレオチドの配列)も含む。
またはNF−κB p65の転写活性化ドメイン)と、触媒的に不活性なCas9タンパ
ク質(dCas9)のN末端またはC末端とを融合することによって作製される。
いくつかの細菌がCas9タンパク質変異体を発現する。現在、化膿性連鎖球菌(St
reptococcus pyogenes)Cas9が最もよく用いられているが、他
のCas9タンパク質にも化膿性連鎖球菌(S.pyogenes)Cas9と高レベル
の配列同一性を有し、同じガイドRNAを利用するものがある。それ以外のものはさらに
多様であり、利用するgRNAが異なり、認識するPAM配列(RNAによって定められ
る配列に隣接するタンパク質によって定められる、2〜5のヌクレオチドの配列)も異な
る。Chylinskiらは多数の細菌群のCas9タンパク質を分類し(RNA Bi
ology 10:5,1−12;2013)、その付図1および付表1に多数のCas
9タンパク質を列記しており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ほかのCa
s9タンパク質については、Esveltら,Nat Methods.2013 No
v;10(11):1116−21およびFonfaraら,“Phylogeny o
f Cas9 determines functional exchangeabi
lity of dual−RNA and Cas9 among ortholog
ous type II CRISPR−Cas systems.” Nucleic
Acids Res.2013 Nov 22.[印刷前電子出版]doi:10.1
093/nar/gkt1074に記載されている。
。化膿性連鎖球菌(S.pyogenes)およびサーモフィルス菌(S.thermo
philus)のCas9分子が本開示の大部分の対象となるが、ほかにも、本明細書に
列記する他の種のCas9タンパク質に由来するか、これに基づくCas9分子を用いる
ことができる。換言すれば、本記載の大部分が化膿性連鎖球菌(S.pyogenes)
およびサーモフィルス菌(S.thermophilus)のCas9分子を用いるもの
であるが、他の種のCas9分子をその代わりに用いることができる。このような種とし
ては、Chylinskiら,2013の付図1に基づいて作成した以下の表に記載され
る種が挙げられる。
よびその対応するガイドRNAまたはこれに相当する他のガイドRNAの使用を含み得る
。サーモフィルス菌(Streptococcus thermophilus)LMD
−9のCas9 CRISPR1系がヒト細胞で機能することがCongらに示されてい
る(Science 339,819(2013))。さらに、Jinekらは、サーモ
フィルス菌(S.thermophilus)およびL.イノキュア(L.innocu
a)のCas9オルソログ(異なるガイドRNAを利用すると思われる髄膜炎菌(N.m
eningitidis)およびジェジュニ菌(C.jejuni)のCas9オルソロ
グではない)が、わずかに効率が低下するものの、化膿性連鎖球菌(S.pyogene
s)二重gRNAによって誘導されて標的プラスミドDNAを切断し得ることをin v
itroで明らかにしている。
現にコドン最適化され、D10、E762、H983またはD986およびH840また
はN863の変異、例えば、D10A/D10NおよびH840A/H840N/H84
0Yを含む化膿性連鎖球菌(S.pyogenes)Cas9タンパク質を用いてタンパ
ク質のヌクレアーゼ部分の触媒的に不活性な状態にし;これらの位置における置換は、(
Nishimasuら,Cell 156,935−949(2014)に記載されてい
るように)アラニンであってよく、また他の残基、例えばグルタミン、アスパラギン、チ
ロシン、セリンまたはアスパラギン酸、例えばE762Q、H983N、H983Y、D
986N、N863D、N863SまたはN863Hであってよい(図1C)。本明細書
に記載の方法および組成物に使用することができる触媒的に不活性な化膿性連鎖球菌(S
.pyogenes)Cas9は以下の通りであり、例示的なD10AおよびH840A
の変異は太字で表され、下線が施されている。
球菌(S.pyogenes)Cas9の配列と少なくとも約50%同一である、すなわ
ち、配列番号13と少なくとも50%同一である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチ
ド配列は配列番号13と約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%、99%または100%同一である。
に不活性な化膿性連鎖球菌(S.pyogenes)Cas9の配列と少なくとも約50
%同一である、すなわち、配列番号13と少なくとも50%、55%、60%、65%、
70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%または100%同一であり、
ここでは、D10およびH840の変異、例えばD10A/D10NおよびH840A/
H840N/H840Yが維持される。
Chylinskiら,RNA Biology 10:5,1−12;2013(例え
ば、その付図1および付表1);Esveltら,Nat Methods.2013
Nov;10(11):1116−21およびFonfaraら,Nucl.Acids
Res.(2014)42(4):2577−2590.[印刷前電子出版 2013
Nov 22]doi:10.1093/nar/gkt1074に記載されている配
列の配列アライメントによって確認され、ここでは、D10およびH840の変異、例え
ばD10A/D10NおよびH840A/H840N/H840Yが維持される。
適な整列に必要であれば第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギ
ャップを導入し、また非相同配列を無視することができる)。比較目的で整列させる参照
配列の長さは少なくとも50%である(いくつかの実施形態では、参照配列の長さの約5
0%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、95%または100
%)を整列させる。次いで、対応する位置のヌクレオチドまたは残基を比較する。第一の
配列のある位置が、第二の配列の対応する位置と同じヌクレオチドまたは残基によって占
められていれば、2つの分子はその位置において同一である。2つの配列のパーセント同
一性は、2つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップの数および各ギャ
ップの長さを考慮に入れた、2つの配列に共通する同一の位置の数の関数となる。
いて実施することができる。本願の目的には、GCGソフトウェアパッケージのGAPプ
ログラムに組み込まれているNeedlemanおよびWunsch((1970)J.
