ES2713503T3 - Uso de nucleasas FOKI guiadas por ARN (RFN) para aumentar la especificidad para la edición del genoma guiada por ARN - Google Patents

Uso de nucleasas FOKI guiadas por ARN (RFN) para aumentar la especificidad para la edición del genoma guiada por ARN Download PDF

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Abstract

Una proteína de fusión de nucleasa FokI guiada por ARN (RFN), que comprende una secuencia de dominio catalítico de FokI fusionada al extremo amino de una proteína 9 (dCas9) asociada a CRISPR catalíticamente inactiva.

Description

DESCRIPCION
Uso de nucleasas FOKI guiadas por ARN (RFN) para aumentar la especificidad para la edicion del genoma guiada por ARN
REIVINDICACION DE PRIORIDAD
Esta solicitud reivindica la prioridad de acuerdo con el Artfculo 35 USC §119(e) de las Solicitudes de patente de Estados Unidos N.° de Serie 61/799.647, presentada el 15 de marzo de 2013; 61/838.178, presentada el 21 de junio de 2013; 61/838.148, presentada el 21 de junio de 2013, y 61/921.007, presentada el 26 de diciembre de 2013. INVESTIGACION O DESARROLLO CON PATROCINIO FEDERAL
Esta invencion se realizo con el apoyo del Gobierno gracias a la Subvencion N.° DP1 GM105378 otorgada por los National Institutes of Health. El Gobierno posee ciertos derechos sobre la presente invencion.
CAMPO TECNICO
Metodos para aumentar la especificidad de la edicion del genoma guiada por ARN, por ejemplo, la edicion utilizando sistemas CRISPR/Cas9, utilizando nucleasas FokI guiadas por ARN (RFN), por ejemplo, protefnas de fusion FokldCas9.
ANTECEDENTES
Trabajos recientes han demostrado que los sistemas de repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)/asociados a CRISPR (Cas) (Wiedenheft et al., Nature 482, 331-338 (2012); Horvath et al., Science 327, 167-170 (2010); Terns et al., Curr Opin Microbiol 14, 321-327 (2011)) puede servir como base para la edicion del genoma en bacterias, levaduras y celulas humanas, asf como in vivo en organismos completos tales como moscas de la fruta, pez cebra y ratones (Wang et al., Cell 153, 910-918 (2013); Shen et al., Cell Res (2013); Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c); Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013); Gratz et al., Genetics 194(4):1029-35 (2013)). La nucleasa Cas9 de S. pyogenes (en lo sucesivo aquf, simplemente Cas9) puede guiarse a traves de la complementariedad de los pares de bases entre los primeros 20 nucleotidos de un ARNg modificado y la cadena complementaria de una secuencia de ADN genomica diana de interes que se encuentra junto a un motivo adyacente de protoespaciador (PAM), por ejemplo, un PAM que empareja la secuencia (Shen et al., Cell Res (2013); Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c); Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013); Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)). Los estudios realizados in vitro (Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)), en bacterias (Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013)) y en celulas humanas (Cong et al., Science 339, 819-823 (2013)) han demostrado que la escision mediada por Cas9 puede, en algunos casos, suprimirse por emparejamientos incorrectos unicos en la interfaz del sitio ARNg/diana, particularmente en los ultimos 10-12 nucleotidos (nt) localizados en el extremo 3' de la region de complementariedad del ARNg de 20 nucleotidos (nt).
El documento WO 2012/093833 A2 divulga una protefna de fusion que tiene un dominio efector TAL (de tipo activador de la transcripcion) (TALE) y un dominio de escision de nucleotidos.
Fu et al., Methods in Enzymology; vol. 546, Elsevier, NL, Paginas 21-45 divulgan ARN gufa truncados.
El documento WO 2015/035162 A2 divulga una especificidad mejorada de Cas9.
RESUMEN
Muchos estudios han demostrado que las nucleasas CRISPR-Cas pueden tolerar hasta cinco emparejamientos incorrectos y seguir escindiendose; es diffcil predecir los efectos de un solo emparejamiento incorrecto o una combinacion de emparejamientos incorrectos en la actividad. En conjunto, estas nucleasas pueden mostrar efectos significativos inespecfficos, pero puede ser diffcil predecir estos sitios. En el presente documento se describen metodos para aumentar la especificidad de la edicion del genoma utilizando el sistema CRISPR/Cas, por ejemplo, utilizando nucleasas FokI guiadas por ARN (RFN), por ejemplo, protefnas de fusion basadas en FokI-Cas9 o FokI-dCas9.
En un primer aspecto, la invencion proporciona protefnas de fusion FokI-dCas9, que comprenden una secuencia de dominio catalftico de FokI fusionada al extremo amino de una protefna 9 asociada a CRISPR catalfticamente inactiva (dCas9), opcionalmente con un conector intermedio, por ejemplo, un conector de 2-30 aminoacidos, por ejemplo, 4­ 12 aminoacidos, por ejemplo, Gly4Ser. En algunas formas de realizacion, el dominio catalftico de FokI comprende los aminoacidos 388-583 o 408-583 de SEQ ID NO:4. En algunas formas de realizacion, dCas9 comprende mutaciones en D10, E762, H983 o D986; y en H840 o N863; por ejemplo, en: (i) D10A o D10N; y (ii) H840A, H840Y o H840N. En otro aspecto, la invencion proporciona acidos nucleicos que codifican estas protefnas de fusion, un vector que comprende los acidos nucleicos, y celulas huesped que albergan o expresan los acidos nucleicos, vectores o protefnas de fusion.
En otro aspecto, la invencion proporciona metodos para inducir una rotura especffica de secuencia en una molecula de ADN bicatenario, por ejemplo, en una secuencia genomica en una celula, comprendiendo el metodo expresar en la celula, o poner en contacto la celula con, la protefna de fusion FokI-dCas9 descrita en el presente documento, y:
(a) dos ARN gufa individuales, en los que cada uno de los dos ARN gufa individuales incluye secuencias que son complementarias cada una con una cadena de la secuencia diana, de tal forma que el uso de ambos ARN gufa da como resultado el direccionamiento de ambas cadenas (es decir, un solo ARN gufa se dirige a una primera cadena, y el otro ARN gufa se dirige a la cadena complementaria), y FokI corta cada cadena dando como resultado un par de muescas en las cadenas de ADN opuestas, creando de este modo una rotura bicatenaria, o
(b) un ARNtracr y dos ARNcr en los que cada uno de los dos ARNcr incluye secuencias que son complementarias con una cadena de la secuencia diana, de tal forma que el uso de ambos ARNcr da como resultado el direccionamiento a ambas cadenas (es decir, un ARNcr se dirige a una primera cadena, y el otro ARNcr se dirige a la cadena complementaria), y FokI corta cada cadena dando como resultado un par de muescas en las cadenas de ADN opuestas, creando de este modo una rotura bicatenaria.
En otro aspecto, la invencion proporciona metodos para aumentar la especificidad de la edicion del genoma guiada por ARN en una celula, comprendiendo el metodo poner en contacto la celula con una protefna de fusion de nucleasa FokI guiada por ARN (RFN) de la invencion.
El metodo puede comprender ademas expresar en la celula, o poner en contacto la celula con,
(a) dos ARN gufa individuales, en los que cada uno de los dos ARN gufa individuales incluye secuencias que son complementarias cada una con una cadena de la secuencia diana, de tal forma que el uso de ambos ARN gufa da como resultado el direccionamiento de ambas cadenas (es decir, un solo ARN gufa se dirige a una primera cadena, y el otro ARN gufa se dirige a la cadena complementaria), y FokI corta cada cadena dando como resultado un par de muescas en las cadenas de ADN opuestas, creando de este modo una rotura bicatenaria, o
(b) un ARNtracr y dos ARNcr en los que cada uno de los dos ARNcr incluye secuencias que son complementarias con una cadena de la secuencia diana, de tal forma que el uso de ambos ARNcr da como resultado el direccionamiento a ambas cadenas (es decir, un ARNcr se dirige a una primera cadena, y el otro ARNcr se dirige a la cadena complementaria), y FokI corta cada cadena dando como resultado un par de muescas en las cadenas de ADN opuestas, creando de este modo una rotura bicatenaria.
En algunas formas de realizacion, las dos secuencias genomicas diana (es decir, las secuencias con las que las regiones de complementariedad diana del ARNcr o los ARN gufa individuales son complementarios) estan separadas por 10-20 pares de bases, preferiblemente separadas por 13-17 pares de bases.
En algunas formas de realizacion, se induce una mutacion indel entre las dos secuencias diana.
En algunas formas de realizacion, se aumenta la especificidad de la edicion del genoma guiada por ARN en una celula.
A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen los mismos significados que los entendidos comunmente por un experto habitual en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Los metodos y materiales se describen en el presente documento para su uso en la presente invencion; tambien pueden usarse otros metodos y materiales adecuados conocidos en la tecnica. Los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos. En caso de conflicto, prevalecera la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones.
Otras caracterfsticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y las figuras, y de las reivindicaciones.
DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Figura 1: Esquema que ilustra un complejo ARNg/nucleasa Cas9 unido a su sitio de ADN diana. Las tijeras indican los puntos de escision aproximados de la nucleasa Cas9 en el sitio diana del ADN genomico. Se ha de apreciar que la numeracion de los nucleotidos en el ARN gufa avanza de manera inversa de 5' a 3'.
Figura 2A: Esquema que ilustra la razon para truncar la region de complementariedad 5' de un ARNg. Lfneas de color gris gruesas = sitio de ADN diana, estructura de lfnea de color gris oscuro fina = ARNg, ovalo de color gris = nucleasa Cas9, las lfneas de color negro indican el emparejamiento de bases entre el ARNg y el sitio de ADN diana. Figura 2B: Vision general esquematica del ensayo de alteracion de EGFP. La reparacion de roturas bicatenarias mediadas por Cas9 dirigida en un unico gen indicador EGFP-PEST integrado por reparacion mediada por NHEJ propensa a errores conduce a mutaciones de cambio de marco de lectura que alteran la secuencia codificante y la perdida asociada de fluorescencia en las celulas.
Figuras 2C-F: Actividades de RGN que albergan ARNsg que llevan (C) emparejamientos incorrectos individuales, (D) emparejamientos incorrectos dobles adyacentes, (E) emparejamientos incorrectos dobles con separacion variable, y (F) aumento del numero de emparejamientos incorrectos adyacentes sometidos a prueba en tres sitios diana diferentes en la secuencia genica indicadora de EGFP. Se muestran las actividades medias de las replicas (veanse Metodos en lfnea), normalizadas con respecto a la actividad de un ARNg perfectamente emparejado. Las barras de error indican errores estandar de la media. Las posiciones incorrectamente emparejadas en cada ARNg se resaltan en gris en la siguiente cuadrfcula. Las secuencias de los tres sitios diana de EGFp fueron las siguientes:
EGFP Sitio 1 GGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGG (SEQ ID NO:1) EGFP Sitio 2 GATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGG (SEQ ID NO:2)
EGFP Sitio 3 GGTGGTGCAGATGAACTTCAGGG (SEQ ID NO:3)
Figura 2G: Los emparejamientos incorrectos en el extremo 5' del ARNg hacen que CRISPR/Cas sea mas sensible a los emparejamientos incorrectos en 3'. El par de bases de los ARNg de Watson-Crick entre el ARN y el ADN con la excepcion de las posiciones indicadas con una "m" que estan emparejadas incorrectamente usando la transversion de Watson-Crick (es decir, EGFP Sitio N.° 2 M18-19 se empareja incorrectamente cambiando el ARNg a su companero de Watson-Crick en las posiciones 18 y 19. Aunque las posiciones cerca de 5' del ARNg son generalmente muy bien toleradas, los emparejamientos en estas posiciones son importantes para la actividad de la nucleasa cuando otros residuos estan emparejados incorrectamente. Cuando las cuatro posiciones estan emparejadas incorrectamente, la actividad de la nucleasa ya no es detectable. Esto demuestra ademas que los emparejamientos en estas posiciones 5' pueden ayudar a compensar los emparejamientos incorrectos en otras posiciones 3' diferentes. Se ha de tener en cuenta que estos experimentos se realizaron con una version de Cas9 no optimizada por codones que puede mostrar niveles absolutos mas bajos de actividad de nucleasa en comparacion con la version optimizada por codones.
Figura 2H: Eficiencia de las actividades de nucleasa Cas9 dirigidas por los ARNg que tienen regiones de complementariedad de longitud variable que van desde 15 a 25 nt en un ensayo de alteracion de U2OS EGFP basado en celulas humanas. La expresion de un ARNg del promotor U6 requiere la presencia de un G 5' y, por lo tanto, solo fue posible evaluar los ARNg que albergaban ciertas longitudes de complementariedad con respecto al sitio de ADN diana (15, 17, 19, 20, 21, 23 y 25 nt).
Figura 3A: Eficiencia de la alteracion de EGFP en celulas humanas mediada por Cas9 y ARNg de longitud completa o corto para cuatro sitios diana en el gen indicador EGFP. Se muestran las longitudes de las regiones de complementariedad y los sitios de ADN diana correspondientes. Ctrl = ARNg de control que carece de una region de complementariedad.
Figura 3B: Eficiencias de las mutaciones indel dirigidas introducidas en siete dianas genicas endogenas humanas diferentes por estandar emparejado y tru-RGN. Se muestran las longitudes de las regiones de complementariedad y los sitios de ADN diana correspondientes. Las frecuencias de indel se midieron mediante el ensayo T7EI. Ctrl = ARNg de control que carece de una region de complementariedad.
Figura 3C: Secuencias de ADN de mutaciones indel inducidas por RGN que utilizan un tru-ARNt o un ARNg de longitud completa emparejado dirigido al sitio EMX1. La porcion del sitio de ADN diana que interactua con la region de complementariedad del ARNg se resalta en gris con la primera base de la secuencia PAM mostrada en minusculas. Las deleciones se indican con guiones resaltados en gris y las inserciones con letras en cursiva resaltadas en gris. El numero neto de bases eliminadas o insertadas y el numero de veces que se aislo cada secuencia se muestran a la derecha.
Figura 3D: Eficiencias de las alteraciones mediadas por HDR/ssODN precisas introducidas en dos genes humanos endogenos por estandar emparejado y tru-RGN. El % de HDR se midio utilizando un ensayo de digestion de restriccion con BamHI (veanse los Procedimientos experimentales para el Ejemplo 2). ARNg de control = vector promotor U6 vacfo.
Figura 3E: Las celulas U2OS.EGFP se transfectaron con cantidades variables de plasmidos de expresion de ARNg de longitud completa (parte superior) o plasmidos de expresion de tru-ARNg (parte inferior) junto con una cantidad fija de plasmido de expresion de Cas9 y despues se sometieron a prueba para determinar el porcentaje de celulas con una expresion de EGFP reducida. Los valores medios de experimentos duplicados se muestran con errores estandar de la media. Cabe apreciar que los datos obtenidos con tru-ARNg coinciden estrechamente con los datos de los experimentos realizados con plasmidos de expresion de ARNg de longitud completa en lugar de los plasmidos de tru-ARNg para estos tres sitios diana de EGFP.
Figura 3F: Se transfectaron las celulas U2OS.EGFP con una cantidad variable de plasmido de expresion de Cas9 junto con cantidades variables de plasmidos de expresion de ARNg de longitud completa (parte superior) o plasmidos de expresion de tru-ARNg (parte inferior) (cantidades determinadas para cada tru-ARNg de los experimentos de la Figura 3E). Los valores medios de experimentos duplicados se muestran con errores estandar de la media. Cabe apreciar que los datos obtenidos con tru-ARNg coinciden estrechamente con los datos de los experimentos realizados con plasmidos de expresion de ARNg de longitud completa en lugar de los plasmidos de tru-ARNg para estos tres sitios diana de EGFP. Los resultados de estas valoraciones determinaron las concentraciones de plasmidos utilizados en los ensayos de alteracion de EGFP realizados en los Ejemplos 1 y 2. Figuras 4A-C. Nucleasas FokI guiadas por ARN y un sistema de expresion de ARNg multiplex basado en CRISPR/protefna 4 (Csy4) subtipo YPest Cas (Cys4).
(a) Vision general esquematica de las nucleasas FokI guiadas por ARN. Dos protefnas de fusion FokI-dCas9 se reclutan en sitios diana adyacentes mediante dos ARNg diferentes para facilitar la dimerizacion de FokI y la escision del ADN.
(b) Vision general esquematica de un sistema de expresion de ARNg multiplex basado en Csy4. Dos ARNg (con cualquier nucleotido del extremo 5') se coexpresan en una sola transcripcion de un promotor U6 con cada ARNg flanqueado por sitios de reconocimiento de Csy4. Csy4 escinde y libera los ARNg de la transcripcion. El sitio de reconocimiento de Csy4 permanece en el extremo 3' del ARNg con una nucleasa Csy4 unida a ese sitio.
