JP2023526007A - β－ヘモグロビン異常症の処置のための塩基編集アプローチ - Google Patents

Abstract

β－ヘモグロビン異常症の臨床歴は、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰＦＨ）の突然変異としても知られるＨＢＢクラスターの遺伝子変異に典型的には関連する成人期における胎児γ－グロビンの合成によって、重症度が緩和されることを示している。本発明者らは、γ－グロビンプロモーターにおける公知のＨＰＦＨ突然変異の大半（Ｃ＞Ｔ、Ｇ＞Ａ、Ｔ＞Ｃ、又はＡ＞Ｇ）が、ＣＢＥ及びＡＢＥ媒介塩基編集アプローチを使用して再現することができることを同定した。特に、本発明者らは、ＣＢＥ又はＡＢＥと組み合わせた場合に、ＨＰＦＨ突然変異を生じ、転写抑制因子の結合部位（－２００及び－１１５の部位）を破壊するか、又は転写活性化因子によって認識されるde novo ＤＮＡモチーフ（例えば－１９８Ｔ＞Ｃ、－１７５Ｔ＞Ｃ、及び－１１３Ａ＞Ｇ）を生成するかのいずれかである、ｇＲＮＡを設計した。－２００及び１１５領域に標的化するｇＲＮＡのサブセットが、同時にＨＰＦＨ突然変異を生じ、また、ＬＲＦ又はＢＣＬ１１Ａ結合部位内又はその周囲にＨＰＦＨ突然変異以外の塩基の変化を作り、これはＬＲＦ及びＢＣＬ１１Ａの占有率を更に減少させ得るであろうと予測されることは特筆すべきである。したがって、本発明は、β－ヘモグロビン異常症の処置のための塩基編集アプローチに関する。

Description

発明の分野：
本発明は、医学、特に血液学の分野のものである。

発明の背景：
β－ヘモグロビン異常症（β－サラセミア及び鎌状赤血球症（ＳＣＤ））は、成人のヘモグロビン（Ｈｂ）の合成又は構造に影響を及ぼす、β－グロビン遺伝子座内の突然変異によって引き起こされる単一遺伝子疾患である。β－サラセミアは、成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）四量体に含まれるβ－グロビン鎖の産生を減少（β^＋）又は消失（β^０）させるβ－グロビン遺伝子（ＨＢＢ）の遺伝子座の突然変異によって引き起こされ、これにより、結合していないα－グロビン鎖の沈降、赤血球系細胞の死滅、及び重度の貧血に至る^（１）。ＳＣＤでは、ＨＢＢ遺伝子のＡ＞Ｔ突然変異は、β－グロビン鎖の６位のグルタミン酸のバリンでの置換を引き起こし（β^Ｓ）、これは脱酸素により誘発される鎌状赤血球ヘモグロビン（ＨｂＳ）の重合化の原因である。この初期事象は、赤血球（ＲＢＣ）の鎌状化、溶血、血管閉塞性危機、多臓器障害を誘引し、しばしばひどく短くなった平均余命を伴う^（２）。

β－ヘモグロビン異常症の唯一の確実な治療法は、患者の３０％未満に適用可能な選択肢である、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）適合性ドナーに由来する同種造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植である^（３）。自己の遺伝子改変されたＨＳＣの移植に基づいた遺伝子療法アプローチは、適合性ドナーのない患者の処置選択肢として研究されている^（４）。直接的な遺伝子の修正に基づいたゲノム編集技術が、β－ヘモグロビン異常症の治療アプローチを開発するために活用された。これらのアプローチは、特定のゲノム標的に対して相補的なシングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を介して、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムなどのデザイナーヌクレアーゼを使用する^（４）。

β－ヘモグロビン異常症の臨床歴は、β－サラセミア及びＳＣＤのどちらの重症度も、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰＦＨ）の突然変異としても知られるＨＢＢクラスター内の遺伝子変異（欠失又は点突然変異）に典型的には関連する成人期における胎児γ－グロビンの合成によって緩和されることを示している^（５）。胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）は、β－サラセミアにおける成人ヘモグロビンの欠損を補い、γ－グロビンは、鎌状β鎖の突然変異体を置き換えることによって、ＳＣＤにおいて強力な抗鎌状化作用を発揮する^（４）。特に、γ－グロビン遺伝子（ＨＢＧ１及びＨＢＧ２）の２つの同一のプロモーターにおける突然変異は、転写活性化因子（ＴＡＬ１、ＫＬＦ１及びＧＡＴＡ１）によって認識されるde novo ＤＮＡモチーフを生成するか^{（６、７、８）}、又は、転写抑制因子（ＬＲＦ及びＢＣＬ１１Ａ）の結合部位を破壊するかのいずれかである^（９）。β－サラセミア及びＳＣＤの両方の可能性ある治療法として、胎児γ－グロビンの発現を再活性化することを目標として、患者の造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）における遺伝性高胎児ヘモグロビン血症の突然変異を模倣した、欠失又は挿入の発生を介するシス調節配列の破壊に基づき、その赤血球系前駆細胞における胎児ヘモグロビンの発現を再活性化する、いくつかのゲノム編集ストラテジーが開発された^（１０）。γ－グロビンプロモーター内のＬＲＦ及びＢＣＬ１１Ａの抑制因子の結合部位のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による破壊は、胎児ヘモグロビンの発現を効率的に再活性化し、ＳＣＤ ＲＢＣの表現型を寛解する^（１）。しかしながら、抑制因子結合部位を破壊する欠失の大部分は、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）によって引き起こされ、これは、大半が分裂中の前駆細胞から構成される、ＨＳＰＣ集団の長期間かけて再増殖中の静止状態のＨＳＣの画分においては効果的ではない場合がある^{（１１、１２）}。

ＨＳＣは、特に複数のオンターゲット事象が存在する場合、又はオンターゲット事象とオフターゲット事象が同時に存在する場合、ＤＮＡのＤＳＢ^（１３）に対して非常に感度が高いことは特筆すべきである。高度に特異的なｇＲＮＡを使用する場合でさえ、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡによるヒトＨＳＰＣの処置は、ＤＮＡ傷害応答を誘導し、これによりアポトーシスに至り得る^（１４）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、Ｐ５３依存性の細胞毒性及び細胞周期停止を引き起こし得、その結果、機能的なＰ５３経路を有する細胞の負の選択がなされる^（１５）。更に、いくつかのオンターゲットのＤＳＢ、オンターゲット及びオフターゲットの同時ＤＳＢ、又は更には単一のオンターゲットのＤＳＢの発生でさえ、欠失、逆位、及び転座のリスクを伴う^（１６）。したがって、ＤＳＢにより誘発されるＤＮＡ修復よりもむしろ、正確な塩基の編集に基づいたβ－ヘモグロビン異常症の新規で効果的で安全な治療ストラテジーの開発の方が優先される。

近年、ＣＲＩＳＰＲシステムに基づいたシトシン塩基編集酵素及びアデニン塩基編集酵素（ＣＢＥ及びＡＢＥ）は、殆ど又は全くＤＳＢを生じることなく、ＤＮＡのピンポイントな変化を起こすことができることが示された^（１７）。塩基編集酵素の基本成分は、触媒能のないＣａｓ９ヌクレアーゼ及びデアミナーゼであり；これらは最終的にＣ－ＧからＴ－Ａへの、又はＡ－ＴからＧ－Ｃへの変換を生じる（それぞれＣＢＥ及びＡＢＥについて）^（１８）。塩基編集アプローチは、実質的にＤＳＢを伴わない、正確なＤＮＡの修復を可能とし、よってＤＳＢにより誘発されるアポトーシス、転座、及びＤＮＡの大部分の挿入又は欠失のリスクは排除される。更に、塩基編集は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼよりも低いレベルのオフターゲット活性を有する^（１７）。重要なことには、塩基編集は、静止状態の細胞で起こり、このことは、真正のＨＳＣを、この新規技術を使用して遺伝子的に改変することができ^（１９）、これにより非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって誘導される不均一かつ予測不可能な突然変異誘発と比較して、均一で予測可能な塩基変化が起こることを示唆する。

発明の概要：
本発明は、特許請求の範囲によって定義される。特に、本発明は、β－ヘモグロビン異常症の処置のための塩基編集アプローチに関する。

発明の詳細な説明：
本発明者らは、γ－グロビンプロモーターにおける既知の遺伝性高胎児ヘモグロビン血症の突然変異の大半（Ｃ＞Ｔ、Ｇ＞Ａ、Ｔ＞Ｃ、又はＡ＞Ｇ）は、ＣＢＥ及びＡＢＥにより媒介される塩基編集アプローチを使用して再現することができることを同定した（図１）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼに基づいたストラテジーと比較して、塩基編集アプローチは、γ－グロビンプロモーター内の複数の領域の同時標的化、例えば、－２００及び－１１５結合部位の両方を破壊する遺伝性高胎児ヘモグロビン血症の突然変異の発生を可能とし得る。γ－グロビン抑制におけるＬＲＦ及びＢＣＬ１１Ａの独立した役割を考えると、これは、胎児ヘモグロビンの再活性化に対して相加作用を及ぼす可能性がある^（２０）。これに対し、γ－グロビンプロモーターの２つの異なる領域（例えば－２００及び－１１５）に標的化するＣａｓ９ヌクレアーゼに基づいたストラテジーはおそらく、介入配列の欠失をトリガーし、これはプロモーター活性にとって有害である可能性があるだろう^（９）。更に、塩基編集は、転写活性化因子のための複数の新規結合部位が生じるように設計することができる（例えば－１９８Ｔ＞Ｃ、－１７５Ｔ＞Ｃ、及び－１１３Ａ＞Ｇ）^（２１）。重要なことには、この配列は、ＨＢＧ２発現の欠失に至るであろう、２つのγ－グロビンプロモーターにおける同時切断から生じる、ＨＢＧ１プロモーターとＨＢＧ２プロモーターの間の領域の起こり得るＣａｓ９により媒介される欠失を回避するだろう^（２２）。本発明者らは以前に、この種類の欠失が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼにより編集されるＨＵＤＥＰ－２において１０～１５％の頻度で起こることを示した^（１１）。重要なことには、塩基編集アプローチは、マイクロホモロジー媒介末端結合経路に依拠せず、起こり得るＤＳＢにより誘発される毒性を回避するだろう。したがって、本発明者らは、ＣＢＥ又はＡＢＥと組み合わせた場合に、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症の突然変異を生じ、転写抑制因子の結合部位（－２００及び－１１５部位）を破壊するか、又は、転写活性化因子によって認識されるde novo ＤＮＡモチーフ（例えば－１９８Ｔ＞Ｃ、－１７５Ｔ＞Ｃ、及び－１１３Ａ＞Ｇ）を生成するかのいずれかである、ｇＲＮＡを設計した（図１）。－２００及び１１５領域に標的化するｇＲＮＡのサブセットが、同時に遺伝性高胎児ヘモグロビン血症の突然変異を生じ、またＬＲＦ及びＢＣＬ１１Ａ結合部位内又はその周囲に遺伝性高胎児ヘモグロビン血症の突然変異以外の塩基変化を起こし、これにより更にＬＲＦ及びＢＣＬ１１Ａの占有率が減少し得ることが予測されることは特筆すべきである^（２３）。

β－グロビン遺伝子座における、ＨＢＧ１／２プロモーター内のＨＰＦＨ突然変異。ＨＢＧ２及びＨＢＧ１遺伝子及びそれらのプロモーターを示した、第１１番染色体上のβ－グロビン遺伝子座の図解。ＨＢＧ２及びＨＢＧ１の同一のプロモーターの配列（ＨＢＧ転写開始点の上流にある－２１４から－９８ヌクレオチド）が以下に示されている。黒色の矢印は、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーターにおいて記載されたＨＰＦＨ突然変異を示す。転写活性化因子（ＴＡＬ１、ＫＬＦ１及びＧＡＴＡ１）結合部位の新規作出をもたらすＨＰＦＨ突然変異が、ＤＮＡ配列の上にあり、一方、転写抑制因子（ＬＲＦ及びＢＣＬ１１Ａ）の破壊をもたらすＨＰＦＨ突然変異は、ＤＮＡ配列の下にある。塩基編集によって生じ得るＨＰＦＨ突然変異は、長方形で強調されている。楕円形は、転写活性化因子及び抑制因子を示す。塩基編集酵素と共に使用されるために設計されたｇＲＮＡの標的配列は、図の下の部分に報告され（黒い矢印で強調されている）、それらが結合するＤＮＡ配列と共に整列している。標的塩基は、白色の太文字で強調され、残りのプロトスペーサー配列は、灰色で強調されている。各ｇＲＮＡについてのＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）は、矢印の最後に黒色で報告されている。 Ｋ５６２細胞内のＨＢＧ１／２プロモーターの効率的な塩基編集。（Ａ～Ｍ）サンガーシーケンスにかけられた試料中の、ＥｄｉｔＲソフトウェアによって計算された、Ａ－ＴからＧ－Ｃ（Ａ－Ｃ、Ｎ）又はＣ－ＧからＴ－Ａ（Ｄ－Ｍ）への塩基編集効率。塩基編集効率の比率は、バックグラウンドノイズと判断された対照における塩基変換率を差し引くことによって測定された。各グラフの上に、使用される標的及び酵素が示されている。データは、平均値±標準偏差（ｎ＝２～３の生物学的に独立した実験）として表現される。（Ｏ）ＴＩＤＥ分析によって測定された、挿入及び欠失（インデル）の頻度が、対照及び塩基編集試料について報告されている。（Ｐ）ドロップレットデジタルＰＣＲによって測定される、４．９ｋｂの欠失の頻度が、対照及び塩基編集試料について、並びに陽性対照（基準のＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて編集されたＫ５６２細胞から抽出されたＤＮＡ）について報告されている。（Ｑ）DiffLogoによって分析されるような塩基編集後の結合部位の変換^（２６）。^＊２つの異なるｇＲＮＡ（ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１及びＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿２）を、酵素ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ及びｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧと組み合わせて使用した（グラフＥ及びＦ）。同様に、２つの異なるｇＲＮＡ（ＬＲＦ＿ｂｓ＿１及びＬＲＦ＿ｂｓ＿２）を、ＣＢＥ－ＳｐＲＹ酵素と組み合わせて使用した（グラフＬ及びＭ）。 ＨＵＤＥＰ－２細胞内のＨＢＧ１／２プロモーターの効率的な塩基編集。サンガーシーケンスにかけられた試料中の、ＥｄｉｔＲソフトウェアによって計算された、Ａ－ＴからＧ－Ｃ（Ａ－Ｃ）又はＣ－ＧからＴ－Ａ（Ｄ－Ｈ）への塩基編集効率。塩基編集効率は、図２の説明文に記載のように計算された。各グラフの上に、使用される標的及び酵素が示されている。（Ｉ）ＴＩＤＥ分析によって測定された、挿入及び欠失（インデル）の頻度が、対照及び塩基編集試料について報告されている。（Ｊ）DiffLogoによって分析されるような塩基編集後の結合部位の変換^（２６）。^＊２つの異なるｇＲＮＡ（ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１及びＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿２）を、酵素ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ及びｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧと組み合わせて使用した（グラフＥ及びＦ）。 ＨＵＤＥＰ－２細胞におけるＴＡＬ１及びＫＬＦ１の結合部位の発生後の胎児ヘモグロビンの脱抑制。（Ａ）赤芽球分化の０日目（Ｄ０）及び９日目（Ｄ９）におけるグリコホリンＡ（ＧＰＡ）^高い集団における胎児ヘモグロビン発現細胞の出現頻度（フローサイトメトリーによって決定されるような）。塩基編集効率は、各々の黒色の棒グラフの上に示されている（Ｄ０）。（Ｂ）赤芽球分化の０日目、６日目及び９日目におけるβ－及びγ－グロビンｍＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ分析。β－及びγ－グロビンｍＲＮＡ発現は、α－グロビンｍＲＮＡに対して正規化され、全β様グロビンに対する比率として表現された。（Ｃ）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって測定されるγ－（^Ｇγ－＋^Ａγ－）及びβ－グロビン鎖の発現。β様グロビン鎖の発現は、α－グロビンに対して正規化された。（Ｄ）陽イオン交換ＨＰＬＣによるＨｂＦ及びＨｂＡの分析。本発明者らは、全体のＨｂ四量体に対する、各Ｈｂ型の比率を計算した。（Ｅ～Ｇ）ＨＵＤＥＰ－２分化の０日目及び９日目における、後期赤血球系マーカーＧＹＰＡ（Ｅ）及び初期赤血球系マーカーＣＤ３６（Ｆ）及びＣＤ７１（Ｇ）のフローサイトメトリー分析。 ＨＵＤＥＰ－２細胞におけるＢＣＬ１１Ａ結合部位の破壊時のＨｂＦの再活性化。（Ａ～Ｃ）ＨＵＤＥＰ－２の分化の０日目及び９日目における、後期赤血球系マーカーＧＹＰＡ（Ａ）並びに初期赤血球系マーカーＣＤ３６（Ｂ）及びＣＤ７１（Ｃ）のフローサイトメトリー分析。（Ｄ）赤芽球分化の０日目（Ｄ０）及び９日目（Ｄ９）におけるＧＰＡ^高い集団内のＨｂＦ発現細胞の出現頻度（フローサイトメトリーによって決定されるような）。塩基編集効率が、各々の黒色の棒グラフの上に示されている（Ｄ０）。（Ｅ）赤芽球分化の０日目、６日目及び９日目における、β－及びγ－グロビンｍＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ分析。β－及びγ－グロビンｍＲＮＡの発現は、α－グロビンｍＲＮＡに対して正規化され、全β様グロビンに対する比率として表現された。（Ｆ）ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定されるγ－（^Ｇγ－＋^Ａγ－）及びβ－グロビン鎖の発現。（Ｇ）陽イオン交換ＨＰＬＣによるＨｂＦ及びＨｂＡの分析。本発明者らは、全Ｈｂ四量体に対する、各Ｈｂ型の比率を計算した。 ＨＵＤＥＰ－２細胞及びＨＳＰＣにおけるＬＲＦ結合部位の破壊時のＨｂＦの増加。（Ａ）未分化ＨＵＤＥＰ－２細胞のＧＰＡ^高い集団におけるＨｂＦ発現細胞の出現頻度（フローサイトメトリーによって決定されるような）。（Ｂ）ＬＲＦ結合部位を編集するために、ＨＳＰＣを、それぞれＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿ＮＡＡ及びＬＲＦ＿ｂｓ＿１ｇＲＮＡを発現している２つのプラスミドを用いてトランスフェクトした。サンガーシーケンスにかけられたＨＳＰＣ試料における、ＥｄｉｔＲソフトウェアによって計算されるようなＬＲＦ結合部位における塩基編集効率。塩基編集効率の比率は、図２の説明文に記載のように計算された。ＴＩＤＥ分析によって測定される、挿入及び欠失（インデル）の頻度が、対照及び塩基編集試料について報告されている。（Ｃ）DiffLogoによって分析されるようなＨＳＰＣ内の塩基編集後の結合部位の変換^（２６）。（Ｄ）対照及びＨＢＧの編集された赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ－Ｅ）コロニーのバルク集団における、陽イオン交換ＨＰＬＣによるＨｂＦ及びＨｂＡの定量。本発明者らは、全Ｈｂ四量体に対する、各Ｈｂ型の比率をプロットした。対照細胞は、ＴＥ緩衝液を用いて、又はＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿ＮＡＡプラスミドのみを用いて、又はＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿ＮＡＡプラスミドとβ－グロビン遺伝子座に関連していない部位に標的化しているｇＲＮＡ試料を用いてのいずれかでトランスフェクトされた試料を含む。 Ｋ５６２細胞内の、ＨＢＧ１／２プロモーター内の、低いＲＮＡオフターゲット活性を有する酵素による塩基編集効率。サンガーシーケンスにかけられた試料における、ＥｄｉｔＲソフトウェアによって計算された、Ａ－ＴからＧ－Ｃ（Ａ－Ｃ）又はＣ－ＧからＴ－Ａ（Ｄ）への塩基編集効率。塩基編集効率の比率は、図２の説明文に記載のように計算された。各グラフの上に、使用される標的及び酵素が示されている。各標的のために、本発明者らは、古典的な塩基編集酵素と、より低いＲＮＡオフターゲット活性を有する塩基編集酵素を比較した。 ＳＣＤ ＨＳＰＣにおけるＬＲＦ結合部位を破壊するＣＢＥの試験。サンガーシーケンスにかけられた試料における、ＥｄｉｔＲソフトウェアによって計算された、Ｃ－ＧからＴ－Ａ（Ａ及びＢ）への塩基編集効率。（Ｃ）ＴＩＤＥ分析によって測定された、挿入及び欠失（インデル）の頻度が、塩基編集試料について報告されている。（Ｄ）赤芽球分化の１３日目におけるβ^Ｓ－及びγ－グロビンｍＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ分析。β^Ｓ－及びγ－グロビンｍＲＮＡ発現は、α－グロビンｍＲＮＡに対して正規化され、全β様グロビンに対する比率として表現された。（Ｅ）ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定されたγ－（^Ｇγ－＋^Ａγ－）及びβ^Ｓ－グロビン鎖の発現。β様グロビン鎖の発現は、α－グロビンに対して正規化された。（Ｆ）陽イオン交換ＨＰＬＣによるＨｂＦ及びＨｂＳの分析。本発明者らは、全Ｈｂ四量体に対する各Ｈｂ型の比率を計算した。（Ｇ）赤芽球分化の１９日目におけるグリコホリンＡ（ＧＰＡ）^高い集団における、ＨｂＦ発現細胞の出現頻度（フローサイトメトリーによって決定されるような）。（Ｈ）偽トランスフェクトされた対照及び塩基編集試料における、酸素の除去時の非鎌状化細胞の出現頻度。（Ｄ－Ｆ及びＨ）各グラフの下に、塩基編集効率（ＢＥ％）、陽イオン交換ＨＰＬＣによって測定されるような全Ｈｂ四量体に対するＨｂＦの比率（ＨｂＦ％）、及びフローサイトメトリーによって決定されるようなＨｂＦ発現細胞の出現頻度（Ｆ細胞％）が、各試料について示されている。ドナー数ｎ＝１。 ＳＣＤ ＨＳＰＣにおいて、ＬＲＦ結合部位を破壊する又はＫＬＦ１結合部位を作出する、ＡＢＥの試験。サンガーシーケンスにかけられた試料における、ＥｄｉｔＲソフトウェアによって計算された、Ａ－ＴからＧ－Ｃ（Ａ及びＤ）への塩基編集効率。（Ｅ）ＴＩＤＥ分析によって測定された、挿入及び欠失（インデル）の出現頻度が、塩基の編集された試料について報告されている。（Ｆ）赤芽球分化の１３日目におけるβ^Ｓ－及びγ－グロビンｍＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ分析。β^Ｓ－及びγ－グロビンｍＲＮＡの発現が、α－グロビンｍＲＮＡに対して正規化され、全β様グロビンに対する比率として表現された。（Ｇ）ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定されるγ－（^Ｇγ－＋^Ａγ－）及びβ^Ｓ－グロビン鎖の発現。β様グロビン鎖の発現は、α－グロビンに対して正規化された。（Ｈ）陽イオン交換ＨＰＬＣによるＨｂＦ及びＨｂＳの分析。本発明者らは、全Ｈｂ四量体に対する各Ｈｂ型の比率を計算した。（Ｉ）対照試料（偽トランスフェクトされ、関連性のないＡＡＶＳ１遺伝子座において編集されている）及び塩基の編集された試料における、酸素除去時の、非鎌状化細胞の出現頻度。（Ｊ）赤芽球分化の１９日目のグリコホリンＡ（ＧＰＡ）^高い集団における、ＨｂＦ発現細胞の出現頻度（フローサイトメトリーによって決定されるような）。（Ｆ～Ｉ）各グラフの下に、塩基編集効率（ＢＥ％）、陽イオン交換ＨＰＬＣによって測定されるような全Ｈｂ四量体に対するＨｂＦの比率（ＨｂＦ％）、及びフローサイトメトリーによって決定されるようなＨｂＦ発現細胞の出現頻度（Ｆ細胞％）が、各試料について示されている。ドナー数ｎ＝１。 Ｋ５６２細胞及びＳＣＤ ＨＳＰＣにおける、ＨＢＧ１／２プロモーターでのＲＮＡにより媒介される塩基編集。（Ａ～Ｈ）Ｋ５６２及びＨＳＰＣにおける、Ａ－ＴからＧ－Ｃ又はＣ－ＧからＴ－Ａへの塩基編集効率。サンガーシーケンスにかけられたＫ５６２細胞（Ａ～Ｅ）及びＳＣＤ ＨＳＰＣ（Ｆ～Ｈ）試料における塩基編集効率が、ＥｄｉｔＲソフトウェアによって計算された。各グラフの上に、使用された酵素及びｇＲＮＡが示されている。

