JP2018529353A

JP2018529353A - 配列決定法による切断事象の包括的生体外報告（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ）

Info

Publication number: JP2018529353A
Application number: JP2018516489A
Authority: JP
Inventors: ジョン，ジェイ．キース; サイ，シェンダー
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2018-10-11
Also published as: US20170088833A1; WO2017059313A1; US9850484B2; CA3000762A1; EP3356526A4; AU2016331185A1; KR20180053748A; US20180245071A1; EP3356526A1; EP3356526B1; US10738303B2

Abstract

細胞型特異的ゲノムＤＮＡサンプルからの潜在的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９オフターゲット切断部位のゲノムワイド検出のための高感度で偏りのない方法。

Description

優先権の主張
本出願は、２０１５年９月３０日に出願された米国特許出願第６２／２３５，１５４号明細書の優先権を主張する。上記の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

連邦支援の研究開発
本発明は、国立衛生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）によって交付された助成金番号ＤＰ１ＧＭ１０５３７８の下で、政府支援によってなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。

本明細書に記載されるのは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどの遺伝子操作されたヌクレアーゼのゲノムワイド切断特異性を定義するためのインビトロ法である。

ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼをはじめとする遺伝子操作されたヌクレアーゼ技術は、生物医学研究に革新をもたらし、遺伝子ベースの疾患の治療に重要な新たな様式を提供する。これらの方法をヒトの治療学に翻訳するには、オフターゲット効果を高感度に検出することが重要である。オフターゲットを発見するための生体外生化学法は、生きている細胞の培養および操作を必要とするストラテジーに関連する制限を回避しながら、より大きな再現性および拡張性がある潜在的利点を提供する。

本発明は、細胞型特異的ゲノムＤＮＡサンプルからの潜在的な遺伝子操作されたヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）オフターゲット切断部位のゲノムワイド検出のための高感度で偏りのない方法の開発に、少なくとも部分的に基づいている。本発明の方法は、共有結合的に閉じたＤＮＡ分子のエキソヌクレアーゼ選択を用いて、切断特異的濃縮および配列決定のための出発集団として、非常に少ない遊離ＤＮＡ末端を有するゲノムＤＮＡ分子の集団を生成する。ヒトゲノムＤＮＡからのこれらの切断された断片の５００，０００倍を超えると推定される濃縮は、全ゲノム配列決定法に依存してはるかに高いバックグラウンドを有する、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−Ｓｅｑ（Ｋｉｍｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ．２０１５Ｍａｒ；１２（３）：２３７−４３）などの方法とは対照的に、生体外で切断されたＤＮＡ断片の非常に配列決定効率の高い発見を可能にする。最適化後に、本生体外アッセイは、ヒトＵ２ＯＳ細胞内で実施されて、Ｔｓａｉｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５Ｆｅｂ；３３（２）：１８７−９７に記載されている、ＶＥＧＦＡ部位１およびＥＭＸ１標的部位における、細胞内ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑアッセイによって検出されたオフターゲット切断部位の１００％、ならびにＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験では発見されなかった追加的な新規オフターゲット部位を検出した（換言すれば、本生体外アッセイは、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑで検出された切断部位の上位集合を検出する）。

本明細書に記載されるのは、ステムループまたはヘアピンアダプターのライゲーション、エキソヌクレアーゼ選択、ステムループの酵素的開口および末端修復、および分子内ライゲーションによって、最小数のＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を有する、共有結合的に閉じた完全環状化ＤＮＡ断片ライブラリーを酵素的に作成する方法である。これらの環は、次に配列決定法によって操作され、この酵素的に精製された共有結合的に閉じた完全環状化ＤＮＡ断片のライブラリーのヌクレアーゼ誘導切断が検出され得る。総合して、これらの２つの方法は、ＤＮＡの複合混合物中のヌクレアーゼ誘導切断部位を効率的に採掘するためのストラテジーを構成する。したがって、この方法は、末端のないＤＮＡ分子の集団を作成するステップと、その集団をヌクレアーゼで処理するステップと、この集団において、ヌクレアーゼ誘導切断の結果として新たに生成された末端を有するＤＮＡ分子を発見するステップとを含み得る。

したがって、本明細書で提供されるのは、共有結合的に閉じた環状化二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリーを作成する方法である。方法は、例えば、目的の細胞型または生物に由来するゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）または合成ＤＮＡなどのｄｓＤＮＡを提供するステップと；ＤＮＡを例えば約２００〜５００ｂｐ、例えば約３００ｂｐの平均長さなどの規定の平均長さに無作為に剪断して、ＤＮＡ断片の集団を提供するステップと；任意選択的に、例えば剪断されたＤＮＡの末端修復および／またはＡテーリングによって、末端ライゲーションのために断片を調製するステップと；回文配列を含んでなるループ配列に隣接するまたはその中にある、少なくとも１つのデオキシウリジンを含んでなる、ステムループアダプターを断片の末端にライゲートして、ライゲートされた直鎖ｄｓＤＮＡ断片の集団を作成するステップと；ライブラリーを（例えば、λエキソヌクレアーゼおよび／または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩの混合物などの）エキソヌクレアーゼに接触させて、末端がライゲートされていないあらゆる残留直鎖断片を分解し、ライゲートされた直鎖ｄｓＤＮＡ断片の精製集団を生成するステップと；ライブラリーを、例えば、デオキシウリジンにおいてＤＮＡにニックを生じさせるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼであるエンドヌクレアーゼＶＩＩＩや、３’末端リン酸を除去するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの、デオキシウリジンにおいてライゲートされたｄｓＤＮＡ断片にニックを生じて、３’末端リン酸を除去する酵素に接触させるステップと；分子内ライゲーションおよび環状ＤＮＡ分子形成を促進するのに十分な条件下で、ニックの入った直鎖ｄｓＤＮＡ断片をインキュベートするステップと；エキソヌクレアーゼを使用してライゲート断片を精製し、それによって共有結合的に閉じた完全環状化二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリーを作成するステップとを含み得る。

いくつかの実施形態では、方法は、共有結合的に閉じた完全環状化ｄｓＤＮＡ断片のライブラリーをヌクレアーゼ（例えば、本明細書に記載されるような遺伝子操作されたヌクレアーゼ）に接触させて、部位特異的切断を誘導するステップと；任意選択的に、例えば、剪断されたＤＮＡの末端修復および／またはＡテーリングによって、末端ライゲーションのための切断断片を作成するステップと；切断部位において、少なくとも１つの（好ましくは唯一の）デオキシウリジンを含んでなる配列決定アダプターを、ＰＣＲプライミングおよび／または配列決定法における使用に適合するプライマー部位にライゲートするステップと；ライブラリーを例えば、デオキシウリジンにおいてニックを生じる、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼであるエンドヌクレアーゼＶＩＩＩなどの酵素に接触させるステップと；配列決定アダプターを使用して、これらの断片を配列決定するステップとを含む。

本明細書でまた提供されるのは、例えば、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）などのｄｓＤＮＡ中に、ヌクレアーゼ誘導二本鎖切断を含んでなる断片のライブラリーを作成する方法である。方法は、例えば、目的の細胞型または生物に由来するｇＤＮＡなどのｄｓＤＮＡを提供するステップと；例えば約２００〜５００ｂｐ、例えば約３００ｂｐの平均長さの規定の平均長さに、ｄｓＤＮＡを無作為に剪断するステップと；任意選択的に、剪断されたＤＮＡを末端修復および／またはＡテーリングするステップと；好ましくは、例えば約１０〜１５、例えば約１２ヌクレオチドなどの第１の領域と、１つまたは複数のループを形成して分子内ライゲーションのための回文配列に隣接する、１つのデオキシウリジンヌクレオチドを含んでなる、好ましくは約５ヌクレオチドの第２の領域と、１つの追加的なヌクレオチドがある第１の領域に相補的な例えば約１３ヌクレオチドなどの第３の領域とを含んでなる、第１のステムループアダプターをライゲートするステップと；ライブラリーをウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼであるエンドヌクレアーゼＶＩＩＩに接触させ、デオキシウリジンおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにおいてｄｓＤＮＡにニックを生じさせ、分子的にライゲーションと不適合である末端３’リン酸を除去するステップと；分子内ライゲーションおよび環状化ｄｓＤＮＡ分子を含んでなるサンプル形成を促進するのに十分な条件下で、ニックの入ったｄｓＤＮＡをインキュベートするステップと；サンプルを環状でないあらゆるｄｓＤＮＡ分子を分解するのに十分な、１つまたは複数のエキソヌクレアーゼ（例えば、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｘｏＩ、ＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ（商標）ＡＴＰ依存性エキソヌクレアーゼ）に接触させるステップと；サンプルをヌクレアーゼで処理し、部位（例えば、オンおよび／またはオフターゲット部位）特異的切断を誘導し（例えば、平滑型またはねじれ型／オーバーハング末端を誘導し）、任意選択的に、得られた末端を末端修復し、次にＡテーリングするステップと；約１２ヌクレオチドの第１の領域と、例えば１つまたは複数のヘアピンループなどのループを形成してＰＣＲプライミングおよび／または例えば次世代配列決定法（ＮＧＳ）などの配列決定法における使用に適合する第２のプライマーを含んでなる、約４０ヌクレオチドの第２の領域と、第１の領域に相補的な約１３ヌクレオチドの第３の領域（例えば第１の領域より長いもの）と、第２および第３の領域の間の１つのデオキシウリジンヌクレオチドとを含んでなる配列決定アダプターをライゲートし、ヌクレアーゼによって切断されたＤＮＡ断片が、末端にライゲートされた配列決定アダプターを有する、集団を生成するステップと；それによって例えば、各末端がｄｓＤＮＡ中のヌクレアーゼ誘導二本鎖切断によって生じ、次にアダプターにライゲートされるなど、ヌクレアーゼ切断アダプターにライゲートされた断片が濃縮された、断片のライブラリーを作成するステップとを含み得る。

いくつかの実施形態では、方法は、ライブラリーをウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼであるエンドヌクレアーゼＶＩＩＩに接触させ、デオキシウリジンにおいてＤＮＡにニックを生じさせるステップと；配列決定アダプターを保有する断片を配列決定するステップとを含む。

いくつかの実施形態では、末端がライゲートされていないあらゆる残留直鎖断片を分解するのに使用されるエキソヌクレアーゼは、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩ、およびＡＴＰ依存性エキソヌクレアーゼの１つまたは複数を含んでなるヌクレアーゼの混合物である。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ＭｅｇａＴＡＬ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーターエフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣａｓＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＧＮ）、およびＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合タンパク質からなる群から選択される。

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、例えば、オンおよびオフターゲット部位などの部位特異的切断を誘導する、ヌクレアーゼによるサンプルの処理は、サンプルを特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体形成するＣａｓ９ヌクレアーゼに接触させるステップを含んでなる。

いくつかの実施形態では、ヘアピン中のプライマー部位は、次世代配列決定プライマー部位、無作為化ＤＮＡバーコードまたは固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含んでなる。

いくつかの実施形態では、方法は、ライブラリーをウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼであるエンドヌクレアーゼＶＩＩＩに接触させ、デオキシウリジンにおいてＤＮＡにニックを生じさせるステップと；第１のおよび第２のヘアピンアダプターを保有する断片を配列決定するステップとを含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ＭｅｇａＴＡＬ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーターエフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣａｓＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＧＮ）、およびＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合物（ＲＮＡ誘導性ＦｏｋＩヌクレアーゼ）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、例えば、オンおよびオフターゲット部位などの部位特異的切断を誘導する、ヌクレアーゼによるサンプルの処理は、サンプルを特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体形成するＣａｓ９ヌクレアーゼに接触させるステップを含んでなる。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、哺乳類、植物、細菌、または真菌細胞（例えばｇＤＮＡ）から単離される。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡは合成される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合体またはＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼ、例えば、その野生型または変異体である。

遺伝子操作されたヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼであるいくつかの実施形態では、方法は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをゲノム中の標的配列に誘導するガイドＲＮＡを使用するステップもまた含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼであり、方法は、細胞内で、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをゲノム中の標的配列に誘導するガイドＲＮＡを発現させるステップもまた含む。

本方法は、遺伝子操作されたヌクレアーゼのオフターゲット部位を発見するための以前記載したアプローチに優る、いくつかの利点を有する。例えば、本方法は、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）の導入、ならびにヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする成分の発現または細胞への導入が必要である、細胞ベースの方法（ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（国際公開第２０１５／２００３７８号パンフレットおよびＴｓａｉｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３３：１８７−１９７（２０１５）などを参照されたい）とは対照的に、インビトロ法である。全ての細胞がｄｓＯＤＮおよび／またはヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする成分を導入させるとは限らず、場合によってはこれらの試薬は有毒であり得る。特に興味のある細胞型が、ｄｓＯＤＮ、ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼをコードする構成要素の導入を受け入れにくい場合、代理細胞型が使用され得るが、細胞特異的効果は検出されないことがある。本方法は、細胞内へのｄｓＯＤＮ、ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼをコードする成分の送達を必要とせず、クロマチン状態の影響を受けず、毒性の問題を引き起こさず、細胞株の成長および増殖を必要とせず、目的の細胞型から得られたゲノムＤＮＡを切断することによって、特定の細胞ゲノムの調査ができるようにする。さらに、エキソヌクレアーゼは二本鎖直鎖ＤＮＡに対して活性を有するが、環状ＤＮＡに対しては本質的に活性を有しないので、バックグラウンドは非常に低く、非常に高い信号対雑音比が提供される。

特に断りのない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明における使用のために、方法および材料が本明細書に記載され；当該技術分野で公知のその他の適切な方法および材料もまた使用され得る。材料、方法、および実施例は例証のみを意図し、限定的であることは意図されない。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース項目、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照により援用する。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先される。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、そして特許請求の範囲から明らかになるであろう。