(c) Validacion del sistema multiplex, basado en Csy4. Dos ARNg dirigidos a sitios adyacentes en EGFP se expresaron en un unico transcrito de ARN utilizando el sistema basado en Csy4 en celulas U2OS.EGFP humanas junto con las nucleasas Csy4 y Cas9. Se muestran las secuencias de mutaciones indel inducidas en estas celulas. La secuencia natural se muestra en la parte superior con ambos sitios diana resaltados en gris y las secuencias PAM se muestran como texto subrayado. Las deleciones se indican mediante guiones sobre un fondo gris y las inserciones con letras minusculas sobre un fondo gris. A la derecha de cada secuencia, se especifican los tamanos de las inserciones (+) o las deleciones (A).
Figuras 5A-F. Diseno y optimizacion de nucleasas FokI guiadas por ARN.
(a) Ilustraciones esquematicas de una fusion ZFN, TALEN, FokI-dCas9 y una fusion dCas9-FokI.
(b) Cribado de las actividades de alteracion de EGFP de la fusion FokI-dCas9 con pares de ARNg dirigidos a semisitios en una de las dos orientaciones: PAM orientados hacia dentro (panel izquierdo) y PAM orientados hacia fuera (panel derecho). Los semisitios se separaron mediante secuencias espaciadoras de longitudes variables que varfan de 0 a 31 pb. La alteracion de EGFP se cuantifico mediante citometrfa de flujo, n = 1. Los datos correspondientes para la fusion dCas9-FokI y los mismos pares de ARNg se muestran en la Figura 5E.
(c) Evaluacion adicional de las actividades de alteracion de EGFP mediadas por FokI-dCas9 en sitios diana con semisitios orientados con sus PAM hacia fuera y con longitudes de espaciador que varfan de 10 a 20 pb. La alteracion de EGFP se cuantifico mediante citometrfa de flujo. Las barras de error indican errores estandar de la media (s.e.m.), n = 2.
(d) Valores medios de alteracion de EGFP de los datos de (c) agrupados de acuerdo con la longitud del espaciador. Las barras de error representan s.e.m.
(e) Estas graficas muestran los resultados de un cribado de la actividad de dCas9-FokI en el ensayo de alteracion de EGFP en las celulas U2OS.EGFP con 60 pares de ARNg con espaciados de 0-31 pb y PAM orientados hacia dentro y PAM orientados hacia fuera.
(f) Se muestran las secuencias de mutaciones inducidas por FokI-dCas9 en las celulas U2OS. La secuencia diana de 23 nt unida por Cas9 o FokI-dCas9 esta etiquetada en gris. El motivo adyacente de protoespaciador o secuencia PAM se marca en negrita con subrayado. Las deleciones estan marcadas con guiones sobre un fondo gris claro. Las inserciones se destacan en gris. El numero neto de bases insertadas o eliminadas se indica en una columna directamente a la derecha de las secuencias.
Figuras 6A-D. Se requiere la dimerizacion de las RFN FokI-dCas9 para una actividad de edicion del genoma eficiente.
(a) Actividades de alteracion de EGFP de dos pares de RFN evaluados en presencia de pares de ARNg correctamente dirigidos (a los sitios 47 y 81 de EGFP) y pares en los que uno u otro de los ARNg se ha reemplazado con otro ARNg dirigido a una secuencia no perteneciente a EGFP (en el gen VEGFA). La alteracion de EGFP se cuantifico mediante citometrfa de flujo. EGFP, protefna verde fluorescente mejorada; VEGFA, factor de crecimiento endotelial vascular A. Las barras de error representan errores estandar de la media (s.e.m), n = 3.
(b) Cuantificacion de las frecuencias de mutagenesis mediante el ensayo T7EI realizado con ADN genomico de las mismas celulas utilizadas en el ensayo de alteracion de EGFP de (a). Las barras de error representan s.e.m., n = 3.
(c) Actividades de RFN dirigidas a sitios en los genes APC, MLH1 y VEGFA. Para cada diana, se expreso conjuntamente FokI-dCas9 con un par de ARNg analogos, solo un ARNg para el semisitio "izquierdo", o solo un ARNg para el semisitio "derecho". Las tasas de mutagenesis se midieron mediante el ensayo T7E1. APC, poliposis adenomatosa coli; MLH1, homologo 1 de mutL; VEGFA, Factor de crecimiento endotelial vascular A. Las barras de error representan s.e.m., n = 3.
(d) Frecuencias de mutagenesis de RFN dirigidas a VEGFA sitio 1 en el sitio especffico y en cinco sitios inespecfficos (OT) conocidos previamente para uno de los ARNg utilizados para dirigirse a VEGFA sitio 1. Las frecuencias de mutacion se determinaron mediante secuenciacion profunda. Cada valor informado se determino a partir de una unica biblioteca de secuenciacion profunda preparada a partir de ADN genomico combinado de tres experimentos de transfeccion independientes. El valor mostrado para VEGFA sitio 1 especffico (marcado con un asterisco) es el mismo que se muestra en la Figura 4a a continuacion y solo se muestra aquf para facilitar la comparacion con los valores presentados en esta figura.
Figuras 7A-B. Las actividades mutagenicas de una Cas9 nickasa o FokI-dCas9 se expresan conjuntamente con un solo ARNg.
(a) Frecuencias de mutacion indel inducidas por FokI-dCas9 (barras de la izquierda) o Cas9 nickasa (barras centrales) en presencia de uno o dos ARNg dirigidos a seis sitios de genes humanos diferentes. Para cada diana genica, se evaluaron las frecuencias de indel con ambos ARNg, solo un ARNg para el semisitio "izquierdo", o solo el otro ARNg para el semisitio "derecho". Las frecuencias de mutacion se determinaron mediante secuenciacion profunda. Cada valor de frecuencia de indel informado se determino a partir de una unica biblioteca de secuenciacion profunda preparada a partir de ADN genomico combinado de tres experimentos de transfeccion independientes. VEGFA, factor de crecimiento endotelial vascular A; DDB2, protefna 2 de union a ADN especffica del dano; FANCF, grupo de complementacion F de la anemia de Fanconi; FES, oncogen de sarcoma felino; RUNX 1, factor 1 de transcripcion relacionado con Runt.
(b) Los datos de (a) se presentan como una reduccion de la frecuencia de indel comparando los valores obtenidos para cada sitio diana con un par de ARNg para cada uno de los experimentos con ARNg individuales o con el experimento de control (sin ARNg ni Cas9 nickasa o FokI-dCas9). Esta reduccion multiple se calculo tanto para FokI-dCas9 (barras de la izquierda en cada par, gris mas claro) como para Cas9 nickasa (barras de la derecha en cada par, gris mas oscuro).
Figuras 8A-C: Las Cas9 nickasas individuales pueden introducir mutaciones puntuales con altas eficiencias en sus sitios diana.
Frecuencias de diferentes mutaciones puntuales encontradas en cada posicion en los semisitios seleccionados por ARNg individuales para las dianas genicas (a) VEGFA, (b) FANCF y (c) RUNX1 en presencia de FokI-dCas9, Cas9 nickasa, o un control de tdTomato. Las frecuencias de mutacion se determinaron mediante secuenciacion profunda. Cada mutacion puntual informada se determino a partir de una unica biblioteca de secuenciacion profunda preparada a partir de ADN genomico combinado de tres experimentos de transfeccion independientes. Cabe apreciar que el ADN genomico utilizado para estos experimentos se aislo de las mismas celulas analizadas para detectar mutaciones indel en las Figuras 7A-B. VEGFA, factor de crecimiento endotelial vascular A; FANCF, grupo de complementacion F de la anemia de Fanconi; RUNX 1, factor 1 de transcripcion relacionado con Runt.
DESCRIPCION DETALLADA
Las nucleasas guiadas por ARN CRISPR (RGN) han emergido rapidamente como una plataforma facil y eficiente para la edicion del genoma. Aunque Marraffini y sus colegas (Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013)) realizaron recientemente una investigacion sistematica de la especificidad de RGN Cas9 en bacterias, las especificidades de las RGN en celulas humanas no se han definido ampliamente. Comprender el alcance de los efectos inespecfficos mediados por RGN en las celulas humanas y otras celulas eucariotas sera esencial si estas nucleasas se van a utilizar ampliamente para investigacion y aplicaciones terapeuticas. Los presentes inventores han usado un ensayo de indicador basado en celulas humanas para caracterizar la escision inespecffica de RGN basadas en Cas9. Los emparejamientos incorrectos sencillos y dobles se toleraron en grados variables dependiendo de su posicion a lo largo de la interfaz de ARN gufa (ARNg)-ADN. Las alteraciones inespecfficas inducidas por cuatro de seis RGN dirigidas a loci endogenos en celulas humanas se detectaron facilmente mediante el examen de sitios parcialmente mal emparejados. Los sitios inespecfficos identificados albergan hasta cinco emparejamientos incorrectos y muchos estan sometidos a mutagenesis con frecuencias comparables (o superiores) a las observadas en el sitio especffico deseado. Por lo tanto, las RGN son muy activas incluso con interfaces de ARN-ADN emparejadas de forma imperfecta en celulas humanas, un hallazgo que podrfa confundir su uso en investigacion y aplicaciones terapeuticas.
Los resultados descritos en el presente documento revelan que la preduccion del perfil de especificidad de cualquier RGN dada no es ni sencilla ni directa. Los experimentos de ensayo de indicador e Gf P muestran que los emparejamientos incorrectos sencillos y dobles pueden tener efectos variables sobre la actividad de RGN en celulas humanas que no dependen estrictamente de su posicion o posiciones dentro del sitio diana. Por ejemplo, en consonancia con los informes publicados previamente, las alteraciones en la mitad 3' de la interfaz de ARNg/ADN generalmente tienen mayores efectos que en la mitad 5' (Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)); sin embargo, las mutaciones sencillas y dobles en el extremo 3' a veces tambien parecen ser bien toleradas, mientras que las mutaciones dobles en el extremo 5' pueden disminuir considerablemente las actividades. Ademas, la magnitud de estos efectos para los emparejamientos incorrectos en cualquier posicion o posiciones dadas parece depender del sitio. El perfil completo de una gran serie de RGN con pruebas de todas las posibles sustituciones de nucleotidos (mas alla de las transversiones de Watson-Crick utilizadas en estos experimentos de indicador EGFP) puede ayudar a proporcionar informacion adicional sobre el rango de posibles dianas inespecfficas. A este respecto, el metodo de celulas bacterianas descrito recientemente de Marraffini y sus colegas (Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013)) o las metodologfas de seleccion de sitios de escision basada en bibliotecas combinatorias in vitro aplicadas previamente a ZFNs de Liu y sus colegas (Pattanayak et al., Nat Methods 8, 765-770 (2011)) podrfan ser utiles para generar conjuntos mas grandes de perfiles de especificidad de RGN.
A pesar de estos retos en la prediccion exhaustiva de las especificidades de RGN, fue posible identificar dianas inespecfficas de RGN de buena fe al examinar un subconjunto de sitios genomicos que diferfan del sitio especffico en uno a cinco emparejamientos incorrectos. En particular, en las condiciones de estos experimentos, las frecuencias de las mutaciones inducidas por RGN en muchos de estos sitios inespecfficos fueron similares (o superiores) a las observadas en el sitio especffico deseado, permitiendo la deteccion de mutaciones en estos sitios usando el ensayo T7EI (que, como se realiza en nuestro laboratorio, tiene un lfmite de deteccion fiable de ~2 al 5% de frecuencia de mutacion). Debido a que estas tasas de mutacion eran muy altas, fue posible evitar el uso de metodos de secuenciacion profunda requeridos previamente para detectar alteraciones inespecfficas inducidas por ZFN y TALEN de frecuencia mucho mas baja (Pattanayak et al., Nat Methods 8, 765-770 (2011); Perez et al., Nat Biotechnol 26, 808-816 (2008); Gabriel et al., Nat Biotechnol 29, 816-823 (2011); Hockemeyer et al., Nat Biotechnol 29, 731-734 (2011)). El analisis de la mutagenesis inespecffica de RGN en celulas humanas tambien confirmo las dificultades de predecir las especificidades de RGN; no todos los sitios inespecfficos con emparejamiento incorrecto sencillos y dobles muestran evidencia de mutacion, mientras que algunos sitios con hasta cinco emparejamientos incorrectos tambien pueden mostrar alteraciones. Ademas, los sitios inespecfficos de buena fe identificados no muestran ningun sesgo obvio hacia las diferencias de transicion o transversion con respecto a la secuencia diana deseada.
Aunque se observaron sitios inespecfficos para varias RGN, la identificacion de estos sitios no estaba completa ni a escala en todo el genoma. Para las seis RGN estudiadas, solo se examino un subconjunto muy pequeno del numero total mucho mayor de posibles secuencias inespecfficas en el genoma humano. Si bien el examen de un numero tan elevado de loci para detectar mutaciones inespecfficas mediante el ensayo T7EI no es una estrategia practica ni rentable, el uso de secuencias de alto rendimiento en estudios futuros podrfa permitir el interrogatorio de un mayor numero de sitios inespecfficos candidatos y proporcionar un metodo mas sensible para detectar mutaciones inespecfficas de buena fe. Por ejemplo, un enfoque de este tipo podrfa permitir la revelacion de sitios inespecfficos adicionales para las dos RGN para las cuales no se ha podido descubrir ninguna mutacion inespecffica. Ademas, una comprension mejorada tanto de las especificidades de RGN como de cualquier factor epigenomico (por ejemplo, metilacion del ADN y estado de la cromatina) que puede influir en las actividades de RGN en las celulas tambien puede reducir el numero de sitios potenciales que deben examinarse y, por lo tanto, hacer que las evaluaciones de todo el genoma de las dianas inespecfficas de RGN sean mas practicas y asequibles.
Se pueden usar varias estrategias para minimizar las frecuencias de mutaciones genomicas inespecfficas. Por ejemplo, la eleccion especffica del sitio diana de RGN se puede optimizar; dado que los sitios inespecfficos que difieren en hasta cinco posiciones del sitio diana previsto pueden mutarse de manera eficiente por RGN, la eleccion de sitios diana con un numero mfnimo de sitios inespecfficos, de acuerdo con lo juzgado por el recuento de emparejamientos incorrectos, parece poco probable que sea eficaz; tfpicamente existiran miles de posibles sitios inespecfficos que difieren en cuatro o cinco posiciones dentro de la region de complementariedad de ARN:ADN de 20 pb para cualquier RGN determinada dirigida a una secuencia en el genoma humano. Tambien es posible que el contenido de nucleotidos de la region de complementariedad de ARNg pueda influir en el rango de posibles efectos inespecfficos. Por ejemplo, se ha demostrado que un alto contenido de GC estabiliza los hfbridos de ARN:ADN (Sugimoto et al., Biochemistry 34, 11211-11216 (1995)) y, por lo tanto, tambien podrfa esperarse que haga mas estable y mas tolerante la hibridacion de ARNg/ADN genomico con respecto a los emparejamientos incorrectos. Se necesitaran experimentos adicionales con un mayor numero de ARNg para evaluar si, y como, estos dos parametros (numero de sitios con emparejamientos incorrectos en el genoma y la estabilidad del hfbrido de ARN:ADN) influiran en las especificidades de todo el genoma de las RGN. Sin embargo, es importante tener en cuenta que, incluso si se pueden definir dichos parametros predictivos, el efecto de la implementacion de tales directrices serfa restringir aun mas el rango de direccionamiento de las RGN.
Una estrategia general potencial para reducir los efectos inespecfficos inducidos por RGN podrfa ser reducir las concentraciones de ARNg y nucleasa Cas9 expresadas en la celula. Esta idea se sometio a prueba utilizando las RGN para los sitios diana 2 y 3 de VEGFA en celulas U2OS.EGFP; la transfeccion de menos plasmido de expresion de ARNg y Cas9 disminuyo la tasa de mutacion en el sitio especffico, pero no cambio apreciablemente las tasas relativas de mutaciones inespecfficas. De acuerdo con esto, tambien se observaron tasas altas de mutagenesis inespecffica en otros dos tipos de celulas humanas (celulas HEK293 y K562), a pesar de que las tasas absolutas de la mutagenesis especffica son mas bajas que en las celulas U2OS.EGFP. Por lo tanto, la reduccion de los niveles de expresion de ARNg y Cas9 en las celulas probablemente no proporcione una solucion para reducir los efectos inespecfficos. Ademas, estos resultados tambien sugieren que las altas tasas de mutagenesis inespecffica observadas en celulas humanas no son causadas por la sobreexpresion de ARNg y/o Cas9.