定義：
本明細書において使用する「β－ヘモグロビン異常症」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、個体の任意のヘモグロビンの構造又は機能の任意の異常を指し、そして、β－グロビン遺伝子のコード領域の欠失突然変異若しくは置換突然変異などの任意の突然変異、又は、正常な容態若しくは標準的な容態と比較して、ヘモグロビン産生量の減少を引き起こす、このような遺伝子のプロモーター若しくはエンハンサー内の突然変異若しくはその欠失によって引き起こされる、ヘモグロビンの一次、二次、三次、若しくは四次構造の異常を含む。

本明細書において使用する「鎌状赤血球症」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、グロビン遺伝子の突然変異から生じ、異常で硬く鎌状形を呈する赤血球によって特徴付けられる、常染色体劣性遺伝性血液疾患の一群を指す。それらは、ペプチドの６位のアミノ酸のグルタミン酸がバリンによって置換されている、β－グロビン鎖変異体をコードしているβＳ－グロビン遺伝子の存在によって定義される：ヘモグロビン四量体におけるβＳ－グロビン（ＨｂＳ、鎌状ヘモグロビン）の取り込みは、ヘモグロビンの重合及び臨床表現型をもたらす。該用語は、鎌状細胞貧血（ＨｂＳＳ）、鎌状ヘモグロビンＣ疾患（ＨｂＳＣ）、鎌状βプラスサラセミア（ＨｂＳ／β＋）、又は鎌状β－ゼロサラセミア（ＨｂＳ／β０）を含む。

本明細書において使用する「β－サラセミア」という用語は、正常なヘモグロビン四量体タンパク質の産生低下、及び対を形成していない遊離α－グロビン鎖の沈降をもたらす、α－グロビンポリペプチド鎖とβ様グロビンポリペプチド鎖の変化した比から生じる、ヘモグロビン異常症を指す。

本明細書において使用する「造血幹細胞」又は「ＨＳＣ」という用語は、自己再生し、血液細胞の前駆体へと分化する能力を有する、血液細胞を指す。これらの前駆細胞は、自己再生できず、かつ成熟した血液細胞へと分化しなければならない未熟血液細胞である。造血幹前駆細胞は、多くの表現型、例えばＬｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－、Ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０－ＣＤ４５ＲＡ－、Ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＩＬ－３ａｌｏＣＤ４５ＲＡ－、及びＬｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０＋を示す（Daley et al., Focus 18:62-67, 1996; Pimentel, E., Ed., Handbook of Growth Factors Vol. III: Hematopoietic Growth Factors and Cytokines, pp. 1-2, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1994）。骨髄微小環境内では、幹細胞は自己再生し、一生を通じて全ての成熟血液細胞を生じる、造血幹細胞の持続的な産生を維持する。いくつかの実施態様では、造血前駆細胞又は造血幹細胞は、末梢血液細胞から単離される。

本明細書において使用する「末梢血液細胞」という用語は、循環中の血液プール内に見られる、赤血球、白血球、及び血小板を含んでいる、血液の細胞性成分を指す。いくつかの実施態様では、真核細胞は骨髄由来幹細胞である。

本明細書において使用する「骨髄由来幹細胞」という用語は、骨髄に見られる幹細胞を指す。幹細胞は、多能性を有する接着性間質細胞型として、又は、血液細胞へと分化することのできる造血幹細胞を識別するＣＤ３４若しくはＣＤ４５細胞表面タンパク質を発現する細胞としてのいずれかで、骨髄内に存し得る。

本明細書において使用する「動員」又は「幹細胞の動員」という用語は、動員剤を用いての処置後に、幹細胞の滞留している組織又は臓器から末梢血への補充に関与するプロセスを指す。このプロセスは、損傷及び炎症中のストレスシグナルに応答した、組織又は臓器からの幹細胞の生理学的放出の増強を模倣する。動員プロセスの機序は、投与される動員剤の種類に依存する。いくつかの動員剤は、幹細胞がそれらの微小環境の細胞又は組織に付着するのを妨げる、アゴニスト又はアンタゴニストとして作用する。他の動員剤は、幹細胞とその付着部位との間の接着分子又は支持構造を切断するプロテアーゼの放出を誘導する。

本明細書において使用する「動員剤」という用語は、幹細胞の滞留している組織又は臓器から、例えば骨髄（例えばＣＤ３４^＋幹細胞）及び脾臓（例えばＨｏｘ１１陽性幹細胞）から末梢血への動員を増強するように作用する、多種多様な分子を指す。動員剤としては、化学療法薬、例えばシクロホスファミド及びシスプラチン；サイトカイン及びケモカイン、例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３（ｆｌｔ－３）リガンド、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ－１）；ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体１（ＣＣＲ１）のアゴニスト、例えばケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド３（ＣＣＬ３、マクロファージ炎症タンパク質－１α（Ｍｉｐ－１α）としても知られる）；ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）受容体１（ＣＸＣＲ１）及び２（ＣＸＣＲ２）のアゴニスト、例えばケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＸＣＬ２）（増殖関連発癌遺伝子タンパク質－β（Ｇｒｏ－β）としても知られる）、及びＣＸＣＬ８（インターロイキン－８（ＩＬ－８）としても知られる）；ＣＸＣＲ４のアゴニスト、例えばＣＴＣＥ－０２１４２、及びＭｅｔ－ＳＤＦ－１；最晩期抗原（ＶＬＡ）－４阻害剤；ＣＸＣＲ４のアンタゴニスト、例えばＴＧ－００５４、プレリキサフォル（ＡＭＤ３１００としても知られる）、及びＡＭＤ３４６５、又は前記の薬剤の任意の組合せが挙げられる。動員剤は、末梢血中の幹細胞の数を増加させ、よって、移植、臓器の修復若しくは再生、又は疾患の処置に使用するための幹細胞のより入手しやすい入手源が可能となる。

本明細書において使用する「単離された細胞」という用語は、それが元来見られていた生物から取り出されたか、又はこのような細胞の子孫である細胞を指す。場合により、真核細胞は、インビトロで、例えば他の細胞の存在下で培養される。場合により、真核細胞は、第二の生物に後で導入されるか、又はそれ（又は子孫である細胞）が単離された生物に再導入される。本明細書において使用するような、本明細書において使用する単離された細胞集団に関する「単離された集団」という用語は、混合された又は不均一な細胞集団から取り出されたか又は分離された、細胞集団を指す。いくつかの実施態様では、単離された集団は、不均一な集団（これから細胞が単離又は濃縮された）と比較して、実質的に純粋な細胞集団である。

本明細書において使用する「ガンマグロビン」又は「γ－グロビン」という用語は、当技術分野にけるその一般的な意味を有し、ＨＢＧ１遺伝子及びＨＢＧ２遺伝子によってヒトにおいてコードされているタンパク質を指す。ＨＢＧ１遺伝子及びＨＢＧ２遺伝子は通常、胎児の肝臓、脾臓、及び骨髄に発現されている。２本のγ－グロビン鎖は、２本のα－グロビン鎖と一緒に、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を構成し、これは通常、生誕翌年に成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）によって置換される（Higgs DR, Vickers MA, Wilkie AO, Pretorius IM, Jarman AP, Weatherall DJ (May 1989). "A review of the molecular genetics of the human alpha-globin gene cluster". Blood. 73 (5): 1081-104.）。ＨＢＧ１及びＨＢＧ２のＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ（すなわちＥｎｓｅｍｂｌｅゲノムブラウザーデータベースの遺伝子識別番号）は、それぞれＥＮＳＧ０００００２１３９３４及びＥＮＳＧ０００００１９６５６５である。

本明細書において使用する「胎児ヘモグロビン含量を増加させる」という表現は、胎児ヘモグロビンが、関連性のない遺伝子座に標的化するエンドヌクレアーゼが存在するか又はエンドヌクレアーゼが全く存在しない、同等な真核細胞よりも、ＤＮＡ標的化エンドヌクレアーゼで処置された真核細胞の方が、少なくとも５％高いことを示す。いくつかの実施態様では、該真核細胞における胎児ヘモグロビンの発現の比率は、真核細胞よりも少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも３０％高い、少なくとも４０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも６０％高い、少なくとも７０％高い、少なくとも８０％高い、少なくとも９０％高い、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、又はそれ以上である。いくつかの実施態様では、当技術分野において公知である任意の方法、例えば、胎児γ－グロビンタンパク質の高速液体クロマトグラフィー分析、及び胎児γ－グロビンｍＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を使用して、胎児ヘモグロビンの発現増加を測定することができる。典型的には、該方法は、実施例に記載されている。

本明細書において使用する「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ鋳型から（例えばｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物へと）転写されるプロセス、及び／又は、転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされるポリペプチドはまとめて、「遺伝子産物」と称されてもよい。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞内のｍＲＮＡをスプライシングする工程を含み得る。

本明細書において使用する「プロモーター」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、プロモーター配列に作動可能に連結された遺伝子の発現に必要とされる、核酸配列を指す。ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーターは、－２２１ｂｐまで同一であり、配列番号１に示され図１に示されるような核酸配列を含む。本発明によると、配列番号１内の第一ヌクレオチドは、ＨＢＧ転写開始部位の上流の－２１０位に位置するヌクレオチドを示し、配列番号１内の最後のヌクレオチドは、ＨＢＧ転写開始部位の上流の－１００位に位置するヌクレオチドを示す。例えば、
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－２０１位のヌクレオチドは、配列番号１の１０位のヌクレオチドを示す、
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－２００位のヌクレオチドは、配列番号１の１１位のヌクレオチドを示す、
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１９８位のヌクレオチドは、配列番号１の１３位のヌクレオチドを示す、
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１９７位のヌクレオチドは、配列番号１の１４位のヌクレオチドを示す、
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１９６位のヌクレオチドは、配列番号１の１５位のヌクレオチドを示す、及び
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１９５位のヌクレオチドは、配列番号１の１６位のヌクレオチドを示す、
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１９４位のヌクレオチドは、配列番号１の１７位のヌクレオチドを示す、
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１７５位のヌクレオチドは、配列番号１の３６位のヌクレオチドを示す、
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１１７位のヌクレオチドは、配列番号１の９４位のヌクレオチドを示す、
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１１６位のヌクレオチドは、配列番号１の９５位のヌクレオチドを示す、
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１１５位のヌクレオチドは、配列番号１の９６位のヌクレオチドを示す、
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１１４位のヌクレオチドは、配列番号１の９７位のヌクレオチドを示す、
－ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１１３位のヌクレオチドは、配列番号１の９８位のヌクレオチドを示す。

配列番号１：＞ＨＢＧ１又はＨＢＧ２のプロモーターの配列

本明細書において使用するＨＢＧ１又はＨＢＧ２のプロモーター内の「－２００領域」は、－１９７位；－１９６位及び－１９５位のヌクレオチドを包含する領域を指し、よって、配列番号１における１１位のヌクレオチド（すなわち－２００）から始まり２１位のヌクレオチド（すなわち－１９０）までの領域、より好ましくは配列番号１における１４位のヌクレオチドから始まり１６位のヌクレオチドまでの領域に関する。

本明細書において使用するＨＢＧ１又はＨＢＧ２のプロモーター内の「－１１５領域」は、－１１６位；－１１５位；－１１４位；及び－１１３位のヌクレオチドを包含する領域を指し、したがって、配列番号１における９５位のヌクレオチド（すなわち－１１５）から始まり９８位のヌクレオチド（すなわち－１１３）までの領域に関する。

本明細書において使用する「活性化因子」という用語は、１つの遺伝子又は遺伝子のセットの遺伝子転写を増加させるタンパク質（転写因子）である、転写活性化因子を指す。大半の活性化因子は、エンハンサー又はプロモーター近位配列に結合するＤＮＡ結合性タンパク質である。本開示によると、活性化因子は、ＫＬ１、ＴＡＬ１及びＧＡＴＡ１からなる群より選択される。

本明細書において使用する「転写活性化因子結合部位」という用語は、本開示に記載の転写活性化因子が結合する、ＤＮＡ上に存在する部位を指す。本発明によると、本発明の塩基編集酵素は、真核細胞のゲノム配列を編集し、これにより、活性化因子は、その転写活性化因子結合部位に結合することができる。

本明細書において使用する「ＫＬＦ１」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、クルッペル様因子１タンパク質を指す。該用語は、ＥＫＬＦ；ＥＫＬＦ／ＫＬＦ１としても知られる。ＫＬＦ１は、成人β－グロビン及び他の赤血球系遺伝子の高レベルの発現を誘導する造血特異的転写因子である。ジンクフィンガータンパク質は、βヘモグロビンプロモーターに見られるＤＮＡ配列に結合する。

本明細書において使用する「ＴＡＬ１」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、赤芽球分化誘導因子であるＴＡＬ ｂＨＬＨ転写因子１を指す。該用語は、ＳＣＬ；ＴＣＬ５；ｔａｌ－１；及びｂＨＬＨａ１７としても知られる。

本明細書において使用する「ＧＡＴＡ１」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＧＡＴＡ結合性タンパク質１を指す。該用語は、ＧＦ１；ＧＦ－１；ＮＦＥ１；ＸＬＴＴ；ＥＲＹＦ１；ＮＦ－Ｅ１；ＸＬＡＮＰ；ＸＬＴＤＡ；及びＧＡＴＡ－１としても知られる。ＧＡＴＡ１は、ＧＡＴＡ転写因子ファミリーに属するタンパク質である。該タンパク質は、胎児ヘモグロビンから成人ヘモグロビンへの切り替えを調節することによって、赤血球系発達において重要な役割を果たす。