Mol.Biol.48:444−453)のアルゴリズムを使用し、ギャップペナルテ
ィが12、ギャップ伸長ペナルティが4、フレームシフトギャップペナルティが5のBl
ossum62スコア行列を用いて、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定す
る。
転写活性化ドメインはCas9のN末端に融合しても、C末端に融合してもよい。さら
に、本記載では転写活性化ドメインを例にあげているが、ほかにも当該技術分野で公知の
他の異種機能ドメイン(例えば、転写リプレッサー(例えば、KRAB、ERD、SID
など、例えば、ets2リプレッサー因子(ERF)リプレッサードメイン(ERD)の
アミノ酸473〜530、KOX1のKRABドメインのアミノ酸1〜97またはMad
mSIN3相互作用ドメイン(SID)のアミノ酸1〜36;Beerliら,PNA
S USA 95:14628−14633(1998)を参照されたい)またはヘテロ
クロマチンタンパク質1(HP1、swi6としても知られる)、例えば、HP1αもし
くはHP1βなどのサイレンサー;固定化RNA結合配列、例えばMS2コートタンパク
質,エンドリボヌクレアーゼCsy4またはラムダNタンパク質が結合するRNA結合配
列などと融合した長い非コードRNA(lncRNA)を動員し得るタンパク質またはペ
プチド;DNAのメチル化状態を修飾する酵素(例えば、DNAメチルトランスフェラー
ゼ(DNMT)またはTETタンパク質);あるいはヒストンサブユニットを修飾する酵
素(例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)、ヒストンデアセチラーゼ
(HDAC)、ヒストンメチルトランスフェラーゼ(例えば、リジンまたはアルギニン残
基をメチル化する)またはヒストンデメチラーゼ(例えば、リジンまたはアルギニン残基
を脱メチル化する))を用いることができる。このようなドメインのいくつかの配列、例
えば、DNA中のメチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒するドメインの配列が当該技
術分野で公知である。例示的なタンパク質は、DNA中の5−メチルシトシン(5−mC
)を5−ヒドロキシメチルシトシン(5−hmC)n変換する酵素である、Ten−El
even−Translocation(TET)1〜3のファミリーを含む。
テインリッチ延長と7つの高度の保存されたエキソンによってコードされる2OGFeD
Oドメインとを含む触媒モジュール、例えば、アミノ酸1580〜2052を含むTet
1触媒ドメイン、アミノ酸1290〜1905を含むTet2およびアミノ酸966〜1
678を含むTet3を含み得る。例えば、3種類すべてのTetタンパク質の重要な触
媒残基を示す整列に関しては、Iyerら,Cell Cycle.2009 Jun
1;8(11):1698−710.Epub 2009 Jun 27の図1を、また
完全長配列に関してはその付属資料(ftpサイトftp.ncbi.nih.gov/
pub/aravind/DONS/supplementary_material_
DONS.htmlで入手可能)を参照されたい(例えば、seq 2cを参照されたい
);いくつかの実施形態では、配列はTet1のアミノ酸1418〜2136またはTe
t2/3の対応する領域を含む。
するものであり得る。
ンパク質、エンドリボヌクレアーゼCsy4またはラムダNタンパク質の全部または一部
(例えば、これらのDNA結合ドメイン)を含む。これらのタンパク質を用いて、特異的
なステムループ構造を含むRNA分子をdCas9 gRNA標的化配列によって特定さ
れる場所に動員することができる。例えば、MS2コートタンパク質、エンドリボヌクレ
アーゼCsy4またはラムダNと融合したdCas9を用いて、Csy4結合配列、MS
2結合配列またはラムダN結合配列と連結したXISTまたはHOTAIRなどの長い非
コードRNA(lncRNA)を動員することができる(例えば、Keryer−Bib
ensら,Biol.Cell 100:125−138(2008)を参照されたい)
。あるいは、Csy4結合配列、MS2結合配列またはラムダNタンパク質結合配列を例
えば、Keryer−Bibensら(上記)に記載されているように、別のタンパク質
と連結してもよく、本明細書に記載の方法および組成物を用いて、このタンパク質をdC
as9結合部位に標的化してもよい。いくつかの実施形態では、Csy4は触媒的に不活
性である。
ンカーを含む。これらの融合タンパク質(または連結構造の融合タンパク質同士)に使用
し得るリンカーは、融合タンパク質の機能に干渉しない任意の配列を含み得る。好ましい
実施形態では、リンカーは短く、例えば2〜20アミノ酸であり、通常は柔軟である(す
なわち、グリシン、アラニンおよびセリンなどの自由度の高いアミノ酸を含む)。いくつ
かの実施形態では、リンカーはGGGS(配列番号14)またはGGGGS(配列番号1
5)からなる1つまたは複数の単位、例えば、2回、3回、4回またはそれ以上反復した
GGGS(配列番号14)またはGGGGS(配列番号15)の単位を含む。ほかにも、
これ以外のリンカー配列を使用することができる。
記載されるCas9−HFD系は、内在遺伝子の発現の改変に有用で用途の多いツール
である。これを達成するのに現在用いられている方法では、標的とする各部位について新
規に設計したDNA結合タンパク質(設計された亜鉛フィンガーまたは転写活性化因子様
エフェクターDNA結合ドメインなど)が必要である。これらの方法は、各標的部位と結
合するよう特異的に設計された大型のタンパク質を発現させる必要があるため、それを多
重化する容量に制限がある。しかし、Cas9−HFDは、Cas9−HFDタンパク質
1つのみの発現を必要し、それは複数の短いgRNAの発現によってゲノムの複数の部位
を標的とさせ得る。したがって、この系は同時に多数の遺伝子の発現を誘導する、または
単一の遺伝子、プロモーターもしくはエンハンサーに複数のCas9−HFDを動員する
のに容易に用いることが可能である。この能力は用途の範囲が広く、例えば、基礎的な生
物学的研究では、遺伝子機能を研究し、単一経路の複数の遺伝子の発現を操作するために
これを用いることが可能であり、また合成生物学では、これにより研究者が細胞内に複数
の入力シグナルに応答する回路を作製することが可能となる。この技術は比較的容易に実
施し多重化に適用することが可能であることから、用途が多岐にわたる汎用性の高い技術
となる。
ドする核酸および選択された遺伝子に対する1つまたは複数のガイドRNAをコードする
核酸とを接触させて、遺伝子の発現を調節することを含む。
一般的に言えば、ガイドRNAには2つの系、すなわち、一緒に機能してCas9によ
る切断を誘導する別個のcrRNAとtracrRNAを用いる系1および2つの別個の
ガイドRNAを単一の系に組み合わせるキメラcrRNA−tracrRNAハイブリッ
ドを用いる系2(単一ガイドRNAまたはsgRNAと呼ばれる。このほか、Jinek
ら,Science 2012;337:816−821を参照されたい)がある。tr
acrRNAは様々な長さに短縮することが可能であり、様々な長さのものが別個の系(
系1)およびキメラgRNA系(系2)の両方で機能することが示されている。例えば、
いくつかの実施形態では、tracrRNAは、その3’末端から少なくとも1nt、2
nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt
、20nt、25nt、30nt、35ntまたは40nt短縮されていてよい。いくつ
かの実施形態では、tracrRNA分子は、その5’末端から少なくとも1nt、2n
t、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、
20nt、25nt、30nt、35ntまたは40nt短縮されていてよい。あるいは
、tracrRNA分子は、5’末端および3’末端の両方から、例えば、5’末端で少
なくとも1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、
10nt、15ntまたは20nt、3’末端で少なくとも1nt、2nt、3nt、4
nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25
nt、30nt、35ntまたは40nt短縮されていてよい。例えば、Jinekら,
Science 2012;337:816−821;Maliら,Science.2
013 Feb 15;339(6121):823−6;Congら,Science
.2013 Feb 15;339(6121):819−23;ならびにHwangお
よびFuら,Nat Biotechnol.2013 Mar;31(3):227−
9;Jinekら,Elife 2,e00471(2013)を参照されたい。系2で
は一般に、キメラgRNAの長さが長いほどオンターゲット活性が高いことがわかってい
るが、様々な長さのgRNAの相対的特異性は現時点では明らかにされておらず、したが
って、場合によっては短いgRNAを用いる方が望ましいことがある。いくつかの実施形
態では、gRNAは、転写開始部位を含む転写開始部位の上流約100〜800bp以内
、例えば、転写開始部位の上流約500bp以内、または転写開始部位の下流約100〜
800bp以内、例えば、約500bp以内にある領域に相補的である。いくつかの実施
形態では、2種類以上のgRNAをコードするベクター(例えば、プラスミド)、例えば
、標的遺伝子の同じ領域の異なる部位を対象とする2種類、3種類、4種類、5種類また
はそれ以上のgRNAをコードするプラスミドを用いる。
0ntを有する単一gRNAまたはtracrRNA/crRNAを用いて、例えば配列
NGGの追加のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を有する特定の17〜20nt
ゲノム標的にCas9ヌクレアーゼを誘導することができる。したがって、本発明の方法
は、通常通りにトランスコードされたtracrRNAと融合したcrRNAを含み、5
’末端に標的配列、例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、例えばNGG、
NAGまたはNNGGの5’側に隣接する標的配列の相補鎖の25〜17ヌクレオチド、
任意選択で20以下のヌクレオチド(nt)、例えば、20nt、19nt、18ntま