El hallazgo de que las RGN pueden inducir una mutagenesis inespecffica significativa en tres tipos de celulas humanas diferentes tiene implicaciones importantes para un uso mas amplio de esta plataforma de edicion del genoma. Para aplicaciones de investigacion, sera necesario considerar los efectos potencialmente confusos de las mutaciones inespecfficas a alta frecuencia, particularmente para los experimented que implican celulas cultivadas u organismos con tiempos de generacion lentos para los cuales el cruce de alteraciones no deseadas sera un desaffo. Una forma de controlar estos efectos podrfa ser utilizar multiples RGN dirigidas a diferentes secuencias de ADN para inducir la misma alteracion genomica, ya que los efectos inespecfficos no son aleatorios, sino que estan relacionados con el sitio de direccionamiento. Sin embargo, para aplicaciones terapeuticas, estos hallazgos indican claramente que las especificidades de las RGN deberan definirse y/o mejorarse cuidadosamente si estas nucleasas se van usar de manera segura a largo plazo para el tratamiento de enfermedades humanas.
Metodos para mejorar la especificidad
Como se muestra en el presente documento, las nucleasas guiadas por ARN CRISPR-Cas basadas en la protefna Cas9 de S. pyogenes pueden tener efectos mutagenicos inespecfficos significativos que son comparables o superiores a la actividad especffica prevista (Ejemplo 1). Tales efectos inespecfficos pueden ser problematicos para la investigacion y, en particular, para posibles aplicaciones terapeuticas. Por lo tanto, se necesitan metodos para mejorar la especificidad de las nucleasas guiadas por ARN (RGN) CRISPR-Cas.
Como se describe en el Ejemplo 1, las RGN Cas9 pueden inducir mutaciones indel de alta frecuencia en sitios inespecfficos en celulas humanas (veanse tambien Cradick et al., 2013; Fu et al., 2013; Hsu et al., 2013; Pattanayak et al., 2013). Estas alteraciones no deseadas pueden tener lugar en secuencias genomicas que difieren en hasta cinco emparejamientos incorrectos del sitio especffico previsto (vease el Ejemplo 1). Ademas, aunque los emparejamientos incorrectos en el extremo 5' de la region de complementariedad del ARNg se toleran generalmente mejor que los del extremo 3', estas asociaciones no son absolutas y muestran dependencia entre sitios (veanse el Ejemplo 1 y Fu et al., 2013; Hsu et al., 2013; Pattanayak et al., 2013). Como resultado, los metodos computacionales que se basan en el numero y/o las posiciones de los emparejamientos incorrectos tienen actualmente un valor predictivo limitado para identificar sitios inespecfficos de buena fe. Por lo tanto, los metodos para reducir las frecuencias de mutaciones inespecfficas siguen siendo una prioridad importante si las nucleasas guiadas por ARN se van a utilizar para investigacion y aplicaciones terapeuticas.
La dimerizacion es una estrategia potencial atractiva para mejorar la especificidad de las nucleasas Cas9. Esto es distinto de un enfoque de Cas9 nickasa emparejada, que no es un verdadero sistema dimerico. Las nickasas emparejadas funcionan localizando conjuntamente dos Cas9 nickasas en un segmento de ADN, induce de este modo la edicion del genoma de alta eficiencia a traves de un mecanismo indefinido. Debido a que la dimerizacion no es necesaria para la actividad enzimatica, las Cas9 nickasas individuales tambien pueden inducir indeles con altas eficiencias en ciertos sitios (a traves de un mecanismo desconocido) y, por lo tanto, pueden causar mutaciones inespecfficas en el genoma.
Por lo tanto, una estrategia para mejorar la especificidad de las RGN es fusionar un dominio de endonucleasa FokI a una forma catalfticamente inactiva de Cas9 que lleva las mutaciones D10A y H840A (tambien conocida como dCas9). El dominio de nucleasa FokI funciona como un dfmero y, por lo tanto, deben reclutarse dos subunidades en la misma pieza local de ADN para inducir una rotura bicatenaria. En esta configuracion (Figura 9A y Ejemplo 2), se reclutan dos fusiones FokI-dCas9 en una configuracion apropiada utilizando dos ARNg diferentes para producir una rotura bicatenaria. Por lo tanto, en este sistema, las fusiones FokI-dCas9 se uniran a un sitio que es dos veces mas largo que el de una sola RGN y, por lo tanto, se esperara que este sistema sea mas especffico.
Por lo tanto, la invencion proporciona protefnas de fusion FokI-dCas9, en las que la secuencia del dominio catalftico de FokI se fusiona con el extremo amino de dCas9 (preferiblemente con el extremo amino-terminal de dCas9, pero tambien opcionalmente con el extremo carboxi), opcionalmente con un conector intermedio, por ejemplo, un conector de 2-30 aminoacidos, por ejemplo, 4 a 12 aminoacidos, por ejemplo, Gly4Ser (SEQ ID NO:23) o (Gly4Ser)3. En algunas formas de realizacion, las protefnas de fusion incluyen un conector entre los dominios dCas9 y FokI. Los conectores que pueden usarse en estas protefnas de fusion (o entre protefnas de fusion en una estructura concatenada) pueden incluir cualquier secuencia que no interfiera con la funcion de las protefnas de fusion. En formas de realizacion preferidas, los conectores son cortos, por ejemplo, de 2-20 aminoacidos, y son tfpicamente flexibles (es decir, que comprenden aminoacidos con un alto grado de libertad, tales como glicina, alanina y serina). En algunas formas de realizacion, el conector comprende una o mas unidades que consisten en GGGS (SEQ ID NO:22) o GGGGS (SEQ ID NO: 23), por ejemplo, dos, tres, cuatro o mas repeticiones de las unidades Gg Gs (SEQ ID NO: 22) o GGGGS (SEQ ID NO: 23). Tambien se pueden usar otras secuencias conectoras.
En el presente documento tambien se describe una plataforma de nucleasa FokI guiada por ARN de la divulgacion en la que se requiere la dimerizacion, en lugar de solo co-localizacion, para una actividad de edicion del genoma eficiente. Estas nucleasas pueden mediar de manera robusta la edicion del genoma altamente eficiente en celulas humanas y pueden reducir las mutaciones inespecfficas a niveles indetectables segun se determina por los metodos de secuenciacion profunda sensibles. Tambien se describe un sistema eficiente para expresar pares de ARNg con cualquier nucleotido del extremo 5', un metodo que confiere un rango de direccionamiento mas amplio en la plataforma RFN. Finalmente, las Cas9 nickasas monomericas generalmente introducen indeles y mutaciones puntuales mas indeseables que las nucleasas descritas en el presente documento en presencia de un solo ARNg. Estos resultados definen una plataforma de nucleasa fuerte y respetuosa con el usuario con las ventajas de especificidad de una arquitectura dimerica bien caracterizada y un perfil de mutagenesis mejorado en relacion con las Cas9 nickasas emparejadas, caractensticas que seran importantes para aplicaciones de investigacion o terapeuticas que requieran la maxima precision de edicion del genoma mas alta posible.
Por lo tanto, se describe en el presente documento una nueva plataforma de nucleasa FokI guiada por ARN (RFN) de la divulgacion para realizar una edicion del genoma robusta y altamente espedfica en celulas humanas. Las RFN requieren dos ARNg para su actividad y funcionan como dfmeros. Sorprendentemente, la modificacion de una RFN activo requirio la fusion del dominio de nucleasa FokI al extremo amino terminal de la protema dCas9, una arquitectura diferente de las ZFN y TALEN en la que el dominio FokI se fusiona al extremo carboxi terminal de un dedo de cinc modificado o matrices de repeticion de efector de tipo activador de transcripcion. Las RFN tambien requieren que los semisitios unidos por cada complejo de Fok-dCas9/ARNg tengan una orientacion relativa particular (pAm hacia fuera) con una longitud de espaciador intermedio relativamente restringida de 14 a 17 pb (aunque la actividad puede ser posible en espacios adicionales, pero con menos exito consistente).
La naturaleza dimerica de las RFN proporciona importantes ventajas de especificidad en relacion con las nucleasas Cas9 monomericas estandar. En un sistema dimerico ideal, se observara poca o ninguna actividad con monomeros en los semisitios. Los datos actuales demuestran que FokI-dCas9 dirigido por un solo ARNg induce muy poca o ninguna mutagenesis en los semisitios de las RFN. Se sometieron a prueba 12 ARNg individuales (para seis sitios diana de RFN) con expresion conjunta de FokI-dCas9 y se observaron indeles a frecuencias muy bajas (intervalo del 0,0045% al 0,47%), en algunos casos a niveles tan bajos como las tasas de fondo observadas en las celulas de control en las que no hubo expresion de ARNg o nucleasa. Dado que el dominio de nucleasa FokI funciona como un dfmero, se presume que cualquier indel observado con un solo ARNg probablemente se deba al reclutamiento de un dfmero FokI-dCas9 en el ADN. Independientemente del mecanismo, dado que solo se observo una mutagenesis de muy bajo nivel cuando se sometio a prueba FokI-dCas9 con ARNg individuales en 12 semisitios espedficos, es muy poco probable que se induzca alguna mutagenesis en los semisitios inespedficos parcialmente emparejados incorrectamente. De hecho, una RFN dirigida a VEGFA no indujo mutaciones detectables en sitios inespedficos conocidos de uno de los ARNg segun se determina mediante secuenciacion profunda.
Debido a que las RFN son un verdadero sistema dimerico, poseen una serie de ventajas importantes con respecto a la tecnologfa de las nickasas emparejadas, que depende de la co-localizacion, pero no requiere dimerizacion. Primero, las comparaciones directas en el presente documento muestran que las Cas9 nickasas individuales generalmente inducen mutaciones indel con mayores eficiencias que las protemas de fusion FokI-dCas9 dirigidas por los mismos ARNg individuales. En segundo lugar, las Cas9 nickasas monomericas tambien pueden inducir sustituciones de pares de bases en sus semisitios diana con altas eficiencias, un efecto secundario mutagenico previamente desconocido que se descubrio en este estudio. De nuevo, las comparaciones directas muestran que las Cas9 nickasas monomericas inducen estas mutaciones puntuales no deseadas a tasas sustancialmente mas altas que las fusiones FokI-dCas9 guiadas por los mismos ARNg individuales. En tercer lugar, las Cas9 nickasas emparejadas muestran una mayor promiscuidad en la orientacion y el espaciado de los semisitios diana que las RFN dimericas y, por lo tanto, tienen un mayor rango potencial de sitios en los que se pueden inducir mutaciones inespedficas. Los semisitios de nickasas emparejadas se pueden orientar con sus PAM hacia dentro o hacia fuera y con secuencias espaciadoras que vanan en longitud de 0 a 1000 pb (Ran et al., Cell 154, 1380-1389 (2013); Mali et al., Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013); Cho et al., Genome Res (2013)). Esta promiscuidad existe porque las actividades de edicion del genoma de las Cas9 nickasas no dependen de la dimerizacion de la enzima, sino de la co-localizacion de las dos muescas. Por el contrario, las RFN son mucho mas estrictas en sus especificidades: los semisitios deben tener sus PAM hacia fuera y deben estar separados por 14 a 17 pb, debido al requisito de dos dominios de division FokI posicionados adecuadamente para una escision eficiente.
FokI
FokI es una endonucleasa de restriccion de tipo IIs que incluye un dominio de reconocimiento de ADN y un dominio catalftico (endonucleasa). Las protemas de fusion descritas en el presente documento pueden incluir todo FokI o solo el dominio de endonucleasa catalttica, por ejemplo, los aminoacidos 388-583 o 408-583 de GenBank con N.° de Acceso AAA24927.1, por ejemplo, como se describe en Li et al., Nucleic Acids Res. 39(1): 359-372 (2011); Cathomen y Joung, Mol. Ther. 16: 1200-1207 (2008), o una forma mutada de FokI como se describe en Miller et al. Nat Biotechnol 25: 778-785 (2007); Szczepek et al., Nat Biotechnol 25: 786-793 (2007); o Bitinaite et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:10570-10575 (1998).
Una secuencia de aminoacidos ejemplar de FokI es como se indica a continuacion:
10 20 30 40 50 60
MFLSMVSKIR TFGWVQNPGK FENLKRWQV FDRNSKVHNE VKNIKIPTLV KESKIQKELV
TO 80 90 100 110 120
AIMNQHDLIY TYKELVGTGT SIRSEAPCDA IIQATIADQG NKKGYIDNWS SDGFLRWAHA
130 140 150 160 170 180
LGFIEYINKS DSFVITDVGL AYSKSADGSA IEKEILIEAI SSYPPAIRIL TLLEDGQHLT
190 200 210 220 230 240
KFDLGKNLGF SGESGFTSLP EGILLDTLAN AMPKDKGEIR NNWEGSSDKY ARMIGGWLDK
250 260 270 280 290 300
LGLVKQGKKE FIIPTLGKPD NKEFISHAFK ITGEGLKVLR RAKGSTKFTR VPKRVYWEML
310 320 330 340 350 360
ATNLTDKEYV RTRRALILEI LIKAGSLKIE QIQDNLKKLG FDEVIETIEN DIKGLINTGI
370 380 390 400 410 420
FIEIKGRFYQ LKDHILQFVI PNRGVTKQLV KSELEEKKSE LRHKLKYVPH EYIELIEIAR
430 440 450 460 470 480
NSTQDRILEM KVMEFFMKVY GYRGKHLGGS RKPDGAIYTV GSPIDYGVIV DTKAYSGGYN
490 500 510 520 530 540
LPIGQADEMQ RYVEENQTRN KHINPNEWWK VYPSSVTEFK FLFVSGHFKG NYKAQLTRLN
550 560 570 580
HITNCNGAVL SVEELLIGGE MIKAGTLTLE EVRRKFNNGE INF (SEQ ID NO:4)
Una secuencia de acidos nucleicos ejemplarque codifica Fokl es como se indica a continuacion:
ATGTTTTTGAGTATGGTTTCTAAAATAAGAACTTTCGGTTGGGTTCAAAATCCAGGTAAA
TTTGAGAATTTAAAACGAGTAGTTCAAGTATTTGATAGAAATTCTAAAGTACATAATGAA
GTGAAAAATATAAAGATACCAACCCTAGTCAAAGAAAGTAAGATCCAAAAAGAACTAGTT
GCTATTATGAATCAACATGATTTGATTTATACATATAAAGAGTTAGTAGGAACAGGAACT
TCAATACGTTCAGAAGCACCATGCGATGCAATTATTCAAGCAACAATAGCAGATCAAGGA
AATAAAAAAGGCTATATCGATAATTGGTCATCTGACGGTTTTTTGCGTTGGGCACATGCT
TTAGGATTTATTGAATATATAAATAAAAGTGATTCTTTTGTAATAACTGATGTTGGACTT
GCTTACTCTAAATCAGCTGACGGCAGCGCCATTGAAAAAGAGATTTTGATTGAAGCGATA
TCATCTTATCCTCCAGCGATTCGTATTTTAACTTTGCTAGAAGATGGACAACATTTGACA
AAGTTTGATCTTGGCAAGAATTTAGGTTTTAGTGGAGAAAGTGGATTTACTTCTCTACCG
GAAGGAATTCTTTTAGATACTCTAGCTAATGCTATGCCTAAAGATAAAGGCGAAATTCGT
AATAATTGGGAAGGATCTTCAGATAAGTACGCAAGAATGATAGGTGGTTGGCTGGATAAA
CTAGGATTAGTAAAGCAAGGAAAAAAAGAATTTATCATTCCTACTTTGGGTAAGCCGGAC
AATAAAGAGTTTATATCCCACGCTTTTAAAATTACTGGAGAAGGTTTGAAAGTACTGCGT
CGAGCAAAAGGCTCTACAAAATTTACACGTGTACCTAAAAGAGTATATTGGGAAATGCTT
GCTACAAACCTAACCGATAAAGAGTATGTAAGAACAAGAAGAGCTTTGATTTTAGAAATA
TTAATCAAAGCTGGATCATTAAAAATAGAACAAATACAAGACAACTTGAAGAAATTAGGA
TTTGATGAAGTTATAGAAACTATTGAAAATGATATCAAAGGCTTAATTAACACAGGTATA
TTTATAGAAATCAAAGGGCGATTTTATCAATTGAAAGACCATATTCTTCAATTTGTAATA
CCTAATCGTGGTGTGACTAAGCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAA
CTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGA
AATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTAT
GGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTC
GGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAAT
CTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAAC
AAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAG
TTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAAT
CATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAA
ATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTGAGACGGAAATTTAATAACGGCGAG
ATAAACTTTTAA (SEQ ID NO:5)
En algunas formas de realizacion, la nucleasa FokI usada en el presente documento es al menos aproximadamente un 50% identica a la SEQ ID NO: 4, por ejemplo, a los aminoacidos 388-583 o 408-583 de SEQ ID NO: 4. Estas nucleasas variantes deben conservar la capacidad de escindir el ADN. En algunas formas de realizacion, las secuencias de nucleotidos son aproximadamente un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o un 100% identicas a los aminoacidos 388-583 o 408-583 de SEQ ID NO:4. En algunas formas de realizacion, cualquier diferencia de los aminoacidos 388-583 o 408-583 de SEQ ID NO: 4 esta en regiones no conservadas.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias, las secuencias se alinean para fines de comparacion optima (por ejemplo, se introducen huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoacidos o de acidos nucleicos segun se requiera para un alineamiento optimo, y las secuencias no homologas pueden ignorarse con fines comparativos). La longitud de una secuencia de referencia alineada con fines de comparacion es al menos del 50% (en algunas formas de realizacion, se alinea aproximadamente el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, o el 100% de la longitud de la secuencia de referencia). Despues, se comparan los nucleotidos o residuos en las posiciones correspondientes. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo nucleotido o residuo que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos, y la longitud de cada hueco, que debe introducirse para un alineamiento optimo de las dos secuencias.
La comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden realizar utilizando un algoritmo matematico. Para los fines de la presente solicitud, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J. Mol. Biol.
48:444-453) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, que utiliza una matriz de puntuacion Blossum 62 con una penalizacion por hueco de 12, una penalizacion de extension de hueco de 4 y una penalizacion por hueco de desplazamiento de marco de lectura de 5.
Cas9
Una serie de bacterias expresan variantes de la protefna Cas9. Cas9 de Streptococcus pyogenes es actualmente la mas utilizada; algunas de las demas protefnas Cas9 tienen altos niveles de identidad de secuencia con Cas9 de S. pyogenes y utilizan los mismos ARN gufa. Otras son mas diversas, utilizan diferentes ARNg, y tambien reconocen diferentes secuencias PAM (la secuencia de 2-5 nucleotidos especificada por la protefna que es adyacente a la secuencia especificada por el ARN). Chylinski et al. clasificaron las protefnas Cas9 de un gran grupo de bacterias (RNA Biology 10:5, 1-12; 2013), y se enumera una gran cantidad de protefnas Cas9 en la Figura 1 complementaria y en la tabla 1 complementaria de la misma. Se describen protefnas Cas9 adicionales en Esvelt et al., Nat Methods.
2013 Nov; 10(11 ):1116-21 y Fonfara et al., "Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems". Nucleic Acids Res. 2013 Nov 22. [Epub anterior a la publicacion impresa] doi:10.1093/nar/gkt1074.
Se pueden usar moleculas de Cas9 de una diversidad de especies en los metodos y composiciones que se describen en el presente documento. Aunque las moleculas de Cas9 de S. pyogenes y S. thermophilus son objeto de gran parte de la divulgacion en el presente documento, tambien se pueden usar moleculas de Cas9, derivadas de, o basadas en las protefnas Cas9 de otras especies enumeradas en el presente documento. En otras palabras, aunque la mayor parte de la descripcion en el presente documento utiliza moleculas de Cas9 de S. pyogenes y S. thermophilus, las moleculas de Cas9 de las otras especies pueden reemplazarlas. Dichas especies incluyen aquellas expuestas en la siguiente tabla, que se creo basandose en la Figura 1 complementaria de Chylinski et al., 2013.
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
Las construcciones y los metodos descritos en el presente documento pueden incluir el uso de cualquiera de estas protefnas Cas9 y sus correspondientes ARN gufa u otros ARN gufa que sean compatibles. La Cas9 del sistema CRISPR1 de Streptococcus thermophilus LMD-9 tambien se demostrado que funciona en celulas humanas en Cong et al (Science 339, 819 (2013)). Se describen ortologos de Cas9 de N. meningitides en Hou et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Sep 24; 110(39):15644-9 y Esvelt et al., Nat Methods. 2013 Nov;10(11):1116-21. Adicionalmente, Jinek et al. demostraron in vitro que los ortologos de Cas9 de S. thermophilus y L. innocua (pero no de N. meningitidis o C.
jejuni, que probablemente utilizan un ARN gufa diferente), pueden guiarse por un ARNg doble de S. pyogenes para dividir el ADN del plasmido diana, aunque con una eficiencia ligeramente reducida.
En algunas formas de realizacion, el presente sistema utiliza la protefna Cas9 de S. pyogenes, ya sea codificada en bacterias o optimizada por codones para la expresion en celulas de mamffero, que contiene mutaciones en D10, E762, H983, o D986 y H840 o N863, por ejemplo, D10A/D10N y H840A/H840N/H840Y, para convertir la porcion de nucleasa de la protefna catalfticamente inactiva; las sustituciones en estas posiciones podrfan ser alanina (como en Nishimasu al., Cell 156, 935-949 (2014)) o podrfan ser otros residuos, por ejemplo, glutamina, asparagina, tirosina, serina o aspartato, por ejemplo, e762Q, H983N, H983Y, D986N, N863D, N863S, o N863H (Figura 1c ). La secuencia de Cas9 de S. pyogenes catalfticamente inactiva que se puede usar en los metodos y composiciones que se describen en el presente documento es como se indica a continuacion; las mutaciones ejemplares de D10A y H840A estan en negrita y subrayadas.
10 20 30 40 50 60
MDKKYSIGLA IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE
70 80 90 100 110 120
ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNEM AKVDDSFFHR LEESFLVEED KKHERHPIFG
130 140 150 160 170 180
NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD LRLIYLALAH MIKFRGHFLI EGDLNPDNSD
190 200 210 220 230 240
VDKLFIQLVQ TYNQLFEENP INASGVDAKA ILSARLSKSR RLENLIAQLP GEKKNGLFGN
250 260 270 280 290 300
LIALSLGLTP NFKSNFDLAE DAKLQLSKDT YDDDLDNLLA QIGDQYADLF LAAKNLSDAI
310 320 330 340 350 360
LLSDILRVNT EITKAPLSAS MIKRYDEHHQ DLTLLKALVR QQLPEKYKEI FFDQSKNGYA
370 380 390 400 410 420
GYIDGGASQE EFYKFIKPIL EKMDGTEELL VKLNREDLLR KQRTFDNGSI PHQIHLGELH
430 440 450 460 470 480
AILRRQEDFY PFLKDNREKI EKILTFRIPY YVGPLARGNS RFAWMTRKSE ETITPWNFEE
490 500 510 520 530 540
WDKGASAQS FIERMTNFDK NLPNEKVLPK HSLLYEYFTV YNELTKVKYV TEGMRKPAFL
550 560 570 580 590 600
SGEQKKAIVD LLFKTNRKVT VKQLKEDYFK KIECFDSVEI SGVEDRFNAS LGTYHDLLKI
610 620 630 640 650 660
IKDKDFLDNE ENEDILEDIV LTLTLFEDRE MIEERLKTYA HLFDDKVMKQ LKRRRYTGWG
670 680 690 700 710 720
RLSRKLINGI RDKQSGKTIL DFLKSDGFAN RNFMQLIHDD SLTFKEDIQK AQVSGQGDSL
730 740 750 760 770 780
HEHIANLAGS PAIKKGILQT VKWDELVKV MGRHKPENIV IEMARENQTT QKGQKNSRER
790 800 810 820 830 840
MKRIEEGIKE LGSQILKEHP VENTQLQNEK LYLYYLQNGR DMYVDQELDI NRLSDYDVDA
850 860 870 880 890 900
IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKNRGKSDNV PSEEWKKMK NYWRQLLNAK LITQRKFDNL
910 920 930 940 950 960
TKAERGGLSE LDKAGFIKRQ LVETRQITKH VAQILDSRMN TKYDENDKLI REVKVITLKS
970 980 990 1000 1010 1020
KLVSDFRKDF QFYKVREINN YHHAHDAYLN AWGTALIKK YPKLESEFVY GDYKVYDVRK
1030 1040 1050 1060 1070 1080
MIAKSEQEIG KATAKYFFYS NIMNFFKTEI TLANGEIRKR PLIETNGETG EIVWDKGRDF
1090 1100 1110 1120 1130 1140
ATVRKVLSMP QVNIVKKTEV QTGGFSKESI LPKRNSDKLI ARKKDWDPKK YGGFDSPTVA
1150 1160 1170 1180 1190 1200
YSVLWAKVE KGKSKKLKSV KELLGITIME RSSFEKNPID FLEAKGYKEV KKDLIIKLPK
1210 1220 1230 1240 1250 1260
YSLFELENGR KRMLASAGEL QKGNELALPS KYVNFLYLAS HYEKLKGSPE DNEQKQLFVE
1270 1280 1290 1300 1310 1320
QHKHYLDEII EQISEFSKRV ILADANLDKV LSAYNKHRDK PIREQAENII HLFTLTNLGA
1330 1340 1350 1360
PAAFKYFDTT IDRKRYTSTK EVLDATLIHQ SITGLYETRI DLSQLGGD (SEQ ID NO:5)
En algunas formas de realizacion, la nucleasa Cas9 usada en el presente documento es al menos aproximadamente un 50% identica a la secuencia de Cas9 de S. pyogenes, es decir, al menos un 50% identica a la SEQ ID NO: 5. En algunas formas de realizacion, las secuencias de nucleotidos son aproximadamente un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o un 100% identicas a la SEQ ID NO:5. En algunas formas de realizacion, cualquier diferencia con la SEQ ID NO: 5 se encuentra en regiones no conservadas, como se identifica mediante el alineamiento de secuencias de las secuencias expuestas en Chylinski et al., RNA Biology 10:5, 1-12; 2013(por ejemplo, en la Figura 1 complementaria y la tabla 1 complementaria de la misma); Esvelt et al., Nat Methods. 2013 Nov;10(11):1116-21 y Fonfara et al., Nucl. Acids Res. (2014) 42 (4): 2577-2590. [Epub anterior a la publicacion impresa 2013 Nov 22] doi:10.1093/nar/gkt1074. La identidad se determina como se expone anteriormente.
ARN guia (ARNg)
Los ARN gufa en general vienen en dos sistemas diferentes: El Sistema 1, que usa ARNcr y ARNtracr separados que funcionan juntos para guiar la escision por Cas9, y el Sistema 2, que usa un hfbrido quimerico de ARNcr-ARNtracr que combina los dos ARN gufa separados en un solo sistema (denominado como ARN gufa individual o ARNsg, vease tambien Jinek et al., Science 2012; 337:816-821). El ARNtracr se puede truncar de manera variable y se ha demostrado que un intervalo de longitudes funciona tanto en el sistema separado (sistema 1) como en el sistema de ARNg quimerico (sistema 2). Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, el ARNtracr puede truncarse desde su extremo 3' en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 nt. En algunas formas de realizacion, la molecula de ARNtracr puede truncarse desde su extremo 5' en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 nt. Como alternativa, la molecula de ARNtracr se puede truncar tanto desde el extremo 5' como 3', por ejemplo, en al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 nt en el extremo 5' final y al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 nt en el extremo 3'. Vease, por ejemplo, Jinek et al., Science 2012; 337:816­ 821; Mali et al., Science. 2013 Feb 15; 339(6121):823-6; Cong et al., Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23; y Hwang y Fu et al., Nat Biotechnol. 2013 Mar; 31(3):227-9; Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013)). Para el Sistema 2, en general, los ARNg quimericos de mayor longitud han mostrado una mayor actividad especffica, pero las especificidades relativas de los ARNg de diversas longitudes actualmente no estan definidas y, por lo tanto, puede ser deseable en ciertos casos usar ARNg mas cortos. En algunas formas de realizacion, los ARNg son complementarios a una region que esta dentro de aproximadamente 100-800 pb aguas arriba del sitio de inicio de la transcription, por ejemplo, esta dentro de aproximadamente 500 pb aguas arriba del sitio de inicio de la transcription, incluye el sitio de inicio de la transcripcion, o dentro de aproximadamente 100-800 pb, por ejemplo, dentro de aproximadamente 500 pb, aguas abajo del sitio de inicio de la transcripcion. En algunas formas de realizacion, se usan vectores (por ejemplo, plasmidos) que codifican mas de un ARNg, por ejemplo, plasmidos que codifican 2, 3, 4, 5 o mas ARNg dirigidos a diferentes sitios en la misma region del gen diana.
La nucleasa Cas9 puede guiarse a dianas genomicos especfficas de 17-20 nt que llevan un motivo adyacente de protoespaciador (pAm) proximal adicional, por ejemplo, de secuencia NGG, utilizando un ARN gufa, por ejemplo, un solo ARNg o un ARNtracr/ARNcr, que lleva 17-20 nt en su extremo 5' que son complementarios a la cadena complementaria del sitio diana del aDn genomico. Por lo tanto, los presentes metodos pueden incluir el uso de un ARN gufa unico que comprende un ARNcr fusionado a un ARNtracr normalmente trans-codificado, por ejemplo, un unico ARN gufa de Cas9 como se describe en Mali et al., Science 2013 Feb 15; 339(6121):823-6, con una secuencia en el extremo 5' que es complementaria a la secuencia diana, por ejemplo, de 25-17, opcionalmente 20 o menos nucleotidos (nt), por ejemplo, 20, 19, 18, o 17 nt, preferiblemente 17 o 18 nt, de la cadena complementaria con respecto a una secuencia diana inmediatamente 5' de un motivo adyacente de protoespaciador (PAM), por ejemplo, NGG, NAG o NNGG. En algunas formas de realizacion, el ARN gufa de Cas9 individual consiste en la secuencia:
(Xi 7 - 2 o)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUC
CG(Xn) (SEQ ID NO:6);
(Xi 7 - 2 o)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCU AGUCCGUUAUC(Xn) (SEQ ID NO:7);
(Xi 7 - 2 o)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGU UAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(Xn) (SEQ ID NO:8);
(Xi 7 - 2 o)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUU AUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(Xn) (SEQ ID NO:9),
(X,7-2o)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUU AUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 10);
0
(Xi 7 - 2 o)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID
NO: 12);
en la que X17-20 es la secuencia de nucleotidos complementaria a 17-20 nucleotidos consecutivos de la secuencia diana. Los ADN que codifican los ARN gma individuales se han descrito previamente en la bibliografia (Jinek et al., Science. 337(6096):816-21 (2012) y Jinek et al., Elife. 2:e00471 (2013)).
Los ARN gma pueden incluir XN, que puede ser cualquier secuencia, en el que N (en el ARN) puede ser 0-200, por ejemplo, 0-100, 0-50 o 0-20, que no interfiere con la union del acido ribonucleico a Cas9.
En algunas formas de realization, el ARN gma incluye uno o mas nucleotidos de adenina (A) o uracilo (U) en el extremo 3'. En algunas formas de realizacion, el ARN incluye uno o mas U, por ejemplo, 1 a 8 o mas U (por ejemplo, U, UU, UUU, UUUU, UUUUU, UUUUUU, UUUUUUU, UUUUUUUU) en el extremo 3' de la molecula, como resultado de la presencia opcional de una o mas T usadas como una senal de termination para terminar la transcription de ARN Pollll.
Aunque algunos de los ejemplos descritos en el presente documento utilizan un ARNg individual, los metodos tambien pueden usarse con ARNg duales (por ejemplo, el ARNcr y el ARNtracr que se encuentran en los sistemas de origen natural). En este caso, se usaria un unico ARNtracr junto con multiples ARNcr diferentes expresados usando el presente sistema, por ejemplo, el siguiente:
(X17-20)GUUUUAGAGCUA (SEQ ID NO:13); (X17-20)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO:14); o (X17-20)GUUUUAGAGCUAUGCU (SEQ ID NO:15); y una secuencia de ARNtracr. En este caso, el ARNcr se utiliza como el ARN gma en los metodos y moleculas descritos en el presente documento, y el ARNtracr se puede expresar a partir de la misma molecula de ADN o desde una diferente. En algunas formas de realizacion, los metodos incluyen poner en contacto la celula con un ARNtracr que comprende o consiste en la secuencia GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 16) o una portion activa de la misma (una portion activa es una que conserva la capacidad de formar complejos con Cas9 o dCas9). En algunas formas de realizacion, la molecula de ARNtracr puede truncarse desde su extremo 3' en al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 nt. En otra forma de realizacion, la molecula de ARNtracr puede truncarse desde su extremo 5' en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 nt. Como alternativa, la molecula de ARNtracr se puede truncar tanto desde el extremo 5' como 3', por ejemplo, en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 nt en el extremo 5' final y al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 nt en el extremo 3'. Las secuencias ejemplares de ARNtracr ademas de la SEQ ID NO: 8, incluyen la siguiente: UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCA CCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO:17) o una porcion activa de la misma; o AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO:18) o una porcion activa de la misma.