図１Ａ−Ｄオフターゲット切断のゲノムワイド検出のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ生体外Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑおよびＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ法の概要である。（Ａ）消化ゲノム配列決定（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ）法の図式的概観である。ゲノムＤＮＡは、生体外でＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて切断され、精製されて剪断され、次に全ゲノム配列決定のためにアダプターにライゲートされる。均一な開始マッピング位置が濃縮されている候補オフターゲット部位は、格付けアルゴリズムによって同定される。（Ｂ）配列決定法による切断効果の生体外報告（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｉｎｖｉｔｒｏｒｅｐｏｒｔｉｎｇｏｆｃｌｅａｖａｇｅｅｆｆｅｃｔｓｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ）のための環状化の図式的概観である。ゲノムＤＮＡは剪断されて環状化され、望まれない直鎖ＤＮＡ分子は、エキソヌクレアーゼ処理によって分解される。Ｃａｓ９切断部位（網掛け）を含有する環状ＤＮＡ分子は、Ｃａｓ９によって直線化され、アダプターライゲーション、ＰＣＲ増幅、および対末端ハイスループット配列決定のために、それらのＤＮＡ末端が遊離され得る。Ｃａｓ９切断によって生成される各読み取り対が、単一のオフターゲット部位に関する完全な配列情報をどのように含むかに留意されたい。（Ｃ）例示的なＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ法の図式的概観である。ゲノムＤＮＡは、平均で約３００ｂｐに無作為に剪断され、末端修復され、Ａテール付加され、ウラシル含有ステムループアダプターにライゲートされる。λエキソヌクレアーゼと大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼとの混合物による処理のために、ステムループアダプターが両端にライゲートされた、共有結合的に閉じたＤＮＡ分子が選択される。４ｂｐオーバーハングは、ＵＳＥＲ酵素とＴ４ＰＮＫとの混合物によって遊離され、ＤＮＡ分子は、分子内ライゲーションに有利な低濃度で環状化される。望まれない直鎖ＤＮＡは、Ｐｌａｓｍｉｄ−ＳａｆｅＡＴＰ依存性ＤＮａｓｅによって分解される。環状ＤＮＡはＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体で処理されて切断され、直線化ＤＮＡは配列決定アダプターにライゲートされ、ハイスループット配列決定法のために増幅される。（Ｄ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数は、独立したＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ実験間で非常に高い再現性があった。同一起源のゲノムＤＮＡ（ヒトＵ２ＯＳ細胞）から作成された、２つの独立したＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑライブラリー間のＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数の散布図である。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数は、強く相関した。図１Ａ−Ｄオフターゲット切断のゲノムワイド検出のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ生体外Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑおよびＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ法の概要である。（Ｂ）配列決定法による切断効果の生体外報告（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｉｎｖｉｔｒｏｒｅｐｏｒｔｉｎｇｏｆｃｌｅａｖａｇｅｅｆｆｅｃｔｓｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ）のための環状化の図式的概観である。ゲノムＤＮＡは剪断されて環状化され、望まれない直鎖ＤＮＡ分子は、エキソヌクレアーゼ処理によって分解される。Ｃａｓ９切断部位（網掛け）を含有する環状ＤＮＡ分子は、Ｃａｓ９によって直線化され、アダプターライゲーション、ＰＣＲ増幅、および対末端ハイスループット配列決定のために、それらのＤＮＡ末端が遊離され得る。Ｃａｓ９切断によって生成される各読み取り対が、単一のオフターゲット部位に関する完全な配列情報をどのように含むかに留意されたい。図１Ａ−Ｄオフターゲット切断のゲノムワイド検出のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ生体外Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑおよびＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ法の概要である。（Ｃ）例示的なＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ法の図式的概観である。ゲノムＤＮＡは、平均で約３００ｂｐに無作為に剪断され、末端修復され、Ａテール付加され、ウラシル含有ステムループアダプターにライゲートされる。λエキソヌクレアーゼと大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼとの混合物による処理のために、ステムループアダプターが両端にライゲートされた、共有結合的に閉じたＤＮＡ分子が選択される。４ｂｐオーバーハングは、ＵＳＥＲ酵素とＴ４ＰＮＫとの混合物によって遊離され、ＤＮＡ分子は、分子内ライゲーションに有利な低濃度で環状化される。望まれない直鎖ＤＮＡは、Ｐｌａｓｍｉｄ−ＳａｆｅＡＴＰ依存性ＤＮａｓｅによって分解される。環状ＤＮＡはＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体で処理されて切断され、直線化ＤＮＡは配列決定アダプターにライゲートされ、ハイスループット配列決定法のために増幅される。図１Ａ−Ｄオフターゲット切断のゲノムワイド検出のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ生体外Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑおよびＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ法の概要である。（Ｄ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数は、独立したＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ実験間で非常に高い再現性があった。同一起源のゲノムＤＮＡ（ヒトＵ２ＯＳ細胞）から作成された、２つの独立したＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑライブラリー間のＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数の散布図である。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数は、強く相関した。図２Ａ−ＤＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑとＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑの比較。（Ａ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって検出された、ＨＢＢ遺伝子を標的とするＣａｓ９のオフターゲット部位およびｇＲＮＡの交差を示すベン図である。（Ｂ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって見いだされたが、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって見いだされなかった、オフターゲット切断位置における、ヌクレアーゼ処理（網掛けバー）および対照（白抜きバー）ＨＡＰ１ゲノムＤＮＡのＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ読み取り数の棒グラフである。（Ｃ）ＨＢＢ遺伝子座を標的化するｇＲＮＡのオンターゲット部位における、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑの配列決定読み取りのマッピングを比較するプロットである。ヌクレアーゼ処理サンプルおよび対照サンプルの双方が示される。薄い灰色の線は、予測切断部位の位置を示し；前方読取りの読取りカバー範囲は黒色、逆読込みは白色に着色される。（Ｄ）（Ｃ）で使用されたＨＢＢｇＲＮＡのオンターゲット部位における、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ開始マッピング位置プロットである。（＋）鎖マッピング読み取りは白色バーで示され、（−）鎖マッピング読み取りは網掛けバーで着色される。図２Ａ−ＤＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑとＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑの比較。（Ｂ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって見いだされたが、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって見いだされなかった、オフターゲット切断位置における、ヌクレアーゼ処理（網掛けバー）および対照（白抜きバー）ＨＡＰ１ゲノムＤＮＡのＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ読み取り数の棒グラフである。図２Ａ−ＤＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑとＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑの比較。（Ｃ）ＨＢＢ遺伝子座を標的化するｇＲＮＡのオンターゲット部位における、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑの配列決定読み取りのマッピングを比較するプロットである。ヌクレアーゼ処理サンプルおよび対照サンプルの双方が示される。薄い灰色の線は、予測切断部位の位置を示し；前方読取りの読取りカバー範囲は黒色、逆読込みは白色に着色される。図２Ａ−ＤＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑとＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑの比較。（Ｄ）（Ｃ）で使用されたＨＢＢｇＲＮＡのオンターゲット部位における、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ開始マッピング位置プロットである。（＋）鎖マッピング読み取りは白色バーで示され、（−）鎖マッピング読み取りは網掛けバーで着色される。図３Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑと細胞ベースＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴＳ法との比較である。（Ａ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ（白色バー）によって排他的に同定された、およびＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（網掛けバー）の双方によって同定された、部位の数を示すヒストグラムである。（Ｂ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット部位のマンハッタンプロットであり、バーの高さはＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数（読み取り数が最も多い部位に対して正規化された）に相当し、染色体の位置によってまとめられる。（Ｃ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑで検出されたゲノムのオフターゲット切断部位の交差を示す、ベン図である。（Ｄ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって排他的に検出された、またはＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴＳの双方によって検出された、部位の数を示すヒストグラムである。（Ｅ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ、およびＨＴＧＴＳの間で検出された、オフターゲット切断部位の組の重なりを示すベン図である。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑは、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴ）の双方によって検出された、実質的に全てのオフターゲット切断部位を検出する。図３Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑと細胞ベースＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴＳ法との比較である。（Ｂ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット部位のマンハッタンプロットであり、バーの高さはＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数（読み取り数が最も多い部位に対して正規化された）に相当し、染色体の位置によってまとめられる。図３Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑと細胞ベースＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴＳ法との比較である。（Ｂ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット部位のマンハッタンプロットであり、バーの高さはＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数（読み取り数が最も多い部位に対して正規化された）に相当し、染色体の位置によってまとめられる。図３Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑと細胞ベースＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴＳ法との比較である。（Ｂ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット部位のマンハッタンプロットであり、バーの高さはＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数（読み取り数が最も多い部位に対して正規化された）に相当し、染色体の位置によってまとめられる。図３Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑと細胞ベースＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴＳ法との比較である。（Ｂ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット部位のマンハッタンプロットであり、バーの高さはＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数（読み取り数が最も多い部位に対して正規化された）に相当し、染色体の位置によってまとめられる。図３Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑと細胞ベースＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴＳ法との比較である。（Ｂ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット部位のマンハッタンプロットであり、バーの高さはＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数（読み取り数が最も多い部位に対して正規化された）に相当し、染色体の位置によってまとめられる。図３Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑと細胞ベースＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴＳ法との比較である。（Ｃ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑで検出されたゲノムのオフターゲット切断部位の交差を示す、ベン図である。図３Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑと細胞ベースＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴＳ法との比較である。（Ｄ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって排他的に検出された、またはＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴＳの双方によって検出された、部位の数を示すヒストグラムである。図３Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑと細胞ベースＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴＳ法との比較である。（Ｅ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ、およびＨＴＧＴＳの間で検出された、オフターゲット切断部位の組の重なりを示すベン図である。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑは、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびＨＴＧＴ）の双方によって検出された、実質的に全てのオフターゲット切断部位を検出する。図４Ａ−ＧＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット切断部位は、ヒト細胞内部でもまた切断され得る。（Ａ）以前にＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって分析された１０個のｇＲＮＡについての、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数の幹葉プロットである。オンターゲットおよびオフターゲット部位が示される。（Ｂ）標的化標識配列決定アプローチの図式的概観である。プライマーは、ヌクレアーゼおよび二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）標識で処理された細胞のゲノムＤＮＡから、ヌクレアーゼ誘導ＤＳＢの側方のゲノム領域を増幅するように設計される。（ｃ−ｄ）ＥＭＸ１およびＶＥＧＦＡ部位１を標的化するｇＲＮＡの、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（パネル上部）の双方によって検出された対照オフターゲット部位、およびＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって検出されたがＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ）によって検出されなかったオフターゲット部位における、標的化標識組み込み頻度。オフターゲット部位は、示される意図された標的配列とのミスマッチを伴うＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数によって、上から下に順序付けられる。対照およびヌクレアーゼ処理細胞について観察された標識組み込み頻度が、対数目盛りでプロットされる。（Ｅ）分析され、標的化標識配列決定法によっても検出された、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ部位の画分を示す円グラフである。（Ｆ）標的化標識配列決定法によって観察された、組込み位置のプロットである。ＰＡＭ塩基は、右から３つ目までのヌクレオチドである。組み込みは、予測されたＤＳＢの位置に近接した位置で起こる（ＰＡＭから３塩基対離れている）。（Ｇ）ＨＥＫ２９３、Ｋ５６２、およびＵ２ＯＳゲノムＤＮＡ中の非反復部位を標的化するｇＲＮＡを用いて実施されたＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ実験で、参照非依存性部位発見アルゴリズムを用いて見いだされ得る、固有の切断部位の百分率である。図４Ａ−ＧＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット切断部位は、ヒト細胞内部でもまた切断され得る。（Ｂ）標的化標識配列決定アプローチの図式的概観である。プライマーは、ヌクレアーゼおよび二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）標識で処理された細胞のゲノムＤＮＡから、ヌクレアーゼ誘導ＤＳＢの側方のゲノム領域を増幅するように設計される。図４Ａ−ＧＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット切断部位は、ヒト細胞内部でもまた切断され得る。（ｃ−ｄ）ＥＭＸ１およびＶＥＧＦＡ部位１を標的化するｇＲＮＡの、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（パネル上部）の双方によって検出された対照オフターゲット部位、およびＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって検出されたがＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ）によって検出されなかったオフターゲット部位における、標的化標識組み込み頻度。オフターゲット部位は、示される意図された標的配列とのミスマッチを伴うＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数によって、上から下に順序付けられる。対照およびヌクレアーゼ処理細胞について観察された標識組み込み頻度が、対数目盛りでプロットされる。図４Ａ−ＧＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット切断部位は、ヒト細胞内部でもまた切断され得る。（ｃ−ｄ）ＥＭＸ１およびＶＥＧＦＡ部位１を標的化するｇＲＮＡの、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（パネル上部）の双方によって検出された対照オフターゲット部位、およびＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって検出されたがＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ）によって検出されなかったオフターゲット部位における、標的化標識組み込み頻度。オフターゲット部位は、示される意図された標的配列とのミスマッチを伴うＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数によって、上から下に順序付けられる。対照およびヌクレアーゼ処理細胞について観察された標識組み込み頻度が、対数目盛りでプロットされる。図４Ａ−ＧＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット切断部位は、ヒト細胞内部でもまた切断され得る。（Ｅ）分析され、標的化標識配列決定法によっても検出された、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ部位の画分を示す円グラフである。図４Ａ−ＧＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット切断部位は、ヒト細胞内部でもまた切断され得る。（Ｆ）標的化標識配列決定法によって観察された、組込み位置のプロットである。ＰＡＭ塩基は、右から３つ目までのヌクレオチドである。組み込みは、予測されたＤＳＢの位置に近接した位置で起こる（ＰＡＭから３塩基対離れている）。図４Ａ−ＧＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑで検出されたオフターゲット切断部位は、ヒト細胞内部でもまた切断され得る。（Ｇ）ＨＥＫ２９３、Ｋ５６２、およびＵ２ＯＳゲノムＤＮＡ中の非反復部位を標的化するｇＲＮＡを用いて実施されたＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ実験で、参照非依存性部位発見アルゴリズムを用いて見いだされ得る、固有の切断部位の百分率である。図５Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑを用いて、オフターゲット部位分析に対する個別化ＳＮＰの影響が評価される。（Ａ）２つの異なる細胞型由来のゲノムＤＮＡに対して実施された実験からの、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数の散布図である。１つの細胞型のみに非参照遺伝的変異を有する部位は黒色であり、双方の細胞型において非参照変異を有する部位は網掛けされる。（Ｂ）非参照遺伝的変異を有するオフターゲット部位における、対立遺伝子特異的ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数の例である。意図された標的配列に対するミスマッチが色付きヌクレオチドで示される一方、マッチする塩基はドットで示される。細胞型間の示差的遺伝的変化を保有する塩基の位置は、小さな矢印で示される。（Ｃ）その中で、アフリカ人（ＡＦＲ）、米国人混合集団（ＡＭＲ）、東アジア人（ＥＡＳ）、欧州人（ＥＵＲ）、東南アジア人（ＳＡＳ）超母集団、および合わせた集団平均の１０００人ゲノムプロジェクトからの遺伝子型が同定された個人において、非参照遺伝的変異が同定された、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑオフターゲット部位の比率である。（Ｄ）参照ヒトゲノム配列（縞模様バー）中の、および１０００人ゲノムプロジェクトデータからのオフターゲット部位ハプロタイプ（白色バー）中のミスマッチ数によって、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑオフターゲット部位の分布を示すヒストグラムである。（Ｅ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって同定されたオフターゲット部位におけるミスマッチの数が増加している、減少している、または同数である、１０００人ゲノムプロジェクトからのハプロタイプの比率である。図５Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑを用いて、オフターゲット部位分析に対する個別化ＳＮＰの影響が評価される。（Ｂ）非参照遺伝的変異を有するオフターゲット部位における、対立遺伝子特異的ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数の例である。意図された標的配列に対するミスマッチが色付きヌクレオチドで示される一方、マッチする塩基はドットで示される。細胞型間の示差的遺伝的変化を保有する塩基の位置は、小さな矢印で示される。図５Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑを用いて、オフターゲット部位分析に対する個別化ＳＮＰの影響が評価される。（Ｃ）その中で、アフリカ人（ＡＦＲ）、米国人混合集団（ＡＭＲ）、東アジア人（ＥＡＳ）、欧州人（ＥＵＲ）、東南アジア人（ＳＡＳ）超母集団、および合わせた集団平均の１０００人ゲノムプロジェクトからの遺伝子型が同定された個人において、非参照遺伝的変異が同定された、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑオフターゲット部位の比率である。図５Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑを用いて、オフターゲット部位分析に対する個別化ＳＮＰの影響が評価される。（Ｄ）参照ヒトゲノム配列（縞模様バー）中の、および１０００人ゲノムプロジェクトデータからのオフターゲット部位ハプロタイプ（白色バー）中のミスマッチ数によって、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑオフターゲット部位の分布を示すヒストグラムである。図５Ａ−ＥＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑを用いて、オフターゲット部位分析に対する個別化ＳＮＰの影響が評価される。（Ｅ）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって同定されたオフターゲット部位におけるミスマッチの数が増加している、減少している、または同数である、１０００人ゲノムプロジェクトからのハプロタイプの比率である。