本明細書において使用する「抑制因子」という用語は、１つの遺伝子又は遺伝子のセットの遺伝子転写を減少させるタンパク質（転写因子）である、転写抑制因子を指す。大半の抑制因子は、エンハンサー又はプロモーター近位配列に結合するＤＮＡ結合性タンパク質である。本開示によると、抑制因子は、ＢＣＬ１１Ａ及びＬＲＦからなる群より選択される。

したがって、「転写抑制因子結合部位」という用語は、転写抑制因子が結合する、ＤＮＡ上に存在する部位を指す。いくつかの実施態様では、本発明の塩基編集酵素は、真核細胞のゲノム配列を編集するので、転写抑制因子は、その転写抑制因子の結合部位に結合することができない。いくつかの実施態様では、本発明のＤＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、ＬＲＦ又はＢＣＬ１１Ａのその結合部位への結合を阻害するだろう。

本明細書において使用する「ＢＣＬ１１Ａ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＢＡＦクロマチンリモデリング複合体サブユニットＢＣＬ１１Ａをコードしている遺伝子（遺伝子識別番号：５３３３５）を指す。該用語は、ＥＶＩ９；ＣＴＩＰ１；ＤＩＬＯＳ；ＺＮＦ８５６；ＨＢＦＱＴＬ５；ＢＣＬ１１Ａ－Ｌ；ＢＣＬ１１Ａ－Ｓ；ＢＣＬ１１ａ－Ｍ；又はＢＣＬ１１Ａ－ＸＬとしても知られる。別個のアイソフォームをコードしている、５つの選択的にスプライシングされたこの遺伝子の転写変異体が報告されている。該タンパク質は、クロマチンのリモデリングを介して、遺伝子の発現を調節する、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体と会合する。ＢＣＬ１１Ａは、いくつかの造血系統において高度に発現され、胎児から成人に移行する間に、γ－グロビンからβ－グロビンへの切り替えにおいて役割を果たす（Sankaran VJ et al. "Human fetal hemoglobin expression is regulated by the developmental stage-specific repressor BCL11A”, Science Science. 2008 Dec 19;322(5909):1839-42）。

本明細書において使用する「ＬＲＦ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＺＢＴＢ７Ａ遺伝子によってコードされる、白血病／リンパ腫関連因子（ＬＲＦ）である、転写抑制因子を指す。ＬＲＦは、Ｃ末端Ｃ２Ｈ２型ジンクフィンガーを通してＤＮＡに結合し、そしておそらくそのＮ末端ＢＴＢドメインを通して転写抑制因子複合体をリクルートする、ＺＢＴＢ転写因子である（Lee SU, Maeda T. Immunol. Rev. 2012;247:107-119）。

本明細書において使用する「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において同義語として使用され、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。該ポリマーは、鎖状であっても分枝状であってもよく、それは修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、それは非アミノ酸が介在していてもよい。該用語はまた、修飾されている；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ＰＥＧ化、又は任意の他の操作、例えば標識化成分とのコンジュゲーションなどを受けたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書において使用する「アミノ酸」という用語は、天然及び／又は非天然又は合成のアミノ酸、例えばグリシン及びＤ体若しくはＬ体の両方の光学異性体、並びにアミノ酸類似体、及びペプチド模倣体を含む。

本明細書において使用する「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばであって以下に限定されないが、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を指す。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。

本明細書において使用する「単離された」という用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及する場合、核酸分子又はポリペプチドが、それが天然の状態で会合しているか又は一緒に見られる、少なくとも１つの他の成分を実質的に含有していないことを意味する。

本明細書において使用する「相補性」という用語は、核酸が、伝統的なワトソンクリック塩基対形成又は他の非伝統的なタイプのいずれかによって、別の核酸配列と水素結合（群）を形成できることを指す。相補率は、第二の核酸配列と水素結合（例えばワトソンクリック塩基対形成）を形成することができる、核酸分子内の残基の比率（例えば、１０個中５個、６個、７個、８個、９個、１０個は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補性である）を示す。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続した残基が、第二の核酸配列内の同じ数の連続残基と水素結合を形成するであろうことを意味する。本明細書において使用する「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれ以上のヌクレオチドの領域にわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補度を指すか、あるいは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２本の核酸を指す。

本明細書において使用するハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」という用語は、標的配列に対して相補性を有する核酸が、主に標的配列にハイブリダイズし、実質的に非標的配列にはハイブリダイズしない、条件を指す。ストリンジェントな条件は一般的に配列依存性であり、多くの因子に応じて変化する。一般的には、配列が長ければ長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度はより高くなる。ストリンジェントな条件の非制限的な例は、Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”, Elsevier, N.Y.に詳述されている。

本明細書において使用する「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズしている」という用語は、完全に又は部分的に相補的な核酸鎖が、特定のハイブリダイゼーション条件下で集合し、２本の構成鎖が水素結合によって接続されている、二本鎖構造又は領域を形成する、プロセスを指す。水素結合は典型的には、アデニンとチミン又はウラシル（ＡとＴ又はＵ）、又はシトシンとグアニン（ＣとＧ）の間で形成されるが、他の塩基対も形成され得る（例えば、Adams et al., The Biochemistry of the Nucleic Acids, 11th ed., 1992）。

本明細書において使用する「塩基編集酵素」という用語は、デアミナーゼポリペプチドに連結された不完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含んでいる、融合タンパク質を指す。該用語は、「塩基エディター」としても知られる。２つのクラスの塩基編集酵素、すなわちシトシン塩基編集酵素（ＣＢＥ）及びアデニン塩基編集酵素（ＡＢＥ）を使用して、二本鎖の切断を伴うことなく、１塩基対の編集を行うことができる。典型的には、シトシン塩基編集酵素は、不完全なＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼをＡＰＯＢＥＣのようなシチジンデアミナーゼに融合することによって作出される。該塩基編集酵素は、ｇＲＮＡによって特定の遺伝子座に標的化され、それらは、ＰＡＭ部位の近くの小さな編集窓内でシチジンをウリジンへと変換することができる。ウリジンは、続いて、塩基切断修復を通してチミジンへと変換され、ＣからＴへの変化（又は反対鎖上ではＧからＡへ）が作出される。同様に、アデノシン塩基編集酵素は、不完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを、アデノシンデアミナーゼに縮合することによって作出される。該塩基編集酵素は、アデノシンをイノシンへと変換するように工学操作されており、このイノシンは細胞によってグアノシンと同様に処理され、ＡからＧ（又はＴからＣ）への変化が作出される。

本明細書において使用する「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」という用語は、２つ以上のポリペプチド配列を互いに接続することによって作出される、タンパク質を意味する。本発明に包含される融合ポリペプチドは、第一のポリペプチドをコードしている核酸配列、例えばＲＮＡ結合ドメインを、第二のポリペプチドをコードしている核酸配列、例えばエフェクタードメインと接続することにより、１つのオープンリーディングフレームを形成した、キメラ遺伝子構築物の翻訳産物を含む。換言すれば、「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」は、ペプチド結合によって又はいくつかのペプチドを介して接続された、２つ以上のタンパク質の組換えタンパク質である。融合タンパク質はまた、２つのドメイン間のペプチドリンカーも含み得る。

本明細書において使用する「リンカー」という用語は、２つ以上の実体を接続させるために使用される任意の手段、実体、又は部分を指す。リンカーは、共有結合性リンカーであっても、又は非共有結合性リンカーであってもよい。共有結合性リンカーの例としては、連結される予定の１つ以上のタンパク質又はドメインに共有結合で付着した、共有結合又はリンカー部分を含む。該リンカーはまた、非共有結合、例えば白金原子などの金属中心を通した有機金属結合であってもよい。共有結合のために、様々な官能基、例えばアミド基（カルボン酸誘導体を含む）、エーテル、エステル（有機及び無機エステルを含む）、アミノ、ウレタン、尿素などを使用することができる。連結させるために、ドメインは、酸化、ヒドロキシル化、置換、還元などによって修飾されることにより、カップリングのための部位が与えられてもよい。コンジュゲーションの方法は、当業者には周知であり、本発明に使用するために包含される。リンカー部分は、化学的リンカー部分、又は例えばペプチドリンカー部分（リンカー配列）を含むがこれらに限定されない。ＲＮＡ結合ドメイン及びエフェクタードメインの機能を有意に減少させない修飾が好ましいことが理解されるだろう。

本明細書において使用するような、本明細書において使用する「連結された」は、２つ以上の実体が付着して１つの実体を形成することを指す。コンジュゲートは、ペプチド低分子コンジュゲート並びにペプチド－タンパク質／ペプチドコンジュゲートの両方を包含する。

本明細書において使用する「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸配列内において切断を、例えば二本鎖ＤＮＡ配列内において一本鎖又は二本鎖の切断を誘導する、タンパク質（すなわち酵素）を含む。

本明細書において使用する「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）とＣａｓ遺伝子によってコードされる関連するヌクレアーゼとを含有している、原核生物ＤＮＡのセグメントを指す。細菌では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、可動遺伝因子（ウイルス、転位因子、及び接合性プラスミド）に対するＲＮＡ誘導適応免疫系をコードしている。３種類のＣＲＩＳＰＲシステムが同定されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、先行する可動因子に相補的な配列であるスペーサーを含有している。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、成熟したＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へと転写及びプロセシングされる。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼＣａｓ９及びＣｐｆ１は、ＩＩ型及びＶ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに属し、標的ＤＮＡを切断する強力なエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、約２０ヌクレオチドの特有の標的配列（スペーサーと呼ばれる）を含有している成熟ｃｒＲＮＡと、リボヌクレアーゼＩＩＩにより補助されるプレ－ｃｒＲＮＡのプロセシングのためのガイドとしての役目を果たすトランス活性化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）によって誘導される。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡの二本鎖は、Ｃａｓ９に指令して、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的ＤＮＡ上の相補的配列（プロトスペーサーと呼ばれる）との間の相補的塩基対形成を介してＤＮＡに標的化させる。Ｃａｓ９は、トリヌクレオチド（化膿性連鎖球菌のＣａｓ９についてはＮＧＧ）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識して、切断部位（ＰＡＭから３番目又は４番目の上流にあるヌクレオチド）を特定する。

本明細書において使用する「Ｃａｓ９」又は「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」という用語は、Ｃａｓ９タンパク質又はその断片（例えば、Ｃａｓ９の活性又は不活性なＤＮＡ切断ドメイン及び／又はＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含んでいる、タンパク質）を含んでいる、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは時に、ｃａｓｎ１ヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）関連ヌクレアーゼとも称される。ＣＲＩＳＰＲは、可動遺伝因子（ウイルス、転位因子、及び接合性プラスミド）に対する防御をもたらす、適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、先行する可動因子に相補的な配列であるスペーサーを含有し、そして侵入してくる核酸に標的化する。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へと転写及びプロセシングされる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、プレｃｒＲＮＡの正しいプロセシングは、トランスにコードされた低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）及びＣａｓ９タンパク質を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、リボヌクレアーゼ３により補助されるプレｃｒＲＮＡのプロセシングのためのガイドとしての役目を果たす。続いて、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに対して相補的である鎖状又は環状二本鎖ＤＮＡ標的をエンドヌクレアーゼで切断する。ｃｒＲＮＡに相補的ではない標的鎖がまず、エンドヌクレアーゼで切断され、その後、３’－５’にエキソヌクレアーゼで短縮される。天然では、ＤＮＡの結合と切断は典型的には、タンパク質と両方のＲＮＡを必要とする。しかしながら、シングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」、又は単に「ｇＲＮＡ」）は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方の側面が単一のＲＮＡ種に取り込まれるように工学操作されていてもよい。例えば、Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012）を参照し、この全内容は、参照によりここに援用される。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲリピート配列内の短いモチーフ（ＰＡＭ又はプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己対非自己を識別することを助ける。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列及び構造は当業者には周知であり（例えば、“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.” Ferretti et al., J. J., McShan W. M., Ajdic D. J., Savic D. J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A. N., Kenton S., Lai H. S., Lin S. P., Qian Y., Jia H. G., Najar F. Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S. W., Roe B. A., McLaughlin R. E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); “CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.” Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C. M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z. A., Eckert M. R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)；及び“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.” Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012）を参照し、この各々の全内容が、参照により本明細書に援用される）。Ｃａｓ９のオルソログが、化膿性連鎖球菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス（S.thermophilus）を含むがこれらに限定されない、様々な種において記載されている。さらなる適切なＣａｓ９ヌクレアーゼ及び配列は、本開示に基づいて当業者には明らかとなり、このようなＣａｓ９ヌクレアーゼ及び配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier, “The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems” (2013) RNA Biology 10:5, 726-737（この全内容は、参照により本明細書に援用される）に開示された生物及び遺伝子座に由来するＣａｓ９配列を含む。いくつかの実施態様では、「Ｃａｓ９」という用語は、コリネバクテリウム・ウリセランス（Corynebacterium ulcerans）(NCBI参照番号: NC_015683.1、NC_017317.1)；コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheria）(NCBI参照番号: NC_016782.1、NC_016786.1)；スピロプラズマ・シルフィディコラ（Spiroplasma syrphidicola）(NCBI参照番号: NC_021284.1)；プレボテラ・インターメディア（Prevotella intermedia）(NCBI参照番号: NC_017861.1)；スピロプラズマ・タイワネンセ（Spiroplasma taiwanense）(NCBI参照番号: NC_021846.1)；ストレプトコッカス・イニエ（Streptococcus iniae）(NCBI参照番号: NC_021314.1)；ベルリエラ・バルティカ（Belliella baltica）(NCBI参照番号: NC_018010.1)；サイクロフレクサス・トルキスＩ（Psychroflexus torquisI）(NCBI参照番号: NC_018721.1)；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）(NCBI参照番号: YP_820832.1)；リステリア・イノキュア（Listeria innocua）(NCBI参照番号: NP_472073.1)；カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）(NCBI参照番号: YP_002344900.1)；又は髄膜炎菌（Neisseria. meningitidis）(NCBI参照番号: YP_002342100.1）に由来するＣａｓ９を指す。典型的には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。

配列番号２：Ｃａｓ９配列

本明細書において使用する「不完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ」という用語は、少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを欠失した、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを指す。

本明細書において使用する「ニッカーゼ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＤＮＡ二本鎖の一本鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼを指す。したがって、「Ｃａｓ９ニッカーゼ」という用語は、典型的にはＣａｓ９タンパク質の１つのヌクレアーゼドメインを不活性化することによって、Ｃａｓ９タンパク質から誘導されたニッカーゼを指す。

本明細書において使用する「デアミナーゼ」という用語は、脱アミノ化反応を触媒する酵素を指す。いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、シチジン又はデオキシシチジンからウラシル又はデオキシウラシルへの加水分解的な脱アミノ化をそれぞれ触媒する、シチジンデアミナーゼである。いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、アデノシンからイノシンへの加水分解的な脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼであり、このイノシンは細胞によってグアノシンと同様に処理されて、ＡからＧ（又はＴからＣ）の変化を作出する。

本明細書において使用する「ガイドＲＮＡ分子」という用語は一般的には、Ｃａｓ９タンパク質に結合し、Ｃａｓ９タンパク質を、標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化させることのできる、ＲＮＡ分子（又はまとめてＲＮＡ分子群）を指す。ガイドＲＮＡは、２つのセグメントを含み得る：ＤＮＡ標的化ガイドセグメントとタンパク質結合性セグメント。ＤＮＡ標的化セグメントは、標的配列に対して相補的である（又は少なくともストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる）ヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合性セグメントは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、例えばＣａｓ９又はＣａｓ９関連ポリペプチドと相互作用する。これらの２つのセグメントは、同じＲＮＡ分子内に位置していても、又は２つ以上の別々のＲＮＡ分子内に位置していてもよい。２つのセグメントが別々のＲＮＡ分子内にある場合、ＤＮＡ標的化ガイドセグメントを含んでいる分子は時に、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と称されるが、タンパク質結合性セグメントを含んでいる分子は、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と称される。

本明細書において使用する「標的核酸」又は「標的」という用語は、標的核酸配列を含有している核酸を指す。標的核酸は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、しばしば二本鎖ＤＮＡである。本明細書において使用する「標的核酸配列」、「標的配列」又は「標的領域」は、本明細書に開示されているようなＣＲＩＳＰＲシステムを使用して結合させたい、特定の配列又はその相補体を意味する。

本明細書において使用する「標的核酸鎖」という用語は、本明細書に開示されているようなガイドＲＮＡとの塩基対形成にかけられる、標的核酸鎖を指す。すなわち、ｃｒＲＮＡ及びガイド配列とハイブリダイズする標的核酸鎖は、「標的核酸鎖」と称される。ガイド配列とは相補的ではない、標的核酸の他方の鎖は、「非相補鎖」と称される。二本鎖標的核酸（例えばＤＮＡ）の場合、各々の鎖は、ｃｒＲＮＡ及びガイドＲＮＡを設計するための「標的核酸鎖」であり得、これを使用して、適切なＰＡＭ部位が存在する限り、本発明の方法を実施することができる。

本明細書において使用する「ヌクレアーゼではないＤＮＡ修飾酵素」という用語は、ヌクレアーゼではないが、ＤＮＡ分子内に何らかの修飾、例えば突然変異を導入することができる、酵素を指す。

本明細書において使用する「シチジンデアミナーゼ」という用語は、シチジン及びデオキシシチジンからそれぞれウリジン及びデオキシウリジンへの不可逆的で加水分解的な脱アミノ化を触媒する酵素を指す。本明細書において使用する「脱アミノ化」という用語は、ある分子からのアミノ基の除去を指す。

本明細書において使用する「ＡＩＤ」すなわち「活性化により誘導されるシチジンデアミナーゼ」という用語は、ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ酵素ファミリーに属する酵素を指す。ＡＩＤは、活性化Ｂ細胞内で発現され、抗体遺伝子をコードしている基礎をなすＤＮＡにおいて点突然変異を作出することによって（Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(19): 12304-12308 (2002) and Nature, 415(6873): (2002); Petersen-Mart et al., Nature, 418(6893): 99-103 (2002)）、体細胞超突然変異（Muramatsu et al., Cell, 102(5): 553-63 (2000); Revy et al., Cell, 102(5): 565-75 (2000); Yoshikawa et al., Science, 296(5575): 2033-6 (2002)）を惹起するために必要とされる。ＡＩＤはまた、クラススイッチ組換え及び遺伝子変換のための必須なタンパク質因子でもある（Muramatsu et al., Cell, 102(5): 553-63 (2000); Revy et al., Cell, 102(5): 565-75 (2000)）。