たは17nt、好ましくは17ntまたは18ntに相補的な配列を有する単一ガイドR
NA、例えば、Maliら,Science 2013 Feb 15;339(612
1):823−6に記載されている単一Cas9ガイドRNAの使用を含み得る。いくつ
かの実施形態では、単一Cas9ガイドRNAは、配列:
(X17〜20)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAA
GGCUAGUCCG(XN)(配列番号1);
(X17〜20)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGU
UAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(配列番号2);
(X17〜20)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAAC
AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(
配列番号3);
(X17〜20)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAA
GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCG
GUGC(XN)(配列番号4)、
(X17〜20GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAG
GCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGG
UGC(配列番号5);
(X17〜20)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAA
GUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGG
CACCGAGUCGGUGC(配列番号6);または
(X17〜20)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAA
GUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGG
CACCGAGUCGGUGC(配列番号7);
からなり、
配列中、X17〜20は、標的配列の連続する17〜20ヌクレオチドに相補的なヌクレ
オチド配列である。単一ガイドRNAをコードするDNAについては既に文献(Jine
kら,Science.337(6096):816−21(2012)およびJine
kら,Elife.2:e00471(2013))に記載されている。
を含んでよく、(RNA中の)Nは0〜200、例えば、0〜100、0〜50または0
〜20であり得る。
)またはウラシル(U)ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、RNA Pol
III転写を停止させる終止シグナルとして用いられる1つまたは複数のTが任意選択で
存在するので、RNAは分子の3’末端に1つまたは複数のU、例えば、1〜8つまたは
それ以上のU(例えば、U、UU、UUU、UUUU、UUUUU、UUUUUU、UU
UUUUU、UUUUUUUU)を含む。
二重gRNA(例えば、天然の系にみられるcrRNAとtracrRNA)とともに用
いてもよい。この場合、単一tracrRNAを、本発明の系を用いて発現させる複数の
異なるcrRNAとともに使用し、例えば、以下のような:
(X17〜20)GUUUUAGAGCUA(配列番号102);
(X17〜20)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号103);
または
(X17〜20)GUUUUAGAGCUAUGCU(配列番号104)
とtracrRNA配列とを使用する。この場合、crRNAを本明細書に記載の方法お
よび分子のガイドRNAとして使用し、tracrRNAを同じまたは異なるDNA分子
から発現させ得る。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞と、配列GGAACCA
UUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUU
AUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号8)ま
たはその活性部分(活性部分とは、Cas9またはdCas9と複合体を形成する能力を
保持している部分のことである)を含むか、これよりなるtracrRNAとを接触させ
ることを含む。いくつかの実施形態では、tracrRNA分子は、その3’末端から少
なくとも1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、
10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35ntまたは40nt短縮され
ていてよい。別の実施形態では、tracrRNA分子は、その5’末端から少なくとも
1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt
、15nt、20nt、25nt、30nt、35ntまたは40nt短縮されていてよ
い。あるいは、tracrRNA分子は、5’末端および3’末端の両方から、例えば、
5’末端で少なくとも1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8n
t、9nt、10nt、15ntまたは20nt、3’末端で少なくとも1nt、2nt
、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、2
0nt、25nt、30nt、35ntまたは40nt短縮されていてよい。例示的なt
racrRNA配列は配列番号8のほかにも、以下のものを含む:
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAA
AAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号105)もしくはその活性部分;
または
AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUU
GAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号106)もしくはその活
性部分。
をcrRNAとして用いるいくつかの実施形態では、以下のtracrRNAを用いる:
GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUA
GUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(
配列番号8)またはその活性部分。
いるいくつかの実施形態では、以下のtracrRNAを用いる:UAGCAAGUUA
AAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACC
GAGUCGGUGC(配列番号105)またはその活性部分。
として用いるいくつかの実施形態では、以下のtracrRNAを用いる:AGCAUA
GCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAA
GUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号106)またはその活性部分。
ムの残りの部分の任意の配列と異なる少なくとも3つ以上のミスマッチである部分に標的
化する。
チドをより好ましい(安定な)コンホメーションにロックすることによってRNA−DN
Aハイブリダイゼーションの特異性を増大させることが示されている。例えば、2’−O
−メチルRNAは2’酸素と4’炭素の間に追加の共有結合が存在する修飾塩基であり、
これをオリゴヌクレオチド内に組み込むことによって全体の熱安定性および選択性を改善
することができる(式I)。
つまたは複数の修飾RNAオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、本明細書に記載の短
縮ガイドRNA分子は、標的配列に相補的なガイドRNAの17〜18ntまたは17〜
19n5’領域の1つ、一部または全部が修飾されていてよく、例えば、ロックされてい
てよく(2’−O−4’−Cメチレン架橋)、5’−メチルシチジンであってよく、2’
−O−メチル−プソイドウリジンであってよく、あるいはリボースリン酸骨格がポリアミ
ド鎖に置き換わっていてよく(ペプチド核酸)、例えば、合成リボ核酸であってよい。
飾されていてよく、例えば、ロックされていてよく(2’−O−4’−Cメチレン架橋)
、5’−メチルシチジンであってよく、2’−O−メチル−プソイドウリジンであってよ
く、あるいはリボースリン酸骨格がポリアミド鎖に置き換わっていてよく(ペプチド核酸
)、例えば、合成リボ核酸であってよい。
tracrRNAは、3’末端に1つまたは複数のアデニン(A)またはウラシル(U)
ヌクレオチドを含み得る。
RNA−DNAヘテロ二本鎖の形成を利用するものである。しかし、RNA−DNAヘテ
ロ二本鎖ではそのDNA−DNA対応物よりも無差別な範囲の構造が形成され得る。実際
、DNA−DNA二本鎖の方がミスマッチに対する感度が高く、このことは、DNA誘導
型ヌクレアーゼがオフターゲット配列と容易には結合せず、RNA誘導型ヌクレアーゼに
比して特異性が高いことを示唆している。したがって、本明細書に記載の方法に使用可能
なガイドRNAはハイブリッド、すなわち、1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド
、例えば短いDNAオリゴヌクレオチドが、gRNAの全部または一部、例えばgRNA
の相補性領域の全部または一部と置き換わったハイブリッドであり得る。このDNAベー
スの分子は、単一gRNA系の全部または一部と置き換わってもよく、あるいは二重cr
RNA/tracrRNA系のcrRNAおよび/またはtracrRNAの全部または
一部と置き換わってもよい。一般にDNA−DNA二本鎖の方がRNA−DNA二本鎖よ
りもミスマッチに対する許容性が低いことから、相補性領域内にDNAを組み込むこのよ
うな系の方がより高い信頼性で目的とするゲノムDNA配列を標的とするはずである。こ