遺伝子操作ゲノム編集ヌクレアーゼは、科学研究および人間医学の双方にとって変革技術である。この技術の使用に関わる重要な問題は、オフターゲット切断事象が、生きている細胞のゲノム中の意図されない標的部位で起こる度合いである。^10,24-27これは、特に、ほぼ全ての細胞型において、非相同末端結合によるヌクレアーゼ誘導切断の修復が、挿入または欠失突然変異（インデル）の効率的な導入をもたらし得ることから、重大である。その中で数百万〜数十億の細胞がこれらのヌクレアーゼで治療されてもよい研究および治療用途のどちらにとっても、低頻度の変異でさえ、望ましくない細胞表現型または望ましくない臨床結果をもたらす可能性がある。

最近、多数のゲノムワイドアプローチが開発されており、ゲノム編集ヌクレアーゼによって誘導されるオフターゲット切断事象の状況が定義されている。例えば、このような変異体のゲノムワイド検出のための様々な細胞ベースの方法が記載されている。^28-32これらとしては、配列決定法によって可能になるＤＳＢのゲノムワイド不偏性同定（ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ）と、ハイスループットのゲノムワイド移行配列決定法（ＨＴＧＴＳ）とが挙げられる。例えば、生きている細胞におけるヌクレアーゼ誘導ＤＳＢ中への短い二本鎖オリゴヌクレオチド「標識」の取り込みに依存するＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ法は、ゲノム全域の規模で、オフターゲット部位を画定することが示されており、細胞集団において０．１％程度に低い頻度で変異誘発される部位が同定される（Ｔｓａｉｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５）。ヌクレアーゼ誘導オフターゲット切断を画定するためのその他の細胞ベースの方法としては、オンターゲット部位への移行融合をマッピングする方法、および組み込み欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）ゲノムのＤＳＢ部位への取り込みに依存する別の方法が挙げられる。しかし、細胞の効率的な操作のためのこれらの方法の要件は、特に治療に最も妥当かつ有用であるが難しい非形質転換細胞型を取り扱う場合、それらの実現可能性、拡張性、および再現性を制限し得る。

この最近の進歩にもかかわらず、オフターゲット決定のための細胞ベースの方法には、（１）ヌクレアーゼ成分とｄｓＯＤＮまたはＩＤＬＶゲノムなどの標識との双方が細胞に導入できるという必要条件；（２）特定タイプのオフターゲット変異を保有する細胞の増殖を支援するまたは支援しないことがある、生物学的選択圧；（３）ヌクレアーゼオフターゲット活性／効果に対する、クロマチン、ＤＮＡメチル化、遺伝子発現、および核構造などの細胞型特異的パラメータの潜在的交絡効果；および／または（４）目的の細胞を培養中で増殖させることができるという必要条件をはじめとする、いくつかの制限がある。

精製されたゲノムＤＮＡを使用するインビトロ法は、細胞ベースのアプローチのこれらの様々な制限を回避することから、魅力的な代案を提供する。（この説明において、インビトロは、無細胞反応において精製された成分を用いて実施される実験を指すことに留意されたい）。オフターゲット切断部位を検出するためのインビトロ法は、以下をはじめとする、細胞ベースの方法に優る利点を有する。ａ）それらは精製されたタンパク質非含有ＤＮＡ上で実施されることから、クロマチン状況、遺伝子発現レベル、または核内局在による影響を受けない、ｂ）それらは、部位を検出するために、ａ）に列挙した要素ならびに配列依存性効果によって影響され得る、誤りがちな細胞ＤＮＡ修復に依存しない、ｃ）ヌクレアーゼ濃度、ゲノムＤＮＡ濃度、および切断時間の長さは全て変更させ得ることから、それらは、低頻度の切断事象の検出のために非常に高感度である可能性を提供する。定義され精製された成分を使用する生化学的アッセイは、再現性を改善して、効率的な細胞形質導入または形質移入に対する必要性を回避し、細胞適合性に対する陽性または陰性の影響によって引き起こされる潜在的なバイアスを回避する。重要なことには、活性ヌクレアーゼ濃度およびゲノムＤＮＡ濃度は、生体外で非常に高レベルに上昇させ得て、細胞において非常に稀な頻度で、および／または細胞において発現され得るヌクレアーゼの最大濃度で、切断されてもよい配列の同定を潜在的に可能にする。特定の標的ＤＮＡ部位に偏った、部分的縮重ＤＮＡライブラリーのＣａｓ９切断特異性を特性解析するインビトロ法は、以前記載されているが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび様々なｇＲＮＡと共に用いた場合、同定された部位の大部分は実際にヒトゲノムには存在しなかった³³。

しかし、インビトロ法は、単離されたゲノムＤＮＡが、実験上の必要性により無作為に剪断され（または壊れて）、より小さな断片になるという課題に直面する。ヌクレアーゼによるＤＮＡの生体外処理によって誘導される、ＤＳＢからの剪断によって誘導されるＤＳＢを示差的に同定することは容易でないため、これは課題を提起する。今日までに、ヒトゲノムＤＮＡでの使用については、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ³⁴として知られている、生体外ゲノムワイドオフターゲット同定法が、唯一記載されている。このアプローチは、バルクゲノムＤＮＡのヌクレアーゼ切断、全ての自由端への配列決定アダプターのライゲーション（ヌクレアーゼ誘導性および非ヌクレアーゼ誘導性）、ハイスループット配列決定法、およびシグネチャの均一なマッピング端を有するヌクレアーゼ切断部位の生物情報学的同定に依存する。しかし、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって配列決定された無作為に剪断されたゲノムＤＮＡ断片の極めて高いバックグラウンドは、より頻度の低いヌクレアーゼ誘導切断事象の同定を極めて困難にし、必要な読み取り数（＞４億）を生成し得る、生産規模のヒトゲノム再配列決定に用いられる、ＨｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑＸ１０装置へのアクセスが必要になる。

Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ法は、ヌクレアーゼオフターゲット活性に関する情報価値がない、配列決定読み取りの高いバックグラウンドに悩まされ、それは配列決定資源に関して非効率的であり、したがってオフターゲット部位を検出する能力の感度が低い。無作為に剪断された遺伝子操作されたゲノムＤＮＡは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによってヌクレアーゼ消化され、次にこれらの断片は全ゲノム再配列決定法に供される。無作為に切断された断片が、ゲノムに無作為に整列するのに対し、ヌクレアーゼによって消化された断片は、ゲノムにマッピングされると、同一ゲノム塩基位置に整列する均一な末端を有する。この方法の最初の検証は、それがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼのオフターゲット切断部位を検出する、いくらかの能力を有することを示した。しかし、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑでは、１００万個の配列決定読み取り当たり１個未満が、ヌクレアーゼオフターゲット部位にマッピングされる。この高いバックグラウンドは、この方法に、いくつかの不都合を引き起こす。（Ａ）これは、配列決定法に関して方法の費用対効果を極めて低くし、ＨｉＳｅｑやＨｉＳｅｑｘ１０プラットフォームなどの方法の使用が必要となる；（Ｂ）ゲノムにマッピングされる無作為に切断されたＤＮＡ断片の高いバックグラウンドは、信号対雑音比問題から、低頻度のヌクレアーゼ誘導切断の同定を困難にする；（Ｃ）情報の低い収率は、ＨｉＳｅｑｘ１０プラットフォームのような最先端技術法によって得られ得る、多数の配列決定読み取りによってさえも、低頻度のヌクレアーゼオフターゲット部位を見いだすことを困難にする。実際に、Ｄｉｇｅｎｏｍｅは、特定のｇＲＮＡについてＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって見いだされたいくつかのオフターゲット部位を同定できなかった（しかし、２つの実験は異なる細胞株由来のゲノムＤＮＡを用いて実施されたという、但し書きを付け加えなくてはならない）。

本明細書に記載されるのは、任意の対象ゲノムＤＮＡ上で、ヌクレアーゼによって誘導されたＤＳＢの包括的判定を可能にする、インビトロ法である。この方法は、ゲノムＤＮＡの剪断によって誘導されるランダムＤＳＢに対する、ヌクレアーゼ誘導ＤＳＢの濃縮を可能にする。

配列決定法による切断効果の生体外報告の環状化（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ）として本明細書に記載される例示的方法は、新しい無細胞ストラテジーであり、それはヌクレアーゼ切断されたゲノムＤＮＡの高効率選択濃縮を可能にし、ハイスループット配列決定法およびゲノムオフターゲット切断部位の発見に用いられ得る。配列決定法によるヌクレアーゼＤＳＢの完全な照会（ＦＩＮＤ−ｓｅｑ）法（米国特許出願第６２／２１７，６９０号明細書に記載される）と同様に、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑは、そのＤＮＡ末端が、配列決定アダプターの引き続くライゲーションを防ぐような様式で保護される、無作為に剪断されたゲノムＤＮＡ断片の出発ライブラリーを作成する原理に基づく。しかし、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑでは、この分子集団は新規の不偏性分子内環状化法によって生じ、エキソヌクレアーゼ処理がそれに続いて、あらゆる残りの残留直鎖断片を分解する（図２）。この共有結合的に閉じた環状化ゲノムＤＮＡ分子の酵素的に精製された集団は、次に、選択された遺伝子操作されたヌクレアーゼによって処理される。このヌクレアーゼによって切断された部位を保有するあらゆるＤＮＡフラグメントは直線化され、それによって２つの利用可能なＤＮＡ末端が解放され、配列決定アダプターがそれにライゲートされ得る。直線化され、アダプターにライゲートされた断片は、引き続いて、ハイスループット配列決定法のためにＰＣＲによって増幅された（図２を参照されたい）。したがって、ＣＩＲＣＬＥ−Ｓｅｑは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって観察されるランダムゲノム読み取りの非常に高いバックグラウンドを実質的に排除する。

低濃度のＤＮＡにおけるｇＤＮＡ分子の効率的な分子内環状化のための生体外条件が最適化されたが、それはこのプロセスが、この方法の成功と低いバックグラウンドにとって重要なためである。ヌクレアーゼ切断断片のＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ濃縮（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる実験に基づく）は、バックグラウンドをほぼ６倍超えると推定され、その結果、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑのような総当たり生体外オフターゲット切断部位発見方法によって配列決定される、無作為に剪断されたＤＮＡ断片の高いバックグラウンドを相当に減少させる（図１Ａ）。濃縮係数は、予測された切断点から得られた読み取り数を、実験の配列決定深度で偶発的に期待される、それらの位置における読み取り数で除算することによって、（そこでほぼ１００％の断片が生体外で切断されると予測される）オンターゲット部位で計算された。