本明細書において使用する「リボヌクレオタンパク質複合体」又は「リボヌクレオタンパク質粒子」という用語は、ヌクレオタンパク質及びリボ核酸を含んでいる、複合体又は粒子を指す。本明細書において提供されるような「ヌクレオタンパク質」は、核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ）に結合することのできるタンパク質を指す。ヌクレオタンパク質がリボ核酸に結合する場合、それは「リボヌクレオタンパク質」と称される。リボヌクレオタンパク質とリボ核酸との間の相互作用は、直接的であっても、例えば共有結合によっても、又は間接的であっても、例えば非共有結合（例えば静電的相互作用（例えばイオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば双極子－双極子、双極子により誘導される双極子、ロンドン分散）、環スタッキング（パイ作用）、疎水性相互作用など）によってもよい。

本明細書において使用する「野生型」という用語は、当業者によって理解される技術分野の用語であり、突然変異体形又は変異体形とは区別されるような、天然に存在するような典型的な形の生物、株、遺伝子、又は特徴を意味する。

本明細書において使用する「突然変異」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、置換、欠失、又は挿入を指す。「置換」という用語は、特定の位置の特定のアミノ酸残基が除去され、別のアミノ酸残基が、同位置に挿入されることを意味する。「欠失」という用語は、特定のアミノ酸残基が除去されることを意味する。「挿入」という用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、特定のアミノ酸残基の前又は後に挿入されることを意味する。

本明細書において使用する「突然変異誘発」という用語は、ポリヌクレオチド配列への突然変異の導入を指す。本発明に従って、突然変異が、抗体の可変ドメインをコードしている標的ＤＮＡ分子に導入されることにより、体細胞超突然変異を模倣する。

本明細書において使用する「変異体」という用語は、第二の組成物（例えば第二の分子、「親」分子とも呼ばれる）に関連する、第一の組成物（例えば第一分子）を指す。変異分子は、親分子に由来し得るか、それから単離され得るか、それに基づき得るか、又はそれと相同であり得る。変異分子は、元来の親分子と全配列の同一性を有していても、又は代替的には、親分子と１００％未満の配列同一率を有していてもよい。例えば、配列の変異体は、元来の配列と比較して、配列において少なくとも５０；５１；５２；５３；５４；５５；５６；５７；５８；５９；６０；６１；６２；６３；６４；６５；６６；６７；６８；６９；７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；１００％同一である、第二の配列であってもよい。配列同一率は頻繁には、同一率（又は類似率又は相同率）に関して測定され；比率が高ければ高いほど、２つの配列はより類似している。比較のための配列のアラインメント法は、当技術分野において周知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988; Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992；及び Pearson et al., Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994に記載されている。Altschul et al., Nat. Genet., 6:119-129, 1994は、配列アラインメント法及び相同性の計算の詳細な考察を提示している。例として、アラインメントツールのＡＬＩＧＮ（Myers and Miller, CABIOS 4:11-17, 1989）又はＬＦＡＴＡ（Pearson and Lipman, 1988）を使用して、配列比較を実施し得る（インターネットプログラム（登録商標）1996, W. R. Pearson及びバージニア大学、fasta20u63バージョン2.0u63、発売日１９９６年１２月）。ＡＬＩＧＮは、全配列を互いに比較するが、ＬＦＡＳＴＡは、局所的に類似した領域を比較する。これらのアラインメントツール及びそれらのそれぞれの指導書は、例えば、インターネット上のＮＣＳＡウェブサイトで入手可能である。あるいは、約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較については、Ｂｌａｓｔ２配列関数を、デフォールトパラメーターに設定したデフォールトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して（ギャップ存在コスト１１、及び１残基あたりのギャップコスト１）採用することができる。短いペプチド（約３０アミノ酸より短い）をアラインさせる場合、アラインメントは、Ｂｌａｓｔ２配列関数を使用して、デフォールトパラメーターに設定されたＰＡＭ３０マトリックス（オープンギャップ９、伸長ギャップ１ペナルティ）を使用して実施されるべきである。ＢＬＡＳＴ配列比較システムは、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトから入手可能である；Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990; Gish. & States, Nature Genet., 3:266-272, 1993; Madden et al. Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997；及びZhang & Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997も参照されたい。

本明細書において使用する「に由来する」という用語は、第一成分（例えば第一分子）又は第一成分からの情報を使用して、第二成分（例えば、第一分子とは異なる第二分子）を単離するか、誘導するか、又は作製する、プロセスを指す。

本明細書において使用する「治療有効量」という用語は、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で疾患を処置するのに十分な量の細胞集団を意味する。本発明の組成物の１日総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決断されるであろうことが理解されるだろう。任意の特定の患者についての具体的な治療有効用量レベルは、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食事、投与時刻、投与経路、処置期間、細胞集団と組み合わせて又は同時に使用される薬物、並びに医学分野において周知である同様な因子を含む、多種多様な因子に依存するだろう。いくつかの実施態様では、細胞は、まずそれらをそれらの培養培地から収集し、その後、処置有効量での投与に適した培地及び容器システム（「薬学的に許容される」担体）中で細胞を洗浄及び濃縮することによって製剤化される。適切な注入媒体は、任意の等張媒体製剤、典型的には通常の食塩水、ノルモゾルＲ（アボット社）又はプラズマライトＡ（バクスター社）であり得るが、５％デキストロース水溶液又はリンガー乳酸液を利用してもよい。注入培地に、ヒト血清アルブミンを補充してもよい。組成物中の処置有効量の細胞は、所望の特異性を有する細胞の相対的割合、レシピエントの年齢及び体重、並びに標的化される容態の重症度に依存する。これらの細胞の量は、低くて約１０^３/kg、好ましくは５×１０^３/kg；高くて１０^７/kg、好ましくは１０^８/kgであり得る。細胞の数は、そこに含まれる細胞の種類と同様に、該組成物が目的とする最終的な用途に依存するだろう。典型的には、最少用量は、２００万個の細胞/kgである。通常、２００万個～２０００万個の細胞が被験者に注射される。所望の純度は、選別工程を導入することによって達成され得る。本明細書に提供される用途のために、細胞は一般的には、１リットル以下の容量であり、５００ml以下であっても、更には２５０ml又は１００ml又はそれ以下であってもよい。臨床的に妥当な細胞の数は、細胞の所望の総量に累積的に同等であるか又は超える、複数回の注入へと配分してもよい。

方法：
したがって、本発明の第一の目的は、真核細胞を、（ａ）少なくとも１つの塩基編集酵素と（ｂ）塩基編集酵素を、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の少なくとも１つの標的配列に誘導するための少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子とからなる遺伝子編集プラットフォームに接触させ、これにより、該プロモーターを編集し、続いて、該真核細胞内のガンマグロビンの発現を増加させる工程を含む、真核細胞内の胎児ヘモグロビン含量を増加させるための方法に関する。

いくつかの実施態様では、遺伝子編集プラットフォームは、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内にいくつかの突然変異を導入するのに適し、これにより、少なくとも１つの転写活性化因子の結合部位が、該プロモーターに導入される。いくつかの実施態様では、遺伝子編集プラットフォームは、ＫＬＦ１、ＴＡＬ１、又はＧＡＴＡ１のための新規な転写活性化因子の結合部位を導入するのに特に適している。

いくつかの実施態様では、本明細書において開示された遺伝子編集プラットフォームは、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内に－１９８Ｔ＞Ｃ突然変異を導入し、これにより、ＫＬＦ１活性化因子はこれでプロモーターに結合することができる。

いくつかの実施態様では、本明細書において開示された遺伝子編集プラットフォームは、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内に－１７５Ｔ＞Ｃ突然変異を導入し、これにより、ＴＡＬ１活性化因子はこれでプロモーターに結合することができる。

いくつかの実施態様では、本明細書において開示された遺伝子編集プラットフォームは、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内に－１１３Ａ＞Ｇ突然変異を導入し、これにより、ＧＡＴＡ１活性化因子はこれでプロモーターに結合することができる。

いくつかの実施態様では、本明細書において開示された遺伝子編集は、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－２００領域を編集するのに特に適し、これにより、ＬＲＦ抑制因子のための結合部位が破壊される。いくつかの実施態様では、本明細書において開示された遺伝子編集プラットフォームは、－２０１Ｃ＞Ｔ、－２００Ｃ＞Ｔ、－１９７Ｃ＞Ｔ、－１９６Ｃ＞Ｔ、－１９５Ｃ＞Ｔ、及び－１９４Ｃ＞Ｔからなる群より選択された少なくとも１つの突然変異を導入し、これにより、ＬＲＦ抑制因子のための結合部位は破壊される。

いくつかの実施態様では、本明細書において開示された遺伝子編集は、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１１５領域を編集するのに特に適し、これにより、ＢＣＬ１１Ａ抑制因子のための結合部位が破壊される。いくつかの実施態様では、本明細書において開示された遺伝子編集プラットフォームは、－１１４Ｃ＞Ｔ、－１１３Ｃ＞Ｔ、－１１５Ｃ＞Ｔ、及び－１１６Ｃ＞Ｔからなる群より選択された少なくとも１つの突然変異を導入し、これにより、ＢＣＬ１１Ａ抑制因子のための結合部位は破壊される。

いくつかの実施態様では、真核細胞は、造血前駆細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、多能性細胞（すなわち胚性幹細胞（ＥＳ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ））からなる群より選択される。典型的には、真核細胞は、幹細胞の動員から生じる。

いくつかの実施態様では、本発明の塩基編集酵素は、不完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。配列認識機序は、不完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼと同じである。典型的には、本発明の不完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、少なくとも１つのＲＮＡ結合性ドメインを含む。ＲＮＡ結合性ドメインは、本明細書で以後に定義されているようなガイドＲＮＡ分子と相互作用する。しかしながら、本発明の不完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を全く持たない修飾された形である。したがって、不完全なＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはガイドＲＮＡ分子を特異的に認識し、よって、塩基編集酵素を、その標的ＤＮＡ配列へと誘導する。

いくつかの実施態様では、不完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、核酸への結合親和性及び／又は特異性を高めるために、酵素活性を改変するために、及び／又はタンパク質の別の特性を変化させるために修飾されていてもよい。いくつかの実施態様では、タンパク質のヌクレアーゼドメインは、修飾されていても、欠失していても、又は不活性化されていてもよい。いくつかの実施態様では、該タンパク質は、タンパク質の機能にとって必須ではないドメインを除去するために切断短縮されていてもよい。いくつかの実施態様では、該タンパク質は、ＲＮＡ結合ドメインの活性を最適化するために切断短縮されているか又は修飾されている。

いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、突然変異ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、すなわち、１つ以上の点突然変異、挿入、欠失、切断短縮を有するタンパク質、融合タンパク質、又はその組み合わせからなる。いくつかの実施態様では、該突然変異体は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合活性を有するが、そのヌクレアーゼ活性部位の一方又は両方を欠失している。いくつかの実施態様では、該突然変異体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の同一率を有するアミノ酸配列を含む。様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを本発明に使用することができる。適切なＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの非制限的な例としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（又はＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕ１９６６が挙げられる。例えば、国際公開第２０１４／１４４７６１号、国際公開第２０１４／１４４５９２号、国際公開第２０１３／１７６７７２号、米国特許出願公開第２０１４／０２７３２２６号、及び米国特許出願公開第２０１４／０２７３２３３号を参照されたい（その全内容はその全体が参照により本明細書に援用される）。

いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに由来する。いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質に由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、とりわけ、化膿性連鎖球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、連鎖球菌属、ノカルジオプシス・ダソンヴィレィ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム（Streptosporangium roseum）、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）、バチルス・シュードミコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス・セレンチレデュセンス（Bacillus selenitireducens）、エキシグオバクテリウム・シビリカム（Exiguobacterium sibiricum）、ラクトバチルス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ミクロシラ・マリナ（Microscilla marina）、バークホルデリア・バクテリア（Burkholderiales bacterium）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス属（Polaromonas sp.）、クロコスファエラ・ワトソニイ（Crocosphaera watsonii）、シアノテセ属（Cyanothece sp.）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）、シネココッカス属（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム・アラバチカム（Acetohalobium arabaticum）、アモニフェックス・デゲンシイ（Ammonifex degensii）、カルシセルロシルプトル・ベクシイ（Caldicelulosiruptor becscii）、カンジダツス・デサルホルディス（Candidatus Desulforudis）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、ナトラナエロビウス・サーモフィルス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム（Pelotomaculum thermopropionicum）、アシディチオバチルス・カルダス（Acidithiobacillus caldus）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）、アロクロマチウム・ビノスム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター属（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Nitrosococcus halophilus）、ニトロソコッカス・ワトソニイ（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、クテノバクター・ラセミフェル（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Methanohalobium evestigatum）、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノデュラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ノストック属（Nostoc sp.）、アルトロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、アルトロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）、アルトロスピラ属（Arthrospira sp.）、リングビア属（Lyngbya sp.）、ミクロコレウス・クロノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、オスキラトリア属（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ・モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、又はアカリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）に由来し得る。

いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）の突然変異体又はその断片である。いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌に由来する突然変異Ｃａｓ９タンパク質である。

不活性なＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９タンパク質（又はその断片）を作製する方法は公知である（例えば、Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., “Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression” (2013) Cell. 28; 152(5):1173-83参照、これはその各々の全内容が参照により本明細書に援用される）。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインは、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインとＲｕｖＣ１サブドメインという、２つのサブドメインを含むことが知られている。ＨＮＨサブドメインは、ｇＲＮＡに対して相補的な鎖を切断し、ここでのＲｕｖＣ１サブドメインは、非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の突然変異は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性をサイレンス状態にすることができる。例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４１Ａの突然変異は、化膿性連鎖球菌のＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を完全に失活させる（Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28; 152(5):1173-83 (2013)）。

いくつかの実施態様では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはニッカーゼであり、より特定するとＣａｓ９ニッカーゼ、すなわち、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａからなる群より選択された１つの突然変異を有する化膿性連鎖球菌に由来するＣａｓ９である。いくつかの実施態様では、本発明のニッカーゼは、配列番号３又は配列番号３３に示されるようなアミノ酸配列を含む。

配列番号３＞Ｄ１０Ａ突然変異を有する化膿性連鎖球菌のｎＣａｓ９タンパク質の配列

配列番号３３＞Ｈ８４０Ａ突然変異を有する化膿性連鎖球菌のｎＣａｓ９タンパク質の配列

いくつかの実施態様では、Ｄ１０Ａ又はＨ８４０Ａ以外の突然変異を有するＣａｓ９変異体が使用され、これにより例えば、ヌクレアーゼの失活したＣａｓ９（ｄＣａｓ９）が得られる。このような突然変異としては、例えば、Ｄ１０及びＨ８４０における他のアミノ酸置換、又は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の置換（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及び／又はＲｕｖＣ１サブドメイン内の置換）が挙げられる。いくつかの実施態様では、配列番号２又は配列番号３に対して少なくとも約７０％同一であるか、少なくとも約８０％同一であるか、少なくとも約９０％同一であるか、少なくとも約９５％同一であるか、少なくとも約９８％同一であるか、少なくとも約９９％同一であるか、少なくとも約９９．５％同一であるか、又は少なくとも約９９．９％同一である、ｄＣａｓ９の変異体が提供される。いくつかの実施態様では、配列番号２又は配列番号３よりも、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸、又はそれ以上だけ短いか又は長いアミノ酸配列を有する、ｄＣａｓ９の変異体が提供される。

本発明によると、本明細書において開示された塩基編集酵素の第二成分は、デアミナーゼである、ヌクレアーゼではないＤＮＡ修飾酵素を含む。

いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼである。いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼである。いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１ファミリーのデアミナーゼである。いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、活性化により誘導されるシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である。いくつかの実施態様では、デアミナーゼはＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼである。

いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、ＡＩＤ：活性化により誘導されるシチジンデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ１：アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集酵素、触媒性ポリペプチド様１、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ：アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集酵素、触媒性ポリペプチド様３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ：アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集酵素、触媒性ポリペプチド様３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ：アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集酵素、触媒性ポリペプチド様３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ：アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集酵素、触媒性ポリペプチド様３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ：アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集酵素、触媒性ポリペプチド様３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ：アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集酵素、触媒性ポリペプチド様３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ：アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集酵素、触媒性ポリペプチド様３Ｈ、ＡＤＡ：アデノシンデアミナーゼ、ＡＤＡＲ１：ＲＮＡ１に対して作用するアデノシンデアミナーゼ、Ｄｎｍｔ１：ＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ１、Ｄｎｍｔ３ａ：ＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ３α、Ｄｎｍｔ３ｂ：ＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ３β、及びＴｅｔ１：メチルシトシンジオキシゲナーゼからなる群より選択される。

いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、活性化により誘導されるシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）に由来する。ＡＩＤは、ＤＮＡ又はＲＮＡの状況においてシトシンの脱アミノ化反応を触媒することのできる、シチジンデアミナーゼである。標的化部位にもたらされると、ＡＩＤは、シチジン塩基をウリジン塩基に変化させる。分裂中の細胞では、これは、シトシンからチミジンへの点突然変異に至り得る。あるいは、ＣからＵへの変化は、細胞内ＤＮＡ修復経路、主に切断修復経路をトリガーし得、これは、Ｕ－Ｇの塩基対のミスマッチを除去し、Ｔ－Ａ対、Ａ－Ｔ対、Ｃ－Ｇ対又はＧ－Ｃ対を用いて置き換えるであろう。結果として、点突然変異が、標的Ｃ－Ｇ部位に生じるだろう。いくつかの実施態様では、ＤＮＡ修飾酵素は、ＡＩＤ＊Δであり、これは核外搬出シグナル（ＮＥＳ）が除去されている、体細胞超突然変異活性の増加した、ＡＩＤ突然変異体である（Hess GT, Fresard L, Han K, Lee CH, Li A, Cimprich KA, Montgomery SB, Bassik MC: Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nat Methods 2016, 13(12):1036-1042）。

いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼである。いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、ＡＤＡＴファミリーのデアミナーゼである。例えば、ＡＤＡＴファミリーのアデノシンデアミナーゼは、Ｃａｓ９タンパク質、例えばヌクレアーゼ失活Ｃａｓ９ドメインに融合させることができ、よって、Ｃａｓ９－ＡＤＡＴ融合タンパク質が生じる。

いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、配列番号４～１４に示されるようなアミノ酸配列の変異体からなる。

配列番号４ ヒトＡＩＤ：

配列番号５ ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ

配列番号６ ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｆ

配列番号７ ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ

配列番号８ ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｃ

配列番号９ ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ａ

配列番号１０ ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｈ

配列番号１１ ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｄ

配列番号１２ ヒトＡＰＯＢＥＣ－１

配列番号１３ ヒトＡＤＡＴ－２

配列番号１４ ヒトＡＤＡＴ－１

いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、不完全なＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＮ末端に融合している。いくつかの実施態様では、デアミナーゼは、不完全なＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＣ末端に融合している。いくつかの実施態様では、不完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼとデアミナーゼは、リンカーを介して融合している。いくつかの実施態様では、該リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号４）、（ＧＧＳ）ｎ、SGSETPGTSESATPES（配列番号５）のモチーフを含む（例えば、Guilinger J P, Thompson D B, Liu D R参照）。追加の適切なリンカーモチーフ及びリンカー構造は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施態様では、適切なリンカーモチーフ及びリンカー構造は、Chen et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65(10):1357-69（その全内容が参照により本明細書に援用される）に記載のものが挙げられる。