のような二本鎖を作製する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Barkerら,
BMC Genomics.2005 Apr 22;6:57;およびSugimot
oら,Biochemistry.2000 Sep 19;39(37):11270
−81を参照されたい。
合成であり、1つまたは複数の修飾(例えば、ロックト)ヌクレオチドまたはデオキシリ
ボヌクレオチドを含むものであり得る。
ISPR/Cas9ヌクレアーゼ系のゲノム全域にわたる特異性を改善することが可能で
ある。
発現させるか、細胞と接触させることを含み得る。
本明細書に記載される融合タンパク質およびガイドRNAを使用するためには、それを
コードする核酸から発現させるのが望ましいであろう。これは様々な方法で実施すること
ができる。例えば、ガイドRNAまたは融合タンパク質をコードする核酸を中間ベクター
にクローン化して原核細胞または真核細胞を形質転換し、複製および/または発現させる
。中間ベクターは通常、融合タンパク質をコードする核酸を保管または操作するか、融合
タンパク質を産生するための原核生物ベクター、例えばプラスミドもしくはシャトルベク
ターまたは昆虫ベクターである。このほか、ガイドRNAまたは融合タンパク質をコード
する核酸を発現ベクターにクローン化して植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞
もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞に投与してもよい。
を指令するプロモーターを含む発現ベクターにサブクローン化する。適切な細菌プロモー
ターおよび真核プロモーターは当該技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら
,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第
3版,2001);Kriegler,Gene Transfer and Expr
ession:A Laboratory Manual(1990);およびCurr
ent Protocols in Molecular Biology(Ausub
elら編,2010)に記載されている。設計したタンパク質を発現させるための細菌発
現系を例えば、大腸菌(E.coli)、バチルス(Bacillus)菌種およびサル
モネラ(Salmonella)で入手することができる(Palvaら,1983,G
ene 22:229−235)。そのような発現系のキットが市販されている。哺乳動
物細胞、酵母および昆虫細胞用の真核発現系は当該技術分野で周知であり、同じく市販さ
れている。
例えば、融合タンパク質の発現および精製には通常、強力な構成的プロモーターを使用す
る。これに対して、遺伝子調節のために融合タンパク質をin vivoで投与する場合
、融合タンパク質の具体的な用途に応じて構成的プロモーターまたは誘導プロモーターの
いずれかを使用することができる。さらに、融合タンパク質の投与に好ましいプロモータ
ーは、HSV TKなどの弱いプロモーターまたはこれと類似する活性を有するプロモー
ターであり得る。プロモーターはほかにも、トランス活性化に応答性の要素、例えば、低
酸素応答要素、Gal4応答要素、lacリプレッサー応答要素ならびにテトラサイクリ
ン調節系およびRU−486系などの小分子制御系を含み得る(例えば、Gossenお
よびBujard,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:
5547;Oliginoら,1998,Gene Ther.,5:491−496;
Wangら,1997,Gene Ther.,4:432−441;Neeringら
,1996,Blood,88:1147−55;ならびにRendahlら,1998
,Nat.Biotechnol.,16:757−761を参照されたい)。
るのに必要なほかのあらゆる要素を含む転写単位または発現カセットを含む。したがって
、典型的な発現カセットは、例えば融合タンパク質をコードする核酸配列と作動可能に連
結されたプロモーターと、例えば効率的な転写産物のポリアデニル化、転写停止、リボソ
ーム結合部位または翻訳停止に必要な任意のシグナルとを含む。カセットのほかの要素と
しては、例えば、エンハンサーおよび異種スプライスイントロンシグナルを挙げ得る。
パク質の用途、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などでの発現を考慮して選択
する。標準的な細菌発現ベクターとしては、pBR322ベースのプラスミド、pSKF
、pET23DなどのプラスミドならびにGSTおよびLacZなどの市販のタグ融合発
現系が挙げられる。好ましいタグ融合タンパク質はマルトース結合タンパク質(MBP)
である。操作したTALE反復タンパク質の精製にこのようなタグ融合タンパク質を用い
ることができる。このほか組換えタンパク質にエピトープタグ、例えばc−mycまたは
FLAGを付加して、単離、発現のモニタリングならびに細胞局在および細胞内局在のモ
ニタリングに便利な方法を得ることができる。
ベクター、パピローマウイルスベクターおよびエプスタイン・バーウイルス由来のベクタ
ーを用いることが多い。その他の例示的な真核ベクターとしては、pMSG、pAV00
9/A+、pMTO10/A+、pMAMneo−5、バキュロウイルスpDSVEおよ
びSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘド
リンプロモーターをはじめとする真核細胞での発現に効果を示すプロモーターの指令を受
けてタンパク質を発現させる他の任意のベクターが挙げられる。
PolIIIプロモーター、例えば、H1、U6または7SKプロモーターを含み得る。
これらのヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクション後に哺乳動物細胞にgR
NAを発現させる。あるいは、例えばvitro転写にT7プロモーターを使用してもよ
く、RNAをin vitroで転写させてから精製することができる。短いRNA、例
えば、siRNA、shRNAをはじめとする低分子RNAの発現に適したベクターを使
用することができる。
えばチミジンキナーゼ、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼおよびジヒドロ葉酸
レダクターゼなどを有する。このほか、昆虫細胞にバキュロウイルスベクターを用いてポ
リヘドリンプロモーターをはじめとする強力なバキュロウイルスプロモーターの指令の下
に融合タンパク質をコードする配列を置くものなど、高収率の発現系が適している。
るレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコー
ドする遺伝子およびプラスミドの非必須領域にあり組換え配列の挿入を可能にする固有の
制限部位が挙げられる。
物、酵母または昆虫の細胞系を作製し、次いで標準的な技術を用いてこのタンパク質を精
製する(例えば、Colleyら,1989,J.Biol.Chem.,264:17
619−22;Guide to Protein Purification,in
Methods in Enzymology,vol.182(Deutscherら
編,1990)を参照されたい)。真核および原核細胞の形質転換を標準的な技術により
実施する(例えば、Morrison,1977,J.Bacteriol.132:3
49−351;Clark−CurtissおよびCurtiss,Methods i
n Enzymology 101:347−362(Wuら編,1983)を参照され
たい)。
うな方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラス
ト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジ
ェクション、裸のDNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター(エピソーム型および
組込み型の両方)およびクローン化したゲノムDNA、cDNA、合成DNAをはじめと
する外来遺伝物質を宿主細胞内に導入する他のあらゆる周知の方法の使用が挙げられる(
例えば、Sambrookら,上記を参照されたい)。唯一必要なのは、用いる具体的な
遺伝子工学的方法で、選択したタンパク質の発現が可能な宿主細胞内に遺伝子を少なくと
も1つ良好に導入することができることである。
化ドメインを含む。核局在化配列(NLS)がいくつか知られており、任意の適切なNL
Sを使用し得る。例えば、多くのNLSが二連塩基反復(bipartite basi
c repeats)と呼ばれる複数の塩基性アミノ酸を有する(Garcia−Bus
tosら,1991,Biochim.Biophys.Acta,1071:83−1
01に概説されている)。二連塩基反復(bipartite basic repea
ts)を含むNLSをキメラタンパク質の任意に部分に配置し、核内に局在化するキメラ
タンパク質を生じさせることができる。好ましい実施形態では、本明細書に記載される融
合タンパク質の最終的な機能には通常、タンパク質が核内に局在する必要があるため、最
終的な融合タンパク質に核局在化ドメインを組み込む。しかし、最終的なキメラタンパク
質内にあるDBDドメイン自体または別の機能ドメインに内因性の核移行機能がある場合
、別個に核局在化ドメインを付加する必要がないこともある。
される本発明の範囲を限定するものではない。
強力な合成VP64活性化ドメイン(Beerliら,Proc Natl Acad
Sci USA 95,14628−14633(1998))と、触媒的に不活性化
されたdCas9タンパク質のカルボキシ末端とを融合することによって、RNA誘導型
転写活性化因子を作製することが可能であるとする仮説を立てた(図1D)。
駆動される完全長キメラgRNA(最初にJinekら(Science 2012)に
記載されたcrRNAとtracrRNAとの融合物)を発現するベクターを設計した。
gRNA発現プラスミドの構築を以下の通りに実施した。可変20nt gRNA標的化
配列をコードするDNAオリゴヌクレオチドのペアをアニールさせて、4bpのオーバー
ハングを有する短い二本鎖DNAフラグメントを作製した(表1)。
約102nt一本鎖ガイドRNA(Maliら,Science.2013 Feb 1
5;339(6121):823−6;Hwangら,Nat Biotechnol.