En algunas formas de realizacion en las que (Xi7-20)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO:14) se usa como un ARNcr, se usa el siguiente ARNtracr: GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO:16) o una porcion activa de la misma. En algunas formas de realizacion en las que (Xi 7-20)GUUUUAGAGCUA (SEQ ID NO:13) se usa como un ARNcr, se usa el siguiente ARNtracr: UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCA CCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO:17) o una porcion activa de la misma. En algunas formas de realizacion en las que (Xi7-20)GUUUUAGAGCUAUGCU (SEQ ID NO:15) se usa como un ARNcr, se usa el siguiente ARNtracr: AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO:18) o una porcion activa de la misma.
En algunas formas de realizacion, el ARNg esta dirigido a un sitio que tiene al menos tres o mas emparejamientos incorrectos diferentes de cualquier secuencia en el resto del genoma para minimizar los efectos inespetificos.
Se ha demostrado que los oligonucleotidos de ARN modificados, tal como los acidos nucleicos bloqueados (LNA), aumentan la especificidad de la hibridacion de ARN-ADN al bloquear los oligonucleotidos modificados en una conformation mas favorable (estable). Por ejemplo, el ARN 2'-O-metilo es una base modificada donde existe un enlace covalente adicional entre el oxigeno 2' y el carbono 4' que, cuando se incorpora a los oligonucleotidos, puede mejorar la estabilidad termica general y la selectividad (Formula I).
Figure imgf000017_0001
Por lo tanto, en algunas formas de realization, los tru-ARNg divulgados en el presente documento pueden comprender uno o mas oligonucleotidos de ARN modificados. Por ejemplo, las moleculas de ARN guia truncadas descritas en el presente documento pueden tener una, algunos o todos los 17-18 o 17-19 nt de la region 5’ del ARN guia complementario a la secuencia diana modificados, por ejemplo, bloqueados (puente de 2'-O-4'-C metileno), 5’-metilcitidina, 2’-O-metil-pseudouridina, o en los que el esqueleto de ribosa fosfato ha sido reemplazado por una cadena de poliamida (acido nucleico peptidico), por ejemplo, un acido ribonucleico sintetico.
En otras formas de realization, uno, algunos o todos los nucleotidos de la secuencia de tru-ARNg pueden modificarse, por ejemplo, bloquearse (puente de 2'-O-4'-C metileno), 5’-metilcitidina, 2-O-metil-pseudouridina, o en los que el esqueleto de ribosa fosfato se ha reemplazado por una cadena de poliamida (acido nucleico peptidico), por ejemplo, un acido ribonucleico sintetico.
En algunas formas de realization, los ARN guia individuales y/o los ARNcr y/o ARNtracr pueden incluir uno o mas nucleotidos de adenina (A) o uracilo (U) en el extremo 3’.
Las RGN basadas en Cas9 existentes utilizan la formation de heteroduplex de ARNg-ADN para guiar el direccionamiento a sitios genomicos de interes. Sin embargo, los heteroduplex de ARN-ADN pueden formar un rango de estructuras mas promiscuo que sus homologos de ADN-ADN. En efecto, los duplex de ADN-ADN son mas sensibles a los emparejamientos incorrectos, lo que sugiere que una nucleasa guiada por ADN puede no unirse tan facilmente a las secuencias inespetificas, lo que las hace comparativamente mas espetificas que las nucleasas guiadas por ARN. Por lo tanto, los ARN guia que pueden utilizarse en los metodos descritos en el presente documento pueden ser hibridos, es decir, en los que uno o mas desoxirribonucleotidos, por ejemplo, un oligonucleotido de ADN corto, reemplaza todo o parte del ARNg, por ejemplo, toda o parte de la region de complementariedad de un ARNg. Esta molecula basada en el ADN podria reemplazar todo o parte del ARNg en un sistema de ARNg individual o, como alternativa, podria reemplazar toda la parte del ARNcr y/o ARNtracr en un sistema dual de ARNcr/ARNtracr. Un sistema de este tipo que incorpora ADN en la region de complementariedad deberia dirigirse de manera mas fiable a las secuencias de ADN genomicas deseadas debido a la intolerancia general de los duplex de ADN-ADN al emparejamiento incorrecto en comparacion con los duplex de ARN-ADN. Los metodos para hacer dichos duplex se conocen en la tecnica, vease, por ejemplo, Barker et al., BMC Genomics. 2005 Apr 22;6:57; y Sugimoto et al., Biochemistry. 2000 Sep 19;39(37):11270-81.
Ademas, en un sistema que utiliza ARNcr y ARNtracr separados, uno o ambos pueden ser sinteticos e incluir uno o mas nucleotidos o desoxirribonucleotidos modificados (por ejemplo, bloqueados).
En un contexto celular, los complejos de Cas9 con estos ARNg sinteticos podrian usarse para mejorar la especificidad de todo el genoma del sistema de nucleasa CRISPR/Cas9.
Los metodos descritos pueden incluir expresar en una celula, o poner en contacto la celula con un ARNm de Cas9 mas una proteina de fusion como se describe en el presente documento.
Sistemas de expresion
Para usar las proteinas de fusion descritas, puede ser deseable expresarlas a partir de un acido nucleico que las codifica. Esto se puede realizar de varias maneras. Por ejemplo, el acido nucleico que codifica el ARN guia puede clonarse en un vector intermedio para la transformacion en celulas procariotas o eucariotas para la replicacion y/o la expresion. Los vectores intermedios son tipicamente vectores procariotas, por ejemplo, plasmidos, o vectores lanzadera, o vectores de insectos, para el almacenamiento o manipulation del acido nucleico que codifica las proteinas de fusion para la production de las proteinas de fusion. El acido nucleico que codifica las proteinas de fusion tambien se puede clonar en un vector de expresion, para su administracion a una celula vegetal, celula animal, preferiblemente una celula de mamifero o una celula humana, celula fungica, celula bacteriana o celula protozoaria.
Para obtener la expresion, una secuencia que codifica una protefna de fusion normalmente se subclona en un vector de expresion que contiene un promotor para la transcripcion directa. Los promotores bacterianos y eucariotas adecuados se conocen bien en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2010). Los sistemas de expresion bacterianos para expresar la protefna modificada estan disponibles en, por ejemplo, E. coli, Bacillus sp., y Salmonella (Palva et al., 1983, Gene 22:229-235). Los kits para tales sistemas de expresion estan disponibles en el mercado. Los sistemas de expresion eucariotas para celulas de mamffero, levaduras y celulas de insecto se conocen bien en la tecnica y tambien estan disponibles comercialmente.
El promotor usado para dirigir la expresion de un acido nucleico depende de la aplicacion particular. Por ejemplo, un promotor constitutivo fuerte se usa tfpicamente para la expresion y purificacion de protefnas de fusion. Por el contrario, cuando el ARN gufa se va a administrar in vivo para la regulacion genica, se puede usar un promotor constitutivo o inducible, dependiendo del uso particular del ARN gufa. Ademas, un promotor preferido para la administracion del ARN gufa puede ser un promotor debil, tal como HSV TK o un promotor que tenga una actividad similar. El promotor tambien puede incluir elementos que responden a la transactivacion, por ejemplo, elementos de respuesta a la hipoxia, elementos de respuesta a Gal4, elemento de respuesta al represor lac, y sistemas de control de moleculas pequenas tales como los sistemas regulados por tetraciclina y el sistema RU-486 (vease, por ejemplo, Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547; Oligino et al., 1998, Gene Ther., 5:491-496; Wang et al., 1997, Gene Ther., 4:432-441; Neering et al., 1996, Blood, 88:1147-55; y Rendahl et al., 1998, Nat. Biotechnol., 16:757-761).
Ademas del promotor, el vector de expresion tfpicamente contiene una unidad de transcripcion o casete de expresion que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresion del acido nucleico en las celulas huesped, ya sean procariotas o eucariotas. Por lo tanto, un casete de expresion tfpico contiene un promotor unido operativamente, por ejemplo, a la secuencia de acido nucleico que codifica el ARNg, y cualquier senal requerida, por ejemplo, para una poliadenilacion eficaz de la transcripcion, terminacion de la transcripcion, sitios de union al ribosoma, o terminacion de la traduccion. Los elementos adicionales del casete pueden incluir, por ejemplo, potenciadores y senales intronicas de corte y empalme heterologas.
El vector de expresion particular utilizado para transportar la informacion genetica a la celula se selecciona con respecto al uso previsto del ARNg, por ejemplo, la expresion en plantas, animales, bacterias, hongos, protozoos, etc. Los vectores de expresion bacterianos estandar incluyen plasmidos tales como plasmidos basados en pBR322, pSKF, pET23D, y sistemas de expresion de fusion de etiquetas disponibles comercialmente tales como GST y LacZ.
Los vectores de expresion que contienen elementos reguladores de virus eucariotas se usan a menudo en vectores de expresion eucariotas, por ejemplo, vectores SV40, vectores de virus de papiloma, y vectores derivados del virus de Epstein-Barr. Otros vectores eucariotas ejemplares incluyen pMSG, pAV009/A+, pMT010/A+, pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus, y cualquier otro vector que permita la expresion de protefnas bajo la direccion del promotor temprano de SV-40, promotor tardfo de SV-40, promotor de metalotionefna, promotor del virus de tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de polihedrina, u otros promotores que se ha mostrado que son eficaces para la expresion en celulas eucariotas.
Los vectores para expresar los ARN gufa pueden incluir promotores de ARN Pol III para dirigir la expresion de los ARN gufa, por ejemplo, los promotores H1, U6 o 7SK. Estos promotores humanos permiten la expresion de ARNg en celulas de mamffero despues de la transfeccion plasmfdica. Como alternativa, puede usarse un promotor T7, por ejemplo, para la transcripcion in vitro, y el ARN puede transcribirse in vitro y purificarse. Se pueden usar vectores adecuados para la expresion de ARN cortos, por ejemplo, ARNsi, ARNsh u otros ARN pequenos. Con el sistema multiplex basado en Cys4 descrito en la Figura 4B, los ARNg multiples pueden expresarse en una sola transcripcion (dirigida por un promotor de ARN Pol II o Pol III) y despues eliminarse por escision de esa transcripcion mas grande.
Algunos sistemas de expresion tienen marcadores para la seleccion de lfneas celulares transfectadas de manera estable, tales como timidina cinasa, higromicina B fosfotransferasa y dihidrofolato reductasa. Los sistemas de expresion de alto rendimiento tambien son adecuados, tal como el uso de un vector de baculovirus en celulas de insecto, con la secuencia codificante de ARNg bajo la direccion del promotor de polihedrina u otros promotores de baculovirus fuertes.
Los elementos que tfpicamente se incluyen en los vectores de expresion tambien incluyen un replicon que funciona en E. coli, un gen que codifica resistencia a los antibioticos para permitir la seleccion de bacterias que albergan plasmidos recombinantes y sitios de restriccion unicos en regiones no esenciales del plasmido para permitir insercion de secuencias recombinantes.
Se usan metodos de transfeccion estandar para producir lfneas celulares de bacterias, mamfferos, levaduras o insectos que expresan grandes cantidades de protefna, que luego se purifican utilizando tecnicas estandar (veanse, por ejemplo, Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). La transformacion de celulas eucariotas y procariotas se realiza de acuerdo con tecnicas estandar (veanse, por ejemplo, Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351; Clark-Curtiss y Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983).
Se puede usar cualquiera de los procedimientos conocidos para introducir secuencias de nucleotidos foraneas en celulas huesped. Estos incluyen el uso de transfeccion con fosfato de calcio, polibreno, fusion de protoplastos, electroporacion, nucleofeccion, liposomas, microinyeccion, ADN desnudo, vectores plasmfdicos, vectores virales, tanto episomales como integrativos, y cualquiera de los demas metodos bien conocidos para introducir ADN genomico clonado, ADNc, ADN sintetico u otro material genetico foraneo en una celula huesped (vease, por ejemplo, Sambrook et al., anteriormente). Solo es necesario que el procedimiento de ingenierfa genetica particular utilizado sea capaz de introducir con exito al menos un gen en la celula huesped capaz de expresar el ARNg.
La presente invencion incluye los vectores y las celulas que comprenden los vectores.
EJEMPLOS
La invencion se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos. Cualquier ejemplo que quede fuera del alcance de la reivindicacion se proporciona solo con fines comparativos.
Ejemplo 1. Evaluacion de la especificidad de las endonucleasas guiadas por ARN
Las nucleasas guiadas por ARN CRISPR (RGN) han emergido rapidamente como una plataforma facil y eficiente para la edicion del genoma. Este ejemplo describe el uso de un ensayo de indicador basado en celulas humanas para caracterizar la escision inespecffica de RGN basadas en Cas9.
Materiales y metodos
Los siguientes materiales y metodos se usaron en el Ejemplo 1.
Construccion de ARN gufa
Los oligonucleotidos de ADN que albergan secuencias variables de 20 nt para el direccionamiento de Cas9 se hibridaron para generar fragmentos de ADN bicatenario cortos con salientes de 4 pb compatibles con la ligadura en el plasmido digerido con BsmBI pMLM3636. La clonacion de estos oligonucleotidos hibridados genera plasmidos que codifican un ARN gufa quimerico monocatenario 103 con 20 nucleotidos 5' variables bajo la expresion de un promotor U6 (Hwang et al, Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013); Mali et al, Science 339, 823-826 (2013)). pMLM3636 y el plasmido de expresion pJDS246 (que codifica una version de Cas9 optimizada por codones) utilizados en este estudio estan disponibles a traves del servicio de distribucion de plasmidos sin animo de lucro Addgene (addgene.org/crispr-cas).
Ensayos de la actividad de EGFP
Se cultivaron las celulas U2OS.EGFP que albergaban una unica copia integrada de un gen de fusion EGFP-PEST como se describe previamente (Reyon et al., Nat Biotech 30, 460-465 (2012)). Para las transfecciones, 200.000 celulas se sometieron a nucleofeccion con las cantidades indicadas de plasmido de expresion de ARNg y pJDS246 junto con 30 ng de un plasmido de codificacion de Td-tomato utilizando el kit SE Cell Line 4D-Nucleofector™ X (Lonza) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las celulas se analizaron 2 dfas despues de la transfeccion utilizando un citometro de flujo BD LSRII. Las transfecciones para optimizar la concentracion de plasmido de ARNg/Cas9 se realizaron por triplicado y todas las demas transfecciones se realizaron por duplicado.
Amplificacion por PCR y verificacion de secuencia de sitios genomicos humanos endogenos
Las reacciones de PCR se realizaron utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad (NEB) Phusion Hot Start II. La mayorfa de los loci se amplificaron con exito utilizando analisis por PCR de toma de contacto (98°C, 10 s; 72-62°C, -1°C/ciclo, 15 s; 72°C, 30 s]10 ciclos, [98°C, 10 s; 62°C, 15 s; 72°C, 30 s]25 ciclos). El analisis por PCR para las dianas restantes se realizo con 35 ciclos a una temperatura de hibridacion constante de 68°C o 72°C y DMSO al 3% o betafna 1 M, de ser necesario. Los productos de PCR se analizaron en un sistema de electroforesis capilar QIAXCEL para verificar tanto tamano como la pureza. Los productos validados se trataron con ExoSap-IT (Affymetrix) y se secuenciaron mediante el metodo Sanger (MGH DNA Sequencing Core) para verificar cada sitio diana.
Determinacion de las frecuencias de la mutacion especffica e inespecffica inducida por RGN en celulas humanas
Para las celulas U2OS.EGFP y K562, se transfectaron 2 x 105 celulas con 250 ng del plasmido de expresion de ARNg o un plasmido de promotor U6 vacfo (para controles negativos), 750 ng del plasmido de expresion de Cas9, y 30 ng del plasmido de expresion de td-Tomato usando el sistema 4D Nucleofector de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Lonza). Para las celulas HEK293, se transfectaron 1,65 x 105 celulas con 125 ng de plasmido de expresion de ARNg o un plasmido de promotor U6 vado (para el control negativo), 375 ng de plasmido de expresion de Cas9, y 30 ng de un plasmido de expresion de td-Tomato usando el reactivo Lipofectamine LTX de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Life Technologies). El ADN genomico se recogio a partir de celulas U2OS.EGFP, HEK293 o K562 transfectadas utilizando el mini Kit QIAamp DNA Blood (QIAGEN), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para generar suficiente ADN genomico para amplificar los sitios candidatos inespedficos, se agrupo el ADN de tres nucleofecciones (para celulas U2OS.EGFP), dos nucleofecciones (para celulas K562), o dos transfecciones de Lipofectamine LTX antes de realizar T7EI. Esto se hizo dos veces para cada condicion probada, generando de este modo conjuntos duplicados de ADN genomico que representan un total de cuatro o seis transfecciones individuales. Despues se realizo el analisis por PCR utilizando estos ADN genomicos como plantillas como se describe anteriormente y se purifico utilizando perlas de Ampure XP (Agencourt) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ensayos T7EI se realizaron como se describe anteriormente (Reyon et al., 2012, anteriormente).