重要なことには、バックグラウンドを減少させると、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ法の結果として得られる信号対雑音比が劇的に増加し、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑで偶発的に存在し得る均一な末端の読み取りに起因する誤検出の確率が減少した。ゲノムＤＮＡ断片の初期環状化はまた、単一のＤＮＡ分子中のＤＳＢの両端の同時回収（したがって、単一のＤＮＡ配列決定読み取り）を可能にし、それは次に、オフターゲット切断部位の参照非依存性発見を可能にし、これはヌクレアーゼ誘導性オフターゲット効果の同定について前述の全ての方法よりも改善されており、ゲノム配列が事前に分かっているかどうかにかかわらず、このアプローチを任意の生物由来のゲノムＤＮＡと共に使用することが可能になる。さらに、（ＤＮＡ修復経路が末端を切除または分解し得る、細胞内とは対照的に）生体外では、末端のプロセシングが最小限であるため、この方法はまた、ヌクレアーゼ誘導切断の位置を割り当てるヌクレオチドレベルの精度も大幅に改善する。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用したＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑの最初の検証実験では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ切断断片の濃縮は、ＦＩＮＤ−ｓｅｑ法と比較して、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑでほぼ２０倍であった（米国特許出願第６２／２１７，６９０号明細書および図１に記載される）。これらの２つの方法の根本的な違いは、ＦＩＮＤ−ｓｅｑが、ステムループアダプターで共有結合的に閉じた直鎖ＤＮＡ基質に基づくのに対し、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑは、共有結合的に閉じた完全環状化ＤＮＡ基質に基づくことである（図１Ａ）。好ましいエキソヌクレアーゼの１つ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅから商業的に入手可能なＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅＡＴＰ依存性ＤＮａｓｅ）は、ＦＩＮＤ−ｓｅｑステムループにライゲートされたＤＮＡ基質の露出したｓｓＤＮＡ部分に対して、いくらかの活性を保持してもよく、これが、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ法が、直鎖ＤＮＡ断片と共有結合的に閉じたＤＮＡ断片との間のより高い酵素的識別、およびより低い全体的バックグラウンドをもたらす理由を説明してもよい。

したがって、提供された結果は、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ法が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼのゲノムワイドオフターゲット切断部位を判定するために、今までに記載されている最も高感度で配列決定効率の高い生体外アプローチであることを示す。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑと比較して、観察されたバックグラウンド読み取りの比率が相当に低下しており、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑで必要とされる配列決定読み取りの総数のわずかな部分（約１．７％）を使用して、オフターゲット部位を高感度で識別できるようにする。より控えめな数の読み取り（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑなどの卓上配列決定装置で得られるもの）だけが必要なことから、方法は、ほとんどの実験室で利用でき、経費の観点から自動化および規模変更を受け入れられるようになる。

ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑは、Ｃａｓ９オフターゲット切断のより正確な予測アルゴリズムの訓練を可能にする、より大きなデータセットを作成できるようにする。方法は、高い費用対効果で自動化および規模変更され得て、したがって、数千のｇＲＮＡのオフターゲット切断部位および相対的インビトロ切断効率（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数による測定）を同定するデータを生成することが、実現可能なはずである。さらに、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑなどの方法で、ＥＮＣＯＤＥ特性決定細胞株において判定された大規模な細胞ベースのオフターゲットデータセットと結合された場合³⁹、ＤＮＡＤＳＢを誘導するヌクレアーゼの能力に対するクロマチンおよびエピジェネティックな修飾の影響を、より良く理解し定量化することが可能であってもよい。

治療用途では、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑやＨＴＧＴＳなどの最高感度の細胞ベースのゲノムワイドオフターゲット検出法と比べてさえも、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑがより優れていることから、この方法を初期スクリーニングとして用いて、潜在的オフターゲット部位を同定し得て、それは次に、実際のヌクレアーゼ修飾細胞における直交アプローチによって確認され得る。この研究では、標的配列決定法を用いてＧＵＩＤＥ−ｓｅｑｄｓＯＤＮ標識を検索し、次世代配列決定法に伴うインデル誤り率（典型的に約０．１％）のために標準的なアンプリコン配列決定法による同定が困難な低頻度部位（＜０．１％）が検証された。しかし、このアプローチは、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑｄｓＯＤＮ標識で形質移入され得る細胞に限定され、これは、全ての細胞で実行可能でないこともある。したがって、将来の研究のための重要かつ緊急な領域は、現在のハイスループット配列決定技術の誤差率未満のオフターゲット変異誘発をより感度良く測定する、代案の直交細胞ベース法の開発であろう。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑはまた、遺伝子操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの、ヒト治療薬のために既に用いられている、その他のヌクレアーゼプラットフォームのオフターゲット効果を分析するために、拡張され得る。

本明細書中のＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑデータは、その他の研究者らによって最初に提起された概念である、オフターゲット切断に対するヒト遺伝的変異の潜在的な影響に、より大きな支持を提供する³⁶。本発明者らの知見は、オフターゲットリスクを評価する際に遺伝子型を検討することの重要性を強調し、ヌクレアーゼの安全性評価に、患者特異的様式で実施される特異性プロファイルを含めるべきであると主張する。代案としては、遺伝的に多様な細胞の大規模パネルからのゲノムＤＮＡに対して実施されたＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑが、任意の所与のヌクレアーゼについて大部分の共通およびＳＮＰ特異的オフターゲット効果を定義する、有効な方法を提供してもよい。この点において、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑが、皮膚生検から得られるであろう一次線維芽細胞から単離されたゲノムＤＮＡ上で実施され、標準的な採血からの軟膜もまた、アッセイを行うのに十分な量のＤＮＡを提供するであろう。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑの単純さ、拡張性、および再現性は、大規模な一連のゲノムＤＮＡサンプル上で、ゲノムワイドオフターゲットプロファイルを定義するのに理想的に適する。

ステムループアダプターおよび配列決定アダプター
本方法は、分子内ライゲーションによって断片を環状化するための、天然に存在しないステムループアダプターの使用を含む。ステムループアダプターは、（５’から３’方向に）例えば約１０〜１５、例えば１２ヌクレオチドなどの第１の領域、少なくとも１つの（好ましくは１つのみの）ヘアピンループを形成し、分子内ライゲーションに適した回文配列を含み、少なくとも１つの（好ましくは１つのみの）ウラシルが側面にある、例えば約４から６、例えば５ヌクレオチドの第２の領域；および第１の領域に相補的な例えば約１０から１５、例えば１３ヌクレオチドの第３の領域を含む。

本方法はまた、プライミングＰＣＲまたは配列決定法で使用するためのヌクレオチド配列を含む、配列決定アダプターの使用も含む。配列決定アダプターは、典型的に（５’から３’方向に）例えば約１０〜１５、例えば１２ヌクレオチドなどの第１の領域、少なくとも１つの（好ましくは１つのみの）ヘアピンループを形成し、ＰＣＲプライミングおよび／または例えば次世代配列決定法（ＮＧＳ）などの配列決定法で使用するのに適した配列を含み、少なくとも１つの（好ましくは１つのみの）ウラシルが側面にある、例えば約２０から６０、例えば４０ヌクレオチドの第２の領域；および第１の領域に相補的な例えば約１０から１５、例えば１３ヌクレオチドの第３の領域を含む。第１、第２、および第３の領域の長さは、選択されたＮＧＳプラットフォームで使用するためのプライミングに必要な配列に依存するので、選択されるＮＧＳ法次第で変動し得る。いくつかの実施形態では、標準的なアダプターの変種である市販のアダプター（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＮＥＢからの）が使用され得る。

ステムループおよび配列決定アダプターは、ＵＳＥＲ（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ）酵素混合物（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）などの、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）とＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼであるエンドヌクレアーゼＶＩＩＩとによって、アダプターが開かれるようにする、少なくとも１つ、好ましくは唯一のウラシルを含む。ＵＤＧは、ウラシル塩基の切除を触媒して脱塩基部位を形成するが、リン酸ジエステル骨格は無傷のまま残す（例えば、Ｌｉｎｄｈａｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３２８６−３２９４（１９７７）；Ｌｉｎｄｈａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１：６１−６４（１９８２）を参照されたい）。エンドヌクレアーゼＶＩＩＩは、脱塩基部位の３’および５’側で、リン酸ジエステル骨格を切断する（例えば、Ｍｅｌａｍｅｄｅｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：１２５５−１２６４（１９９４）；Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２２３０−３２２３９（１９９７）を参照されたい）。この組み合わせは、ウラシルの位置に単一のヌクレオチドギャップを生成する。いくつかの実施形態では、ウラシルは、ＰＣＲプライミングおよび／または配列決定法における使用に適合する配列の、または回文配列の、３’または５’末端に、またはその１、２、３、または４ヌクレオチド以内に配置される。

本方法において、アダプターの全ての部分は、好ましくは、細胞のゲノムに直交する（すなわち、細胞ゲノム中に存在せず、または細胞ゲノム中に存在する配列と相補的でなく、すなわち細胞ゲノム中に存在する配列と１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以下の同一性を有する）。

配列決定アダプターは、好ましくは、例えば、無作為化ＤＮＡバーコードであるプライマー部位（例えば、ＳＨＡＰＥ−ＳＥＱ，Ｌｕｃｋｓｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０８：１１０６３−１１０６８）、固有の分子識別子（ＵＭＩ）（例えば、Ｋｉｖｉｏｊａｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ９，７２−７４（２０１２）；Ｉｓｌａｍｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ１１，１６３−１６６（２０１４）；Ｋａｒｌｓｓｏｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１５Ｍａｒ；１０５（３）：１５０−８を参照されたい）、または固有のＰＣＲプライミング配列および／または配列決定法における使用に適合する固有の配列（例えばＮＧＳ）などの、ＰＣＲプライミングおよび／または配列決定法における使用に適合する配列を含むべきである。配列決定法における使用に適合する配列は、例えば次世代配列決定法、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、イオントレント、またはＲｏｃｈｅ／４５４のようなライブラリー作成法、ｌｌｌｕｍｉｎａＳｏｌｅｘａＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＳＯＬｉＤ（商標）システム、イオントレント（商標）半導体配列分析器、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）リアルタイム配列決定法、およびＨｅｌｉｃｏｓ（商標）単一分子配列決定法（ＳＭＳ）などの所望の配列決定法での使用について選択され得る。例えば、国際公開第２０１４０２０１３７号パンフレット、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇｅｔａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ５５：４６４１−６５８（２００９）およびＭｅｔｚｋｅｒ，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＧｅｎｅｔｉｃｓ１１：３１−４６（２０１０）を参照されたい）。ＴｈｒｕＰＬＥＸＤＮＡ−ｓｅｑキット（Ｒｕｂｉｃｏｎ；米国特許第７，８０３，５５０号明細書；米国特許第８，０７１，３１２号明細書；米国特許第８，３９９，１９９号明細書；米国特許第８，７２８，７３７号明細書を参照されたい）、およびＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ；例えば、米国特許第８，４２０，３１９号明細書を参照されたい））をはじめとする、ＮＧＳ用ＤＮＡを調製するためのいくつかのキットが市販されている。例示的なステムループアダプター配列は、／５Ｐｈｏｓ／ＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣ／ｉｄｅｏｘｙＵ／ＡＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＧ^*Ｔ（配列番号１；星印はホスホロチオエート結合を示す）である。いくつかの実施形態では、配列決定アダプターは、例えば、ＮＥＢＮｅｘｔキットからなどの市販の配列決定アダプターである。

いくつかの実施形態では、アダプターは、好ましくは細胞ゲノムに相対的に稀である部位などの制限酵素認識部位を含む。

アダプターは、好ましくは修飾され；いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターの５’末端がリン酸化され、および／または３’末端がホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、アダプターは平滑末端化される。いくつかの実施形態では、アダプターは、５’または３’末端に、１、２、３、４個またはそれ以上のヌクレオチドオーバーハングのランダム変種を含み、あるいは５’または３’末端に単一のＴを含む。

アダプターは、例えば、技術分野で公知の、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６０４９３号明細書に記載されるような、１つまたは複数の追加的な修飾もまた含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターはビオチン化される。ビオチンは、ヘアピンアダプター内部の任意の場所にあり得る（例えば、修飾チミジン残基（ビオチン−ｄＴ）、またはビオチンアジドを使用）が、５’または３’末端上にはない。これは、ライゲートされた配列決定アダプターを含有する断片を回収する、代替方法を提供する。いくつかの実施形態では、これらの配列は、ＰＣＲによって取得され増幅されるに対し、このアプローチでは、それらは例えば、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズとの結合によって、または溶液ハイブリッド捕捉を用いて、ビオチンを使用して物理的に引き寄せられ濃縮される；例えば、Ｇｎｉｒｋｅｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２７，１８２−１８９（２００９）を参照されたい。

遺伝子操作されたヌクレアーゼ
現在のところ、以下の４つの主なクラスの遺伝子操作されたヌクレアーゼが存在する：１）メガヌクレアーゼ、２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、３）転写アクチベーターエフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および４）規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＣａｓＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）。これらのプラットフォームの様々な構成要素はまた、融合して、Ｍｅｇａ−ＴＡＬｓおよびＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合物などの追加的なヌクレアーゼが生成され得る。例えば、Ｇａｊｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３Ｊｕｌ；３１（７）：３９７−４０５を参照されたい。ヌクレアーゼは、当該分野で公知の方法を用いて、細胞内で一過性にまたは安定して発現され得て；典型的に、発現が得られ、タンパク質をコードする配列が、転写を誘導するプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングされる。適切な真核発現系は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（４ｔｈｅｄ．２０１３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２００６）；およびＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，２０１０）に記載される。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準技術に従って実施される（例えば、上記の参考文献およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３４９−３５１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１０１：３４７−３６２（Ｗｕｅｔａｌ．，ｅｄｓ，１９８３）を参照されたい。

ホーミングメガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼは、細菌、酵母、藻類、および植物細胞小器官などの様々な生物に由来する、配列特異的エンドヌクレアーゼである。内因性メガヌクレアーゼは、１２〜３０塩基対の認識部位を有し；１８ｂｐおよび２４ｂｐ長のメガヌクレアーゼ認識部位があるカスタマイズされたＤＮＡ結合部位が記載されており、どちらも本方法およびコンストラクトで使用され得る。例えば、Ｓｉｌｖａ，Ｇ．，ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１１：１１−２７，（２０１１）；Ａｒｎｏｕｌｄｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，３５５：４４３−５８（２００６）；Ａｒｎｏｕｌｄｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＤｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４：２７−３１（２０１１）；およびＳｔｏｄｄａｒｄ，Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８，４９（２００５）；Ｇｒｉｚｏｔｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，３８：２００６−１８（２０１０）を参照されたい。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ
最近の研究により、クラスター化され規則的に間隔を置いた短い回文構造の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４８２，３３１−３３８（２０１２）；Ｈｏｒｖａｔｈｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２７，１６７−１７０（２０１０）；Ｔｅｒｎｓｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１４，３２１−３２７（２０１１））は、細菌、酵母、およびヒト細胞内で、ならびにショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、およびマウスなどの生物全体の生体内で、ゲノム編集を実施するための単純かつ高効率な方法の基礎の役割を果たし得る（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１５３，９１０−９１８（２０１３）；Ｓｈｅｎｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＲｅｓ（２０１３）；Ｄｉｃａｒｌｏｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ（２０１３）；Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１，２３３−２３９（２０１３）；Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｅｌｉｆｅ２，ｅ００４７１（２０１３）；Ｈｗａｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１，２２７−２２９（２０１３）；Ｃｏｎｇｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９，８１９−８２３（２０１３）；Ｍａｌｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９，８２３−８２６（２０１３ｃ）；Ｃｈｏｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１，２３０−２３２（２０１３）；Ｇｒａｔｚｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１９４（４）：１０２９−３５（２０１３））ことが実証されている。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９ヌクレアーゼ（以下、単にＣａｓ９）は、例えば、シングルガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ対などの遺伝子操作されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の１７〜２０個のヌクレオチドと、例えば、ＮＧＧまたはＮＡＧ配列にマッチするＰＡＭなどのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣に位置する標的ゲノムＤＮＡ配列の相補鎖との間の単純な塩基対相補性を通じて、誘導され得る（Ｓｈｅｎｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＲｅｓ（２０１３）；Ｄｉｃａｒｌｏｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ（２０１３）；Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１，２３３−２３９（２０１３）；Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｅｌｉｆｅ２，ｅ００４７１（２０１３）；Ｈｗａｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１，２２７−２２９（２０１３）；Ｃｏｎｇｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９，８１９−８２３（２０１３）；Ｍａｌｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９，８２３−８２６（２０１３ｃ）；Ｃｈｏｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１，２３０−２３２（２０１３）；Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７，８１６−８２１（２０１２））。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１６３，７５９−７７１（２０１５）；Ｓｃｈｕｎｄｅｒｅｔａｌ．，ＩｎｔＪＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ３０３，５１−６０（２０１３）；Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．，ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１３，７２２−７３６（２０１５）；Ｆａｇｅｒｌｕｎｄｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ１６，２５１（２０１５）に記載されるように、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼに由来する遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲもまた使用され得る。ＳｐＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１は、標的ＤＮＡ配列のプロトスペーサーに相補的な３’末端に２３ｎｔを有する、単一の４２ｎｔのｃｒＲＮＡのみを必要とする（Ｚｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．，２０１５）。さらに、ＳｐＣａｓ９が、プロトスペーサーの３’であるＮＧＧＰＡＭ配列を認識するのに対して、ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐ１は、プロトスペーサーの５’に見いだされるＴＴＴＮＰＡＭを認識する（同書）。

いくつかの実施形態では、本システムは、細菌においてコードされているか、または哺乳類細胞における発現のためにコドン最適化されているか、および／またはそのＰＡＭ認識特異性および／またはそのゲノムワイド特異性が改変されているかのいずれかとして、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）に由来する野生型または変異型Ｃａｓ９タンパク質、またはアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種ＢＶ３Ｌ６またはラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＤ２００６に由来する野生型Ｃｐｆ１タンパク質を利用する。いくつかの変法が記載されており、例えば、特に、国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９１４７号明細書、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６Ａｕｇ；３４（８）：８６９−７４；ＴｓａｉａｎｄＪｏｕｎｇ，ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔ．２０１６Ｍａｙ；１７（５）：３００−１２；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１６Ｊａｎ２８；５２９（７５８７）：４９０−５；Ｓｈｍａｋｏｖｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌ．２０１５Ｎｏｖ５；６０（３）：３８５−９７；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５Ｄｅｃ；３３（１２）：１２９３−１２９８；Ｄａｈｌｍａｎｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５Ｎｏｖ；３３（１１）：１１５９−６１；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５Ｊｕｌ２３；５２３（７５６１）：４８１−５；Ｗｙｖｅｋｅｎｓｅｔａｌ．，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０１５Ｊｕｌ；２６（７）：４２５−３１；Ｈｗａｎｇｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．２０１５；１３１１：３１７−３４；Ｏｓｂｏｒｎｅｔａｌ．，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０１５Ｆｅｂ；２６（２）：１１４−２６；Ｋｏｎｅｒｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５Ｊａｎ２９；５１７（７５３６）：５８３−８；Ｆｕｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２０１４；５４６：２１−４５；およびＴｓａｉｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４Ｊｕｎ；３２（６）：５６９−７６を参照されたい。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１と共に、細胞内で発現され、または細胞内に存在する。ガイドＲＮＡまたはヌクレアーゼのどちらか、またはその双方は、細胞内で一過性にまたは安定して発現され得るか、または精製されたタンパク質または核酸として導入され得る。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合、ＲＮＡ誘導ＦｏｋＩヌクレアーゼであり、その中でＣａｓ９ヌクレアーゼは、変異（例えばｄＣａｓ９）によって触媒的に不活性化されており、ＦｏｋＩヌクレアーゼは、フレーム内で任意選択的に介在性リンカーによって、ｄＣａｓ９に融合する。例えば、国際公開第２０１４／１４４２８８号パンフレット、および国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレットを参照されたい。

ＴＡＬエフェクターリピートアレイ
キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）の植物病原菌のＴＡＬエフェクターは、宿主ＤＮＡに結合し、エフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、疾病において重要な役割を果たすか、または防御を始動する。特異性は、不完全な、典型的に約３３〜３５個のアミノ酸反復である、エフェクター可変数に依存する。多型性は、本明細書では反復可変二残基（ＲＶＤ）と称される、反復位置１２および１３に主に存在する。ＴＡＬエフェクターのＲＶＤは、１つのＲＶＤと１つのヌクレオチドとの直接的な直線様式で、それらの標的部位のヌクレオチドに対応し、いくらかの縮重があるが明らかな文脈依存はない。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド特異性を付与する多型性領域は、三残基または三つ組として発現されてもよい。

各ＤＮＡ結合反復は、標的ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み得て、その中では各ＤＮＡ結合反復は、標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識に関与する。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＡ；Ｃを認識するためのＮＤ；Ｃを認識するためのＨＩ；Ｇを認識するためのＨＮ；Ｇを認識するためのＮＡ；ＧまたはＡを認識するためのＳＮ；Ｔを認識するためのＹＧ；Ｇを認識するためのＮＫの１つまたは複数、およびＣを認識するためのＨＤ；Ｔを認識するためのＮＧ；Ａを認識するためのＮＩ；ＧまたはＡを認識するためのＮＮ；ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ；ＣまたはＴを認識するためのＮ^*（^*はＲＶＤの第２の位置におけるギャップを表す）；Ｔを認識するためのＨＧ；Ｔを認識するためのＨ^*（^*はＲＶＤの第２の位置におけるギャップを表す）；およびＴを認識するためのＩＧの１つまたは複数を含んでなり得る。

ＴＡＬＥタンパク質は、ゲノム編集における相同組換えを容易にし得る標的キメラヌクレアーゼとして、（例えば、植物において、バイオ燃料または再生可能なエネルギーに有用な形質を追加しまたは増強する）研究および生物工学において有用であってもよい。これらのタンパク質はまた、特に、非限定的例として、病原体（例えばウイルス）に対する治療薬などの非常に高い特異性を要する治療用途のために、例えば、転写因子として有用であってもよい。

遺伝子操作されたＴＡＬＥアレイを生成する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、全てそれらの内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願第６１／６１０，２１２号明細書およびＲｅｙｏｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３０，４６０−４６５（２０１２）に記載される高速ライゲーションベースの自動化可能固相ハイスループット（ｆａｓｔｌｉｇａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄａｕｔｏｍａｔａｂｌｅｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）（ＦＬＡＳＨ）システム、ならびにＢｏｇｄａｎｏｖｅ＆Ｖｏｙｔａｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３３，１８４３−１８４６（２０１１）；Ｂｏｇｄａｎｏｖｅｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＯｐｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｌ１３，３９４−４０１（２０１０）；Ｓｃｈｏｌｚｅ＆Ｂｏｃｈ，Ｊ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１１）；Ｂｏｃｈｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６，１５０９−１５１２（２００９）；Ｍｏｓｃｏｕ＆Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６，１５０１（２００９）；Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２９，１４３−１４８（２０１１）；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒｅｔａｌ．，Ｔ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０７，２１６１７−２１６２２（２０１０）；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３９，５７９０−５７９９（２０１１）；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２９，１４９−１５３（２０１１）；Ｇｅｉｓｓｌｅｒｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯＮＥ６，ｅ１９５０９（２０１１）；Ｗｅｂｅｒｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯＮＥ６，ｅ１９７２２（２０１１）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１８６，７５７−７６１（２０１０）；Ｌｉｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３９，３５９−３７２（２０１１）；Ｍａｈｆｏｕｚｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０８，２６２３−２６２８（２０１１）；Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ（２０１１）；Ｌｉｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３９，６３１５−６３２５（２０１１）；Ｃｅｒｍａｋｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３９，ｅ８２（２０１１）；Ｗｏｏｄｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３３，３０７（２０１１）；Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｅｔａｌ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２９，７３１−７３４（２０１１）；Ｔｅｓｓｏｎｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２９，６９５−６９６（２０１１）；Ｓａｎｄｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２９，６９７−６９８（２０１１）；Ｈｕａｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２９，６９９−７００（２０１１）；およびＺｈａｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２９，１４９−１５３（２０１１）に記載される方法を参照されたい。

メガヌクレアーゼとＴＡＬエフェクターとの融合物であるＭｅｇａＴＡＬもまた、本方法で使用するのに適し；例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．４２（４）：２５９１−２６０１（２０１４）；ＢｏｉｓｓｅｌａｎｄＳｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．２０１５；１２３９：１７１−９６を参照されたい。

ジンクフィンガー
ジンクフィンガータンパク質は、独立して折りたたまれた亜鉛含有ミニドメインである、１つまたは複数のジンクフィンガーを含有するＤＮＡ結合タンパク質であり、その構造は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯＪ．，４：１６０９；Ｂｅｒｇ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：９９；Ｌｅｅｅｔａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４５：６３５；およびＫｌｕｇ，１９９３，Ｇｅｎｅ，１３５：８３で定義される。ジンクフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８の、およびＤＮＡに結合したその変異体の結晶構造は、半保存パターンの相互作用を示し、その中では、ジンクフィンガーのαらせんに由来する典型的に３つのアミノ酸は、３つの隣接する塩基対、またはＤＮＡ中の「サブサイト」に接触する（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈｅｔａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８０９；Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，１９９８，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，６：４５１）。したがって、Ｚｉｆ２６８の結晶構造は、ジンクフィンガーとＤＮＡ配列中の３塩基対「サブサイト」との間の１対１の相互作用で、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、モジュラー様式で機能するかもしれないことを示唆した。天然に存在するジンクフィンガー転写因子中では、複数のジンクフィンガーが、典型的に、タンデムアレイで共に連結し、連続ＤＮＡ配列の配列特異的認識を達成する（Ｋｌｕｇ，１９９３，Ｇｅｎｅ１３５：８３）。

複数の研究により、ＤＮＡ結合に関与するαらせん位置でアミノ酸を無作為化することによって、そして目的のＤＮＡ標的部位に結合できる所望の変異体を同定するためのファージディスプレイなどの選択法を用いることによって、個々のジンクフィンガーのＤＮＡ結合特性を人工的に操作できることが示されている（Ｒｅｂａｒｅｔａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：６７１；Ｃｈｏｏｅｔａｌ．，１９９４Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１１１６３；Ｊａｍｉｅｓｏｎｅｔａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：５６８９；Ｗｕｅｔａｌ．，１９９５Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：３４４）。このような組換えジンクフィンガータンパク質は、転写活性化因子、転写抑制因子、メチル化ドメイン、およびヌクレアーゼなどの機能ドメインに融合されて、遺伝子発現を調節し、ＤＮＡメチル化を改変し、モデル生物、植物、およびヒト細胞のゲノムに標的改変を導入し得る（Ｃａｒｒｏｌｌ，２００８，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，１５：１４６３−６８；Ｃａｔｈｏｍｅｎ，２００８，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６：１２００−０７；Ｗｕｅｔａｌ．，２００７，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．，６４：２９３３−４４）。