2013 Mar;31(3):227−9)をコードしヒトU6プロモーターによって
発現されるDNAを得た。pMLM3636プラスミドおよびその完全DNA配列はAd
dgeneから入手可能である。図4を参照されたい。
ら,2012;およびQiら,2013に記載されている)を野生型またはコドン最適化
Cas9配列に導入した(図5)。上記変異は、Cas9が二本鎖切断を誘導しないよう
触媒的に不活性な状態にするものである。1つの構築物では、不活性化Cas9のC末端
に三重flagタグ、核局在化シグナルおよびVP64活性化ドメインを融合した(図6
)。CMVプロモーターによってこの融合タンパク質の発現を駆動した。
る通りに、開始コドンの5’側にT7プロモーター部位、Cas9コード配列のカルボキ
シ末端に核局在化シグナルを付加するプライマーを用いて、不活性化D10A/H840
A変異を保有するCas9ヌクレアーゼ(dCas9)をコードするDNAをプラスミド
pMJ841(Addgeneプラスミド番号39318)からPCRにより増幅し、C
MVプロモーターを含むプラスミドにクローン化して(Hwangら,Nat Biot
echnol 31,227−229(2013))、プラスミドpMLM3629を得
た。三重FLAGエピトープをコードするオリゴヌクレオチドをアニールさせ、プラスミ
ドpMLM3629のXhoI部位およびPstI部位にクローン化して、C末端fla
gFLAGタグを有するdCas9を発現するプラスミドpMLM3647を作製した。
プラスミドpMLM3647のFLAGタグ化dCas9の下流にGly4Serリンカ
ーをコードするDNA配列とこれに続く合成VP64活性化ドメインを導入して、プラス
ミドpSL690を得た。このほか、ヒト細胞での発現にコドン最適化されたFLAGタ
グ化Cas9配列をコードするプラスミドpJDS247にD10A/H840A変異を
QuikChange部位特異的変異誘発(Agilent)により導入して、プラスミ
ドpMLM3668を得た。次いで、Gly4SerリンカーをコードするDNA配列お
よびVP64活性化ドメインをpMLM3668に導入して、pMLM3705という名
称のコドン最適化dCas9−VP64発現ベクターを得た。
Flp−In T−Rex293細胞を10%FBS、1%penstrepおよび1%
Glutamaxを添加したAdvanced DMEM(Invitrogen)で維
持した。製造業者の説明書に従ってLipofectamine LTX(Invitr
ogen)により細胞をトランスフェクトした。簡潔に述べると、160,000個の2
93細胞を24ウェルプレートに播種し、翌日、gRNAプラスミド250ng、Cas
9−VP64プラスミド250ng、pmaxGFPプラスミド30ng(Lonza)
、Plus試薬0.5μlおよびLipofectamine LTX 1.65μlで
トランスフェクトした。トランスフェクションの40時間後、トランスフェクトした29
3細胞から組織培地を回収し、R&D System社のHuman VEGF−A E
LISAキット「Human VEGF Immunoassay」を用いて、分泌され
たVEGF−Aタンパク質をアッセイした。
DNアーゼI高感受性部位(HSS)内にある標的配列に対して16種類のsgRNAを
構築した(図1E)。
ク質を動員する能力を検証する前に、最初に上記gRNAがそれぞれヒト293細胞内の
目的とする標的部位にCas9ヌクレアーゼを誘導する能力を評価した。この目的のため
に、gRNA発現ベクターおよびCas9発現ベクターを1:3の比でトランスフェクト
したが、それは、これまでの最適化実験で、U2OS細胞にプラスミドを1:3の比で用
いて高レベルのCas9誘導DNA切断が得られることが示されたからである。
クレアーゼ(pMLM3639)をコードするプラスミド375ngを細胞にトランスフ
ェクトしたことを除いて、dCas9−VP16 VEGFA実験について上に記載した
通りに293細胞のトランスフェクションを実施した。トランスフェクションの40時間
後、QIAamp DNA Blood Miniキット(Qiagen)を製造業者の
説明書に従って用い、ゲノムDNAを単離した。Phusion Hot Start
II高忠実度DNAポリメラーゼ(NEB)および3%DMSOならびに以下のタッチダ
ウンPCRサイクル:98℃、10秒;72〜62℃、−1℃/サイクル、15秒;72
℃、30秒を10サイクル、次いで98℃、10秒;62℃、15秒;72℃、30秒を
25サイクル用いて、VEGFAプロモーター内の3つの異なる標的化領域のPCR増幅
を実施した。プライマーoFYF434(5’−TCCAGATGGCACATTGTC
AG−3’(配列番号82))およびoFYF435(5’−AGGGAGCAGGAA
AGTGAGGT−3’(配列番号83))を用いて−500領域を増幅した。プライマ
ーoFYF438(5’−GCACGTAACCTCACTTTCCT−3’(配列番号
84))およびoFYF439(5’−CTTGCTACCTCTTTCCTCTTTC
T−3’(配列番号85))を用いて転写開始部位付近の領域を増幅した。プライマーo
FYF444(5’−AGAGAAGTCGAGGAAGAGAGAG−3’(配列番号
86))およびoFYF445(5’−CAGCAGAAAGTTCATGGTTTCG
−3’(配列番号87))を用いて+500領域を増幅した。既に記載されている通りに
Ampure XPビーズ(Agencourt)を用いてPCR産物を精製し、T7エ
ンドヌクレアーゼIアッセイを実施し、QIAXCELキャピラリー電気泳動系で分析し
た(Reyonら,Nat Biotech 30,460−465(2012))。
用いた評価でそれぞれの標的部位へのCas9ヌクレアーゼ誘導挿入欠失変異の効率的な
導入を媒介することができた(表2)。したがって、16種類のgRNAはいずれも、ヒ
ト細胞内でCas9ヌクレアーゼと複合体を形成し、特定の標的ゲノム部位にその活性を
誘導することができる。
のゲノム部位に標的化することが可能であるかどうかを検証するため、VEGFAタンパ
ク質の酵素結合免疫測定を以下の通りに実施した。VEGFを標的とするsgRNAおよ
びdCas9−VP64をコードするプラスミドをトランスフェクトしたFlp−In
T−Rex HEK293細胞の培地をトランスフェクションの40時間後に回収し、V
EGFAタンパク質の発現を既に記載されている通りにELISAにより測定した(Ma
ederら,Nat Methods 10,243−245(2013))。sgRN
AとdCas9−VP64の両方を発現する細胞に由来する培地中のVEGFAタンパク
質の濃度を、オフターゲットsgRNA(EGFPレポーター遺伝子内に配列を標的とす
る)およびdCas9−VP64を発現する細胞に由来する培地中のVEGFAタンパク
質の濃度で除することにより、VEGFA発現の活性化倍数を計算した。
64と共発現した場合にVEGFAタンパク質発現の有意な増加を誘導した(図2A)。
観察されたVEGFA誘導の程度は2〜18.7倍の範囲の活性化であり、平均は5倍の
活性化であった。対照実験では、16種類のgRNA単独の発現、dCas9−VP64
単独の発現およびdCas9−VP64と、EGFPレポーター遺伝子配列と結合するよ
う設計した「オフターゲット」gRNAとの共発現ではいずれも、VEGFA発現の増大
を誘導することはできなかったことが明らかになり(図2A)、プロモーター活性化には
特異的gRNAとdCas9−VP64タンパク質の両方が同時発現する必要があること
が示された。したがって、dCas9−VP64をヒト細胞内で安定に発現させ、gRN
Aによって特定のゲノム遺伝子座の転写を活性化するよう誘導することが可能である。g
RNA3でトランスフェクトした細胞において最大のVEGFA増加が観察され、この細
胞ではタンパク質発現が18.7倍誘導された。興味深いことに、最も成績の良かった3
種類のgRNAおよび発現を3倍以上誘導することができる9種類のgRNAのうち6種
類が、−500領域(転写開始部位の約500bp上流)を標的とする。
4活性化因子融合物を動員するものであるため、単一細胞内で複数のガイドRNAを発現
させることによって、内在遺伝子標的を多重に、または組み合わせて活性化することが可