いくつかの実施態様では、融合タンパク質は、追加の特色を含み得る。存在し得る他の例示的な特色は、局在化配列、例えば核局在化配列（ＮＬＳ）、細胞質局在化配列、搬出配列、例えば核外搬出配列、又は他の局在化配列、並びに、融合タンパク質の可溶化、精製又は検出に有用である配列タグである。適切な局在化シグナル配列及びタンパク質タグの配列は本明細書において提供され、これには、ビオチンカルボキシラーゼ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ポリヒスチジンタグ（ヒスチジンタグ又はＨｉｓタグとも称される）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、Ｓｏｆｔａｇ（例えばＳｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３）、ストレプトアビジンタグ、ビオチン系統タグ、ＦＩＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、及びストレプトアビジン結合性ペプチドタグが挙げられるがこれらに限定されない。追加の適切な特色は、当業者には明らかとなろう。

様々な塩基編集酵素が、当技術分野において公知であり（例えば、Improving cytidine and adenine base-editing enzymes by expression optimization and ancestral reconstruction. Nat Biotechnol. 2018 May 29参照）、そしてこれには典型的には表Ａに記載のものが含まれる。

本明細書において開示された遺伝子編集プラットフォームの第二成分は、塩基編集酵素を、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内に位置する少なくとも１つの標的配列に誘導するのに適した少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子からなる。したがって、本発明のガイドＲＮＡ分子は、標的化特異性をもたらすためのガイド配列を含む。それは、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の関心のある予め選択された標的部位に対して相補的でありかつハイブリダイズすることのできる、領域を含む。

いくつかの実施態様では、このガイド配列は、約１０ヌクレオチドから約２５を超えるヌクレオチドを含み得る。例えば、ガイド配列と対応する標的部位配列の間の塩基対形成領域は、約1０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、又は２５を超えるヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施態様では、ガイド配列は、約１７～２０ヌクレオチド長、例えば２０ヌクレオチド長である。

典型的には、ソフトウェアプログラムを使用して、所望のガイド配列長及び特定のＣＲＩＳＰＲ酵素のためのＣＲＩＳＰＲモチーフ配列（ＰＡＭ）に基づき、ＨＢＧ遺伝子を含有しているＤＮＡ核酸分子の両鎖上で候補ＣＲＩＳＰＲ標的配列を同定する。適切な標的核酸を選択するための１つの必要条件は、それが３’ＰＡＭ部位／配列を有することである。各標的配列及びその対応するＰＡＭ部位／配列は本明細書においてＣａｓ標的化部位と称される。最もよく特徴付けられたシステムの１つであるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的の切断を起こすために、Ｃａｓ９タンパク質と、標的配列に相補的なガイドＲＮＡのみを必要とする。例えば、ＰＡＭ配列ＮＧＧを有する、化膿性連鎖球菌に由来するＣａｓ９の標的部位は、インプット配列上及びインプット配列の逆相補体上の両方で５’－Ｎｘ－ＮＧＧ－３’を探索することによって同定され得る。ゲノム内にＤＮＡ標的部位が複数存在することにより、非特異的なゲノムの編集がなされる可能性があるので、全ての可能性ある部位を同定した後、プログラムが、関連する参照ゲノム内に出現する回数に基づいて配列をフィルター除去する。配列の特異性が、ＰＡＭ配列それ自体を含む、ＰＡＭ配列から５’側の１１～１２ｂｐなどの「シード」配列によって決定されるＣＲＩＳＰＲ酵素のための、フィルタリング工程は、シード配列に基づき得る。したがって、追加のゲノム遺伝子座での編集を回避するために、結果を、関連するゲノム内のシード：ＰＡＭ配列の出現数に基づいてフィルターする。ユーザーは、シード配列の長さを選択することを許可され得る。ユーザーはまた、フィルターを通過させる目的のために、ゲノム内のシード：ＰＡＭ配列の出現数を特定することを許可され得る。デフォールトは、特有の配列についてスクリーニングするためである。フィルターレベルは、シード配列の長さとゲノム内の配列の出現数の両方の変化によって変化する。プログラムは、追加して又は代替的に、同定された標的配列（群）の逆相補体を提供することによって、報告された標的配列（群）に対して相補的なガイド配列の配列を提供し得る。配列の選択を最適化するための方法及びアルゴリズムのさらなる詳細は、米国特許出願第６１／８３６，０８０号に見られ得、これは参照により本明細書に援用される。

いくつかの実施態様では、塩基編集酵素及び対応するガイドＲＮＡ分子は、表Ｂに従って選択される。

本発明のガイドＲＮＡ分子は、細胞に基づいた発現、インビトロでの転写、及び化学合成を含む、当技術分野において公知である様々な方法によって作製され得る。末端継続ＲＮＡ（ＴＣ－ＲＮＡ）化学反応（例えば米国特許第８，２０２，９８３号参照）を使用した比較的長いＲＮＡ（２００ｍｅｒ以上もの長さ）を化学合成できることにより、基本的な４つのリボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵ）によって可能となるＲＮＡよりも優れている特殊な特色を有するＲＮＡを作製することが可能となる。特に、本発明のＲＮＡ分子は、当技術分野において公知である宿主細胞系又はインビトロでの翻訳－転写系を使用した組換え技術を用いて作製され得る。このような系及び技術の詳細は、例えば、国際公開第２０１４／１４４７６１号、国際公開第２０１４／１４４５９２号、国際公開第２０１３／１７６７７２号、米国特許出願公開第２０１４／０２７３２２６号及び米国特許出願公開第２０１４／０２７３２３３号に見られ得、これらの内容のその全体が参照により本明細書に援用される。

いくつかの実施態様では、ガイドＲＮＡ分子は、１つ以上の修飾を含み得る。このような修飾は、少なくとも１つの非天然ヌクレオチド、又は修飾されたヌクレオチド、又はその類似体の包含を含み得る。修飾されたヌクレオチドは、リボース、リン酸塩、及び／又は塩基部分において修飾されていてもよい。修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル類似体、２’－デオキシ類似体、又は２’－フルオロ類似体を含み得る。核酸骨格は、修飾されていてもよく、例えばホスホロチオエート骨格が使用され得る。ロックド核酸（ＬＮＡ）又は架橋核酸（ＢＮＡ）の使用も可能であり得る。修飾された塩基のさらなる例としては、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、シュードウリジン、イノシン、７－メチルグアノシンが挙げられるがこれらに限定されない。

いくつかの実施態様では、複数のガイドＲＮＡ分子が、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の複数の配列に標的化するように設計される。いくつかの実施態様では、したがって、本明細書において開示された遺伝子編集プラットフォームは、本明細書において開示されているような、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個又は２０個のガイドＲＮＡ分子を含む。

いくつかの実施態様では、複数の塩基編集酵素は、複数のガイドＲＮＡ分子と共に、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の複数の配列に標的化するように設計される。いくつかの実施態様では、したがって、本明細書において開示された遺伝子編集プラットフォームは、２個、３個、又は４個の塩基編集酵素、及び本明細書において開示されているような２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個又は２０個のＲＮＡ分子を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子編集プラットフォームの様々な成分が、１つ以上の発現ベクターからの発現を通して真核細胞に提供される。例えば、ガイドＲＮＡ分子又は塩基編集酵素をコードしている核酸を、それらを真核細胞に導入するための１つ以上のベクターにクローニングすることができる。ベクターは典型的には、本明細書において開示されたガイドＲＮＡ分子又は塩基編集酵素をコードしている核酸の保存又は操作のための、原核細胞ベクター、例えばプラスミド、又はシャトルベクター、又は挿入ベクターである。好ましくは、核酸は、単離及び／又は精製されている。したがって、本発明は、上記の１つ以上のガイドＲＮＡ分子又は塩基編集酵素をコードしている配列を有する組換え構築物又はベクターを提供する。構築物の例としては、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターが挙げられ、これに本発明の核酸配列が正方向に又は逆方向に挿入されている。いくつかの実施態様では、該構築物は更に、調節配列を含む。「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御配列（例えばポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列は、核酸配列並びに誘導性調節配列の恒常的な発現を指令する配列を含む。発現ベクターの設計は、形質転換、トランスフェクト又は感染させる予定の真核細胞の選択、所望の発現レベルなどのこのような因子に依存し得る。多くの適切なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。真核細胞宿主で使用するのに適したクローニングベクター及び発現ベクターは、Sambrook et al.（2001, 分子クローニング：実験マニュアル、コールドスプリングハーバー出版）にも記載されている。ベクターは、自律複製できるか、又は宿主ＤＮＡに組み込むことができる。ベクターはまた、発現を増幅するのに適切な配列も含んでいてもよい。更に、発現ベクターは好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特質、例えば真核細胞培養液用のジヒドロ葉酸還元酵素若しくはネオマイシン耐性、又はＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性などをもたらす、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有している。外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための当技術分野において公知である任意の手順を使用し得る。例は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔法、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、裸ＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソーム及び組込み型の両方）、及びクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又は他の外来遺伝子物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子編集プラットフォームの様々な成分が、ＲＮＡによりコードされるシステムの使用を通して、細胞集団に提供される。例えば、塩基編集システムは、Jiang, T., Henderson, J.M., Coote, K. et al. Chemical modifications of adenine base editor mRNA and guide RNA expand its application scope. Nat Commun 11, 1979 (2020）に記載のような修飾されたガイドＲＮＡと一緒に、化学的に修飾されたｍＲＮＡによりコードされるアデニン又はシチジン塩基エディターの使用を通して、細胞集団に提供され得る。特に、工学操作されたＲＮＡによりコードされる塩基編集酵素（例えばＡＢＥ）システムは、様々な化学的修飾を、塩基編集酵素とガイドＲＮＡをコードする両方のｍＲＮＡに導入することによって調製される。特に、該修飾は、５－メトキシウリジンで修飾されたウリジンの欠失したｍＲＮＡからなる。同義コドンを、コード配列を変化させることなく、できるだけ多くのウリジンを欠失させるために導入し得、そして５－メトキシウリジンを用いて残りの全てのウリジンを置換し得る。前記の最適化された塩基編集システムは、ＤＮＡによりコードされるシステムと比較して、いくつかのゲノム部位においてより高い編集効率を示す。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達を可能とするための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に、修飾されたｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを封入することも可能である。

いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子編集プラットフォームの様々な成分が、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の使用を通して、細胞集団に提供される。例えば、塩基編集酵素は、１つ以上のガイドＲＮＡ分子と予め複合体を形成することにより、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができる。よって、ＲＮＰ複合体を、真核細胞に導入することができる。ＲＮＡ複合体の導入は、時刻を設定できる。細胞は、細胞周期のＧ１期、Ｓ期、及び／又はＭ期で他の細胞と同調させることができる。ＲＮＰ送達は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、又はウイルスによる送達に伴う多くの落とし穴を回避する。典型的には、ＲＮＡ複合体は単に、タンパク質（すなわち塩基編集酵素）及び１つ以上のガイドＲＮＡ分子を適切な緩衝液中で混合することによって作製される。この混合物を、電気穿孔前に、室温で５～１０分間インキュベートする。電気穿孔法は、電場を１つ以上の細胞にかけ、細胞膜の透過性を増加させる、送達技術である。いくつかの実施態様では、遺伝子編集効率は、トランスフェクション増強オリゴヌクレオチドの添加によって改善され得る。

いくつかの実施態様では、複数回の連続的なトランスフェクションが、細胞内の所望のレベルの突然変異誘発に到達するために実施される。

本発明のさらなる目的は、必要とする被験者における胎児ヘモグロビンレベルを増加させるための方法に関し、該方法は、上記のような方法によって得られた真核細胞集団の治療有効量を移植する工程を含む。

いくつかの実施態様では、細胞集団は、被験者に対して自己であり、このことは、細胞集団が同じ被験者に由来することを意味する。

いくつかの実施態様では、被験者は、ヘモグロビン異常症と診断されている。したがって、本発明の方法は特に、ヘモグロビン異常症の処置に適している。

いくつかの実施態様では、β－ヘモグロビン異常症は鎌状赤血球症である。

いくつかの実施態様では、ヘモグロビン異常症は、β－サラセミアである。

キット
本発明は更に、突然変異誘発を実施するために本明細書において開示されているような遺伝子編集プラットフォームの全ての成分を含む、上記方法を実施するための試薬を含有している、キットを提供する。この目的を達成するために、反応成分の１つ以上、例えばガイドＲＮＡ分子、及び本明細書に開示されている方法のための塩基編集酵素をコードしている核酸分子は、使用のためにキットの形態で供給され得る。いくつかの実施態様では、該キットは、１つ以上の塩基編集酵素と１つ以上のガイドＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施態様では、該キットは、１つ以上の他の反応成分を含み得る。いくつかの実施態様では、適切な量の１つ以上の反応成分が、１つ以上の容器内に提供されるか、又は基剤上に保たれる。キットの追加の成分の例は、１つ以上の宿主細胞、外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための１つ以上の試薬、ガイドＲＮＡ若しくは塩基編集酵素の発現を検出するための又は標的核酸の状態を確認するための１つ以上の試薬（例えばプローブ又はＰＣＲプライマー）、及び反応用の緩衝液又は培養培地を含むがこれらに限定されない。該キットはまた、以下の１つ以上の成分も含み得る：支持試薬、終結試薬、修飾試薬、又は消化試薬、浸透圧調節物質、及び検出用器具。使用される成分は、様々な形態で提供され得る。例えば、該成分（例えば酵素、ＲＮＡ、プローブ及び／又はプライマー）は、水溶液中に懸濁されていても、又はフリーズドライさせた若しくは凍結乾燥させた粉末、ペレット、又はビーズとしてでもよい。後者の場合、該成分は、復元されると、アッセイで使用するための成分の完全な混合物を形成する。本発明のキットは、任意の適切な温度で提供され得る。例えば、液体中にタンパク質成分又はその複合体を含有しているキットの保存では、それらは０℃未満、好ましくは－２０℃若しくはそれ未満で、又はさもなくば凍結状態で提供及び維持されることが好ましい。該キットはまた、容器又は容器の組合せを入れるための梱包材料を含み得る。このようなキット及びシステムのための典型的な包装材料は、多種多様な構造（例えばバイアル、マイクロタイタープレートのウェル、マイクロアレイなど）のいずれかに、反応成分又は検出用プローブを入れる、固体マトリックス（例えばガラス、プラスチック、紙、ホイル、微粒子など）を含む。該キットは更に、実体のある形で記録された成分の使用説明書を含んでいてもよい。

本発明を更に、以下の図面及び実施例によって説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いかなる方法でも、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきものではない。

実施例：
方法：
細胞株の培養
Ｋ５６２を、グルタミンを含有し、１０％ウシ胎児血清（ロンザ社）、２mMのＨｅｐｅｓ（ライフテクノロジーズ社）、１００nMのピルビン酸ナトリウム（ライフテクノロジーズ社）、及びペニシリンとストレプトマイシン（ライフテクノロジーズ社）の補充された、ＲＰＭＩ１６４０（ロンザ社）中で維持した。ＨＵＤＥＰ－２細胞を、１μg/mLのドキシサイクリン（シグマ社）、１０^－６Ｍのデキサメタゾン（シグマ社）、１００ng/mLのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）（ペプロテック社）、３ＩＵ/mLのエリスロポエチン（Necker Hospital Pharmacy社）、Ｌ－グルタミン（ライフテクノロジーズ社）及びペニシリン／ストレプトマイシンの補充された、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジーズ社）中で培養した。ＨＵＤＥＰ－２細胞を、３３０μg/mLのホロ－トランスフェリン（シグマ社）、１０μg/mLの組換えヒトインシュリン（シグマ社）、２IU/mLのヘパリン（シグマ社）、５％ヒトＡＢ型血清、３IU/mLのエリスロポエチン、１００ng/mLのヒト幹細胞因子、１μg/mLのドキシサイクリン、１％のＬ－グルタミン、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンの補充されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ライフテクノロジーズ社）中で９日間かけて分化させた。ＣＤ３６、ＣＤ７１、及びＧＹＰＡ表面マーカーのフローサイトメトリーによる分析、並びに標準的なメイ・グリュンワルドギムザ染色を実施して、赤芽球分化をモニタリングした。

ＨＳＰＣの精製及び培養
本発明者らは、ヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣを健康なドナーから、及び動員されていないヒト末梢血ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣをＳＣＤ患者から入手した。研究目的のための適格な臍帯血試料は、セントルイス病院（パリ、フランス）の臍帯血バンクから慣例により入手した。研究目的のための適格なＳＣＤ試料は、慣例により、「ネッケル小児病院」という病院（パリ、フランス）から入手した。書面によるインフォームドコンセントを、全ての成人被験者から得た。全ての実験は、ヘルシンキ宣言に従って実施された。研究は、地域試験審査委員会（リファレンス番号：ＤＣ２０１４－２２７２、CPP Ile-de-France II、「ネッケル小児病院」）によって承認された。ＨＳＰＣは、ＣＤ３４マイクロビーズキット（ミルテニーバイオテク社）を用いた免疫染色後、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社）を用いた免疫磁気による選択によって精製された。トランスフェクションの４８時間前に、ＣＤ３４^＋細胞（１０^６個の細胞/ml）を解凍し、ペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ社）、２５０nMのStemRegenin1（ステムセルテクノロジーズ社）及び以下の組換えヒトサイトカイン（ペプロテック社）：ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）（３００ng/ml）、Ｆｌｔ－３Ｌ（３００ng/ml）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）（１００ng/ml）、及びインターロイキン－３（ＩＬ－３）（６０ng/ml）の補充されたＳｔｅｍＳｐａｎ（ステムセルテクノロジーズ社）を含有している「ＨＳＰＣ培地」中で培養した。