「モジュラーアセンブリー」として知られているジンクフィンガーアレイを遺伝子操作する１つの既存の方法は、事前に選択されたジンクフィンガーモジュールをアレイに単純に共に結合することを提唱する（Ｓｅｇａｌｅｔａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：２１３７−４８；Ｂｅｅｒｌｉｅｔａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：１３５−１４１；Ｍａｎｄｅｌｌｅｔａｌ．，２００６，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３４：Ｗ５１６−５２３；Ｃａｒｒｏｌｌｅｔａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：１３２９−４１；Ｌｉｕｅｔａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３８５０−５６；Ｂａｅｅｔａｌ．，２００３，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：２７５−２８０；Ｗｒｉｇｈｔｅｔａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，１：１６３７−５２）。この方法は、いかなる研究者でも実施するのに十分に簡単ではあるが、最近の報告では、特にジンクフィンガーヌクレアーゼの文脈で、失敗率が高いことが示されており（Ｒａｍｉｒｅｚｅｔａｌ．，２００８，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５：３７４−３７５；Ｋｉｍｅｔａｌ．，２００９，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．１９：１２７９−８８）、これは、任意の所与の標的遺伝子に対する非常に多数のジンクフィンガータンパク質の構築および細胞ベースの試験を典型的に必要とする限界である。（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２００９，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．１９：１２７９−８８）。

無作為化されたライブラリーからジンクフィンガーアレイを同定するコンビナトリアル選択ベースの方法は、モジュラーアセンブリーよりさらに高い成功率を有することが示されている（Ｍａｅｄｅｒｅｔａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，３１：２９４−３０１；Ｊｏｕｎｇｅｔａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７：９１−９２；Ｉｓａｌａｎｅｔａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：６５６−６６０）。好ましい実施形態では、ジンクフィンガーアレイは、国際公開第２０１１／０１７２９３号パンフレットおよび国際公開第２００４／０９９３６６号パンフレットに記載されており、または国際公開第２０１１／０１７２９３号パンフレットおよび国際公開第２００４／０９９３６６号パンフレットに記載されているように生成される。追加的な適切なジンクフィンガーＤＢＤは、米国特許第６，５１１，８０８号明細書、米国特許第６，０１３，４５３号明細書、米国特許第６，００７，９８８号明細書、および米国特許第６，５０３，７１７号明細書、および米国特許出願第２００２／０１６０９４０号明細書に記載される。

ＤＮＡ
本明細書に記載の方法は生体外で実施されるため、例えば、任意の細胞から単離されたゲノムＤＮＡ、人工的に作成されたＤＮＡ集団、またはその任意の他のＤＮＡプールなどのＤＮＡに適用され得る。

配列決定法
本明細書の用法では、「配列決定法」は、核酸配列を決定する任意の方法を含む。本方法では、連鎖停止剤（Ｓａｎｇｅｒ）配列決定法および色素ターミネーター配列決定法をはじめとする、任意の配列決定法が用いられ得る。好ましい実施形態では、数千のまたは数百万の配列決定反応を並行して遂行するハイスループット配列決定技術である、次世代配列決定法（ＮＧＳ）が用いられる。異なるＮＧＳプラットフォームは様々なアッセイ化学反応を用いるが、それらは全て、多数の鋳型上で同時に実行される、多数の配列決定反応からの配列データを生成する。典型的には、配列データはスキャナーを用いて収集され、次にアセンブルされて、生物情報学的に分析される。したがって、配列決定反応は、並行して実施され、読み取られ、アセンブルされ、分析され；例えば、米国特許第２０１４０１６２８９７号明細書、ならびにＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇｅｔａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；およびＭａｃＬｅａｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＲｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６（２００９）を参照されたい。いくつかのＮＧＳ法は鋳型増幅を必要とし、いくつかは増幅を必要としない。増幅が必要な方法としては、ピロシーケンス（例えば、米国特許第６，２１０，８９号明細書および米国特許第６，２５８，５６８号明細書を参照されたい；Ｒｏｃｈｅによって商品化されている）；Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（例えば、米国特許第６，８３３，２４６号明細書、米国特許第７，１１５，４００号明細書、および米国特許第６，９６９，４８８号明細書を参照されたい）；およびＳｕｐｐｏｒｔｅｄＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＬｉｇａｔｉｏｎａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）プラットフォーム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；例えば、米国特許第５，９１２，１４８号明細書および米国特許第６，１３０，０７３号明細書を参照されたい）が挙げられる。例えば、単一分子配列決定法などの増幅を必要としない方法としては、ナノポア配列決定法、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（米国特許第７，１６９，５６０号明細書；米国特許第７，２８２，３３７号明細書；米国特許第７，４８２，１２０号明細書；米国特許第７，５０１，２４５号明細書；米国特許第６，８１８，３９５号明細書；米国特許第６，９１１，３４５号明細書；および米国特許第７，５０１，２４５号明細書）；合成によるリアルタイム配列決定法（例えば、米国特許第７，３２９，４９２号明細書を参照されたい）；ゼロモード導波路（ＺＭＷ）を用いた単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡ配列決定法；および米国特許第７，１７０，０５０号明細書；米国特許第７，３０２，１４６号明細書；米国特許第７，３１３，３０８号明細書；および米国特許第７，４７６，５０３号明細書）に記載されるものをはじめとするその他の方法が挙げられる。例えば、米国特許第２０１３０２７４１４７号明細書；米国特許第２０１４００３８８３１号明細書；Ｍｅｔｚｋｅｒ，ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔ１１（１）：３１−４６（２０１０）を参照されたい。

代案としては、例えば、マイクロアレイ分析、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ、またはその他の配列決定プラットフォームなどの、ハイブリダイゼーションに基づく配列方法またはその他のハイスループット法もまた用いられ得る。

キット
本明細書でまた提供されるのは、本明細書に記載の方法で使用するためのキットである。キットは、以下の１つまたは複数を含み得る：ヘアピンアダプター；末端修復およびＡテーリングのための試薬および／または酵素（例えば、Ｔ４ポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、および／またはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）；エキソヌクレアーゼ；例えば、ＵＳＥＲ（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ）酵素混合物（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）などのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼであるエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ；例えばｃａｓ９タンパク質などの精製されたヌクレアーゼ；ガイドＲＮＡ（例えば、対照ｇＲＮＡ）；ｇＤＮＡ鋳型（例えば、対照ｇＤＮＡ鋳型）；および／または本明細書に記載の方法で使用するための使用説明書。

本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない、以下の実施例においてさらに記載される。

材料と方法
以下の材料および方法を以下の実施例１〜６で使用した。

細胞培養および形質移入
細胞培養実験は、ヒトＵ２ＯＳ（Ｔ．Ｃａｔｈｏｍｅｎからの寄贈）、ＨＥＫ２９３（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｋ５６２、およびＰＧＰ１線維芽細胞（Ｇ．Ｃｈｕｒｃｈからの寄贈）上で実施した。Ｕ２ＯＳおよびＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、５％ＣＯ₂と共に３７℃で培養した。Ｋ５６２細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ、およびペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、５％ＣＯ₂と共に３７℃で培養した。ヒトＰＧＰ１線維芽細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ、およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したイーグルＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中で、５％ＣＯ₂と共に３７℃で培養した。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ実験では、ＧｅｎｔｒａＰｕｒｅｇｅｎｅＴｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを単離し、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって定量化した。標的化標識組み込みディープシーケンシング実験のために、ＬｏｎｚａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ４−Ｄ上で、Ｕ２ＯＳ細胞（プログラムＤＮ−１００）、ＨＥＫ２９３細胞（プログラムＣＭ−１３７）、およびＫ５６２細胞（プログラムＦＦ−１２０）を２０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＳＥ（Ｌｏｎｚａ）溶液中で、製造会社の使用説明書に従って形質移入した。Ｕ２ＯＳ細胞において、５００ｎｇのｐＣＡＧ−Ｃａｓ９（ｐＳＱＴ８１７）、２５０ｎｇのｇＲＮＡコードプラスミド、および１００ｐｍｏｌのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ末端保護ｄｓＯＤＮを同時形質移入した。ＡｇｅｎｃｏｕｒｔＤＮＡｄｖａｎｃｅｄゲノムＤＮＡ単離キット（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＧｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して、形質移入のおよそ７２時間後に、標的化標識組み込み配列決定法のためのゲノムＤＮＡを収穫した。

ｇＲＮＡの生体外転写
アニールされたオリゴヌクレオチド含有ｇＲＮＡ標的部位は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含有するプラスミドＮＷ５９にクローン化した。ｇＲＮＡ発現プラスミドはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（ＮＥＢ）で直線化し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。直線化プラスミドは、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔキットを使用して、製造会社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の使用説明書に従って、ｇＲＮＡの生体外転写のためのＤＮＡ鋳型として使用した。

ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑライブラリーの作成
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって以前に評価されたｇＲＮＡを用いた実験では、その中でそれらがＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって評価されたのと同じ細胞（Ｕ２ＯＳまたはＨＥＫ２９３細胞のいずれか）に由来するゲノムＤＮＡ上で、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ実験を実施した。精製ゲノムＤＮＡは、ＣｏｖａｒｉｓＳ２００装置によって３００ｂｐの平均長さに剪断し、末端修復してＡテールを付加し、ウラシル（デオキシウリジン）含有ステムループアダプターｏＳＱＴ１２８８５’−Ｐ−ＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＵＡＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＧ^*Ｔ−３’（配列番号１）にライゲートした（^*はホスホロチオエート結合を示す）。アダプターにライゲートされたＤＮＡは、λエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ）との混合物で処理し、次にＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）で処理した。ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて５ｎｇ／μｌの濃度で環状化し、Ｐｌａｓｍｉｄ−ＳａｆｅＡＴＰ依存性ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理して、残りの直鎖ＤＮＡ分子を分解した。生体外切断反応は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、９０ｎＭのＳｐＣａｓ９タンパク質、９０ｎＭの生体外転写ｇＲＮＡ、および２５０ｎｇのＰｌａｓｍｉｄ−Ｓａｆｅ処理環状化ＤＮＡを使用して、１００μｌで実施した。消化産物をＡテールテール付加し、ヘアピンアダプターにライゲートして、ＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）で処理し、ＫａｐａＨｉＦｉポリメラーゼ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＰＣＲで増幅した。完成したライブラリーは液滴デジタルＰＣＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって定量化し、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ装置上において、１５０ｂｐの対末端読み取りで配列決定した。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑライブラリー構築の詳細なユーザープロトコルは、実施例７に記載されている。

標的化ディープシーケンシング
Ｕ２ＯＳ細胞は、上記のＧＵＩＤＥ−ｓｅｑｄｓＯＤＮに加えて、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ発現プラスミドで形質移入した。ＰｈｕｓｉｏｎＨｏｔＳｔａｒｔＦｌｅｘＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用して単離されたＵ２ＯＳゲノムＤＮＡから、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって同定されるオフターゲット部位を増幅させた。各ＰＣＲのための投入量として１００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて、各形質移入条件から三連のＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物の濃度を標準化し、異なる形質移入条件に対応する異なるライブラリーにプールして、ＡｍｐｕｒｅＸＰ磁気ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を用いて精製した。５００ｎｇの各プールされたサンプル（ＫＡＰＡＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕ−ｓｅｑディープシーケンシングライブラリーを構築し、リアルタイムＰＣＲ（ＫＡＰＡＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって定量化して、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ機器で配列決定した。

ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑデータ解析
対末端読み取りをマージさせ、次にデフォルトパラメータでｂｗａ⁴⁰ｍｅｍを用いてマッピングした。≧５０のマッピング品質で予測される方向でマッピングされた読み取りの開始マッピング位置を表にして、ヌクレアーゼ処理されたサンプル中で濃縮されたゲノム間隔を同定した。ギャップを考慮して、６以下の編集距離を有する潜在的なヌクレアーゼ誘導オフターゲット部位について、どちらかの側の参照配列の間隔および２０ｂｐを検索した。

ｓａｍｔｏｏｌｓ^41,42ｍｐｉｌｅｕｐを使用して、オフターゲット部位における非参照遺伝的変異を同定した。平均品質スコアが２０を超える位置を可能な変種と見なし、目視検査によって確認した。

オフターゲット切断部位の参照非依存性発見は、対の一方の読み取りの配列を逆補完し、それを対のもう一方に連結することによって実施した。同定された部位に対応するギャップおよび読み取り数を考慮して、≦６の編集距離を有する潜在的なオフターゲット切断部位について、接合部のどちらかの側で開始する２０ｂｐの間隔を直接検索した。

ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑオープンソース解析ソフトウェア
ヌクレアーゼオフターゲット部位のゲノムワイド検出のためのＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑの幅広い利用を可能にするために、本発明者らは、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ実験データを解析するための自由に利用できるオープンソースのＰｙｔｈｏｎパッケージｃｉｒｃｌｅｓｅｑを開発した。単純なサンプルマニフェストを提供すると、ｃｉｒｃｌｅｓｅｑソフトウェアは、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ配列決定データの完全なエンドツーエンド解析を１つのコマンドで実行し、オフターゲットの切断部位の候補位置の表、ならびにオフターゲット配列の視覚的アラインメントを返す。

Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑデータ解析
ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって同定された切断部位周辺の狭い範囲（＋／−３ｂｐ）のマッピング位置の読み取り数は、元のＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ配列決定アラインメントから表にした。負の二項分布を適合させることによって、０．０１の有意水準での切断の有意な証拠を評価し、この基準による統計的に有意な部位を図２ｂに含めた。

実施例１．ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ法の概要と最適化
本発明者らは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって生じるランダムゲノムＤＮＡの交絡したバックグラウンド読み取り（図１Ａ）が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ切断ゲノムＤＮＡ断片の選択濃縮によって実質的に減少すると推論した。これを達成するために、本発明者らは、制限酵素非依存的ストラテジーを設計し、無作為に剪断された直鎖ゲノムＤＮＡを環状化し、残る非環状ＤＮＡの酵素分解がそれに続いた（図１Ｂ〜Ｃ）。本発明者らは、オンターゲットおよびオフターゲット部位における、部位特異的ヌクレアーゼによるこのゲノムＤＮＡ環集団の切断が、線形化ＤＮＡ末端を遊離させ、それに次世代配列決定アダプターがライゲートされ得ることを想定した。本発明者らは、これらの工程が集合的に、ヌクレアーゼ誘導ＤＮＡ末端の選択濃縮および配列決定を可能にし、ランダムに分布した末端剪断ゲノムＤＮＡ調製物の望まれない配列決定を抑止すると仮定した。重要なことには、ヌクレアーゼオフターゲット切断部位発見のための全てのその他のゲノムワイド法とは対照的に、本発明者らのストラテジーは、対末端配列決定法を用いて、１つのＤＮＡ分子の単一切断部位の両側の配列決定を独自に可能にする。