能であると考えることができる。この可能性を検証するため、dCas9−VP64発現
プラスミドを、それぞれがVEGFAプロモーターから発現を誘導する4種類のgRNA
(V1、V2、V3およびV4)の発現プラスミドとともに293細胞にトランスフェク
トした。全4種類のgRNAとdCas9−VP64の同時発現によりVEGFAタンパ
ク質発現の相乗的活性化(すなわち、予想される個々の活性化因子の相加効果を上回る活
性化倍数)が誘導された(図2B)。さらに、この4種類の活性化因子のうち3種類を様
々に組み合わせた場合にも、VEGFAプロモーターが相乗的に活性化された(図2B)
。転写の相乗的活性化は複数の活性化因子ドメインが単一のプロモーターに動員されるこ
とに起因すると考えられるため、以上の実験では複数のgRNA/dCas9−VP64
複合体が同時にVEGFAプロモーターと結合していると可能性が高い。
ベータータンパク質(VP64転写活性化ドメインを保有する)と、ヒトVEGF−Aプ
ロモーターの部位に対して20ntの配列相補性を有するsgRNAとを同時発現させる
ことによって、VEGF−A発現の上方制御を生じさせることが可能であることを示して
いる。ELISAアッセイによりVEGF−Aタンパク質の増加を測定し、個々のgRN
AがCas9活性化因子融合タンパク質とともに機能して、VEGF−Aタンパク質レベ
ルを最大で約18倍増大させ得ることがわかった(図2A)。さらに、同じプロモーター
の様々な部位を標的とする複数のgRNAをCas9活性化因子融合タンパク質とともに
導入することによって、転写相乗作用を介して活性化増大をさらに大きくすることができ
た(図2B)。
設計
今回の観察結果の一般性を拡大するため、本発明者らは、RNA誘導型活性化因子プラ
ットフォームを用いてヒトNTF3遺伝子の発現を誘導することが可能であるかどうかを
検証した。この検証を実施するため、ヒトNTF3プロモーターの予測DNアーゼI高感
受性部位(HSS)に対して6種類のsgRNAを設計し、これらのgRNAをそれぞれ
発現するプラスミドと、dCas9−VP64タンパク質をコードし、ヒト細胞での発現
にコドン最適化されたプラスミドとを共トランスフェクトした(図3A)。
レベルの有意な増大を誘導した(図3B)。この6種類のRNA誘導型活性化因子の活性
化倍数の数値を正確に計算することはできなかったが(転写の基底レベルが実質的に検出
不可能であったため)、活性化されたNTF3 mRNA発現の平均レベルは4倍の範囲
で変化した。トランスフェクトするgRNA発現プラスミドおよびdCas9−VP64
発現プラスミドの量を減らすとNTF3遺伝子の活性化が低くなり(図3B)、これは明
確な用量依存性の効果を示している。
発現プラスミドを単独で、ならびに単一および二重の組合せで共トランスフェクトした。
NTF3 mRNAの相対発現量を定量的RT−PCRにより検出し、GAPDH対照に
正規化した(デルタCt×104)。上記実験ではいずれも、トランスフェクションに使
用した個々のgRNA発現プラスミドの量を同じにした。図3Bは、この多重gRNA発
現がdCas9−VP64タンパク質によるNTF3 mRNA発現の相乗的活性化を誘
導したことを示している。
RISPR/Cas−ラムダN融合物系の設計―生物学的テザーの作製
不活性化されたdCas9のN末端またはC末端にMS2コートタンパク質、Csy4
ヌクレアーゼ(好ましくは触媒的に不活性なCsy4、例えば、Haurwitzら,3
29(5997):1355−8(2010)に記載されているH29A変異体)または
ラムダNが融合した融合タンパク質を作製する。MS2およびラムダNは特定のRNA配
列と結合するバクテリオファージタンパク質であり、したがって、その特定のMS2また
はラムダN RNA結合配列でタグ化した異種RNA配列をdCas9タンパク質に係留
するアダプターとして用いることができる。dCas9−MS2融合物またはdCas9
−ラムダN融合物と、MS2またはラムダNステムループ認識配列と5’末端または3’
末端で融合した長いキメラ非コードRNA(lncRNA)とを同時発現させる。キメラ
XistまたはキメラRepA lncRNAはがdCas9融合物によって特異的に動
員され、標的遺伝子発現を測定することによって、この戦略が標的化サイレンシングを誘
導する能力を評価する。コートタンパク質およびキメラRNAに対する様々な変化を試験
することによってこの系を最適化する。MS2コートタンパク質に対するN55Kおよび
デルタFG変異がタンパク質凝集を防ぎ、ステムループRNAに対する親和性を増大させ
ることが以前に示されている。さらに、本発明者らは、MS2コートタンパク質に対する
親和性を増大させることが報告されている高親和性CループRNA変異体を検証する。M
S2およびラムダNタンパク質の例示的な配列を以下に記載するが、MS2は二量体とし
て機能するため、MS2タンパク質は融合した一本鎖二量体配列を含み得る。
N末端またはC末端に融合した融合物の例示的な配列。
MS2コートタンパク質のアミノ酸配列:
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRS
QAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPV
AAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIP
SAIAANSGIY(配列番号88)
MS2 N55K:
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRS
QAYKVTCSVRQSSAQKRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPV
AAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIP
SAIAANSGIY(配列番号89)
MS2デルタFG:
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGIAEWISSNSRS
QAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTI
PIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY(配列
番号90)
のN末端またはC末端に融合した融合物の例示的な配列。
二量体MS2コートタンパク質:
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRS
QAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPV
AAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIP
SAIAANSGLYGAMASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFAN
GVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKV
ATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKA
MQGLLKDGNPIPSAIAANSLIN(配列番号91)
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRS
QAYKVTCSVRQSSAQKRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPV
AAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIP
SAIAANSGLYGAMASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFAN
GVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQKRKYTIKVEVPKV
ATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKA
MQGLLKDGNPIPSAIAANSLIN(配列番号92)
二量体MS2デルタFG:
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRS
QAYKVTCSVRQSSAQKRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTI
PIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGLYGAM
ASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQ
AYKVTCSVRQSSAQKRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTIP
IFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSLIN(配列番
号93)
ラムダNのアミノ酸配列:
MDAQTRRRERRAEKQAQWKAAN(配列番号94)または
MDAQTRRRERRAEKQAQWKAANPLLVGVSAKPVNRPILSL
NRKPKSRVESALNPIDLTVLAEYHKQIESNLQRIERKNQR
TWYSKPGERGITCSGRQKIKGKSIPLI(配列番号95)
Haurwitzら,329(5997):1355−8(2010)にCys4の例
示的な配列が、例えば不活性型のものが記載されている。
融合した調節RNA、例えば、HOTAIR、HOTTIP、XISTまたはXIST
RepAなどの長い非コードRNA(lncRNA)も発現する細胞内で構築物を発現さ
せる。MS2の野生型配列および高親和性配列はそれぞれ、AAACAUGAGGAUU
ACCCAUGUCG(配列番号96)およびAAACAUGAGGAUCACCCAU
GUCG(配列番号97)である(Keryer−Bibensら,上記,図2を参照さ
れたい);ラムダNが結合するnutL配列およびnutR BoxB配列はそれぞれ、
GCCCUGAAGAAGGGC(配列番号98)およびGCCCUGAAAAAGGG
C(配列番号99)である。Csy4が結合する配列は、GTTCACTGCCGTAT
AGGCAG(短縮された20nt)(配列番号100)またはGUUCACUGCCG
UAUAGGCAGCUAAGAAA(配列番号101)である。
標的部位と結合すると、そのlncRNAがdCas9結合部位に動員され、lncRN
Aがリプレッサー、例えばXISTであればdCas9結合部位付近の遺伝子が抑制され
る。同様に、ラムダN結合配列でタグ化されたlncRNAを発現する細胞内でdCas
9/ラムダNが標的部位と結合すると、そのlncRNAがdCas9結合部位に動員さ
れる。
本明細書に記載されるdCas9融合タンパク質は、サイレンシングドメイン、例えば
、ヘテロクロマチンタンパク質1(HP1、swi6としても知られる)、例えばHP1
αまたはHP1βを標的とするのに用いることもできる。クロモドメインが除去された短
縮型のHP1αまたはHP1βを特定の遺伝子座に対して標的として、ヘテロクロマチン
形成および遺伝子サイレンシングを誘導することができる。dCas9と融合した短縮H
P1の例示的な配列を図8A〜8Bに示す。HP1配列を上記のように不活性化されたd
Cas9のN末端またはC末端に融合することができる。
本明細書に記載されるdCas9融合タンパク質は、DNAのメチル化状態を修飾する
酵素(例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)またはTETタンパク質)
を標的とするのに用いることもできる。短縮型のTET1を特定の遺伝子座に対して標的
として、DNA脱メチル化を触媒することができる。dCas9と融合した短縮TET1
の例示的な配列を図9に示す。TET1配列を上記のように不活性化されたdCas9の
N末端またはC末端に融合することができる。
VP64活性化ドメインを保有するdCas9ベースの転写活性化因子の活性を、これ
らの融合物内の核局在化シグナル(1つまたは複数)(NLS)および3×FLAGタグ
の数および位置を変化させることによって、最適化した(図10)。N末端NLSおよび
dCas9配列とVP64配列の間にあるNLSの両方を含むdCas9−VP64融合
物では一貫してより高いレベルの標的遺伝子活性化が誘導されたが、これは活性化因子の
核局在化の増強によるものである可能性が考えられる(図10)。さらに、3×FLAG
タグをdCas9のC末端とVP64のN末端の間に配置したところ、さらに高いレベル
の活性化が観察された。3×FLAGタグは人工リンカーとしての役割を果たし、dCa
s9とVP64の間に必要な間隔が生じさせ、おそらくVP64ドメインの折り畳み(d
Cas9付近に拘束されていると不可能であると考えられる)を向上させるか、RNAポ
リメラーゼIIを動員する転写メディエーター複合体によるVP64の認識を向上させる
と考えられる。あるいは、負に帯電した3×FLAGタグが偶発的な転写活性化ドメイン
として機能し、VP64ドメインの効果を増強する可能性もある。
dCas9ドメインのCas9のヌクレアーゼ活性を失活させる不活性化変異の性質を
変化させることによって、dCas9−VP64活性化因子の活性をさらに最適化した(
図11A〜11B)。これまでに公開された研究では、触媒残基D10およびH840を
アラニンに変異させて(D10AおよびH840A)、DNAの加水分解を媒介する活性
部位のネットワークを破壊している。これらの位置におけるアラニン置換によってdCa
s9が不安定化するため、活性が最適に至らないとする仮説を立てた。そこで、D10ま
たはH840におけるより構造的に保存された置換(例えば、アスパラギンまたはチロシ
ン残基への置換:D10N、H840NおよびH840Y)であれば、これらの異なる変
異を有するdCas9−VP64融合物による遺伝子活性化が増大するかどうかを確認す
るため、このような置換を検証した。上記変異型置換を有するdCas9−VP64変異
体を内在ヒトVEGFA遺伝子の上流領域を標的とする3種類のgRNAとともにHEK
293細胞に共トランスフェクトしたところ、上記変異体のうち1つを除く全変異体でV
EGFAタンパク質発現の増大が観察された(図11A)。しかし、dCas9−VP6
4変異体を上記gRNAのうちの1種類のみと共トランスフェクトした場合(図11A)
または単一のVEGFA標的化gRNAを発現するHEK293由来細胞系に共トランス
フェクトした場合(図11B)、この効果はそれほど著しいものではなかった。
ここまで本発明をその詳細な説明と関連させて記載してきたが、上記説明は例示説明を目的とするものであり、添付の「特許請求の範囲」の範囲によって定められる本発明の範囲を限定するものではないことを理解するべきである。その他の態様、利点および改変は以下の特許請求の範囲内にある。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
[1]
異種機能ドメインと連結した触媒的に不活性なCRISPR関連9(dCas9)タンパク質を含む、融合タンパク質。
[2]
前記異種機能ドメインが転写活性化ドメインである、上記[1]に記載の融合タンパク質。
[3]
前記転写活性化ドメインが、VP64またはNF−κB p65由来のものである、上記[2]に記載の融合タンパク質。
[4]
前記異種機能ドメインが、転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、上記[1]に記載の融合タンパク質。
[5]
前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス(KRAB)ドメイン、ERFリプレッサードメイン(ERD)またはmSin3A相互作用ドメイン(SID)である、上記[4]に記載の融合タンパク質。
[6]
前記転写サイレンサーが、ヘテロクロマチンタンパク質1(HP1)、例えばHP1αまたはHP1βである、上記[4]に記載の融合タンパク質。
[7]
前記異種機能ドメインが、DNAのメチル化状態を修飾する酵素である、上記[1]に記載の融合タンパク質。
[8]