Secuenciacion de ADN de mutaciones indel mediadas por NHEJ
Los productos de PCR purificados utilizados para el ensayo T7EI se clonaron en el vector Zero Blunt TOPO (Life Technologies) y los ADN plasmfdicos se aislaron utilizando un metodo de miniprep de lisis alcalina mediante el MGH DNA Automation Core. Los plasmidos se secuenciaron usando un cebador directo M13 (5' -GTAAAACGACGGCCAG - 3' (SEQ ID NO:19)) por el metodo Sanger (MGH DNA Sequencing Core).
Ejemplo 1a. Emparejamientos incorrectos de nucleotidos individuales
Para comenzar a definir los determinantes de especificidad de RGN en celulas humanas, se realizo una prueba a gran escala para evaluar los efectos de emparejar de forma incorrecta sistematicamente diversa posiciones dentro de multiples interfaces de ARNg/ADN diana. Para esto, se utilizo un ensayo cuantitativo de alteracion de la protema verde fluorescente (EGFP) basado en celulas humanas previamente descrito (veanse Metodos anteriores y Reyon et al., 2012, anteriormente) que permite la cuantificacion rapida de las actividades de nucleasas dirigidas (Figura 2B). En este ensayo, las actividades de las nucleasas dirigidas a un unico gen indicador EGFP integrado se pueden cuantificar evaluando la perdida de la senal de fluorescencia en las celulas U2OS.EGFP humanas causada por la inactivacion de las mutaciones de insercion/delecion (indel) de cambio de marco introducidas por una reparacion de union de extremos no homologos (NHEJ) propensa a errores de roturas bicatenarias inducidas por nucleasa (DSB) (Figura 2B). Para los estudios descritos aqrn, se usaron tres ARNg individuales de ~100 nt (ARNsg) dirigidos a diferentes secuencias dentro de EGFP, de la siguiente manera:
EGFP Sitio 1 GGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGG (SEQ ID NO:1)
EGFP Sitio 2 GATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGG (SEQ ID NO:2)
EGFP Sitio 3 GGTGGTGCAGATGAACTTCAGGG (SEQ ID NO:3)
Cada uno de estos ARNsg puede dirigir eficientemente la alteracion mediada por Cas9 de la expresion de EGFP (vease el Ejemplo 1e y 2a, y las Figuras 3E (superior) y 3F (inferior)).
En los experimentos iniciales, se sometieron a prueba los efectos de los emparejamientos erroneos de nucleotidos individuales en 19 de 20 nucleotidos en la region de direccionamiento complementaria de tres ARNsg dirigidos a EGFP. Para ello, se generaron ARNsg variantes para cada uno de los tres sitios diana que albergaban emparejamientos incorrectos de transversion de Watson-Crick en las posiciones 1 a 19 (numeradas del 1 al 20 en la direccion de 3' a 5'; vease la Figura 1) y se sometieron a prueba las capacidades de estos diversos ARNsg para dirigir la alteracion de EGFP mediada por Cas9 en celulas humanas (los ARNsg variantes que llevaban una sustitucion en la posicion 20 no se generaron porque este nucleotido es parte de la secuencia del promotor U6 y, por lo tanto, debe seguir siendo una guanina para evitar afectar a la expresion).
Para el sitio diana N.° 2 de EGFP, los emparejamientos incorrectos individuales en las posiciones 1 a 10 del ARNg tienen efectos drasticos en la actividad de Cas9 asociada (Figura 2C, panel central), lo que concuerda con estudios anteriores que sugieren que los emparejamientos incorrectos en el extremo 5' de los ARNg son mejor tolerados que los del extremo 3' (Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)). Sin embargo, con los sitios diana N.° 1 y N.° 3 de de EGFP, los emparejamientos incorrectos individuales en absoluto, parecen ser bien tolerados, salvo unas pocas posiciones en el ARNg, incluso dentro del extremo 3' de la secuencia. Ademas, las posiciones espedficas que fueron sensibles al emparejamiento incorrecto difirieron para estas dos dianas (Figura 2C, comparar los paneles superior e inferior); por ejemplo, el sitio diana N.° 1 fue particularmente sensible a un emparejamiento incorrecto en la posicion 2, mientras que el sitio diana N.° 3 fue el mas sensible a los emparejamientos incorrectos en las posiciones 1 y 8.
Ejemplo 1b. Emparejamientos incorrectos multiples
Para probar los efectos de mas de un emparejamiento incorrecto en la interfaz de ARNg/ADN, se crearon una serie de ARNsg variantes que teman dobles emparejamientos incorrectos de transversion de Watson-Crick en posiciones adyacentes y separadas, y las capacidades de estos ARNsg para dirigir la actividad de nucleasa Cas9 se sometieron a prueba en celulas humanas utilizando el ensayo de alteracion de EGFP. Los tres sitios diana generalmente mostraron una mayor sensibilidad a las alteraciones dobles en las que uno o ambos emparejamientos incorrectos se producen dentro de la mitad 3' de la region de direccionamiento del ARNg. Sin embargo, la magnitud de estos efectos mostro una variacion especffica del sitio, ya que el sitio diana N.° 2 muestra la mayor sensibilidad a estos dobles emparejamientos incorrectos y el sitio diana N.° 1 generalmente muestra la menor sensibilidad. Para probar el numero de emparejamientos incorrectos adyacentes que pueden tolerarse, se construyeron ARNsg variantes que tenfan un numero creciente de posiciones con emparejamientos incorrectos que van de las posiciones 19 a 15 en el extremo 5' de la region de direccionamiento de ARNg (donde los emparejamientos incorrectos sencillos y dobles parecen ser mejor tolerados).
Las pruebas de estos ARNsg, cada vez con mas emparejamientos incorrectos, revelo que para los tres sitios diana, la introduccion de tres o mas emparejamientos incorrectos adyacentes da como resultado una perdida significativa de la actividad de RGN. Se produjo un descenso repentino en la actividad de tres ARNg diferentes dirigidos a EGFP, ya que uno hace emparejamientos incorrectos progresivos comenzando desde la posicion 19 en el extremo 5' y anadiendo mas emparejamientos incorrectos moviendose hacia el extremo 3'. Especfficamente, los ARNg que contienen emparejamientos incorrectos en las posiciones 19 y 19 18 muestran actividad esencialmente completa, mientras que aquellos con emparejamientos incorrectos en las posiciones 19+18+17, 19+18+17+16, y 19+18+17+16+15 no muestran esencialmente diferencia alguna con respecto a un control negativo (Figura 2F). (Se ha de tener en cuenta que no habfa emparejamientos incorrectos en la posicion 20 en estos ARNg variantes porque esta posicion debe permanecer como G ya que forma parte del promotor U6 que dirige la expresion del ARNg).
Se obtuvo una prueba adicional de ese acortamiento de la complementariedad del ARNg podrfa conducir a RGN con mayores especificidades en el siguiente experimento: para cuatro ARNg diferentes dirigidos a EGFP (Figura 2H), la introduccion de un doble emparejamiento incorrecto en las posiciones 18 y 19 no tuvo un impacto significativo sobre la actividad. Sin embargo, la introduccion de otro doble emparejamiento incorrecto en las posiciones 10 y 11 despues en estos ARNg da como resultado una perdida de actividad casi completa. De forma interesante, la introduccion de solo los emparejamientos incorrectos dobles de 10/11 generalmente no tiene un impacto tan grande en la actividad.
Tomados en conjunto, estos resultados en las celulas humanas confirman que las actividades de las RGN pueden ser mas sensibles a los emparejamientos incorrectos en la mitad 3' de la secuencia de direccionamiento de ARNg. Sin embargo, los datos tambien revelan claramente que la especificidad de las RGN es compleja y depende del sitio diana, con emparejamientos incorrectos sencillos y dobles a menudo bien tolerados, incluso cuando se produce uno o mas emparejamientos incorrectos en la mitad 3' de la region de direccionamiento del ARNg. Ademas, estos datos tambien sugieren que no todos los emparejamientos incorrectos en la mitad 5' de la interfaz ARNg/ADN son necesariamente bien tolerados.
Ademas, estos resultados sugieren fuertemente que los ARNg que tienen regiones mas cortas de complementariedad (especfficamente ~17 nt) seran mas especfficos en sus actividades. Se observa que 17 nt de especificidad combinados con los 2 nt de especificidad conferida por la secuencia PAM dan como resultado la especificacion de una secuencia de 19 pb, una de longitud suficiente para ser unica en genomas complejos grandes, tales como los que se encuentran en las celulas humanas.
Ejemplo 1c. Mutaciones inespecfficas
Para determinar si se podrfan identificar mutaciones inespecfficas para RGN dirigidas a genes humanos endogenos, se usaron seis ARNsg que se dirigen a tres sitios diferentes en el gen VEGFA, uno en el gen EMX1, uno en el gen RNF2 y uno en el FANCF. Estos seis ARNsg dirigieron de manera eficiente los indeles mediados por Cas9 en sus respectivos loci endogenos en celulas U2OS.EGFP humanas segun se detecto mediante el ensayo de Endonucleasa I T7 (T7EI) (Metodos anteriormente). Para cada uno de estas seis RGN, se examinaron docenas de posibles sitios inespecfficos (variando de 46 hasta como mucho 64) en busca de evidencia de mutaciones indel mediadas por NHEJ inducidas por nucleasas en celulas U2OS.EGFP. Los loci evaluados inclufan todos los sitios genomicos que difieren en uno o dos nucleotidos, asf como subconjuntos de sitios genomicos que difieren en tres a seis nucleotidos y con un sesgo hacia aquellos que tenfan uno o mas de estos emparejamientos incorrectos en la mitad 5' de la secuencia de direccionamiento de ARNg. Usando el ensayo T7EI, se identificaron facilmente cuatro sitios inespecfficos (de 53 sitios candidatos examinados) para el sitio 1 de VEGFA, doce (de 46 examinados) para el sitio 2 de VEGFA, siete (de 64 examinados) para el sitio 3 de VEGFA y uno (de 46 examinados) para el sitio EMX1. No se detectaron mutaciones inespecfficas entre los 43 y 50 sitios potenciales examinados para los genes RNF2 o FANCF, respectivamente. Las tasas de mutacion en los sitios inespecfficos verificados fueron muy altas, con un rango del 5,6% al 125% (media del 40%) de la tasa observada en el sitio diana previsto. Estas dianas inespecfficas de buena fe incluyeron secuencias con emparejamientos incorrectos en el extremo 3' del sitio diana y con un total de cinco emparejamientos incorrectos, produciendose la mayorfa de los sitios inespecfficos dentro de los genes de codificacion de protefnas. La secuenciacion del ADN de un subconjunto de sitios inespecfficos proporciono una confirmacion molecular adicional de que se producen mutaciones indel en el sitio de escision de RGN esperado (Figuras 8A-C).
Ejemplo 1d. Mutaciones inespecfficas en otros tipos de celulas
Despues de haber establecido que las RGN pueden inducir mutaciones inespecfficas con altas frecuencias en celulas U2OS.EGFP, se busco a continuacion determinar si estas nucleasas tambien tendrfan estos efectos en otros tipos de celulas humanas. Las celulas U2OS.EGFP se habfan elegido para experimented iniciales porque estas celulas se usaron previamente para evaluar las actividades de TALEN15, pero se han utilizado mas ampliamente las celulas humanas HEK293 y K562 para someter a prueba las actividades de las nucleasas dirigidas. Por lo tanto, las actividades de las cuatro RGN dirigidas a los sitios 1, 2 y 3 de VEGFA y el sitio de EMX1 tambien se evaluaron en celulas HEK293 y K562. Cada una de estas cuatro rGn indujo eficazmente las mutaciones indel mediadas por NHEJ en su sitio especffico previsto en estas dos lfneas celulares humanas adicionales (como se evaluo por el ensayo T7EI), aunque con frecuencias de mutacion algo mas bajas que las observadas en las celulas U2OS.EGFP. La evaluacion de los 24 sitios inespecfficos para estas cuatro rGn identificadas originalmente en las celulas U2OS.EGFP revelo que muchos de ellos mutaron de nuevo en las celulas HEK293 y K562 con frecuencias similares a las de su sitio inespecffico correspondiente. Como se esperaba, la secuenciacion de ADN de un subconjunto de estos sitios inespecfficos de las celulas HEK293 proporciono evidencia molecular adicional de que se estan produciendo alteraciones en los loci genomicos esperados. No se sabe con certeza por que en las celulas HEK293 cuatro y en las celulas K562 once de los sitios inespecfficos identificados en las celulas U2OS.EGFP no mostraron mutaciones detectables. Sin embargo, muchos de estos sitios inespecfficos tambien mostraron frecuencias de mutacion relativamente mas bajas en las celulas U2OS.EGFP. Por lo tanto, las tasas de mutacion de estos sitios en celulas HEK293 y K562 pueden estar disminuyendo por debajo del lfmite de deteccion fiable de este ensayo T7EI (~2-5%) porque las RGN generalmente parecen tener actividades mas bajas en las celulas HEK293 y K562 en comparacion con las celulas U2OS.EGFP en estos experimentos. En conjunto, los resultados en las celulas HEK293 y K562 proporcionan evidencia de que las mutaciones inespecfficas de alta frecuencia que se observan con las RGN seran un fenomeno general visto en multiples tipos de celulas humanas.
Ejemplo 1e. Valoracion de las cantidades de plasmidos que expresan ARNg y Cas9 utilizadas para el ensayo de alteracion de EGFP
Se generaron ARN gufa individuales (ARNsg) para tres secuencias diferentes (SITIOS 1-3 de EGFP, mostrados arriba) ubicadas aguas arriba del nucleotido de EGFP 502, una posicion en la que la introduccion de mutaciones de cambio de marco a traves de una union de extremos no homologos puede alterar fuertemente la expresion de EGFP (Maeder, M.L. et al., Mol Cell 31, 294-301 (2008); Reyon, D. et al., Nat Biotech 30, 460-465 (2012)).
Para cada uno de los tres sitios diana, se transfecto inicialmente un rango de cantidades de plasmidos de expresion de ARNg (12,5 a 250 ng) junto con 750 ng de un plasmido que expresa una version de la nucleasa Cas9 optimizada por codones en estas celulas indicadoras U2OS.EGFP que tienen una sola copia, expresadas de forma constitutiva por el gen indicador EGFP-PEST. Las tres RGN alteraron eficazmente la expresion de EGFP en la concentracion mas alta de plasmido de ARNg (250 ng) (Figura 3E (parte superior)). Sin embargo, las RGN para los sitios diana N.° 1 y N.° 3 presentaron niveles equivalentes de alteracion cuando se transfectaron cantidades inferiores de plasmido de expresion de ARNg, mientras que la actividad de RGN en el sitio diana N.° 2 disminuyo inmediatamente cuando la cantidad de plasmido de expresion de ARNg se redujo (Figura 3E (parte superior)).
La cantidad de plasmido codificante de Cas9 (en el intervalo de 50 ng a 750 ng) transfectada en estas celulas indicadoras U2OS.EGFP se valoro para someter a ensayo la alteracion de EGFP. Como se muestra en la Figura 3F (parte superior), el sitio diana N.° 1 tolero una disminucion de tres veces en la cantidad de plasmido codificante de Cas9 transfectado sin una perdida sustancial de la actividad de alteracion de EGFP. Sin embargo, las actividades de las RGN dirigidas a los sitios diana N.° 2 y N.° 3 disminuyeron inmediatamente con una reduccion de tres veces en la cantidad de plasmido Cas9 transfectado (Figura 3F (parte superior)). Basandose en estos resultados, se utilizaron 25 ng/250 ng, 250 ng/750 ng y 200 ng/750 ng de plasmidos de expresion de ARNg/Cas9 para los sitios diana N.° 1, N.° 2 y N.° 3 de EGFP, respectivamente, para los experimentos descritos en los Ejemplos 1a-1d.
Las razones por las que algunas combinaciones de ARNg/Cas9 funcionan mejor que otras para alterar la expresion de EGFP no se entienden, ni por que algunas de estas combinaciones son mas o menos sensibles a la cantidad de plasmidos utilizados para la transfeccion. Aunque es posible que el rango de sitios inespecfficos presentes en el genoma para estos tres ARNsg pueda influir en cada una de sus actividades, no se observaron diferencias en el numero de sitios genomicos que difieren en uno a seis pb para cada una de estos sitios inespecfficos particulares (Tabla 1) que darfan cuenta del comportamiento diferencial de los tres ARNsg.
Tabla 1
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Se identificaron sitios inespecfficos para cada una de las seis RGN dirigidas a los genes VEGFA, RNF2, FANCF y EMX1 y las tres RGN dirigidas a los sitios diana N.° 1, N.° 2 y N.° 3 de EGFP en la construction de secuencia del genoma humano GRCh37. Los emparejamientos incorrectos solo se permitieron para la region de 20 nt en la que el ARNg hibrida y no en la secuencia PAM.