プラスミド
この研究に使用されたプラスミドとしては、ｐＣＭＶ＿ＡＢＥｍａｘ＿Ｐ２Ａ＿ＧＦＰ（アドジーン社１１２１０１番）、ｐＣＭＶ＿ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿Ｐ２Ａ＿ＧＦＰ（アドジーン社１１２１００番）、ｐＢＴ３７４（アドジーン社１２５６１５番）、ｐＢＴ３７２（アドジーン社１２５６１３番）、ｐＣＭＶ－ＡＢＥｍａｘＡＷ（アドジーン社１２５６４７番）、ｐＭＪ（アドジーン社４２２３４番）、ＡＢＥ８ｅ（アドジーン社１３８４８９番）、ｐＣＭＶ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＲＣＨ（アドジーン社１３６９２０番）、ｐＣＡＧ－ＣＢＥ４ｍａｘ－ＳｐＧ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ（ＲＴＷ４５５２）（アドジーン社１３９９９８番）及びｐＣＡＧ－ＣＢＥ４ｍａｘ－ＳｐＲＹ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ（ＲＴＷ５１３３）（アドジーン社１３９９９９番）が挙げられる。ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿ＮＡＡプラスミドは、ＳｐＣａｓ９ｎのＰＡＭ相互作用ドメインを、ＳｍａＣａｓ９の１つで置換することによって作出されたが、一方、プラスミドＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿Ｒ３３Ａ／Ｋ３４Ａは、Ｒ３３Ａ及びＫ３４Ａの突然変異を、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘプラスミド（アドジーン社１１２０９４番）のＡＰＯＢＥＣ１ドメインに挿入することによって作出された。ＨＢＢ遺伝子の２コピーの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）と９６個のアデニンのポリＡ配列とを含有しているＤＮＡ断片（３’ＵＴＲ＋ポリＡ）は、ジェンスクリプト社（遺伝子合成）によって購入された。同様に、ウリジンの欠失したｐＣＡＧ－ＣＢＥ４ｍａｘ－ＳｐＲＹ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰのコード配列を含有しているＤＮＡ断片を作製した（ＣＢＥ－ＳｐＲＹ＿Ｕ－ｄｅｌｐ）。ＣＢＥ－ＳｐＲＹ－ＯＰＴプラスミドは、３’ＵＴＲ＋ポリＡ断片をｐＣＡＧ－ＣＢＥ４ｍａｘ－ＳｐＲＹ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰに挿入し、そしてＣＢＥ４ｍａｘ－ＳｐＲＹをＣＢＥ－ＳｐＲＹ＿Ｕ－ｄｅｌｐ断片で置換することによって作製された。更に、本発明者らは、ＣＢＥ－ＳｐＲＹプラスミドのＣＡＧ合成プロモーターを、Ｔ７プロモーターで置換した。ＡＢＥ－ＳｐＲＹ－ＯＰＴプラスミドは、３’ＵＴＲ＋ポリＡ断片をｐＣＭＶ－Ｔ７－ＡＢＥｍａｘ（７．１０）－ＳｐＲＹ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ（ＲＴＷ５０２５）（アドジーン社、１４０００３番）に挿入することによって作出された。

ｇＲＮＡの設計
ｇＲＮＡの発現プラスミドの構築のために、オリゴヌクレオチドをアニーリングさせて、ｇＲＮＡのプロトスペーサーを作出し、二本鎖をＢｂｓ Ｉで消化されたＭＡ１２８プラスミド（フランス、Genethon社のM. Amendolaによって提供）にライゲートした。

ｍＲＮＡのインビトロでの転写
１０μgのＣＢＥ－ＳｐＲＹ－ＯＰＴ、ＡＢＥ－ＳｐＲＹ－ＯＰＴ又はＡＢＥ８ｅを発現しているプラスミドを、一晩かけて、ポリＡテイルの直後で一回切断する２０単位の制限酵素を用いて消化した（ＣＢＥ－ＳｐＲＹではＡｆｌＩＩ、ＡＢＥ８ｅではＡＢＥ－ＳｐＲＹ及びＳａｐＩ）。鎖状化プラスミドを、ＰＣＲ精製キット（キアゲン社、２８１０６番）を使用して精製し、３０μlのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水中で溶出した。１μgの鎖状化プラスミドを、インビトロでの転写反応のための鋳型として使用した（MEGAscript、アンビオン社、ＡＭ１３３４番）。インビトロ転写プロトコールは以下のように改変された。ＧＴＰヌクレオチド溶液を、７．５mMの代わりに３．０mMの最終濃度で使用し、抗リバースキャップアナログＮ７－メチル－３’－Ｏ－メチル－グアノシン－５’－トリホスフェート－５’－グアノシン（ＡＲＣＡ、Trilink社、Ｎ－７００３番）を、ｍＲＮＡの効率的なキャッピングを可能とする、４：１のキャップ：ＧＴＰの最終比をもたらす、最終濃度１２．０mMで使用した。インビトロでの反応のためのインキュベーション時間は、３０分まで短縮された。デオキシヌクレーアーゼＩによる処理後（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ、アンビオン社、ＡＭ１３３４番）、ＡＢＥ８ｅ ｍＲＮＡに、製造業者のプロトコールに従ってポリＡテイルを付加した（ポリＡテイリングキット、アンビオン社、ＡＭ１３５０番）。ｍＲＮＡを、塩化リチウムを使用し沈降させ、１μg/μl以上の濃度を達成することを可能とした最終容量のＴＥ緩衝液中に再懸濁した。ｍＲＮＡの品質を、バイオアナライザ（アジレント社）を使用して確認した。

プラスミドのトランスフェクション
Ｋ５６２細胞及びＨＵＤＥＰ－２細胞（１０^６個の細胞／条件）を、３．６μgの塩基編集酵素を発現しているプラスミド及び１．２μgのｇＲＮＡ含有プラスミドを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰを発現していない塩基編集酵素プラスミドのために、本発明者らは、２５０ngのＧＦＰｍａｘを発現しているプラスミド（ロンザ社）をコトランスフェクトした。本発明者らは、Ｋ５６２及びＨＵＤＥＰ－２について、それぞれ、ＡＭＡＸＡ細胞株ヌクレオフェクターキットＶ（ＶＣＡ－１００３）並びにＵ－１６及びＬ－２９プログラム（ヌクレオフェクターＩＩ）を使用した。Ｋ５６２細胞では、トランスフェクション効率は、ＦｏｒｔｅｓｓａＸ２０（ＢＤバイオサイエンシーズ社）フローサイトメーターを使用して、トランスフェクションから１８時間後にフローサイトメトリーによって評価され、細胞は、少なくとも３日間は培養液中に維持され、３日目にゲノムＤＮＡ抽出を実施した。ＧＦＰ^＋ＨＵＤＥＰ－２細胞を、ＳＨ８００細胞選別機（ソニーバイオテクノロジー社）を使用して、トランスフェクションから１８時間後に選別し、選別された細胞を培養液中で増殖させた。トランスフェクションから３日間後に、ゲノムＤＮＡの抽出を実施した。ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ（１０^６個の細胞／条件）を、３．６μgの酵素を発現しているプラスミド及び２．４μgのｇＲＮＡ含有プラスミドを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰを発現していない塩基編集酵素プラスミドについては、本発明者らは、２５０ngのＧＦＰｍａｘ発現プラスミド（ロンザ社）をコトランスフェクトした。本発明者らは、ＡＭＡＸＡヒトＣＤ３４細胞ヌクレオフェクターキット（ＶＰＡ－１００３）及びＵ－０８プログラム（ヌクレオフェクターＩＩ）を使用した。トランスフェクションから１８時間後、ＧＦＰ^＋ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣを、ＳＨ８００細胞選別機（ソニーバイオテクノロジー社）を使用して選別し、５００，０００/mLの濃度でサイトカインの濃縮されたＨＳＰＣ培地（上記）中に少なくとも６日間かけて播種し、その後、ゲノムＤＮＡの抽出を実施したか、又は、３相の赤芽球分化プロトコール（Weber, Frati Science Advances 2020）を２０日間まで使用して成熟ＲＢＣに分化させた。ゲノムＤＮＡの抽出を６日目に実施し、全ＲＮＡの抽出を１３日目に実施し、ＨｂＦの発現を評価するための機能的分析（フローサイトメトリー、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＣＥ－ＨＰＬＣ、及び鎌状化アッセイ）を１９日目に実施した。

ＲＮＡのトランスフェクション
Ｋ５６２細胞（２×１０^５個の細胞／条件）を、２．０μgの一塩基エディターを発現しているｍＲＮＡ、及びSynthego社から購入した化学的修飾（最初の３個の塩基と最後の塩基における２’－Ｏ－メチル、最初の３個の塩基と最後の２個の塩基との間の３’ホスホロチオエート結合）を含有している合成ｇＲＮＡを用いて、１．５μMの最終濃度でトランスフェクトした。本発明者らは、P3 Primary Cell 4D- ヌクレオフェクターXキットＳ（ロンザ社）及びＣＡ１３７プログラム（ヌクレオフェクター４Ｄ）を使用した。ＴＥ緩衝液でトランスフェクトされた細胞は、陰性対照としての役目を果たした。ＲＮＡのトランスフェクトされたＫ５６２細胞は、ゲノムＤＮＡ抽出及び塩基編集分析前に、少なくとも３日間、培養液中で維持された。

ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ（２×１０^５個の細胞／条件）に、３．０μgの一塩基エディター発現ｍＲＮＡ、及びSynthego社から購入した化学的修飾（最初の３個の塩基と最後の塩基における２’－Ｏ－メチル、最初の３個の塩基と最後の２個の塩基との間の３’ホスホロチオエート結合）を含有している合成ｇＲＮＡを用いて、４．６μMの最終濃度でトランスフェクトした。本発明者らは、P3 Primary Cell 4D-ヌクレオフェクターXキットＳ（ロンザ社）及びＣＡ１３７プログラム（ヌクレオフェクター４Ｄ）を使用した。ＴＥ緩衝液で、又は塩基エディターｍＲＮＡのみで、又は塩基エディターｍＲＮＡ及びＡＡＶＳ１遺伝子座に標的化するｇＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、陰性対照としての役目を果たした。ＲＮＡのトランスフェクトされたＨＳＰＣを、ＨＳＰＣ培地（上記）中５００，０００個/mLの濃度で播種し、ゲノムＤＮＡ抽出及び塩基編集分析の前に少なくとも６日間培養した。

編集効率の評価
ゲノムＤＮＡは、Ｋ５６２細胞及びＨＵＤＥＰ２細胞についてはトランスフェクションから３日後、及びＣＤ３４^＋ＨＳＰＣではトランスフェクションから６日後に、製造業者の説明書に従って、ＰＵＲＥ ＬＩＮＫゲノムＤＮＡミニキット（ライフテクノロジーズ社）を使用して、対照細胞及び編集された細胞から抽出した。ｇＲＮＡ標的部位における塩基編集効率を評価するために、本発明者らは、ＰＣＲ、それに続いて、サンガーシーケンス及びＥｄｉｔＲ分析（ＥｄｉｔＲ：サンガーシーケンスから塩基編集を定量する方法）を実施した^（２７）。ＴＩＤＥ分析（Tracking of InDels by Decomposition）も、塩基編集試料における挿入及び欠失（インデル）の比率を評価するために実施された^（２８）。

デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を、ＥｖａＧｒｅｅｎミックス又はプライマー／プローブミックス（バイオラッド社）を使用して実施して、ＨＢＧ１－ＨＢＧ２介在領域Ｉ又はＩＩをそれぞれ増幅することによって、４．９ｋｂの欠失の出現頻度を定量した。短い（約１分間）伸長時間は、欠失を有するゲノム領域のＰＣＲによる増幅を可能とした。同じ染色体（第１１番染色体）又はヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）（第４番染色体）上のゲノム領域にアニーリングする対照プライマーを、ＤＮＡローディング対照としてそれぞれ使用した。

フローサイトメトリー分析
分化したＨＵＤＥＰ－２を、BD Cytofix/Cytoperm溶液（ＢＤファーミンゲン社）を使用して固定及び透過処理を行ない、ＨｂＦ（アロフィコシアニン（ＡＰＣ）にコンジュゲートした抗ＨｂＦ抗体、ＭＨＦ０５、ライフテクノロジーズ社）を認識する抗体で染色した。ＣＤ３６、ＣＤ７１及びＧＹＰＡ赤血球系表面マーカーのフローサイトメトリー分析は、Ｖ４５０にコンジュゲートさせた抗ＣＤ３６抗体（５６１５３５、BD Horizon）、ＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗ＣＤ７１抗体（５５５５３６、BD Pharmingen）、及びＰＥ－Ｃｙ７にコンジュゲートさせた抗ＧＹＰＡ抗体（５６３６６６、BD Pharmingen）を使用して実施された。対照細胞及び編集されたＨＳＰＣから分化したＳＣＤ ＲＢＣを、０．０５％のグルタルアルデヒドで固定し、０．１％トリトンＸ－１００を用いて透過性処理を行ない、ＨｂＦを認識する抗体（ＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗ＨｂＦ抗体、クローン２Ｄ１２ ５５２８２９ ＢＤ）で染色した。ＣＤ３６、ＣＤ７１、ＧＹＰＡ、ＢＡＮＤ３及びα４－インテグリン赤血球系表面マーカーのフローサイトメトリーによる分析は、Ｖ４５０にコンジュゲートさせた抗ＣＤ３６抗体（５６１５３５、BD Horizon）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲートさせた抗ＣＤ７１抗体（５５５５３６、BD Pharmingen）、フィコエリトリン－シアニン７（ＰＥ－Ｃｙ７）にコンジュゲートさせた抗ＧＹＰＡ抗体（５６３６６６、BD Pharmingen）、フィコエリトリンにコンジュゲートさせた抗ＢＡＮＤ３抗体（９４３９、ＩＢＧＲＬ）、及びアロフィコシアニンにコンジュゲートさせた抗ＣＤ４９ｄ抗体（５５９８８１、ＢＤ社）を使用して実施された。ＤＲＡＱ５（除核）及び７ＡＡＤ（生存率）のフローサイトメトリーによる分析は、抗二本鎖ＤＮＡ色素（それぞれ、６５－０８８０－９６、インビトロジェン社、及び５５９９２５、ＢＤ社）を使用して実施された。フローサイトメトリー分析は、ＦｏｒｔｅｓｓａＸ２０（ＢＤバイオサイエンシーズ社）又はガリオスフローサイトメーターを使用して実施された。データは、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤバイオサイエンシーズ社）又はＫＡＬＵＺＡソフトウェアを使用して分析された。

コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイ
ＨＳＰＣを、メチルセルロース含有培地（ＧＦＨ４４３５、ステムセルテクノロジーズ社）中１×１０^３個の細胞/mLの濃度で、赤芽球及び顆粒球分化を支持する条件下で播種した。赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ－Ｅ）及び顆粒球マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ－ＧＭ）のコロニーを１４日後にスコアリングした。ＢＦＵ－Ｅ及びＣＦＵ－ＧＭを無作為に拾い上げ、バルク集団（少なくとも３０個のコロニーを含有している）として収集して、陽イオン交換－高速液体クロマトグラフィー（ＣＥ－ＨＰＬＣ）によるヘモグロビンの発現を評価した。

グロビン転写物のＲＴ－ｑＰＣＲ分析
全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、ＲＮｅａｓｙマイクロキット（キアゲン社）を使用して、ＨＵＤＥＰ－２細胞（分化の０日目、６日目、及び９日目）、及びＳＣＤ ＨＳＰＣから分化（１３日目）した赤血球系細胞から抽出した。成熟した転写物は、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いたＲＴ－ｑＰＣＲ（インビトロジェン社）のためのSuperScript First-Strand Synthesis Systemを使用して逆転写された。ＲＴ－ｑＰＣＲは、ｉＴａｑユニバーサルＳＹＢＲグリーンマスターミックス（バイオラッド社）及びＶｉｉａ７リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して実施された。

グロビン鎖のＲＰ－ＨＰＬＣによる分析
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析を、ＮｅｘｅｒａＸ２ＳＩＬ－３０ＡＣクロマトグラフ及びLC solutionソフトウェア（島津）を使用して実施した。グロビン鎖は、２５０×４．６mm、３．６μmのAeris Wideporeカラム（フェノメネクス社）を使用してＨＰＬＣによって分離した。試料を、溶液Ａ（水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸、９５：５：０．１）及び溶液Ｂ（水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸、５：９５：０．１）の勾配混合物を用いて溶出した。吸光度は２２０nmで測定された。

ヘモグロビン四量体のＣＥ－ＨＰＬＣ分析
陽イオン交換ＨＰＬＣ分析を、ＮｅｘｅｒａＸ２ ＳＩＬ－３０ＡＣクロマトグラフ及びLC Solutionソフトウェア（島津）を使用して実施した。ヘモグロビン四量体は、２つの陽イオン交換カラム（ポリキャットＡ、ポリエルシー社、コロンビア、メリーランド州）を使用してＨＰＬＣによって分離した。試料を、溶液Ａ（２０mMのビストリス、２mMのＫＣＮ、ｐＨ６．５）と溶液Ｂ（２０mMのビストリス、２mMのＫＣＮ、２５０mMのＮａＣｌ、ｐＨ＝６．８）の勾配混合物を用いて溶出した。吸光度は４１５nmで測定された。

鎌状化アッセイ
赤芽球分化の終了時に、ＳＣＤ ＨＳＰＣに由来する成熟ＲＢＣを、低酸素条件（０％酸素）下でインキュベートし、鎌状化の経緯を、AxioObserver Z1顕微鏡（ツァイス社）及び４０倍の対物レンズを使用して、２０分間毎に少なくとも６０分間画像を撮影しながら、ビデオ顕微鏡によってリアルタイムでモニタリングした。同じ視野の画像が、全ての段階を通して撮影され、ImageJで処理することにより、全ＲＢＣ集団における１つの取得された視野あたりの非鎌状化ＲＢＣの比率を決定した。１つの条件あたり４００個を超える細胞を計数した。

結果：
ＨＢＧプロモーターにおける効率的な塩基編集により、ＴＡＬ１及びＫＬＦ１の転写活性化因子のための結合部位が新規に生じる
－１７５Ｔ＞Ｃ ＨＰＦＨ突然変異は、ＴＡＬ１転写活性化因子をＨＢＧプロモーターにリクルートすることが示されており^（６）、一方、－１９８Ｔ＞Ｃ ＨＰＦＨ突然変異は、ＫＬＦ１転写活性化因子をリクルートする^（７）。本発明者らは、ＨＢＧプロモーター内の－１７５位及び－１９８位における塩基に標的化することのできる、ｇＲＮＡ（ＴＡＬ１＿ｂｓ＿１及びＫＬＦ１＿ｂｓ＿１）（図１）を使用した。これらのｇＲＮＡのための、標的塩基は、それぞれ３位及び７位にある。Ｋ５６２赤白血病細胞株を、ＡＢＥｍａｘ＿ＧＦＰプラスミド及びＴＡＬ１＿ｂｓ＿１又はＫＬＦ１＿ｂｓ＿１ｇＲＮＡプラスミドを用いてトランスフェクションすることにより、バルク細胞集団においてそれぞれ６１．０％及び３０．３％の効率でＡ＞Ｇ変換（反対の鎖ではＴ＞Ｃ）がもたらされた（図２Ａ、２Ｂ及び２Ｑ）。