前記DNAのメチル化状態を修飾する酵素が、DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)またはTETタンパク質である、上記[7]に記載の融合タンパク質。
[9]
前記TETタンパク質がTET1である、上記[8]に記載の融合タンパク質。
[10]
前記異種機能ドメインが、ヒストンサブユニットを修飾する酵素である、上記[1]に記載の融合タンパク質。
[11]
前記ヒストンサブユニットを修飾する酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、ヒストンメチルトランスフェラーゼ(HMT)またはヒストンデメチラーゼである、上記[1]に記載の融合タンパク質。
[12]
前記異種機能ドメインが生物学的テザーである、上記[1]に記載の融合タンパク質。
[13]
前記生物学的テザーが、MS2、Csy4またはラムダNタンパク質である、上記[12]に記載の融合タンパク質。
[14]
前記触媒的に不活性なCas9タンパク質が、化膿性連鎖球菌(S.pyogenes)由来のものである、上記[1]に記載の融合タンパク質。
[15]
前記触媒的に不活性なCas9タンパク質が、D10、E762、H983またはD986;およびH840またはN863に変異を含む、上記[1]に記載の融合タンパク質。
[16]
前記変異が、
(i)D10AまたはD10Nおよび
(ii)H840A、H840NまたはH840Y
である、上記[15]に記載の融合タンパク質。
[17]
前記異種機能ドメインが、任意選択の介在リンカーを伴って前記触媒的に不活性なCas9タンパク質のN末端またはC末端と連結し、前記リンカーが、前記融合タンパク質の活性に干渉しない、上記[1]に記載の融合タンパク質。
[18]
任意選択で1つまたは複数の介在リンカーを伴って、N末端上、C末端上および/または前記触媒的に不活性なCRISPR関連9(Cas9)タンパク質と前記異種機能ドメインとの間に核局在化配列および1つもしくは複数のエピトープタグの一方または両方をさらに含む、上記[1]に記載の融合タンパク質。
[19]
前記エピトープタグが、c−myc、6HisまたはFLAGである、上記[18]に記載の融合タンパク質。
[20]
上記[1]〜[19]のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
[21]
上記[20]に記載の核酸を含む、発現ベクター。
[22]
細胞の標的遺伝子の発現を増大させる方法であって、前記細胞内で上記[2]〜[3]に記載の融合タンパク質と、前記標的遺伝子に対する1つまたは複数のガイドRNAとを発現させることを含む、方法。
[23]
細胞の標的遺伝子を減少させる方法であって、前記細胞内で上記[4]〜[6]に記載の融合タンパク質と、前記標的遺伝子に対する1つまたは複数のガイドRNAとを発現させることを含む、方法。
[24]
細胞の標的遺伝子またはそのプロモーターもしくはエンハンサー(1つまたは複数)のDNAメチル化を減少させる方法であって、前記細胞内で上記[7]〜[9]に記載の融合タンパク質と、関連する標的遺伝子配列に対する1つまたは複数のガイドRNAとを発現させることを含む、方法。
[25]
細胞の標的遺伝子またはそのプロモーターもしくはエンハンサー(1つまたは複数)と結合しているヒストンを修飾する方法であって、前記細胞内で上記[10]〜[11]に記載の融合タンパク質と、関連する標的遺伝子配列に対する1つまたは複数のガイドRNAとを発現させることを含む、方法。
Claims (12)
- 哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を増大させる方法であって、前記方法は、
in vitroまたはex vivoで前記哺乳動物細胞を、
異種機能ドメインと連結した触媒的に不活性なS.pyogenes CRISPR関連9(Cas9)タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクター、および
前記標的遺伝子のプロモーターに対する1つまたは複数のガイドRNAをコードする核酸配列と作動可能に連結されたプロモーターを含む1つまたは複数の発現ベクター
と接触させる工程を含み、
前記触媒的に不活性なCas9タンパク質は、D10およびH840に変異を含み、前記異種機能ドメインは、転写活性化ドメインであり、
前記接触哺乳動物細胞は、Cas9融合タンパク質および1つまたは複数のガイドRNAを発現して、該発現したCas9融合タンパク質が、該発現した1つまたは複数のガイドRNAによって標的遺伝子のプロモーターに動員(リクルート)され、かつ、
前記転写活性化ドメインが、発現の増大を媒介する、方法。 - in vitroまたはex vivoで哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を増大させる方法であって、前記方法は、
前記哺乳動物細胞において、異種機能ドメインと連結した触媒的に不活性なS.pyogenes Cas9タンパク質を含む融合タンパク質を発現する工程、および、前記標的遺伝子に対する1つまたは複数のガイドRNAを発現する工程
を含み、
前記触媒的に不活性なCas9タンパク質は、D10およびH840に変異を含み、前記異種機能ドメインは、転写活性化ドメインであり、
前記発現したCas9融合タンパク質は、前記1つまたは複数のガイドRNAによって標的遺伝子に動員(リクルート)され、かつ、
前記転写活性化ドメインが、発現の増大を媒介する、方法。 - 前記転写活性化ドメインが、DNAのメチル化状態を修飾する酵素である、請求項2に記載の方法。
- 前記転写活性化ドメインが、ヒストンを修飾する酵素である、請求項2に記載の方法。
- 前記転写活性化ドメインが、VP64およびNF−κB p65からなる群から選択される転写活性化ドメインである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記触媒的に不活性なCas9タンパク質の変異が、(i)D10Aおよび(ii)H840Aである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異種機能ドメインが、任意選択の介在リンカーを伴って前記触媒的に不活性なCas9タンパク質のN末端またはC末端と連結し、前記リンカーが、前記融合タンパク質の活性に干渉しない、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が、N末端上、C末端上または前記触媒的に不活性なCas9タンパク質と前記異種機能ドメインとの間に核局在化配列および1つもしくは複数のエピトープタグの一方または両方をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が、1つまたは複数の介在リンカーを伴って、N末端上、C末端上または前記触媒的に不活性なCas9タンパク質と前記異種機能ドメインとの間に核局在化配列および1つもしくは複数のエピトープタグの一方または両方をさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のエピトープタグが、c−mycタグ、6HisタグおよびFLAGタグからなる群から選択される、請求項8または9に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞において融合タンパク質を発現する工程が、前記融合タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターと前記哺乳動物細胞を接触させる工程を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞において標的遺伝子に対する1つまたは複数のガイドRNAを発現する工程が、前記標的遺伝子に対する1つまたは複数のガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む1つまたは複数の発現ベクターと前記哺乳動物細胞を接触させる工程を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
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