Ejemplo 2: Uso de pares de ARN guia con protefnas de fusion FokI-dCas9
Las nucleasas CRISPR-Cas9 monomericas se usan ampliamente para la edition del genoma dirigida, pero pueden inducir mutaciones inespecfficas no deseadas con altas frecuencias. Este ejemplo describe nuevas nucleasas FokI guiadas por ARN (RFN) que reconocen una secuencia extendida de doble longitud y que dependen estrictamente de dos ARN gufa individuales (ARNg) para la actividad de escision. Las RFN pueden editar de forma robusta secuencias de ADN en genes humanos endogenos con altas eficiencias. Adicionalmente, se describe un metodo para expresar ARNg que llevan cualquier nucleotido del extremo 5', un avance crftico que otorga a las RFN dimericas un rango util de direccionamiento. En comparaciones directas, las Cas9 nickasas monomericas generalmente inducen indeles no deseados y mutaciones puntuales focales inesperadas con frecuencias mas altas que las RFN dirigidas por un ARNg individual emparejado. Las RFN combinan la facilidad del direccionamiento basado en ARN CRISPR con las mejoras de especificidad de la dimerization, y proporcionan una nueva plataforma importante para las aplicaciones de investigation y terapeuticas que requieren una edicion del genoma altamente precisa.
Materiales y metodos
Los siguientes materiales y metodos se usaron en el Ejemplo 2.
Plasmidos de expresion de ARNg individuales y multiplex
Los plasmidos que codifican ARNg sencillos o multiplex se ensamblaron en una ligadura de un solo paso de oligoduplex de sitio diana hibridados (Integrated DNA Technologies) y un oligoduplex de region constante (para ARNg multiplex) con esqueleto de ARNg flanqueado por Csy4 digerido por BsmBI (pSQT 1313; Addgene).
Se construyeron plasmidos codificantes de ARNg multiplex mediante ligadura: 1) oligos hibridados que codifican el primer sitio diana, 2) oligos hibridados fosforilados que codifican ARNcr, ARNtracr y el sitio de union a Csy4, y 3) oligos hibridados que codifican el segundo sitio diana, en un esqueleto de plasmido U6-sitio Csy4-ARNg digerido con la enzima de restriction BsmBI de Tipo IIs. Los sitios de union a ARN de Csy4 se unieron a los extremos 3' y 5' de una secuencia de ARNg y se expresaron con Cas9 en las celulas. La secuencia del sitio de union al ARN de Csy4 'GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA' (SEQ ID NO:20) se fusiono al extremo 5' y 3' de la secuencia de ARNg estandar.
GUUCACUGCCGUAUAGGCAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUA
GAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCA
CCGAGUCGGUGCGUUCACUGCCGUAUAGGCAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUU
GAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCGUUCACUGCCGUAUAGGCAG (SEQ ID
NO:21)
Esta secuencia es una secuencia de ARNg multiplex flanqueada por sitios Csy4 (subrayados). Funcionalmente, la codification de estos en multiplex en una transcription debe tener el mismo resultado que codificarlos por separado. Aunque todos los pares de ARNsg flanqueados por Csy4 se expresaron en un contexto multiplex en los experimentos descritos en el presente documento, los ARNsg pueden codificarse en ARNsg multiplex separados por sitios Csy4 codificados en una transcripcion, asf como ARNsg individuales que tienen una secuencia Csy4 adicional. En esta secuencia, la primera secuencia N20 representa la secuencia complementaria a una cadena de la secuencia genomica diana, y la segunda secuencia N20 representa la secuencia complementaria a la otra cadena de la secuencia genomica diana.
Un plasmido que codifica el sitio de reconocimiento de Csy4 que contiene ARNg se cotransfecto con el plasmido que codifica las protefnas Cas9 y Csy4 separadas por un enlace peptfdico "2A". Los resultados mostraron que los ARNg con sitios Csy4 fusionados con los extremos 5' y 3' segufan siendo capaces de dirigir la escision mediada por Cas9 en celulas humanas utilizando el ensayo de alteration de U2OS-EGFP descrito previamente. Por lo tanto, los sitios de union a ARN Csy4 pueden unirse al extremo 3' de una secuencia de ARNg y los complejos de estos ARNg que contienen sitios Csy4 con Cas9 permanecen funcionales en la celula.
En algunos experimentos, se utilizo una construction que codificaba Csy4-T2A-FokI-dCas9. Las secuencias de las fusiones FokI-dCas9 se muestran a continuation, e incluyen un conector GGGGS (SEQ ID NO:23) (subrayado) entre FokI y dCas9 y una secuencia de localization nuclear.
Secuencia de aminoacidos FokI-dCas9 (FokI-G4S-dCas9-nls-3XFLAG)
MQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYR
GKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRN
KHINPNEWWKVYPS SVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLI
GGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINFGGGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKV
PSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQE
IFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKK
LVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEE
NPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSN
FDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEI
TKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQ
EEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQ
EDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVD
KGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFL
SGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDL
LKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRR
RYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKA
QVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQ
TTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVD
QELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNY
WRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRM
NTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTA
LIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFY SNIMNFFKTEITLA
NGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESI
LPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGIT
IMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGN
ELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVI
LADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTS
TKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGSPKKKRKVSSDYKDHDGDYKDHDIDY
KDDDDK (SEQ ID NO:24)
Secuencia de nucleotidos FokI-dCas9 (FokI-G4S-dCas9-nls-3XFLAG)
ATGCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTG AAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAG GATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGA GGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCT CCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTG CCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAAC AAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTT AAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGA TTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATT GGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTT AATAACGGCGAGATAAACTTTGGTGGCGGTGGATCCGATAAAAAGTATTCTATTGGT TTAGCCATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTA CCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAAT CTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAA CGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAA ATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAG TCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATA GTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAG CTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCAT ATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCG GATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAG AACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCT AAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGG TTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAAC TTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGAT CTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCC AAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATT ACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGAC TTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATA TTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAA GAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAG TTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAAC GGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAG GAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACC TTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGG ATG ACAAGAAAG TCC GAAGAAAC GATTAC TCCAT GGAAT TTTGAGG AAGTT GTCGAT AAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTA CCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTAC AATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTA AGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTG ACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTC GAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTC CTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTA GAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGA CTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGT
CGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAG
CAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAAC
TTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCA
CAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCG
CCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAG
GTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAA
ACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGT
ATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTG
CAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGAT
CAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAA
TCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAAC
CGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTAT
TGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACT
AAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAG
CTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATG
AATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTA
AAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAG
ATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCA
CTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTT
TATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCC
AAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCA
AACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATC
GTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAA
GTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATT
CTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAA
AAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAA
GTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACG
ATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGT
TACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAG
TTAGAAAAT GGCCGAAAAC GGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTT CAAAAG GGGAAC
GAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAG
AAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCAC
AAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATC
CTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAA
CCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGC
GCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCT
ACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAA
ACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAA
GTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTAC
AAGGAT GACGATGACAAG TGA (SEQ ID NO:25)
Como alternativa, se uso una version optimizada por codones humanos de la construction, que contenfa senales de localization nuclear tanto N-terminales como C-terminales, como se muestra a continuation.
Secuencia de aminoacidos Nls-FokI-dCas9-nls
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGE
TAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDD SFFHRLEE SFLVEEDKKHE
RHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIE
GDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQ
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Secuencia de nucleotidos Nls-FokI-dCas9-nls
ATGCCTAAGAAGAAGCGGAAGGTGAGCAGCCAACTTGTGAAGTCTGAACTCGAGGAG
AAAAAAT CAGAGTTGAGAC ACAAG TTGAAG TACGTGC CACACG AATACAT CGAGCT T
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Todos los experimentos de cultivo celular se realizaron en celulas HEK 293, celulas U2OS o en celulas U2OS que albergaban un gen EGFP desestabilizado, de una sola copia, integrado de manera estable (celulas U2OS.EGFP). Las lfneas celulares se cultivaron en DMEM avanzado (Life Technologies) complementado con FBS al 10%, GlutaMax 2 mM (Life Technologies) y penicilina/estreptomicina a 37°C con CO2 al 5%. Adicionalmente, se cultivaron celulas U2OS.eGfP en presencia de 400 pg/ml de G4l8.
Las celulas U2OS y las celulas U2OS.EGFP se transfectaron usando el programa DN-100 de un Lonza 4D-Nucleofector de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En los cribados iniciales de actividad de FokI-dCas9 y el analisis de la longitud del espaciador focalizado, se transfectaron 750 ng de plasmido de nucleasa pCAG-Csy4-FokI-dCas9-nls y 250 ng de plasmidos que codifican ARNg junto con 50 ng de plasmido de expresion de tdTomato (Clontenh) como transfeccion de control. En todos los demas experimentos en celulas U2OS y U2OS.EGFP, se transfectaron 975 ng pCAG-Csy4-T2A-nls-hFokI-dCas9-nls optimizado por codones humanos (SQT1601) o pCAG-Cas9-D10A nickasa (NW3) junto con 325 ng del vector de ARNg y 10 ng de plasmido de expresion de Td tomato y se analizaron 3 dfas despues de la transfeccion. Las celulas HEK293 se transfectaron con 750 ng de plasmido de nucleasa, 250 ng de plasmido de expresion de ARNg y 10 ng de Td-tomato, usando Lipofectamine (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se analizaron para determinar la mutagenesis mediada por NHEJ 3 dfas despues de la transfeccion.
Se realizaron transfecciones individuales para el cribado de actividad inicial del espaciador, y transfecciones duplicadas para el analisis de longitud del espaciador focalizado. Todas las demas transfecciones se realizaron por triplicado.
Ensayo de alteracion de EGFP
El ensayo de rotura de EGFP se realizo como se describe previamente (vease el Ejemplo 1 y Reyon et al., Nat Biotech 30, 460-465 (2012)) usando celulas indicadoras U2OS.EGFP. Las celulas se sometieron a prueba para determinar la expresion de EGFP y tdTomato utilizando un analizador BD Biosciences LSR II o Fortessa FACS.
Cuantificacion de las tasas de mutacion inducidas por nucleasa o nickasa mediante el ensayo T7EI
Los ensayos T7E1 se realizaron como se describe previamente (Reyon et al., Nat Biotech 30, 460-465 (2012)). Brevemente, se aislo el ADN genomico durante 72 horas despues de la transfeccion utilizando el kit de aislamiento de ADN denomico Agencourt DNAdvance (Beckman Coulter Genomics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con una estacion de trabajo de manejo de lfquidos Sciclone G3 (Caliper). Las reacciones de PCR para amplificar los loci genomicos se realizaron utilizando la ADN polimerasa Phusion Hot-start Flex (New England Biolabs). Las muestras se amplificaron utilizando un protocolo de dos pasos (98°C, 30 s; (98°C, 7 s; 72°C, 30 s) x 35; 72°C, 5 min) o un protocolo de PCR de toma de contacto ((98°C, 10 s; 72-62°C, -1°C/ciclo, 15 s; 72°C, 30 s) x 10 ciclos, (98°C, 10 s; 62°C, 15 s; 72°C, 30 s) x 25 ciclos). Se desnaturalizaron 200 ng de amplicones de PCR purificados, se hibridaron y se trataron con Endonucleasa I T7 (New England Biolabs). La frecuencia de mutacion se cuantifico utilizando un instrumento de electroforesis capilar Qiaxcel (Qiagen) como se describe anteriormente (Reyon et al., Nat Biotech 30, 460-465 (2012)).
Secuenciacion de Sanger de ADN genomico mutagenizado
Los mismos productos de PCR purificados utilizados para el ensayo T7EI se clonaron por Topo (Life Technologies) y el ADN plasmfdico de los clones individuales se aislo y se secuencio utilizando un cebador inverso M13 (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'; SEQ ID NO:19).
Preparacion y analisis de la biblioteca Illumina
Los productos de PCR cortos de 200-350 pb se amplificaron usando ADN polimerasa Phusion Hot-start FLEX. Los productos de PCR se purificaron utilizando perlas Ampure XP (Beckman Coulter Genomics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas de secuenciacion profunda TruSeq Illumina de doble fndice se prepararon utilizando un sistema de preparacion de bibliotecas de alto rendimiento (Kapa Biosystems) en una estacion de trabajo de manejo de lfquidos Sciclone G3. Las bibliotecas ligadas al adaptador final se cuantificaron utilizando un instrumento de electroforesis capilar Qiaxcel (Qiagen). La secuenciacion de 150 pares de bases emparejadas se realizo en un Secuenciador Illumina MiSeq por el Dana-Farber Cancer Institute Molecular Biology Core.
Las lecturas de extremos emparejados de MiSeq se cartografiaron con respecto a la referencia del genoma humano GChr37 utilizando bwa. Las lecturas con una puntuacion de calidad promedio >30 se analizaron para detectar mutaciones de insercion o delecion que se superponen con respecto sitio de union previsto de nucleasa diana o inespecffico candidato. Los analisis de mutacion se realizaron utilizando Genome Analysis Toolkit (GATK) y Python.
Algoritmo de busqueda inespecffico:
Se implemento un algoritmo de emparejamiento de sitio diana que busca emparejamientos con menos de un numero especffico de emparejamientos incorrectos en una ventana deslizante a traves del genoma humano.
Ejemplo 2a. Justificacion para el diseno de nucleasas guiadas por ARN dimerico
Se planted la hipotesis de que podrfa desarrollarse una plataforma unica de combinacion de las ventajas de especificidad de la dimerizacion con la facilidad del direccionamiento de Cas9. Para ello, el dominio de nucleasa FokI dependiente de la dimerizacion bien caracterizado se fusiono con una protefna Cas9 (dCas9) catalfticamente inactiva guiada por ARN. Se esperaba que, al igual que las ZFN y TALEN que contienen FokI, los dfmeros de estas fusiones pudieran mediar la escision del ADN especffico de secuencia cuando se unen a sitios diana compuestos por dos "semisitios" con una secuencia "espaciadora" de cierta longitud entre ellos (Figura 4A). Se planted la hipotesis de que dichas fusiones tenfan una especificidad mejorada porque debfan requerir dos ARNg para su actividad (Figura 4A) y porque un solo ARNg probablemente serfa demasiado ineficiente o incapaz de reclutar las dos protefnas de fusion que contienen FokI requeridas para la escision del ADN. Se planteo la hipotesis de que un sistema dimerico de este tipo mostrarfa una especificidad mejorada con respecto a las nucleasas Cas9 monomericas estandar y tambien tendrfa potencialmente importantes ventajas de especificidad sobre el sistema de nickasas emparejadas en el que las nickasas individuales todavfa pueden ejercer efectos mutagenicos no deseados.
Ejemplo 2b. Expresion multiplex de ARNg sin limitaciones de nucleotidos en el extremo 5'
El intervalo de direccionamiento para una nucleasa guiada por ARN dimerico serfa bajo usando los metodos de expresion de ARNg existentes. Tfpicamente, dos requisitos de secuencia restringen el rango de direccionamiento de un monomero dCas9: el requisito de una secuencia PAM de 5'-NGG que se especifica mediante dCas9 y un requisito para un nucleotido G en el extremo 5' del ARNg impuesto por el uso de un promotor U6 en la mayorfa de los vectores de expresion. Sin embargo, si se pudiera aliviar el requisito de G 5' en el ARNg, entonces el rango de direccionamiento mejorarfa en 16 veces.
Para desarrollar un sistema multiplex que permitiera la expresion de ARNg con cualquier nucleotido 5', se construyo un plasmido a partir del cual dos ARNg, cada uno flanqueado por sitios de escision para la ribonucleasa Csy4 (Haurwitz et al., Science 329, 1355-1358 (2010)), se pueden expresar dentro de un ARN individual transcrito a partir de un promotor U6 (Figura 4B). Se esperarfa que Csy4 procesara esta transcripcion liberando de este modo los dos ARNg. Basandose en el mecanismo conocido de la escision mediada por Csy4 ((Haurwitz et al., Science 329, 1355­ 1358 (2010); Sternberg et al., RNA 18, 661-672 (2012)), cada ARNg procesado debe conservar un sitio de reconocimiento Csy4 en su extremo 3' con una protefna Csy4 unida a ese sitio (Figura 4B). En esta configuracion, deberfa ser posible expresar ARNg con cualquier nucleotido 5'. Este sistema se sometio a prueba usandolo para expresar dos ARNg dirigidos a sitios dentro del gen indicador EGFP. La coexpresion de esta transcripcion junto con nucleasas Csy4 y Cas9 en celulas humanas condujo a la introduccion de mutaciones indel en ambos sitios diana de EGFP, asf como a la delecion de la secuencia entre estos sitios (Figura 4C). Estos experimentos sugieren que ambos ARNg se estan procesando a partir del unico transcrito de ARN precursor y que ambos son capaces de dirigir las actividades de nucleasa Cas9 en celulas humanas.