本発明者らがＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑと称するこの方法の最適化、およびその技術的再現性の特徴付け（図１Ｄ）は、次のようにして実施した。ゲノムＤＮＡの制限酵素独立環状化を達成するために、本発明者らは、末端修復されたＡテール付加ＰＣＲアンプリコンへのウラシル含有ステムループアダプターのライゲーションに基づく、ストラテジーを試験した。本発明者らは、λエキソヌクレアーゼと大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩとの混合物を用いて、両側にライゲートされたステムループアダプターを有する、共有結合的に閉じたＤＮＡ分子を酵素的に選択した。ＵＳＥＲ酵素とＴ４ＰＮＫとの混合物を用いて４ｂｐのオーバーハングを遊離させ、分子内ライゲーションに有利な条件下で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションを実施し、キャピラリー電気泳動によって環状化を成功させた。最も高い環状化効率をもたらす条件（４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５ｎｇ／μｌのＤＮＡ濃度）を後続する実験のために用いた。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑの技術的再現性を特性解析するために、本発明者らはＵ２ＯＳゲノムＤＮＡの同一起源から、独立したライブラリー作成を実施した。本発明者らは、独立した技術的複製において、強いＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数相関を観察した（図１Ｄ）。

実施例２．ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノムワイドオフターゲット切断部位の高感度の生体外検出を可能にする
ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑの有効性と感度を試験するために、本発明者らは、それを用いて、これまでのところ最も新しく正確なＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑバージョンでプロファイリングされている、単一の公開されたｇＲＮＡによって誘導された、Ｃａｓ９のオフターゲット切断部位を同定した³⁵。ヒトＫ５６２細胞ゲノムＤＮＡ上のこのｇＲＮＡ（ヒトＨＢＢ遺伝子を標的とする）を用いたＳｐＣａｓ９のＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ評価は、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって以前に同定された２９個のオフターゲット部位のうち２６個を同定しただけでなく、１５６個の新たなオフターゲット部位もまた同定した（図２Ａ）。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑで見いだされたが、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑでは見いだされなかった３つのオフターゲット部位について、本発明者らは、支持的な読み取りをＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑデータで観察し、これらの部位が単にこれらの特定の実験でアンダーサンプリングされたことが実証された。本発明者らは、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによってのみ検出された１５６個の新たなオフターゲット切断部位のうち、２９個が元のＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑデータでもまた切断の証拠を示すことを見いだし³⁴（図２Ｂ）；Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑがこれらの部位を呼び出せないことは、この方法によって生成された豊富なゲノムワイドバックグラウンドの読み取りに対抗するために要求される、厳密な情報科学のスコアリング基準に起因する可能性が高い。対照的に、本発明者らは、このようなバックグラウンド読み取りが、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑでは稀であることを見いだした（図２Ｃ）。実際に、本発明者らは、２つの方法でオンターゲット部位の調査および配列決定深度に対する補正調整に基づいて、ランダムバックグラウンド読み取りに対するヌクレアーゼ切断配列読み取りのＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑの濃縮係数は、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑよりも約１８，０００倍優れていると推定する（図２Ｃ）。双方向性ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取りの開始マッピング位置は、ＳｐＣａｓ９の予測切断部位（ＰＡＭ配列の３ｂｐ前）に一致し、この方法が、ヌクレオチドレベル精度で切断位置を正確にマッピングする能力を実証する（図２Ｄ）。総合すると、これらの結果は、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑがＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑと比較して、より高い信号対雑音比を有することを実証しており、これがゲノムワイドオフターゲット部位を同定するその高感度の原因である可能性が高い。

実施例３．ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑと細胞ベースのオフターゲット判定法の直接比較
本発明者らは次に、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑの性能を、ゲノムワイドオフターゲット変異同定に現在利用可能な最も高感度の細胞ベースのアプローチの１つである、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑと比較した³⁰。最初の比較では、本発明者らは、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑを用いて、以前、２つの異なるヒト細胞系にわたりＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって特徴付けられていた、標準的な非反復配列を標的とする６つの異なるｇＲＮＡを有するＳｐＣａｓ９を評価した。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑは、これらの６つの様々なｇＲＮＡのオフターゲット切断部位の可変数を同定し、それは２１程度の少数から１２４程度の多数に至る数であり（図３Ａ；ＥＭＸ１標的化実験の１つの複製の例示的データは下の表２に示される；ＥＭＸ１標的部位配列：ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＮＧＧ（配列番号２））、ヒトゲノム全体に分布する（図３Ｂ）。重要なことには、６つのｇＲＮＡの全てで、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑは、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって以前に見いだされたのよりも多くのオフターゲット部位を同定し、本発明者らが、以前ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑを用いてオフターゲット部位を同定できなかった、ＲＮＦ２を標的化するｇＲＮＡなどが挙げられる。６つのｇＲＮＡのうち４つでは、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑは、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって同定された全てのオフターゲット部位を検出し（図３Ｃ）、他の２つのｇＲＮＡでは、それぞれ１つのオフターゲット以外は全て検出した（図３Ｃ）。これらの実験のＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑデータのより詳細な調査は、実際に、これら２つのオフターゲット部位に対するいくつかの支持的な読取りの証拠を明らかにしたが、本発明者らのこれらの実験における検出の統計学的閾値を満たすのに十分な数ではなかった。さらに、予期されたように、これら２つの非検出部位は、本発明者らのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験における検出の端にあった。総合すると、これらの知見もまた、本発明者らがＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ配列決定深度を適度に増加させたなら、これら２つのオフターゲット部位が検出されたであろうことを示唆する。

ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑのより難易度の高い試験を提供するために、本発明者らはまた、反復配列を標的化する４つの追加的なｇＲＮＡを有するＳｐＣａｓ９をプロファイリングしたが、これは以前はＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって特徴付けられていた。それらの標的の反復的性質により、これらの４つのｇＲＮＡは、ヒトゲノムにおいて比較的多数の厳密に一致する部位を有し（表１）、当然のことながら、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって、ヒト細胞において多数のオフターゲット効果を誘導することが示されている³⁰。予測されたように、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑは、４つのｇＲＮＡのそれぞれについて、４９６〜２５０３の範囲の数のより多くのオフターゲット部位を同定し（図３Ａおよび表２）、ヒトゲノム全体に分布していた（図３Ｂ）。これらには、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験によって以前に同定された３６４個のオフターゲット部位のうち、３５３個（図３Ｃ）が含まれていた。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑで見いだされたが、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑでは同定されなかった１１部位のうち９部位については、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑデータに支持的な読み取りの証拠が認められ得たが、統計的カットオフのために十分に高い数値でなく、より大きな読み取り深度が、これらの部位の検出を可能にすることが再度示唆される。

次に本発明者らは、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑを用いて、以前に細胞ベースのＨＴＧＴＳ法により特徴付けられているＳｐＣａｓ９および２つのｇＲＮＡをプロファイリングした。これらの実験は、（ＥＭＸ１およびＶＥＧＦＡ遺伝子中の部位を標的化する）双方のｇＲＮＡについて、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑが、ＨＴＧＴＳによって以前に同定された５３個のオフターゲット部位のうち５０個（９４％）を見いだしたことを明らかにした（図３Ｅ）。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって検出されなかった３つのＨＴＧＴＳ部位のうち、２つは追加の反復試験が実施された際に見いだされ、３つめは低いＨＴＧＴＳスコアを有し、これらの３つの部位が、より大きなＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ配列決定深度によって検出されるであろうことが示唆される。重要なことには、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑはまた、ＨＴＧＴＳによって以前に同定されたよりもはるかにより多数のオフターゲット部位を見いだした（図３Ｄ）。

実施例４．ヒト細胞内でＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって同定されたオフターゲット部位の変異
本発明者らの実験によって提起された重要な疑問は、（ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑまたはＨＴＧＴＳではなく）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって、生体外で同定された新規のオフターゲット切断部位が、実際にＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体によって細胞内で変異しているかどうかである。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑとＧＵＩＤＥ−ｓｅｑの双方で検出されたオフターゲット部位の多くが、高いＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ配列決定読み取り数を有することを考慮すると（図４Ａ）、これはＧＵＩＤＥ−ｓｅｑが、生体外で効率的に切断される部位を主に検出することを強く示唆する。対照的に、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑのみによって見いだされるオフターゲット部位は、より低いＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数を有し（図４Ａ）、これらがより低い頻度で切断されるため、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって見逃される可能性があることが示唆される。これが正しいとすれば、本発明者らは、標準的な標的化アンプリコン配列決定法を用いて細胞内のこれらの部位を検証することは困難であると予測するが、これは、次世代配列決定法の誤り率がインデル変異検出の床（ｆｌｏｏｒ）を約０．１％にするからである。

ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑのみによって明らかにされた（しかし、本発明者らの元のＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験では検出されなかった）新規のオフターゲット部位が、ヒト細胞内で切断されるかどうかを判定するために、本発明者らは、細胞ベースのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験から得られたゲノムＤＮＡを使用して、オフターゲットＣａｓ９切断の証拠としての標識組み込みを探すことで、高深度の標的化アンプリコン配列決定を実施し得ると推論した（図４Ｂ）。このストラテジーは、ディープシーケンシングに伴うインデル誤り率の問題を回避するが、これは、標識組み込みが、無視できるバックグラウンド頻度で起こるからである。この標的化標識組み込み配列決定アプローチを用いて、本発明者らは、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって見いだされた（しかしＧＵＩＤＥ−ｓｅｑでは見いだされなかった）合計９８のオフターゲット部位をＳｐＣａｓ９を用いて、ＥＭＸ１およびＶＥＧＦＡ部位１ｇＲＮＡについて調べた。本発明者らは、オンターゲット部位と比較して、一連のＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数および／またはミスマッチ数を有する部位を選択した。標識組み込みアッセイの陽性対照として、本発明者らは、可変ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取り数を示してＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑの双方によって見いだされる、オフターゲット部位のより小さなセットもまた選択した。標的化アンプリコン配列決定法は、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ読み取り数と良好に相関する頻度で、対照オフターゲット部位の全てにおけるｄｓＯＤＮ標識の検出を明らかにした（図４Ｃおよび４Ｄ）。注目すべきことに、本発明者らはまた、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ〜によってのみ同定された９８個の新しいオフターゲット部位のうち２４個で、ｄｓＯＤＮタグの組込みを予想どおりの低範囲（０．００３〜０．２％）の頻度で検出した（図４Ｃ〜Ｅ）。これらの２４個の標識組込みの位置は全て、プロトスペーサー相補性領域内の予測された位置にマッピングされ、これはＰＡＭ配列から３ｂｐ離れており、真正のオフターゲット切断部位に相当する部位に一致する（図４Ｆ）。

実施例５．ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって発見された参照ゲノム非依存性オフターゲット部位
単一ＤＮＡ分子からのＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取りの各対は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ切断部位の両側からの配列をもたらすので、本発明者らは、この方法を用いて、参照ゲノム配列なしでもオフターゲット部位を同定し得ると推論した。この目的を達成するために、本発明者らは、エンドツーエンド方向で対末端の読み取りをマージしてオンターゲット部位と似ているオフターゲット切断部位を直接検索する、マッピング非依存性オフターゲット部位発見アルゴリズムを開発した（材料と方法を参照されたい）。このアルゴリズムを用いて、本発明者らは、平均で約９９．５％のＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ部位を同定し、１０個を超えるＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取りが、本発明者らの標準的な参照ベースのマッピングアルゴリズムによって検出された（図４Ｇ）。この結果は、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑを参照非依存様式で用いて、そのゲノム配列が良好に特性解析されておらず、および／または高い遺伝的変動性（例えば、野生の非同系交配種）を示す、生物のオフターゲット切断部位を同定し得ることを実証する。

実施例６．ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑオフターゲット部位とＳＮＰとの関連性
ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑなどのインビトロ法は、スループットがより高く、再現性が容易であるため、任意の所与のＣａｓ９／ｇＲＮＡヌクレアーゼに対して、患者特異的オフターゲットプロファイルを定義する機会を提供する。以前の研究は、オフターゲット切断に影響を及ぼすＳＮＰの単一の例を同定したＡ³⁶。遺伝的差異がヌクレアーゼ誘導オフターゲット切断に影響し得るかどうかをより広く試験するために、本発明者らは、ヒトＨＥＫ２９３ゲノムＤＮＡおよびＵ２ＯＳゲノムＤＮＡ上で本発明者らが既に評価した６つのｇＲＮＡを用いて、ヒトＫ５６２ゲノムＤＮＡ上で追加的なＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ実験を実施した（ＨＥＫ２９３上の３つのｇＲＮＡおよびＵ２ＯＳ上の３つのｇＲＮＡ）。これらのｇＲＮＡの多くのオフターゲット部位は、試験した双方の細胞型由来のＤＮＡ上で、相関するＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ読み取りカウントを示したが、本発明者らは、１つの細胞型または他の細胞型においてのみ優先的に切断される、５５個の部位もまた観察した（図５Ａ）。調査は、８個のオフターゲット切断部位が、非参照一塩基多型（ＳＮＰ）を保有することを明らかにし、これが、切断効率における、これらの観察された細胞型特異的差異のいくつかを説明し得る（図５Ｂ）。興味深いことに、これらのＳＮＰは、プロトスペーサー相補性領域内ならびにＰＡＭ内で観察されて、参照ゲノム配列と比較して、部位の切断を増加または減少させると予測された（図５Ｂ）。