ＴＡＬ１及びＫＬＦ１の結合部位の発生により、γ－グロビンの脱抑制がもたらされる
Ｋ５６２細胞は主に、γ－グロビンを発現し、この理由のために、それらはγ－グロビンの脱抑制を測定するためのモデルとしては使用できない。したがって、本発明者らは、ＴＡＬ１及びＫＬＦ１の活性化因子の結合部位の作出後のγ－グロビンの脱抑制を評価するために、ＨＵＤＥＰ－２成人赤血球系前駆細胞株を使用した。ＡＢＥｍａｘ＿ＧＦＰプラスミド及びＴＡＬ１＿ｂｓ＿１又はＫＬＦ１＿ｂｓ＿１ｇＲＮＡプラスミドのいずれかを用いた、プラスミドによるトランスフェクション後、ＧＦＰ^＋ＨＵＤＥＰ２細胞を選別し、増幅した。塩基編集効率は、－１７５位及び－１９８位においてそれぞれ６５％及び４５％であった（図３Ａ、３Ｂ及び３Ｊ）。対照細胞及び編集された細胞を、成熟赤血球に分化した。－１７５位及び－１９８位において編集された細胞のフローサイトメトリー分析により、高い出現頻度のＨｂＦ発現細胞が判明し（分化の０日目に７６．０％及び８０．３％、並びに分化の９日目に８５．０％及び８８．１％）、一方、ＡＢＥｍａｘ＿ＧＦＰプラスミドのみでトランスフェクトされた対照集団では、ＨｂＦ発現細胞は約３．０％であった（図４Ａ）。したがって、本発明者らは、γ－グロビン転写物の産生増加、及び平行した成人β－グロビンｍＲＮＡの減少を観察した（図４Ｂ）。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）は、γ－グロビンの有意な増加と、同時に起こるβ－グロビンの産生減少を確認した（図４Ｃ）。ＴＡＬ１及びＫＬＦ１の結合部位の発生により、陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥ－ＨＰＬＣ）によって決定したところ、全Ｈｂのそれぞれ最大で５３．５％及び３０．０％まで占める高いＨｂＦレベルがもたらされた（図４Ｄ）。ＨＢＧ１／２プロモーターの塩基編集は、赤血球系マーカーのＧＹＰＡ、ＣＤ３６及びＣＤ７１のフローサイトメトリーによる分析によって評価されるように、赤血球系細胞の分化を変化させなかった（図４Ｅ～４Ｇ）。

ＨＢＧプロモーターの－１１５領域における塩基編集により、ＢＣＬ１１Ａ転写抑制因子の結合部位が破壊され、同時にＧＡＴＡ１転写活性化因子の結合部位が生じる
ＨＢＧプロモーターの－１１５領域上のＨＰＦＨ突然変異は、ＢＣＬ１１Ａ転写抑制因子の結合部位を破壊することによって（－１１４Ｃ＞Ｔ）、又はＧＡＴＡ１転写活性化因子の結合部位を作出することによって（－１１３Ａ＞Ｇ）、上昇したＨｂＦの発現を引き起こす。本発明者らは、これらのＨＰＦＨ突然変異（－１１４Ｃ＞Ｔ及び－１１３Ａ＞Ｇ）及び追加のＨＰＦＨ様突然変異（－１１６Ａ＞Ｇ及び－１１５Ｃ＞Ｔ）を作出するために、ＡＢＥ又はＣＢＥのいずれかによって使用され得る、ｇＲＮＡ（ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１及びＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿２）を設計した（図１）。標的塩基は、基準の塩基編集窓に該当する。特に、－１１６、－１１５、－１１４及び－１１３塩基は、それぞれｇＲＮＡ ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１及びＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿２について５～８位及び４～７位にある。ＡＢＥｍａｘ＿ＧＦＰ及びｇＲＮＡ ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１プラスミドを用いたＫ５６２細胞株のトランスフェクション後、本発明者らは、－１１６位及び－１１３位においてＡ＞Ｇの変換を得ることに成功した（それぞれ４０．７％及び３４．３％）（図２Ｃ及び２Ｑ）。ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿ＧＦＰプラスミドを用いた同じｇＲＮＡ ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１プラスミドのトランスフェクションにより、－１１５位及び－１１４位においてＣ＞Ｔの変換がなされた（それぞれ３４．８％及び２８．５％）（図２Ｄ及び２Ｑ）。ＢＣＬ１１Ａ転写抑制因子の結合部位を破壊するための酵素の選択肢を増やす試みにおいて、本発明者らは、ＢＣＬ１１Ａ結合部位（ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１及びＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿２）に標的化する２つのｇＲＮＡと組み合わせて、ＮＧ ＰＡＭを認識する２つの酵素である、ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ又はｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧプラスミドを用いて、Ｋ５６２細胞株をトランスフェクトした。４つ全ての異なる組合せにより、同じＣ＞Ｔの変換がもたらされ（－１１５Ｃ＞Ｔ及び－１１４Ｃ＞Ｔ）、効率は１８～４０．５％の範囲であった（ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ － ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１；４０．５％の－１１５Ｃ＞Ｔ、及び３１．５％の－１１４Ｃ＞Ｔ、ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ － ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿２；３０．０％の－１１５Ｃ＞Ｔ、及び２２．０％の－１１４Ｃ＞Ｔ、ｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ － ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１；２２．０％の－１１５Ｃ＞Ｔ、及び２１．５％の－１１４Ｃ＞Ｔ、及びｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ － ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿２；１８．０％の－１１５Ｃ＞Ｔ、及び１９．０％の－１１４Ｃ＞Ｔ）（図２Ｅ、２Ｆ及び２Ｑ）。

ＮＧＧを含まない塩基エディターは、複数の塩基を編集し、そしてＨＰＦＨ及びＨＰＦＨ様突然変異を作出することによって、ＬＲＦ転写抑制因子の結合部位を破壊することができる
ＨＢＧプロモーターの－２００領域は、成人期における高度なγ－グロビン発現に関連した、様々なＨＰＦＨ突然変異を含有している。これらの大半の突然変異は、その結合部位の破壊を介して、ＬＲＦ転写抑制因子の結合能を減少させることによって、ＨＢＧ遺伝子を脱抑制する。ＬＲＦ結合部位には、８つのシトシンがあり、理論的にはそれらの全てが、チミンに変換されるために、塩基編集によって標的化され得る。結果として、多数のＨＰＦＨ突然変異、及びＬＲＦ結合能を損なうことによってＨＰＦＨ様表現型を誘導し得る追加の突然変異を作出することができる（図１）。ＬＲＦ結合部位に近い基準のＳｐｙＣａｓ９ ＮＧＧ ＰＡＭが存在しないことは、この部位の編集を可能とするＮＧＧを含まないＣａｓ９変異体を含有している塩基編集酵素の作製を本発明者らに促した。Ｃａｓ９のこの変異体は、ＬＲＦ結合部位の標的化にとって理想的なＮＡＡ ＰＡＭを認識する。なぜなら、それは、２～１１位に標的塩基（８つのシトシン）を配置する、ｇＲＮＡ（ＬＲＦ＿ｂｓ＿２）の設計を可能とするからである。ＰＡＭ相互作用性ドメインの交換後、結果として得られた酵素（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿ＮＡＡと呼ばれる）を、ＬＲＦ＿ｂｓ＿２ｇＲＮＡプラスミドと組み合わせて、Ｋ５６２細胞株にプラスミドとしてトランスフェクトした。本発明者らは、最大３７．０％の効率で、ＬＲＦ結合部位の８個のシトシンの中の７個を修飾することができた（８．７％の－２０２Ｃ＞Ｔ；２０．３％の－２０１Ｃ＞Ｔ；３７．０％の－２００Ｃ＞Ｔ；３０.７％の－１９７Ｃ＞Ｔ；２７．７％の－１９６Ｃ＞Ｔ；１６．３％の－１９５Ｃ＞Ｔ；５．７％の－１９４Ｃ＞Ｔ）（図２Ｇ及び２Ｑ）。ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ又はｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧの酵素を使用して、ＬＲＦ結合部位に標的化するための、１つ以上のｇＲＮＡ（ＬＲＦ＿ｂｓ＿１）が設計された（図１）。これらの組合せを用いて、本発明者らは、モチーフの８個のシトシンの中の６個を標的化することができ、これらの６個のシトシンは、１～８位にある。ＬＲＦ＿ｂｓ＿１ ｇＲＮＡプラスミドと、ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ又はｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧのいずれかの酵素を使用した、Ｋ５６２細胞株のトランスフェクションにより、ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ酵素では８．０～２８．５％（８．０％の－２０１Ｃ＞Ｔ；２２．５％の－２００Ｃ＞Ｔ；２８．０％の－１９７Ｃ＞Ｔ；２７.５％の－１９６Ｃ＞Ｔ；２８．５％の－１９５Ｃ＞Ｔ；２１．０％の－１９４Ｃ＞Ｔ）、ｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ酵素では１５．０～３２．５％の範囲である効率（２８．０％の－１９７Ｃ＞Ｔ；３２．５％の－１９６Ｃ＞Ｔ；２５．５％の－１９５Ｃ＞Ｔ；１５．０％の－１９４Ｃ＞Ｔ）が判明した（図２Ｈ、２Ｉ及び２Ｑ）。同じｇＲＮＡを、より効率的なＮＧＧを含まない塩基エディター、例えばＣＢＥ－ＮＲＣＨ、ＣＢＥ－ＳｐＧ及びＣＢＥ－ＳｐＲＹを用いて試験した。ＬＲＦ＿ｂｓ＿１ ｇＲＮＡと組み合わせた場合、ＣＢＥ－ＮＲＣＨ、ＣＢＥ－ＳｐＧ及びＣＢＥ－ＳｐＲＹにより、Ｋ５６２細胞へのプラスミドのトランスフェクション時に、それぞれ最大５０．３％、４３．７％、及び４６．３％までのＣ＞Ｔの効率がもたらされた（図２Ｊ～Ｌ及び２Ｑ）。ＣＢＥ－ＳｐＲＹのＰＡＭがない性質を考えると、この塩基エディターをＬＲＦ＿ｂｓ＿２ ｇＲＮＡと組み合わせ、そして上記の全ての酵素より優れ、５８．０％の効率に達した。重要なことには、その幅広い編集窓のお陰で、ＣＢＥ－ＳｐＲＹは、－２００領域の全てのシトシンを変換した（図２Ｍ及び２Ｑ）。最後に、ＡＢＥ８ｅ酵素プラスミドを、ＫＬＦ１＿ｂｓ＿１ ｇＲＮＡと共にＫ５６２細胞にコトランスフェクトし、これにより最大で７２．７％までの効率で、－１９８ Ａ：Ｔ ｂｐ及び－１９９ Ａ：Ｔ ｂｐの両方のＡ＞Ｇ修飾がもたらされ、その結果、ＬＲＦの結合部位は破壊された（図２Ｎ及び２Ｑ）。

塩基編集によるＢＣＬ１１Ａ及びＬＲＦ転写抑制因子の結合部位の破壊により、ＨｂＦは再活性化される
ＨＰＦＨ及びＨＰＦＨ様突然変異を作出することによって、ＨＢＧプロモーターの－１１５及び－２００領域に標的化するための、以前に報告された塩基編集アプローチを、ＢＣＬ１１Ａ及びＬＲＦ転写抑制因子結合部位の破壊後、並びに／あるいはＧＡＴＡ１転写活性化因子の結合部位の作出後、γ－グロビンの脱抑制を評価するために、ＨＵＤＥＰ－２細胞株において試験した。両方の領域について、４つの異なる酵素（ＡＢＥｍａｘ＿ＧＦＰ、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿ＧＦＰ、ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ及びｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ）を発現しているプラスミドを、単一のｇＲＮＡ発現プラスミド（ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１、ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿２、ＬＲＦ＿ｂｓ＿１及びＬＲＦ＿ｂｓ＿２）と組み合わせてＨＵＤＥＰ－２細胞に個々にトランスフェクトした。ＧＦＰを発現しないプラスミドについては（ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ及びｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ）、少量のＧＦＰｍａｘ発現プラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＧＦＰ^＋細胞をＦＡＣＳで選別し、培養液中で増幅し、赤血球に分化させた。

ＡＢＥｍａｘ＿ＧＦＰ酵素及びＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１ ｇＲＮＡを用いたＢＣＬ１１Ａ結合部位の編集により、それぞれ５６．０％及び５７．０％の頻度で、－１１６Ａ＞Ｇ及び－１１３Ａ＞Ｇの変換がなされ、ＢＣＬ１１Ａ結合部位が破壊され、同時にＧＡＴＡ１結合部位が作出された（図３Ｃ及び３Ｊ）。ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１ ｇＲＮＡと組みわせたＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿ＧＦＰ酵素を使用して、本発明者らは、ＨＰＦＨ（３８．０％の－１１４Ｃ＞Ｔ）及びＨＰＦＨ様（４７．０％の－１１５Ｃ＞Ｔ）突然変異の作製に成功した（図３Ｄ及び３Ｊ）。ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１又はＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿２ ｇＲＮＡのいずれかと組み合わせた、ＮＧＧを含まないＰＡＭ酵素（ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ及びｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ）による塩基編集は、ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧを使用した場合にのみ効果的であり、これにより、ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１ ｇＲＮＡを用いると－１１５Ｃ＞Ｔ及び－１１４Ｃ＞Ｔの変換（それぞれ４０．０％及び２７．０％）が、及びＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿２ｇＲＮＡを用いると－１１５Ｃ＞Ｔ及び－１１４Ｃ＞Ｔの変換（それぞれ２４．０％及び１５．０％）がなされた（図３Ｅ、３Ｆ及び３Ｊ）。上記酵素を用いたＢＣＬ１１Ａ結合部位の塩基編集は、赤血球系マーカーのＧＹＰＡ、ＣＤ３６及びＣＤ７１のフローサイトメトリーによる分析によって評価したところ、赤血球系の分化には影響を及ぼさなかった（図５Ａ～５Ｃ）。フローサイトメトリー分析は、ＨｂＦ発現細胞の増加した出現頻度を示した（最大８７．８％まで）（図５Ｄ）。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析により、フローサイトメトリーデータと一致して、上昇したγ－グロビン転写物の産生と、同時に起こるβ－グロビン転写物の産生減少が判明した（図５Ｅ）。ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＣＥ－ＨＰＬＣ分析はこれらのデータを確認し、ＨｂＦは、全Ｈｂの最大３１．８％までを占めた（図５Ｆ～５Ｇ）。

ＬＲＦ抑制因子の結合部位に標的化するために、ＬＲＦ＿ｂｓ＿１ ｇＲＮＡと組み合わせた、ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ及びｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ酵素の使用により、ｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ酵素では最大２４．０％までの塩基編集効率が（４．０％の－２０１Ｃ＞Ｔ；２４．０％の－１９７Ｃ＞Ｔ；２３．０％の－１９６Ｃ＞Ｔ；２３．０％の－１９５Ｃ＞Ｔ；１７．０％の－１９４Ｃ＞Ｔ）、そしてｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧ酵素では最大２０．０％までの塩基編集効率（２０．０％の－１９７Ｃ＞Ｔ；２０．０％の－１９６Ｃ＞Ｔ；５．０％の－１９５Ｃ＞Ｔ；１．０％の－１９４Ｃ＞Ｔ）がもたらされ（図３Ｇ、３Ｈ及び３Ｊ）、同時にＨｂＦ発現細胞はそれぞれ１２．９％（編集されていない対照細胞では３．５％）及び２１．４％（編集されていない対照細胞では６．７％）まで増加した（図６Ａ）。その後、本発明者らは、初代臍帯血由来のＣＤ３４^＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）を使用した。ＣＤ３４^＋細胞に、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿ＮＡＡ、ＬＲＦ＿ｂｓ＿１ ｇＲＮＡ及びＧＦＰｍａｘプラスミドをトランスフェクトし、ＧＦＰの発現について選別した。細胞は液体培養液中に維持されたか、又は赤芽球及び顆粒球－単球前駆細胞の増殖及び分化を可能とする半固形培地に蒔いた（コロニー形成単位アッセイ）。トランスフェクションから６日後、本発明者らは、液体培養液中で１９．０％の－２００Ｃ＞Ｔの変換効率を得た（図６Ｂ～６Ｃ）。トランスフェクションから１４日後、陽イオン交換ＨＰＬＣ分析を実施して、赤芽球前駆細胞に由来する赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ－Ｅ）コロニーにおけるヘモグロビン四量体を検出した（図６Ｄ）。この分析は、１１．０２％のＨｂＦレベルの増加を明らかとした（対照試料では６８．２２％、編集された試料では７９．２４％）（図６Ｄ）。要するにこれらのデータは、新規ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿ＮＡＡ塩基編集酵素が、初代ＨＳＰＣにおけるＬＲＦ転写抑制因子の結合部位に標的化することができ、それらの赤芽球前駆細胞におけるＨｂＦの発現を増加させることができることを示す。

インデル及び大きな欠失は、塩基の編集された細胞ではほとんど検出不可能であった
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用と共に出現する安全性問題の１つは、二本鎖切断の発生後のゲノム内に挿入及び欠失（インデル）の作出である。しかし塩基編集システムを用いると本発明者らはこの問題を克服することができる。なぜなら、塩基エディターは失活したＣａｓ９ヌクレアーゼを含有しているからである。本発明者らは、本発明者らが使用した塩基編集酵素を用いて、ゲノム内の二本鎖切断を作出していないことを確認したかった。この理由のために、本発明者らは、ＰＣＲによって標的領域を増幅し、塩基の編集された試料及び対照Ｋ５６２試料について、サンガーシーケンス、それに続いてＴＩＤＥ分析を実施した^（２８）（図２Ｏ、３Ｉ及び図６Ｂ）。殆ど全ての試料について、本発明者らは、それぞれ１８．４％及び２２．０％のインデルの平均値を示した、ＡＢＥ８ｅとＫＬＦ１＿ｂｓ＿１ｇＲＮＡプラスミド、及びｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧとＬＲＦ＿ｂｓ＿２ ｇＲＮＡプラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞を除いて、インデルを全く検出しなかった（図２Ｏ）。

Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いてβ－グロビン遺伝子座を編集する場合に生じる別の問題は、同一のＨＢＧ１／２プロモーターの同時切断であり、これにより、介在している４．９ｋｂのゲノム領域の欠失及びＨＢＧ２遺伝子の消失が起こる。それ故、本発明者らは、４．９ｋｂの欠失が、塩基の編集されたＫ５６２細胞において存在するかどうかを試験した。塩基の編集された試料のインデルプロファイルに従って（図２Ｏ）、本発明者らは、ＡＢＥｍａｘ－、ＡＢＥ８ｅ－及びｅｖｏＦＥＲＮＹ－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧで処理された試料においてのみ、低い頻度の４．９ｋｂの欠失を観察した（それぞれ４．９％、４．９％、及び３．２％；図２Ｐ）。４．９ｋｂの欠失についての陽性対照として、本発明者らは、基準のＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて編集されたＫ５６２細胞から抽出されたＤＮＡを使用した（図２Ｐ）。