Ejemplo 2c. Construccion y optimizacion de nucleasas guiadas por ARN dimerico
Se construyeron dos protefnas hfbridas diferentes que albergaban el dominio de nucleasa FokI y la protefna dCas9: una en la que el dominio de nucleasa FokI se fusiona con el extremo carboxi de dCas9 (dCas9-FokI) y la otra en la que esta fusionada al extremo amino (FokI-dCas9) (Figura 5A). La protefna dCas9-FokI es analoga en arquitectura a ZFN y TALEN (Figura 5A). Para determinar si cualquiera o ambas de estas fusiones podrfan mediar la escision del ADN de sitio especffico, se utilizo un ensayo basado en celulas humanas bien establecido que puede cuantificar rapida y facilmente la introduccion de indeles mediados por NHEJ en un gen indicador EGFP (el ensayo de alteracion de EGFP descrito anteriormente en el Ejemplo 1). Debido a que no se conocfa la geometrfa de los semisitios requeridos para una escision eficiente, se disenaron 60 pares de ARNg dirigidos a diversos sitios en EGFP. Los dos semisitios dirigidos por cada uno de estos pares de ARNg se orientaron de manera que ambas de sus secuencias PAM estan directamente adyacentes a la secuencia espaciadora (la orientacion "PAM hacia dentro") o se posicionaron en los lfmites externos del sitio diana de longitud completa (la orientacion "PAM hacia fuera") (Figura 5B). Ademas, la secuencia espaciadora tambien vario en longitud de 0 a 31 pb (Figura 5B y Tabla 2)
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Sorprendentemente, la protefna dCas9-FokI no mostro una actividad de alteracion de EGFP detectable cuando se expreso conjuntamente con cualquiera de los 60 pares de ARNg en celulas U2OS.EGFP humanas (Figura 5E). Sin embargo, el cribado de la protefna FokI-dCas9 con los mismos 60 pares de ARNg revelo una actividad de alteracion de EGFP en los sitios diana compuestos por semisitios en la orientacion PAM hacia fuera y con longitudes de espaciador de 13 a 17 pb y de 26 pb (aproximadamente una vuelta de la helice de ADN mas que las longitudes de espaciador de 13-17 pb) (Figura 5B). La prueba de FokI-dCas9 en 25 sitios de ADN diana adicionales con longitudes de espaciador que varfan de 10 a 20 pb y con semisitios en la orientacion de PAM hacia fuera demostro una escision eficiente en dianas con longitudes de espaciador de 13 a 18 pb (Figuras 5C-D). En estos experimentos, se sometio a prueba en cada sitio la longitud de espaciador de 17 o 18 pb y no todos los sitios con una longitud de espaciador de 13 pb mostraron actividad. El analisis de un subconjunto de sitios dirigidos con exito mediante el analisis T7EI y la secuenciacion de Sanger confirmaron adicionalmente la presencia de indeles en la localizacion prevista. Por lo tanto, FokI-dCas9 puede dirigirse por dos ARNg posicionados apropiadamente para escindir eficientemente un sitio diana de longitud completa de interes. Con fines de simplicidad, el complejo de dos fusiones FokI-dCas9 y dos ARNg se denomina en el presente documento nucleasas FokI guiadas por a Rn (RFN).
Para ampliar los hallazgos iniciales con el gen indicador EGFP y determinar si las RFN podrfan usarse para realizar la edicion genomica de rutina de los genes humanos endogenos, se disenaron pares de ARNg para 12 sitios diana diferentes en nueve genes humanos diferentes (Tabla 2). Once de las 12 RFN sometidas a prueba introdujeron indeles con altas eficiencias (rango del 3 al 40%) en sus sitios diana previstos en celulas U2OS.EGFP humanas segun se determino por el ensayo T7EI (Tabla 2). Se obtuvieron resultados similares con estos mismos 12 pares de RFN en celulas HEK293 (Tabla 2). La secuenciacion de Sanger de alelos dirigidos con exito de celulas U2OS.EGFP revelo la introduccion de un rango de indeles (principalmente deleciones) en el sitio de escision esperado (Figura 5F). La alta tasa de exito y la alta eficiencia de las modificaciones observadas en dos lfneas celulares humanas diferentes demuestran la robustez de las RFN para modificar los genes humanos endogenos.
Ejemplo 2d. Las RFN poseen especificidades extendidas para sus sitios de escision
Para probar si las RFN poseen especificidades de reconocimiento mejoradas asociadas con la dimerizacion, se examino si estas nucleasas dependen estrictamente de la presencia de ambos ARNg en un par. En un sistema dimerico ideal, los ARNg individuales no deberfan poder dirigir de manera eficiente los indeles inducidos por FokI-dCas9. Para realizar una prueba inicial, se utilizaron dos pares de ARNg dirigidos a dos sitios diana en EGFP que se habfa demostrado que dirigfan de manera eficiente los indeles inducidos por FokI-dCas9 a sus sitios diana (sitios 47 y 81 de EGFP) en celulas U2OS.EGFP humanas (Figura 5C). El reemplazo de uno u otro ARNg en cada uno de estos dos pares con un ARNg dirigido a un sitio no relacionado en VEGFA dio como resultado la reduccion de la actividad de alteracion de EGFP (Figura 6A) y la reduccion de mutaciones dirigidas a niveles no detectables segun se determino por los ensayos T7EI (Figura 6B). De manera similar, los efectos de usar solo uno de cada uno de los dos ARNg se sometieron a prueba utilizando pares que introducen eficientemente los indeles mediados por FokI-dCas9 en los genes APC, MLH1 y VEGFA humanos (Tabla 2) y de nuevo se observo una perdida detectable de indeles inducidos por RFN detectables por ensayo T7EI (Figura 6C). Estos resultados demuestran que la induccion eficiente de la edicion del genoma por una RFN requiere dos ARNg con una complementariedad apropiada con el sitio diana de longitud completa.
Dado que las actividades de estas RFN dependen de la expresion de dos ARNg, era de esperar que sus efectos mutagenos en los sitios inespecfficos conocidos de uno de los ARNg individuales en el par fueran despreciables. La forma de realizacion de estas comparaciones directas requiere conocer los sitios inespecfficos para una nucleasa Cas9 monomerica guiada por un ARNg individual que tambien puede servir a uno de los dos ARNg necesarios para dirigirse a una RFN dimerica. Aunque en la bibliograffa se han definido muy pocos sitios inespecfficos de la nucleasa Cas9 monomerica, se identificaron previamente cinco sitios inespecfficos para uno de los ARNg que se utilizaron para dirigir el sitio de las RFN dimericas al gen VEGFA humano (Ejemplo 1). Se utilizo la secuenciacion profunda para determinar si estos cinco sitios inespecfficos mostraron evidencia de mutaciones en las celulas en las que se habfan expresado las RFN dirigidas a VEGFA (estas son las mismas celulas que se usaron para el ensayo T7EI que se muestra en la Figura 6C). La frecuencia de las mutaciones indel en los cinco sitios inespecfficos fue indistinguible del fondo (Figura 6D y Tabla 3). Estos resultados demuestran que el uso de las RFN puede eliminar esencialmente los efectos inespecfficos originalmente inducidos por la nucleasa Cas9 y un solo ARNg y son consistentes con la observacion de que un solo ARNg expresado con FokI-dCas9 no induce eficientemente indeles. Aunque, en la actualidad, no es posible realizar estas comparaciones directas en sitios adicionales (tales experimentos tendran que esperar a la identificacion de sitios inespecfficos para obtener mas sitios de ARNg individuales que tambien puedan dirigirse a un semisitio para una RFN dimerica), se concluyo que las RFN dimericas tienen especificidades mejoradas en relacion con las nucleasas Cas9 monomericas estandar.
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Ejemplo 2e. Las Cas9 nickasas monomericas inducen mayores tasas de mutagenesis que los complejos de ARNg individual/FokI-dCas9
Como se aprecio anteriormente, una debilidad importante del enfoque de las Cas9 nickasas emparejadas es que las nickasas monomericas individuales pueden introducir mutaciones indel con altas frecuencias en ciertos sitios diana (veanse el Ejemplo 1 y Ran et al., Cell 154, 1380-1389 (2013); Mali et al., Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013); Cho et al., Genome Res (2013); y Mali et al., Science 339, 823-826 (2013)). Esta falta de dependencia de la dimerizacion en el sistema de Cas9 nickasas emparejadas es una fuente potencial de efectos inespecfficos, ya que las dos nickasas monomericas pueden crear mutaciones indel no deseadas en otras partes del genoma. Se planted la hipotesis de que debido a que las RFN introducen alteraciones utilizando una nucleasa FokI dependiente de la dimerizacion, estas fusiones generalmente deberfan mostrar una actividad indel menos indeseable en presencia de solo un ARNg en comparacion con lo que se observa con las Cas9 nickasas monomericas.
Para probar esta hipotesis, las actividades de FokI-dCas9 y Cas9 nickasa se compararon en presencia de un solo ARNg en seis sitios diana de genes humanos dimericos (un total de 12 semisitios; Tabla 4). Estos sitios en particular se eligieron porque las Cas9 nickasas monomericas dirigidas por solo uno y/o el otro ARNg en un par podrfan inducir mutaciones indel en estas dianas. Usando secuenciacion profunda, las actividades de edicion del genoma de FokldCas9 o Cas9 nickasa se evaluaron en presencia de ambos o solo uno u otro ARNg. Tanto FokI-dCas9 como Cas9 nickasa indujeron indeles en los seis sitios diana con altas eficiencias en presencia de dos ARNg (Tabla 5). De acuerdo con la hipotesis, las Cas9 nickasas monomericas dirigidas por los 12 ARNg individuales indujeron indeles con frecuencias que variaban del 0,0048% al 3,04% (Figura 7A y Tabla 5). Por el contrario, FokI-dCas9 dirigido por los mismos 12 ARNg indujo indeles a frecuencias inferiores que variaban del 0,0045% al 0,473% (Figura 7A y Tabla 5). Comparando estos datos directamente, FokI-dCas9 indujo indeles con frecuencias mas bajas que las de Cas9 nickasa para 10 de los 12 ARNg individuales (Figura 7A y Tabla 5). Ademas, FokI-dCas9 mostro mayores reducciones multiples en las frecuencias de indel que la Cas9 nickasa en 11 de los 12 semisitios cuando se comparan las tasas de ARNg emparejadas con las tasas de ARNg individuales (Figura 7B).
Tabla 4
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Tabla 5. Secuenciacion profunda de controles de Fokl-dCas9, Cas9n, y tdTomato en 6 sitios, con ARNg individuales y pares de ARNg (mismos datos que los presentados en la Figura 7).
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Tabla 5. Secuenciacion profunda de controles de Fokl-dCas9, Cas9n, y tdTomato en 6 sitios, con ARNg individuates y pares de ARNg (mismos datos que los presentados en la Figura 7).
Figure imgf000046_0002
Los experimented de secuenciacion profunda tambien revelaron un efecto secundario previamente no descrito e inesperado de ciertas Cas9 nickasas monomericas: la introduccion de mutaciones puntuales en posiciones particulares dentro de sus sitios diana. La Cas9 nickasa expresada conjuntamente con un solo ARNg para el semisitio "derecho" de la diana de VEGFA indujo sustituciones de bases en la posicion 15 del sitio de reconocimiento a una frecuencia del 10,5% (Figura 8A). Se observaron resultados similares con Cas9 nickasa y ARNg individuales dirigidos al semisitio "derecho" del sitio diana 1 de FANCF (frecuencia de mutacion del 16,3% en la posicion 16) (Figura 8B) o al semisitio "derecho" del sitio diana de RUNX1 (frecuencia de mutacion del 2% en la posicion 17) (Figura 8C). No se observaron mutaciones puntuales en estas posiciones por encima de los niveles de fondo en las muestras de control en las que no se expresa Cas9 nickasa ni ARNg en la celula (Figuras 8A-8C). De forma interesante, para dos de los tres sitios en los que se observo esta hipermutacion, la mayorfa de las sustituciones observadas son transversiones de C a G en la cadena de ADN sin diana. Las posiciones en las que se observaron estas mutaciones puntuales estaban dentro de una region separada por cadena del sitio diana que se ha observado que es susceptible a la nucleasa PI in vitro en un complejo dCas9/ARNg/ADN diana. Es importante destacar que estas mutaciones puntuales se producen a frecuencias mucho mas bajas (de cinco a 100 veces mas bajas) en las celulas que expresan la protefna FokI-dCas9 y los mismos ARNg (Figura 8A-C). En general, se llego a la conclusion de que las nucleasas FokI-dCas9 dirigidas por un solo ARNg generalmente inducen mutaciones indel y puntuales mutagenicas con frecuencias mas bajas que las Cas9 nickasas individuales emparejadas.
Ejemplo 2f. Las RFN dimericas poseen un alto grado de especificidad
No se espera que las RFN dimericas dirigidas por dos ARNg induzcan mutaciones inespecfficas apreciables en las celulas humanas. Se espera que las RFN, dirigidas por un par de ARNg para escindir una secuencia de longitud completa compuesta por dos semisitios, especifiquen hasta 44 pb de ADN en el sitio diana. Una secuencia de esta longitud, por azar, casi siempre sera unica (excepto en ciertas circunstancias donde la diana podrfa estar en una secuencia genomica duplicada). Ademas, los sitios mas estrechamente emparejados en el genoma con este sitio de longitud completa deben poseer, en la mayorfa de los casos, un gran numero de emparejamientos incorrectos, que a su vez se espera que minimicen o eliminen la actividad de escision por un dfmero de RFN. De hecho, en este estudio se identificaron todos los sitios en el genoma humano que tienen de 0 a 16 emparejamientos incorrectos (y que permiten espaciadores de longitud de 14 a 17 pb) para las 15 secuencias de longitud completa dirigidas con exito con las RFN. Este analisis mostro que las 15 secuencias de longitud completa eran unicas y que los sitios mas estrechamente emparejados en el genoma variaban de 7 a 12 emparejamientos incorrectos (Tabla 6). Los sitios que contienen este numero de emparejamientos incorrectos no deben someterse a mutagenesis de manera eficiente por las RFN y sera interesante en futuros estudios confirmar esta hipotesis. En general, las RFN dimericas deben poseer un alto grado de especificidad en las celulas humanas, pero la caracterizacion definitiva de la especificidad esperara el desarrollo de metodos imparciales que puedan definir exhaustivamente la especificidad de las RFN en todo el genoma.
Tabla 6. Frecuencias de los sitios inespecfficos de FokI-dCas9 candidatos en el genoma humano que tienen n n m r fini m r mi n in rr
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una protefna de fusion de nucleasa FokI guiada por ARN (RFN), que comprende una secuencia de dominio catalftico de FokI fusionada al extremo amino de una protefna 9 (dCas9) asociada a CRISPR catalfticamente inactiva.
2. La protefna de fusion de la reivindicacion 1, que comprende ademas un conector intermedio.
3. La protefna de fusion de la reivindicacion 2, que comprende un conector de 2-30 aminoacidos.
4. La protefna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el dominio catalftico de FokI comprende los aminoacidos 388-583 o 408-583 de la SEQ ID NO:4.
5. La protefna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la dCas9 comprende mutaciones en D10A y H840A.
6. Un acido nucleico que codifica la protefna de fusion de las reivindicaciones 1-5.
7. Un vector que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 6.
8. Una celula huesped que expresa la protefna de fusion de las reivindicaciones 1-5.
9. Un metodo para inducir una ruptura especffica de secuencia en una secuencia genomica en una celula, comprendiendo el metodo expresar en la celula, o poner en contacto la celula con, la protefna de fusion de nucleasa FokI guiada por ARN (RFN) de las reivindicaciones 1-5, y
(a) dos ARN gufa unicos, en los que un ARN gufa unico se dirige a una primera cadena, y el otro ARN gufa se dirige a la cadena complementaria, y FokI corta cada cadena dando como resultado un par de muescas en cadenas de ADN opuestas, creando de este modo una rotura bicatenaria; o
(b) un ARNtracr y dos ARNcr, en los que un ARNtracr se dirige a una primera cadena, y el otro ARNcr se dirige a la cadena complementaria, y FokI corta cada cadena dando como resultado un par de muescas en cadenas de ADN opuestas, creando de este modo una rotura bicatenaria.
10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 6, en el que la protefna de fusion RFN dCas9 tiene mutaciones en D10A y H840A y la especificidad de la edicion del genoma guiada por ARN en una celula aumenta.
11. Un metodo para aumentar la especificidad de la edicion del genoma guiada por ARN en una celula, comprendiendo el metodo poner en contacto la celula con una protefna de fusion de nucleasa FokI guiada por ARN (RFN) de la reivindicacion 5.
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