ＳＮＰがオフターゲット部位で切断効率に影響を及ぼすように見える追加的な例を同定した後、本発明者らは次に、ＳＮＰがオフターゲット切断効率に影響を及ぼすと予測される頻度の推定を試みた。これを行うために、本発明者らは、本発明者らがＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによって評価した６つのｇＲＮＡ（標準的な非反復配列を標的化する）について本発明者らが検出した、１２４７個のオフターゲット部位の全てにおいて、１０００人ゲノムプロジェクト³⁷からの２５０４人の遺伝子型を試験した。本発明者らは、平均して、これらのオフターゲット部位の約２．５％で非参照遺伝的変異を見いだした（図５Ｃ）。集団レベルでは、本発明者らは、超母集団が、これらのオフターゲット部位の平均約２０％で、遺伝的変異を含むことを見いだした（図５Ｃ）。さらに、これらのオフターゲット部位の５０％は、１０００人ゲノムプロジェクトにおいて配列決定された少なくとも１つの個々の非参照遺伝的変異を含んだ（図５Ｃ）。これらの頻度は、最新バージョンのｄｂＳＮＰ³⁸に、約１億個の検証されたヒトＳＮＰが存在すれば、ヒトゲノムのＳｐＣａｓ９オフターゲット部位の約６９％にＳＮＰが存在するという予想に一致する。予期されたように、１０００人ゲノムプロジェクトの多様な個々の遺伝子型を考慮すると、本発明者らが調査したオフターゲット部位で観察されたミスマッチの範囲が増加する（図５Ｄ）。興味深いことに、オフターゲット部位ハプロタイプの約９％では、参照ゲノムと比較してミスマッチ数が減少し、これらの部位におけるオフターゲット切断リスクの潜在的増加が予測される（図５Ｅ）。総合すると、これらの結果は、オフターゲット分析に対する個々の遺伝的変異の重要性を強調し、個別化ゲノムワイドオフターゲットプロファイルを生成するために、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑがどのように使用されるかを強調する。

実施例７．例示的ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑプロトコル
本明細書に記載されるのは、複合ゲノムＤＮＡ混合物からＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼの切断部位を見いだすための生体外アッセイのための例示的プロトコルである。

材料
プロトコル１では、以下の材料を使用した。

ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑヘアピンアダプター
ｏＳＱＴ１２８８／５Ｐｈｏｓ／ＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣ／ｉｄｅｏｘｙＵ／ＡＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＧ^*Ｔ
アニーリングプログラム：９５℃で５分間、−１℃／分で７０サイクル、４℃で保持する。

投入定量化および剪断
１．ＣｏｖａｒｉｓＳ２の標準操作プロトコルに従って、ゲノムＤＮＡを３００ｂｐの平均長さに剪断する。
２．剪断されたＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従って１．８×ＡｍｐｕｒｅＸＰＳＰＲＩビーズを用いて洗浄し、３５μｌの１×ＴＥ緩衝液で溶出する。

末端修復

２．１．７×ＳＰＲＩクリーンアップ（１２０μｌのＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ）、４２μｌの１×ＴＥ緩衝液で溶出する。

Ａテーリング

２．１．８×ＳＰＲＩクリーンアップ（９０μｌのＰＥＧ／ＮａＣｌＳＰＲＩ溶液）、３０μｌの１×ＴＥ緩衝液中で溶出する。

アダプターライゲーション

２．１×ＳＰＲＩクリーンアップ（５０μｌのＰＥＧ／ＮａＣｌＳＰＲＩ溶液）、３０μｌの１×ＴＥ緩衝液中で溶出する。

酵素処理
λエキソヌクレアーゼ／エキソヌクレアーゼＩ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））処理

２．１．８×ＳＰＲＩクリーンアップ（９０μｌのＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ）、４０μｌの１×ＴＥ緩衝液で溶出する。

ＵＳＥＲ／Ｔ４ＰＮＫ処理

２．１．８×ＳＰＲＩクリーンアップ（９０μｌのＰＥＧ／ＮａＣｌＳＰＲＩ溶液）、３５μｌの１×ＴＥ緩衝液中で溶出する。

分子内環状化

２．１×ＳＰＲＩクリーンアップ（１００μｌのＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ）、３８μｌの１×ＴＥ緩衝液で溶出する。

Ｐｌａｓｍｉｄ−ＳａｆｅＡＴＰ依存性ＤＮａｓｅ処理

２．１×ＳＰＲＩクリーンアップ（５０μｌのＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ）、１５μｌの１×ＴＥ緩衝液で溶出する。

Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを用いた生体外消化

２．１×ＳＰＲＩクリーンアップ（１００μｌのＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ）、４２μｌの１×ＴＥ緩衝液で溶出する。

Ａテーリング

アダプターライゲーション

２．１×ＳＰＲＩクリーンアップ（５０μｌのＰＥＧ／ＮａＣｌＳＰＲＩ溶液）、４７μｌの１×ＴＥ緩衝液中で溶出する。

ＵＳＥＲ酵素処理
１．３μｌのＵＳＥＲ酵素（１Ｕ／μｌ）をビーズと共に、（ステップ２２からの）アダプターにライゲートされたＤＮＡに添加する。
２．０．７×ＳＰＲＩクリーンアップ（３５μｌのＰＥＧ／ＮａＣｌＳＰＲＩ溶液）、２０μｌの１×ＴＥ緩衝液中で溶出する。

ＰＣＲ

２．０．７×ＳＰＲＩクリーンアップ（３５μｌのＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ）、３０μｌの１×ＴＥ緩衝液で溶出する。

ライブラリー定量化
１．製造会社の使用説明書に従って、ＱＸ２００ＤｒｏｐｌｅｔＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ装置上で、ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のためのｄｄＰＣＲライブラリー定量化キットを使用して、ライブラリーを定量化する。代案の定量法は、製造会社の使用説明に従って、次世代配列決定のためのＫＡＰＡライブラリー定量化キット（ＫＡＰＡＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する。

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２０．Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔａｌ．ＯｒｔｈｏｇｏｎａｌｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｗｉｔｈａｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅＣａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１−４（２０１５）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３９０
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３０．Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑｅｎａｂｌｅｓｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｃｌｅａｖａｇｅｂｙＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓｎｕｃｌｅａｓｅｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３３，１８７−１９７（２０１５）．
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４１．Ｌｉ，Ｈ．ＡｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｆｒａｍｅｗｏｒｋｆｏｒＳＮＰｃａｌｌｉｎｇ，ｍｕｔａｔｉｏｎｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｍａｐｐｉｎｇａｎｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｅｓｔｉｍａｔｉｏｎｆｒｏｍｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２７，２９８７−２９９３（２０１１）．
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その他の実施形態
本発明は、その詳細な説明を参照して説明されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲の例示を意図し、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないと理解される。その他の態様、利点、および修正は、以下の請求項の範囲内である。

Claims

共有結合的に閉じた環状化二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）断片のライブラリーを作成する方法であって、
ｄｓＤＮＡを含んでなるサンプルを提供するステップと；
前記ｄｓＤＮＡを定義された平均長さまで無作為に剪断し、ｄｓＤＮＡ断片の集団を提供するステップと；
任意選択的に、末端ライゲーションのために前記断片を調製するステップと；
回文配列を含んでなるループ配列に隣接するまたはその中にある、少なくとも１つのデオキシウリジンを含んでなる、ステムループアダプターを前記断片の末端にライゲートして、ライゲートされた直鎖ｄｓＤＮＡ断片の集団を作成するステップと；
前記ライゲートされた直鎖ｄｓＤＮＡ断片の集団をエキソヌクレアーゼに接触させ、末端がライゲートされていないあらゆる残留直鎖断片を分解し、ライゲートされた直鎖ｄｓＤＮＡ断片の精製集団を生成するステップと；
前記ライゲートされた直鎖ｄｓＤＮＡ断片の精製集団を、前記デオキシウリジンにおいて前記ライゲートされたｄｓＤＮＡ断片にニックを生じる酵素に接触させ、３’末端リン酸を除去するステップと；
分子内ライゲーションおよび環状化ｄｓＤＮＡ分子形成を促進するのに十分な条件下で、前記ニックの入った直鎖ｄｓＤＮＡ断片をインキュベートするステップと；
エキソヌクレアーゼを使用して、前記ライゲートされた環状化ｄｓＤＮＡ断片を精製し、それによって共有結合的に閉じた完全環状化ｄｓＤＮＡ断片のライブラリーを作成するステップと
を含んでなる、方法。
前記共有結合的に閉じた完全環状化ｄｓＤＮＡ断片のライブラリーを、遺伝子操作されたヌクレアーゼに接触させ、部位特異的切断を誘導するステップと；
任意選択的に、末端ライゲーションのための切断断片を調製するステップと；
前記切断部位において、少なくとも１つのデオキシウリジンを含んでなる配列決定アダプターを、ＰＣＲプライミングまたは配列決定法における使用に適合するプライマー部位にライゲートするステップと；
前記ライブラリーを前記デオキシウリジンにおいてニックを生じる酵素に接触させるステップと；
前記配列決定アダプターに結合するプライマーを使用して、得られた断片を配列決定するステップと
をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子中の遺伝子操作されたヌクレアーゼ誘導二本鎖切断部位を含んでなる、断片のライブラリーを作成する方法であって、
ｄｓＤＮＡを提供するステップと；
前記ｄｓＤＮＡを規定の平均長さに無作為に剪断するステップと；
任意選択的に、前記剪断されたｄｓＤＮＡを末端修復および／またはＡテーリングするステップと；
ステムループアダプターをライゲートするステップであって、好ましくは、
約１２ヌクレオチドの第１の領域と、
１つまたは複数のループを形成して分子内ライゲーションのための回文配列に隣接する、１つのデオキシウリジンヌクレオチドを含んでなる、好ましくは約５ヌクレオチドの第２の領域と、
１つの追加的なヌクレオチドがある前記第１の領域に相補的な第３の領域と
を含んでなる、ステップと；
前記ライブラリーを前記デオキシウリジンにおいて前記ｄｓＤＮＡにニックを生じる酵素に接触させ、末端３’リン酸を除去するステップと；
分子内ライゲーションおよび環状化ｄｓＤＮＡ分子を含んでなるサンプル形成を促進するのに十分な条件下で、前記ニックの入ったｄｓＤＮＡをインキュベートするステップと；
前記サンプルを、環状でないあらゆるＤＮＡ分子を分解するのに十分な１つまたは複数のエキソヌクレアーゼに接触させるステップと；
前記サンプルを遺伝子操作されたヌクレアーゼで処理し、部位特異的切断を誘導するステップと；
任意選択的に、得られた末端を末端修復し、次にＡテーリングするステップと；
配列決定アダプターであって、
約１２ヌクレオチドの第１の領域と、
１つまたは複数のヘアピンループプライマー部位を形成してＰＣＲプライミングおよび／または配列決定法における使用に適合するプライマー部位を含んでなる、約４０ヌクレオチドの第２の領域と、
１つの追加的なヌクレオチドがある前記第１の領域に相補的な約１３ヌクレオチドの第３の領域と、
前記第２および第３の領域の間の１つのデオキシウリジンヌクレオチドと
を含んでなる配列決定アダプターをライゲートするステップであって、ヌクレアーゼによって切断された前記ＤＮＡ断片が、末端にライゲートされた配列決定アダプターを有する、集団を生成するステップと；
それによってヌクレアーゼ切断アダプターにライゲートされた断片が濃縮されたライブラリーを作成するステップと
を含んでなる、方法。
前記ｄｓＤＮＡを無作為に剪断するステップが、前記ｄｓＤＮＡを約２００〜５００ｂｐ、好ましくは約３００ｂｐの平均長さに無作為に剪断するステップを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
末端がライゲートされていないあらゆる残留直鎖断片を分解するのに使用される前記エキソヌクレアーゼが、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩ、およびＡＴＰ依存性エキソヌクレアーゼの１つまたは複数を含んでなるヌクレアーゼの混合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
末端ライゲーションのために前記断片を調製するステップが、前記剪断されたＤＮＡの末端修復および／またはＡテーリングの片方または双方を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記デオキシウリジンにおいてＤＮＡにニックを生じる酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの片方または双方を含んでなり、前記末端３’リン酸を除去する前記酵素が、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）または合成ＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記遺伝子操作されたヌクレアーゼが、オンおよび／またはオフターゲット部位を切断する、請求項２または３に記載の方法。
前記遺伝子操作されたヌクレアーゼが、平滑型またはねじれ型／オーバーハング末端を誘導する、請求項２または３に記載の方法。
前記ライブラリーを酵素に接触させて、前記配列決定アダプター中の前記デオキシウリジンにおいてニックを生じさせるステップと；
任意選択的にＰＣＲ増幅を用いて、アダプターにライゲートされた断片を濃縮し、完全配列決定アダプターに追加するステップと；
配列決定アダプターを保有する断片を配列決定するステップと
をさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。
前記ＤＮＡにニックを生じる前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
前記遺伝子操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ＭｅｇａＴＡＬ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーターエフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣａｓＲＮＡ誘導されるヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＧＮ）、およびＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合タンパク質からなる群から選択される、請求項２または３に記載の方法。
前記ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＧＮがＣａｓ９またはＣｐｆ１である、請求項１３に記載の方法。
前記サンプルを遺伝子操作されたヌクレアーゼで処理して部位特異的切断を誘導するステップが、前記サンプルを特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体形成するＣａｓ９ヌクレアーゼに接触させるステップを含んでなる、請求項２または３に記載の方法。
前記遺伝子操作されたヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼであり、前記方法が、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼを前記ゲノム中の標的配列に誘導するガイドＲＮＡを使用するステップもまた含む、請求項１５に記載の方法。
前記プライマー部位が、次世代配列決定プライマー結合配列、無作為化されたＤＮＡバーコードまたは固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含んでなる、請求項２または３に記載の方法。
前記断片が、末端ライゲーションのために調製される、請求項１に記載の方法。
前記切断断片が、末端ライゲーションのために調製される、請求項２に記載の方法。
前記得られた末端を末端修復して、次にＡテーリングするステップをさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。