低いＲＮＡオフターゲット活性を有する酵素を使用して、ＨＢＧ抑制因子及び活性化因子の結合部位に標的化することができる
塩基編集酵素は、殆どがｇＲＮＡに非依存性である、細胞内ＲＮＡのオフターゲット編集を引き起こす可能性がある。塩基編集酵素のデアミナーゼの突然変異は、ＲＮＡのオフターゲット編集を最小限にすることができる。アデニン塩基エディターでは、これらの突然変異は、ＴａｄＡドメイン内のＥ５９Ａ、及びＴａｄＡ^＊ドメイン内のＶ１０６Ｗであり、これらの突然変異を有する酵素はＡＢＥｍａｘＡＷと呼ばれる^（２９）。シトシン塩基エディターについての突然変異は、ＡＰＯＢＥＣ１ドメイン内のＲ３３Ａ及びＫ３４Ａである^（３０）。これらの突然変異をＡｎｃＢＥ４ｍａｘ酵素に挿入することによって、本発明者らは、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿Ｒ３３Ａ／Ｋ３４Ａ塩基編集酵素を作出した。本発明者らの目的は、低いＲＮＡオフターゲット編集を示すこれらの酵素を使用して、ＴＡＬ１及びＫＬＦ１活性化因子の結合部位を作出することができるかどうか、又はＢＣＬ１１Ａ抑制因子の結合部位を破壊することができるかどうかを確認することであった。ＡＢＥｍａｘＡＷプラスミド及びＴＡＬ１＿ｂｓ＿１又はＫＬＦ１＿ｂｓ＿１ ｇＲＮＡプラスミドを用いたＫ５６２細胞のトランスフェクションにより、それぞれ２５．０％及び１７．０％の頻度で、－１７５Ｔ＞Ｃ（反対の鎖に対してＡ＞Ｇ）及びＴ＞Ｃ（反対の鎖に対してＡ＞Ｇ）の変換が行なわれた（図７Ａ及び７Ｂ）。ＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１ ｇＲＮＡと組み合わせたＡＢＥｍａｘＡＷを用いたＢＣＬ１１Ａ結合部位の標的化は、３６．０％の－１１６Ａ＞Ｇ及び３３．０％のＡ＞Ｇの変換を引き起こしたが（図７Ｃ）、一方、同じｇＲＮＡ及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿Ｒ３３Ａ／Ｋ３４Ａ酵素を用いたこの部位の標的化により、それぞれ２９．０％及び２４．０％の頻度で、－１１５Ｃ＞Ｔ及び－１１４Ｃ＞Ｔの変換がもたらされた（図７Ｄ）。要するに、これらのデータは、これらのより安全な形の塩基編集酵素を使用することにより、ＨＢＧプロモーター内の転写活性化因子又は抑制因子の結合部位に効率的に標的化することができることを実証する。

ＳＣＤ ＨＳＰＣにおける、ＣＢＥによる、ＨＢＧプロモーター内のＬＲＦ抑制因子の結合部位の破壊は、ＨｂＦの再活性化をもたらし、鎌状化表現型を救出する
ＳＣＤの処置のための治療ストラテジーとしての本発明者らの塩基編集アプローチの有効性を証明するために、本発明者らは、塩基エディターを発現しているプラスミド及びｇＲＮＡを発現しているプラスミドを、動員されていない初代ヒト成人ＳＣＤ ＨＳＰＣにトランスフェクトした。特に、ＣＢＥ酵素を発現しているプラスミド（ＣＢＥ－ＮＲＣＨ、ＣＢＥ－ＳｐＧ－ＧＦＰ、ＣＢＥ－ＳｐＲＹ－ＧＦＰ）を、単一のｇＲＮＡ発現プラスミド（ＬＲＦ＿ｂｓ＿１、ＬＲＦ＿ｂｓ＿２）と組み合わせて個々にトランスフェクトした。編集された細胞を濃縮するために、本発明者らは塩基エディター－ＧＦＰ融合体（ＣＢＥ－ＳｐＧ－ＧＦＰ、ＣＢＥ－ＳｐＲＹ－ＧＦＰ）を発現するプラスミドを使用したか、又は本発明者らは、塩基エディターを発現しているプラスミド（ＣＢＥ－ＮＲＣＨ）及びＧＦＰｍａｘを発現しているプラスミドをコトランスフェクトした。赤血球系統に向けて分化したＧＦＰ^高い細胞を、３相プロトコールを使用して、ＦＡＣＳにより選別した。

塩基編集効率を、赤血球系分化の第一相の終了時（６日目）に赤芽球において測定した。ＬＲＦ結合部位における４つのシトシン（ＬＲＦ ４Ｃ）を変換する、ＣＢＥ及びＬＲＦ＿ｂｓ＿１ ｇＲＮＡで処理された試料は、約２２．４％（ＣＢＥ－ＮＲＣＨ、ＣＢＥ－ＳｐＧ及びＣＢＥ－ＳｐＲＹを用いてそれぞれ２６．８％、２３．８％及び１６．５％）の編集効率を示した（図８Ａ）。ＣＢＥ－ＳｐＲＹで及びＬＲＦ＿ｂｓ＿２で処理された試料では、ＬＲＦ結合部位の全てのシトシンが、最大２５．５％までの効率でチミジンに変換された（図８Ｂ）。塩基の編集された試料のＴＩＤＥ分析は、インデルの存在しないことを確認した（図８Ｃ）。

その後、本発明者らは、編集された赤芽球のバルク集団を、成熟したＲＢＣへと分化させて、ＨｂＦの発現及び鎌状化細胞の表現型の回復を評価した。赤血球系分化は、分化に沿って、後期（ＣＤ３６、ＣＤ７１及びα４－インテグリン）及び初期（ＧＹＰＡ及びＢＡＮＤ３）赤血球系マーカーのフローサイトメトリーによる分析によって測定したところ、対照試料とＣＢＥで処理された試料の間で類似していた（データは示されていない）。除核速度は、分化中の様々な時点における群間で類似し、最後の相の終了時には全ての試料において９０％以上に到達した（データは示されていない）。ＬＲＦ ４Ｃ及びＬＲＦ ８ＣのＣＢＥで処理された試料は、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＰ－ＨＰＬＣ（図８Ｄ及び８Ｅ）及びＣＥ－ＨＰＬＣ（編集された試料及び対照試料においてそれぞれ２２．３％及び９．１％のＨｂＦ、図８Ｆ）によって測定したところ、ｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルの両方において胎児ヘモグロビンの再活性化を示した。フローサイトメトリー分析は、高い頻度のＨｂＦ発現ＲＢＣを明らかとした（それぞれ、対照試料、ＬＲＦ ４Ｃ試料及びＬＲＦ ８Ｃ試料において４２．９％、６４．３％及び７０．０％；図８Ｇ）。鎌状化表現型に対するＨｂＦの再活性化の作用を評価するために、本発明者らは、成熟したＲＢＣを、ＨｂＳ重合を誘導する低酸素条件下でインキュベートした。興味深いことには、ＬＲＦ結合部位の４又は８つのシトシンの編集が、鎌状化表現型を寛解した（対照試料、ＬＲＦ ４Ｃ試料及びＬＲＦ ８Ｃ試料においてそれぞれ、２３．２％、５２．５％及び５８．４％の非鎌状化細胞）（図８Ｈ）。全体的に、これらのデータは、ＣＢＥによるＨＢＧ１／２プロモーターの塩基編集が、ＨｂＦの再活性化をもたらし得、そしてＳＣＤ患者のＨＳＰＣから分化したＲＢＣの鎌状化表現型を救出することを実証する。

ＳＣＤ ＨＳＰＣにおけるＡＢＥによる、ＨＢＧプロモーターにおける、ＬＲＦ抑制因子の結合部位の破壊、又はＫＬＦ１活性化因子の作出により、ＨｂＦの活性化が起こり、鎌状化表現型は救出される
ＡＢＥはまた、ＬＲＦ転写抑制因子の結合部位を破壊するために、又はＫＬＦ１転写活性化因子の結合部位を作出するために使用され得る。本発明者らは、ＡＢＥの治療能を実証するために、動員されていない初代ヒト成人ＳＣＤ ＨＳＰＣにおいて、ＣＢＥについて以前の段落で記載された同じセットの実験を実施した。より具体的には、ＡＢＥｍａｘ－ＧＦＰ又はＡＢＥ８ｅを発現しているプラスミドを、単一のｇＲＮＡを発現しているプラスミド（関連性のないＡＡＶＳ１遺伝子座に標的化するＫＬＦ１＿ｂｓ＿１ｇＲＮＡ又はＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ；Weber et al., Sc. Advances, 2020）と組み合わせて個々にトランスフェクトした。編集された細胞を強化するために、本発明者らは、ＡＢＥｍａｘ－ＧＦＰ融合タンパク質を発現しているプラスミドを使用したか、又は、本発明者らは、ＡＢＥ８ｅ発現プラスミド及びＧＦＰｍａｘ発現プラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＧＦＰ^中間及びＧＦＰ^高い細胞を、ＦＡＣＳで選別して、多種多様な編集効率を有する細胞集団を得た。選別された細胞は、３相プロトコールを使用して、成熟ＲＢＣへと完全に分化させた。

塩基編集効率は、赤血球系分化の第一相の終了時（６日目）に赤芽球において測定された。ＡＢＥｍａｘ（ＫＬＦ１結合部位を生じる、ＫＬＦ１）及びＡＢＥ８ｅ（ＬＲＦ結合部位の２つのチミジンを変換；ＬＲＦ ２Ｔ）で処理された試料は、ＧＦＰ^中間及びＧＦＰ^高いバルク集団においてそれぞれ、４１．０％から５２．３％、及び５６．５％から７６．０％の範囲の効率を示した（図９Ａ～９Ｄ）。塩基編集試料のＴＩＤＥ分析は、ＡＢＥｍａｘで処理された細胞にインデルが存在しないことを確認したが（図９Ｅ）、一方、７．９％及び１４．８％の中程度のインデルの出現頻度が、ＧＦＰ^中間及びＧＦＰ^高いＡＢＥ８ｅで処理された試料においてそれぞれ検出された（図９Ｅ）。

編集された赤芽球から成熟ＲＢＣへのバルク集団の分化を行なうことにより、ＨｂＦの発現及び鎌状化細胞の表現型の回復を評価した。赤血球系分化は、分化に沿って、後期（ＣＤ３６、ＣＤ７１及びα４－インテグリン）及び初期（ＧＹＰＡ及びＢＡＮＤ３）赤血球系マーカーのフローサイトメトリーによる分析によって測定したところ、対照試料とＡＢＥで処理された試料の間で類似していた（データは示されていない）。除核速度は、分化中の様々な時点における群間で類似し、最後の相の終了時には全ての試料において９０％以上に到達した（データは示されていない）。ＫＬＦ１結合部位又はＬＲＦ ２Ｔプロファイルのいずれかを有する、ＡＢＥで処理された試料は、ＣＥ－ＨＰＬＣによって測定したところ、高いＨｂＦレベルを発現した（それぞれ６６．３％及び６２．６％）（図９Ｈ）。これらの結果は、ＲＴ－ｑＰＣＲ及びＲＰ－ＨＰＬＣによってｍＲＮＡ及び単一グロビン鎖レベルにおいて確認された（図９Ｆ及び９Ｇ）。フローサイトメトリー分析により、高い出現頻度のＨｂＦを発現しているＲＢＣ（対照試料、ＡＢＥｍａｘで処理された試料、及びＡＢＥ８ｅで処理された試料のそれぞれにおいて、６０．４％、９４．２％以上、及び８１．４％以上）が判明した（図９Ｊ）。鎌状化アッセイが、対照試料及び編集された試料において実施された。高い出現頻度の修正された細胞が、ＡＢＥｍａｘで処理された試料及びＡＢＥ８ｅで処理された試料について観察された（対照試料、ＡＢＥｍａｘで処理された試料、及びＡＢＥ８ｅで処理された試料のそれぞれにおいて、１４．７％、７５．７％、及び６０．６％の非鎌状化細胞）（図９Ｉ）。全体的には、この試験は、ＡＢＥを使用した、ＨＢＧ１／２プロモーターの－２００領域内のＬＲＦ抑制因子結合部位の破壊又はＫＬＦ１活性化因子結合部位の作出のいずれかにより、胎児ヘモグロビンの再活性化が起こり、ＳＣＤ患者のＨＳＰＣから分化したＲＢＣにおける鎌状化表現型が救出されることを示す。

Ｋ５６２細胞及びＳＣＤ ＨＳＰＣにおける、ＨＢＧ１／２プロモーターの効率的なＲＮＡにより媒介される編集
初代ＨＳＰＣに塩基編集システムを送達するための臨床的に妥当な方法を確立し、最小限の毒性を伴って高い編集効率を達成するために、本発明者らは、塩基エディターをコードしているｍＲＮＡ及び修飾された合成ｇＲＮＡのトランスフェクションに基づいたプロトコールを最適化した。まず、本発明者らは、インビトロでの転写及びｍＲＮＡの生成のために、ＣＢＥ－ＳｐＲＹ及びＡＢＥ－ＳｐＲＹをコードしているプラスミドを最適化した。特に、本発明者らは、ＨＢＢ遺伝子の２コピーの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）（これはｍＲＮＡの半減期を延長し、タンパク質レベルを改善することが示されている^{３１～３３}）及びポリＡ配列を３’ＵＴＲの後に挿入することにより、ＣＢＥ－ＳｐＲＹ及びＡＢＥ－ＳｐＲＹの構築物におけるｍＲＮＡ^３４を更に安定化させた。

次に、本発明者らは、ＣＢＥ－ＳｐＲＹ－ＯＰＴ、ＡＢＥ－ＳｐＲＹ－ＯＰＴ及びＡＢＥ８ｅのプラスミドを使用して、インビトロでｍＲＮＡの転写を実施した。Ｋ５６２細胞では、ＬＲＦ＿ｂｓ＿２、ＫＬＦ１＿ｂｓ＿１又はＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１の修飾された合成ｇＲＮＡと一緒に、ＣＢＥ－ＳｐＲＹ、ＡＢＥ－ＳｐＲＹ及びＡＢＥ８ｅのｍＲＮＡをトランスフェクションすることにより、高い塩基編集効率が得られ、このことは本発明者らが、完全に機能するｍＲＮＡを作製したことを実証する。特に、ＬＲＦ＿ｂｓ＿２又はＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１ｇＲＮＡと組み合わせたＣＢＥ－ＳｐＲＹ ｍＲＮＡのトランスフェクションにより、それぞれ８７．０％及び８３．０％のＣ＞Ｔ変換がもたらされた（図１０Ａ及び１０Ｂ）。同様に、ＡＢＥ－ＳｐＲＹ ｍＲＮＡ及びＫＬＦ１＿ｂｓ＿又はＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１ｇＲＮＡのトランスフェクションにより、それぞれ５５．０％及び３９．０％のＡ＞Ｇ変換がもたらされた。最後に、ＡＢＥ８ｅ ｍＲＮＡ及びＢＣＬ１１Ａ＿ｂｓ＿１ｇＲＮＡの共トランスフェクションにより、８８．０％の塩基編集効率が得られた（図１０Ｃ～１０Ｅ）。

ＣＢＥ－ＳｐＲＹ及びＡＢＥ８ｅ ｍＲＮＡも、化学的に修飾された単一ｇＲＮＡと組み合わせて、ＳＣＤ ＨＳＰＣにトランスフェクトした。ＬＲＦ＿ｂｓ＿１又はＬＲＦ＿ｂｓ＿２ｇＲＮＡと併せたＣＢＥ－ＳｐＲＹ ｍＲＮＡにより、それぞれ５１．０％及び６１．０％のＣ＞Ｔ変換がもたらされ、一方、ＫＬＦ１＿ｂｓ＿１ｇＲＮＡと併せたＡＢＥ８ｅ ｍＲＮＡにより、７５．０％のＡ＞Ｇ変換がもたらされた（図１０Ｆ～１０Ｈ）。これらの結果は、ＲＮＡにより媒介される塩基エディターの送達が、ＳＣＤ ＨＳＰＣにおけるＨＢＧ１／２プロモーターの効率的な標的化を可能とすることを実証する。

参考文献：
本出願全体にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示中に、本明細書により援用される。

Claims (19)

1. 真核細胞を、（ａ）少なくとも１つの塩基編集酵素と（ｂ）該塩基編集酵素を、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の少なくとも１つの標的配列に誘導するための少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子とからなる遺伝子編集プラットフォームに接触させ、これにより、該プロモーターを編集し、続いて、該真核細胞内のガンマグロビンの発現を増加させる工程を含む、真核細胞内の胎児ヘモグロビン含量を増加させるための方法。
2. 前記遺伝子編集プラットフォームが、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内に－１９８Ｔ＞Ｃ突然変異を導入し、これにより、ＫＦＬ１活性化因子はこれで該プロモーターに結合することができる、請求項１記載の方法。
3. 前記遺伝子編集プラットフォームが、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内に－１７５Ｔ＞Ｃ突然変異を導入し、これにより、ＴＡＬ１活性化因子はこれで該プロモーターに結合することができる、請求項１記載の方法。
4. 前記遺伝子編集プラットフォームが、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内に－１１３Ａ＞Ｇ突然変異を導入し、これにより、ＧＡＴＡ１活性化因子はこれで該プロモーターに結合することができる、請求項１記載の方法。
5. 前記遺伝子編集が、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－２００領域を編集するために使用され、これにより、ＬＲＦ抑制因子に対する結合部位が破壊される、請求項１記載の方法。
6. 前記遺伝子編集プラットフォームが、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内に－２０１Ｃ＞Ｔ、－２００Ｃ＞Ｔ、－１９７Ｃ＞Ｔ、－１９６Ｃ＞Ｔ、－１９５Ｃ＞Ｔ、及び－１９４Ｃ＞Ｔからなる群より選択された少なくとも１つの突然変異を導入し、これにより、ＬＲＦ抑制因子に対する結合部位が破壊される、請求項５記載の方法。
7. 前記遺伝子編集が、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の－１１５領域を編集するために使用され、これにより、ＢＣＬ１１Ａ抑制因子に対する結合部位が破壊される、請求項１記載の方法。
8. 前記遺伝子編集プラットフォームが、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内に－１１４Ｃ＞Ｔ、－１１３Ｃ＞Ｔ、－１１５Ｃ＞Ｔ、及び－１１６Ｃ＞Ｔからなる群より選択された少なくとも１つの突然変異を導入し、これにより、ＢＣＬ１１Ａ抑制因子に対する結合部位が破壊される、請求項７記載の方法。
9. 前記真核細胞が、造血前駆細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、多能性細胞（すなわち胚性幹細胞（ＥＳ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ））からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
10. 前記塩基編集酵素が、ニッカーゼ、より特定するとＣａｓ９ニッカーゼを含む、請求項１記載の方法。
11. 前記ニッカーゼが、配列番号３又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０記載の方法。
12. 前記塩基編集酵素が、シチジンデアミナーゼ又はアデノシンデアミナーゼである、請求項１記載の方法。
13. 前記デアミナーゼが、配列番号４～１４に示されるアミノ酸配列の変異体からなる、請求項１２記載の方法。
14. 前記塩基編集酵素が、ＡＢＥｍａｘ、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ、又はｅｖｏＣＤＡ１－ＢＥ４ｍａｘ－ＮＧである、請求項１記載の方法。
15. 前記塩基編集酵素及び対応するガイドＲＮＡ分子が、表Ｂに従って選択される、請求項１記載の方法。
16. 複数のガイドＲＮＡ分子が、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の複数の配列に標的化するように設計されている、請求項１記載の方法。
17. 複数のガイドＲＮＡ分子と共に、複数の塩基編集酵素が、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター内の複数の配列に標的化するように設計されている、請求項１記載の方法。
18. それを必要とする被験者において胎児ヘモグロビンレベルを増大させるための方法であって、該方法は、上記の方法によって得られる真核細胞集団の治療有効量を移植することを含む、該方法。
19. 前記被験者が、鎌状赤血球症又はβ－サラセミアなどのヘモグロビン異常症と診断されている、請求項１記載の方法。

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